ИММОРТАЛИЗОВАННЫЙ МАКРОФАГ Российский патент 2019 года по МПК C12N5/16 A61K39/12 C12N7/02 

Настоящее изобретение относится к иммортализованнымальвеолярным макрофагам свиней (PAM), к клеточным культурам, которые включают такие PAM, к способам иммортализации PAM, к методам проведения репликации PRRS вируса на иммортализованных PAM и к способам получения вакцин, включающих PRRSV.

Вирус респираторного и репродуктивного синдрома свиней (PRRSV) представляет собой чрезвычайно важный с экономической точки зрения артеривирус, оказывающий негативное влияние на свиноводство во всем мире. Инфекция, вызванная этим вирусом, приводит к замедлению роста животных, снижению эффективности используемых кормов, анорексии и лихорадке у поросят-отъемышей, аборту у беременных свиноматок и респираторным проблемам у молодых свиней. Только в США, ежегодные потери, связанные с инфекцией вирусом PRRSV, составляли, по подсчетам, примерно 560 миллионов долларов в 2005 году и 664 миллионов долларов в 2011 году. Инфекция PRRSV рассматривается как ассоциированный с проблемами здоровья вызов номер один для всей индустрии свиноводства. Учитывая такие факторы, как появление высоко вирулентных штаммов PRRSV в Юго-Восточной Азии в 2006 году и размер Азиатской свиной индустрии, которая является крупнейшей в мире, можно легко увидеть, что соответствующие потери в этой части мира будут значительно выше, чем те потери, которые известны сейчас для Европы и США.

Вирус PRRSV остается большой угрозой для свиноводства, поскольку, как было показано, вызванное этим вирусом заболевание трудно контролировать, из-за отсутствия как живой, ослабленной, так и убитой вакцин против PRRSV.

Для получения вакцины против PRRSV, живой аттенуированной или инактивированной, нужно провести репликацию вируса в чувствительных к нему клетках. В этой связи, одна из проблем, которая возникает на пути размножения PRRSV, связана с очень ограниченным клеточным тропизмом этого вируса. Он инфицирует в основном альвеолярные макрофаги свиней (PAM). Такие макрофаги (PAM) трудно получить: обычно их получают из легочного лаважа 6-12-недельных поросят (Wensvoort, G. et al., The Veterinary Quarterly 13: 121-130 (1991)). Это весьма сложный и затратный метод, который дает продукт с высокой степенью вариабельности между партиями. Кроме того, первичные PAM могут поддерживаться в клеточной культуре в течение очень ограниченного периода времени. Так что, несмотря на то, что первичные PAM очень хорошо подходят для культивирования PRRSV, они используются лишь ограниченно, в частности, в экспериментальных условиях для изучения процессов инфекции и получения экспериментальных вакцин. Тогда как получение вакцины, пригодной для широкого коммерческого применения, с использованием первичных PAM экономически невыгодно.

Ввиду этой проблемы, ученые-исследователи пытались найти другие клетки, или, даже лучше, линии клеток, которые были бы чувствительны к PRRSV. И были обнаружены всего три таких клеточных линии: MA104, линия клеток из почки обезьяны, и две линии клеток, производных от MA104: MARC-145 и CL2621 клеточные линии (Kumar Shanmukhappa et al., Virology Journal 2007, 4: 62). Именно эти клеточные линии используются в настоящее время в коммерческом варианте для размножения и культивирования PRRSV.

Хотя PRRSV можно культивировать и на этих клеточных линиях с получением относительно высоких титров, но такого рода линии клеток, основанные на других клетках, не PAM, которые не являются линиями свиных клеток, имеют большой недостаток, а именно: поскольку это не естественный хозяин для роста и размножения PRRSV, вирус PRRSV нужно вначале адаптировать к этим клеточным линиям, для достижения высоких титров. В этой связи, ни MA104, ни MARC-145 или CL2621 не могут рассматриваться как вариант первого выбора, для целей культивирования новых диких вирусов. Для отбора новых диких изолятов PRRSV, РАМ, как природная клетка-хозяин, будет более подходящим выбором.

Считается, что иммортализованная линия РАМ клеток может быть решением указанных выше проблем.

В принципе, иммортализованные линии PAM клеток можно выращивать без ограничений по числу пассажей, и они являются наиболее подходящими хозяйскими клетками для PRRSV.

Было сделано несколько попыток с целью разработки иммортализованных линий РАМ клеток.

В заявке на PCT патент WO2008/089094 описаны два природных, нетрансформированных (за счет использования щадящих методик) РАМ мутанта, полученных из эмбрионов свиньи. Эти клетки ведут себя как иммортализованная линия PAM клеток, и они способны поддерживать рост PRRSV. Недостатком описанного способа является то, что это подход, основанный на методе “проб и ошибок», и его результат трудно прогнозировать и ясно представить. Конкретно, нельзя точно сказать, будет ли любая линия эмбриональных клеток, полученных с использованием этого метода, действительно иммортализованной в стабильном режиме или просто достигнут несколько увеличенный период жизни клеток или таким клеткам свойственна усиленная способность делиться несколько дольше, большее число раз, в сравнении с первичными PAM клетками. В этой связи, данный метод не подходит для специалистов, которым нужна действительно иммортализованная линия PAM клеток.

В диссертации Jian-Jun Jia (August 2009, Universite de Montreal, Montreal, Canada) была, описана линия клеток из легкого свиньи, предположительно чувствительная к PRRSV, но эта клеточная линия основана не на альвеолярных клетках, а на эпителиальных клетках, и которые, к тому же, происходят не полностью из организма свиньи (D.W. Silversides et al., Journal of virology 84: 5454-5455 (2010)).

Еще одну попытку создания настоящей иммортализованной линии PAM клеток описали H.M. Weingartl et al, in J. Virol. Meth. 104: 203-216 (2002). Weingartl описал трансфекцию первичных PAM клеток плазмидой pSV3neo, несущей гены резистентности к неомицину и Т-антиген SV40. Этот подход привел к выделению трех иммортализованных линий миелоидных (на основе моноцитов/макрофагов) клеток. Однако, результат этого эксперимента был довольно странный, а именно: ни в одной из этих клеточных линий не выявлялся Т-антиген SV40, и, кроме того, ни одна из этих клеточных линий не поддерживала репликацию PRRSV. В этой связи, Weingartl делает вывод, согласно которому не наличие Т-антигена SV40, а некий другой, альтернативный механизм отвечает за иммортализацию.

После этой неудачной попытки, способ, основанный на использовании Т-антигена SV40, был заменен на альтернативные подходы. Yoo Jin Lee et al., обнаружили, что клеточные линии, которые разработал Weingartl, не экспрессируют заметные количества локализованного на поверхности клеток гликопротеина CD163 размером 130 кДa, который известен как клеточный рецептор для PRRSV (J. Virol. Meth. 163: 410-415 (2010)). Соответственно, Yoo Jin Lee провел дополнительную трансфекцию одной из созданных Weingartl линий PAM клеток геном CD163, клонированным в ретровирусном векторе, под контролем LTR промотора ретровируса. И это привело к созданию действительно иммортализованной линии PAM клеток, способных поддерживать рост PRRSV.

Исследовательская группа Mingeun Sagong, в которую входил и Yoo Jin Lee, сделала в 2012 году вывод о том, что потеря исходных свойств первичных клеток, таких как PAM-специфичные маркеры, например, CD163, может быть связана с трансформацией Т-антигеном SV40 (J. of Virological Methods 179: 26-32 (2012)). По этой причине, указанная выше исследовательская группа Sagong использовала альтернативный способ для иммортализации PAM. Использованный ими способ включает экспрессию обратной транскриптазы человеческой изомеразы (hTERT), с использованием ретровирусного вектора, в клетках PAM для восстановления активности теломеразы. А восстановление активности теломеразы устраняет потерю теломеров ДНК и, таким образом, предупреждает старение клеток, вызванное репликацией. Далее, исследовательская группа Mingeun Sagong заявляет о том, что полученные ими данные показали, что, в отличие от РАМ клеток, трансформированных Т-антигеном SV40, иммортализация с использованием hTERT позволяет клеткам надежно сохранить все те показатели, которые были свойственны фенотипу их родительской клетки.

Из вышесказанного следует, что для целей успешной трансформации PAM, направленной на индукцию иммортализации, независимо от того способа, который применяется для предупреждения старения, использование Т-антигена SV40 следует исключить, а использовать ретровирус или, по меньшей мере, крупные последовательности ретровируса для введения ДНК в геном PAM. Однако, серьезным недостатком использования ретровирусов или, по меньшей мере, крупных последовательностей ретровируса для трансформации клеток является тот факт, что во многих случаях в ДНК, используемой для трансформации клеток, присутствуют крупные концевые повторы (Large terminal Repeat (LTR)).

Указанные LTR последовательности представляют собой элементы ретровируса, которые содержат все необходимые сигналы для экспрессии ретровирусных генов: энхансер, промотор, инициатор транскрипции, терминатор транскрипции и сигал полиаденилирования. Есть также основания полагать, что эти LTR последовательности обладают опухолегенным эффектом. Это представление основано на том, что они, как это было показано, являются цис-активаторами других клеточных генов и могут вступать в рекомбинацию с другими ретровирусными последовательностями в клеточном геноме (Mosier, D.E., Applied Biosafety 9: 68-75 (2004)). Тем не менее, представлялось, что трансформация клеток ретровирусной ДНК, включающей LTR последовательности и отказ от использования Т-антигена SV40, представляет собой единственный способ получения иммортализованных PAM.

Неожиданно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что есть возможность успешно получать PAM, которые стали иммортализованными и сохранили чувствительность к PRRSV и которые, к тому же, не содержат крупных концевых повторов (LTR) ретровирусной ДНК.

Такие иммортализованные PAM клетки по настоящему изобретению, как это неожиданно было показано, могут быть получены при трансфекции ДНК, включающей Т-антиген SV40, но теперь уже в сочетании с использованием транспозона, как средства, способствующего достижению стабильной интеграции в клеточный геном.

Транспозоны можно рассматривать как природные носители для переноса ДНК, которые, как и интегративные вирусы, способствуют достижению эффективной вставке в геном.

По неизвестным причинам, описанные выше негативные эффекты Т-антигена SV40, при наличии или в отсутствие ретровирусной ДНК, могут быть неожиданно устранены, если проводить трансформацию клеток с использованием молекулы ДНК, включающей ген, кодирующий Т-антиген SV40 и транспозоны.

В принципе, транспозоны стабильно продолжают присутствовать в клеточном геноме после их интеграции в геном. В этой связи, предпочтительно, чтобы иммортализованные PAM по настоящему изобретению включали транспозоны.

Согласно настоящему изобретению, рассматриваемая в нем иммортализованная клеточная линия представляет собой популяцию клеток (в данном случае, PAM), взятых из многоклеточного организма, которые в норме не способны пролиферировать бесконечно долго, но которые, за счет мутации, избавились от нормального для клеток процесса старения и продолжают деление. Такие клетки избавились от существующего в норме ограничения роста, рассчитанного лишь на определенное количество циклов деления.

Методы, использованные для получения иммортализованных PAM по настоящему изобретению, включают в основном следующие стадии:

a) стадию получения, из организма свиньи, образца бронхоальфеолярного лаважа, содержащего клетки. Проведение такого рода стадий уже было описано, в частности, в работе Wensvoort, G. et al., in 1991 (vide supra), в работе Weingartl, H.M. et al. (vide supra), а также рядом других авторов, и описанные в них способы представляют собой предпочтительную стратегию получения PAM;

b) стадию отделения клеточного компонента от указанного образца. Способы проведения этой стадии также хорошо известны в данной области и описаны, в частности, в работе Wensvoort и в работе Weingartl, и обычно эта стадия проводится путем центрифугирования материала легочного лаважа при низкой скорости;

c) стадию трансфекции в указанный клеточный компонент молекулы ДНК, включающей транспозоны, а также ген, кодирующий Т-антиген SV40, под контролем соответствующего промотора.

Трансфекцию можно проводить в рамках большого числа способов, известных в данной области. В настоящее время имеются коммерческие наборы, используемые для проведения трансфекции, которые доступны от ряда компании, например, Bio-Rad (Life Science (Research, Education, Process Separations, Food Science), Life Science Research, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547, USA) и Invitrogen (Life Technology, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072, USA). Обычно используемые методы трансфекции, основанные на использовании реагентов, включают применение липидов, фосфата кальция, катионных полимеров, ДЭАЭ-декстрана, активированных дендромеров и магнитных шариков. Инструментальные методы включают использование процедур электропорации и микроинъекции.

Молекула ДНК, включающая транспозоны и ген, кодирующий Т-антиген SV40, под контролем соответствующего промотора, может представлять собой, в частности, плазмиду, включающую ген, кодирующий Т-антиген SV40, под контролем соответствующего промотора. Указанная плазмида может иметь кольцевую или линейную форму, в случае использования ее на стадии трансфекции.

Сам процесс применения транспозонов хорошо известен в данной области. В работе Ivics, Z. and Izsvak Z. приводится широкий обзор транспозонов и вариантов их использования, а также рассматриваются механизмы действия транспозонов (Mobile DNA 1: 25-39 (2010)).

Обзорная работа Deepika Ahuja et al., посвященная Т-антигену SV40, включает описание механизмов действия этого белка (Oncogene 24: 7729-7745 (2005)). Главным образом, Т-антиген SV40 ингибирует p53 и Rb-семейство опухолевых супрессоров. Считается, что именно эта активность Т-антигена вызывает трансформацию клеток в направлении их иммортализации. В настоящее время известно большое число промоторов, подходящих для экспрессии Т-антигена SV40, которые способны поддерживать высокий уровень экспрессии. Они включают классические промоторы, такие как (человеческий) предранний промотор цитомегаловируса (Seed, B. et al., Nature 329, 840-842, 1987; Fynan, E.F. et al., PNAS 90, 11478-11482,1993; Ulmer, J.B. et al., Science 259, 1745-1748, 1993), промотор-энхансер цитомегаловируса человека для экспрессии gD в BoHV-1. (Donofrio G., et al., Clinical and Vaccine Immunology 13: 1246-1254, (2006)), предранний промотор мышиного цитомегаловируса (MCMVie1), ранний промотор мышиного цитомегаловируса (MCMVe1), предранний промотор SV40 (Sprague J. et al., J. Virology 45, 773, 1983), промотор SV-40 (Berman, P.W. et al., Science, 222, 524-527, 1983), промотор металлотионеина (Brinster, R.L. et al., Nature 296, 39-42, 1982), промотор для белков теплового шока (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985), основной поздний промотор Ad2 и промотор β-актина (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992).

Предпочтительным промотором является CAG промотор. (Miyazaki, J; Takaki, S; Araki, K; Tashiro, F; Tominaga, A; Takatsu, K; Yamamura, K., Gene 79 (2): 269–77 (1989), и Niwa, H; Yamamura, K; Miyazaki, J,. Gene 108 (2): 193–9 (1991).)

d) стадию отбора клеток, которые способны поддерживать длительную пролиферацию. PAM клетки, которые способны поддерживать длительную пролиферацию, представляют собой клетки, которые прошли культивирование в течение по меньшей мере 5 клеточных циклов. Клеточный цикл, или цикл деления клеток, представляет собой серию событий, которые происходят в клетке и которые ведут к ее делению и дупликации (клеточная репликация). Отбор клеток, которые способны к длительной пролиферации, представляет собой очень простой процесс по следующей причине: первичные PAM клетки делятся с трудом или вообще не делятся за пределами своей природной среды, легкого свиньи. Как видно из данных фиг.2, первые 2 графика (без добавления M-CSF) показывают, что число живых первичных PAM клеток после промывания легкого и их выделения, снижается с течением времени. В культуре, где изначально было 200000 PAM клеток, лишь примерно половина остается жизнеспособной через 3 дня. И это количество продолжает неуклонно снижаться с течением времени.

Это значит, что, если происходит увеличение числа клеток, это должно быть связано с тем, что в одну или несколько клеток была успешно трансфицирована молекула ДНК, включающая транспозон, и ген, кодирующий Т-антиген SV40, был встроен в геном клетки. Таким образом, идет автоматическая селекция, а именно: сохранение клеток PAM, которые были успешно трансформированы в подходящей для роста клеток среде, ведет к репликации удачно трансформированных клеток, тогда как не иммортализованные клетки будут прекращать деление и погибают. Подходящие для культивирования клеток среды известны в данной области и описаны, в частности, здесь, в разделе Примеры. Они также описаны, например, в работе Wensvoort, G. et al., в 1991 (vide supra), в работе Weingartl, H.M. et al. (vide supra). Другие руководства по условиям культивирования клеток также даны в разделе Примеры.

Таким образом, настоящее изобретение, в одном варианте своего осуществления, относится к способу получения иммортализованных PAM клеток, включающему стадии:

a) получения из организма свиньи образца бронхоальвеолярного лаважа, содержащего клетки;

b) отделения от указанного образца клеточного компонента;

c) трансфекции в указанный клеточный компонент молекулы ДНК, включающей транспозоны и ген, кодирующий Т-антиген SV40, под контролем промотора; и

d) отбора клеток, которые могут культивироваться в течение по меньшей мере 5 клеточных циклов.

Обычно проводят отбор клеток, которые культивировались в течение по меньшей мере 5 клеточных циклов. Применительно к таким клеткам, есть все основания рассматривать их как успешно иммортализованные PAM, поскольку первичные PAM клетки, как правило, не проходят репликацию более одного или двух раз, в исключительных случаях, до 5 раз, in vitro, после их выделения из легких.

В редких случаях, ранние клеточные циклы могут демонстрировать нестабильный характер, вызванный, например, тем, что транспозон был интегрирован в клеточный геном в очень важном сайте или в результате нестабильной интеграции гена, кодирующего Т-антиген SV40. В этой связи, на практике, проводят отбор тех клеток, которые культивировались в течение по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или даже 60 клеточных циклов, в указанном порядке, соответствующем предпочтительности их отбора. Вероятность проявления любой нестабильности снижается по мере нарастания числа клеточных циклов, которые прошли выбранные иммортализованные PAM клетки.

Таким образом, предпочтительно отбирают те клетки, которые культивировались в течение по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или даже 60 клеточных циклов, в указанном порядке, соответствующем предпочтительности их отбора.

Присутствие макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) не оказывают существенного стимулирующего воздействия на репликацию первичных PAM в течение более, чем нескольких клеточных делений.
Тогда как присутствие гранулоцитарного M-CSF (gM-CSF) может улучшить состояние первичных PAM клеток, причем даже до такой степени, что репликация будет происходить в течение очень короткого периода времени. Однако авторы настоящего изобретения показали, что использование gM-CSF ведет к снижению экспрессии CD163. А поскольку CD163 вовлекается в репликацию вируса PRRSV в PAM, использование gM-CSF может, в этой связи, не способствовать достижению результирующего благоприятного эффекта.
И хотя M-CSF, по всей видимости, улучшает состояние первичных клеток PAM в меньшей степени, чем это может делать gM-SCF, он не препятствует образованию CD163.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что присутствие M-CSF в среде для роста PAM, полученных из легочного лаважа, до проведения их трансфекции, в некоторой мере способствует повышению устойчивости клеток к стрессовому процессу трансфекции. Таким образом, эффективность трансфекции существенно повышается в присутствии M-CSF. Подходящие количества M-CSF составляют, например, 5, 10, 25, 50, 100 или 200 нг/мл, в указанном порядке повышения предпочтительности.

(Из данных, приведенных на фиг. 2, можно видеть, что действительно, в присутствии M-CSF, число живых первичных PAM, полученных после промывания легких и последующего выделения, снижается (или, в лучшем случае, остается стабильным в течение 6 дней). Это снижение становится менее выраженным с течением времени, если его сравнивать со снижением, наблюдаемым в варианте отсутствия M-CSF, но в любом случае, в пределах статистической вероятности, отсутствует увеличение числа клеток.

В этой связи, другая предпочтительная форма рассматриваемого варианта осуществления настоящего изобретения относится к способам по настоящему изобретению, где указанный способ включает стадию добавления M-CSF в количестве, равном по меньшей мере 5 нг/мл, к образцу бронхоальвеолярного лаважа, содержащего клетки, и/или к клеточному компоненту до проведения стадии трансфекции.

В заявке на PCT патент WO2008/089094 описано применение M-CSF в качестве обязательного компонента ростовой среды, используемого с целью поддержания в живом состоянии иммортализованные, но не трансформированные клетки PAM из эмбрионов. Тогда как, в настоящем изобретении, M-CSF или gM-CSF используется до проведения иммортализации PAM.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что присутствие M-CSF на стадии d) и/или в ходе культивирования иммортализованных PAM клеток по настоящему изобретению, т.е. трансформированных и не фетальных клеток PAM, также повышает жизнеспособность трансформированных и не фетальных клеток по настоящему изобретению. Как показано на фиг. 4, и жизнеспособность, и скорость репликации иммортализованных PAM клеток по настоящему изобретению значительно возрастают в присутствии M-CSF. Небольших количеств M-CSF на уровне 1, 2, 3, 4 или 5 нг/мл уже будет достаточно для повышения и жизнеспособности, и скорости репликации. Предпочтительные концентрации M-CSF охватывают такие значения, как 6, 12, 25, 50, 100, 200 или даже 400 нг/мл, в порядке возрастания их предпочтительности.

Таким образом, еще одна предпочтительная форма данного варианта осуществления настоящего изобретения относится к способу по настоящему изобретению, где указанный способ дополнительно включает стадию добавления M-CSF, в количестве, равном по меньшей мере 1 нг/мл, на стадии d), и/или в ходе культивирования иммортализованных PAM клеток по настоящему изобретению.

На фиг. 5 показано, что антитела против CD163 и P210, двух рецепторов, которые, как было показано, необходимы для поступления вируса PRRS в PAM клетки и репликации в этих клетках, действительно взаимодействуют с иммортализованными PAM клетками по настоящему изобретению. Это означает, что CD163 и P210 действительно присутствуют на иммортализованных PAM клетках по настоящему изобретению.

На фиг.6 показано, что иммортализованные PAM клетки по настоящему изобретению действительно поддерживают репликацию PRRSV. Из представленных данных видно, что дикий изолят PRRSV реплицируется еще быстрее и при этом достигаются более высокие титры в первые 2-3 дня после инфекции, в сравнении с первичными PAM клетками.

На фиг.7 показано, что действительно дикий изолят PRRSV реплицируется еще быстрее и при этом достигаются более высокие титры на иммортализованных PAM клетках по настоящему изобретению, в сравнении с вариантом их репликации на MARC-145 клетках. Из представленных данных также видно, что дикий изолят действительно реплицируется в целом лучше на PAM клетках, независимо от того, были они иммортализованы или нет, в сравнении с вариантом их репликации на MARC-145 клетках.

Из приведенных на фиг. 7 данных также видно, что, наоборот, тип I и тип II штаммы PRRSV, которые адаптированы к репликации на MARC-145 реплицируются с достижением более высокого титра на MARC-145 клетках, в сравнении с вариантом их репликации на PAM клетках.

Все это указывает на то, что действительно иммортализованные PAM клетки по настоящему изобретению так же приемлемы для репликации диких изолятов PRRSV, как и первичные PAM, и, в этой связи, они больше подходят для этой цели, чем отличные от PAM клетки, такие как MA104, MARC-145 или CL2621 клетки.

Во втором варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к иммортализованному альвеолярному макрофагу свиней (PAM), где указанный PAM отличается тем, что он чувствителен к вирусу свиного респираторного и репродуктивного синдрома (PRRSV), тем, что указанный PAM экспрессирует Т-антиген SV40 и тем, что этот PAM не включает длинные концевые повторы ДНК.

В принципе, иммортализованные PAM по настоящему изобретению могут также содержать функциональный ген, кодирующий обратную транскриптазу теломеразы человека (hTERT). Однако, в этом нет необходимости, поскольку Т-антиген SV40 способен поддерживать иммортализованное состояние PAM клеток по настоящему изобретению. Фактически, только в связи с технической простотой процедуры получения иммортализованных PAM, предпочтительно использовать только Т-антиген SV40 для иммортализации.

Таким образом, предпочтительная форма осуществления данного варианта настоящего изобретения относится к иммортализованным PAM клеткам по настоящему изобретению, которые отличаются тем, что указанные PAM клетки на включают hTERT.

В третьем варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способам репликации PRRS вируса, отличающимся тем, что они включают следующие стадии:

a) культивирование иммортализованных PAM клеток по настоящему изобретению;

b) осуществление взаимодействия иммортализованных PAM клеток с PRRS вирусом;

c) проведение репликации вируса PRRSV; и

d) выделение потомства вируса.

В четвертом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к культуре клеток, включающей иммортализованные PAM по настоящему изобретению.

В предпочтительной форме этого варианта осуществления настоящего изобретения, указанная культура клеток, включающая иммортализованные PAM, инфицирована вирусом PRRSV.

В другой предпочтительной форме этого варианта осуществления настоящего изобретения, указанная культура клеток, включающая иммортализованные PAM, включает M-CSF.

В пятом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способам получения вакцины, включающей PRRSV, отличающимся тем, что они включают способ репликации PRRSV по настоящему изобретению с последующей стадией объединения вируса с фармацевтически приемлемым носителем.

В предпочтительной форме этого варианта осуществления настоящего изобретения, указанный PRRSV вирус представлен в живой аттенуированной или в инактивированной форме.

Примеры

Пример 1:

Материалы и методы

Плазмиды

Для создания pPB-CAG-SV40 T Ag, XhoI и BglII сайты добавляли к SV40 T Ag в рамках ПЦР, с использованием праймеров SV40 Tag 5’-BII (5’-GGCGAGATCTACCATGGATAAAGTTTTAAACAG-3’) и SV40 Tag 3’-XI (5’-GGCGCTCGAGTTATGTTTCAGGTTCAGGGG-3’). Использовали Phusion ДНК-полимеразу для проведения ПЦР, согласно протоколу производителя (New England Biolabs). Полученный фрагмент клонировали в pCR-Blunt (Life Technologies) и структуру подтверждали секвенированием. Далее, вырезали SV40 T Ag из pCR-Blunt и подвергали клонированию в pPB-CAG-EBNXN (Yusa et al., 2009), с использованием BglII-XhoI сайтов, для создания pPB-CAG-SV40 T Ag (фиг. 1). Структуру полученной конструкции подтверждали секвенированием. Затем, с использованием соответствующего набора (Qiagen EndoFree plasmid maxi kit (Qiagen)), выделяли плазмидную ДНК, для последующей трансфекции в первичные PAM клетки.

Выделение и культивирование первичных РАМ клеток и PAM SVh клеток

Свиные альвеолярные макрофаги получали из легких 1-2-недельных, отрицательных по вирусу PRRSV, SPF поросят. Легкие промывали три-пять раз стерильным фосфатно-буферным раствором (ФБР). Далее, промывную жидкость центрифугировали в течение 10 минут со скоростью 1000g при 4°C, для осаждения клеток. После этого, полученные клетки ресуспендировали и хранили под жидким азотом в среде RPMI 1640+HEPES+GlutaMax (Life Technologies), содержащей 50% ФСТ (Hyclone, Thermo Scientific), с добавкой 1-кратного количества заменимых аминокислот (Life Technologies), 2 мM глютамина, антибиотиков и 10% ДМСО. После оттаивания, PAM клетки вносили в культуру и растили в среде RPMI 1640+HEPES+GlutaMax (Life Technologies), содержащей 20% FCS (Hyclone, Thermo Scientific), с добавкой 1-кратного количества заменимых аминокислот (Life Technologies), 2 мM глютамина, антибиотиков, при температуре 37°C и в атмосфере 5% CO₂. Рекомбинантный человеческий M-CSF (M-CSF) получали от компании R&D Systems. PAM SVh культивировали в указанной среде, содержащей дополнительно 100 нг/мл M-CSF (R&D Systems).

Тесты для оценки жизнеспособности

Влияние M-CSF на выживание in vitro первичных PAM клеток определяли при высевании 200000 клеток в ячейки 24-ячеечного микропланшета в среде, содержащей разные концентрации M-CSF. Каждый вариант тестировали в двойном повторе. Образцы клеток отбирали из ячеек через 3 и 6 дней после высева и подсчитывали количество жизнеспособных клеток с использованием GUAVA Easycyte plus (Guava Millipore) и красителя Viacount (Guava Millipore), согласно протоколу производителя. Оценку каждого образца проводили в двойном повторе.

Влияние концентрации M-CSF на пролиферацию PAM SVh клеток оценивали аналогичным образом с некоторыми изменениями. В данном случае, высевали 25000 клеток в ячейки 96-ячеечного микропланшета, с использованием соответствующего приспособления (ultra-low attachment), и через 3, 4, 5 и 6 дней после посева собирали клетки для определения их количества. Оценку каждого образца проводили в двойном повторе.

Трансфекция

После 6 дней культивирования, собирали первичные PAM клетки и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В этом эксперименте, к указанной среде добавляли M-CSF (100 нг/мл), для усиления способности выживания первичных РАМ клеток in vitro. Для трансфекции, осуществляли трансфекцию 1,10 E6 жизнеспособных клеток в 100 мкл буфера для первичных клеток P3 + добавка (Lonza Cologne AG) с использованием программы DN-100 от Nucleofector 4D (Lonza Cologne AG). Клетки трансфицировали с использованием либо 1,6 мкг pPB-CAG-SV40 T Ag и 0,4 мкг pPB-CMV-hyPBase (Yusa et al., 2011), либо, в качестве контроля, 1,6 мкг pPB-CAG-EBNXN и 0,4 мкг pPB-CMV-hyPBase. После пульсового введения Nucleofection, клетки выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут. Далее, к клеткам медленно добавляли 400 мкл среды RPMI 1640 (37°C), после чего клетки инкубировали при температуре 37°C в течение 5 минут. Затем, клетки осторожно ресуспендировали, высевали в среде RPMI 1640+HEPES+GlutaMax (Life Technologies), содержащей containing 20% ФСТ (Hyclone, Thermo Scientific), с добавкой 1-кратного количества заменимых аминокислот (Life Technologies), 2 мM глютамина, антибиотиков и 100 нг/мл и инкубировали при температуре 37°C и в атмосфере 5% CO₂.

Антитела и проточная цитометрия

Клетки метили мышиными моноклональными антителами против свиного CD163 (клон 2A10/11, AbD Serotec), мышиными моноклональными антителами против свиного силоадгезина/p210 (Duan et al., 1998) или FITC-мечеными мышиными контрольными антителами IgG1 изотипа (AbD Serotec). После промывания, клетки, меченные с использованием анти-CD163 или анти-силоадгезина/p210 антител, метили FITC-меченными козьими анти-мышиными антителами (Lifespan Biosciences). Далее, клетки анализировали с использованием цитометра Becton Dickinson FACS Calibur и программного обеспечения CellQuest Pro.

Репликация PRRSV и определение титра вируса

Для сравнения способностей первичных PAM клеток, PAM SVh или MARC-145 клеток служить в качестве субстрата для репликации PRRSV, высевали равные количества этих клеток в ячейки 12-ячеечного планшета. Далее, клетки инфицировали в момент времени t=0, с использованием либо патогенного дикого изолята, вакцины для штамма типа I или вакцины для штамма типа II с множественностью заражения MOI 0,001 или MOI 0,0001. Далее, через несколько дней после инфицирования, супернатанты собирали и оставляли для хранения при температуре -20°C. Титры вируса определяли путем титрования супернатантов от первичных PAM и PAM SVh на супернатантах от первичных PAMs и MARC-145 на MARC-145 клетках. Все титрования проводили в двойном повторе. Значения титров подсчитывали с использованием метода Spearman-Kärber и выражали в виде log₁₀TCID₅₀/мл.

Результаты:

M-CSF усиливает жизнеспособность первичных PAM клеток in vitro

Первичные PAM клетки характеризуются низким показателем выживания в стандартной среде RPMI 1640, содержащей 20% ФСТ (фиг. 2). Количество жизнеспособных клеток снижается с течение времени и через три дня жизнеспособность сохраняют лишь около 50% клеток. Добавление к культуральной среде макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) оказывает положительный эффект на выживание клеток, при этом, количество жизнеспособных клеток явно возрастает через три или шесть дней, в сравнении с клетками, растущими без M-CSF.

Установка линии РАМ клеток, иммортализованных с использованием SV40

Первичные клетки культивировали в течение 6 дней в среде, содержащей M-CSF, и затем проводили трансфекцию с использованием pPB-CAG-SV40 T Ag или pPB-CAG-EBNXN, в сочетании с введением вектора pPB-CMV-hyPBase, кодирующего piggyBac транспозазу. После трансфекции, проводили тщательный ежедневный мониторинг клеток, для оценки их пролиферативной способности, и ростовую среду регулярно пополняли свежей средой с добавкой 100 нг/мл M-CSF. При этом, в контрольных клетках, в которые трансфицировали pPB-CAG-EBNXN, не наблюдалась пролиферация клеток, и через 4-5 недель после трансфекции все клетки погибли. Тогда как даже через 3-4 недели после трансфекции наблюдался рост небольших колоний в культурах pPB-CAG-SV40 T Ag-трансфицированных клеток (фиг. 3). Эти колонии продолжали пролиферировать и подвергались дальнейшим пассажам, для увеличения их числа. Все клетки были положительными по SV40 T Ag, согласно данным флуоресцентного анализа (результаты не показаны).

Те клетки, которые продолжали пролиферировать, подвергались пассажам два раза в неделю и сохранялись в культуре в течение более 8 месяцев (50-60 пассажей). Рост такой клеточной линии может быть легко возобновлен в культуре после хранения в жидком азоте. Установленная таким образом клеточная линия получила название PAM SVh.

Пролиферация линии PAM SVh клеток зависит от концентрации M-CSF

Для выяснения, требуется ли M-CSF для пролиферации клеточной линии PAM SVh, растили PAM SVh без M-CSF или при наличии в среде разных концентраций M-CSF. Число жизнеспособных клеток определяли через 3 и 6 дней после посева клеток. Было показано, что пролиферация PAM SVh зависит от M-CSF, и эта зависимость определяется концентрацией M-CSF (фиг. 4). Наибольшее увеличение числа клеток отмечается в присутствии высоких концентраций (400-100 нг/мл) M-CSF. Меньшие концентрации M-CSF приводят к сниженной пролиферации клеток, а в отсутствие M-CSF наблюдается лишь небольшое или вовсе отсутствие увеличение числа клеток, указывая на то, что пролиферация PAM SVh зависит от концентрации M-CSF в среде.

PAM SVh экспрессируют маркеры силоадгезин/p210 и CD163

Было показано, что два рецептора важны для поступления вируса PRRS в PAM клетки и репликации в них PRRS вируса, силоадгезин/P210 и CD163. При этом, было показано, что экспрессия силоадгезина/p210 требуется для связывания PRRSV с РАМ клетками и входа в PAM клетки, тогда как CD163 необходим для репликации вируса PRRSV в клетках (Delputte et al., 2005; Van Gorp et al., 2008; Calvert et al., 2007). Авторы исследовали, экспрессируют ли PAM SVh клетки силоадгезин/P210 и CD163, проводя мечение клеток специфическими антителами против этих рецепторов, с последующим анализом по методу проточной цитометрии. Было показано, что более 80% PAM SVh клеток являются положительными по CD163+ и более 70% положительными по силоадгезину/P210+ (фиг. 5), и это указывает на то, что данные клетки могут использоваться для инфекции вирусом PRRSV и репликации в них вируса PRRSV.

PAM SVh cells подходят в качестве субстратов для репликации вируса PRRSV

Авторы определяли, являются ли PAM SVh клетки субстратом для репликации PRRSV, в случае инфицирования их патогенным диким изолятом. Супернатанты отбирали в разные дни после инфекции и проводили титрование для определения титра вируса. Для целей сравнения, авторы также проводили инфицирование первичных PAM клеток в рамках того же эксперимента. PAM SVh клетки инфицировали диким изолятом PRRSV, и в них наблюдалась продукция PRRSV вируса (фиг. 6). В сравнении с первичными PAM клетками, титры вирусов, наблюдаемые в случае PAM SVh клеток, были выше в 1 день и 2 день после инфекции 2, а на 3 и 4 день были сравнимы по результатам и снижались на 5 день.

Клетки MARC-145 обычно используют в качестве субстрата для продукции вакцины против штаммов PRRSV вируса. Авторы проводили сравнение первичных PAM клеток, PAM SVh клеток и MARC-145 клеток, для оценки возможности использовать их в качестве субстратов для репликации разных штаммов PRRSV. С этой целью, авторы инфицировали равные количества первичных PAM клеток, PAM SVh клеток и MARC-145 клеток, с использованием для этого либо патогенного дикого штамма, либо вакцинного штамма PRRSV типа I, либо вакцинного штамма PRRSV типа II. Супернатанты собирали в разные дни после инфекции и проводили титрование супернатантов для определения титра вирусов. И вновь, PAM SVh клетки продуцировали сравнимые или более высокие титры дикого изолята PRRSV, чем первичные PAM клетки (фиг. 7A). PAM SVh клетки также продуцировали более высокие титры дикого изолята PRRSV, в сравнении их с MARC-145 клетками. При сравнении титров вируса штаммов типа I и типа II вируса PRRSV, продуцируемых на разных субстратах, авторы обнаружили, что оба этих штамма лучше всего реплицируются на MARC-145 клетках, т.е. на субстрате, который в норме используется для получения этих ослабленных вирусов (фиг. 7B and C). Однако, PAM SVh клетки продуцировали более высокие титры, чем первичные PAM клетки, в случае обоих вакцинных штаммов, во все временные точки, что вновь указывает на то, что PAM SVh клетки представляют собой лучший субстрат для репликации PRRSV, чем первичные PAM клетки.

Описание графического материала

Фиг. 1: Карта вектора pPB-CAG-SV40 T Ag

Фиг. 2: M-CSF повышает выживание первичных PAM клеток in vitro. 200000 первичных PAM клеток высевали в двойном повторе, в момент времени t=0 (день 0), в среду, не содержащую M-CSF или содержащую разные концентрации M-CSF. Количество жизнеспособных клеток определяли через 3 и 6 дней после посева. Число клеток определяли в двойном повторе, на ячейку. Приведенные данные представлены в виде среднего значения + СКО для четырех независимых экспериментов.

Фиг. 3: Образование колоний в pPB-CAG-SV40 T Ag-трансфицированных клетках

Колонии обозначены черными стрелками.

Фиг. 4: M-CSF стимулирует пролиферацию PAM SVh клеток. 25000 PAM SVh клеток высевали в момент времени t=0 (день 0) в среду, не содержащую M-CSF или содержащую разные концентрации M-CSF. Количество жизнеспособных клеток определяли через 3, 4, 5 и 6 дней после посева. Приведенные данные представляют собой среднее значение для двух подсчетов числа клеток в ячейке.

Фиг. 5: PAM SVh клетки экспрессируют CD163 и силоадгезин. PAMSVh клетки метили антителами против CD163 или p210 или контрольными антителами против определенного изотипа. Далее, клетки метили FITC-меченными вторичными антителами и анализировали по методу проточной цитометрии. Показан процент FITC-положительных клеток на антитело.

Фиг. 6: Репликация PRRSV в PAM SVh клетках. Клетки инфицировали в момент времени t=0 патогенным диким изолятом PRRSV (MOI 0,001). Супернатанты собирали в разные дни после инфекции и проводили их титрование для определения титра вируса. Показаны значения 10 log показателя TCID50/мл, для первичных PAM клеток (светлые столбцы) и PAM SVh клеток (темные столбцы). Приведенные данные представляют собой результаты двух независимых титрований.

Фиг. 7: Репликация разных штаммов вируса PRRSV в клеточной линии PAM SVh клеток. Клетки инфицировали в момент времени t=0 с использованием либо (A) патогенного дикого изолята PRRSV (множественность заражения MOI 0,0001), либо (B) вакцинного штамма PRRSV Type I (множественность заражения MOI 0,001), либо (C) вакцинного штамма PRRSV Type II (множественность заражения MOI 0,001). Супернатанты собирали в разные дни после инфекции и проводили их титрование для определения титра вируса. Показаны значения 10 log показателя TCID50/мл, для MARC-145 (светлые столбцы), для первичных PAM клеток (заштрихованные столбцы) и PAM SVh клеток (темные столбцы). Приведенные данные представляют собой результаты двух независимых титрований.

Список цитированной литературы

Calvert,J.G., Slade,D.E., Shields,S.L., Jolie,R., Mannan,R.M., Ankenbauer,R.G., and Welch,S.K. (2007). CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses. J. Virol. 81, 7371-7379.

Delputte,P.L., Costers,S., and Nauwynck,H.J. (2005). Analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus attachment and internalization: distinctive roles for heparan sulphate and sialoadhesin. J. Gen. Virol. 86, 1441-1445.

Duan,X., Nauwynck,H.J., Favoreel,H.W., and Pensaert,M.B. (1998). Identification of a putative receptor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine alveolar macrophages. J. Virol. 72, 4520-4523.

Van Gorp,H., Van Breedam,W., Delputte,P.L., and Nauwynck,H.J. (2008). Sialoadhesin and CD163 join forces during entry of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 89, 2943-2953.

Yusa,K., Rad,R., Takeda,J., and Bradley,A. (2009). Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nat. Methods 6, 363-369.

Yusa,K., Zhou,L., Li,M.A., Bradley,A., and Craig,N.L. (2011). A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 108, 1531-1536.

Okabe M, Ikawa M, Kominami K, Nakanishi T, Nishimune Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 1997 May 5;407(3):313-9.

Alexopoulou AN, Couchman JR, and Whiteford JR. The CMV early enhancer/chicken beta actin (CAG) promoter can be used to drive transgene expression during the differentiation of murine embryonic stem cells into vascular progenitors. BMC Cell Biology 9: 2, 2008.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен иммортализованный альвеолярный макрофаг свиней (PAM) для репликации вируса PRRS. Данный PAM чувствителен к вирусу респираторного и репродуктивного синдрома свиней (PRRSV), экспрессирует Т-антиген SV40, причем ДНК, включающая Т-антиген SV40, интегрирована в клеточный геном с использованием транспозона, который не включает длинные концевые повторы (LTR) ретровирусной ДНК. Также предложена клеточная культура, способ получения иммортализованных PAM, способ репликации PRRSV и способ получения вакцины, включающей PRRSV. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 пр.

1. Иммортализованный альвеолярный макрофаг свиней (PAM) для репликации вируса PRRS, отличающийся тем, что указанный PAM чувствителен к вирусу респираторного и репродуктивного синдрома свиней (PRRSV), экспрессирует Т-антиген SV40, причем ДНК, включающая Т-антиген SV40, интегрирована в клеточный геном с использованием транспозона, который не включает длинные концевые повторы ретровирусной ДНК.

2. Иммортализованный PAM по п.1, отличающийся тем, что указанный PAM не включает обратную транскриптазу изомеразы человека (hTERT).

3. Клеточная культура для репликации вируса PRRS, включающая PAM по любому из пп. 1-2.

4. Клеточная культура по п.3, отличающаяся тем, что указанная клеточная культура инфицирована вирусом PRRSV.

5. Клеточная культура по п.3 или 4, отличающаяся тем, что указанная клеточная культура включает M-CSF.

6. Способ получения иммортализованных PAM по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что он включает стадии:

a) получения из организма свиньи образца бронхоальвеолярного лаважа, содержащего клетки;

b) отделения клеточного компонента из указанного образца;

c) трансфекции в указанный клеточный компонент молекулы ДНК, включающей транспозоны, а также включающей ген, кодирующий Т-антиген SV40, под контролем подходящего промотора;

d) отбора PAM клеток, которые культивировались в течение по меньшей мере 5 клеточных циклов.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что на стадии d) отбирают те клетки, которые культивировались в течение по меньшей мере 10 клеточных циклов.

8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что он включает стадию добавления M-CSF в количестве, составляющем по меньшей мере 5 нг/мл, к содержащему клетки образцу бронхоальвеолярного лаважа и/или к клеточному компоненту, до проведения стадии трансфекции.

9. Способ по любому из пп. 6-8, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию добавления макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) в количестве, составляющем по меньшей мере 1 нг/мл, на стадии d) и/или в процессе культивирования иммортализованных PAM.

10. Способ репликации PRRSV, отличающийся тем, что он включает стадии

a) культивирования иммортализованных PAM по любому из пп. 1-2;

b) осуществления взаимодействия PAM клеток с PRRS вирусом;

c) ожидания завершения процесса репликации PRRSV; и

d) выделения вирусного потомства.

11. Способ получения вакцины, включающей PRRSV, отличающийся тем, что он включает способ по п.10, с проведением впоследствии стадии объединения вируса с фармацевтически приемлемым носителем.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный PRRSV вирус представлен в живой, ослабленной форме или в инактивированной форме.