ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору (CAR), который связывает антиген созревания B-клеток (BCMA). T-клетки, экспрессирующие такой CAR, полезны для лечения заболеваний плазматических клеток, таких как множественная миелома.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Множественная миелома
Множественная миелома (миелома) является злокачественной опухолью костного мозга, состоящей из плазматических клеток. Группы аномальных плазматических клеток накапливаются в костном мозге, где они препятствуют производству нормальных клеток крови. В США миелома является вторым наиболее распространенным гематологическим злокачественным новообразованием (после неходжкинской лимфомы) и составляет 13% от гематологических злокачественных новообразований и 1% от всех случаев заболевания раком. Заболевание является обременительным с точки зрения причиняемых страданий, а также медицинских расходов, поскольку оно вызывает патологические переломы, восприимчивость к инфекции, почечную недостаточность, а затем отказ костного мозга перед наступлением смерти.
В отличие от многих лимфом, миелома в настоящее время неизлечима. Стандартные химиотерапевтические средства, используемые для лечения лимфомы, в значительной степени неэффективны в случае миеломы. Кроме того, поскольку экспрессия CD20 утрачена в плазматических клетках, ритуксимаб невозможно использовать в случае этого заболевания. Новые средства, такие как бортезомиб и леналидомид, частично эффективны, но не способны приводить к долгосрочной ремиссии.
Таким образом, существует потребность в альтернативных средствах для лечения миеломы, имеющих повышенную эффективность и производящих более выраженные долговременные эффекты.
Химерные антигенные рецепторы (CAR)
Химерные антигенные рецепторы представляют собой белки, которые в их обычном формате добавляют специфичность моноклонального антитела (мАт) к эффекторной функции T-клеток. Их обычной формой является форма белка с трансмембранным доменом типа I, при этом узнающий антиген амино-конец, спейсер, трансмембранный домен, все связаны со сложным эндодоменом, который передает сигналы выживания и активации T-клеток (смотри фигуру 3).
В наиболее распространенной форме этих молекул используют одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), полученные из моноклональных антител, для узнавания целевого антигена. scFv слит через спейсер и трансмембранный домен с сигнальным эндодоменом. Такие молекулы приводят к активации T-клетки в ответ на узнавание scFv его мишени. Когда T-клетки экспрессируют такой CAR, они узнают и уничтожают клетки-мишени, экспрессирующие целевой антиген. Были разработаны несколько CAR против ассоциированных с опухолью антигенов, и подходы, заключающиеся в адоптивном переносе с использованием таких CAR-экспрессирующих T-клеток, в настоящее время проходят клинические испытания в качестве способа лечения различных форм рака. В статье Carpenter et al. (2013, Clin Cancer Res 19(8) 2048-60) описан CAR, который содержит scFv против антигена созревания B-клеток (BCMA).
BCMA представляет собой трансмембранный белок, который предпочтительно экспрессируется в зрелых лимфоцитах, то есть, B-клетках памяти, плазмабластах и плазматических клетках костного мозга. BCMA также экспрессируется на клетках множественной миеломы.
В статье Carpenter et al. показано, что T-клетки, трансдуцированные для экспрессии анти-BCMA CAR, способны специфически уничтожать миеломные клетки из плазмацитомы пациента с миеломой.
Хотя подходы с использованием CAR на основе анти-BCMA антител являются многообещающими, особого внимания в случае таргетирования данного антигена требует тот факт, что плотность BCMA на клетках миеломы крайне низка, в сравнении, например, с CD19 на клетках лимфомы. Таким образом, существует необходимость в повышении чувствительности процесса узнавания клетки-мишени T-клеткой с анти-BCMA CAR.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1 - Лигандная специфичность и определение функции APRIL и BAFF
Фактор, активирующий B-клетки (BAFF, TNFSF13B), взаимодействует с рецептором BAFF (BAFF-R, TNFRSF13C), B-клеточным мембранным антигеном (BCMA, TNFRSF17), а также трансмембранным активатором, модулятором кальция и активатором лиганда циклофилина (TACI, TNFRSF13B), в то время как лиганд A, индуцирующий пролиферацию (APRIL, TNFSF13), взаимодействует с BCMA, TACI и протеогликанами. Активация BAFF-R влияет на выживаемость периферических B-клеток, в то время как BCMA может влиять на выживаемость плазматических клеток. Во взаимодействии APRIL с протеогликанами принимает участие амино-конец APRIL, содержащий кислый сульфатированный гликоль-саминогликан в виде боковой цепи.
Фигура 2 - Данные по экспрессии BCMA на миеломе
Клетки миеломы из образцов костного мозга от 39 пациентов с множественной миеломой выделяли отбором с помощью магнитных гранул с CD138+. Эти клетки окрашивали анти-BCMA моноклональным антителом J6MO, конъюгированным с PE (GSK). Число копий антигена подсчитывали с использованием гранул PE Quantibrite beads (Becton Dickenson) в соответствии с инструкциями производителя. Диаграмма типа «ящик с усами» числа копий антигена представлена наряду с указанным диапазоном, межквартильными и средними значениями. Авторы изобретения обнаружили, что диапазон составляет 348,7-4268,4 копий BCMA на клетку со средним значением 1181 и медианным значением 1084,9.
Фигура 3 - Стандартный дизайн химерного антигенного рецептора
Представлен типичный формат химерного антигенного рецептора. Они представляют собой трансмембранные белки типа I. Эктодомен узнает антиген. Он состоит из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) антитела, который присоединен к спейсерному домену. Тот, в свою очередь, связан с трансмембранным доменом, который заякоривает молекулу в мембране. И наконец, этот домен связан с эндодоменом, который передает внутриклеточные сигналы клетке. Он состоит из одного или более сигнальных доменов.
Фигура 4 -Дизайн разных CAR, созданных на основе APRIL.
Дизайн CAR, представленный на фигуре 3, модифицировали таким образом, что scFv был заменен модифицированной формой APRIL для функционирования в качестве антигенсвязывающего домена: APRIL был укорочен так, что протеогликан-связывающий амино-конец отсутствовал. Затем сигнальный пептид присоединяли к укороченному амино-концу APRIL для направления белка к клеточной поверхности. Было получено три CAR с таким связывающим доменом на основе APRIL: A. В первом CAR в качестве спейсерного домена использовали стеблевой домен CD8 человека. B. Во втором CAR качестве спейсерного домена использовали шарнирную область из IgG1. C. В третьем CAR в качестве спейсера использовали шарнирный, CH2 и CH3 домены человеческого IgG1, модифицированные pva/a мутациями, описанными в статье Hombach et al. (2010 Gene Ther. 17: 1206-1213), для уменьшения связывания Fc-рецептора (далее в настоящем документе называемый Fc-pvaa). Во всех CAR эти спейсеры были связаны с трансмембранным доменом CD28, а затем с состоящим из трех частей эндодоменом, содержащим слитый продукт CD28, OX40 и CD3-дзета эндодомена (Pule et al., Molecular therapy, 2005: Volume 12; Issue 5; Pages 933-41).
Фигура 5 - Аннотированные аминокислотные последовательности вышеуказанных трех APRIL-CAR
A: Представлена аннотированная аминокислотная последовательность APRIL-CAR со стеблевой областью CD8; B: Представлена аннотированная аминокислотная последовательность CAR на основе APRIL с шарнирной областью IgG1; C: Представлена аннотированная аминокислотная последовательность CAR на основе APRIL с Fc-pvaa.
Фигура 6- Экспрессия и связывание лиганда CAR на основе разных APRIL
A. Рецепторы совместно экспрессировали с маркерным геном укороченного CD34 в ретровирусном генном векторе. Экспрессия маркерного гена на трансдуцированных клетках является подтверждением трансдукции. B. T-клетки трансдуцировали CAR на основе APRIL со спейсером либо из стеблевой области CD8, шарнирной области IgG1, либо из Fc. Для тестирования того, могут ли эти рецепторы стабильно экспрессироваться на клеточной поверхности, T-клетки затем окрашивали анти-APRIL-биотин/стрептавидин APC и анти-CD34. Проводили проточно-цитометрический анализ. APRIL в равной степени обнаруживали на клеточной поверхности в трех CAR, это свидетельствовало о том, что они в равной степени стабильно экспрессировались. C. Затем определяли способность CAR узнавать TACI и BCMA. Трансдуцированные T-клетки окрашивали либо рекомбинантным BCMA, либо TACI, слитыми с Fc IgG2a мыши, наряду с вторичными антителами против иммуноглобулинов мыши, и анти-CD34. Все три формата рецептора продемонстрировали связывание как с BCMA, так и с TACI. Неожиданно было обнаружено, что связывание с BCMA, судя по всему, было сильнее, чем с TACI. Другим удивительным наблюдением было то, что, хотя все три CAR были в равной степени экспрессированы, CAR со стеблевой областью CD8 и шарнирной областью IgG1, похоже, лучше узнавали BCMA и TACI, чем CAR со спейсером Fc.
Фигура 7 - Функционирование различных конструктов CAR.
Проводили функциональные анализы трех разных CAR на основе APRIL. T-клетки периферической крови нормальных доноров либо не трансдуцировали (н/т), либо трансдуцировали для экспрессии разных CAR. Трансдукцию проводили с использованием супернатантов с одинаковыми титрами. Эти T-клетки затем истощали по CD56 для удаления неспецифической активности NK и использовали в качестве эффекторов. Клетки SupT1, либо не трансдуцированные (н/т), либо трансдуцированные для экспрессии BCMA или TACI, использовали в качестве мишеней. Представленные данные являются средними величинами и стандартным отклонением из 5 независимых экспериментов. A. Специфическое уничтожение экспрессирующих BCMA и TACI клеток T-клетками определяли в анализе высвобождения хрома. B. Также определяли высвобождение интерферона-γ. Мишени и эффекторы совместно культивировали в соотношении 1:1. Через 24 часа интерферон-γ в супернатанте анализировали методом ELISA. C. Также определяли пролиферацию/выживаемость T-клеток с CAR путем подсчета числа T-клеток с CAR в той же совместной культуре, инкубированной еще в течение 6 дней. Все 3 CAR демонстрировали прямые ответы против экспрессирующих BCMA и TACI мишеней. Ответы на BCMA были сильнее, чем на TACI.
Фигура 8 - Уничтожение клеток первичной миеломы T-клетками с APRIL-CAR
Поскольку большинство клеток первичной миеломы экспрессируют небольшое количество молекул BCMA на своей поверхности, проводили исследование того, происходит ли уничтожение клеток первичной миеломы, несмотря на экспрессию низкой плотности. Были выбраны три случая, представляющие диапазон экспрессии BCMA, описанный на фигуре 2: в первом случае отражающее экспрессию окрашивание было тусклым (ниже, чем в среднем); во втором случае экспрессия была промежуточной (примерно средняя экспрессия) и в третьем случае отражающее экспрессию окрашивание было ярким (выше, чем при средней экспрессии). Гистограмма окрашивания BCMA в зависимости от изотипического контроля для всех трех случаев представлена слева. В этом анализе тестировали только APRIL-CAR со стеблевой областью CD8 и шарнирной областью. Слева показана выживаемость в сравнении с исходным количеством клеток миеломы в день 3 и день 6 после совместного культивирования в соотношении 1:1 клеток миеломы и T-клеток с CAR. Ко дню 6 >95% клеток миеломы были уничтожены, включая те, которые имели тусклое окрашивание на экспрессию BCMA.
Фигура 9 - Вектор, коэкспрессирующий CAR на основе APRIL с укороченным CD34
Линию клеток, экспрессирующих вектор, используемый для скрининга, инкубировали либо с BCMA-Fc, либо с TACI-Fc, и окрашивали как анти-CD34, так и анти-Fc человека мАт, конъюгированными с PE и FITC. Затем клетки изучали методом проточной цитометрии. Это показало типичную картину связывания BCMA и TACI относительно маркерного гена CD34.
Фигура 10A - Схематическая диаграмма, иллюстрирующая классический CAR
B: Дизайн разных созданных CAR на основе APRIL.
Сигнальный пептид был присоединен к укороченному амино-концу APRIL. Тот был слит с разными спейсерами: или шарнирной областью, CH2 и CH3 доменами IgG1 человека, модифицированными мутацией pvaa, как описано в статье Hombach et al. (2010 Gene Ther. 17: 1206-1213), для уменьшения связывания Fc-рецептора; или стеблевой областью CD8α человека; или шарнирной областью IgG1. Эти спейсеры были связаны с состоящим из трех частей эндодоменом, содержащим трансмембранный домен CD28, эндодомен OX40 и эндодомен CD3-дзета.
Фигура 11 - Экспрессия разных CAR
Рецепторы совместно экспрессировали с усиленным синим флуоресцентным белком 2 (eBFP2), используя последовательность IRES. Первичные человеческие T-клетки трансдуцировали и окрашивали анти-APRIL-биотин/стрептавидин APC. Проводили проточно-цитометрический анализ. Сигнал eBFP2 показан против результатов обнаружения APRIL. Все три CAR стабильно экспрессированы (репрезентативный эксперимент из 3 независимых экспериментов, проведенных с использованием T-клеток 3 трех разных нормальных доноров).
Фигура 12 -- Анализ высвобождения хрома
Использовали T-клетки периферической крови нормальных доноров, либо не трансдуцированные (н/т), либо трансдуцированные для экспрессии CAR с разными спейсерами, в качестве эффекторов, и клетки SupT1, либо не трансдуцированные (н/т), либо трансдуцированные для экспрессии BCMA или TACI, в качестве мишеней. T-клетки были истощены по CD56 для уменьшения активности NK. Данный эксперимент является репрезентативным из трех независимых экспериментов и приведен в качестве примера. Кумулятивные данные по уничтожению приведены на фигуре 7A. Видно специфическое уничтожение экспрессирующих BCMA и TACI клеток T-клетками и отсутствие активности в отношении клеток, не являющихся мишенями.
Фигура 13 - Высвобождение интерферона-гамма
Высвобождение интерферона-гамма при совместном культивировании в соотношении 1:1 эффекторов и мишеней измеряли методом ELISA. Конструкт со стеблевой областью CD8, судя по всему, обладал наибольшей специфичностью, в то время как конструкт с шарнирной областью, вызывающий наибольшее высвобождение интерферона, демонстрировал некоторую неспецифическую активность. Данный эксперимент является репрезентативным из 3 независимых экспериментов и приведен в качестве примера. Кумулятивные данные по высвобождению интерферона-гамма приведены на фигуре 7B.
Фигура 14 -- Примеры экспрессии BCMA на первичных миеломах
Показаны четыре примера образцов миеломы, окрашенных с помощью крысиных мАт Vicky1 против BCMA человека. На первой панели показано яркое окрашивание BCMA в образце от пациента с плазмоклеточным лейкозом (необычной, запущенной и агрессивной формой миеломы). Другие три случая являются клинически и морфологически типичными миеломами. Они демонстрируют обычно наблюдаемое промежуточное или тусклое окрашивание. Сверху наложено окрашивание изотипическим контролем (серый цвет). Эти данные являются примером кумулятивных данных по экспрессии BCMA, показанной на фигуре 2.
Фигура 15 - Аминокислотная последовательность APRIL-CAR с эпитопным маркером V5.
A: dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ
B: dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ
C: dAPRIL-HNG-CD28OXZ.
Последовательности на данной фигуре отличаются от последовательностей на фигуре 5, имеющих другой сигнальный пептид и не имеющих маркера V5.
Фигура 16 - Демонстрация in vivo функционирования T-клеток с APRIL-CAR
Шесть самок мышей NSG в возрасте 3 месяцев получали 1x107 клеток MM1.s.FLuc инъекцией в хвостовую вену. Биолюминесцентное изображение мышей получали в день 8 и день 13. После визуализации в день 13 четыре мыши получали 5×106 T-клеток с APRIL-CAR инъекцией в хвостовую вену. Визуализацию у мышей проводили в день 13 и день 18. Мыши, получавшие T-клетки с CAR, отмечены (*). Ремиссию миеломы можно наблюдать ко дню 18 у всех получавших лечение мышей, в то время как заболевание у не получавших лечение мышей прогрессировало.
СУЩНОСТЬ АСПЕКТОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ
B-клеточный мембранный антиген (BCMA) представляет собой поверхностный белок, экспрессируемый почти на всех видах множественной миеломы (MM). В иных случаях BCMA экспрессируется только на плазматических клетках, таким образом, таргетирование данного антигена может подтверждать эффективность лечения миеломы. Однако при таргетировании этого антигена следует иметь в виду низкий уровень экспрессии BCMA (смотри фигуру 2).
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что, если использовать связывающий домен на основе лиганда A, индуцирующего пролиферацию (APRIL), а не связывающего BCMA антитела, в молекуле CAR-типа, то T-клетки, экспрессирующие такие CAR, обеспечивают очень эффективное уничтожение экспрессирующих BCMA клеток-мишеней, даже тех, которые отличаются низкими уровнями экспрессии.
Не желая быть связанными теорией, авторы настоящего изобретения предполагают, что это происходит в результате того, что связыванию BCMA с APRIL присуща трехкратная симметрия. Это означает, что в каждом взаимодействии CAR и BCMA принимают участие 3 CAR, сближая 3 эндодомена на поверхности T-клетки. Поскольку T-клеточная активация запускается за счет тесного сближения сигнальных эндодоменов в иммунологическом синапсе, дизайн CAR по настоящему изобретению является высокочувствительным и специфическим. Поскольку BCMA экспрессируется с очень низкой плотностью на клетках первичной миеломы (смотри фигуры 2 и 7), такой дизайн рецептора особенно подходит для данной мишени.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору (CAR), содержащему:
(i) связывающий антиген созревания B-клеток (BCMA) домен, который содержит по меньшей мере часть индуцирующего пролиферацию лиганда (APRIL);
(ii) спейсерный домен
(iii) трансмембранный домен; и
(iv) внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен.
BCMA-связывающий домен может содержать укороченный APRIL, который содержит сайт связывания BCMA, но лишен амино-концевой части APRIL, ответственной за связывание протеогликанов. Такая молекула может содержать последовательность, обозначенную SEQ ID No. 14. Альтернативно, молекула может содержать вариант данной последовательности, имеющий по меньшей мере на 80% идентичную последовательность, который связывает BCMA.
Трансмембранный и внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен могут содержать последовательность, обозначенную SEQ ID No. 7, или ее вариант, имеющий по меньшей мере на 80% идентичную последовательность.
BCMA-связывающий домен и трансмембранный домен могут быть связаны спейсером. Спейсер может представлять собой одно из следующего: спейсер из IgG1; шарнирную область IgG1; или стеблевую область CD8 человека.
CAR по первому аспекту изобретения может содержать последовательность, обозначенную SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5 или 6, либо ее вариант, который имеет по меньшей мере на 80% идентичную последовательность, но сохраняет способность i) связывать BCMA и ii) индуцировать T-клеточную сигнализацию.
CAR по первому аспекту изобретения может связываться с BCMA в виде тримера.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей CAR по любому из предшествующих пунктов.
Нуклеотидная последовательность может содержать последовательность, обозначенную SEQ ID No 15, 16, 17, 18, 19 или 20, либо ее вариант, имеющий по меньшей мере на 80% идентичную последовательность.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеотидную последовательность по второму аспекту изобретения.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к T-клетке или NK-клетке, экспрессирующей CAR по первому аспекту изобретения.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения T-клетки или NK-клетки по четвертому аспекту изобретения, включающему этап введения нуклеиновой кислоты по второму аспекту изобретения в T-клетку или NK-клетку.
В шестом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вектор по третьему аспекту изобретения или T-клетку/NK-клетку по четвертому аспекту изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.
В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания плазматических клеток, включающему этап введения субъекту вектора по третьему аспекту изобретения или T-клетки/NK-клетки по четвертому аспекту изобретения.
Заболевание плазматических клеток может быть выбрано из плазмацитомы, плазмоклеточного лейкоза, множественной миеломы, макроглобулинемии, амилоидоза, макроглобулинемии Вальденстрема, солитарной костной плазмацитомы, экстрамедуллярной плазмацитомы, остеосклеротической миеломы, болезни тяжелых цепей, моноклональной гаммопатии неопределенного значения и тлеющей множественной миеломы.
Заболевание плазматических клеток может представлять собой множественную миелому.
В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к вектору по третьему аспекту изобретения или T-клетке/NK-клетке по четвертому аспекту изобретения для использования в лечении заболевания плазматических клеток.
В девятом аспекте настоящее изобретение относится к применению вектора по третьему аспекту изобретения или T-клетки/NK-клетки по четвертому аспекту изобретения в производстве лекарственного средства для лечения заболевания плазматических клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ (CAR)
Химерные антигенные рецепторы (CAR), также известные как химерные T-клеточные рецепторы, искусственные T-клеточные рецепторы и химерные иммунорецепторы, представляют собой сконструированные рецепторы, которые придают произвольную специфичность иммунной эффекторной клетке. В классическом CAR (фигура 3) специфичность моноклонального антитела придана T-клетке или NK-клетке. Кодирующие CAR нуклеиновые кислоты можно вводить в T-клетки или NK-клетки с использованием, например, ретровирусных векторов. Таким образом может быть получено большое число специфичных для раковой опухоли T-клеток или NK-клеток для адоптивного клеточного переноса. Начальные клинические исследования такого подхода показали эффективность при некоторых формах рака, в основном при таргетировании пан-B-клеточного антигена CD19 для лечения В-клеточных злокачественных новообразований.
Связывающий целевой антиген домен CAR обычно слит через спейсер и трансмембранный домен с сигнальным эндодоменом. Когда CAR связывает целевой антиген, это приводит к передаче активирующего сигнала T-клетке, на которой он экспрессирован.
CAR по настоящему изобретению содержит:
(i) связывающий антиген созревания B-клеток (BCMA) домен, содержащий по меньшей мере часть индуцирующего пролиферацию лиганда (APRIL), который обсуждается более подробно ниже;
(ii) спейсер
(iii) трансмембранный домен; и
(iv) внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен.
CAR по настоящему изобретению может содержать одну из следующих аминокислотных последовательностей:
SEQ ID No. 1 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No. 2 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No. 3 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No. 4 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No. 5 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No. 6 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.
Молекула по изобретению может содержать вариант последовательности, обозначенной SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5 или 6, имеющий по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную последовательность, при условии, что эта вариантная последовательность представляет собой молекулу, определенную в первом аспекте изобретения, то есть, CAR, который содержит:
(i) BCMA-связывающий домен;
(ii) спейсерный домен
(iii) трансмембранный домен; и
(iv) внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен.
Процент идентичности между двумя полипептидными последовательностями можно легко определять с помощью программы, такой как BLAST, которая находится в свободном доступе на вебсайте http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ДОМЕН
Трансмембранный домен представляет собой последовательность CAR, которая пронизывает мембрану. Он может содержать гидрофобную альфа-спираль. Трансмембранный домен может быть получен из CD28, что придает хорошую стабильность рецептору. Трансмембранный домен может быть получен из любого трансмембранного белка типа I. Трансмембранный домен может представлять собой синтетическую последовательность, которая, согласно предсказаниям, образует гидрофобную спираль.
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ T-КЛЕТОЧНЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ ДОМЕН (ЭНДОДОМЕН)
Эндодомен представляет собой передающую сигнал часть CAR. После узнавания антигена рецепторы группируются и сигнал передается клетке. Наиболее часто используемый компонент эндодомена представляет собой эндодомен CD3-дзета, который содержит 3 ITAM. Он передает сигнал активации T-клетке после связывания антигена. CD3-дзета может не обеспечивать надлежащий сигнал активации и могут быть необходимы дополнительные костимулирующие сигналы. Например, химерные CD28 и OX40 можно использовать вместе с CD3-дзета для передачи сигнала пролиферации/выживания, или все три можно использовать вместе (Pule et al., Molecular therapy, 2005: Volume 12; Issue 5; Pages 933-41). Эндодомен CAR также может быть получен из других сигнальных доменов, либо отдельно, либо в сочетании, полученных из сигнальных белков, встречающихся в природе или искусственных, сконструированных специалистами в данной области, таким образом, чтобы CAR передавал надлежащий сигнал для эффективного терапевтического действия CAR.
Эндодомен CAR по настоящему изобретению может содержать эндодомен CD28, а также OX40 и CD3-дзета эндодомен.
Трансмембранный и внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен (эндодомен) CAR по настоящему изобретению могут содержать последовательность, обозначенную SEQ ID No. 7 или ее вариант, имеющий по меньшей мере на 80% идентичную последовательность.
SEQ ID No. 7
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Вариантная последовательность может иметь по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID No. 7, при условии, что последовательность создает эффективный трансмембранный домен и эффективный внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен.
СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД
CAR по настоящему изобретению может содержать сигнальный пептид, так что, когда CAR экспрессируется внутри клетки, такой как T-клетка, формирующийся белок направляется в эндоплазматический ретикулум и затем к клеточной поверхности, где он экспрессируется.
Ядро сигнального пептида может содержать длинный гидрофобный аминокислотный участок, имеющий тенденцию к образованию одиночной альфа-спирали. Сигнальный пептид может начинаться с короткого положительного заряженного аминокислотного участка, который помогает обеспечивать правильную топологию полипептида в процессе транслокации. На конце сигнального пептида, как правило, существует аминокислотный участок, который узнается и расщепляется сигнальной пептидазой. Сигнальная пептидаза может расщеплять пептид либо в процессе, либо после завершения транслокации, с образованием свободного сигнального пептида и зрелого белка. Свободные сигнальные пептиды затем расщепляются особыми протеазами.
Сигнальный пептид может находиться на амино-конце молекулы.
CAR по изобретению может иметь общую формулу:
Сигнальный пептид - BCMA-связывающий домен - спейсерный домен - трансмембранный домен - внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен.
Сигнальный пептид может содержать SEQ ID No. 8 или 9, или их вариант, имеющий 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотные мутации (вставки, замены или добавления), при условии, что сигнальный пептид продолжает функционировать, обеспечивая экспрессию CAR на клеточной поверхности.
SEQ ID No. 8: MGTSLLCWMALCLLGADHADG
SEQ ID No. 9: METDTLLLWVLLLWVPGSTG
Сигнальный пептид с последовательностью SEQ ID No. 8 и SEQ ID No 9 является компактным и высокоэффективным. Согласно предсказаниям, он обеспечивает примерно 95% расщепление после концевого остатка глицина, делая возможным эффективное отделение с помощью сигнальной пептидазы.
СПЕЙСЕР
CAR по настоящему изобретению может содержать последовательность спейсера для связывания BCMA-связывающего домена с трансмембранным доменом и пространственного разделения BCMA-связывающего домена и эндодомена. Гибкий спейсер позволяет BCMA-связывающему домену ориентироваться в разных направлениях, делая возможным связывание BCMA.
Последовательность спейсера может, например, представлять собой Fc-область IgG1, шарнирную область IgG1 или стеблевую область CD8. Альтернативно, линкер может содержать альтернативную линкерную последовательность, которая имеет сходную длину и/или характер расположения доменов, что и Fc-область IgG1, шарнирная область IgG1 или стеблевая область CD8.
Спейсер может быть коротким спейсером, например, спейсером, который содержит менее 100, менее 80, менее 60 или менее 45 аминокислот. Спейсер может представлять собой или содержать шарнирную область IgG1 или стеблевую область CD8, либо их модифицированные варианты.
Спейсер из IgG1 человека можно изменять для удаления Fc-связывающих фрагментов.
Примеры аминокислотных последовательностей для этих спейсеров приведены ниже:
SEQ ID No. 10 (шарнир-CH2CH3 из IgG1 человека)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD
SEQ ID No. 11 (стеблевая область CD8 человека):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
SEQ ID No. 12 (шарнирная область IgG1 человека):
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
B-КЛЕТОЧНЫЙ МЕМБРАННЫЙ АНТИГЕН (BCMA)
CAR по первому аспекту изобретения содержит домен, который связывает BCMA.
BCMA, также известный как TNFRSF17, представляет собой специфический поверхностный антиген плазматических клеток, который экспрессируется исключительно на гемопоэтических клетках B-клеточной линии дифференцировки или дендритных клетках. Он является членом семейства рецепторов TNF. BCMA не экспрессируется на наивных B-клетках, но его экспрессия повышается в процессе дифференциации B-клеток в плазмабласты, и он сильно экспрессирован на B-клетках памяти, плазмабластах и плазматических клетках костного мозга. BCMA также экспрессируется на большинстве клеток первичной миеломы. В отличие от других мишеней CAR, таких как CD19, BCMA экспрессируется с низкой плотностью (фигура 2).
BCMA действует в сети взаимосвязанных лигандов и рецепторов, что схематично представлено на фигуре 1. Два других рецептора TNF имеют общие лиганды APRIL и BAFF с BCMA - TACI (TNFRSF13B), который присутствует на активированных T-клетках и всех B-клетках, и BAFF-R (TNFRSF13C), который преимущественно экспрессируется на B-лимфоцитах. Клетки множественной миеломы в некоторых случаях экспрессируют TACI и в большинстве случаев BCMA, но никогда BAFF-R.
APRIL
BCMA-связывающий домен CAR по изобретению содержит по меньшей мере часть индуцирующего пролиферацию лиганда (APRIL). APRIL также известен как TNFSF13.
Последовательность дикого типа APRIL доступна на UNIPROT/O75888 и приведена ниже (SEQ ID No. 13). Он не является классическим секретируемым белком в том, что у него нет сигнального пептида. Он имеет сайт расщепления фурином «KQKKQK» (подчеркнут в SEQ ID No. 13). Амино-конец участвует в связывании протеогликанов.
BCMA-связывающий домен может содержать BCMA-связывающий сайт из APRIL. BCMA-связывающий домен может содержать фрагмент APRIL, который содержит BCMA-связывающий сайт.
BCMA-связывающий домен может содержать укороченный APRIL, который лишен амино-концевого фрагмента молекулы. Укороченный APRIL может сохранять способность к связыванию BCMA и TACI, но утрачивает способность к связыванию протеогликанов. Укороченный APRIL может расщепляться на сайте расщепления фурином или сразу за ним. Укороченный APRIL может быть лишен амино-концевых 116 аминокислот из молекулы APRIL дикого типа с последовательностью SEQ ID No. 13. Укороченный APRIL может содержать последовательность, обозначенную SEQ ID No. 14 (которая соответствует части SEQ ID No. 13, выделенной жирным шрифтом), или ее вариант. Он соответствует части молекулы, которая необходима для связывания BCMA и TACI.
SEQ ID No. 13
SEQ ID No. 14
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
CAR по настоящему изобретению может содержать вариант укороченной молекулы APRIL, обозначенной SEQ ID No. 14, который по меньшей мере на 80% идентичен по аминокислотной последовательности и который обладает такой же или улучшенной способностью к связыванию BCMA. Вариантная последовательность может иметь по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID No. 14.
НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
Второй аспект изобретения относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей CAR по первому аспекту изобретения.
Нуклеотидная последовательность может представлять собой или содержать одну из следующих последовательностей:
SEQ ID No. 15 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No. 16 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No. 17 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No. 18 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No. 19 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No. 20 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA.
Нуклеотидная последовательность может кодировать ту же аминокислотную последовательность, что и последовательность, закодированная SEQ ID No. 15, 16, 17, 18 19 или 20, но может представлять собой другую нуклеотидную последовательность, вследствие вырожденности генетического кода. Нуклеотидная последовательность может иметь по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности с последовательностью, обозначенной SEQ ID No. 15, 16, 17, 18 19 или 20, при условии, что она кодирует CAR, определенный в первом аспекте изобретения.
ВЕКТОР
Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению. Такой вектор можно использовать для введения нуклеотидной последовательности в клетку-хозяина таким образом, что она экспрессирует и продуцирует молекулу по первому аспекту изобретения.
Вектор может, например, представлять собой плазмиду или синтетическую мРНК, или вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор или лентивирусный вектор.
Вектор может быть способен трансфицировать или трансдуцировать эффекторную клетку.
КЛЕТКА-ХОЗЯИН
Изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту по изобретению. Клетка-хозяин может быть способна экспрессировать CAR по первому аспекту изобретения.
Клетка-хозяин может быть человеческой T-клеткой или человеческой NK-клеткой.
T-клетку, способную экспрессировать CAR по изобретению, можно получать путем трансдукции или трансфекции T-клетки кодирующей CAR нуклеиновой кислотой.
T-клетка может представлять собой ex vivo T-клетку. T-клетка может быть из образца мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). T-клетки можно активировать и/или размножать перед трансдукцией кодирующей CAR нуклеиновой кислотой, например, путем обработки анти-CD3 моноклональным антителом.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей вектор или экспрессирующую CAR T-клетку по изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом и, необязательно, одним или более другими фармацевтически активными полипептидами и/или соединениями. Такой препарат, например, может быть в форме, подходящей для внутривенной инфузии.
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ
T-клетки, экспрессирующие молекулу CAR по настоящему изобретению, способны к уничтожению раковых клеток, таких как клетки множественной миеломы. Экспрессирующие CAR T-клетки можно создавать ex vivo или из собственной периферической крови пациента (1я сторона), или в контексте трансплантата гемопоэтических стволовых клеток из периферической крови донора (2я сторона), или из периферической крови от не связанного донора (3я сторона). Альтернативно, T-клетки с CAR можно получать путем ex-vivo дифференциации индуцируемых клеток-предшественников или эмбриональных клеток-предшественников T-клеток. В этих случаях T-клетки с CAR получают путем введения ДНК или РНК, кодирующей CAR, одним из многих методов, включая трансдукцию вирусным вектором, трансфекцию ДНК или РНК.
T-клетки, экспрессирующие молекулу CAR по настоящему изобретению, можно использовать для лечения онкологического заболевания, в частности, заболевания плазматических клеток или B-клеточного заболевания, связанного с повышенной экспрессией BCMA.
Заболевания плазматических клеток включают плазмацитому, плазмоклеточный лейкоз, множественную миелому, макроглобулинемию, амилоидоз, макроглобулинемию Вальденстрема, солитарную костную плазмацитому, экстрамедуллярную плазмацитому, остеосклеротическую миелому (синдром POEMS) и болезни тяжелых цепей, а также клинически неоднозначную моноклональную гаммопатию неопределенного значения/тлеющую множественную миелому.
Заболевание может представлять собой множественную миелому.
Примерами B-клеточных заболеваний, которые связаны с повышенными уровнями экспрессии BCMA, являются ХЛЛ (хронический лимфоцитарный лейкоз) и неходжкинская лимфома (НХЛ). Биспецифические связывающие агенты по изобретению можно также использовать для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка (СКВ), рассеянный склероз (РС) и ревматоидный артрит (РА).
Способ по настоящему изобретению можно использовать для лечения онкологического заболевания, в частности, заболевания плазматических клеток или B-клеточного заболевания, связанного с повышенной экспрессией BCMA.
Способ лечения заболевания относится к терапевтическому применению вектора или T-клетки по изобретению. В этом отношении, вектор или T-клетку можно вводить субъекту, имеющему заболевание или состояние, с целью уменьшения, ослабления или облегчения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с заболеванием, и/или замедления, ослабления или блокирования прогрессирования заболевания. Способ по изобретению может вызывать или стимулировать опосредованное T-клетками уничтожение экспрессирующих BCMA клеток, таких как плазматические клетки.
Далее изобретение будет дополнительно описано с помощью примеров, которые призваны облегчать специалисту в данной области применение на практике изобретения и не должны никоим образом ограничивать объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Характеризация BCMA как мишени для миеломы
Клетки первичной миеломы выделяли, выполняя иммуномагнитную селекцию на CD138 на свежих образцах костного мозга от пациентов с множественной миеломой, имеющих болезнь в явной форме. Эти клетки окрашивали специфическим для BCMA мАт J6MO (GSK), конъюгированным с PE. В то же время получали стандарты гранул с известным числом сайтов связывания, используя набор PE Quantibrite bead kit (Becton Dickenson) в соответствии с инструкциями производителя. Число копий BCMA на клетках миеломы можно получать, проводя корреляцию средней интенсивности флуоресценции от клеток миеломы со стандартной кривой, полученной с помощью гранул. Было установлено, что диапазон числа копий BCMA на поверхности клеток миеломы является низким: 348,7-4268,4 копий BCMA на клетку, со средним значением 1181 и медианным значением 1084,9 (фигура 2). Это гораздо меньше, чем, например, в случае CD19 и GD2, классических мишеней для CAR. Наличие экспрессии BCMA на клетках первичной миеломы также подтверждали с помощью антитела Vicky-1 (Abcam Ab17323), примеры чего приведены на фигуре 14.
Пример 2 - Дизайн и конструирование CAR на основе APRIL.
APRIL в его естественной форме представляет собой секретируемый белок типа II. Для использования APRIL в качестве связывающего BCMA домена CAR необходимо превратить этот секретируемый белок типа II в связанный с мембраной белок типа I, и чтобы данный белок был стабильным и сохранял способность к связыванию BCMA в этой форме. Для получения молекул-кандидатов крайний амино-конец APRIL делетировали для устранения связывания с протеогликанами. Затем добавляли сигнальный пептид для направления формирующегося белка в эндоплазматический ретикулум и, таким образом, на клеточную поверхность. Кроме того, поскольку характер используемого спейсера может изменять функционирование CAR, тестировали три разных спейсерных домена: получали CAR на основе APRIL, содержащий (i) спейсер из IgG1 человека, измененный для удаления Fc-связывающих фрагментов; (ii) стеблевую область CD8 и (iii) отдельную шарнирную область IgG1 (рисунок на фигуре 4 и аминокислотные последовательности на фигуре 5, а также аминокислотные последовательности на фигуре 19, которые отличаются от последовательностей на фигуре 5 тем, что имеют другой сигнальный пептид и эпитопный маркер V5). Эти CAR были экспрессированы в бицистронном ретровирусном векторе (фигура 6A) так, чтобы с удобного маркерного гена мог совместно экспрессироваться маркерный белок - укороченный CD34.
Пример 3 - Экспрессия и функционирование CAR на основе APRIL.
Целью данного исследования была проверка того, будут ли CAR на основе APRIL, которые были сконструированы, экспрессироваться на клеточной поверхности, и будет ли APRIL сворачиваться, образуя нативный белок. T-клетки трансдуцировали этими разными конструктами CAR, окрашивали с использованием коммерчески доступного анти-APRIL мАт, наряду с окрашиванием на маркерный ген, и анализировали методом проточной цитометрии. Результаты данного эксперимента приведены на фигуре 6B, где построен график связывания APRIL в зависимости от флуоресценции маркерного гена. Эти данные показывают, что в этом формате CAR на основе APRIL экспрессируются на клеточной поверхности и APRIL сворачивается в достаточной степени, чтобы быть узнанным анти-APRIL мАт.
Затем определяли, способен ли APRIL в этом формате узнавать BCMA и TACI. Рекомбинантные BCMA и TACI получали в виде слитых белков с Fc из IgG2a мыши. Эти рекомбинантные белки инкубировали с трансдуцированными T-клетками. После этого клетки промывали и окрашивали антителом против иммуноглобулинов мыши, конъюгированным с флуорофором, а также антителом для обнаружения маркерного гена, конъюгированным с другим флуорофором. Клетки анализировали методом проточной цитометрии, и результаты представлены на фигуре 6C. Разные CAR были способны связывать как BCMA, так и TACI. Удивительно, но CAR были в большей степени способны к связыванию BCMA, чем TACI. Кроме того, неожиданно, что CAR со спейсером из стеблевой области CD8 или шарнирной области IgG1 были в большей степени способны к связыванию BCMA и TACI, чем CAR со спейсером из Fc.
Пример 4 - Химерные антигенные рецепторы на основе APRIL активны против экспрессирующих BCMA клеток
T-клетки от нормальных доноров трансдуцировали разными APRIL-CAR и тестировали против клеток SupT1 либо дикого типа, либо сконструированных для экспрессии BCMA и TACI. Для определения функции использовали несколько анализов. Проводили классический анализ с высвобождением хрома. Вкратце, клетки-мишени (клетки SupT1) метили 51Cr и смешивали с эффекторами (трансдуцированными T-клетками) в разных соотношениях. Лизис клеток-мишеней определяли путем подсчета 51Cr в супернатанте совместной культуры (на фигуре 6A представлены кумулятивные данные, иллюстративные данные из одного анализа с разными соотношениями эффекторы:мишени приведены на фигуре 12).
Кроме того, супернатант от T-клеток, культивированных в соотношении 1:1 с клетками SupT1, анализировали методом ELISA на интерферон-гамма (на фигуре 6B представлены кумулятивные данные, иллюстративные данные из одного анализа представлены на фигуре 13). Также проводили измерение размножения T-клеток после одной недели совместного культивирования с клетками SupT1 (фигура 6C). T-клетки подсчитывали методом проточной цитометрии с калибровкой по гранулам для подсчета. Эти экспериментальные данные показали, что CAR на основе APRIL способны уничтожать экспрессирующие BCMA мишени. Кроме того, эти данные показали, что CAR на основе стеблевой области CD8 или шарнирной области IgG1 более эффективны, чем CAR на основе Fc-pvaa.
Пример 5 - CAR на основе APRIL способны уничтожать клетки первичной миеломы
Приведенные выше данные являются обнадеживающими, поскольку они демонстрируют, что, в принципе, возможно создавать CAR на основе APRIL. Однако, поскольку большинство клеток первичной миеломы экспрессируют небольшое количество молекул BCMA на своей поверхности, было изучено, будут ли такие CAR на основе APRIL вызывать уничтожение клеток первичной миеломы, особенно в случае экспрессии низкой плотности. Были выбраны три случая, представляющие диапазон экспрессии BCMA, описанный на фигуре 2: в первом случае отражающее экспрессию окрашивание было тусклым (ниже, чем в среднем); во втором случае экспрессия была промежуточной (примерно средняя экспрессия) и в третьем случае отражающее экспрессию окрашивание было ярким (выше, чем при средней экспрессии). Слева на фигуре 8 представлена гистограмма окрашивания BCMA в зависимости от изотипического контроля во всех трех случаях для иллюстрации экспрессии BCMA. Поскольку при сравнении CAR на основе APRIL с разными спейсерами было установлено, что CAR со спейсером из стеблевой области CD8 и спейсером из шарнирной области IgG1 были более эффективны, чем CAR со спейсером из Fc-pvaa, в данном анализе тестировали только APRIL-CAR со стеблевой областью CD8 и шарнирной областью IgG1. Слева показана выживаемость в сравнении с исходным количеством клеток миеломы в день 3 и день 6 после совместного культивирования в соотношении 1:1 клеток миеломы и T-клеток с CAR. Ко дню 6 >95% клеток миеломы были уничтожены, включая те, которые имели тусклое окрашивание на экспрессию BCMA. Слабо экспрессирующие BCMA клетки миеломы могут являться мишенью для APRIL-CAR, хотя и с более медленными темпами уничтожения, чем экспрессирующие на более высоком уровне клетки.
Пример 6 - Секретируемый и укороченный APRIL, слитый со спейсером из Fc, узнает BCMA и TACI
Для изучения того, сможет ли укороченный APRIL в формате CAR (то есть, слитый с трансмембранным доменом и заякоренный в клеточной мембране) связывать BCMA и TACI, был сконструирован базовый CAR в рамке считывания с геном самоотщепляющегося пептида 2A вируса ящура с укороченным CD34, в качестве удобного маркерного гена. Была получена стабильная линия клеток SUPT1, экспрессирующих этот конструкт. Также были получены секретируемые укороченные BCMA и TACI, слитые с Fc-доменом Ig человека (и других видов, не показано), и продуцирован рекомбинантный белок. Показано, что как BCMA-Fc, так и TACI-Fc связывают сконструированные клетки линии SUPT1. Установлено, что только клетки, экспрессирующие маркерный ген CD34, связывают BCMA-Fc и TACI-Fc (фигура 9).
Пример 7 - Химерные антигенные рецепторы на основе APRIL стабильно экспрессируются на поверхности T-клеток
Спейсерный домен CAR может изменять чувствительность и специфичность. Были получены три варианта CAR на основе APRIL с тремя спейсерными доменами: (i) спейсером из IgG1 человека, измененным для удаления Fc-связывающих фрагментов; (ii) стеблевой областью CD8 и (iii) отдельной шарнирной областью IgG1 (фигура 10B). Первичные человеческие T-клетки трансдуцировали этими тремя разными CAR и окрашивали с использованием коммерчески доступного анти-APRIL мАт (фигура 11).
Пример 8 - Химерные антигенные рецепторы на основе APRIL активны против клеток, экспрессирующих родственную мишень
T-клетки от нормальных доноров трансдуцировали разными APRIL-CAR и тестировали против клеток SupT1 либо дикого типа, либо сконструированных для экспрессии BCMA и TACI. Для определения функции использовали несколько анализов. Проводили классический анализ с высвобождением хрома. Вкратце, клетки-мишени (клетки SupT1) метили 51Cr и смешивали с эффекторами (трансдуцированными T-клетками) в разных соотношениях. Лизис клеток-мишеней определяли путем подсчета 51Cr в супернатанте совместной культуры (фигура 12).
Кроме того, супернатант от T-клеток, культивированных в соотношении 1:1 с клетками SupT1, анализировали методом ELISA на интерферон-гамма (фигура 13).
Также проводили измерение размножения T-клеток после одной недели совместного культивирования с клетками SupT1. T-клетки подсчитывали методом проточной цитометрии с калибровкой по гранулам для подсчета. Первоначальные данные (не показано), судя по всему, свидетельствовали о том, что конструкт на основе стеблевой области CD8 приводил к большей пролиферации T-клеток, чем другие конструкты.
Пример 9 - Демонстрация in vivo функционирования T-клеток с APRIL-CAR
Для демонстрации функционирования T-клеток с APRIL-CAR in vivo T-клетки с APRIL-CAR тестировали в человеческой/мышиной химерной модели. MM1.s (ATCC CRL-2974) является линией клеток миеломы человека, которые экспрессируют промежуточные количества BCMA. Авторы изобретения генетически изменили эту линию клеток для экспрессии люциферазы светляков, чтобы получить линию клеток MM1.s.FLuc.
Мыши NOD scid гамма (NSG: NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) являются мышами с глубоко подавленным иммунитетом, которым можно трансплантировать разные линии клеток человека и лимфоциты периферической крови человека. Самкам мышей NSG в возрасте трех месяцев вводили 1×107 клеток MM1.s.FLuc инъекцией в хвостовую вену без какого-либо подготовительного воздействия. Трансплантаты определяли путем серийной биолюминесцентной визуализации (фигура 16). Стабильные и увеличивающиеся интрамедуллярные трансплантаты наблюдали у всех мышей. В день 13 5×106 T-клеток с CAR на основе APRIL-HNG-CD28OXZ вводили мышам инъекцией в хвостовую вену. Проводили серийную биолюминесцентную визуализацию, которая показала быстрое уменьшение количества MM1.s (фигура 16) у всех получавших лечение мышей до полной ремиссии. Этот ответ на терапию CAR подтверждали методами проточной цитометрии и иммуногистохимии.
Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и системы по изобретению будут очевидны для специалистов в данной области без отклонения от объема и сущности изобретения. При том, что изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно быть чрезмерно ограничено такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в области молекулярной биологии, клеточной иммунологии или родственных областях, должны входить в объем прилагаемой формулы изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР | 2019 |
|
RU2810092C2 |
| КЛЕТКА | 2016 |
|
RU2729158C2 |
| Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания B-клеток | 2016 |
|
RU2706582C2 |
| КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С BCMA РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И АУТОИММУННЫХ РАССТРОЙСТВ | 2018 |
|
RU2799762C2 |
| ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР | 2015 |
|
RU2685479C2 |
| ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА АНТИГЕН СОЗРЕВАНИЯ В-КЛЕТОК | 2013 |
|
RU2650805C2 |
| ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ К КАППА-АНТИГЕНУ МИЕЛОМЫ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2743188C2 |
| КЛЕТКА | 2014 |
|
RU2717984C2 |
| КЛЕТКА | 2014 |
|
RU2732236C2 |
| ОПТИМИЗИРОВАННЫЙ СЛИТЫЙ БЕЛОК TACI-FC | 2008 |
|
RU2433141C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к химерным антигенным рецепторам (CAR), и может быть использовано в медицине для лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией антигена созревания B-клеток (BCMA) и рецептора трансмембранного активатора, модулятора кальция и активатора лиганда циклофилина (TACI). Конструируют CAR, содержащий укороченный индуцирующий пролиферацию лиганд (APRIL), который связывается как с BCMA, так и с TACI; спейсерный домен; трансмембранный домен и внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен. Изобретение обеспечивает получение CAR, который эффективно связывает BCMA и TACI. 15 н. и 11 з.п. ф-лы, 16 ил., 9 пр.
1. Химерный антигенный рецептор (CAR), который связывает антиген созревания B-клеток (BCMA) и рецептор трансмембранного активатора, модулятора кальция и активатора лиганда циклофилина (TACI) и содержит:
(i) укороченный индуцирующий пролиферацию лиганд (APRIL) с SEQ ID NO:14, который связывается как с BCMA, так и с TACI;
(ii) спейсерный домен; и
(iii) трансмембранный домен; и
(iv) внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен.
2. CAR по п. 1, в котором укороченный APRIL лишен амино-концевой части APRIL, ответственной за связывание протеогликанов.
3. CAR по п. 2, содержащий последовательность SEQ ID NO:14.
4. CAR по любому из предшествующих пунктов, в котором трансмембранный и внутриклеточный T-клеточный сигнальный домен содержат последовательность SEQ ID NО:7.
5. CAR по любому из пп. 1-3, в котором спейсер содержит одно из следующего: спейсер IgG1 человека; шарнирную область IgG1 или стеблевую область CD8.
6. CAR по п. 5, в котором спейсер содержит стеблевую область CD8.
7. CAR по любому из пп. 1-3, содержащий последовательность SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 или 6.
8. Нуклеиновая кислота, кодирующая CAR по любому из предшествующих пунктов.
9. Нуклеиновая кислота по п. 8, содержащая последовательность SEQ ID NО:15, 16, 17, 18, 19 или 20.
10. Вектор экспрессии, который содержит нуклеиновую кислоту по п. 8 или 9.
11. T-клетка, которая экспрессирует CAR по любому из пп. 1-7 и которая получена путем введения вектора экспрессии по п. 10 в Т-клетку.
12. Способ получения T-клетки по п. 11, который включает стадию введения вектора экспрессии по п. 10 в T-клетку.
13. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией BCMA и TACI, которая содержит эффективное количество T-клеток по п. 11 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.
14. Способ лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией BCMA и TACI, который включает стадию введения субъекту эффективного количества T-клетки по п. 11.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что заболевание плазматических клеток выбрано из плазмацитомы, плазмоклеточного лейкоза, множественной миеломы, макроглобулинемии, амилоидоза, макроглобулинемии Вальденстрема, солитарной костной плазмацитомы, экстрамедуллярной плазмацитомы, остеосклеротической миеломы, болезни тяжелых цепей, моноклональной гаммопатии неопределенного значения и тлеющей множественной миеломы.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что заболевание плазматических клеток представляет собой множественную миелому.
17. Применение T-клетки по п. 11 для лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией BCMA и TACI.
18. Применение T-клетки по п. 11 в производстве лекарственного средства для лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией BCMA и TACI.
19. NK-клетка, которая экспрессирует CAR по любому из пп. 1-7 и которая получена путем введения вектора экспрессии по п. 10 в NK-клетку.
20. Способ получения NK-клетки по п. 19, который включает стадию введения вектора экспрессии по п. 10 в NK-клетку.
21. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией BCMA и TACI, которая содержит эффективное количество NK-клеток по п. 19 в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.
22. Способ лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией BCMA и TACI, который включает стадию введения субъекту эффективного количества NK-клетки по п. 19.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что заболевание плазматических клеток выбрано из плазмацитомы, плазмоклеточного лейкоза, множественной миеломы, макроглобулинемии, амилоидоза, макроглобулинемии Вальденстрема, солитарной костной плазмацитомы, экстрамедуллярной плазмацитомы, остеосклеротической миеломы, болезни тяжелых цепей, моноклональной гаммопатии неопределенного значения и тлеющей множественной миеломы.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что заболевание плазматических клеток представляет собой множественную миелому.
25. Применение NK-клетки по п. 19 для лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией BCMA и TACI.
26. Применение NK-клетки по п. 19 в производстве лекарственного средства для лечения заболевания плазматических клеток, которые характеризуются экспрессией BCMA и TACI.
