ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ К КАППА-АНТИГЕНУ МИЕЛОМЫ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2021 года по МПК C07K14/725 C07K19/00 C12N5/783 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА НЕПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТ США

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США сер. № 62/151968, поданной 23 апреля 2015 г., и предварительной заявке на патент США сер. № 62/158407, поданной 7 мая 2015 г., каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки полностью для любых целей.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Связанный с настоящей заявкой перечень последовательностей предоставлен в текстовом формате, заменяющем бумажную копию, и включен в настоящее описание посредством ссылки. Название текстового файла, содержащего указанный перечень последовательностей: HMLX_002_02WO_SeqList_ST25.txt. Размер указанного текстового файла составляет приблизительно 24 Кб, он был создан 23 апреля 2016 г. и подан в электронном виде через EFS-Web.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Множественная миелома (MM) представляет собой злокачественное новообразование плазматических клеток костного мозга, которое остается неизлечимым, несмотря на последние достижения в терапии. Его клиническое течение характеризуется первоначальным ответом на терапию, за которым следуют многократные рецидивы с развитием в конечном счете устойчивости ко всем формам лечения. Оно также сопряжено со значительной смертностью и инвалидизацией, обусловленными как собственно заболеванием, так и токсичностью доступных вариантов лечения.

[0004] Множественная миелома характеризуется злокачественными плазматическими клетками, которые секретируют ограниченный по легкой цепи каппа или лямбда моноклональный парапротеин. Ограничение по каппа имеет место у 60% пациентов с миеломой, и экспрессия каппа-антигена миеломы (KMA) в большой степени ограничена множественной миеломой и B-клеточными злокачественными новообразованиями. KappaMab представляет собой KMA-специфическое моноклональное антитело, которое продемонстрировало безопасность и эффективность в клинических испытаниях фазы I и II.

[0005] Лечение только моноклональными антителами не приводит к излечению, обеспечивая неполную эрадикацию опухоли, что в конечном счете приводит к рецидиву. Это может быть обусловлено неадекватным проникновением антитела в опухоль (путем пассивной диффузии), гетерогенностью экспрессии антигена на опухолевых клетках или устойчивостью опухолевых клеток к механизмам антителозависимой цитотоксичности. Соответственно, имеется потребность в эффективных средствах терапии с низкой токсичностью, которые могут обеспечивать долгосрочное излечение заболевания.

[0006] Несущие химерный антигенный рецептор T-клетки (CAR-T-клетки) представляют собой возможное решение указанной проблемы. CAR-T-клетки содержат антигенсвязывающий домен моноклональных антител с одним или больше внутриклеточным(и) сигнальным(и) доменом(ами) T-клеток для получения локализованного опухолеспецифичного иммунного ответа. CAR-T-клетки обладают несколькими преимуществами по сравнению с моноклональными антителами: они активно мигрируют в опухоль, пролиферируют в ответ на несущие антиген опухолевые клетки, секретируют факторы, которые мобилизуют другие ветви иммунного ответа и способны выживать в течение длительного времени, обеспечивая продолжительную защиту от рецидива. Другое преимущество CAR-T-клетки по сравнению с терапевтическим антителом, нацеленным на тот же антиген, заключается в том, что CAR-T-клетка может также быть дополнительно модифицирована для повышения безопасности и улучшения функции. Например, T-клетка может быть модифицирована таким образом, чтобы включать экспрессию хоминг-рецептора, повышающего специфичность T-клетки и способность указанной(ых) T-клетки(ток) к инфильтрации раковых клеток или опухолей, или они могут содержать «выключатель», функция которого может заключаться в элиминации клеток в случае появления токсичности. Кроме того, что важно при лечении множественной миеломы и связанных нарушений, T-клетка может быть модифицирована для экспрессии дополнительных биологически активных или фармацевтически активных молекул, которые могут усиливать противоопухолевый ответ, таких как, например, подавляющие опухолевый рост цитокины. Как описано в настоящем документе, авторы настоящего изобретения разработали новые конструкции CAR, способные специфически связываться с конкретным конформационным эпитопом KMA, экспрессируемым только на клетках MM, и сконструировали CAR-T-клетки для экспрессии внеклеточного антигенсвязывающего домена, специфического для указанного эпитопа, и внутриклеточного T-клеточного сигнального домена, отдельно или в комбинации с экспрессией других противоопухолевых иммунных медиаторов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Настоящее изобретение относится к химерным антигенным рецепторам (CAR), специфическим в отношении каппа-антигена миеломы (KMA), и при этом содержащим внутриклеточные сигнальные домены, способные запускать T-клеточный ответ против KMA, T-клеткам, содержащим такие CAR, и способу лечения множественной миеломы и связанных расстройств путем введения T-клеток, экспрессирующих KMA-специфические CAR. Получаемые CAR-T-клетки способны опосредовать направленный иммунный ответ против раковых клеток, и в то же время не дают нежелательных побочных эффектов, связанных с системной доставкой моноклональных антител и/или противоопухолевых цитокинов.

[0008] В одном варианте реализации химерные антигенные рецепторы (CAR) согласно настоящему изобретению содержат один или больше внутриклеточных сигнальных доменов и внеклеточный антигенсвязывающий домен, который специфически распознает каппа-антиген миеломы (KMA). В одном варианте реализации указанный внутриклеточный сигнальный домен представляет собой один или больше костимулирующих эндодоменов. В еще одном варианте реализации указанный один или больше костимулирующих доменов представляет собой что-либо одно или больше из домена CD28, домена CD3ζ, домена 4-1BB или домена OX-40, или их комбинаций. В одном варианте реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ и домен CD28. В другом варианте реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ и домен OX-40. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, домен CD28 и домен OX-40. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ и домен 4-1BB. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, домен CD28 и домен 4-1BB. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, домен 4-1BB и домен OX-40.

[0009] В одном варианте реализации указанный внеклеточный связывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который специфически распознает KMA. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv содержит определяющие комплементарность участки (участки CDR), происходящие из KappaMab. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv содержит участки CDR VL (CDR вариабельной области легкой цепи) последовательностей SEQ ID NO: 6-8. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFV содержит область VL последовательности SEQ ID NO: 21. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv содержит участки CDR VH (CDR вариабельной области тяжелой цепи) последовательностей SEQ ID NO: 3-5. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFV содержит область VH последовательности SEQ ID NO: 22. В еще одном дополнительном варианте реализации указанный scFv содержит участки CDR VL последовательностей SEQ ID NO: 6-8 и участки CDR VH последовательностей SEQ ID NO: 3-5. В еще одном дополнительном варианте реализации указанный scFv содержит область VL последовательности SEQ ID NO: 21 и область VH последовательности SEQ ID NO: 22. В одном варианте реализации указанные VL-цепь последовательности SEQ ID NO: 2 и VH-цепь последовательности SEQ ID NO: 1 присоединены глицин-сериновым линкером. В одном варианте реализации указанные область VL последовательности SEQ ID NO: 21 и область VH последовательности SEQ ID NO: 22 присоединены глицин-сериновым линкером. Согласно еще одному варианту реализации указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанный линкер представляет собой глицин-сериновый линкер размером 15 аминокислот и содержит (Gly₄Ser)₃. В одном варианте реализации указанный (Gly₄Ser)₃-линкер представляет собой последовательность SEQ ID NO: 23. В одном варианте реализации указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным сигнальным доменам спейсером. Согласно еще одному варианту реализации scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным доменам спейсером, который содержит константную область иммуноглобулина. В одном варианте реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит что-либо одно или больше из шарнира IgG, CH2-домена IgG и CH3-домена IgG. Согласно конкретному варианту реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит шарнирный домен иммуноглобулина. Согласно еще одному варианту реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит CH3-домен иммуноглобулина. Согласно еще одному варианту реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит CH2-домен IgG. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным доменам спейсером, который содержит CD8α-домен. В одном варианте реализации указанный спейсер присоединен к scFV глицин-сериновым линкером. Согласно еще одному варианту реализации указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанный линкер представляет собой глицин-сериновый линкер размером 15 аминокислот и содержит (Gly₄Ser)₃. В одном варианте реализации указанный (Gly₄Ser)₃ линкер представляет собой последовательность SEQ ID NO: 23.

[0010] В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает T-клетки, содержащие химерные антигенные рецепторы (CAR-T-клетки). В одном варианте реализации указанные CAR-T-клетки содержат CAR, содержащие один или больше внутриклеточных сигнальных доменов и внеклеточный связывающий домен. Согласно конкретному варианту реализации указанный внеклеточный связывающий домен специфически распознает каппа-антиген миеломы. В одном варианте реализации указанные CAR-T-клетки сконструированы с дополнительной возможностью экспрессии одной или больше дополнительных биологической молекулы. В одном варианте реализации указанные дополнительные одна или больше молекул содержат ИЛ-12 и/или SANT7 и/или галектин-3C (GAL3C). В одном варианте реализации указанные CAR-T-клетки экспрессируют одноцепочечный полипептид, содержащий одну субъединицу p35 ИЛ-12 и одну субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером. В одном варианте реализации указанный ИЛ-12 p35 и ИЛ-12 p40 соединены (G₄S)₃-линкером. В одном варианте реализации указанный одноцепочечный полипептид ИЛ-12 образует биоактивный гетеродимер p70 ИЛ-12. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12 и селективный маркер (маркер отбора). В одном варианте реализации указанная одна или больше биологических молекул представляет SANT7. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует GAL3C. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует GAL3C и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует SANT7 и GAL3C. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует SANT7, GAL3C и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12 и GAL3C. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12, GAL3C и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует SANT7 и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12 и SANT7. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12, SANT7 и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12, SANT7 и GAL3C. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12, SANT7, GAL3C и селективный маркер.

[0011] В одном варианте реализации CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению также экспрессируют связывающий фактор роста гепатоцитов (ФРГ) белок, который способен ингибировать ФРГ-сигнализацию и эффекторную функцию. Согласно одному аспекту указанный ФРГ-связывающий белок представляет собой антитело или его фрагмент.

[0012] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения генетически модифицированной T-клетки, включающий введение экспрессионного вектора, кодирующего CAR, содержащий один или больше внутриклеточных сигнальных доменов и внеклеточный антигенсвязывающий домен, в T-клетку. Согласно конкретному варианту реализации указанный внеклеточный антигенсвязывающий домен специфически распознает KMA. В одном варианте реализации указанный экспрессионный вектор представляет собой экспрессионную систему на основе транспозируемого вектора. В некоторых вариантах реализации указанный экспрессионный вектор представляет собой экспрессионный вектор с транспозоном PiggyBac. В другом варианте реализации указанный экспрессионный вектор представляет собой вирусный вектор. В одном варианте реализации указанный вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор или ретровирусный вектор. В одном варианте реализации указанный экспрессионный вектор вводят в клетки путем электропорации. В одном варианте реализации указанный один или больше внутриклеточных сигнальных доменов в CAR представляет собой один или больше костимулирующих эндодоменов. В еще одном варианте реализации указанный один или больше костимулирующих доменов представляет собой что-либо одно или больше из домена CD28, домена CD3ζ, домена 4-1BB или домена OX-40, или их комбинаций. В одном варианте реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ и домен CD28. В другом варианте реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ и домен OX-40. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, домен CD28 и домен OX-40. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ и домен 4-1BB. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, домен CD28 и домен 4-1BB. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, домен 4-1BB и домен OX-40. В одном варианте реализации указанный внеклеточный связывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который специфически распознает KMA. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv содержит определяющие комплементарность участки (участки CDR), происходящие из KappaMab. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv содержит участки CDR VL последовательностей SEQ ID NO: 6-8. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFV содержит область VL последовательности SEQ ID NO: 21. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv содержит участки CDR VH последовательностей SEQ ID NO: 3-5. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFV содержит область VH последовательности SEQ ID NO: 22. В еще одном дополнительном варианте реализации указанный scFv содержит участки CDR VL последовательностей SEQ ID NO: 6-8 и участки CDR VH последовательностей SEQ ID NO: 3-5. В еще одном дополнительном варианте реализации указанный scFv содержит область VL последовательности SEQ ID NO: 21 и область VH последовательности SEQ ID NO: 22. В одном варианте реализации указанные VL-цепь последовательности SEQ ID NO: 2 и VH-цепь последовательности SEQ ID NO: 1 присоединены глицин-сериновым линкером. В одном варианте реализации указанные область VL последовательности SEQ ID NO: 21 и область VH последовательности SEQ ID NO: 22 присоединены глицин-сериновым линкером. Согласно еще одному варианту реализации указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанный линкер представляет собой глицин-сериновый линкер размером 15 аминокислот и содержит (Gly₄Ser)₃. В одном варианте реализации указанный (Gly₄Ser)₃-линкер представляет собой последовательность SEQ ID NO: 23. В одном варианте реализации указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным сигнальным доменам спейсером. Согласно еще одному варианту реализации scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным доменам спейсером, который содержит константную область иммуноглобулина. В одном варианте реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит что-либо одно или больше из шарнира IgG, CH2-домена IgG и CH3-домена IgG. Согласно конкретному варианту реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит шарнирный домен иммуноглобулина. Согласно еще одному варианту реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит CH3-домен иммуноглобулина. Согласно еще одному варианту реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит CH2-домен IgG. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным доменам спейсером, который содержит CD8α-домен. В одном варианте реализации указанный спейсер присоединен к scFV глицин-сериновым линкером. Согласно еще одному варианту реализации указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанный линкер представляет собой глицин-сериновый линкер размером 15 аминокислот и содержит (Gly₄Ser)₃. В одном варианте реализации указанный (Gly₄Ser)₃ линкер представляет собой последовательность SEQ ID NO: 23. В одном варианте реализации указанный способ дополнительно включает введение одного или больше дополнительных экспрессионных векторов, сконструированных с возможностью экспрессии одной или больше дополнительных биологических молекул. В одном варианте реализации указанная дополнительная одна или больше молекул содержит ИЛ-12, и/или SANT7, и/или GAL3C. В одном варианте реализации указанный один или больше дополнительных экспрессионных векторов содержит последовательность, кодирующую одноцепочечный полипептид, содержащий одну субъединицу p35 ИЛ-12 и одну субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером. В одном варианте реализации указанные p35 ИЛ-12 и p40 ИЛ-12 соединены (G₄S)₃-линкером. В одном варианте реализации указанная последовательность, кодирующая одноцепочечный полипептид ИЛ-12, кодирует биоактивный гетеродимер p70 ИЛ-12. В одном варианте реализации указанный экспрессионный вектор, экспрессирующий один или больше биологически активных агентов, также содержит селективный маркер. В одном варианте реализации указанный экспрессионный вектор содержит последовательность, кодирующую одноцепочечный полипептид ИЛ-12, содержащий p35 ИЛ-12 и p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером, и селективный маркер, соединенный с одноцепочечным ИЛ-12 элементом «рибосомального перепрыгивания» 2A. В одном варианте реализации указанная одна или больше биологических молекул представляет собой SANT7. В одном варианте реализации указанный экспрессионный вектор, экспрессирующий один или больше биологически активных агентов, содержит SANT7 и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная последовательность, кодирующая SANT7 и селективный маркер, соединены последовательностью элемента «рибосомального перепрыгивания» 2A. В одном варианте реализации указанный экспрессионный вектор, экспрессирующий один или больше биологически активных агентов, содержит GAL3c и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная последовательность, кодирующая GAL3C и селективный маркер, соединена последовательностью элемента «рибосомального перепрыгивания». В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка содержит ИЛ-12, SANT7 и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная последовательность, кодирующая ИЛ-12, соединена с селективным маркером элементом «рибосомального перепрыгивания» 2A, и указанная последовательность, кодирующая SANT7, соединена с последовательностью, кодирующей ИЛ-12, дополнительным элементом «рибосомального перепрыгивания» 2A. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка содержит GAL3C, SANT7 и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная последовательность, кодирующая GAL3C, соединена с селективным маркером элементом «рибосомального перепрыгивания» 2A, и указанная последовательность, кодирующая SANT7, соединена с последовательностью, кодирующей GAL3C, дополнительным элементом «рибосомального перепрыгивания» 2A. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка содержит ИЛ-12, GAL3C и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная последовательность, кодирующая ИЛ-12, соединена с селективным маркером элементом «рибосомального перепрыгивания» 2A, и указанная последовательность, кодирующая GAL3C, соединена с последовательностью, кодирующей ИЛ-12, дополнительным элементом «рибосомального перепрыгивания» 2A. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка содержит GAL3C, SANT7, ИЛ-12 и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная последовательность, кодирующая каждый из GAL3C, SANT7, ИЛ-12 и селективный маркер, соединена последовательностью элемента «рибосомального перепрыгивания» 2A.

[0013] В одном варианте реализации предложен способ лечения KMA-экспрессирующего злокачественного новообразования. В одном варианте реализации указанное KMA-экспрессирующее злокачественное новообразование представляет собой B-клеточное злокачественное новообразование. В еще одном варианте реализации указанное B-клеточное злокачественное новообразование представляет собой множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ) или амилоидоз. Согласно конкретному варианту реализации указанный способ включает введение субъекту с множественной миеломой, макроглобулинемией Вальденстрема, диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВККЛ), амилоидозом или другим B-клеточным злокачественным новообразованием, экспрессирующим KMA, генетически модифицированных T-клеток, сконструированных с возможностью экспрессии одного или больше внутриклеточных сигнальных доменов и внеклеточного антигенсвязывающего домена, который специфически распознает KMA. В одном варианте реализации указанный один или больше внутриклеточных сигнальных доменов в CAR представлен(ы) одним или больше костимулирующими эндодоменами. В еще одном варианте реализации указанный один или больше костимулирующих доменов представляет собой что-либо одно или больше из домена CD28, домена CD3ζ, домена 4-1BB или домена OX-40, или их комбинаций. В одном варианте реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ и домен CD28. В другом варианте реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, и домен OX-40. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, домен CD28 и домен OX-40. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ и домен 4-1BB. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, домен CD28 и домен 4-1BB. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше костимулирующих эндодоменов CAR содержит домен CD3ζ, домен 4-1BB и домен OX-40. В одном варианте реализации указанный внеклеточный связывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который специфически распознает KMA. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv содержит определяющие комплементарность участки (участки CDR), происходящие из KappaMab. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv содержит участки CDR VL последовательностей SEQ ID NO: 6-8. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFV содержит область VL последовательности SEQ ID NO: 21. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv содержит участки CDR VH последовательностей SEQ ID NO: 3-5. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFV содержит область VH последовательности SEQ ID NO: 22. В еще одном дополнительном варианте реализации указанный scFv содержит участки CDR VL последовательностей SEQ ID NO: 6-8 и участки CDR VH последовательностей SEQ ID NO: 3-5. В еще одном дополнительном варианте реализации указанный scFv содержит область VL последовательности SEQ ID NO: 21 и область VH последовательности SEQ ID NO: 22. В одном варианте реализации указанные VL-цепь последовательности SEQ ID NO: 2 и VH-цепь последовательности SEQ ID NO: 1 присоединены глицин-сериновым линкером. В одном варианте реализации указанные область VL последовательности SEQ ID NO: 21 и область VH последовательности SEQ ID NO: 22 присоединены глицин-сериновым линкером. Согласно еще одному варианту реализации указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанный линкер представляет собой глицин-сериновый линкер размером 15 аминокислот и содержит (Gly₄Ser)₃. В одном варианте реализации указанный (Gly₄Ser)₃-линкер представляет собой последовательность SEQ ID NO: 23. В одном варианте реализации указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным сигнальным доменам спейсером. Согласно еще одному варианту реализации scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным доменам спейсером, который содержит константную область иммуноглобулина. В одном варианте реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит что-либо одно или больше из шарнира IgG, CH2-домена IgG и CH3-домена IgG. Согласно конкретному варианту реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит шарнирный домен иммуноглобулина. Согласно еще одному варианту реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит CH3-домен иммуноглобулина. Согласно еще одному варианту реализации указанная константная область иммуноглобулина содержит CH2-домен IgG. Согласно еще одному варианту реализации указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным доменам спейсером, который содержит CD8α-домен. В одном варианте реализации указанный спейсер присоединен к scFV глицин-сериновым линкером. Согласно еще одному варианту реализации указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанный линкер представляет собой глицин-сериновый линкер размером 15 аминокислот и содержит (Gly₄Ser)₃. В одном варианте реализации указанный (Gly₄Ser)₃-линкер представляет собой последовательность SEQ ID NO: 23. В другом варианте реализации указанные генетически модифицированные T-клетки сконструированы с дополнительной возможностью экспрессии одной или больше дополнительных биологических молекул. В одном варианте реализации указанная дополнительная одна или больше молекул содержит ИЛ-12, и/или SANT7, и/или GAL3C. В одном варианте реализации указанные CAR-T-клетки экспрессируют одноцепочечный полипептид, содержащий одну субъединицу p35 ИЛ-12 и одну субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером. В одном варианте реализации указанные p35 ИЛ-12 и p40 ИЛ-12 соединены (G₄S)₃-линкером. В одном варианте реализации указанный одноцепочечный полипептид ИЛ-12 образует биоактивный гетеродимер p70 ИЛ-12. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12 и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная одна или больше биологических молекул представляет собой SANT7. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует SANT7 и селективный маркер. В одном варианте реализации указанный селективный маркер представляет собой GAL3C. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует GAL3C и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12, SANT7 и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12, GAL3C и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует SANT7, GAL3C и селективный маркер. В одном варианте реализации указанная CAR-T-клетка экспрессирует ИЛ-12, SANT7, GAL3C и селективный маркер.

[0014] В еще одном варианте реализации указанный способ включает дополнительное введение пациенту с множественной миеломой, макроглобулинемией Вальденстрема, диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВККЛ), амилоидозом или другим B-клеточным злокачественным новообразованием, экспрессирующим KMA, ФРГ-связывающего белка. В одном варианте реализации указанный ФРГ-связывающий белок представляет собой антитело или его фрагмент. В одном варианте реализации экспрессионным вектором, содержащим указанный ФРГ-связывающий белок, котрансфицируют T-клетку вместе с экспрессионным вектором, кодирующим конструкцию CAR, таким образом, что итоговая CAR-T-клетка также экспрессирует указанный ФРГ-связывающий белок.

[0015] В другом варианте реализации указанный способ включает введение одного или больше дополнительных биологических или фармацевтических активных агентов. В одном варианте реализации указанный один или больше дополнительных фармацевтически активных агентов представляет собой химиотерапевтический агент. В другом варианте реализации указанный один или больше дополнительных фармацевтически активных агентов представляет собой иммуномодулирующее средство. Согласно конкретному варианту реализации указанное иммуномодулирующее средство представляет собой талидомид или его аналог. Согласно еще одному варианту реализации указанный аналог талидомида представляет собой актимид, леналидомид или помалидомид. Согласно еще одному варианту реализации указанный дополнительный фармацевтически активный агент представляет собой ингибитор гистондеацетилазы. Согласно еще одному варианту реализации указанный ингибитор гистондеацетилазы представляет собой панобиностат, вориностат, трихостатин A, депсипептиды, фенилбутират, вальпроевую кислоту, белиностат, LAQ824, энтиностат, CI944 или моцетиностат. Согласно еще одному варианту реализации указанный один или больше дополнительных биологических или фармацевтически активных агентов вводят до, во время или после лечения указанными генетически модифицированными T-клетками. Согласно еще одному варианту реализации указанные генетически модифицированные T-клетки вводят внутривенно. Согласно еще одному варианту реализации указанный генетически модифицированные T-клетки получены из организма указанного пациента. Согласно еще одному варианту реализации указанные генетически модифицированные T-клетки не получены из организма указанного пациента.

[0016] В одном варианте реализации указанные CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению вводят до, одновременно с или после аллогенного трансплантата стволовых клеток. Согласно еще одному варианту реализации CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению вводят до, одновременно с или после аллогенного трансплантата стволовых клеток.

[0017] Примеры этих описанных выше аспектов, а также других аспектов настоящего изобретения приведены в иллюстративных примерах вариантов осуществления и применения, некоторые из которых представлены на чертежах и описаны в формуле изобретения ниже. Однако не предполагается, что в приведенном выше кратком описании описаны все проиллюстрированные варианты реализации или всех вариантов осуществления настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0018] Новые признаки настоящего изобретения подробно представлены в прилагаемой формуле изобретения. Для лучшего понимания признаков и преимуществ настоящего изобретения ниже приведено подробное описание, содержащее иллюстративные варианты реализации с применением принципов настоящего изобретения, и сопровождающие чертежи, где:

[0019] На фиг. 1A-1B показана структурная связь CAR и иммуноглобулина (IgG), и T-клеточного рецептора (TCR). На фиг. 1A показан одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), состоящий из вариабельной области легкой цепи (VL) исходного антитела, соединенной с вариабельной областью тяжелой цепи (VH) полипептидным линкером придает антигенную специфичность указанному CAR. Гибкий шарнир соединяет scFv с трансмембранным и внутриклеточным сигнальным доменом костимулирующей молекулы, такой как CD28, 4-1 BB или OX-40, за которым следует CD3-зета. На фиг. 1B показаны T-клетки, трансдуцированные CAR, которые активируются при встрече с опухолевыми клетками, несущими целевой антиген (Ag), что приводит к лизису опухолевых клеток.

[0020] На фиг. 2 показаны структурные детерминанты функции химерных антигенных рецепторов.

[0021] На фиг. 3 показана экспрессия KMA на первичных клетках миеломы.

[0022] На фиг. 4A-4C показана функция KMA.CAR-28z. На фиг. 4A представлен проточно-цитометрический анализ экспрессии KMA на клетках различных линий; На фиг. 4B показана экспрессия интерферона-гамма (ИФН-γ) на CD8⁺ T-клетках, трансдуцированных (верхние графики) и нетрансдуцированных (нижние графики) KMA.CAR-28z. На фиг. 4C показан специфический лизис KMA-положительных и KMA-отрицательных линий клеток трансдуцированными KMA.CAR-28z T-клетками.

[0023] На фиг. 5A показаны мыши RPMI-Rag, которым инъецировали 5×10⁵ - 5×10⁶ клеток миеломы. На фиг. 5B показана инфильтрация костного мозга и селезенки CD138⁺ клетками RPMI9226. На фиг. 5C показаны повышенные уровни легкой цепи лямбда в сыворотке человека при прогрессирующем заболевании. На фиг. 5D показаны положительные по CD138⁺/цитоплазматической легкой цепи лямбда клетки в костном мозге. На фиг. 5E показаны мыши RPMI-Rag в качестве терапевтической модели.

[0024] На фиг. 6A-6C показана оптимизация KMA.CAR. На фиг. 6A показана исходная конструкция KMA.CAR-28z; на фиг. 6B показаны конструкции с шарниром тяжелой цепи Ig и CH3, или только шарниром. На фиг. 6C показаны конструкции, сочетающие оптимальную шарнирную область (opti) с комбинациями различных эндодоменов костимулирующих молекул и CD3-зета.

[0025] На фиг. 7 показаны векторы ИЛ-12 и SANT7.

[0026] На фиг. 8A-8B показано размножение KM.CAR-T-клеток и экспрессия CAR для конструкций, описанных в примере 3. На фиг. 8A представлен общий показатель размножения клеток в культурах CAR-T-клеток с добавлением (слева) и без добавления (справа) клеток KMA-экспрессирующей линии JJN3. Фиг. 8B: экспрессия CAR по оценке с применением GFP в культурах с клетками KMA-экспрессирующей линии JJN3 (верхние графики) и без клеток KMA-экспрессирующей линии JJN3. (нижние графики). hCH2CH3 = T-клетки KM.CAR_hCH2CH3_28z; hCH2CH3mut = T-клетки KM.CAR hCH2CH3mut_28™_41BBz; h = T-клетки KM.CAR_h_28™_41BBz; CD8a = T-клетки KM.CAR_8a_28™_41BBz.

[0027] На фиг. 9 показана структура индуцируемой активацией транспозонной кассеты. IR = инвертированные повторы; Ins = инсулятор, фланкирующий два конца генной вставки; NFATpro = индуцируемый активацией промотор; BGHpA = сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста; EF1α = промотор фактора удлинения 1 альфа человека; RQR8 = маркер; SV40 = поздний сигнал полиаденилирования вируса обезьян.

[0028] На фиг. 10 показана экспрессия eGFP под контролем индуцируемого активацией промотора. Оценивали коэкспрессию RQR8 (ось X) и eGFP (ось Y) на трансдуцированных МКПК, стимулированных ФМА и иономицином (правый график), и сравнивали с нестимулированными контролями (левый график). Трансдуцированные клетки не экспрессируют eGFP в отсутствие стимуляции. 50% трансдуцированных клеток экспрессировали eGFP при стимуляции.

[0029] На фиг. 11 показана структура индуцируемой активацией транспозонной кассеты с CAR и биологическим средством. IR = инвертированные повторы; Ins = инсулятор, фланкирующий два конца генной вставки; NFATpro = индуцируемый активацией промотор; BGHpA = сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста; EF1α = промотор фактора удлинения 1 альфа человека; SV40 = поздний сигнал полиаденилирования вируса обезьян.

[0030] На фиг. 12A-12B показаны получение KMA-специфического интерферона-гамма и стандартный анализ на цитотоксичность T-клеток KM.CAR_hCH2CH3_28z (фиг. 12A) или T-клеток KM.CAR_h_28™_41BBz с высвобождением хрома (фиг. 12 B) в линиях KMA+ и KMA- клеток. Использованные KMA-положительные линии клеток включали JJN3, Pfeiffer, NCI-H929, тогда как KMA-отрицательные линии клеток включали Nalm-6 и Molt.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0031] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, соответствующие обычному пониманию среднего специалиста в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя на практике для тестирования настоящего изобретения могут применяться любые методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, предпочтительные материалы и методы описаны в настоящем документе. В описании и формуле настоящего изобретения используются приведенные ниже определения. Следует также понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена не для ограничения, а для описания конкретных вариантов реализации.

[0032] Термины в единственном числе (соотв. артиклям «a» и «an» в исходном тексте на английском языке) используют в настоящем документе для обозначения одного или больше (т.е. по меньшей мере одного, или одного или больше) объектов, название которого приведено в единственном числе.

[0033] Термин «экспрессионный вектор» в настоящем документе относится к вектору, содержащему рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере одну последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, которую нужно экспрессировать. Экспрессионный вектор содержит все необходимые цис-действующие элементы, необходимые для экспрессии. Примеры экспрессионных векторов включают, не ограничиваясь перечисленными, плазмиды, космиды и вирусы, кодирующие рекомбинантный полинуклеотид, который нужно экспрессировать. В некоторых вариантах реализации указанный экспрессионный вектор содержит транспозируемые элементы, способные к интеграции в геном, например, экспрессионную систему на основе PiggyBac. В некоторых вариантах реализации указанный экспрессионный вектор представляет собой вирусный вектор, который позволяет осуществлять интеграцию содержимого экспрессионного вектора в геном хозяина, например, ретровирусные и лентивирусные векторы.

[0034] «Химерный антигенный рецептор», или «CAR» означает сконструированный рецептор, который содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен и внутриклеточный сигнальный домен. Хотя наиболее распространенный тип CAR содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), происходящий из моноклонального антитела, слитый с трансмембранным и внутриклеточным доменом T-клеточного корецептора, например, цепью CD3ζ, описанное в настоящем документе изобретение не ограничено указанными доменами. Так, в настоящем документе «химерный антигенный рецептор», или «CAR» относится к любому рецептору, сконструированному для экспрессии внеклеточного антигенсвязывающего домена, слитого или связанного с любой внутриклеточной сигнальной молекулой.

[0035] В настоящем документе термин «CAR-T-клетка» относится к T-лимфоциту, генетически сконструированному для экспрессии CAR. Определение CAR-T-клеток охватывает все классы и подклассы T-лимфоцитов, в том числе CD4⁺, CD8⁺ T-клетки, а также эффекторные T-клетки, T-клетки памяти, регуляторные T-клетки и т.п. T-лимфоциты, которые были генетически модифицированы, могут «происходить» или быть «получены» от субъекта, который будет получать лечение с применением указанных генетически модифицированных T-клеток, или могут «происходить» или быть «получены» от другого субъекта.

[0036] Под «внутриклеточным сигнальным доменом» подразумевается часть CAR, которая находится или сконструирована таким образом, чтобы находиться в T-клетке. «Внутриклеточный сигнальный домен» может также содержать или не содержать «трансмембранный домен», который заякоривает CAR в плазматической мембране T-клетки. В одном варианте реализации указанный «трансмембранный домен» и указанный «внутриклеточный сигнальный домен» происходят из одного и того же белка (например, CD3ζ) в других вариантах реализации; указанный внутриклеточный сигнальный домен и указанный трансмембранный домен происходят из разных белков (например, трансмембранный домен CD3ζ и внутриклеточный сигнальный домен молекулы CD28, или наоборот).

[0037] Под «костимулирующим эндодоменом» подразумевается внутриклеточный сигнальный домен или его фрагмент, происходящий из T-клеточной костимулирующей молекулы. Неограничивающий перечень T-клеточных костимулирующих молекул включает CD3, CD28, OX-40, 4-1BB, CD27, CD270, CD30 и ICOS. Указанный костимулирующий эндодомен может включать или не включать трансмембранный домен того же или другого костимулирующего эндодомена.

[0038] Под «внеклеточным антигенсвязывающим доменом» подразумевается часть CAR, которая специфически распознает и связывает представляющий интерес антиген. Указанный «внеклеточный связывающий домен» может происходить из моноклонального антитела. Например, указанный «внеклеточный связывающий домен» может включать полностью или частично Fab-домен моноклонального антитела. В некоторых вариантах реализации указанный «внеклеточный связывающий домен» включает определяющие комплементарность участки конкретного моноклонального антитела. Согласно еще одному варианту реализации указанный «внеклеточный связывающий домен» представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[0039] Под «одноцепочечным вариабельным фрагментом», или «scFv» подразумевается гибридный белок из вариабельной области тяжелой (VH) и вариабельной области легкой (VL) цепей антитела с пептидным линкером между указанными VL и VH. Длина и состав линкера варьируют в зависимости от применяемых частей антитела, однако обычно длина составляет от приблизительно 10 до приблизительно 25 аминокислот. В некоторых вариантах реализации указанный пептидный линкер богат глицином, что обеспечивает гибкость. В некоторых вариантах реализации указанный линкер также включает серин и/или треонин, которые могут, без связи с какой-либо теорией, способствовать растворимости. В некоторых вариантах реализации указанный линкер представляет собой аминокислоту с последовательностью SEQ ID NO: 23. ScFv разрабатывают таким образом, чтобы они сохраняли антигенсвязывающую специфичность исходного антитела, из которого были получены их вариабельные цепи, несмотря на отсутствие тяжелой цепи иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации в scFV применяют только определяющие комплементарность участки (участки CDR) VH и VL. В некоторых вариантах реализации используют полные цепи VL и VH.

[0040] Термин «антитело» в настоящем документе относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с антигеном. Антитела могут представлять собой интактные иммуноглобулины, происходящие из природных источников или рекомбинантных источников и могут представлять собой иммунореактивные части интактных иммуноглобулинов. Антитела согласно настоящему изобретению могут существовать в различных формах, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, Fv, Fab и F(ab)₂, а также одноцепочечные антитела и гуманизированные антитела (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). В настоящем документе термин «антитело» также охватывает фрагменты антитела.

[0041] Термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела и относится к определяющим антигены вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают, не ограничиваясь перечисленными, Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты, линейные антитела, scFv-антитела и мультиспецифичные антитела, образованные фрагментами антител.

[0042] «Тяжелая цепь антитела» в настоящем документе относится к большей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих во всех молекулах антитела в их встречающихся в природе конформациях.

[0043] «Легкая цепь антитела» в настоящем документе относится к меньшей из полипептидных цепей двух типов, присутствующих во всех молекулах антитела в их встречающихся в природе конформациях. Легкие цепи κ и λ относятся к двум основным изотипам легких цепей антител.

[0044] В настоящем документе термин «определяющая комплементарность область», или «CDR» относится к части двух вариабельных цепей антител (тяжелые и легкие цепи), которые распознают и связывают конкретный антиген. Участки CDR представляют собой наиболее вариабельную часть вариабельных цепей и обеспечивают специфичность антитела. На каждой из вариабельных областей тяжелых (VH) и вариабельных областей легких (VL) цепей расположено по три участки CDR, и, соответственно, всего в каждой молекуле антитела присутствует шесть областей CDR.

[0045] Под «KappaMab» подразумевается моноклональное антитело, ранее называвшееся IST-1097 или MDX-1097. Кроме того, в настоящем документе KappaMab может относиться к полной последовательности антитела KappaMab (см., например, патенты США №7344715 и №7556803, каждый из которых включен в настоящий документ полностью посредством ссылки.) Кроме того, термин «KappaMab» в настоящем документе применяют для обозначения любого полипептида, содержащего последовательности CDR SEQ ID NO: 3-8, и/или последовательность VL из SEQ ID NO: 2 и последовательность VL из SEQ ID NO: 1. Термин «KappaMab» в настоящем документе может включать любой полипептид, содержащий последовательность VL из SEQ ID NO: 21 и последовательность VL из SEQ ID NO: 22. В композициях и способах согласно настоящему изобретению KappaMab может включать полное моноклональное антитело или любой его антигенсвязывающий фрагмент, в том числе Fab и scFv.

[0046] Термин «антиген», или «Ag» в настоящем документе определен как молекула, которую распознает рецептор иммунной клетки (например, T-клеточный рецептор, B-клеточный рецептор/иммуноглобулин). В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой молекулу, которая вызывает иммунный ответ. В указанный иммунный ответ может быть вовлечен либо синтез антител, либо активация специфических иммунологически компетентных клеток, высвобождение цитотоксических медиаторов, либо иммуностимулирующих или регуляторных цитокинов. Специалисту будет понятно, что антигеном может служить любая макромолекула, в том числе практически все белки или пептиды.

[0047] В настоящем документе термин «специфически связывает» или «специфически распознает» применительно к антителу, фрагменту антитела или CAR относится к антителу, фрагменту антитела или CAR, которое(ый) распознает специфический антиген, но по существу не распознает или не связывает другие молекулы в образце.

[0048] Под «рибосомальным перепрыгиванием» подразумевается альтернативный механизм трансляции, при котором специфический пептид препятствует ковалентному связыванию рибосомы клетки с новой встроенной аминокислотой и вместо этого обеспечивает продолжение трансляции, что, соответственно, приводит к котрансляционному расщеплению полипротеина. Указанный процесс индуцирует элемент «рибосомального перепрыгивания 2A» или цис-действующий гидролазный элемент (например, последовательность CHYSEL). В некоторых вариантах реализации указанная последовательность содержит неконсервативную последовательность аминокислот с выраженной склонностью к образованию альфа-спиралей, за которой следует консенсусная последовательность -D(V/I)ExNPG P, где x = любая аминокислота. Видимое расщепление происходит между G и P. В некоторых вариантах реализации указанный элемент «рибосомального перепрыгивания» представляет собой элемент «рибосомального перепрыгивания» 2A. Указанный элемент «рибосомального перепрыгивания» 2A может представлять собой 5'-элемент «рибосомального перепрыгивания» T2A.

[0049] В настоящем документе «иммуномодулирующее средство» или «IMiD» представляет собой класс лекарственных средств, в который входят талидомид и его аналоги. Аналоги талидомида включают леналидомид, помалидомид и апремиласт.

[0050] В настоящем документе термин «ингибитор гистондеацетилазы», или «ингибитор HDAC», или «HDI» относится к классу соединений, взаимодействующих с функцией гистондеацетилазы. Примеры HDI включают, не ограничиваясь перечисленными: гидроксамовые кислоты, включая, например, трихостатин A, вориностат (SAHA), белиностат (PXD101), LAQ824, панобиностат (LBH589); циклические трипептиды, в том числе, например, депсипептиды и тайпоксин B; бензамиды, в том числе, например, энтиностат (MS-275), CI994 и моцетиностат (MGCD0103); электрофильные кетоны; и алифатические соединения, такие как например, фенилбутират и вальпроевая кислота.

Каппа-антиген миеломы и антитела

[0051] Каппа-антиген миеломы, или KMA, представляет собой антиген клеточной мембраны, присутствующий на поверхности клеток миеломы. Конкретно, KMA состоит из свободных легких цепей каппа, экспрессируемых на клеточной мембране в связанном нековалентной связью с актином виде (Goodnow et al. (1985) J. Immunol. 135:1276). Хотя в соответствии с настоящим изобретением может применяться любое антитело, которое специфически связывается с KMA, согласно предпочтительному варианту реализации в качестве основы для внеклеточного антигенсвязывающего домена рецепторов CAR согласно настоящему изобретению применяют моноклональное антитело KappaMab. Моноклональное антитело, обозначаемое как KappaMab (ранее обозначалось как IST-1097, также известно как MDX-1097) связывается с конформационным эпитопом в области переключения свободной легкой цепи каппа человека, доступным только в тех случаях, когда указанная каппа-цепь не связана с тяжелой цепью, и, соответственно, не связывается с интактными содержащими каппа-цепь IgG, IgM, IgE или IgA (Hutchinson et al. (2011) Mol. Immunol.). На типичную экспрессию KMA на первичных клетках миеломы, происходящих из биоптатов костного мозга пациентов, указывает связывание KappaMab, показанное на фиг. 3. Антитело KappaMab может содержать VH-цепь последовательности SEQ ID NO: 1 и VL-цепь последовательности SEQ ID NO: 2. Более конкретно, VH-цепь KappaMab может содержать участки CDR последовательности SEQ ID NO: 3-5 и участки CDR VL последовательности SEQ ID NO: 6-8. Дополнительно KappaMab может содержать область VH последовательности SEQ ID NO: 22 и область VL последовательности SEQ ID NO: 21.

Химерные антигенные рецепторы

[0052] Химерные антигенные рецепторы (CAR) представляют собой искусственные рецепторы, состоящие из связывающих опухолевый антиген областей моноклональных антител и внутриклеточной активирующей части T-клеточного рецепторного комплекса в составе одной полипептидной цепи, удерживаемых вместе группой линкера(ов) и спейсера(ов) (фиг. 1A-1B). Чаще всего CAR представляют собой гибридные белки из одноцепочечных вариабельных фрагментов (ScFv), слитых с трансмембранным доменом CD3ζ. Однако могут применяться и другие внутриклеточные сигнальные домены, такие как CD28, 41-BB и Ox40, в различных комбинациях, для обеспечения требуемого внутриклеточного сигнала. В некоторых вариантах реализации CAR, предложенные в настоящем изобретении, содержат лидерный пептид тяжелой цепи Ig. Лидерный пептид может быть представлен последовательностью SEQ ID NO: 20.

I. Внеклеточный антигенсвязывающий домен

[0053] В одном варианте реализации CAR согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен из моноклонального антитела, специфический в отношении одного или больше эпитопов KMA, экспрессируемых на клетках MM. В одном варианте реализации CAR согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен из KappaMab. В одном варианте реализации указанный внеклеточный связывающий домен содержит участки CDR VL последовательностей SEQ ID NO: 6-8 и участки CDR VH последовательностей SEQ ID NO: 3-5. Согласно конкретному варианту реализации указанный внеклеточный связывающий домен представляет собой scFv, содержащий домены VL (SEQ ID NO: 2) и VH (SEQ ID NO: 1) KappaMab. В другом варианте реализации указанный внеклеточный связывающий домен представляет собой scFv, содержащий домены VL (SEQ ID NO: 21) и VH (SEQ ID NO: 22) KappaMab.

II. Линкер между доменами VL и VH scFv KappaMab

[0054] В еще одном варианте реализации домен VL KappaMab соединен с доменом VH KappaMab гибким линкером. В частности, указанный гибкий линкер представляет собой глицин-сериновый линкер из приблизительно 10-30 аминокислот (например, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот) и содержит структуру (Gly₄Ser)₃. Согласно конкретному варианту реализации указанный линкер имеет длину 15 аминокислот. Длина линкера представляет собой важную характеристику CAR. Без определенного теоретического обоснования, более короткие линкеры могут повышать аффинность, однако могут также приводить к образованию внутриклеточных мультимеров, соответственно, нарушая экспрессию CAR; тогда как более длинные линкеры демонстрируют тенденцию к снижению аффинности в отношении антигена за счет большего пространственного отдаления областей CDR VL и VH.

III. Спейсеры между внеклеточным антигенсвязывающим доменом и внутриклеточным сигнальным доменом

[0055] Внеклеточный антигенсвязывающий домен (например, scFv KappaMab) соединяют с внутриклеточным сигнальным доменом при помощи «спейсера». Указанный спейсер разработан таким образом, чтобы обладать достаточной гибкостью, обеспечивающей ориентацию антигенсвязывающего домена, облегчающую распознавание и связывание антигена. Указанный спейсер может происходить из собственно иммуноглобулинов и включать шарнирную область IgG1 или область CH2 и/или CH3 IgG. Как вариант, шарнир может содержать, полностью или частично, цепь CD8α. Длина и гибкость спейсера(ов) зависят как от распознающего антиген домена, так и от внутриклеточных связывающих областей; то, что может быть функциональным и/или оптимальным для одной конструкции CAR, может не подходить для другого CAR. В определенных случаях спейсер может быть обозначен в настоящем документе как «opti» (см. фиг. 6A-6C), что означает, что оптимальные характеристики и длина спейсера варьируют в зависимости от применяемой внеклеточной связывающей части и выбранных внутриклеточных сигнальных доменов. Согласно определенному варианту реализации применяют отдельно шарнир IgG. Согласно другим вариантам реализации указанный шарнир IgG применяют совместно с полным CH2-доменом IgG или его частью. Согласно другим вариантам реализации указанный шарнир IgG применяют совместно с полным CH3-доменом IgG или его частью. Согласно другим вариантам реализации шарнир IgG применяют совместно с полными CH2- и CH3-доменами IgG или их частями. Согласно другим вариантам реализации применяют CH2-домен IgG полностью или частично. Согласно другим вариантам реализации применяют CH3-домен IgG полностью или частично. Согласно дополнительным вариантам реализации применяют и CH2-, и CH3-домен IgG, полностью или частично. В одном варианте реализации шарнир, CH2- и CH3-домены, применяемые в любых предложенных в настоящем изобретении конструкциях, содержат мутацию C→P в шарнирной области в положении аминокислоты 103 согласно Uniprot P01857). В одном варианте реализации шарнир, CH2- и CH3-домены, применяемые в любых предложенных в настоящем изобретении конструкциях, представлены последовательностью SEQ ID NO: 24. В другом варианте реализации указанный шарнир применяют совместно с полными CH2- и CH3-доменами IgG или их частями, причем вводят мутации аминокислот в положениях, важных для взаимодействия CH2 с Fc-рецепторами. Указанные мутации могут опосредовать повышенную выживаемость после инфузии за счет уменьшения взаимодействия Fc с CAR-T-клетками, предложенными в настоящем изобретении. Примером указанных мутаций может быть конструкция KM.CAR_hCH2CH3mut_28™_41BBz, представленная в примере 3 в настоящем документе. В еще одном дополнительном варианте реализации применяют полипептид CD8α. В еще одном варианте реализации спейсер (например, происходящий из доменов иммуноглобулина согласно описанию в настоящем документе) может быть присоединен к scFV гибким линкером. В частности, указанный гибкий линкер представляет собой глицин-сериновый линкер из приблизительно 10-30 аминокислот (например, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот) и содержит структуру (Gly₄Ser)₃.

IV. Внутриклеточный сигнальный домен

[0056] Внутриклеточный сигнальный домен содержит полностью или частично цепь CD3ζ. CD3ζ также известная как CD247, совместно T-клеточным корецептором либо с CD4 или CD8 отвечает за сопряжение внеклеточного распознавания антигена с внутриклеточными сигнальными каскадами. В одном варианте реализации CD3ζ, применяемый в любых предложенных в настоящем изобретении конструкциях, представлен последовательностью SEQ ID NO: 26.

[0057] В дополнение к включению сигнального домена CD3ζ, включение костимулирующих молекул, как было показано, усиливает активность CAR-T-клеток в моделях на мышах и в клинических испытаниях. Было исследовано несколько молекул, в том числе CD28, 4-1BB, ICOS, CD27, CD270, CD30 и OX-40. CAR согласно настоящему изобретению содержат также, помимо scFv KappaMab, гибкого линкера, оптимального шарнира и цепи CD3ζ, один или больше дополнительных костимулирующих доменов, например, из CD28, 4-1BB, ICOS, CD27, CD270, CD30 и/или OX-40. Указанные костимулирующие домены выбирают на основании требуемой функциональности итоговой CAR-T-клетки. Примеры комбинаций показаны, например, на фиг. 6A-6C. Помимо изменения длины внеклеточного шарнира, включение конкретных комбинаций костимулирующих доменов (например, CD28, OX-40, 4-1BB) также повышает пролиферацию и выживаемость CAR-T-клеток in vivo. В одном варианте реализации применяемый в любых предложенных в настоящем изобретении конструкциях домен CD28 представлен последовательностью SEQ ID NO: 25.

Коэкспрессия биологически активных молекул

[0058] CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению имеют дополнительное преимущество по сравнению с применением только KappaMAb, так как они могут быть дополнительно модифицированы для включения дополнительных биологически активных молекул, усиливающих противоопухолевую функцию и/или повышающих безопасность композиций. В одном варианте реализации указанные CAR-T-клетки могут быть дополнительно генетически модифицированы для продуцирования противоопухолевых цитокинов, обеспечивающих целенаправленную доставку в микроокружение опухоли/раковые клетки, позволяя при этом избежать системной токсичности. Примеры дополнительных биологически активных молекул, которые могут усиливать противоопухолевый ответ CAR-T-клеток согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, ИЛ-12, углевод-связывающий белок галектин-3 (GAL3) или его усеченную форму, GAL3C, и супер-антагонист цитокиновых рецепторов SANT7. В другом варианте реализации CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению могут также быть котрансдуцированы плазмидой, которая экспрессирует связывающий фактор роста гепатоцитов (ФРГ) белок. В одном варианте реализации указанный связывающий фактор роста гепатоцитов белок представляет собой антитело или его фрагмент, которое(ый) способен связывать и ингибировать функцию ФРГ.

[0059] ИЛ-12 представляет собой мощный подавляющий рост опухоли цитокин, уменьшающий рост опухоли и ангиогенез и усиливающий опухолеспецифичный иммунный ответ. В клетках множественной миеломы сохраняется экспрессия рецептора ИЛ-12; у мышей - носителей миеломы ИЛ-12 снижает прогрессирование опухоли при введении в виде монотерапии и действует синергистически при введении с ингибитором протеасомы бортезомибом (Airoldi, et al. (2008) Blood, 112(3):750-759; Wang, et al. (2014) Anticancer Drugs, 25(3): 282-288). Экспрессия ИЛ-12 CAR-T-клетками значительно повышает их способность к эрадикации солидных опухолей, однако указанный способ еще не был исследован при множественной миеломе (Pegram, (2012) Blood, 119(180:4133-4141 и Zhang, et al. (2011) Mol. Ther. 19(4):751-759).

[0060] SANT7 представляет собой супер-антагонист цитокинового рецептора. Он представляет собой аналог ИЛ-6, который был генетически модифицирован с обеспечением 70-кратного усиления связывания с α-субъединицей рецептора ИЛ-6, при практически полном отсутствии взаимодействия с сигнальной субъединицей gp130. SANT7 индуцирует апоптоз в клетках ИЛ-6-зависимых линий миеломы in-vitro, устраняет опосредованную стромой устойчивость к дексаметазону in-vitro и в модели на мышах, а в комбинации с ингибиторами NFκB, полностью устраняет устойчивость к апоптозу. ИЛ-6 представляет собой цитокин, имеющий значение для роста и выживаемости различных опухолей, в том числе множественной миеломы, рака легкого, рака ободочной и прямой кишки, рака молочной железы и других. Связывание ИЛ-6 с соответствующим рецептором активирует путь JAK-STAT, с последующим фосфорилированием STAT3, который модулирует экспрессию связанных с апоптозом генов, таких как BCL-XL и p53, вызывающую устойчивость к апоптозу. ИЛ-6 также способствует понижающей регуляции рецептора ИЛ-12 на клетках миеломы, что уменьшает подавляющие опухолевый рост свойства ИЛ-12. (Airoldi, et al. (2008) Blood, 112(3):750-759). При миеломе наблюдается повышающая регуляция рецептора ИЛ-6, а повышенные системные уровни ИЛ-6 коррелируют с неблагоприятным прогнозом. (Rawstron, et al. (2000) Blood 96(12) 3880-3886; Ludwig, et al. (1991) Blood, 77(12):2794-2795). Были разработаны моноклональные антитела к ИЛ-6 для клинического применения, однако, хотя в ранних клинических испытаниях при миеломе были продемонстрированы измеряемые биологические эффекты, указанные антитела, как оказалось, образуют комплексы с циркулирующим ИЛ-6, что приводит к снижению выведения и потенциально ограничивает их эффективность. (Bataille, et al. (1995) Blood, 86(2): 685-691). Недавно проводилась оценка гибридного ИЛ-6-специфического моноклонального антитела силтуксимаб в клинических испытаниях фазы I и II при рецидивирующей и рефрактерной множественной миеломы. Ответ на собственно силтуксимаб отсутствовал, однако была распространена гематологическая токсичность, при этом более чем в половине случаев наблюдались связанные с терапией инфекции.

[0061] Галектин-3 представляет собой углевод-связывающий белок, который может играть роль в адгезии и инвазии опухоли. Усеченная форма галектина-3, Gal3C, действует доминантно-негативным образом и может ингибировать рост и инвазию клеток миеломы. Конструкция Gal3C для индуцируемой активацией секреции была разработана на основе источников: John et al (2003) Clin Cancer Res., 9(6):2374-83 и Mirandola et al. (2011) PLoS One, 6(7):e21811. Она состоит из карбоксильного конца длиной 143 аминокислот, сохраняющего углевод-связывающие свойства, однако не содержащего N-концевые аминокислоты, необходимые для перекрестного связывания лиганда. Указанная конструкция также содержит лидерный пептид CD8-альфа для направления секреции и 6xHis-метку для детекции.

[0062] В некоторых вариантах реализации помимо экспрессионных векторов, содержащих конструкцию CAR, описанную выше, T-клетки дополнительно модифицировали одним или больше экспрессионными векторами, содержащими ИЛ-12, SANT7 и/или GAL3C. Например, экспрессионные конструкции, экспрессирующие одноцепочечный ИЛ-12, содержащий субъединицу p35 ИЛ-12, связанную с субъединицей p40 ИЛ-12, в частности, подходят для применения, поскольку итоговый белок представляет собой полностью биоактивный гетеродимер p70 ИЛ-12, однако экспрессируемый в виде единого полипептида. В одном варианте реализации применяют одноцепочечную конструкцию ИЛ-12, называемую Flexi-12 и описанную, например, в источнике: Anderson, et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8(9):1125-35. Одноцепочечная конструкция ИЛ-12 может быть экспрессирована в составе того же экспрессионного вектора, что и конструкция CAR, или может быть экспрессирована в отдельном экспрессионном векторе и котрансдуцирована в T-клетку. Аналогичным образом, T-клетки, трансдуцированные описанной выше конструкцией CAR, могут быть котрансдуцированы дополнительным экспрессионным вектором, содержащим SANT7 и/или GAL3C. Как вариант, один экспрессионный вектор может применяться для трансдуцирования T-клеток как SANT7, так и GAL3C, по отдельности или в комбинации, и описанной выше конструкцией CAR. В другом варианте реализации могут применяться три экспрессионных вектора, один из которых экспрессирует конструкцию CAR, другой экспрессирует одноцепочечную конструкцию ИЛ-12, а третий экспрессирует конструкцию SANT7. Аналогичная стратегия может применяться для коэкспрессии GAL3C с ИЛ-12 и/или SANT7. Как вариант, конструкция ИЛ-12, GAL3C и/или SANT7 может быть экспрессирована с помощью одного экспрессионного вектора, а конструкция CAR - с помощью собственного экспрессионного вектора. Специалисту в данной области техники известны и другие комбинации и возможности экспрессирования указанных молекул в одной T-клетке.

ФРГ-связывающий белок

[0063] Была показана вовлеченность фактора роста гепатоцитов (ФРГ) и его рецептора MET в развитие и прогрессирование раковых заболеваний, в частности, в инвазию опухолей и прогрессирование до метастатического заболевания. Клетки множественной миеломы экспрессируют и ФРГ, и MET, что, соответственно, приводит к образованию как аутокринной, так и паракринной петли, тогда как нормальные плазматические клетки не экспрессируют ФРГ (Zhan et al. (2002); Borset, et al. (1996). Кроме того, концентрации ФРГ значимо повышены в плазматических клетках крови и костного мозга пациентов с множественной миеломой; высокие уровни ФРГ в сыворотке коррелируют с распространенной стадией заболевания и обширным поражением костей (Seidel et al. (1998); Wader, et al. (2008); Alexandrakis, et al. (2003). Кроме того, анализ биомаркеров сыворотки пациентов в ходе фазы I испытания KappaMab демонстрирует статистически значимое дозозависимое снижение уровней ФРГ в сыворотке после лечения KappaMab по сравнению с контролем. Для усиления указанного снижения уровней ФРГ сыворотки, согласно определенным вариантам реализации, ФРГ-связывающий белок экспрессируют в CAR-T-клетках согласно настоящему изобретению. Согласно конкретному варианту реализации экспрессируемый ФРГ-связывающий белок представляет собой антитело или его фрагмент. Согласно конкретному варианту реализации указанный связывающий анти-ФРГ белок представляет собой антитело, диатело, scFv или Fab. В одном варианте реализации указанный ФРГ-связывающий белок экспрессируют в составе того же экспрессионного вектора, что и конструкцию CAR. В еще одном варианте реализации указанный ФРГ-связывающий белок экспрессируют в составе отдельного экспрессионного вектора, однако котрансдуцируют вместе с конструкцией CAR. В еще одном дополнительном варианте реализации CAR-T-клетка экспрессирует CAR, ФРГ-связывающий белок и ИЛ-12. В еще одном дополнительном варианте реализации CAR-T-клетка экспрессирует CAR, ФРГ-связывающий белок и SANT7. В еще одном дополнительном варианте реализации CAR-T-клетка экспрессирует CAR, ФРГ-связывающий белок и GAL3C. В еще одном дополнительном варианте реализации CAR-T-клетка экспрессирует CAR, ФРГ-связывающий белок, ИЛ-12 и GAL3C. В еще одном дополнительном варианте реализации CAR-T-клетка экспрессирует CAR, ФРГ-связывающий белок и SANT7 и GAL3C. Согласно еще одному варианту реализации CAR-T-клетка экспрессирует CAR, связывающий анти-ФРГ белок, ИЛ-12 и SANT7. В еще одном дополнительном варианте реализации CAR-T-клетка экспрессирует CAR, ФРГ-связывающий белок, ИЛ-12, SANT7 и GAL3C.

Способы получения CAR-T-клеток согласно настоящему изобретению

[0064] Согласно одному аспекту предложены способы получения CAR-T-клеток, экспрессирующие рецептор(ы) CAR, описанные в настоящем документе, и необязательно один или больше противоопухолевых цитокинов (например, ИЛ-12 и/или SANT7), и/или один или больше ФРГ-связывающих белков. Специалисту в данной области техники будет хорошо понятно, что, хотя в настоящем документе описаны предпочтительные способы конструирования экспрессионных векторов, содержащих указанные CAR и противоопухолевые цитокины/антитела согласно настоящему изобретению, могут применяться любые способы, способные обеспечивать трансдукцию T-клеток для экспрессии указанных компонентов.

[0065] В одном варианте реализации T-клетки получают из крови субъекта путем венепункции, аспирации костного мозга, равновесного лейкофереза или лейкофереза с примированием цитокинами и последующего выделения мононуклеарных клеток периферической крови, в том числе T-клеток, с применением разделения в градиенте плотности. В некоторых вариантах реализации после лизирования красных клеток крови T-клетки сортируют с помощью проточной цитометрии или очищают с применением антител к антигенам, экспрессируемым на T-клетках, и магнитных гранул для получения популяции чистых T-клеток. Согласно конкретному варианту реализации T-клетки сортируют на основании экспрессии ими CD3 с получением фракции цельных T-клеток. В другом варианте реализации T-клетки сортируют на основании экспрессии ими CD4 или CD8 с получением популяции CD4⁺ T-клеток или CD8⁺ T-клеток. Согласно конкретному варианту реализации T-клетки получают от субъекта, нуждающегося терапии CAR-T-клетками. В другом варианте реализации T-клетки получают от субъекта-донора, не являющегося предполагаемым реципиентом терапии CAR-T-клетками.

[0066] В одном варианте реализации отделенные T-клетки культивируют in vivo в условиях, подходящих для их выживания, и трансдуцируют экспрессионными векторами, содержащими последовательности, необходимые для экспрессии CAR, описанных в настоящем документе, и/или ИЛ-12, SANT7, GAL3C и/или ФРГ-связывающего белка. В одном варианте реализации указанный экспрессионный вектор представляет собой экспрессионную систему на основе транспозируемого вектора. Согласно конкретному варианту реализации указанный экспрессионный вектор представляет собой экспрессионную плазмиду с транспозоном PiggyBac или вирусный вектор (например, ретровирусный вектор или лентивирусный вектор). В одном варианте реализации указанная экспрессионная плазмида с транспозоном PiggyBac является индуцируемой, такой как, например, плазмида с транспозоном PiggyBac, описанная в примерах в настоящем документе. В одном варианте реализации указанная экспрессионная плазмида с транспозоном PiggyBac содержит конститутивно активный промотор и/или индуцируемый активацией промотор. Указанный конститутивно активный промотор может представлять собой промотор фактора удлинения 1 альфа (EF1альфа). Указанный индуцируемый активацией промотор может представлять собой промотор (NFAT pro). Согласно одному аспекту применяют экспрессионную плазмиду с PiggyBac, обеспечивающую стойкую интеграцию CAR за счет вырезания и вставки кодирующих последовательностей CAR, ИЛ-12, SANT-7, GAL3C и/или ФРГ-связывающего белка в геном T-клетки. Согласно конкретному варианту реализации экспрессионные векторы согласно настоящему изобретению дополнительно содержат детектируемый маркер, позволяющий идентифицировать T-клетки, которые были успешно трансдуцированы указанным одним или больше экспрессионными векторами. В одном варианте реализации указанный детектируемый маркер выбирают из группы, состоящей из маркера клеточной поверхности, такого как CD34 или CD20, или другого поверхностного белка, флуорофора, такого как флуоресцеин-изотиоцианат, или любого другого флуоресцентного красителя, испускающего свет при возбуждении с переходом в более высокое энергетическое состояние, в том числе с применением лазера, и кассеты устойчивости к антибиотику, например, устойчивости к канамицину, устойчивости к ампициллину или любой другой кассеты, которая придает устойчивость к веществу-антибиотику, содержащемуся в среде, в которой предполагается культивировать трансдуцированные T-клетки. В одном варианте реализации указанный детектируемый маркер представляет собой зеленый флуоресцентный белок (GFP). GFP может представлять собой усиленный GFP, такой как, например, в конструкциях, представленных в примерах в настоящем документе. Согласно конкретному варианту реализации каждый из применяемых экспрессионных векторов (например, один экспрессионный вектор, содержащий CAR; один, содержащий ИЛ-12, GAL3C и/или SANT-7; и один, содержащий ФРГ-связывающий белок) содержит уникальный детектируемый маркер. В одном варианте реализации указанные экспрессионные векторы трансдуцируют в T-клетку способом, подходящим для выбранного(ых) экспрессионного(ых) вектора(ов). В одном варианте реализации указанный экспрессионный вектор с PiggyBac трансдуцируют в T-клетки путем электропорации.

[0067] После введения подходящих экспрессионных векторов T-клетки могут быть культивированы и размножены in vitro путем совместного культивирования с аутологичными мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) и подходящими факторами роста; затем проводят их скрининг на присутствие одного или больше детектируемых маркеров. T-клетки, экспрессирующие надлежащие детектируемые маркеры выбранных экспрессионных векторов, могут затем быть отсортированы и очищены для применения в способах согласно настоящему изобретению.

Способы лечения KMA-экспрессирующих злокачественных новообразований

[0068] Согласно одному аспекту предложены способы лечения нуждающихся в этом субъектов CAR-T-клетками согласно настоящему изобретению. Согласно конкретному аспекту нуждающийся в этом субъект представляет собой субъекта-человека, у которого было диагностировано или предположительно имеется злокачественное новообразование, экспрессирующее KMA, например, B-клеточное злокачественное новообразование, экспрессирующее KMA. В некоторых вариантах реализации пациент страдает или предположительно страдает множественной миеломой (MM), макроглобулинемией Вальденстрема, диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВККЛ) или амилоидозом. Способы диагностики B-клеточных злокачественных новообразований, экспрессирующих KMA, например, множественной миеломы (MM), макроглобулинемии Вальденстрема, диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) и амилоидоза известны в данной области техники, и поэтому подробно не описаны в настоящем документе. Указанные CAR-T-клетки могут применяться по отдельности или в комбинации с другими терапевтически эффективными агентами для лечения множественной миеломы (MM), макроглобулинемии Вальденстрема, диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ), амилоидоза или другого B-клеточного злокачественного новообразования, экспрессирующего KMA. В некоторых аспектах CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению вводят в фармацевтический состав, подходящий для внутривенной доставки.

[0069] В некоторых аспектах CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению вводят до, во время или после одного или больше иммуномодулирующих лекарственных средств. Согласно конкретному аспекту указанное одно или больше иммуномодулирующих лекарственных средств представляет собой талидомид или аналог талидомида, такой как, например, леналидомид или помалидомид.

[0070] В некоторых аспектах настоящего изобретения CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению действуют синергистически при введении с одним или больше иммуномодулирующих лекарственных средств.

[0071] В еще одном варианте реализации CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению вводят до, во время или после лечения одним или больше ингибиторов гистондеацетилазы, таким(и) как панобиностат, вориностат, трихостатин A, депсипептиды, фенилбутират, вальпроевая кислота, белиностат, LAQ824, энтиностат, CI944 или моцетиностат.

[0072] В некоторых аспектах настоящего изобретения CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению действуют синергистически при введении в комбинации с одним или больше ингибиторов гистондеацетилазы.

[0073] В некоторых аспектах настоящего изобретения CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению действуют синергистически при введении в комбинации с химиотерапией с промежуточными или высокими дозами и после введения аутологичных или аллогенных стволовых клеток крови человека.

[0074] В одном варианте реализации CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению вводят до, одновременно с или после аллогенного трансплантата стволовых клеток. Согласно еще одному варианту реализации CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению вводят до, одновременно с или после аллогенного трансплантата стволовых клеток. Без связи с какой-либо теорией, CAR-T-клетки согласно настоящему изобретению при введении в комбинации с аутологичным или аллогенным трансплантатом стволовых клеток предотвращают появление минимального остаточного заболевания, которое может возникать при неполной абляции костного мозга перед трансплантацией стволовых клеток или при повторном появлении злокачественных клонов B-клеток, экспрессирующих KMA.

[0075] Все цитируемые в настоящем документе патенты, заявки на патент и публикации включены посредством ссылки явным образом и полностью для любых целей.

ПРИМЕРЫ

[0076] Настоящее изобретение дополнительно подробно описано на представленных ниже экспериментальных примерах. Указанные примеры предложены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Соответственно, настоящее изобретение никоим образом не должно толковаться как ограниченное приведенными ниже примерами; напротив, оно охватывает любые возможные варианты, ставшие очевидными в свете принципов, изложенных в настоящем документе.

[0077] Без дополнительного описания, считается, что специалист в данной области техники сможет с применением предшествующего описания и приведенных ниже примеров получить и использовать соединения согласно настоящему изобретению и реализовать на практике заявленные способы. Соответственно, приведенные ниже демонстрационные примеры, в частности, указывают на предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие каким-либо образом остальную часть настоящего описания.

ПРИМЕР 1: получение KMA.CAR-28z

[0078] На основе последовательности нуклеотидов, кодирующей вариабельные области KappaMab (SEQ ID NO: 9 и 10), был разработан scFv и клонирован в конструкцию CAR, содержащую шарнир тяжелой цепи иммуноглобулина, костимулирующий домен CD28 и эндодомен CD3-зета (фиг. 6A). Указанная конструкция была разработана в Clone Manage 9 (Sci-Ed Software) с применением генетической последовательности вариабельных областей антитела, поставляемого Haemalogix Pty Ltd. Последовательности аминокислот в направлении от 5' к 3' частей указанной конструкции (т.е. KM.CAR-hCH2CH3-28z; фиг. 6A) приведены ниже:

[0079] Лидерный пептид тяжелой цепи Ig (Uniprot P01764): MEFGLSWLFLVAILKGVQCSR (SEQ ID NO: 20).

[0080] Вариабельная область легкой цепи антитела KappaMab: DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSTSYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 21).

[0081] Вариабельная область тяжелой цепи: EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATIIADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGVYHDYDGDYWGQGTTLTVSSYVTVSS (SEQ ID NO: 22).

[0082] Гибкий (G4S)₃-линкер: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23).

[0083] Шарнир, CH2- и CH3-домены константной области IgG1 с мутацией C>P в шарнирной области в положении аминокислоты 103 (Uniprot P01857): YVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK (SEQ ID NO: 24).

[0084] Трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 (Uniprot P10747): FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 25).

[0085] Внутриклеточный домен CD3-зета человека (Uniprot P20693): RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 26).

[0086] Полноразмерная последовательность аминокислот имеет следующую последовательность: MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSTSYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATIIADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGVYHDYDGDYWGQGTTLTVSSYVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 27).

[0087] Указанную последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 27) кодирует следующая последовательность ДНК:

[0088] ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCTACGTCACCGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 28).

[0089] Для конструирования указанной конструкции с использованием сервиса GeneArt (ThermoFisher Scientific) синтезировали генную последовательность, состоящую из 5'-сайта рестрикции фермента EcoRI, 5'-последовательности Kozak, лидерного пептида, одноцепочечного вариабельного фрагмента и части константной области IgG1, в которую входит сайт рестрикции фермента AleI, верифицировали последовательность и затем клонировали в экспрессионную плазмиду pIRII-CAR.CD19-28z с транспозоном PiggyBac. Затем ее вводили в донорные T-клетки от 2 нормальных доноров путем совместной электропорации с транспозазной плазмидой для PiggyBac, опосредующей стабильную интеграцию. Транспозон/транспозазная система PiggyBac обеспечивает стойкую интеграцию CAR за счет вырезания и вставки представляющего интерес гена в геном целевой клетки. Экспрессионная система на основе PiggyBac была выбрана ввиду ее способности обеспечивать стойкую генетическую модификацию на выраженном уровне при значительно более низкой стоимости, чем для ретровирусных векторов. При этом специалисту в данной области техники будет понятно, что в соответствии с настоящим изобретением могут также применяться другие экспрессионные системы, включая ретровирусные векторы.

[0090] Экспрессирующие KM.CAR-hCH2CH3-28z T-клетки размножали в соответствии с оптимизированными протоколами авторов изобретения путем совместного культивирования с аутологичными питающими клетками - мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) с добавлением 10 нг/мл интерлейкина-15 (ИЛ-15). После культивирования на протяжении 3 недель с еженедельной заменой МКПК и восполнением ИЛ-15 2-3 раза в неделю, T-клетки собирали, оценивали их фенотип и экспрессию CAR с помощью проточной цитометрии, KMA-специфическую функцию путем проточно-цитометрического анализа на внутриклеточный цитокин интерферон-гамма при стимуляции клетками KMA⁺ и KMA^--линий (фиг. 4A); и цитотоксичность этих линий клеток в анализе с высвобождением хрома.

[0091] В конце 3-недельного периода культуры состояли в основном из CAR-экспрессирующих CD3⁺ T-клеток (55% и 70% живых клеток), экспрессировали интерферон-гамма в ответ на KMA⁺ клетки миеломы и B-линий (фиг. 4B), и демонстрировали KMA-специфическую цитотоксичность (фиг. 4C).

Пример 2: получение модели ксенотрансплантата миеломы человека на мышах

[0092] Получали модель миеломы человека на основе ксенотрансплантата множественной миеломы у мышей. Клетки RPMI8226 или альтернативных линий миеломы инокулировали в/в мышам Rag2-/-γc-/- (BALB/c) для получения модели Rag MM (фиг. 5A-5D). У мышей Rag2-/-γc-/- (BALB/c) отсутствуют лимфоциты мышей (T, B и NK-клетки), и они представляют собой восприимчивых хозяев для исследования ксенотрансплантатов человека. Указанную модель успешно применяли для тестирования новых терапевтических средств, таких как бортезомиб, в комбинации с новым антителом (фиг. 5E). Авторы настоящего изобретения применяют указанную модель MM для тестирования и дополнительной оптимизации KMA.CAR-T-клеток.

Пример 3: оптимизированные конструкции KMA.CAR

[0093] На основе конструкции, описанной в примере 1, конструировали 6 конструкций CAR, содержащих scFv KM, описанный в примере 1, с областями спейсеров вариабельной длины и костимулирующими эндодоменами (например, CD28 или 4-1BB (CD137-Uniport Q07011)), с эндодоменом CD3-зета (фиг. 2 и фиг. 6B-6D). С помощью спейсера варьирующей длины изменяли расстояние между T-клеткой и целевой клеткой, при этом более короткий спейсер потенциально усиливал лизис целевых клеток. Во всех конструкциях применяли трансмембранный домен CD28 для обеспечения стабильной экспрессии рецепторов KMA.CAR на поверхности T-клеток. Во всех случаях, когда в качестве спейсера применяли компоненты константной области тяжелой цепи IgG1, между scFv и спейсерной областью размещали второй гибкий (G4S)₃-линкер. Указанные CAR синтезировали с использованием коммерческого сервиса Genscript и клонировали в плазмиду pVAX1PB с транспозоном PiggyBac для дальнейшего тестирования.

[0094] 3 из 6 конструкций KM.CAR содержали костимулирующий эндодомен CD28; они представлены ниже:

[0095] Первая конструкция указанной группы была представлена конструкцией KM.CAR_hCH3_28z, которая содержит только шарнирный и CH3-домены константной области тяжелой цепи IgG1 в качестве спейсера и имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

[0096] ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCGGTGGAGGCGGGTCTGGGGGCGGAGGTTCAGGCGGGGGTGGTTCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 29).

[0097] В направлении от 5' к 3' указанная конструкция (SEQ ID NO: 29) содержит лидерный пептид, вариабельную область легкой цепи KappaMab, (G4S)₃-линкер, вариабельную область тяжелой цепи KappaMab, второй (G4S)₃-линкер, шарнирный домен & домен CH3 константной области IgG1, трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 и внутриклеточный домен CD3-зета. Диаграмма указанной конструкции приведена на фиг. 6B.

[0098] Вторая конструкция указанной группы представлена конструкцией KM.CAR_h_28z, которая содержит только шарнирный домен константной области тяжелой цепи IgG1 в качестве спейсера, и имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

[0099] ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCGGTGGAGGCGGGTCTGGGGGCGGAGGTTCAGGCGGGGGTGGTTCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 30).

[00100] В направлении от 5' к 3' указанная конструкция (SEQ ID NO: 30) содержит лидерный пептид, вариабельную область легкой цепи KappaMab, (G4S)₃-линкер, вариабельную область тяжелой цепи KappaMab, второй (G4S)₃-линкер, шарнирный домен константной области IgG1, трансмембранный и внутриклеточный домены CD28 и внутриклеточный домен CD3-зета. Диаграмма указанной конструкции приведена на фиг. 6B.

[00101] Третья конструкция указанной группы была представлена конструкцией KM.CAR_CD8a_28z, которая содержит «стебель» CD8-альфа (Uniprot P01732, аминокислоты 138-182) в качестве спейсера, и имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

[00102] ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 31).

[00103] В направлении от 5' к 3' указанная конструкция (SEQ ID NO: 31) содержит лидерный пептид, вариабельную область легкой цепи KappaMab, (G4S)₃-линкер, вариабельную область тяжелой цепи KappaMab, «стебель» CD8-альфа, трансмембранный и внутриклеточный домены CD28, и внутриклеточный домен CD3-зета.

[00104] Остальные 3 из 6 конструкций KM.CAR, описанных в указанном примере, содержали костимулирующий эндодомен 4-1BB (CD137) и имели следующие последовательности:

[00105] Первая конструкция указанной группы представлена KM.CAR_h_28™_41BBz, которая содержит только шарнирный домен константной области тяжелой цепи IgG1 в качестве спейсера, и где внутриклеточный домен CD28 заменен на внутриклеточный домен костимулирующей молекулы 4-1BB, и имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

[00106] ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCGGTGGAGGCGGGTCTGGGGGCGGAGGTTCAGGCGGGGGTGGTTCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 32).

[00107] В направлении от 5' к 3' указанная конструкция (SEQ ID NO: 32) содержит лидерный пептид, вариабельную область легкой цепи KappaMab, (G4S)₃-линкер, вариабельную область тяжелой цепи KappaMab, второй (G4S)₃-линкер, шарнирный домен константной области IgG, трансмембранный домен CD28, внутриклеточный домен 4-1BB и внутриклеточный домен CD3-зета.

[00108] Вторая конструкция указанной группы была представлена KM.CAR_8a_28™_41BBz, которая содержит «стебель» CD8-альфа (Uniprot P01732, аминокислоты 138-182) в качестве спейсера и где внутриклеточный домен CD28 заменен на внутриклеточный домен костимулирующей молекулы 4-1BB и имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

[00109] ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 33).

[00110] В направлении от 5' к 3' указанная конструкция (SEQ ID NO: 33) содержит лидерный пептид, вариабельную область легкой цепи KappaMab, (G4S)₃-линкер, вариабельную область тяжелой цепи KappaMab, «стебель» CD8-альфа, трансмембранный домен CD28, внутриклеточный домен 4-1BB и внутриклеточный домен CD3-зета.

[00111] Третья конструкция указанной группы представлена KM.CAR_hCH2CH3mut_28™_41BBz, которая содержит шарнир, CH2- и CH3-домены константной области тяжелой цепи IgG1 в качестве спейсера, с введенными мутациями аминокислот, важных для взаимодействия CH2 с Fc-рецепторами (3-6), которые могут опосредовать сниженную выживаемость CAR-T-клеток in-vivo (3, 6, 7) путем выведения CAR-T-клеток в ретикулоэндотелиальную систему. Последовательность нуклеиновой кислоты:

[00112] ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGAGACATCGTCATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCGGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGTACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAACACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAATAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGTCTACCATGATTACGACGGGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGCTCACCGTCTCCTCCGGTGGAGGCGGGTCTGGGGGCGGAGGTTCAGGCGGGGGTGGTTCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCAGTCGCGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGAACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 34).

[00113] В направлении от 5' к 3' указанная конструкция (SEQ ID NO: 34) содержит лидерный пептид, вариабельную область легкой цепи KappaMab, (G4S)₃-линкер, вариабельную область тяжелой цепи KappaMab, второй (G4S)₃-линкер, мутированный шарнирный, CH2- и CH3-домены константной области IgG1, трансмембранный домен CD28, внутриклеточный домен 4-1BB и внутриклеточный домен CD3-зета. Мутированный шарнирный домен IgG1 содержит, в направлении от 5' к 3', мутации E233P, L234V, L235A, G236-, S254A, D265N и N297A, выделенные в указанной конструкции затемненными прямоугольниками (SEQ ID NO: 34). Мутации в указанных участках (E233P, L234V, L235A, G236-, S254A, D265N, N297A) могут снижать взаимодействие Fc с CAR-T-клетками, обеспечивая улучшенную выживаемость после инфузии.

[00114] Добавление элемента «рибосомального перепрыгивания» 2A и eGFP в KM.CAR

[00115] Для облегчения детекции T-клеток, экспрессирующих каждый из описанных выше CAR, синтезировали eGFP с 5'-элементом «рибосомального перепрыгивания» T2A с перекрывающимися последовательностями с CAR- эндодоменом CD3-зета и остовом плазмиды. Затем их клонировали путем расщепления рестрикционными ферментами и лигирования в содержащие CAR транспозонные плазмиды pVAX1 PB с получением следующих конструкций.

[00116] Конструкции, содержащие эндодомен 28z _2A_GFP:

[00117] 1. pVAX1PB KM.CAR_hCH2CH3_28z_2A_GFP

[00118] 2. pVAX1PB KM.CAR_hCH3_28z_2A_GFP

[00119] 3. pVAX1PB KM.CAR_h_28z_2A_GFP

[00120] 4. pVAX1PB KM.CAR_8a_28z_2A_GFP

[00121] Конструкции, содержащие эндодомен 41BBz _2A_GFP:

[00122] 1. pVAX1PB KM.CAR_h_28™_41BBz_2A_GFP

[00123] 2. pVAX1PB KM.CAR_8a_28™_41BBz_2A_GFP

[00124] 3. pVAX1PB KM.CAR_hCH2CH3mut_28™_41BBz_2A_GFP

[00125] Получение KM.CAR-T-клеток с костимулирующим доменом 4-1BB.

[00126] Проводили сравнение предварительных KM.CAR_hCH2CH3_28z и 4-1BB-содержащих CAR. KM.CAR-T-клетки получали путем электропорации с применением системы PiggyBac согласно приведенному ранее в настоящем документе описанию и известной в данной области техники (2). 4 млн мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) от здоровых доноров электропорировали с применением системы электропорации Neon при 2400 В в течение 20 мс, в одноимпульсном режиме, в присутствии 5 мкг каждой из транспозазной и транспозонной PiggyBac-плазмид. Протестированные конструкции KMA.CAR включали KM.CAR_hCH2CH3_28z_2A_GFP; KM.CAR_h_28™_41BBz_2A_GFP; KM.CAR_8a_28™_41BBz_2A_GFP; или KM.CAR_hCH2CH3mut_28™_41BBz_2A_GFP.

[00127] Электропорированные МКПК (CAR-МКПК) выдерживали в покое в течение ночи в AIMV с 10% фетальной бычьей сыворотки (AIM-V CM), собирали, промывали и ресуспендировали в AIM-V CM до плотности 1×10⁶/мл. CAR-МКПК совместно культивировали с аутологичными облученными питающими клетками МКПК в присутствии или в отсутствие облученных KMA-экспрессирующих клеток JJN3 с соотношением CAR-МКПК:JJN3, составляющим 5:1. Каждые 3 дня добавляли интерлейкин-15 (ИЛ-15) в количестве 10 нг/мл. Клетки подсчитывали путем вытеснения трипанового синего, и каждые 7 дней добавляли свежие облученные стимуляторы/питающие клетки.

[00128] Оценка экспрессии KM.CAR

[00129] Экспрессию KM.CAR оценивали с помощью проточной цитометрии в начале культивирования (1 день), на 15 день и 21 день (фиг. 8A-8B). В культурах KM.CAR-T-клеток выполняли поверхностное окрашивание антителом к CD3 человека и оценивали экспрессию CAR по экспрессии GFP.

[00130] KM.CAR-T-клеткам требуется каппа-антиген миеломы для персистенции in-vitro

[00131] Культуры, содержащие KMA-экспрессирующие клетки линии JJN3, демонстрировали более высокий общий уровень размножения, повышенную экспрессию KM.CAR или и то, и другое, по сравнению с культурами, содержащими только МКПК (фиг. 8A-8B). В соответствии с известным взаимодействием CH2-домена константной области IgG с Fc-рецепторами, проводили обогащение экспрессирующими KM.CAR_hCH2CH3_28z T-клетками в присутствии только МКПК (28% CD3⁺ T-клеток), однако более высокие уровни размножения и обогащения наблюдались при добавлении клеток JJN3 (15-кратное размножение при 38% уровне экспрессии CAR по сравнению с 6-кратным размножением при 29% уровне экспрессии CAR).

[00132] Экспрессирующие KM.CAR_hCH2CH3mut_28™_41BBz T-клетки демонстрировали крайне незначительный уровень экспрессии CAR (6%) и размножения (6-кратное) в присутствии только МКПК, по сравнению с совместным культивированием с JJN3 (26% уровень экспрессии CAR и 17-кратное размножение). KM.CAR-T-клетки, содержащие только шарнир IgG1 в качестве спейсера, демонстрировали аналогичный уровень размножения (5-кратное при JJN3, 6-кратное без JJN3), при повышенной экспрессии CAR (17% при JJN3, 9% без JJN3). Только KM.CAR-T-клетки, содержащие цепь CD8-альфа в качестве спейсера, не демонстрировали какого-либо увеличения размножения или обогащения в присутствии клеток JJN3 (8-кратное размножение и 5% уровень экспрессии CAR в присутствии JJN3, по сравнению с 5-кратным размножением и 5% уровнем экспрессии CAR без JJN3).

[00133] Функциональная оценка KM.CAR-T-клеток

[00134] Оценивали синтез KMA-специфического интерферона-гамма и цитотоксичность KM.CAR-T-клеток посредством проточно-цитометрического анализа на внутриклеточные цитокины и стандартного анализа с высвобождением хрома на линиях KMA+ и KMA- клеток, с применением ранее описанных протоколов (2). Использованные линии KMA-положительных клеток включали JJN3, Pfeiffer, NCI-H929. Линии KMA-отрицательных клеток включали Nalm-6 и Molt (фиг. 12A-12B).

[00135] Для проточно-цитометрического анализа на цитокины, 2×10⁵ KM.CAR-T-клетки стимулировали целевыми клетками в соотношении 1:1 в течение 5 часов. Через 1 час добавляли монензин (2 мкМ) (BD Biosciences) и брефелдин A (1 мкг/мл) (BD Biosciences). CAR-T-клетки, неспецифически активированные 50 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА: Sigma-Aldrich) и 1 мкг/мл иономицина (Sigma-Aldrich) и нестимулированные клетки применяли в качестве положительного и отрицательного контролей. Затем CAR-T-клетки собирали, промывали, проводили поверхностное окрашивание на CD3, CD4 и CD8. CAR-T-клетки фиксировали и пермеабилизировали цитофиксом и буфером Perm/Wash (BD Biosciences), и окрашивали антителом против интерферона гамма (BD Biosciences) с последующим дополнительным промыванием буфером Perm/Wash. Окрашенные клетки анализировали с применением проточного цитометра FACSCanto™ II с регистрацией по меньшей мере 30 000 событий.

[00136] KMA-специфическую цитотоксичность оценивали с применением стандартного анализа с высвобождением хрома (⁵¹Cr). Целевые клетки метили хроматом натрия (Na₂⁵¹CrO₄) (Perkin-Elmer, Уолтем, Массачусетс, США). KM.CAR-T-клетки предварительно инкубировали с клетками линии K562 в соотношении 1:1 для компенсации активности NK-клеток. Меченые хромом целевые клетки добавляли к KM.CAR-T-клеткам в трех повторностях при соотношении эффекторных:целевых клеток в диапазоне от 40:1 до 1,25:1, и инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 4 часов. Целевые клетки в трех повторностях лизировали 10% додецилсульфата натрия для определения максимального высвобождения; целевые клетки в трех повторностях без эффекторов применяли для оценки спонтанного высвобождения. Супернатанты аспирировали и считывали с применением счетчика для планшетов MicroBeta2 (PerkinElmer). Процент специфического лизиса рассчитывали с применением стандартной формулы: % специфического лизиса = (экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение) / (максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение) × 100]

Пример 4: получение плазмиды с транспозоном PiggyBac с индуцируемым активацией промотором

[00137] Разрабатывали и клонировали одну транспозонную кассету, содержащую конститутивно активный промотор (EF1альфа) и индуцируемый активацией промотор (NFATpro). Индуцируемую активацией генную экспрессионную кассету получали путем разработки NFATpro с применением Clone Manage 9 (Sci-Ed Software), на основе источника: Fiering et al (8). Она включает 6 копий последовательности ДНК размером 30 п.о. (элемент ответа - RE), связанных ядерным фактором активированных T-клеток (NFAT-RE) - GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT (SEQ ID NO: 35), за которыми следует минимальный промотор ИЛ-2 - ACATTTTGACACCCCCATAATATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTG (SEQ ID NO: 36), обнаруживаемый на хромосоме 4 (референсная последовательность NCBI: NG_016779.1).

[00138] Для обеспечения детекции индуцированной активацией генной экспрессии в направлении 3' от NFATpro размещают последовательность ДНК усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), за которой следует сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) (9-11). Последовательность ДНК указанной генной кассеты приведена ниже.

[00139] GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTCAATTAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAG AAGGCGTCAATTAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTCAATTGTCCCATCGAAT TAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTCAATTAGGAGGAAAAACTGTTTCATACA GAAGGCGTCAATTAGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTCAATTGTCCCGGGAC ATTTTGACACCCCCATAATATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAA GAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGAACTCCATGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGAC GGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTA CGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCAC CCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAA GCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTT CTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCC TGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGG CACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAA GAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGC TCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGT TAAAGCAAGCAGGAGACGTTGAAGAAAACCCCGGTCCTATTTAAATCCTCGACTGTGCCT TCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTG CCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG TCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACA ATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGC (SEQ ID NO: 37).

[00140] В направлении от 5' к 3' указанные конструкции содержат NFAT-RE, минимальный промотор ИЛ-2, eGFP и сигнал полиаденилирования BGH.

[00141] Указанную кассету синтезировали с использованием коммерческого сервиса Genscript и клонировали в транспозонную плазмиду pVAX1PB между 5'-инсулятором cHS4 (GenBank: U78775.2) (12) и промотором фактора удлинения 1 человека. Для идентификации трансдуцированных T-клеток в начальных экспериментах гибридный маркер RQR8, состоящий из эпитопа CD34, распознаваемого моноклональным антителом QBEnd10, и мимеотопов CD20-специфического моноклонального антитела Ритуксимаб (13) клонировали в сайт множественного клонирования транспозона для получения транспозонной генной вставки, показанной на фиг. 9 (плазмида pVAX1PB NFATGFP-RQR8). Совместная электропорация индуцируемой активацией генной кассеты, содержащей транспозонную плазмиду pVAX1PB NFATGFP-RQR8 и транспозазную плазмиду pVAX1 PBase, приводит к стойкой интеграции генной вставки NFATGFP-RQR8, показанной на фиг. 9.

Демонстрация функции индуцируемого активацией гена, содержащего транспозон

[00142] Для демонстрации функции транспозона pVAX1PB NFATGFP-RQR8 из примера 4 (см. фиг. 9) 4×10⁶ МКПК электропорировали в присутствии 5 мкг каждой из транспозонных и транспозазных плазмид. Электропорированные клетки выдерживали в покое в течение 24 часов и затем неспецифически стимулировали в течение ночи 50 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА: Sigma-Aldrich) и 1 мкг/мл иономицина (Sigma-Aldrich), и сравнивали с нестимулированными контролями. Трансдуцированные клетки идентифицировали по окрашиванию QBEnd10 при экспрессии маркера RQR8; через 19 часов оценивали индуцированную активацией генную экспрессию (eGFP). В указанный момент времени экспрессия eGFP наблюдалась в 50% трансдуцированных клеток (фиг. 10).

Пример 5: разработка контролируемой биологической KM.CAR-терапии

[00143] Также конструировали экспрессионные плазмиды, содержащие ИЛ-12 и/или антагонист рецептора интерлейкина-6 SANT7, а также содержащие оптимизированный химерный антигенный рецептор с экспрессией ИЛ-12 и/или SANT7 под контролем индуцируемого активацией промотора (Hooijberg et al. 2000). Последовательность SANT-7 была предоставлена профессором Рокко Савино (Prof. Rocco Savino) и была основана на мутированной генной последовательности ИЛ-6 дикого типа (референсная последовательность NCBI: NM_000600.4) согласно Savino et al 1994 и Sporeno et al 1996 (14-17). Указанную последовательность импортировали в Clone Manage 9 (Sci-Ed Software) и добавляли 6xHis-метку для детекции в супернатантах посредством ИФА ELISA.

[00144] В предложенной последовательности нуклеотидов SANT-7, приведенной ниже, выделены замены аминокислот:

[00145] MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRDILDFISALRKETCNKSNMCESSKEADAFWNLNLPKMAEKDGCFYKGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMRTKDLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLIRSLRALRAMHHHHHH (SEQ ID NO: 38). Замены нуклеотидов соответствуют Y31D, G35F, L57D, E59F, N60W, Q75Y, S76K, S118R, V121D. Предложенная последовательность также содержала замену Q211A, не указанную в опубликованной последовательности.

[00146] Последовательность ДНК, соответствующая указанной последовательности аминокислот (т.е. SEQ ID NO: 38):

[00147] ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTACCCCCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTAGCCGCCCCACACAGACAGCCACTCACGAGCTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGGACATCCTCGACTTTATCTCAGCCTTAAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAGAGCTCCAAAGAGGCAGACGCATTCTGGAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCTACAAAGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTGAAAATCATCACTGGTCTTCTCGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGCGCACAAAAGACCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGAGATCTTTTAAGGAGTTCCTGATCCGTAGCCTGAGGGCTCTTCGGGCTATGCATCATCACCATCACCACT (SEQ ID NO: 39).

[00148] Одноцепочечная конструкция с интерлейкином-12 (Flexi-IL-12) была разработана путем объединения субъединиц p40 и p35 ИЛ-12 (Uniprot P29459 и P29460) с применением гибкого (G₄S)₃-линкера, аналогично описанию у Zhang et al и Chinnasamy et al (18, 19), что позволяет экспрессировать обе субъединицы в виде одной пептидной цепи, которая легко образует биоактивный гетеродимер p70. Синтезировали конструкцию Flexi-IL-12 и клонировали конструкции, содержащие ИЛ-12 и SANT7, в индуцируемую активацией транспозонную кассету, описанную в настоящем документе и показанную на фиг. 11.

[00149] Кроме того, может быть синтезирована конструкция Flexi-IL-12 и конструкции, содержащие ИЛ-12 и SANT7, разделенные элементами «рибосомального перепрыгивания» 2A, могут быть клонированы в плазмиду PiggyBac, описанную в настоящем документе и показанную на фиг. 7.

[00150] Последовательность аминокислот Flexi-IL-12:

[00151] MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFK™NAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS (SEQ ID NO: 40).

[00152] В направлении от 5' к 3' конструкция Flexi-IL-12 содержит лидерный пептид, субъединицу p40 ИЛ-12, (G4S)₃-линкер и субъединицу p35 ИЛ-12.

[00153] Последовательность ДНК, соответствующая приведенной выше последовательности аминокислот (т.е. SEQ ID NO: 40):

[00154] ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCC (SEQ ID NO: 41).

[00155] Дополнительно также конструировали экспрессионные плазмиды, содержащие усеченную доминантно-негативную форму галектина-3, GAL3C. Указанная конструкция содержит лидерный пептид CD8-альфа для направления секреции, а также метку 6xHis для детекции. Последовательность аминокислот GAL3C приведена ниже:

[00156] MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRHHHHHHGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASY™I (SEQ ID NO: 42)

[00157] Соответствующая последовательность ДНК конструкции GAL 3C приведена ниже:

[00158] ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCTCTAGACATCATCACCATCACCACGGCGCCCCTGCTGGGCCACTGATTGTGCCTTATAACCTGCCTTTGCCTGGGGGAGTGGTGCCTCGCATGCTGATAACAATTCTGGGCACGGTGAAGCCCAATGCAAACAGAATTGCTTTAGATTTCCAAAGAGGGAATGATGTTGCCTTCCACTTTAACCCACGCTTCAATGAGAACAACAGGAGAGTCATTGTTTGCAATACAAAGCTGGATAATAACTGGGGAAGGGAAGAAAGACAGTCGGTTTTCCCATTTGAAAGTGGGAAACCATTCAAAATACAAGTACTGGTTGAACCTGACCACTTCAAGGTTGCAGTGAATGATGCTCACTTGTTGCAGTACAATCATCGGGTTAAAAAACTCAATGAAATCAGCAAACTGGGAATTTCTGGTGACATAGACCTCACCAGTGCTTCATATACCATGATA (SEQ ID NO: 43)

[00159] Проводят нуклеофекцию содержащими CAR и «биологические средства» транспозонными плазмидами с получением CAR-T-клеток, экспрессирующих либо только ИЛ-12, либо только SANT7, либо только GAL3C, или же и ИЛ-12, и SANT7; или и IL12, и GAL3C; или и SANT7, и GAL3C; или все три молекулы: ИЛ-12, SANT7 и GAL3C. Клетки, успешно трансдуцированные конструкциями с «биологическими средствами», могут быть идентифицированы по экспрессии селективного маркера, например, с помощью проточной цитометрии. Уровни ИЛ-12, SANT7 и/или GAL3C измеряют внутриклеточно путем проточно-цитометрического анализа на цитокины и в супернатантах культур CAR-T-клеток путем ИФА ELISA с применением коммерческих наборов и реагентов, и сравнивали с контрольными T-клетками, экспрессирующими CAR отдельно. Функцию CAR-T-клеток оценивают путем проточно-цитометрического анализа на цитокины и анализов на цитотоксичность согласно описанию выше, а также анализов с совместным культивированием с клетками линий миеломы для оценки ингибирования опухолевого роста. Эксперименты проводят в трех повторностях и выбирают 2 оптимальные идентифицированные конструкции CAR для оценки в модели на мышах с экспрессией и без экспрессии ИЛ-12, GAL3C и/или SANT7.

[00160] На основе созданной ранее модели ксенотрансплантата миеломы человека RPMI-Rag у мышей разрабатывают модели RPMI-Rag-Luc (KMA-) и JJN3-Rag-Luc (KMA+) для оценки функции полученных авторами настоящего изобретения CAR-T-клеток in-vivo. Клетки JJN3 и RPMI8226 трансфицируют Luc-1 и затем инокулируют в/в мышам Rag2-/-γc-/- (BALB/c) для получения моделей MM JJN3- Rag-Luc и RPMI-Rag-Luc. Проводят мониторинг приживления и уровней заболевания путем оптической визуализации после в/в инъекции люциферина, и сопоставляли с уровнями легких цепей каппа (JJN3) и лямбда (RPMI) сыворотки человека. Устанавливают оптимальное время для инокуляции кандидатными CAR-T-клетками с применением оптической визуализации до развития паралича задних конечностей, обычно с 5-8 недель. В когортах по 6 мышей JJN3-Rag-Luc и RPMI-Rag-Luc мышам инокулируют в/в возрастающие дозы CAR-T-клеток (с экспрессией и без экспрессии ИЛ-12/SANT7) для установления терапевтической дозы, начиная с общей дозы клеток 1×10⁶. Снимки мышей получают на 0, +1, +3, +8 дни и затем еженедельно до развития прогрессирования заболевания по оценке на основании развития паралича задних конечностей, повышения содержания свободных легких цепей сыворотки (SFLC) или другие институциональных стандартов. Опухоли костного мозга и экстрамедуллярные опухоли собирают и проводят гистологическое исследование распределения клеток MM и CAR-T-клеток. Эффективность определяют по ответу по данным визуализации ответа и выживаемости по сравнению с контролями.

Основные признаки настоящего изобретения перечислены в следующих пунктах.

1. Химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий один или больше внутриклеточных сигнальных доменов и внеклеточный антигенсвязывающий домен, причем указанный внеклеточный антигенсвязывающий домен специфически распознает каппа-антиген миеломы (KMA).

2. Химерный антигенный рецептор по п. 1, в котором указанный один или больше внутриклеточных сигнальных доменов содержит один или больше костимулирующих эндодоменов.

3. Химерный антигенный рецептор по п 2, в котором указанный один или больше костимулирующих эндодоменов представляет собой что-либо одно или больше из домена CD28, домена CD3ζ, домена 4-1BB или домена OX-40, или их комбинаций.

4. Химерный антигенный рецептор по п. 3, в котором указанные костимулирующие эндодомены представляют собой домен CD3ζ и домен CD28.

5. Химерный антигенный рецептор по п. 3, в котором указанные костимулирующие эндодомены представляют собой домен CD3ζ и домен OX-40.

6. Химерный антигенный рецептор по п. 4, дополнительно содержащий домен OX-40.

7. Химерный антигенный рецептор по п. 3, в котором указанные костимулирующие эндодомены представляют собой домен CD3ζ и домен 4-1BB.

8. Химерный антигенный рецептор по п. 4, дополнительно содержащий домен 4-1BB.

9. Химерный антигенный рецептор по п. 7, дополнительно содержащий домен OX-40.

10. Химерный антигенный рецептор по п. 1, в котором указанный внеклеточный связывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который специфически распознает KMA.

11. Химерный антигенный рецептор по п. 10, в котором указанный scFv содержит определяющие комплементарность участки (CDR), происходящие из моноклонального антитела KappaMab, при этом участки CDR указанных KappaMAb содержат последовательности SEQ ID NO: 3-8.

12. Химерный антигенный рецептор по п. 10, в котором указанный scFv содержит VL-цепь и VH-цепь KappaMab, при этом VL-цепь содержит SEQ ID NO: 2, а VH-цепь содержит SEQ ID NO: 1.

13. Химерный антигенный рецептор по п. 11, в котором указанные VL-цепь и VH-цепь KappaMab соединены глицин-сериновым линкером.

14. Химерный антигенный рецептор по п. 13, в котором указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот.

15. Химерный антигенный рецептор по п. 14, в котором указанный линкер из 15 аминокислот содержит (Gly₄Ser)₃.

16. Химерный антигенный рецептор по п. 10, в котором указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным сигнальным доменам спейсером.

17. Химерный антигенный рецептор по п. 16, в котором указанный спейсер представляет собой константную область иммуноглобулина или цепь CD8α.

18. Химерный антигенный рецептор по п. 17, в котором указанная константная область иммуноглобулина содержит что-либо одно или больше из шарнирного домена IgG, CH2-домена IgG и CH3-домена IgG.

19. Химерный антигенный рецептор по п 18, в котором указанная константная область иммуноглобулина содержит шарнирный домен иммуноглобулина.

20. Химерный антигенный рецептор по п. 19, в котором указанная константная область иммуноглобулина дополнительно содержит CH3-домен IgG.

21. Химерный антигенный рецептор по п. 19 или 20, в котором указанная константная область иммуноглобулина дополнительно содержит CH2-домен IgG.

22. Химерный антигенный рецептор по любому из пп 17-21, в котором указанный спейсер присоединен к scFV глицин-сериновым линкером.

23. Химерный антигенный рецептор по п. 22, в котором указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот.

24. Химерный антигенный рецептор по п. 23, в котором указанный линкер из 15 аминокислот содержит (Gly₄Ser)₃.

25. Генетически модифицированная T-клетка, сконструированная с возможностью экспрессии химерного антигенного рецептора по любому из пп. 1-24.

26. Генетически модифицированная T-клетка по п. 25, сконструированная с дополнительной возможностью экспрессии одной или больше дополнительных биологических молекул.

27. Генетически модифицированная T-клетка по п. 26, причем указанная одна или больше дополнительных биологических молекул содержит что-либо одно или больше из ИЛ-12, GAL3C или SANT7.

28. Генетически модифицированная T-клетка по п. 26, причем указанная одна или больше дополнительных биологических молекул представляет собой ИЛ-12, и указанный ИЛ-12 экспрессируется одноцепочечным полипептидом, содержащим одну субъединицу p35 ИЛ-12 и одну субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером.

29. Генетически модифицированная T-клетка по п. 28, причем указанный гибкий линкер представляет собой линкер (G₄S)₃.

30. Генетически модифицированная T-клетка по п. 29, причем указанный одноцепочечный полипептид, содержащий одну субъединицу p35 ИЛ-12 и одну субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером, образует биоактивный гетеродимер p70 ИЛ-12.

31. Генетически модифицированная T-клетка по п. 26, сконструированная с возможностью экспрессии ИЛ-12 и селективного маркера.

32. Генетически модифицированная T-клетка по п. 26, сконструированная с возможностью экспрессии SANT-7.

33. Генетически модифицированная T-клетка по п. 26, сконструированная с возможностью экспрессии SANT-7 и селективного маркера.

34. Генетически модифицированная T-клетка по п. 31, сконструированная с дополнительной возможностью экспрессии SANT7.

35. Генетически модифицированная T-клетка по п. 26, сконструированная с возможностью экспрессии GAL3C.

36. Генетически модифицированная T-клетка по п. 26, сконструированная с возможностью экспрессии GAL3C и селективного маркера.

37. Генетически модифицированная T-клетка по п. 31, сконструированная с дополнительной возможностью экспрессии GAL3C.

38. Генетически модифицированная T-клетка по п. 31, сконструированная с дополнительной возможностью экспрессии GAL3C и SANT7.

39. Генетически модифицированная T-клетка по п. 33, сконструированная с дополнительной возможностью экспрессии GAL3C.

40. Способ получения генетически модифицированной T-клетки, включающий введение в T-клетку экспрессионного вектора, кодирующего CAR, содержащий один или больше внутриклеточных сигнальных доменов и внеклеточных антигенсвязывающих доменов, причем указанный внеклеточный антигенсвязывающий домен специфически распознает каппа-антиген миеломы (KMA).

41. Способ по п. 40, в котором указанный экспрессионный вектор представляет собой экспрессионную систему на основе транспозируемого вектора.

42. Способ по п. 40, в котором указанный экспрессионный вектор представляет собой экспрессионный вектор с транспозоном PiggyBac.

43. Способ по п. 40, в котором указанное введение включает электропорацию.

44. Способ по п. 40, в котором указанный один или больше внутриклеточных сигнальных доменов содержит один или больше костимулирующих эндодоменов.

45. Способ по п. 44, в котором указанный один или больше костимулирующих эндодоменов представляет собой что-либо одно или больше из домена CD28, домена CD3ζ, домена 4-1BB или домена OX-40, или их комбинаций.

46. Способ по п. 45, в котором указанные костимулирующие эндодомены представляют собой домен CD3ζ и домен CD28.

47. Способ по п. 45, в котором указанные костимулирующие эндодомены представляют собой домен CD3ζ и домен OX-40.

48. Способ по п. 46, в котором указанный CAR дополнительно содержит домен OX-40.

49. Способ по п. 45, в котором указанные костимулирующие эндодомены представляют собой домен CD3ζ и домен 4-1BB.

50. Способ по п. 46, в котором указанный CAR дополнительно содержит домен 4-1BB.

51. Способ по п. 50, в котором указанный CAR дополнительно содержит домен OX-40.

52. Способ по п. 40, в котором указанный внеклеточный связывающий домен содержит scFv, который специфически распознает KMA.

53. Способ по п. 52, в котором указанный scFv содержит определяющие комплементарность участки (CDR), происходящие из моноклонального антитела KappaMab, при этом указанные CDR содержат последовательности SEQ ID NO: 3-8.

54. Способ по п. 53, в котором указанный scFv содержит VL-цепь и VH-цепь моноклонального антитела KappaMab, при этом указанная VL-цепь содержит SEQ ID NO: 2, а указанная VH-цепь содержит SEQ ID NO: 1.

55. Способ по п. 54, в котором указанные участки CDR VL и участки CDR VH соединены глицин-сериновым линкером.

56. Способ по п. 55, в котором указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот.

57. Способ по п. 56, в котором указанный линкер из 15 аминокислот содержит (Gly₄Ser)₃.

58. Способ по п. 52, в котором указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным сигнальным доменам спейсером.

59. Способ по п. 58, в котором указанный спейсер представляет собой константную область иммуноглобулина или цепь CD8α.

60. Способ по п. 59, в котором указанная константная область иммуноглобулина содержит что-либо одно или больше из шарнирного домена IgG, CH2-домена IgG и CH3-домена IgG.

61. Способ по п. 59, в котором указанная константная область иммуноглобулина содержит шарнирный домен иммуноглобулина.

62. Способ по п. 61, в котором указанная константная область иммуноглобулина дополнительно содержит CH3-домен IgG.

63. Способ по п. 61 или 62, в котором указанная константная область иммуноглобулина дополнительно содержит CH2-домен IgG.

64. Химерный антигенный рецептор по любому из пп. 59-63, в котором указанный спейсер присоединен к scFV глицин-сериновым линкером.

65. Химерный антигенный рецептор по п. 22, в котором указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот.

66. Химерный антигенный рецептор по п. 23, в котором указанный линкер из 15 аминокислот содержит (Gly₄Ser)₃.

67. Способ по п. 40, дополнительно включающий введение одного или больше дополнительных экспрессионных векторов, способных экспрессировать одну или больше дополнительных биологических молекул.

68. Способ по п. 67, в котором указанная одна или больше дополнительных биологических молекул содержит что-либо одно или больше из ИЛ-12, GAL3C или SANT7.

69. Способ по п. 68, в котором указанная одна или больше дополнительных биологических молекул представляет собой ИЛ-12, и указанный ИЛ-12 экспрессируется одноцепочечной конструкцией, содержащей субъединицу p35 ИЛ-12 и субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером.

70. Способ по п. 69, в котором указанный гибкий линкер представляет собой (G₄S)₃-линкер.

71. Способ по п. 70, в котором указанная одноцепочечная конструкция, содержащая субъединицу p35 ИЛ-12 и субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером, образует биоактивный гетеродимер p70 ИЛ-12.

72. Способ по п. 67, в котором указанный один или больше дополнительных биологических агентов экспрессируется конструкцией, дополнительно кодирующей селективный маркер.

73. Способ по п. 72, в котором указанная конструкция кодирует ИЛ-12 и селективный маркер, при этом кодирующие последовательности указанного селективного маркера и ИЛ-12 соединены последовательностью, кодирующей элемент «рибосомального перепрыгивания» 2A.

74. Способ по п. 72, в котором указанная конструкция кодирует SANT7 и селективный маркер, при этом кодирующие последовательности указанного селективного маркера и SANT7 соединены последовательностью, кодирующей элемент «рибосомального перепрыгивания» 2A.

75. Способ по п. 72, в котором указанная конструкция кодирует GAL3C и селективный маркер, при этом кодирующие последовательности указанного селективного маркера и GAL3C соединены последовательностью, кодирующей элемент «рибосомального перепрыгивания».

76. Способ по п. 74, в котором указанная конструкция дополнительно кодирует GAL3C, при этом кодирующая последовательность GAL3C соединена с кодирующей последовательностью SANT7 в указанной конструкции дополнительным элементом «рибосомального перепрыгивания» 2A.

77. Способ по п. 73, в котором указанная конструкция дополнительно кодирует SANT7, при этом кодирующая последовательность SANT7 соединена с кодирующей последовательностью ИЛ-12 в указанной конструкции дополнительной кодирующей последовательностью элемента «рибосомального перепрыгивания» 2A.

78. Способ по п. 73, в котором указанная конструкция дополнительно кодирует GAL3C, при этом кодирующая последовательность GAL3C соединена с кодирующей последовательностью ИЛ-12 в указанной конструкции дополнительной кодирующей последовательностью элемента «рибосомального перепрыгивания» 2A.

79. Способ по п. 78, в котором указанная конструкция дополнительно кодирует SANT7, при этом кодирующие последовательности каждого из ИЛ-12, SANT7, GAL3C и селективного маркера соединены элементом «рибосомального перепрыгивания» 2A.

80. Способ лечения KMA-экспрессирующего злокачественного новообразования у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение генетически модифицированных T-клеток, сконструированных с возможностью экспрессии одного или больше внутриклеточных сигнальных доменов и внеклеточных антигенсвязывающих доменов, причем указанный внеклеточный антигенсвязывающий домен специфически распознает каппа-антиген миеломы (KMA).

81. Способ по п. 80, в котором указанное KMA-экспрессирующее злокачественное новообразование представляет собой множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ) или амилоидоз.

82. Способ по п. 80, в котором указанный один или больше внутриклеточных сигнальных доменов содержит один или больше костимулирующих эндодоменов.

83. Способ по п. 82, в котором указанный один или больше костимулирующих эндодоменов представляет собой что-либо одно или больше из домена CD28, домена CD3ζ, домена 4-1BB или домена OX-40 или их комбинаций.

84. Способ по п. 83, в котором указанные костимулирующие эндодомены представляют собой домен CD3ζ и домен CD28.

85. Способ по п. 83, в котором указанные костимулирующие эндодомены представляют собой домен CD3ζ и домен OX-40.

86. Способ по п. 84, в котором указанный внутриклеточный сигнальный домен дополнительно содержит домен OX-40.

87. Способ по п. 83, в котором указанные костимулирующие эндодомены представляют собой домен CD3ζ и 41-BB домен.

88. Способ по п. 84, дополнительно содержащий 41-BB домен.

89. Способ по п. 80, в котором указанный внеклеточный связывающий домен содержит scFv, который специфически распознает KMA.

90. Способ по п. 89, в котором указанный scFv распознает KMA и содержит определяющие комплементарность участки (CDR), происходящие из моноклонального антитела KappaMab, при этом указанные участки CDR содержат последовательности SEQ ID NO: 3-8.

91. Способ по п. 89, в котором указанный scFv содержит VL-цепь и VH-цепь моноклонального антитела KappaMab, в котором указанная VL-цепь содержит SEQ ID NO: 2 и указанная VH-цепь содержит SEQ ID NO:1.

92. Способ по п. 91, в котором VL из SEQ ID NO: 2 и VL из SEQ ID NO: 1 присоединены глицин-сериновым линкером.

93. Способ по п. 92, в котором указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот.

94. Способ по п. 93, в котором указанный линкер из 15 аминокислот содержит (Gly₄Ser)₃.

95. Способ по п. 89, в котором указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным сигнальным доменам спейсером.

96. Способ по п. 95, в котором указанный спейсер представляет собой константную область иммуноглобулина или цепь CD8α.

97. Способ по п. 96, в котором указанная константная область иммуноглобулина содержит что-либо одно или больше из шарнирного домена IgG, CH2-домена IgG и CH3-домена IgG.

98. Способ по п. 97, в котором указанная константная область иммуноглобулина содержит шарнирный домен иммуноглобулина.

99. Способ по п. 98, в котором указанная константная область иммуноглобулина дополнительно содержит CH3-домен IgG.

100. Способ по п. 98 или 99, в котором указанная константная область иммуноглобулина дополнительно содержит CH2-домен IgG.

101. Химерный антигенный рецептор по любому из пп. 96-100, в котором указанный спейсер присоединен к scFV глицин-сериновым линкером.

102. Химерный антигенный рецептор по п. 101, в котором указанный глицин-сериновый линкер представляет собой линкер из 15-20 аминокислот.

103. Химерный антигенный рецептор по п. 102, в котором указанный линкер из 15 аминокислот содержит (Gly₄Ser)₃.

104. Способ по п. 80, в котором указанные генетически модифицированные T-клетки сконструированы с дополнительной возможностью экспрессии одной или больше дополнительных биологической молекулы.

105. Способ по п. 104, в котором указанная одна или больше дополнительных биологических молекул содержит что-либо одно или больше из ИЛ-12, GAL3C или SANT7.

106. Способ по п. 104, в котором указанная одна или больше дополнительных биологических молекул представляет собой ИЛ-12, и указанный ИЛ-12 экспрессируется в виде одноцепочечного полипептида, содержащего субъединицу p35 ИЛ-12 и субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером.

107. Способ по п. 106, в котором указанный гибкий линкер представляет собой (G₄S)₃-линкер.

108. Способ по п. 106, в котором указанный одноцепочечный полипептид, содержащий субъединицу p35 ИЛ-12 и субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером, образует биоактивный гетеродимер p70 ИЛ-12.

109. Способ по п. 105, в котором указанные CAR-T-клетки сконструированы с возможностью экспрессии ИЛ-12 и селективного маркера.

110. Способ по п. 104, в котором указанные CAR-T-клетки сконструированы с возможностью экспрессии SANT7 и селективного маркера.

111. Способ по п. 104, в котором указанные CAR-T-клетки сконструированы с возможностью экспрессии GAL3C и селективного маркера.

112. Способ по п. 104, в котором указанные CAR-T-клетки сконструированы с возможностью экспрессии SANT7, ИЛ-12 и селективного маркера.

113. Способ по п. 104, в котором указанные CAR-T-клетки сконструированы с возможностью экспрессии SANT7, GAL3C и селективного маркера.

114. Способ по п. 104, в котором указанные CAR-T-клетки сконструированы с возможностью экспрессии ИЛ-12, GAL3C и селективного маркера.

115. Способ по п. 104, в котором указанные CAR-T-клетки сконструированы с возможностью экспрессии ИЛ-12, GAL3C, SANT7 и селективного маркера.

116. Способ по п. 80, дополнительно включающий введение одного или больше дополнительных биологических или фармацевтических активных агентов.

117. Способ по п. 116, в котором указанный один или больше дополнительных биологически активных агентов содержит ИЛ-12, антагонист рецептора ИЛ-6 или SANT7.

118. Способ по п. 116, в котором указанные дополнительные фармацевтически активные агенты содержат один или больше химиотерапевтических агентов.

119. Способ по п. 116, в котором указанный дополнительный фармацевтически активный агент представляет собой иммуномодулирующее средство.

120. Способ по п. 119, в котором указанное иммуномодулирующее средство представляет собой талидомид или его аналог.

121. Способ по п. 120, в котором указанный аналог талидомида представляет собой актимид, леналидомид или помалидомид.

122. Способ по п. 116, в котором указанный дополнительный фармацевтический активный агент представляет собой ингибитор гистондеацетилазы.

123. Способ по п. 122, в котором указанный ингибитор гистондеацетилазы представляет собой панобиностат, вориностат, трихостатин A, депсипептиды, фенилбутират, вальпроевую кислоту, белиностат, LAQ824, энтиностат, CI944 или моцетиностат.

124. Способ по п. 116, в котором указанный один или больше дополнительных биологических или фармацевтических активных агентов вводят до, во время или после лечения генетически модифицированными T-клетками.

125. Способ по п. 80, в котором указанные генетически модифицированные T-клетки вводят внутривенно.

126. Способ по п. 80, в котором указанные генетически модифицированные T-клетки происходят от пациента.

127. Способ по п. 80, в котором указанные генетически модифицированные T-клетки не происходят от пациента.

128. Генетически модифицированная T-клетка по п. 26 или 27, сконструированная с дополнительной возможностью экспрессии ФРГ-связывающего белка.

129. Генетически модифицированная T-клетка по п. 128, отличающаяся тем, что указанный ФРГ-связывающий белок представляет собой антитело к ФРГ или его фрагмент.

130. Способ по п. 67 или 104, в котором указанная одна или больше дополнительных биологических молекул представляет собой ФРГ-связывающий белок.

131. Способ по п. 130, в котором указанный ФРГ-связывающий белок представляет собой антитело или его фрагмент.

132. Способ по п. 80, в котором указанные генетически модифицированные T-клетки вводят до, одновременно с или после трансплантата стволовых клеток.

133. Способ по п. 132, в котором указанный трансплантат стволовых клеток представляет собой аллогенный трансплантат стволовых клеток.

134. Способ по п. 132, в котором указанный трансплантат стволовых клеток представляет собой аллогенный трансплантат стволовых клеток.

[00161] Список литературы

[00162] 1. Rossig C, Pscherer S, Landmeier S, Altvater B, Jurgens H, Vormoor J. Adoptive cellular immunotherapy with CD19-specific T cells. Klin Padiatr. 2005; 217(6):351-6.

[00163] 2. Ramanayake S, Bilmon I, Bishop D, Dubosq MC, Blyth E, Clancy L, et al. Low-cost generation of Good Manufacturing Practice-grade CD19-specific chimeric antigen receptor-expressing T cells using piggyBac gene transfer and patient-derived materials. Cytotherapy. 2015.

[00164] 3. Hombach A, Hombach AA, Abken H. Adoptive immunotherapy with genetically engineered T cells: modification of the IgG1 Fc 'spacer' domain in the extracellular moiety of chimeric antigen receptors avoids 'off-target' activation and unintended initiation of an innate immune response. Gene Ther. 2010; 17(10):1206-13.

[00165] 4. Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, et al. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 2001; 276(9):6591-604.

[00166] 5. Armour KL, van de Winkel JG, Williamson LM, Clark MR. Differential binding to human FcgammaRIIa and FcgammaRIIb receptors by human IgG wildtype and mutant antibodies. Mol Immunol. 2003; 40(9):585-93.

[00167] 6. Hudecek M, Sommermeyer D, Kosasih PL, Silva-Benedict A, Liu L, Rader C, et al. The nonsignaling extracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity. Cancer immunology research. 2015; 3(2):125-35.

[00168] 7. Clemenceau B, Valsesia-Wittmann S, Jallas AC, Vivien R, Rousseau R, Marabelle A, et al. In Vitro and In Vivo Comparison of Lymphocytes Transduced with a Human CD16 or with a Chimeric Antigen Receptor Reveals Potential Off-Target Interactions due to the IgG2 CH2-CH3 CAR-Spacer. J Immunol Res. 2015; 2015:482089.

[00169] 8. Fiering S, Northrop JP, Nolan GP, Mattila PS, Crabtree GR, Herzenberg LA. Single cell assay of a transcription factor reveals a threshold in transcription activated by signals emanating from the T-cell antigen receptor. Genes Dev. 1990; 4(10):1823-34.

[00170] 9. Miller WL, Martial JA, Baxter JD. Molecular cloning of DNA complementary to bovine growth hormone mRNA. J Biol Chem. 1980; 255(16):7521-4.

[00171] 10. Miller WL, Thirion JP, Martial JA. Cloning of DNA complementary to bovine prolactin mRNA. Endocrinology. 1980; 107(3):851-3.

[00172] 11. Goodwin EC, Rottman FM. The 3'-flanking sequence of the bovine growth hormone gene contains novel elements required for efficient and accurate polyadenylation. J Biol Chem. 1992; 267(23):16330-4.

[00173] 12. Chung JH, Bell AC, Felsenfeld G. Characterization of the chicken beta-globin insulator. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94(2):575-80.

[00174] 13. Philip B, Thomas S, Marin V, Jathoul A, Kopec A, Linch DC, et al. A Highly Compact Epitope-Based Marker-Suicide Gene for More Convenient and Safer T-Cell Adoptive Immunotherapy. ASH Annual Meeting Abstracts. 2010; 116(21):1473-.

[00175] 14. Demartis A, Bernassola F, Savino R, Melino G, Ciliberto G. Interleukin 6 receptor superantagonists are potent inducers of human multiple myeloma cell death. Cancer Res. 1996; 56(18):4213-8.

[00176] 15. Savino R, Ciapponi L, Lahm A, Demartis A, Cabibbo A, Toniatti C, et al. Rational design of a receptor super-antagonist of human interleukin-6. EMBO J. 1994; 13(24):5863-70.

[00177] 16. Savino R, Lahm A, Salvati AL, Ciapponi L, Sporeno E, Altamura S, et al. Generation of interleukin-6 receptor antagonists by molecular-modeling guided mutagenesis of residues important for gp130 activation. EMBO J. 1994; 13(6):1357-67.

[00178] 17. Sporeno E, Savino R, Ciapponi L, Paonessa G, Cabibbo A, Lahm A, et al. Human interleukin-6 receptor super-antagonists with high potency and wide spectrum on multiple myeloma cells. Blood. 1996; 87(11):4510-9.

[00179] 18. Zhang L, Kerkar SP, Yu Z, Zheng Z, Yang S, Restifo NP, et al. Improving adoptive T cell therapy by targeting and controlling IL-12 expression to the tumor environment. Mol Ther. 2011; 19(4):751-9.

[00180] 19. Chinnasamy D, Yu Z, Kerkar SP, Zhang L, Morgan RA, Restifo NP, et al. Local delivery of interleukin-12 using T cells targeting VEGF receptor-2 eradicates multiple vascularized tumors in mice. Clin Cancer Res. 2012;18(6):1672-83.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> HaemoLogiX Pty. Ltd.

Micklethwaite, Kenneth

Dunn, Rosanne

Gottlieb, David

Logan, Grant

Harrison, Simon

<120> KAPPA MYELOMA ANTIGEN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND USES THEREOF

<130> HMLX-002/02WO 324961-2004

<150> US 62/151,968

<151> 2015-04-23

<150> US 62/158,407

<151> 2015-05-07

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody heavy chain

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ile Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Tyr His Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody light chain

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VH CDR

<400> 3

Asp Thr Tyr Met His

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VH CDR

<400> 4

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VH CDR

<400> 5

Gly Val Tyr His Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VL CDR

<400> 6

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VL CDR

<400> 7

Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VL CDR

<400> 8

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VH

<400> 9

gaggtgcagc tgcagcagtc aggggcggag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgtacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa cactaaatat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccactata atagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc taggggggtc 300

taccatgatt acgacgggga ctactggggc caagggacca cgctcaccgt ctcctcc 357

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VL

<400> 10

gacatcgtca tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg acatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa g 321

<210> 11

<211> 1200

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VH DNA in pHCMV-Gamm1-neo expression

vector

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (947)..(947)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (998)..(998)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1009)..(1009)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1027)..(1027)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1032)..(1032)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1036)..(1036)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1044)..(1044)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1065)..(1065)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1085)..(1085)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1095)..(1095)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1099)..(1100)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1105)..(1105)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1108)..(1108)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1111)..(1111)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1127)..(1127)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1134)..(1134)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1136)..(1136)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1157)..(1157)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1168)..(1168)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1172)..(1172)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1190)..(1190)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 11

caggacgatc ngcctccgca agcttatgaa tatgcaaatc ctctgaatct acatggtaaa 60

tataggtttg tctataccac aaacagaaaa acatgagatc acagttctct ctacagttac 120

tgagcacaca ggacctcacc atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag 180

ctacaggtaa ggggctcaca gtagcaggct tgaggtctgg acatatatat gggtgacaat 240

gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtgcactccg aggtgcagct gcagcagtca 300

ggggcggagc ttgtgaagcc aggggcctca gtcaagttgt cctgtacagc ttctggcttc 360

aacattaaag acacctatat gcactgggtg aagcagaggc ctgaacaggg cctggagtgg 420

attggaagga ttgatcctgc gaatggtaac actaaatatg acccgaagtt ccagggcaag 480

gccactataa tagcagacac atcctccaac acagcctacc tgcagctcag cagcctgaca 540

tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgct aggggggtct accatgatta cgacggggac 600

tactggggcc aagggaccac gctcaccgtc tcctccggtg agtggatccc aagctagctt 660

tctggggcag gccaggcctg accttggctt tggggcaggg agggggctaa ggtgaggcag 720

gtggcgccag ccaggtgcac acccaatgcc catgagccca gacactggac gctgaacctc 780

gcggacagtt aagaacccag gggcctctgc gccctgggcc cagctctgtc ccacaccgcg 840

gtcacatggc accacctctc ttgcagcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc 900

acccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgncct ggtcaaggac 960

tacttccccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcangc gccctgacna gcggggtgca 1020

caccttnccg gntgtnctac agtnctcagg actctactcc ctcancagcg tggtgaccgt 1080

gcccntcagc agctngggnn cccanacnta natttgcacg ggaatcnaag cccngnaacc 1140

caaggggaaa aaaaaanttg gtgaaagncc cnccagggag ggaggggttn tgctggaaac 1200

<210> 12

<211> 1121

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VL DNA in pHCMV-Gamm1-neo expression

vector

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (983)..(983)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1002)..(1003)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1014)..(1014)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1055)..(1055)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1057)..(1057)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1084)..(1084)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1092)..(1092)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1098)..(1098)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1110)..(1110)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1113)..(1113)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1119)..(1119)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1121)..(1121)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 12

ncagggcgat cngcctccgc aagcttatga atatgcaaat cctctgaatc tacatggtaa 60

atataggttt gtctatacca caaacagaaa aacatgagat cacagttctc tctacagtta 120

ctgagcacac aggacctcac catgggatgg agctgtatca tcctcttctt ggtagcaaca 180

gctacaggta aggggctcac agtagcaggc ttgaggtctg gacatatata tgggtgacaa 240

tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtgcactcc gacatcgtca tgacccagtc 300

tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc gtcacctgca aggccagtca 360

gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca gggcaatctc ctaaagcact 420

gatttactcg acatcctacc ggtacagtgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc 480

tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt 540

ctgtcagcaa tataacagct atccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa 600

gggtgagtgg atcctagaat tctaaactct gagggggtcg gatgacgtgg ccattctttg 660

cctaaagcat tgagtttact gcaaggtcag aaaagcatgc aaagccctca gaatggctgc 720

aaagagctcc aacaaaacaa tttagaactt tattaaggaa tagggggaag ctaggaagaa 780

actcaaaaca tcaagatttt aaatacgctt cttggtctcc ttgctataat tatctgggat 840

aagcatgctg ttttctgtct gtccctaaca tgccctgtga ttatccgcaa acaacacacc 900

caagggcaga actttgttac ttaaacacca tcctgtttgc ttctttcctc aggaactgtg 960

gctgcaccat ctgtcttcat ctncccgcca tctgatgagc anntgaaatc tggnaactgc 1020

ctctgttgtg tgcctgctga aaaacttcta tcccnanagg ccaaagtaca gtggaagggg 1080

aaanccccct cnatcggnaa ctcccggaan ggncccganc n 1121

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VH CDR

<400> 13

gacacctata tgcac 15

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VH CDR

<400> 14

aggattgatc ctgcgaatgg taacactaaa tatgacccga agttccaggg c 51

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VH CDR

<400> 15

ggggtctacc atgattacga cggggactac 30

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VL CDR

<400> 16

aaggccagtc agaatgtggg tactaatgta gcc 33

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VL CDR

<400> 17

tcgacatcct accggtacag t 21

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human monoclonal antibody VL CDR

<400> 18

cagcaatata acagctatcc gtacacg 27

<210> 19

<211> 530

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Flexi-IL12

<400> 19

Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu

1 5 10 15

Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val

20 25 30

Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu

35 40 45

Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln

50 55 60

Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys

65 70 75 80

Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val

85 90 95

Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp

100 105 110

Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe

115 120 125

Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp

130 135 140

Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser

165 170 175

Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu

180 185 190

Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile

195 200 205

Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr

210 215 220

Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn

225 230 235 240

Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp

245 250 255

Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr

260 265 270

Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg

275 280 285

Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala

290 295 300

Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser

305 310 315 320

Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

325 330 335

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp

340 345 350

Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala

355 360 365

Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro

370 375 380

Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr

385 390 395 400

Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser

405 410 415

Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu

420 425 430

Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile

435 440 445

Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala

450 455 460

Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met

465 470 475 480

Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu

485 490 495

Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Ala

500 505 510

Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn

515 520 525

Ala Ser

530

<210> 20

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IgG heavy chain leader component of KM.CAR-hCH2CH3-28z construct

<400> 20

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Ser Arg

20

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KappaMab variable light chain component of KM.CAR-hCH2CH3-28z

construct

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> KappaMab variable heavy chain component of KM.CAR-hCH2CH3-28z

construct

<400> 22

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ile Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Tyr His Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Tyr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> (G4S)3 flexible linker component of KM.CAR-hCH2CH3-28z construct

<400> 23

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 24

<211> 246

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hinge, CH2 and CH3 components of KM.CAR-hCH2CH3-28z construct

<400> 24

Tyr Val Thr Val Ser Ser Gln Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp

1 5 10 15

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

20 25 30

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

35 40 45

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

50 55 60

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

65 70 75 80

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

85 90 95

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

100 105 110

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

115 120 125

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

130 135 140

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

145 150 155 160

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

165 170 175

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

180 185 190

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

195 200 205

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

210 215 220

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

225 230 235 240

Gly Lys Lys Asp Pro Lys

245

<210> 25

<211> 68

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 26

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 27

<211> 688

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full length KM.CAR-hCH2CH3-28z amino acid construct

<400> 27

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met

20 25 30

Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln

35 40 45

Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser

50 55 60

Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr

100 105 110

Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

145 150 155 160

Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

165 170 175

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

180 185 190

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

195 200 205

Gly Lys Ala Thr Ile Ile Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu

210 215 220

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Arg Gly Val Tyr His Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Thr Leu Thr Val Ser Ser Tyr Val Thr Val Ser Ser Gln Asp Pro Ala

260 265 270

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

275 280 285

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

290 295 300

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

305 310 315 320

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

325 330 335

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

340 345 350

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

355 360 365

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

370 375 380

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

385 390 395 400

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

405 410 415

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

420 425 430

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

435 440 445

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

450 455 460

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

Страница 18

Attachment1

465 470 475 480

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

485 490 495

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu

500 505 510

Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val

515 520 525

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His

530 535 540

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

545 550 555 560

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

565 570 575

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

580 585 590

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

595 600 605

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

610 615 620

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

625 630 635 640

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

645 650 655

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

660 665 670

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680 685

<210> 28

<211> 2064

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full length KM.CAR-hCH2CH3-28z nucleic acid construct

<400> 28

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgctct 60

agagacatcg tcatgaccca gtctcaaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 120

agcgtcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtactaatg tagcctggta tcaacagaaa 180

ccagggcaat ctcctaaagc actgatttac tcgacatcct accggtacag tggagtccct 240

gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 300

tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatataaca gctatccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggaaat aaagggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgcagct gcagcagtca ggggcggagc ttgtgaagcc aggggcctca 480

gtcaagttgt cctgtacagc ttctggcttc aacattaaag acacctatat gcactgggtg 540

aagcagaggc ctgaacaggg cctggagtgg attggaagga ttgatcctgc gaatggtaac 600

actaaatatg acccgaagtt ccagggcaag gccactataa tagcagacac atcctccaac 660

acagcctacc tgcagctcag cagcctgaca tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgct 720

aggggggtct accatgatta cgacggggac tactggggcc aagggaccac gctcaccgtc 780

tcctcctacg tcaccgtctc ttcacaggat cccgccgagc ccaaatctcc tgacaaaact 840

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 900

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 960

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1020

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1080

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1260

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320

aatgggcaac cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1440

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1500

tctccgggta aaaaagatcc caaattttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 1560

tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 1620

aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 1680

cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc 1740

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1800

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1860

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1920

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1980

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 2040

cacatgcagg ccctgccccc tcgc 2064

<210> 29

<211> 1727

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full length KM.CAR-hCH3-28z nucleic acid construct

<400> 29

tggagtttgg gctgagctgg ctttttcttg tggctatttt aaaaggtgtc cagtgctcta 60

gagacatcgt catgacccag tctcaaaaat tcatgtccac atcagtagga gacagggtca 120

gcgtcacctg caaggccagt cagaatgtgg gtactaatgt agcctggtat caacagaaac 180

cagggcaatc tcctaaagca ctgatttact cgacatccta ccggtacagt ggagtccctg 240

atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc aatgtgcagt 300

ctgaagactt ggcagagtat ttctgtcagc aatataacag ctatccgtac acgttcggag 360

gggggaccaa gctggaaata aagggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcgggtggcg 420

gcggatctga ggtgcagctg cagcagtcag gggcggagct tgtgaagcca ggggcctcag 480

tcaagttgtc ctgtacagct tctggcttca acattaaaga cacctatatg cactgggtga 540

agcagaggcc tgaacagggc ctggagtgga ttggaaggat tgatcctgcg aatggtaaca 600

ctaaatatga cccgaagttc cagggcaagg ccactataat agcagacaca tcctccaaca 660

cagcctacct gcagctcagc agcctgacat ctgaggacac tgccgtctat tactgtgcta 720

ggggggtcta ccatgattac gacggggact actggggcca agggaccacg ctcaccgtct 780

cctccggtgg aggcgggtct gggggcggag gttcaggcgg gggtggttcc gagcccaaat 840

ctcctgacaa aactcacaca tgcccagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc 900

ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct 960

tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca 1020

agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg 1080

tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc 1140

tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaattt tgggtgctgg 1200

tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt 1260

tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc 1320

gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag 1380

cctatcgctc cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc 1440

agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca 1500

agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag 1560

gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga 1620

aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca 1680

ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1727

<210> 30

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full length KM.CAR-h-28z nucleic acid construct

<400> 30

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgctct 60

agagacatcg tcatgaccca gtctcaaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 120

agcgtcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtactaatg tagcctggta tcaacagaaa 180

ccagggcaat ctcctaaagc actgatttac tcgacatcct accggtacag tggagtccct 240

gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 300

tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatataaca gctatccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggaaat aaagggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgcagct gcagcagtca ggggcggagc ttgtgaagcc aggggcctca 480

gtcaagttgt cctgtacagc ttctggcttc aacattaaag acacctatat gcactgggtg 540

aagcagaggc ctgaacaggg cctggagtgg attggaagga ttgatcctgc gaatggtaac 600

actaaatatg acccgaagtt ccagggcaag gccactataa tagcagacac atcctccaac 660

acagcctacc tgcagctcag cagcctgaca tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgct 720

aggggggtct accatgatta cgacggggac tactggggcc aagggaccac gctcaccgtc 780

tcctccggtg gaggcgggtc tgggggcgga ggttcaggcg ggggtggttc cgagcccaaa 840

tctcctgaca aaactcacac atgcccattt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 900

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 960

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1020

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1080

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1140

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1200

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1260

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1320

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1380

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1407

<210> 31

<211> 1461

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full length KM.CAR-CD8a-28z nucleic acid construct

<400> 31

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgctct 60

agagacatcg tcatgaccca gtctcaaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 120

agcgtcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtactaatg tagcctggta tcaacagaaa 180

ccagggcaat ctcctaaagc actgatttac tcgacatcct accggtacag tggagtccct 240

gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 300

tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatataaca gctatccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggaaat aaagggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgcagct gcagcagtca ggggcggagc ttgtgaagcc aggggcctca 480

gtcaagttgt cctgtacagc ttctggcttc aacattaaag acacctatat gcactgggtg 540

aagcagaggc ctgaacaggg cctggagtgg attggaagga ttgatcctgc gaatggtaac 600

actaaatatg acccgaagtt ccagggcaag gccactataa tagcagacac atcctccaac 660

acagcctacc tgcagctcag cagcctgaca tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgct 720

aggggggtct accatgatta cgacggggac tactggggcc aagggaccac gctcaccgtc 780

tcctccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900

gggctggact tcgcctgtga tttttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 960

tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg 1020

ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 1080

taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc 1140

aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440

atgcaggccc tgccccctcg c 1461

<210> 32

<211> 1410

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full length KM.CAR-h-28TM-41BBz nucleic acid construct

<400> 32

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgctct 60

agagacatcg tcatgaccca gtctcaaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 120

agcgtcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtactaatg tagcctggta tcaacagaaa 180

ccagggcaat ctcctaaagc actgatttac tcgacatcct accggtacag tggagtccct 240

gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 300

tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatataaca gctatccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggaaat aaagggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgcagct gcagcagtca ggggcggagc ttgtgaagcc aggggcctca 480

gtcaagttgt cctgtacagc ttctggcttc aacattaaag acacctatat gcactgggtg 540

aagcagaggc ctgaacaggg cctggagtgg attggaagga ttgatcctgc gaatggtaac 600

actaaatatg acccgaagtt ccagggcaag gccactataa tagcagacac atcctccaac 660

acagcctacc tgcagctcag cagcctgaca tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgct 720

aggggggtct accatgatta cgacggggac tactggggcc aagggaccac gctcaccgtc 780

tcctccggtg gaggcgggtc tgggggcgga ggttcaggcg ggggtggttc cgagcccaaa 840

tctcctgaca aaactcacac atgcccattt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 900

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgaa acggggcaga 960

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1020

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1080

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1140

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1200

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1260

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1320

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1380

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1410

<210> 33

<211> 1464

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full length KM.CAR_8a_28TM_41BBz nucleic acid construct

<400> 33

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgctct 60

agagacatcg tcatgaccca gtctcaaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 120

agcgtcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtactaatg tagcctggta tcaacagaaa 180

ccagggcaat ctcctaaagc actgatttac tcgacatcct accggtacag tggagtccct 240

gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 300

tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatataaca gctatccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggaaat aaagggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgcagct gcagcagtca ggggcggagc ttgtgaagcc aggggcctca 480

gtcaagttgt cctgtacagc ttctggcttc aacattaaag acacctatat gcactgggtg 540

aagcagaggc ctgaacaggg cctggagtgg attggaagga ttgatcctgc gaatggtaac 600

actaaatatg acccgaagtt ccagggcaag gccactataa tagcagacac atcctccaac 660

acagcctacc tgcagctcag cagcctgaca tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgct 720

aggggggtct accatgatta cgacggggac tactggggcc aagggaccac gctcaccgtc 780

tcctccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900

gggctggact tcgcctgtga tttttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 960

tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaaacgggg cagaaagaaa 1020

ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1080

ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1140

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440

cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1464

<210> 34

<211> 2067

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full length KM.CAR_hCH2CH3mut_28TM_41BBz nucleic acid construct

<400> 34

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgctct 60

agagacatcg tcatgaccca gtctcaaaaa ttcatgtcca catcagtagg agacagggtc 120

agcgtcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtactaatg tagcctggta tcaacagaaa 180

ccagggcaat ctcctaaagc actgatttac tcgacatcct accggtacag tggagtccct 240

gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag caatgtgcag 300

tctgaagact tggcagagta tttctgtcag caatataaca gctatccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggaaat aaagggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgcagct gcagcagtca ggggcggagc ttgtgaagcc aggggcctca 480

gtcaagttgt cctgtacagc ttctggcttc aacattaaag acacctatat gcactgggtg 540

aagcagaggc ctgaacaggg cctggagtgg attggaagga ttgatcctgc gaatggtaac 600

actaaatatg acccgaagtt ccagggcaag gccactataa tagcagacac atcctccaac 660

acagcctacc tgcagctcag cagcctgaca tctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgct 720

aggggggtct accatgatta cgacggggac tactggggcc aagggaccac gctcaccgtc 780

tcctccggtg gaggcgggtc tgggggcgga ggttcaggcg ggggtggttc cgagcccaaa 840

tctcctgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctccagtcgc gggaccgtca 900

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tcgcccggac ccctgaggtc 960

acatgcgtgg tggtgaacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1020

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta cgccagcacg 1080

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1140

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1200

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1260

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1320

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1380

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1440

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1500

agcctctccc tgtctccggg taaattttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 1560

tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaaacg gggcagaaag 1620

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1680

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1740

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1800

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1860

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1920

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1980

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 2040

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 2067

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 30

<210> 36

<211> 114

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 36

acattttgac acccccataa tatttttcca gaattaacag tataaattgc atctcttgtt 60

caagagttcc ctatcactct ctttaatcac tactcacagt aacctcaact cctg 114

<210> 37

<211> 1233

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Constructed nucleic acid sequence of transposon gene expression

cassette

<400> 37

ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt caattaggag gaaaaactgt ttcatacaga 60

aggcgtcaat taggaggaaa aactgtttca tacagaaggc gtcaattgtc ccatcgaatt 120

aggaggaaaa actgtttcat acagaaggcg tcaattagga ggaaaaactg tttcatacag 180

aaggcgtcaa ttaggaggaa aaactgtttc atacagaagg cgtcaattgt cccgggacat 240

tttgacaccc ccataatatt tttccagaat taacagtata aattgcatct cttgttcaag 300

agttccctat cactctcttt aatcactact cacagtaacc tcaactcctg aactccatgg 360

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 420

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 480

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 540

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 600

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 660

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 720

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 780

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 840

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 900

gaccactacc agcagaacac ccccatcgga tccggagcca cgaacttctc tctgttaaag 960

caagcaggag acgttgaaga aaaccccggt cctatttaaa tcctcgactg tgccttctag 1020

ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 1080

tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 1140

ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 1200

caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggc 1233

<210> 38

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mutated SANT-7 amino acid sequence

<400> 38

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro

20 25 30

Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr

35 40 45

Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Asp Ile Leu Asp Phe Ile

50 55 60

Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser

65 70 75 80

Ser Lys Glu Ala Asp Ala Phe Trp Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala

85 90 95

Glu Lys Asp Gly Cys Phe Tyr Lys Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu

100 105 110

Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr

115 120 125

Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln

130 135 140

Met Arg Thr Lys Asp Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn

145 150 155 160

Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu

165 170 175

Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His

180 185 190

Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Ile Arg Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Leu Arg Ala Met His His His His His His

210 215

<210> 39

<211> 655

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mutated SANT-7 nucleic acid sequence

<400> 39

atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg gctgctcctg 60

gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagta cccccaggag aagattccaa agatgtagcc 120

gccccacaca gacagccact cacgagctca gaacgaattg acaaacaaat tcgggacatc 180

ctcgacttta tctcagcctt aagaaaggag acatgtaaca agagtaacat gtgtgagagc 240

tccaaagagg cagacgcatt ctggaacctg aaccttccaa agatggctga aaaagatgga 300

tgcttctaca aaggattcaa tgaggagact tgcctggtga aaatcatcac tggtcttctc 360

gagtttgagg tatacctaga gtacctccag aacagatttg agagtagtga ggaacaagcc 420

agagctgtgc agatgcgcac aaaagacctg atccagttcc tgcagaaaaa ggcaaagaat 480

ctagatgcaa taaccacccc tgacccaacc acaaatgcca gcctgctgac gaagctgcag 540

gcacagaacc agtggctgca ggacatgaca actcatctca ttctgagatc ttttaaggag 600

ttcctgatcc gtagcctgag ggctcttcgg gctatgcatc atcaccatca ccact 655

<210> 40

<211> 540

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Flexi-IL-12 amino acid construct

<400> 40

Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu

1 5 10 15

Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val

20 25 30

Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu

35 40 45

Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln

50 55 60

Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys

65 70 75 80

Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val

85 90 95

Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp

100 105 110

Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe

115 120 125

Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp

130 135 140

Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser

165 170 175

Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu

180 185 190

Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile

195 200 205

Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr

210 215 220

Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn

225 230 235 240

Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp

245 250 255

Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr

260 265 270

Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg

275 280 285

Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala

290 295 300

Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser

305 310 315 320

Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

325 330 335

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp

340 345 350

Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala

355 360 365

Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro

370 375 380

Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr

385 390 395 400

Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser

405 410 415

Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu

420 425 430

Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile

435 440 445

Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala

450 455 460

Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met

465 470 475 480

Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu

485 490 495

Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr

500 505 510

Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val

515 520 525

Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser

530 535 540

<210> 41

<211> 1620

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Flexi-IL-12 nucleic acid construct

<400> 41

atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60

gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120

gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180

accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240

gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300

ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360

aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420

acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480

ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540

agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600

gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660

gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720

ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780

acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840

agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900

cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960

gaatgggcat ctgtgccctg cagtggtggc ggtggaagcg gcggtggcgg aagcggcggt 1020

ggcggcagca gaaacctccc cgtggccact ccagacccag gaatgttccc atgccttcac 1080

cactcccaaa acctgctgag ggccgtcagc aacatgctcc agaaggccag acaaactcta 1140

gaattttacc cttgcacttc tgaagagatt gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc 1200

agcacagtgg aggcctgttt accattggaa ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc 1260

agagagacct ctttcataac taatgggagt tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg 1320

atggccctgt gccttagtag tatttatgaa gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag 1380

accatgaatg caaagcttct gatggatcct aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg 1440

ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa 1500

aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt 1560

catgctttca gaattcgggc agtgactatt gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc 1620

<210> 42

<211> 170

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAL 3C amino acid construct

<400> 42

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Ser Arg His His His His His His Gly Ala Pro Ala Gly

20 25 30

Pro Leu Ile Val Pro Tyr Asn Leu Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro

35 40 45

Arg Met Leu Ile Thr Ile Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg

50 55 60

Ile Ala Leu Asp Phe Gln Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn

65 70 75 80

Pro Arg Phe Asn Glu Asn Asn Arg Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys

85 90 95

Leu Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe

100 105 110

Glu Ser Gly Lys Pro Phe Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His

115 120 125

Phe Lys Val Ala Val Asn Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg

130 135 140

Val Lys Lys Leu Asn Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile

145 150 155 160

Asp Leu Thr Ser Ala Ser Tyr Thr Met Ile

165 170

<210> 43

<211> 510

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAL 3C nucleic acid construct

<400> 43

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgctct 60

agacatcatc accatcacca cggcgcccct gctgggccac tgattgtgcc ttataacctg 120

cctttgcctg ggggagtggt gcctcgcatg ctgataacaa ttctgggcac ggtgaagccc 180

aatgcaaaca gaattgcttt agatttccaa agagggaatg atgttgcctt ccactttaac 240

ccacgcttca atgagaacaa caggagagtc attgtttgca atacaaagct ggataataac 300

tggggaaggg aagaaagaca gtcggttttc ccatttgaaa gtgggaaacc attcaaaata 360

caagtactgg ttgaacctga ccacttcaag gttgcagtga atgatgctca cttgttgcag 420

tacaatcatc gggttaaaaa actcaatgaa atcagcaaac tgggaatttc tggtgacata 480

gacctcacca gtgcttcata taccatgata 510

<---

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены химерный антигенный рецептор к каппа-антигену миеломы (КМА), генетически модифицированная Т-клетка, способ получения генетически модифицированной Т-клетки, применение генетически модифицированной Т-клетки. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии КМА-экспрессирующих злокачественных новообразований. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 23 ил., 5 пр.

1. Химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий один или больше внутриклеточных сигнальных доменов и внеклеточный антигенсвязывающий домен, при этом указанный внеклеточный антигенсвязывающий домен специфически связывается с каппа-антигеном миеломы (KMA) и не связывается с легкой цепью каппа иммуноглобулина, связанной с тяжелой цепью иммуноглобулина, при этом внеклеточный антигенсвязывающий домен содержит определяющие комплементарность участки (CDR), которые содержат последовательности SEQ ID NO: 3–8.

2. Химерный антигенный рецептор по п. 1, в котором указанный один или больше внутриклеточных сигнальных доменов содержит один или больше костимулирующих эндодоменов, при этом указанный один или больше костимулирующих эндодоменов представляет собой что-либо одно или больше из домена CD28, домена CD3ζ, домена 4-1BB, домена OX-40 или их комбинаций.

3. Химерный антигенный рецептор по п. 1 или 2, в котором указанный внеклеточный связывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который специфически связывается с KMA и не связывается с легкой цепью каппа иммуноглобулина, связанной с тяжелой цепью иммуноглобулина.

4. Химерный антигенный рецептор по п. 3, в котором указанный scFv содержит VL-цепь и VH-цепь KappaMab, при этом VL-цепь содержит SEQ ID NO: 2, а VH-цепь содержит SEQ ID NO: 1.

5. Химерный антигенный рецептор по п. 4, в котором указанные VL-цепь и VH-цепь KappaMab соединены глицин-сериновым линкером, при этом указанный глицин-сериновый линкер содержит (Gly₄Ser)₃.

6. Химерный антигенный рецептор по любому из пп. 3-5, в котором указанный scFv присоединен к одному или больше внутриклеточным сигнальным доменам спейсером, в котором указанный спейсер представляет собой константную область иммуноглобулина или цепь CD8α.

7. Химерный антигенный рецептор по п. 6, в котором указанная константная область иммуноглобулина содержит что-либо одно или больше из шарнирного домена IgG, CH2-домена IgG и CH3-домена IgG.

8. Химерный антигенный рецептор по п. 6 или 7, в котором указанная константная область иммуноглобулина содержит комбинацию из шарнирного домена иммуноглобулина, CH2-домена IgG и CH3-домена IgG с последовательностью SEQ ID NO: 24.

9. Химерный антигенный рецептор по любому из пп. 6-8, в котором указанный спейсер присоединен к scFV глицин-сериновым линкером, в котором указанный глицин-сериновый линкер содержит (Gly₄Ser)₃.

10. Генетически модифицированная T-клетка, экспрессирующая химерный антигенный рецептор по любому из пп. 1-9, при этом Т-клетка уничтожает клетки KMA-экспрессирующего злокачественного новообразования.

11. Генетически модифицированная T-клетка по п. 10, которая дополнительно экспрессирует одну или больше дополнительных биологических молекул, причем указанная одна или больше дополнительных биологических молекул содержит что-либо одно или больше из ИЛ-12, галектина-3С (GAL3C), SANT7 или связывающего фактор роста гепатоцитов (ФРГ) белка.

12. Генетически модифицированная T-клетка по п. 11, при этом указанная одна или больше дополнительных биологических молекул представляет собой ИЛ-12, и указанный ИЛ-12 экспрессируется одноцепочечным полипептидом, содержащим одну субъединицу p35 ИЛ-12 и одну субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером, при этом указанный гибкий линкер представляет собой линкер (G₄S)₃.

13. Генетически модифицированная T-клетка по п. 12, при этом указанный одноцепочечный полипептид, содержащий одну субъединицу p35 ИЛ-12 и одну субъединицу p40 ИЛ-12, соединенные гибким линкером, образует биоактивный гетеродимер p70 ИЛ-12.

14. Генетически модифицированная T-клетка по п. 11, которая дополнительно экспрессирует одну или больше дополнительных биологических молекул и селектируемый маркер.

15. Способ получения генетически модифицированной T-клетки по любому из пп. 10-14, при этом способ включает введение в T-клетку экспрессионного вектора, кодирующего CAR, содержащий один или больше внутриклеточных сигнальных доменов и внеклеточных антигенсвязывающих доменов, при этом указанный внеклеточный антигенсвязывающий домен специфически связывается с каппа-антигеном миеломы (KMA) и не связывается с легкой цепью каппа иммуноглобулина, связанной с тяжелой цепью иммуноглобулина.

16. Способ по п. 15, в котором указанный экспрессионный вектор представляет собой экспрессионную систему на основе транспозируемого вектора.

17. Применение генетически модифицированных T-клеток по любому из пп. 10-14 в производстве лекарственного препарата для лечения KMA-экспрессирующего злокачественного новообразования у субъекта.

18. Применение по п. 17, в котором лекарственный препарат содержит один или больше фармацевтически активных агентов, при этом один или больше фармацевтически активных агентов содержат один или больше химиотерапевтических агентов, иммуномодулирующих лекарственных средств или ингибиторов гистондеацетилазы.

19. Применение по п. 17 или 18, в котором указанное KMA-экспрессирующее злокачественное новообразование представляет собой множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ) или амилоидоз.

20. Применение по любому из пп. 17-19, в котором генетически модифицированные Т-клетки получены из организма субъекта.