СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА Российский патент 2004 года по МПК A61K39/108 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности, к производству и использованию биопрепаратов, предназначенных для специфической профилактики радиационных поражений организма.

Известен способ специфической профилактики радиационных поражений организма и способ получения препарата для специфической профилактики радиационных поражений организма путем подкожного введения тканевого антигена от облученных животных за 15-30 сут до облучения (см. Патент РФ №2145877, МПК А 61 К 39/00, 41/00 за 2000 г.).

Недостатком этого способа является реактогенность радиозащитного препарата, обусловленная наличием в составе тканевых антигенов-цитотоксинов, которые будучи введенными в организм за 5-10 дней до облучения оказывают обратный эффект, уменьшая процент выживаемости облученных животных. Другим существенным недостатком способа является использование в качестве технологического сырья дорогостоящего материала - органов и тканей лабораторных или сельскохозяйственных животных, что ведет к существенному увеличению себестоимости конечного продукта. Кроме того, тканевые препараты от животных, являясь слабыми антигенами, не могут обеспечить длительную и напряженную радиорезистентность организма, поскольку, будучи тимуснезависимыми, быстро элиминируются из организма, прекращая радиозащитный эффект.

Задачей изобретения является снижение реактогенности препарата, повышение его противолучевой эффективности для специфической профилактики радиационных поражений организма, увеличение срока радиозащитного действия (пролонгирование), удешевление способа, снижение иммунизирующей дозы препарата и повышение производительности труда.

Поставленная задача решается тем, что способ специфической профилактики радиационных поражений организма, предусматривающий введение в организм антигенсодержащего биологического препарата, в качестве антигенсодержащего биологического препарата используют бактериальный антигенный комплекс, состоящий из протективного антигена, анатоксина и радиотоксина -E.coli “ПЛ-6”, который вводят однократно подкожно в дозах 0,09-0,10 мг на 1 кг живой массы за 5-90 суток до облучения.

Препарат для профилактики радиационных поражений организма получают путем предварительного приготовления каждого в отдельности, сначала протективный антиген, анатоксин и радиотоксин, затем составляют бактериальный антигенный комплекс протективного антигена, анатоксина и радиотоксина при их массовом соотношении 90:5:5 соответственно, а содержание белка в комплексе доводят до 1,75-1,92 мг/мл.

Препарат для профилактики радиационных поражений организма получают от облученного энтеротоксигенного штамма E.coli, который выращивают на оптимальной для токсинообразования питательной среде (бульон Хоттингера или специальная среда по а.с. СССР №1682394, 1997 г.) с последующим переводом энтеротоксина в анатоксин; получения микробного радиотоксина облучением эшерихиозной суспензии на гамма-установке в дозе 140-150 Гр с последующим инкубированием облученной культуры в течение 4 ч при 37°С; получения эшерихиозного протективного антигена путем добавления к микробной взвеси гексаметилентетрамина до конечной концентрации 10%, инкубирования смеси в течение 7 дней при 36-37°С с последующим выдерживанием смеси в течение 30-40 дней для полного снижения токсигенности микробной культуры.

Технология получения препарата для профилактики радиационных поражений животных состоит из 4 этапов.

На первом этапе получают эшерихиозный анатоксин (ЭАТ). Для его получения энтеропатогенный штамм E.coli (например, штамм “ПЛ-6”) засевают в двухлитровые колбы со средой Хоттингера (рН 7,8) или (предпочтительнее) специальной средой, состоящей из 2,5-3,5 мас.% питательного агара, 0,5-1,5 мас.% пептона, 0,008-0,1 мас.%, 1,4 бензохинон гуанилгидразонтиосемикарбазона (см. а.с. СССР №1682394), выращивают 5-7 дней при температуре 37°С. Затем к культуре добавляют гексаметилентетрамин до конечной концентрации 10% или формалина до 0,4-0,5%-ной концентрации и термостатируют при 37°С в течение 10-12 дней. Полученный анатоксин осаждают 10%-ным стерильным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем. После отстаивания анатоксина в течение 2-3 дней надосадочную жидкость декантируют, осадок в виде геля используют как анатоксин (AT).

На втором этапе технологического цикла получают микробный радиотоксин (РТ). Для получения РТ штамма Е/соli (“ПЛ-6”) высевают на полноценную твердую питательную среду (бактопептон 0,8%, хлорид натрия 0,5%, агар 0,5%) и выращивают в аэробных условиях в течение 48 ч. Затем биомассу смывают физиологическим раствором, центрифугируют при 8000 об/мин, повторяя эту процедуру трехкратно. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе в концентрации 1,2·10¹⁰ м.к./см³ и используют для выделения РТ. Для этой цели микробную суспензию с указанной концентрацией облучают на гамма-установке в дозе 140-150 Гр с последующим термостатированием в течение 3,5-4,5 ч при 36-37°С. Затем проводят экстрагирование радиотоксина в 70% подкисленном (0,05% НС1) до рН 5,5 этаноле до полной экстракции. Экстрагирование проводят 3-кратно. Полученный экстракт упаривают на роторном испарителе при 20°С до исходного объема и нейтрализуют 0,1н. КОН до рН 6,5-7,0. Полученный раствор РТ разводят физиологическим раствором в 4 раза и используют в работе в качестве радиотоксина.

На третьей стадии получают эшерихозный протективный антиген. Для этой цели энтеротоксигенный штамм E.coli “ПЛ-6” выращивают 24 ч на МПА при 36-37°С, смывают 0,25%-ным стерильным раствором хлорида натрия, готовят микробную суспензию в концентрации 1,2·10¹⁰ м.к./см³ по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Культуру проверяют на чистоту, морфологическую и серологическую типичность в соответствии с общепринятыми методами. К микробной взвеси, имеющей вышеуказанную концентрацию, добавляют сухой порошок гексаметилентитерамина до конечной концентрации 10% (или формалина до 0,4-0,5%), перемешивают на автоматической мешалке в течение 45-55 мин при 150-170 качаний/мин. Смесь выдерживают при 36-37°С в течение 6,5-7,5 дней до полного снижения токсичности эшерихиозной микробной взвеси (30-40 дней). Инактивированная микробная взвесь, разведенная 0,2 М раствором хлорида натрия до концентрации 30 млрд/см³, представляет собой эшерихиозный протективный антиген (ПА).

На четвертом этапе технологического цикла составляют трехвалентную композицию антигенов на основе эшерихиозного протективного антигена (ПА), анатоксина (AT) и радиотоксина (РТ). Для этой цели к 30 миллиардной суспензии протективного антигена (ПА) добавляют анатоксин (AT) и радитоксин (РТ) в соотношениях, мас.% 90:5:5 соответственно на 100 см³ радиопротективного препарата. К этой смеси добавляют 6% геля гидроокиси алюминия - 10 см³ на 100 см³ радиопротективного препарата. Проверяют чистоту, стерильность и безвредность препарата общепринятым методом (см. кн. Руководство по вакцинному и сывороточному делу/Под ред. П.Н.Бургасова. - М.: Медицина, 1978, 439 с.), определяют содержание белка биуретовым методом (см. кн. Экспериментальная иммунология./Под ред. П.Н. Холчева. - М.: Медицина, 1968, 665с.), доводят путем разведения в фосфатно-буферном растворе (рН 7,2-7,4) до оптимальной концентрации - 1,75-1,92 мг белка в 1 мл.

Фасуют готовый протективный антиген (иммуноген-вакцину) в условиях бокса в стерильные стеклянные флаконы емкостью 100 см³, закрывают резиновыми пробками, заливают сургучом и этикетируют.

Контроль вакцины на стерильность, безвредность и иммунологическую активность осуществляют по общепринятой методике (Экспериментальная иммунология, 1968). Срок хранения иммуногена (протективного антигена) при 2-6°С до 1,5 года.

Способ профилактики радиационных поражений организма и способ получения препарата для его осуществления иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Для получения эшерихиозного протективного антигена с высокой серологической активностью использовали энтеротоксигенные штаммы E.coli (К-88, ПЛ-6, А-09 и O-35), которые выращивали на МПА 24, 48, 72 ч при температуре 36-37 и 38°С, готовили суспензии в концентрациях 60, 100, 120, 130 и т.д. млрд м.к./см³, добавляли сухой порошок гексаметилентетрамина до конечной концентрации 5, 10, 15%, перемешивали на мешалке 20, 30, 60, 90 мин при 100, 130, 160, 170, 180 качаний/мин, выдерживали при 35, 36, 37, 38°С в течение 3, 5, 7, 10 дней при температуре 2, 3, 4, 5, 6°С в течение 10, 20, 30, 40, 50, 60 дней, затем инактивированную взвесь разводили 0,2М раствором хлорида натрия до концентрации 10, 20, 30, 40, 50 млрд м.к./см³. В полученных протективных антигенах определяли концентрацию микробных клеток в 1 см³, содержание аминного азота по Къелдалю и серологическую активность антигенов в реакции агглютинации (РА) с агглютинирующими сыворотками.

Результаты опытов показали, что наибольший выход антигенного материала (0,32 мг/мл аминного азота) с наибольшей серологической активностью (титры антигена в РА - 1:128-1:256) получали при выращивании энтеротоксигенного штамма E.coli “ПЛ-6” на МПА в течение 24 ч при 37°С, который обеспечивал максимальный выход микробных клеток. Установлено, что максимальный выход протективного антигена (ПА) достигается при концентрации микробной суспензии 120 млрд м.к./см³, добавлении гексаметилентетрамина в концентрации 10%, перемешивании на мешалке при 160-170 качаний/мин, выдерживании 6-7 дней при температуре 36-37°С. Полная инактивация микробной взвеси наступает за 30-40 дней при концентрации микробов 25-35 млрд м.к./см³.

Пример 2. Для получения эшерихиозного анатоксина (AT) энтеротоксигенный штамм E.coli “ПЛ-6” засевали в двухлитровые колбы со средой Хоттингера (рН 7,8) и специальной питательной средой состава, мас.%: гидролизат казеина - 20, сыворотка крови - 20, раствор Хенкса - 40 и МПБ - 20 (рН 7,8), выращивали в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 дней при температуре 35, 36, 37, 38, 39°С. Затем к культуре добавляли гексаметилентетрамин в концентрациях 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14% (или формалин до концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 0,6 и 0,7%), выдерживали в термостате при 35, 36, 37, 38°С в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 дней. Полученный анатоксин осаждали 5, 7, 9, 10, 12, 14%-ным стерильным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 0,5, 0,7, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2% на весь объем. После отстаивания анатоксина в течение 1, 2, 3, 4, 5 дней надосадочную жидкость декантировали. Полученный осадок в виде геля использовали как анатоксин (AT).

Результаты опытов по определению серологической активности полученных образцов анатоксинов (AT) в РНГА с антитоксическими диагностикумами показали, что стабильную наибольшую серологическую активность проявлял анатоксин, полученный из штамма “ПЛ-6”, выращенного на специальной среде в течение 5-7 дней при температуре 37°С, при добавлении к культуре гексаметилентетрамина до конечной концентрации 10% и последующим термостатировании при 37°С 10-12 дней, осаждении 10%-ным стерильным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем и отстаивании анатоксина в течение 3 дней с удалением супернатанта.

Пример 3. Для получения эшерихиозного радиотоксина (РТ) штамм E.coli “ПЛ-6” высевали на обычную (МПА) и полноценную питательную среду (бактопептон 0,8%, хлорид натрия 0,5%, агар 0,5%) и выращивали в аэробных условиях в течение 24, 48 и 72 ч. Затем бакмассу смывали физиологическим раствором, центрифугировали при 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 об/мин, повторяя эту процедуру 1, 2, 3, 4, 5 раз. Осадок ресуспендировали в физиологическом растворе из расчета 1·10⁹, 2·10⁹; 5·10⁹; 1,0·10¹⁰; 1,1·10¹⁰; 1,2·10¹⁰; 1,3·10¹⁰ м.к./см³ и облучали на гамма-установке “Исследователь” (источник - кобальт-60) в дозах 50, 100, 150, 200, 250, 300 Гр при мощности 2,064 Кл. После облучения культуру инактивировали при 35, 36, 37, 38, 39°С в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 ч и проводили экстрагирование радиотоксинов с использованием 50, 60, 70, 80, 90%-ного неподкисленного и подкисленного (0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07% НС1) до рН 5,1, 5,2, 5,3, 5,5, 5,6 и 5,7 этанола, повторяя эту операцию 2, 3, 4, 5 раз. Полученные экстракты упаривали на роторном испарителе при 10, 15, 20, 25°С до исходного объема и нейтрализовали 0,05, 0,07, 0,1, 0,2, 0,3н. КОН до рН 6,4, 6,5, 6,7, 6,8, 7,0, 7,1 и 7,2. Полученный раствор РТ разводили физиологическим раствором в 4 раза и использовали в работе.

Результаты опытов по оценке активности радиотоксинов показали, что наибольший выход радиотоксина (из 100 см биомассы 20-30 мг конечного продукта) с высокой серологической активностью (титр радиотоксина в РНГА - 1:128-1:256) достигается при выращивании культуры на специальной среде в течение 48 ч, 3-кратном центрифугировании при 8000 об/мин, ресуспендировании до концентрации 1,2-10¹⁰ м.к./см³, облучении на гамма-установке в дозе 140-150 Гр, последующем инкубировании при 37°С в течение 4 ч, 3-кратном экстрагировании РТ из культуры в 70% подкисленном (0,05% НС1) до рН 5,5 этаноле, последующем упаривании экстракта на роторном испарителе при 20°С до исходного объема и нейтрализации 0,1н. КОН до рН 6,7-7,0.

Пример 4. Опыты по изучению радиозащитных свойств полученных антигенов проводили на 260 белых мышах живой массой 18-20 г, разделенных на 8 групп по 40 мышей в первых 6 группах и по 10 в двух последних. Животным первых 7 групп (опытные) за 5, 10, 15, 20, 25, 30 дней до тотального облучения (8,5 Гр) подкожно вводили предполагаемые радиозащитные препараты в дозе 0,1 см³ (2 млрд. м.к.), что составляет 0,64 мг белка или 0,112 мг аминного азота. Животные 8-й группы иммунизации не подвергались (контроль). Через вышеуказанные сроки животных всех групп подвергали гамма-облучению в дозах, вызывающих абсолютный летальный эффект - гибель всех животных (ЛД₁₀₀=9,0 Гр). Оценку радиозащитной активности испытанных антигенов проводили по критерию выживаемости в вышеуказанные срок после иммунизации и облучения животных.

Результаты определения радиозащитной активности антигенов в отдельности и в сочетании представлены в табл. 1.

Из материалов табл. 1 видно, что испытанные антигены в отдельности не обладают достаточно высокой радиозащитной активностью. Сочетанное применение 2 антигенов (диантигены) увеличивают процент защиты на 10-15%, а сочетание всех трех антигенов обеспечивает максимальную защиту (80-90%) животных от радиационной гибели.

Пример 5. В опытах на белых крысах устанавливали оптимальную дозу антигенного комплекса, используя для этой цели 150 животных живой массой 150-180 г, разделенных на 8 групп. Животных первых 6 групп подкожно однократно иммунизировали тривакциной (ПА+АТ+РТ), 7-ой группы - известной вакциной (контроль вакцины), 8-ой - не иммунизировали (контроль облучения). Оценку радиозащитной активности препаратов проводили согласно примеру 4.

Результаты опытов представлены в табл. 2.

Из материалов табл. 2 видно, что оптимальной дозой антигенов является 0,09-0,10 мг/мл, которая обеспечивает выживаемость 80-90% летально облученных животных. В отличие от предлагаемого, известный препарат обладает высокой реактогенностью - иммунизация за 5 дней до облучения увеличивает процент гибели животных, проявляя защитный эффект только при иммунизации за 15-30 суток.

Пример 6. Опыты по изучению оптимального соотношения компонентов-антигенов тривакцины проводили на 120 белых мышах живой массой 18-20 г, разделенных на 6 групп по 20 мышей в каждой, которым за 5 и 15 дней до летального облучения (8,5 Гр) вводили предлагаемый радиозащитный препарат в оптимальной иммунизирующей дозе (0,95 мг/кг) при различных объемных соотношениях компонентов тривакцины. Оценку эффективности препаратов проводили согласно примеру 4. Результаты опытов представлены в табл. 3.

Из материалов таблицы видно, что оптимальными соотношениями антигенов в предлагаемом защитном препарате является 90:5:5 мас.%, которое обеспечивает максимальную защиту животных от радиационной гибели. Любые изменения этого соотношения как в сторону увеличения, так и снижения его ведут к снижению защитного эффекта препарата.

Пример 7. Сроки наступления радиорезистентности и ее продолжительность проверены на 130 белых крысах, иммунизированных за 5, 10, 20, 30, 60 и 90 дней до летального облучения (9,0 Гр). Для сравнения параллельно проводили опыты с использованием известного способа. Результаты сравнительных опытов представлены в табл. 4.

Из материалов табл. 4 видно, что применение предлагаемого препарата создает радиорезистентность за 5 дней до летального облучения животных, обеспечивая 80%-ную защиту от радиационной гибели, продолжительность радиорезистентности животных сохраняется длительное время (90 суток, срок наблюдения). В отличие от предлагаемого, известный способ обеспечивает защиту от ионизирующего излучения только за 15-20 и более суток до облучения, причем продолжительность радиорезистентности составляет не более 60 суток, затем она резко падает.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает раннюю (за 5 сут. до облучения) и продолжительную (до 3 месяцев) радиозащиту организма, обеспечивая выживаемость 80-90% животных. Препарат, в отличие от известного, не обладает реактогенностью, значительно более экономичен и более доступен.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, в частности к производству и использованию биопрепаратов, предназначенных для специфической профилактики радиационных поражений организма. Сущность способа специфической профилактики радиационных поражений организма заключается в однократном подкожном введении в организм бактериального антигенного комплекса, содержащего протективный антиген, анатоксин и радиотоксин, в дозах 0,09-0,10 мг на 1 кг живой массы за 5-90 суток до облучения. Препарат для специфической профилактики радиационных поражений организма получают путем предварительного приготовления каждого в отдельности протективного антигена (ПА), анатоксина (AT) и радиотоксина (РТ), затем составляют бактериальный антигенный комплекс, состоящий из протективного антигена, анатоксина и радиотоксина при массовом соотношения 90:5:5 соответственно, содержание белка в комплексе доводят до 1,75-1,92 мг/мл. Техническим результатом является снижение реактогенности препарата, повышение его противолучевой эффективности для специфической профилактики радиационных поражений организма, увеличение срока радиозащитного действия (пролонгирование), удешевление способа, снижение иммунизирующей дозы препарата и повышение производительности труда. 2 с.п.ф-лы, 4 табл.

1. Способ специфической профилактики радиационных поражений организма, предусматривающий введение в организм антигенсодержащего биологического препарата, отличающийся тем, что в качестве антигенсодержащего биологического препарата используют бактериальный комплекс протективного антигена, анатоксина и радиотоксина, полученных из энтеротоксического штамма ПЛ-6 Е.coli, указанный комплекс вводят однократно подкожно в дозах 0,09-0,10 мг на 1 кг массы тела за 5-90 суток до облучения.2. Способ получения препарата для профилактики радиационных поражений организма, отличающийся тем, что из энтеропатогенного штамма ПЛ-6 Е.coli предварительно готовят отдельно протективный антиген путем выращивания микроба на МПА в течение 24 ч при 36-37°С с последующим приготовлением микробной суспензии в концентрации 1,2·10¹⁰ м.к./см³ и добавлением к ней сухого порошка гексаметилентетрамина (10%) или формалина (0,4-0,5%), затем перемешивают смеси и выдерживают при 36-37°С в течение 6,5-7,5 дней с последующим разведением инактивированной бактериальной взвеси 0,2 М раствором хлорида натрия до концентрации 3,0·10¹⁰ м.к./см³, анатоксин путем выращивания вышеуказанного штамма на среде Хоттингера 5-7 дней с последующим добавлением гексаметилентетрамина (10%) или формалина (0,4-0,5%), термостатирования при 37°С в течение 10-12 дней и осаждения анатоксина стерильным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем, декантирования надосадочной жидкости, радиотоксин путем выращивания тест-штамма на полноценной твердой питательной среде (бактопептон 0,8%, хлорид натрия 0,5%, агар 0,5%) в течение 48 ч, смыва биомассы физиологическим раствором, центрифугирования и ресуспендирования микробов физиологическим раствором до концентрации 1,2·10¹⁰ м.к./см³, облучения суспензии на гамма-установке в дозе 140-150 Гр с последующим термостатированием культуры в течение 3,5-4,5 ч при 36-37°С, затем радиотоксин экстрагируют 70%-ным подкисленным (0,05% НС1) до рН 5,5 этанолом, упаривания его на роторном испарителе при 20°С до исходного объема, нейтрализации 0,1 Н КОН до рН 6,5-7,0 и 4-кратного разведения конечного продукта физиологическим раствором и составляют бактериальный антигенный комплекс протектинного антигена, анатоксина и радиотоксина при их массовом соотношении 90:5:5 соответственно, а содержание белка в комплексе доводят до 1,75-1,92 мг/мл.