СРЕДСТВО ДЛЯ РАННЕГО ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННЫХ И КОМБИНИРОВАННЫХ РАДИАЦИОННО-ТЕРМИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЙ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/74 

Изобретение относится к медицине, в частности к радиационной медицине и микробиологической технологии, и касается препаратов для лечения радиационных поражений, в том числе комбинированных радиационно-термических поражений (КРТП).

Как известно, острая лучевая болезнь (ОЛБ), развивающаяся в результате воздействия на организм высоких доз ионизирующей радиации, представляет собой реальную угрозу для жизни пострадавших. Особенно неблагоприятным исходом характеризуются комбинированные радиационно-термические и радиационно-механические поражения: даже сравнительно "легкие" травмы и ожоги, не представляющие сами по себе опасности для жизни, существенно отягощают клиническое течение костно-мозговой формы ОЛБ и повышают вероятность гибели от токсико-инфекционных осложнений.

Одним из перспективных направлений совершенствования медицинской защиты от облучения является разработка и внедрение в практику так называемых "средств раннего лечения" острых радиационных поражений - препаратов, способствующих повышению выживаемости при их однократном введении непосредственно после облучения или в течение первых нескольких часов после воздействия ионизирующей радиации (т.е. задолго до развития основных проявлений повреждения "критических" радиочувствительных систем организма).

Потребность в таких средствах неизмеримо возрастает в случае крупномасштабных радиационных аварий и катастроф мирного времени, а также при ведении боевых действий с применением ядерного оружия, поскольку в подобных ситуациях (при дефиците медицинских сил и средств) резко снижается возможность своевременного оказания в полном объеме квалифицированной и специализированной медицинской помощи каждому из нуждающихся в ней пострадавших.

В арсенале средств раннего лечения ОЛБ известны микробные и дрожжевые полисахариды и пептидогликаны, интерлейкины, иммуномодуляторы и другие модификаторы биологических реакций. Однако большинство из них повышает выживаемость облученных подопытных животных не более чем на 25 - 45%. Причем даже наиболее эффективные средства раннего лечения ОЛБ оказывают значительно менее выраженное лечебное действие при комбинированных радиационных поражениях.

Согласно собственным наблюдениям авторов эффективность известных препаратов бактериальной природы и дрожжевых полисахаридов при комбинированных радиационно-термических поражениях (КРТП) по показателю 30-суточной выживаемости находится в пределах от 15 до 35%.

Наиболее близок к заявляемому препарат, изготовленный в Японии из культуры лактобацилл вида Lactobacillus casei, сведения о котором опубликованы в 1991 г. Препарат представляет собой лиофилизированную культуру L. casei, которую инактивируют прогреванием при 100^oC в течение 30 минут, затем разводят физиологическим раствором до плотности 1 - 10 мг/мл и вводят мышам по 0,1 мл подкожно однократно через 10 мин после облучения. Применение препарата обеспечивает повышение 30-суточной выживаемости облученных животных по сравнению с группой нелеченых до 50% и более в зависимости от дозы облучения. Данные об эффективности этого препарата при КРТП не приведено. Таким образом, изыскание средств раннего лечения КРТП является актуальной задачей современной медицины.

Цель изобретения - создать препарат для раннего лечения радиационных поражений, в том числе наиболее тяжелой формы радиационных поражений - КРТП.

С этой целью предлагается средство, представляющее собой убитые микробные клетки лактобацилл и продукты их метаболизма в среде культивирования, полученные при инактивации консорциума штаммов Lactobacillus acidophilus NN100аш, NK₁ и К₃Ш₂₄, взятых в соотношении 1:1:1 при содержании 10⁷ - 10⁸ живых микробных клеток в 1 мл ростовой среды.

Заявляемый препарат получают следующим образом.

Культуры производственных штаммов L. asidophilus 100аш, L. asidophilus NK₁ и L. asidophilus К₃Ш₂₄ выращивают раздельно на молоке при 37^oC в течение 16 - 18 ч на протяжении трех последовательных пассажей. Из молочных культур 3-его пассажа готовят смесь, соединяя их в соотношении 1:1:1. Полученную смесь засевают в среду культивирования в объеме 5% и инкубируют при 37^oC в течение 12 - 14 ч. Выращенную трехкомпонентную культуру с содержанием 10⁷ - 10⁸ живых микробных клеток на 1 мл ростовой среды подвергают коррекции кислотности при помощи 5%-ного раствора аммиака до значений pH 6,8 - 7,0, после чего инактивируют. Инактивированную биомассу контролируют на отсутствие сохранивших жизнеспособность микробных клеток производственных штаммов и стерильность. По окончании контроля препарат используют в нативном виде или после лиофилизации для лечения экспериментальных животных, получивших острые радиационные поражения.

Эффективность заявляемого препарата была изучена в опытах на мышах-гибридах (F₁(CBA • C57B16) массой тела 22 - 24 г при лечении КРТП, как одной из наиболее тяжелых форм острых радиационных поражений. Животных подвергали общему однократному гамма-облучению в дозе 7 Гр и непосредственно после облучения наносили им стандартизированный по площади и глубине термический ожог кожи спины III-Б степени 10% поверхности тела, т.е. использовали адекватную модель для воспроизведения клиники КРТП.

Сразу после моделирования КРТП мышам вводили заявляемый препарат подкожно в левую паховую область в объеме 0,1 мл. Животным контрольной группы с КРТП вводили такой же объем физ. раствора. Способ приготовления, схема и доза введения препарата были одинаковы во всех вариантах постановки опытов.

Об эффективности препарата судили по выживаемости животных в течение месяца после моделирования КРТП, что является общепринятым интегральным критерием оценки терапевтического действия средств, предназначенных для лечения острых радиационных поражений у мелких лабораторных животных. Наряду с этим учитывали ряд частных показателей, дополняющих характеристику положительного влияния препарата на облученный организм.

Пример. В эксперименте на 60 мышах (по 30 в контроле и опыте) было установлено, что при однократном введении препарата 30-суточная выживаемость составляет 80%, а без его применения находится на уровне 27% (см. чертеж). При уменьшении дозы вводимого препарата в 2 и 5 раз (путем разведения его физ. раствором) лечебный эффект практически не снижался: в первом случае из 10 мышей выжило 8, а во втором - из 20 выжило 14.

Таким образом, заявляемый препарат оказывает выраженное терапевтическое действие и существенно улучшает исход тяжелой формы радиационно-термических поражений. Это определяет его перспективность для применения в качестве средства раннего (догоспитального) лечения таких поражений.

Наряду с повышением 30-суточной выживаемости подопытных животных лечебное действие заявляемого препарата проявлялось в коррекции развивающейся при КРТП эндогенной кишечной инфекции. Для выявления этого свойства через 9 суток после моделирования КРТП (в периоде разгара ОЛБ и манифестации аутоинфекции) исследовали микрофлору тонкого кишечника, учитывая частоту выделения и количество микроорганизмов условно-патогенной группы, определяющих развитие опасных для жизни токсико-инфекционных осложнений. В качестве контроля были использованы мыши с КРТП без лечения, а также интактные (биоконтроль для определения показателей нормы).

Было установлено, что у интактных мышей (n = 20) из материала тощей и подвздошной кишки с частотой 100% высевается стафилококк в количестве соответственно 2,83 ± 0,05 и 3,03 ± 0,09 (lg M ± m) на грамм ткани, а кишечную палочку, энтеробактер и энтерококки обнаружить не удается.

В контроле у нелеченых мышей с КРТП (n = 16) показатель высеваемости всех четырех названных видов микроорганизмов составлял практически 100% в обоих отделах тонкой кишки. При этом количественные показатели концентрации стафилококка на грамм ткани достигали 5,48 ± 0,03 для тощей кишки и 6,24 ± 0,10 - для подвздошной кишки; кишечная палочка, энтеробактер и энтерококки были обнаружены в концентрациях 4,67 ± 0,14, 3,86 ± 0,06, 4,56 ± 0,04 из материала тощей кишки и 5,70 ± 0,06, 5,37 ± 0,04, 5,02 ± 0,05 - из материала подвздошной.

В группе мышей с КРТП, получавших заявляемый препарат (n = 18), частота выделения стафилококка составляла 11% при концентрации 4,83 из материала тощей кишки и 89% при концентрации 4,73 ± 0,13 - из подвздошной. Кишечная палочка, энтеробактер и энтерококки высевались с частотой соответственно 33%, 22%, 89% в количестве 3,69 ± 0,24, 3,47 ± 0,29, 4,66 ± 0,15 из материала тощей кишки и с частотой соответственно 39%, 16%, 100% в количестве 4,37 ± 0,13, 5,61 ± 0,13, 5,44 ± 0,16 - из подвздошной.

Как показали полученные данные, введение заявляемого препарата способствовало статистически достоверному снижению частоты выделения из обоих отделов тонкой кишки кишечной палочки и энтеробактера, а также уменьшению среднего содержания кишечной палочки и стафилококка на 1 г ткани подвздошной кишки. Таким образом, однократное парентеральное введение препарата животным с тяжелой формой радиационно-термического поражения в значительном проценте случаев предотвращает колонизацию тонкого кишечника условно-патогенными грамотрицательными микробами и тем самым способствует эффективной профилактике аутоинфекционных осложнений КРТП.

В экспериментах по моделированию КРТП с облучением в дозе 4 Гр (при которой гибели животных не наблюдается) было изучено влияние заявляемого препарата на резистентность животных к экзогенной раневой инфекции. Для этого сразу после моделирования КРТП 20 мышам под ожоговую поверхность инокулировали микробную культуру Ps. aeruginosa (1 млрд. микр. клеток в объеме 0,5 мл). Об эффективности препарата судили по выживаемости животных в течение первых 10 суток после инфицирования. Было установлено, что средняя продолжительность жизни павших мышей в контрольной группе (n = 10) составила 2,9 ± 0,64 суток, а в группе получавших препарат (n = 10) - 4,8 ± 1,11 суток. Количество выживших мышей среди получавших препарат оказалось втрое больше (6 особей), чем в контроле (2 особи).

Таким образом, введение заявляемого препарата существенно повышало резистентность животных с КРТП к экзогенной инфекции. Его следует расценивать как эффективное средство контроля за развитием раневой инфекции у животных с КРТП, характеризующимся сниженным уровнем противоинфекционной защиты.

При моделировании КРТП с облучением в дозе 4 Гр были изучены гематологические показатели в различные сроки после КРТП с применением заявляемого препарата у 80 мышей. Установлено, что однократное введение препарата статистически значимо предотвращает критическое снижение количества лейкоцитов в периферической крови на 5-е сутки после КРТП (в периоде разгара пострадиационной лейкопении). Более высокий уровень числа лейкоцитов в крови леченых животных обеспечивается, главным образом, за счет сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов. Количество клеток костного мозга бедренной кости через 5 сут после КРТП у леченых животных составляет 7,1 ± 0,20 млн. (в контроле - 4,1 ± 0,22 млн. ), а через 20 сут - 16,3 ± 0,58 млн. (в контроле - 12,7 ± 0,75): различия между сравниваемыми группами статистически достоверны (P < 0,05).

Таким образом, однократное введение препарата обеспечивает поддержание минимально необходимого уровня клеток крови, обладающих фагоцитарными свойствами, что может иметь существенное значение в защите организма от пострадиационных инфекционных осложнений. Кроме того, препарат оказывает положительное модифицирующее влияние на численность миелокариоцитов.

Заключение. Результаты всестороннего изучения заявляемого препарата на адекватной модели КРТП свидетельствуют о его выраженном защитном (лечебном) эффекте, который определяется как интегральным показателем - повышением уровня 30-суточной выживаемости подопытных животных до 80%, так и повышением резистентности организма к экзогенной инфекции (Ps. aeruginosa), коррегирующим влиянием на развитие постлучевого дисбактериоза, общую клеточность костного мозга и количество лейкоцитов периферической крови (сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов).

Изобретение относится к медицине, в частности к радиационной медицине и микробиологической технологии, и касается препаратов для лечения радиационных поражений, в том числе комбинированных радиационно-термических поражений, в том числе для раннего лечения. Средство представляет собой убитые микробные клетки лактобацилл и продукты их метаболизма в среде культивирования, полученные при инактивации консорциума штаммов Lactobacillus acidophilus NN 100AШ, NK₁ и K₃Ш₂₄, взятых соотношении 1 : 1 : 1 при содержании 10⁷-10⁸ живых микробных клеток в 1 мл ростовой среды. Препарат улучшает исход тяжелой формы радиационно-термических поражений. 1 ил.

Средство для раннего лечения радиационных и комбинированных радиационно-термических поражений, включающее убитые лактобациллы, отличающееся тем, что оно представляет собой микробные клетки и продукты их метаболизма в среде культивирования, полученные при инактивации консорциума штаммов Lactobacillus acidophilus NN 100 Аш, NK₁ и К₃ Ш₂₄, взятых в соотношении 1 : 1 : 1 при содержании 10⁷ - 10⁸ живых микробных клеток в 1 мл ростовой среды.