Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид DBPAG, перспективный для серодиагностики клещевого боррелиоза, рекомбинантная плазмидная ДНК pETdbpagNH, кодирующая слитный полипептид DBPAG, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/ pETdbpagNH - продуцент полипептида DBPAG, полипептид DBPAG и способ его получения Российский патент 2019 года по МПК C07K19/00 C07K14/20 C12N15/31 C12N15/63 G01N33/569 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к получению иммуногенного полипептида, обеспечивающего формирование иммунного ответа против инфекции, вызываемой спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato.

Клещевой боррелиоз (болезнь Лайма) - инфекционное трансмиссивное природноочаговое заболевание, имеющее наклонность к хроническому и рецидивирующему течению с преимущественным поражением кожи, нервной системы, опорно-двигательного аппарата и сердца. Возбудителем болезни Лайма являются спирохеты комплекса В. burgdorferi s.l. Классификация боррелий основана на характеристике белков наружной мембраны (OspA, OspB, OspC), структур флагеллярного гена, белкового профиля, метаболической активности, генетической структуре, определяемой молекулярным типированием и секвенированием [1-3].

Состав комплекса представлен 18 геномовидами спирохет, среди которых наиболее распространенными и клинически значимыми являются В. garinii, В. burgdorferi sensu stricto и В. afzelii. Циркуляция всех трех геномовидов зафиксирована на территории Европы и Азии [1], а также Северной Америки [4, 5]. На территориях эндемичных по клещевым боррелиозам в РФ (Московская, Ленинградская, Тверская, Ярославская, Костромская, Калининградская, Пермская, Тюменская области, а также Уральский, Западносибирский и Дальневосточный регионы) в основном циркулируют боррелии двух видов - В. afzelii и В. garinii [6]. Зараженность иксодовых клещей возбудителями болезни Лайма в разных природных очагах может варьировать в широком диапазоне (от 5-10 до 70-90%) [7, 8]. Работы в США продемонстрировали, что процесс трансмиссии боррелий человеку от момента присасывания клеща занимает минимум 24 ч [9]. В то же время исследования в Европе показывают более быструю передачу возбудителя в течение уже нескольких часов от момента присасывания переносчика [10].

Согласно статистическим данным заболеваемость клещевой боррелиоз (КБ) за последние 5 лет устойчиво регистрируется практически во всех субъектах РФ за исключением территорий, где иксодовые клещи отсутствуют в силу климатических условий (в частности, Ненецкий и Чукотский автономные округа). Однако порядковое различие по заболеваемости КБ между некоторыми европейскими странами и РФ (например, в Германии более 200 случаев на 100 тыс. населения, а в ближайших Калининградской области и Северо-западном регионе РФ этот показатель составил лишь около 20), свидетельствует о гиподиагностике боррелиоза в нашей стране. Причинами этого могут быть как низкая обращаемость покусанных и профилактическое применение антибиотиков, так и недостаточная чувствительность применяемых диагностических тестов. Поскольку вызываемые боррелиями инфекции эффективно лечатся антибиотиками, а запоздалый диагноз может привести к серьезным осложнениям, трудно переоценить роль своевременной и точной диагностики в контроле над этим заболеванием [11-13]. Следствием же гиподиагностики может стать рост числа пациентов, обращающихся за помощью из-за осложнений, вызванных своевременно не выявленном КБ, и соответствующее повышение нагрузки на органы здравоохранения. Поэтому совершенствование диагностики КБ, в частности разработка более чувствительных и специфичных тест-систем, представляется актуальной задачей здравоохранения РФ.

Болезнь Лайма диагностируется на основании эпидемиологического анамнеза, клинической картины, а также данных лабораторных исследований. Являясь внутриклеточными паразитами, боррелии проникают в клетки ретикулогистиоцитарной системы (в том числе в макрофаги), эндотелиальные клетки различных органов и систем, что клинически проявляется развитием полиорганной патологии [14-18]. Сходство клинических симптомов между Лайм-боррелиозом и другими заболеваниями, а также вариабельность их проявлений затрудняет клиническую диагностику. Такие методы лабораторной диагностики, как непосредственное выделение боррелий в чистой культуре из пораженных тканей и биологических жидкостей больного человека и ПЦР обладают низкой чувствительностью при исследовании большинства клинических образцов, за исключением синовиальной жидкости при Лайм-артрите. В первую очередь, это связано с небольшим количеством боррелий в объеме исследуемого биологического материала, что находится за пределами порога детекции метода [19-21].

Постановка диагноза Лайм-боррелиоза основана на выявлении в сыворотке крови, цереброспинальной и синовиальной жидкостях специфических антител, направленных против диагностически значимых антигенов патогенных боррелий.

Серологическую лабораторную диагностику обычно проводят в два этапа [22-24]. Начинают со скринингового анализа (чаще это ИФА), который должен давать минимум псевдо отрицательных результатов, т.е. быть высокочувствительным и, в идеале, выявлять анти-боррелиозные IgG и/или IgM антитела во всех положительных контрольных образцах. Для этого первоначально использовали т.н. «полный антиген, цельно-клеточный антиген» (Whole-antigen extract) - фрагменты разрушенных ультразвуком (лизат) или детергентом (экстракт) клеток боррелий, выращенных на искусственных питательных средах. Результаты серологических исследований с данными антигенами в высокой степени вариативны в отношении специфичности и чувствительности. Ложноположительные серологические реакции наблюдаются у больных сифилисом, возвратным тифом, другими спирохетозами, а также при ревматических заболеваниях и при инфекционном мононуклеозе. Несмотря на некоторые недостатки, иммуноферментный метод остается наиболее перспективным для раннего выявления возбудителя болезни Лайма и контроля эффективности лечения заболевания. В настоящее время для повышения чувствительности, полноклеточные экстракты боррелий стали дополнять индивидуальными нативными или рекомбинантными (включая in vivo-синтезируемые) антигенами [25]. Однако было показано, что повышение чувствительности тест систем достигаемое за счет введения дополнительных антигенных компонентов часто ведет к снижению специфичности, особенно при анализе IgM антител. Поэтому, было предложено ввести второй этап тестирования для подтверждения положительных результатов скрининга с помощью более специфичных мультиплексных тест систем второго уровня («confirmatory tests»), с помощью которых можно одновременно выявлять антитела к различным антигенам [26, 27]. Наиболее распространенным вариантом стал иммуноблот (Вестерн блот - Western blot), в котором используется отпечаток с геля после электрофореза белков боррелий [28-30]. Отсутствие или недостаточное количество в отпечатках таких диагностически важных антигенов как in vivo экспрессирующиеся (VlsE), ранние (OspC), поздние (Р83), иммуногенные липиды, обусловили появление другого варианта иммуноблота, названного «line blot», который представляет собой стрипы из мембраны, на который нанесены линии с индивидуальными антигенами [31]. Кроме этого предпринимаются попытки использовать множество (до 15) индивидуальных специфических антигенов боррелий в мультиплексных форматах, основанных на биочиповых и Люминекс (Х-МАР) технологиях [32, 33]. Для решения задач по точному анализу гуморального иммунного ответа необходимо учитывать такие особенности иммунопатогенеза КБ, как переключение иммунного ответа в ходе инфекции с одних антигенов на другие («ранние и поздние» антигены), синтез некоторых антигенов только in vivo, (т.е. их отсутствие при культивировании микроорганизмов на искусственной питательной среде), видоспецифичность антительного ответа при боррелиозе. Из-за этих особенностей производители боррелиозных серотестов используют антиген OspC для выявления IgM на ранних стадиях и антиген VlsE для выявления IgG в поздней стадии инфекции, получают in vivo экспрессирующиеся антигены VlsE и Dbp(A) в виде рекомбинантных белков и для предотвращения псевдоотрицательных результатов, сочетают в одном тесте антигенные эпитопы из разных видов боррелий. Помимо разработки новых форматов тестов для серодиагностики проводятся исследования по молекулярному дизайну диагностически важных антигенов. В частности, получены химерные антигены состоящие из различных сочетаний антигенных детерминант рекомбинантных белков боррелий OspA, OspB, BmpA, р83, FlaA, FlaB, DbpB, VlsE, OspC, DbpA [34-36].

Одним из наиболее перспективных антигенов для серодиагностики КБ является декорин-связывающий протеин DbpA [37]. Известно, что антитела к DbpA защищают мышей от экспериментальной инфекции, а зараженные мыши проявляют выраженный гуморальный ответ к DbpA. Это обстоятельство предполагает, что антиген способен экспрессироваться in vivo. Установлено, что гипериммунная сыворотка к DbpA инактивирует боррелии, что говорит о доступности DbpA иммунной системе на протяжении всей фазы заболевания. Так же показано, что довольно легко заразить мышей, иммунизированных OspA антигеном, перелив им кровь больных мышей, в то время как при иммунизации DbpA экспериментальную боррелиозную инфекцию получить значительно труднее. В ранее опубликованных исследованиях показано, что аминокислотные последовательности DbpA В. burgdorferi sensu lato, В. Burgdorferi sensu stricto, В. afzelii, В. garinii имеют высокую степень гетерогенности структуры, что присуще практически всем антигенам возбудителя боррелиоза. Установлено, что совместное использование антигена DbpA, выделенного из трех видов боррелий существенно повышает чувствительность и иммуноферментного анализа [38]. Поскольку в Европе и РФ боррелиоз обычно вызывают В. afzelii и В. garinii [7], одним из подходов для повышения иммунологической чувствительности серологических тестов на основе DbpA является объединение иммунологически значимых эпитопов из этих двух видов боррелий. В рамках разработки усовершенствованного серологического теста для диагностики боррелиза в РФ, мы поставили задачу сконструировать новый гибридный полипептид, в котором объединены наиболее иммунологически значимые эпитопы DbpA.

Техническим результатом предполагаемого изобретения является получение нового полипептида, перспективного для разработки новой тест-системы для диагностики Лайм боррелиоза.

Технический результат достигается тем, что

- предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид DBPAG, приведенная на фиг. 2;

- сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pETdbpagNH, имеющая размер 6584 п.н., кодирующая полипептид DBPAG и состоящая из следующих элементов: репликона плазмиды pBR322, гена β-лактамазы, определяющего устойчивость к ампициллину, Т7-промотора, lac-оператора, f1-репликона и фрагмента ДНК, фланкированного сайтами для рестриктаз NdeI и HindIII, кодирующего синтез белка DBPAG, начинающегося с инициирующего кодона ATG; фиг. 1;

- предложен рекомбинантный штамм бактерий Е. coli BL21 (DE3)/pETdbpagNH - продуцент полипептида DBPAG;

- разработан способ получения рекомбинантного полипетида DBPAG при культивировании штамма Е. coli BL21 (DE3)/pETdbpagNH, причем культивируемые клетки разрушают в буферном растворе ультразвуком, а выделение полипептида происходит в одну стадию металло-хелатной хроматографии;

- предложен полипептид DBPA, продуцируемый рекомбинантным штаммом Е. coli BL21 (DE3)/pETdbpagNH, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 3, в которой объединены, иммуногенные домены белков DbpA Borrelia afzelii и Borrelia garinii.

В процессе изучения физико-химических и биологических свойств улучшенного для серодиагностики Лайм-боррелиоза рекомбинантного полипептида DBPAG, мы установили, что:

1. Молекулярная масса DBPAG-his 36,1 kD;

2. Полипептид DBPAG обладает высокой иммунохимической чувствительностью в ИФА с сыворотками крови больных боррелиозов в стадии диссеминации и поздней стадии заболевания (84.1%). Установлена его высокая специфическая активность в отношение сывороток крови здоровых доноров, пациентов с аутоиммунными заболеваниями (100, 0%) и больных сифилисом (96,7%).

Предлагается рассматривать DBPAG в качестве перспективного кандидата для разработки новой тест-системы для диагностики болезни Лайма с повышенной чувствительностью.

Предлагаемый штамм бактерий Е. coli BL21 (DE3)/pETdbpagNH характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. По этим признакам штамм-продуцент рекомбинантного белка DBPAG не отличается от исходного штамма Е. coli BL21 (DE3), не содержащего плазмиду pETdbpagNH.

Культуральные признаки. По культуральным признакам штамм-продуцент рекомбинантного белка DBPAG не отличается от исходного штамма Е. coli BL21 (DE3), не содержащего целевую плазмиду.

Устойчивость к антибиотикам.

Клетки штамма-продуцента рекомбинантного белка DBPAG проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием целевой плазмиды.

Существенным отличием штамма Е. coli BL21 (DE3)/pETdbpagNH является то, что он обеспечивает синтез полипептида DBPAG обладающего свойствами иммуногенного антигена с уровнем продукции растворимой формы целевого белка до 120 мг/л.

Штамм Е. coli BL21 (DE3)/pETdbpagNH депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-6810

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

Фиг. 1. - Схема организации рекомбинантной плазмиды pETdbpagNH, где: dbpag -клонированный фрагмент, включающий полный ген белка DBPAG; сайты эндонуклеаз рестрикции - HindIII и NdeI, использованные при создании данной конструкции; Т7 - промотор, присутствующий в рекомбинантной плазмиде; lacI - ген β-лактамазы, обеспечивающий трансформированным бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину.

Фиг. 2. Нуклеотидная последовательность гена dbpag, кодирующего синтез иммуногенного полипептида DBPAG.

Фиг 3. Аминокислотная последовательность иммуногенного полипептида DBPAG

Фиг. 4. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для конструирования рекомбинантной плазмиды pETdbpagNH, кодирующей синтез гибридного полипептида DBPAG в клетках штамма бактерий Escherichia coli BL21 (DE3)/pETdbpagNH - продуцента иммуногенного полипептида DBPAG

Фиг. 5. Иммуноблотинг препарата рекомбинантного полипептида DBPAG с пулом сывороки крови болных лайм-боррелиозом

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют подробные примеры его конкретного выполнения со ссылками на прилагаемые таблицы и рисунки.

Пример 1.

СИКВЕНС, АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ.

Для определения нуклеотидной последовательности гена dbpag используют прямой метод секвенирования рекомбинантной плазмидной ДHKpETdbpagNH. Определяют нуклеотидную последовательность открытой рамки считывания (ORF) гена dbpag. Определение нуклеотидной последовательности проводят на приборе ABI Applied Biosistems с использованием секвенирующих олигонуклеотидных праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности Т7-промотора и Т7-терминатора векторной плазмиды (фиг. 2).

На основании полученного сиквенса определяют аминокислотную последовательность белка DBPAG, используемую в дальнейшем для прогнозирования его физико-химических и биологических свойств (фиг. 3).

Пример 2.

КОСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ.

Плазмиду pETdbpagNH конструируют в результате следующих манипуляций: амплификация гена dbpaG (454 н.п.) в ПЦР на матрице суммарной ДНК штамма В. AfzeliiH13, с использованием клонирующих праймеров "Forward AZ и Reverse AZ", рестрикция ПЦР-фрагмента эндонуклеазами NdeI и HindIII, лигирование его с рестрицированной эндонуклеазами NdeI и HindIII векторной ДНК, под контроль Т7laс-промотора в векторе рЕТ32b(+), трансформация клеток реципиентного штамма; селекция на среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина (pETdbpaNH); амплификация гена dbpaG (504 н.п.) в ПЦР на матрице суммарной ДНК штамма В. garinii HI9, с использованием клонирующих праймеров "Forward GOR и Reverse GOR", рестрикция ПЦР-фрагмента эндонуклеазой HindIII, лигирование его с рестрицированной эндонуклеазой HindIII плазмидой pETdbpaNH, трансформация клеток реципиентного штамма; селекция на среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина.

Отобранные рекомбинантные клоны Е. coli проявляют максимальную продукцию белка после 3 ч индукции 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ), причем целевой белок составляет не менее 50% всех клеточных белков штамма-продуцента.

Пример 3

ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ПОЛИПЕПТИДА DBPAG ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ БОРРЕЛИОЗА

Штамм-продуцент полипептида DBPAG конструируют на основе протеазо-дефицитного штамма Е. coli BL21 (DE3) [F^- ompT hsdSe (r_B^- m_B^-) gal dcm (DE3)], несущего ген T7 РНК полимеразы под контролем ИПТГ-индуцибельного lacUV5 промотора (Novagen, США). Штамм получают в результате следующих манипуляций:

амплификации гена dbpa Borrelia afzelii методом ПЦР,

встраивания ПЦР-фрагмента в вектор рЕТ32b(+),

трансформации клеток реципиентного штамма,

амплификации гена dbpa Borrelia garinii,

встраивания ПЦР-фрагмента в рекомбинантную плазмиду pETdbpaNH,

трансформации клеток реципиентного штамма рекомбинантной плазмидой pETdbpagNH.

В качестве матриц в ПЦР используют тотальную ДНК штаммов Borrelia afzeliiH13 и Borrelia narinii H19.

Клетки E.coli BL21(DE3) трансформируют рекомбинантной плазмидой pETdbpagNH и отбирают клоны с фенотипом Ap^R на селективной среде с ампициллином (50 мкг/мл). Штамм получил название Е. coli BL21(DE3)/ pETdbpagNH.

Пример 4.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИПЕПТИДА DBPAG.

Для выделения белка DBPAG клетки Е. coli BL21 (DE3)/pET pETdbpagNH выращивают при температуре 30°С в жидкой аэрируемой среде LB с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) в лабораторном ферментере New Brunsuik Scientific с рабочим объемом 2 л до оптической плотности А600-0,6-0,8. Затем добавляют IPTG-1мM и растят еще 3-4 часа. Клеточную суспензию центрифугируют при 7000 × g в течение 10 мин и температуре 4°С.Осадок клеток можно заморозить и хранить при -20°С. Готовят колонку с Iminodiacetic acid Sepharose (Sigma), активированной Ni2+ объемом 4-5 мл. Осадок суспендируют в 20 объемах 20 мМ трис-HCl (рН 7,9) буферного раствора с 6М мочевиной. Лизис клеток проводят на льду при помощи ультразвукового дезинтегратора (Virsonic 16-850, США). Эффективность озвучивания контролируют микроскопиией, после чего центрифугируют клеточный лизат при 15000 × g в течение 25 мин. Супернатант наносят на колонку с активированной сефарозой с помощью перистальтического насоса. Скорость нанесения не более 60 мл в час. Получение целевого белка осуществляется с помощью ступенчатой хроматографии имидазолом. Для контроля выхода измеряют оптическую плотность при 280 нм. Основная часть целевого белка выходит при концентрации имидазола 500 мМ. Фракции, содержащие белок объединяют и диализуют против 10 мМ фосфатно-солевого буфера рН 7.2. Полученный препарат содержит 90% целевого белка. Препарат хранится при -20С°.

Молекулярная масса белка DBPAG-his составила по результатам электрофоретического анализа 36,1 кДа.

Проверка предложенного способа на соответствие его критерию "изобретательский уровень" показала, что ни в научной, ни в патентной литературе не выявлено совокупности признаков, указанной в отличительной части формулы изобретения.

Пример 5. ТЕСТИРОВАНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИПЕПТИДА DBPAG.

Для получения иммунохимической характеристики белка DBPAG использовали сыворотки крови людей из коллекции Референс-Центра по контролю за боррелиозом на базе ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. Панель сывороток крови включала: сыворотки крови пациентов с установленным клиническим диагнозом болезни Лайма в стадии диссеминации и поздней стадии (n-164), сыворотки крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями (n-26), сыворотки крови больных сифилисом (n-42), сыворотки крови здоровых доноров из эндемичных по боррелиозу районов (n-105), сыворотки крови здоровых доноров из неэндемичных по боррелиозу районов (n-100). Все сыворотки были охарактеризованы в коммерческих тест-системах («Anti-Borrelia-Euroline-WB» и «Anti-Borrelia plus VlsE ELISA (IgG)», Euroimmun). В качестве антигенов сравнения использовали полноклеточный ультразвуковой дезинтеграт боррелий штамма B.afzelii H13, а также рекомбинантные антигены боррелий - DbpA B.afzelii, DbpA В.garinii.

Иммунохимическую характеристику белка DBPAG исследовали с помощью методов иммуноблотинга [39, 40] и иммуноферментного анализа (ИФА) [41].

Постановку иммуноблоттинга проводили следующим образом. Белки из полиакриламидного геля электрофоретически (ТЕ70ХР, Hoefer, США) переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham, кат. №10600003) при силе тока 200 мА в течение 60 мин. Дальнейшие процедуры отмывки и инкубации мембраны с реагентами проводили при температуре 37°С на ротационном шейкере при 150 rpm (ST-3L, ELMI Ltd., Латвия). Мембрану инкубировали в растворе ФСБ, содержащем 5% обезжиренного молока (BIO-RAD, США, кат. №170-6404) в течение 40 мин. Далее проводили отмывку мембраны в течение 5 мин раствором ФСБ, содержащим 0,1% твин-20 (Sigma, Япония, кат. №194841), и инкубировали 1 час в растворе (1:100) сыворотки крови пациентов. После этапа отмывки (трижды по 5 мин) мембрану инкубировали 40 мин в растворе антител к иммуноглобулинам человека (Sigma, Япония, кат. № А8754), конъюгированных с пероксидазой хрена. После отмывки (трижды по 5 мин) мембрану помещали в раствор субстратной смеси (0,05% 3,3'диаминобензидина тетрагидрохлорид (AppliChem, Германия, кат. № А0596,0001), 0,015% перекиси водорода, 0,01 М ФСБ). Результаты регистрировали через 5-10 мин, останавливая реакцию промыванием мембраны в дистиллированной воде.

На фиг. 5 представлен результат проведенного методом иммуноблоттинга анализа очищенного препарата DBPAG. По результату иммуноблоттинга белка DBPAG с пулом сывороток крови больных боррелиозом установлена его высокая иммунохимической активность.

Постановку ИФА проводили следующим образом. Планшеты для проведения анализа (Nunc, MaxiSorp, Дания) в течение ночи при температуре 4°С сенсибилизировали раствором антигена (5 мкг/мл по белку - 0,1 мл/лунка) в 0,01 М натрий-карбонатном буфере (ПанЭко, РФ, кат. № Р076). Планшет промывали однократно с использованием автоматической системы отмывки «Проплан» (ЗАО Пикон, Россия) (объем заполнения лунок 0,25 мл) раствором ФСБ, содержащего 0,1% Твин-20. Дальнейшие процедуры инкубации планшета с реагентами проводили при температуре 37°С на ротационном шейкере при 150 rpm. Для блокирования участков неспецифической сорбции в лунки планшета приливали раствор 5% обезжиренного молока в ФСБ и инкубировали в течение часа. После трехкратной промывки планшет инкубировали 1 час с разведениями (1: 200) сывороток крови пациентов в объеме 0,1 мл/лунка. Каждый образец сыворотки вносили в трех повторах. Отмытый планшет инкубировали в течение 30 мин в растворе рабочего разведения антител к иммуноглобулинам, конъюгированных с пероксидазой хрена (0,1 мл/лунка). После четырехкратной отмывки в лунки планшета добавляли 0,1 мл свежеприготовленного субстратного раствора (0,2 мг/мл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, 0,0% перекиси водорода). Ферментативную реакцию останавливали после развития окраски (через 15 мин) добавлением в лунки планшета 0,05 мл 1 М серной кислоты и регистрировали оптическую плотность раствора при длине волны 492 нм с помощью планшетного фотометра (Униплан, ЗАО Пикон, Россия). Определение Cut-off проводили суммированием усредненного показателя OD в лунках с пятью образцов сывороток крови здоровых доноров из неэндемичного по боррелиозу района (Астраханская область) и трех стандартных отклонений измерения OD. Показатели OD для индивидуальных образцов сывороток в трех повторах не варьировали более, чем на 5,0%.

В результате проведенных исследований установлена высокая иммунохимическая активность белка DBPAG.

В таблицах 1 и 2 представлены результаты исследования чувствительности и специфичности антигенов боррелий в ИФА.

Таким образом, по результатам проведенного тестирования иммунохимической активности полученного белка DBPAG методом ИФА, установлено, что полученный рекомбинантный полипептид DBPAG обладает высокой чувствительностью в ИФА с сыворотками крови больных боррелиозов в стадии диссеминации и поздней стадии заболевания (84.1%). Установлена его высокая специфическая активность в отношение сывороток крови здоровых доноров, пациентов с аутоиммунными заболеваниями (100,0%) и больных сифилисом (96,7%).

Сконструирован продуцент улучшенного иммуногенного полипептида DBPAG, пригодный для получения препаративных количеств антигена для использования в составе тест-системы для определения антител в крови больных клещевым боррелиозом.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Baranton et al., 1992 Baranton G., De Martino S.J. Borrelia burgdorferi sensu lato diversity and its influence on pathogenicity in human // Curr. Probl. Dermatol. 2009. 37. 1-17.

2. Stanek G., Reiter M. The expanding Lyme Borrelia complex - clinical signifi cance of genomic species? // Clin. Microbiol. Infect. 2011. 17. (4). 487-493.

3. Wang G, Alje P, van Dam AP, Schwarz I, Dankert J (1999) Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin Microb Rev 12 (4): 633-653.

4. Morshed MG, Scott JD, Fernando K, Geddes G, McNabb A, Mak S, Durden LA (2006) Distribution and characterization of Borrelia burgdorferi isolates from Ixodes scapularis and presence in mammalian hosts in Ontario, Canada. J Med Entomol 43 (4): 762

5. Burgdorfer W, Anderson JF, Gern L, Lane RS, Piesman J, Spielman A (1991) Relationship of Borrelia burgdorferi to its arthropod vectors. Scand J Infect Dis Suppl 77: 35-40.

6. Postic D., Korenberg E., Gorelova N. Et al. Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia and neighbouring countries: high incidence of mixed isolates // Res. Microbiol. 1997. 148. 691-702.

7. Коренберг Э.И., Горелова Н.Б., Ковалевский Ю.В. Основные черты природной очаговости иксодовых клещевых боррелиозов в России // Паразитология. - 2002. - №36 (3). - С. 177-187.

8. Mead P.S. (2015).Epidemiology of Lyme Disease // Infectious Disease Clinics of North America. - vol. 29. no 2: 187-210.

9. Des Vignes F., Piesman J., Heff ernan R., Schulze T.L., Stafford K.C., Fish D. (2001) Effect of tick removal on transmission of Borrelia burgdorferi and Ehrlichia phagocytophila by Ixodes scapularis nymphs II The Journal of Infectious Diseases, vol. 183, no 5, pp. 773-778.

10. Hynote E.D., Mervine P.C., Strieker R.B. (2012) Clinical evidence for rapid transmission of Lyme disease following a tickbite. Diagnostic microbiology and infectious disease, vol. 72, no 2, pp. 188-192.

11. Hu LT (2012) In the clinic. Lyme disease. Ann Intern Med 157: 2-16.

12. Stanek G, Fingerle V, Hunfeld KP, Jaulhac B, Kaiser R, et al. (2011) Lyme borreliosis: clinical case definitions for diagnosis and management in Europe. Clin Microbiol Infect 17: 69-79.

13. Stanek G, Wormser GP, Gray J, Strle F (2012) Lyme borreliosis. Lancet 379: 461-473.

14. Nadelman R.B. (2015) Erythema Migrans. Infectious Disease Clinics of North America, vol. 29, no 2, pp. 211-239.

15. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2013) Three sudden cardiac deaths associated with Lyme carditis - United States, November 2012 - July 2013. MMWR. Morbidity and mortality weekly report, vol. 62, no 49, pp. 993-996.

16. Hildenbrand P., Craven D.E., Jones R., Nemeskal P. (2009) Lyme neuroborreliosis: manifestations of a rapidly emerging zoonosis. AJNR. American journal of neuroradiology, vol. 30, no 6, pp. 1079-1087.

17. Halperin J.J. (2011) Neurologic manifestations of lyme disease. Current Infectious Disease Reports, vol. 13, no 4, pp. 360-366.

18. Halperin J.J. (2015) Chronic Lyme disease: misconceptions and challenges for patient management. Infection and Drug Resistance, vol. 8, pp. 119-128.

19. Brettschneider S., Bruckbauer H., Klugbauer N., Hofmann H. (1998) Diagnostic value of PCR for detection of Borrelia burgdorferi in skin biopsy and urine samples from patients with skin borreliosis. Journal of clinical microbiology, vol. 36, no 9, pp. 2658-2665.

20. Nocton J.J., Dressler F., Rutledge B.J., Rys P.N., Persing D.H., Steere A.C. (1994) Detection of Borrelia burgdorferi DNA by polymerase chain reaction in synovial fl uid from patients with Lyme arthritis. The New England journal of medicine, vol. 330, no 4, pp. 229-234.

21. Nocton J.J., Bloom B.J., Rutledge B.J., Persing D.H., Logigian E.L., Schmid C.H., Steere A.C. (1996) Detection of Borrelia burgdorferi DNA by polymerase chain reaction in cerebrospinal fluid in Lyme neuroborreliosis. The Journal of infectious diseases, vol. 174, no 3, pp. 623-627.

22. Wormser G.P., Dattwyler R.J., Shapiro E.D., Halperin J.J., Steere A.C, Klempner M.S., Krause P.J. (2006) The clinical assessment, treatment, and prevention of lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases: an offi cial publication of the Infectious Diseases Society of America, vol. 43, no 9, pp. 1089-1134.

23. Steere A.C, McHugh G., Damle N., Sikand V.K. (2008) Prospective study of serologic tests for Lyme disease. Clinical infectious diseases: an offi cial publication of the Infectious Diseases Society of America, vol. 47, no 2, pp. 188-195.

24. O.A. Конева, Л.П. Ананьева, E.B. Баранова, A.B. Штанников, С.И. Евсегнеев. Изучение динамики антиборрелиозного ответа методом иммуноблот у больных с поражением опорно-двигательного аппарата при болезни Лайма. / «Новое в диагностике и лечении ревматических заболеваний»: Материалы научно-практической конференции ревматологов. - 2002. - №4. -С. 99.

25. Т. Hans-Iko Huppertz, I. Seppala, H. Sillanpa, H. Saxen, and P. Lahdenne Recombinant or Peptide Antigens in the Serology of Lyme Arthritis in Children // The Journal of Infectious Diseases 2003; 187: 1888-94.

26. Brouqui P, Bacellar F, Baranton G, Birtles RJ, Bjoersdorff A, et al. (2004) Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe. Clin Microbiol Infect 10: 1108-1132.

27. Wilske B, Fingerle V, Schulte-Spechtel U (2007) Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunol Med Microbiol 49: 13-21.

28. Ang CW, Notermans DW, Hommes M, Simoons-Smit AM, Herremans T (2011) Large differences between test strategies for the detection of anti-Borrelia antibodies are revealed by comparing eight ELISAs and five immunoblots. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 30: 1027-1032.

29. Hauser U, Lehnert G, Lobentanzer R, Wilske В (1997) Interpretation criteria for standardized Western blots for three European species of Borrelia burgdorferi sensu lato. J Clin Microbiol 35: 1433-1444.

30. Hunfeld KP, Kraiczy P (2009) When is the best time to order a Western blot and how should it be interpreted? Curr Probl Dermatol 37: 167-177.

31. Goettner G, Schulte-Spechtel U, Hillermann R, Liegl G, Wilske B, et al. (2005) Improvement of Lyme borreliosis serodiagnosis by a newly developed recombinant immunoglobulin G (IgG) and IgM line immunoblot assay and addition of VlsE and DbpA homologues. J Clin Microbiol 43: 3602-3609.

32. Gerritzen A, Brandt S (2012) Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods 56: 477-483.

33. Porwancher RB, Hagerty CG, Fan J, Landsberg L, Johnson В J, et al. (2011) Multiplex immunoassay for Lyme disease using VlsE1-IgG and рерС10-IgM antibodies: improving test performance through bioinformatics. Clin Vaccine Immunol 18: 851-859.

34. Беклемишев А.Б., Рябченко A.B., Караваев B.C. Рекомбинантные химерные полипептиды, несущие эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato и способ диагностики иксодового клещевого боррелиоза. // Патент RU №2514230, опубликован 03.03.2014.

35. Leve, Lionel, Mezhan-Leturnel, Odil. Chimeric Protein used for Lyme-Borreliosis Diagnostics. // Патент RU №2546246, опубликован 10.04.2015.

36. Leve, Lionel, Mezhan-Leturnel, Odil. Borrelia hybrid protein, nucleic acid coding this protein, expressing cartridge, vector, method and kit for diagnosing lyme borreliosis, vaccine for borreliosis prevention. // Патент RU №2549698, опубликован 27.04.2015.

37. D.R. Cassat, N.K. Patel, N.D. UlbrantT, M.S. Hason DbpA, but Not OspA, Is Expressed by Borrelia burgdorferi during Spirochetemia and Is a Target for Protective Antibodies // Inf.and Imm., Nov. 1998, p. 5379-5387 Vol. 66, No. 11.

38. Heikkila Т., Seppala I., Saxen H., Panelius J., Yrjanainen H., Lahdenne P. Species-specific serodiagnosis of Lyme arthritis and neuroborreliosis due to Borrelia burgdorferi sensu stricto, B.afzelii, and B.garinii by using decorin binding protein A // J. Clin. Microbiol. - 2002. - V. 40. - P. 453-460.

39. Renner, S.W. Immunoblotting and dot immunobinding. Emerging techniques in protein immunochemistri // Arch. Pathol. Lab. Med. - 1988. - Vol. 112. - P. 780-786.

40. Towbin, H. Immunoblotting and dot immunoblotting - current status and outlook / H. Towbin, J. Gordon // J. Immunol. Methods. - 1984. - Vol. 72. - P. 313-340.

41. Егоров A. M., Осипов А. П., Дзантиев Б.Б и др. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Высш. шк., 1991, 288 с.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению иммуногенного полипептида, обеспечивающего формирование иммунного ответа против инфекции, вызываемой спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato, и может быть использовано для серодиагностики клещевого боррелиоза. Рекомбинантным путем в клетках штамма бактерий Е. coli BL21(DE3)/pETdbpagNH получен слитый полипептид DBPAG, состоящий из иммуногенных доменов белков DBPA Borrelia garinii и Borrelia afzelii. Изобретение обеспечивает получение нового полипептида, перспективного для разработки новой тест-системы для диагностики Лайм боррелиоза. 5 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Нуклеиновая кислота, кодирующая слитный полипептид DBPAG, состоящий из иммуногенных доменов белков DBPA Borrelia garinii и Borrelia afzelii, нуклеотидная последовательность которой приведена в SEQ ID NO: 1.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pETdbpagNH, имеющая размер 6584 п. н., предназначенная для трансформации клетки Е. coli BL21(DE3) и состоящая из следующих элементов: репликон плазмиды pBR322, ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину, Т7-промотор, las-оператор, f1-репликон, фрагмент ДНК, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 1, фланкированный сайтами для рестриктаз NdeI и HindIII, кодирующий синтез слитого иммуногенного белка DBPAG, начинающегося с инициирующего кодона ATG.

3. Рекомбинантный штамм бактерий Е. coli BL21(DE3)/ pETdbpagNH - продуцент слитного полипептида DBPAG, состоящего из иммуногенных доменов белков DBPA Borrelia garinii и Borrelia afzelii, полученный путем трансформации клеток Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой ДНК pETdbpagNH по п. 2.

4. Слитый иммуногенный полипептид DBPAG с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, состоящий из иммуногенных доменов белков DBPA Borrelia garinii и Borrelia afzelii, продуцируемый рекомбинантным штаммом Е. coli BL21(DE3)/pETdbpagNH по п. 3.

5. Способ получения рекомбинантного слитого полипептида DBPAG по п. 4 путем культивирования рекомбинантного штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)/pETdbpagNH по п. 3, разрушением культивируемых клеток в буферном растворе ультразвуком и выделением целевого полипептида в одну стадию с использованием металло-хелатной хроматографии.