СПОСОБ СНИЖЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДНК В ФЕРМЕНТАЦИОННОМ БУЛЬОНЕ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/08 C12N1/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу получения белкового продукта из ферментационного бульона, причем ферментационный бульон подвергается чрезвычайно эффективному процессу удаления ДНК клетки-хозяина.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Получение белковых продуктов путем ферментации - это хорошо известный процесс, который применяется для получения различных нужных белков в промышленном масштабе. В ходе ферментации некоторые из клеток-хозяев, продуцирующих нужный белковый продукт, разрушаются, и содержимое клеток, включая ДНК, попадает в ферментационный бульон. Кроме того, в некоторых процессах ферментации нужный белок продуцируется в виде внутриклеточного продукта. Это означает, что такие клетки необходимо лизировать как часть процесса очистки после ферментации, и это неизбежно приводит к высвобождению значительных количеств ДНК в ферментационный бульон.

В случае некоторых типов белковых продуктов требуется избегать присутствия остаточной ДНК из клеток-хозяев, продуцирующих нужный белок, например, из-за проблем с экологией и здоровьем. Кроме того, ДНК в ферментационном бульоне может повышать вязкость, приводя к большим затратам энергии при перемешивании и/или обращении с бульоном.

Следовательно, существует потребность в способе удаления или снижения содержания ДНК в ферментационном бульоне.

Однако удалить все количество остаточной ДНК клеток-хозяев из ферментационного бульона очень трудно, поэтому в этой области техники необходимо развивать технологии для преодоления проблемы с ДНК.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно было обнаружено, что осуществление теплового воздействия на ферментационный бульон является очень эффективным способом удаления ДНК, поэтому настоящим изобретением заявляется:

Способ удаления ДНК из ферментационного бульона, содержащего нужный белок и микроорганизм, продуцирующий нужный белок, причем указанный способ включает:

a) нагревание ферментационного бульона до температуры не ниже 70°C.

Способ предпочтительно включает стадии:

b) введения в ферментационный бульон полихлорида алюминия, и

c) отделения выпавших хлопьями микроорганизмов от ферментационного бульона.

Способы согласно настоящему изобретению будут снижать уровень содержания ДНК в ферментационном бульоне до уровня ниже 1 мкг/мл или даже ниже. В предпочтительном варианте осуществления уровень содержания ДНК снижен до уровня ниже предела обнаружения.

Краткое описание фигур

Фигура 1: Электрофорез в агарозном геле ПЦР-амплифицированной геномной ДНК штамма B. Licheniformis, продуцирующий вариант амилазы в полупромышленном масштабе. Бульон подвергали тепловой обработке и флокуляции до выделения фермента. Только необработанный бульон имел положительный сигнал ДНК, определяемый по полосе на геле (стрелка). Отрицательный контроль подтверждает, что ложные положительные результаты не наблюдаются.

Фигура 2: Электрофорез в агарозном геле ПЦР-амплифицированной геномной ДНК штамма B. subtilis, продуцирующий аспарагиназу в полупромышленном масштабе. Бульон подвергали тепловой обработке и флокуляции до выделения фермента. Только необработанный бульон имел положительный сигнал ДНК, определяемый по полосе на геле (стрелка). Отрицательный контроль подтверждает, что ложные положительные результаты не наблюдаются.

Фигура 3: Электрофорез в агарозном геле ПЦР-амплифицированной геномной ДНК штамма B. subtilis, производящий аспарагиназу в полупромышленном масштабе. Бульон подвергали тепловой обработке и флокуляции до выделения фермента. Необработанный бульон и надосадочная жидкость прошедшего тепловую обработку бульона дают положительный сигнал ДНК, определяемый по полосе на геле (стрелки); все другие технологические потоки дают отрицательный сигнал. Отрицательный контроль подтверждает, что ложные положительные результаты не наблюдаются.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к простому и очень эффективному способу удаления остаточного ДНК клеток-хозяев из ферментационного бульона. В пределах объема настоящего изобретения ДНК клетки-хозяина определена как включающая геномную ДНК из штамма-продуцента и фрагмент ДНК, кодирующий нужный белок.

Микроорганизмы, способные продуцировать нужный белок

Микробная клетка-хозяин может принадлежать к любому из родов. Нужный белок может быть гомологичным или гетерологичным по отношению к клетке-хозяину, способной продуцировать нужный белок.

Термин "гомологичный белок" означает белок, кодируемый геном, который происходит из клетки-хозяина, в которой он продуцируется.

Термин "гетерологичный белок" означает белок, кодируемый геном, который является чужеродным для клетки-хозяина, в которой он продуцируется.

Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" в данном контексте означает клетку-хозяина, которая содержит в себе ген(ы), кодирующий(ие) требуемый белок, и способна экспрессировать указанный ген(ы), чтобы продуцировать требуемый белок. Кодирующий(ие) требуемый белок ген(ы) можно трансформировать, трансфицировать, трансдуцировать и т.д. в рекомбинантную клетку-хозяина, используя хорошо известные в области техники методики.

Когда требуемый белок является гетерологичным белком, рекомбинантная клетка-хозяин, способная продуцировать требуемый белок, предпочтительно имеет грибковую или бактериальную природу. Выбор рекомбинантной клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от гена, кодирующего требуемый белок, и источника указанного белка.

Термин "клетка-хозяин дикого типа" в данном контексте относится к клетке-хозяину, которой присущ(и) ген(ы), кодирующий(ие) требуемый белок, и которая способна экспрессировать указанный(ые) ген(ы).

"Ее мутант" может представлять собой клетку-хозяина дикого типа, в которой один или несколько генов были удалены, например, для обогащения препарата требуемым белком.

В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная микробная клетка-хозяин дикого типа представляет собой бактерию или гриб.

Микробная клетка-хозяин может быть дрожжевой клеткой, такой как штамм Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia. В другом аспекте штамм представляет собой штамм Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis.

Микробная клетка-хозяин может представлять собой штамм нитчатого гриба, такой как Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella или Xylaria.

В другом аспекте штамм представляет собой Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

В одном аспекте грибковая клетка-хозяин представляет собой штамм, выбранный из группы, состоящей из Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium и Trichoderma.

В более предпочтительном варианте осуществления нитчатую грибковую клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из Trichoderma и Aspergillus клеток-хозяев, в частности, из штамма Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viridel, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae, особенно штамма Trichoderma reesei.

В другом предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная микробная клетка-хозяин дикого типа представляет собой бактерию. Примеры микробных клеток-хозяев включают те, которые выбраны из группы, состоящей из грамположительных бактерий, таких как Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus или Streptomyces, или грамотрицательных бактерий, таких как Campylobacter, Escherichia, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella или Ureaplasma.

В одном аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis.

В другом аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis или Streptococcus equi подвида Zooepidemicus.

В другом аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой штамм Streptomyces murinus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus или Streptomyces lividans. В другом аспекте бактериальная клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli.

В другом аспекте бактериальную клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из Bacillus, Streptomyces, Escherichia, Buttiauxella и Pseudomonas.

Штаммы этих видов являются легкодоступными неограниченному кругу лиц в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection) (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Коллекция патентованных культур Службы сельскохозяйственных исследований (Agricultural Research Service Patent Culture Collection), Северный региональный исследовательский центр (Northern Regional Research Center) (NRRL).

Нужный белок

Согласно настоящему изобретению нужный белок может быть пептидом или полипептидом. Предпочтительный пептид согласно данному изобретению содержит от 5 до 100 аминокислот; предпочтительно - от 10 до 80 аминокислот; более предпочтительно - от 15 до 60 аминокислот. Предпочтительный пептид, предназначенный к выделению согласно данному изобретению, представляет собой противомикробный пептид, липопептид или другой функциональный пептид, такой как браззеин.

Предпочтительным полипептидом может быть любой белок, который может продуцироваться микроорганизмом. В предпочтительном варианте осуществления нужный белок представляет собой фермент. В предпочтительном варианте осуществления к гидролазе (класс EC 3 согласно Номенклатуре ферментов; Рекомендации Номенклатурного комитета Международного биохимического союза) применяется способ. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты.

В особенно предпочтительном варианте осуществления фермент выбирают из группы, состоящей из амилазы, протеазы, липазы, целлюлазы, ксиланазы, маннаназы, фитазы, изомеразы ксилозы, лактазы, ацетолактата декарбоксилазы, пектиназы, кутиназы, лиазы, арабиназы, галактаназы, оксидазы, лакказы пероксидазы, и аспарагиназа предпочтительна.

В другом предпочтительном варианте осуществления нужный белок представляет собой белок, имеющий высокую стабильность по отношению к тепловой инактивации, и который вследствие этого может подвергаться тепловой обработке данного изобретения без неприемлемо высоких потерь функционального белка. Так, в особенно предпочтительном варианте осуществления нужный белок представляет собой теплоустойчивый фермент. Теплоустойчивый фермент может иметь теплоустойчивость, измеренную как время полужизни при 70°C и pH 7,0, не менее 30 минут, предпочтительно не менее 40 минут, предпочтительно не менее 50 минут, предпочтительно не менее 60 минут, предпочтительно не менее 70 минут, предпочтительно не менее 80 минут, предпочтительно не менее 90 минут и особенно предпочтительно не менее 100 минут. Примеры теплоустойчивых ферментов, для которых пригоден способ данного изобретения, включают теплоустойчивую аспарагиназу, раскрытую в публикациях WO 2008/110513, WO 2014/027062 и WO2008/151807.

Амилазы. Амилаза может быть нужным ферментом, полученным согласно данному изобретению. Амилазы включают альфа-амилазы, бета-амилазы, пуллуланазы и мальтогенные амилазы.

Альфа-амилаза может быть получена из рода Bacillus, например, получена из штамма B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis и B. stearothermophilus. Другие альфа-амилазы включают в себя альфа-амилазу, полученную из штамма Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 или DSM 9375, все из которых подробно описаны в WO 95/26397, или альфа-амилазу, описанную в публикации Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31.

Другие альфа-амилазы включают в себя альфа-амилазу, полученную из нитчатого гриба, предпочтительно представляющего собой штамм Aspergillus, такой как Aspergillus oryzae и Aspergillus niger.

В предпочтительном варианте осуществления требуемый фермент представляет собой альфа-амилазу, полученную из Aspergillus oryzae, как та, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10 в WO 96/23874.

Требуемый фермент может также представлять собой альфа-амилазу, полученную из A. Niger, особенно ту, которая раскрыта под названием "AMYA_ASPNG" в базе данных Swiss-prot/TeEMBL под основным инвентарным номером P56271.

Требуемый фермент может также быть бета-амилазой, такой как любая растительная и микробная бета-амилаза, раскрытая в W.M. Fogarty and C.T. Kelly, Progress in Industrial Microbiology, vol. 15, pp. 112-115, 1979.

Требуемый фермент также может представлять собой мальтогенную амилазу. "Мальтогенная амилаза" (глюкан 1,4-альфа-мальтогидролаза, E.C. 3.2.1.133) способна гидролизовать амилозу и амилопектин до мальтозы в альфа-конфигурации. Нужную мальтогенную амилазу получают из Bacillus stearothermophilus штамма NCIB 11837. Мальтогенные альфа-амилазы описаны в патентах США №№ 4598048, 4604355 и 6162628.

В продаже находятся амилазы Duramyl^TM, Termamyl SC^TM, Termamyl Ultra^TM, Stainzyme^TM, Natalase^TM, Novamyl^TM and BAN^TM (Novozymes A/S), Rapidase^TM и Purastar^TM (от компании DuPont).

Требуемый фермент также может представлять собой пуллуланазу, включая глюкоамилазу (EC 3.2.1.41), которая действует на невосстанавливающие концы пуллулана с образованием глюкозы, также называемую a-декстрин 6-глюканогидролазой, или истинной пуллуланазой, или предельной декстриназой, пуллуланазу, которая действует на a-(1,6)-глюкозидную связь в пуллулане с образованием мальтотриозы, изопуллуланазу, которая гидролизует a-(1,4)-связь с образованием изопанозы, и неопуллуланазу, которая действует на a-(1,4)-связь с образованием панозы.

Протеазы: Подходящие протеазы включают таковые животного, растительного или микробного происхождения. Микробное происхождение является предпочтительным. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Протеаза может представлять собой сериновую протеазу или металлопротеазу, предпочтительно щелочную микробную протеазу или трипсин-подобную протеазу. Примерами щелочных фосфатаз являются субтилизины, особенно таковые, полученные из Bacillus, например, субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168 (описанные в WO 89/06279). Примерами трипсин-подобных протеаз являются трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеаза Fusarium, описанная в WO 89/06270 и WO 94/25583.

Другими пригодными протеазами являются протеазы Nocardiopsis, описанные, например, в WO 2005/115445, полезные для замены панкреатических ферментов.

Подходящие коммерчески доступные ферменты-протеазы включают продаваемые под торговыми названиями Alcalase®, Duralase^Tm, Durazym^Tm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® и Esperase® (Novozymes A/S), продаваемые под торговым названием Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Preferenz^Tm, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, Effectenz^Tm, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Opticlean®, Optimase® и Excellenz P1000 (DuPont), Axapem^TM (Gist-Brocases N.V.), BLAP (последовательность, представленная на фигуре 29 в US5352604) и их варианты (Henkel AG) и KAP (субтилизин Bacillus alkalophilus) от Kao.

Липазы или кутиназы: Липазы - это ферменты, которые катализируют гидролиз или образование липидов. Липазы включают ферменты, определяемые в EC 3.1.1.3. Подходящие липазы и кутиназы включают таковые бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные с применением белковой инженерии мутантные ферменты. Примеры включают липазу из Thermomyces, например, из T. lanuginosus (ранее называемый Humicola lanuginosa), которая описана в EP 258068 и EP 305216, кутиназу из Humicola, например, H. insolens (WO96/13580), липазу из штаммов Pseudomonas (некоторые из них сейчас переименованы в Burkholderia), например, P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP 331376), P. sp. штамм SD705 (WO 95/06720 и WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), липазы GDSL-типа Streptomyces (WO 10/065455), Streptomyces griseus (WO11/150157) и S. pristinaespiralis (WO12/137147), кутиназу из Magnaporthe grisea (WO 10/107560), кутиназу из Pseudomonas mendocina (US5389536) и липазу из Thermobifida fusca (WO11/084412). Другими полезными липазами могут быть липаза Bacillus, например, из B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992, WO11/084599), липаза Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417) или B. pumilus (WO 91/16422).

Другими примерами являются варианты липаз, такие как описанные в EP 407225, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 07/87508 и WO 09/109500.

Предпочтительные коммерческие продукты на основе липаз включают Lipolase^TM, Lipex™; Lipolex^TM и Lipoclean^TM (Novozymes A/S), Lumafast (первоначально от Genencor) и Lipomax (первоначально от Gist-Brocades).

Другими примерами являются липазы, иногда называемые ацилтрансферазами или пергидролазами, например, ацилтрансферазы с гомологией липазы А Candida antarctica (WO10/111143), ацилтрансферазы из Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), пергидролазы из семейства CE 7 (WO09/67279) и варианты пергидролазы M. smegmatis.

Другими пригодными липазами являются липазы Nocardiopsis, описанные, например, в WO 2006/136159, полезные для замены панкреатических ферментов.

Целлюлазы: Целлюлазы включают ферменты, которые действуют непосредственно на целлюлозу, и вспомогательные ферменты, которые облегчают прямое действие других ферментов на целлюлозу. Пригодные целлюлазы выключают целлюлазы, имеющие бактериальное или грибковое происхождение, такие как экзоглюканазы или экзоцеллобиогидролазы, и/или ендоглюканазы и/или бета-глюкозидазы. Эти различные типы ферментов целлюлозы действуют синергичным образом, преобразовывая целлюлозу и ее производные до глюкозы. Целлюлазные ферменты также включают вспомогательные ферменты, включая элементы типа GH61, такие как EG4, сволленин, Loosenin, CIP1 и т.п. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы из рода Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, например, грибковые целлюлазы, полученные из Humicola insolens, Myceliophthora thermophila и Fusarium oxysporum, раскрытые в US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 и WO 89/09259.

Особенно подходящими целлюлазами являются щелочные или нейтральные целлюлазы, обладающие положительными эффектами сохранения цвета. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Другими примерами являются такие варианты целлюлаз, как описанные в WO 94/07998, EP 0531315, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471, WO 98/12307 и PCT/DK98/00299.

Поступающие в продажу целлюлазы включают Celluzyme™, Carezyme™ и Celluclean™ (Novozymes A/S), Clazinase™ и Puradax HA™ (DuPont), и KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

Ксиланазы: Ксиланазы включают 1,4-(бета)-D-ксилан-ксиланогидролазу, (EC 3.2.1.8), 4-ксиланогидролазу, эндо-1,4-ксиланазу, эндо-1,4-бета-ксиланазу, бета-1,4-ксиланазу, эндо-1,4-бета-D-ксиланазу, 1,4-бета-ксилан-ксиланогидролазу, бета-ксиланазу, бета-1,4-ксилан-ксиланогидролазу, бета-D-ксиланазу, которые разлагают линейный полисахарид бета-1,4-ксилан до ксилозы, таким образом, разрушая гимицеллюлозу - один из основных компонентов стенок растительной клетки. Примером поступающей в продажу ксиланазы является Econase^TM (AB Vista).

Аспарагиназы: Аспарагиназу также называют L-аспарагиназой и L-аспарагинамидогидролазой. (ЕС 3.5.1.1) представляет собой фермент, который катализирует гидролитическое расщепление аспарагина с образованием аспарагиновой кислоты

Acrylaway™ (Novozyme A/S) - это пример поступающей в продажу аспарагиназы.

Маннаназы: Маннаназы (EC 3.2.1.25) включают ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление концевой, невосстанавливающей бета-D-маннозы в бета-D-маннозидах, также называемых маннанами.

Примером коммерческих маннаназ является Mannaway™ (Novozymes A/S).

Фитазы: В данном контексте фитаза представляет собой фермент, который катализирует гидролитическое расщепление фитазы (мио-инозитолгексакисфосфат) до (1) мио-инозитол и/или (2) в ее моно-, ди-, три-, тетра- и/или пента-фосфаты и (3) неорганические фосфаты.

Фитазы включают 3-фитазу (мио-инозитолгексафосфат 3-фосфогидролазу, EC 3.1.3.8) и 6-фитазу (мио-инозитолгексафосфат 6-фосфогидролазу, EC 3.1.3.26).

Примеры поступающих в продажу фитаз включают Ronozyme^TM (DSM Nutritional Products), Natuphos^TM (BASF), Finase^TM (AB Vista), Quantum^TM XT и Blue (AB Vista), продукты ряда Phyzyme^TM (DuPont) и продукты ряда Axtra^TM PHY (DuPont). Другие предпочтительные фитазы включают описанные в WO 98/28408, WO 00/43503 и WO 03/066847.

Лиазы: Лиаза может представлять собой пектатлиазу бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически или генетически модифицированные мутанты. В предпочтительном варианте осуществления пектатлиазу получают из Bacillus, особенно из Bacillus substilis, B. licherniformis или B. agaradhaerens, или вариант полученного из любого из них, как описано, например, в US 6124127, WO 1999/027083, WO 1999/027084, WO 2002/006442, WO 2002/092741, WO 2003/095638. Поступающие в продажу пектатлиазы включают XPect; Pectawash^TM и Pectaway^TM (Novozymes A/S).

Ацетолактат декарбоксилазы (EC 4.1.1.5) принадлежит к группе ферментов, называемых лиазами, в частности, карбоксилиазам, которые расщепляют связи углерод-углерод. Поступающий в продажу фермент Maturex™ (Novozymes A/S) широко используется в пивоваренной промышленности.

Изомеразы ксилозы: Поступающей в продажу изомеразой ксилозы является, например, Sweetzyme ^TM (Novozymes A/S) или GenSweet™ (DuPont).

Лактазы: Лактоза - димер глюкозы и галактозы - представляет собой преобладающий в молоке сахар, который является в большой степени причиной непереносимости молока у млекопитающих, особенно у людей. Бета-галактозидазы или лактазы (EC 3.2.1.23) гидролизуют димер в отдельные углеводы, тем самым повышая переносимость и способность усваивать молоко при его приеме. Альтернативные названия лактозы включают также экзо-(1,4)-бета-D-галактаназы.

Поступающие в продажу лактазы включают, например, Lactozyme Pure™ (Novozymes A/S) и лактазу GODO-YNL2 (DuPont).

Пероксидазы/оксидазы. Подходящие пероксидазы/оксидазы включают таковые растительного, бактериального или грибкового происхождения. Предусматриваются химически модифицированные или полученные при помощи белковой инженерии мутанты. Примеры пригодных пероксидаз включают пероксидазы из Coprinus, например, из C. cinereus, и их варианты, описанные в WO 93/24618, WO 95/10602 и WO 98/15257.

Другие пероксидазы включают Guardzyme^TM (Novozymes A/S).

В определенном варианте осуществления настоящее изобретение не охватывает ферменты, которые разрушаются при нагревании. В более определенном варианте осуществления настоящее изобретение не включает ферменты, которые разрушаются при температуре выше 65°C, 70°C, 80°C, 90°C и/или 100°C.

Ферментационный бульон

Настоящее изобретение может быть полезно для любой ферментации, проводимой в промышленном масштабе, например, для любой ферментации с питательной средой объемом не менее 50 литров, предпочтительно - не менее 500 литров, более предпочтительно - не менее 5000 литров, даже более предпочтительно - не менее 50000 литров.

Ферментацию микроорганизмов, продуцирующих нужный белок, можно проводить любым способом, известным в области техники. Питательная среда может быть минимальной средой, как описано, например, в публикации WO 98/37179, или питательная среда может быть сложной средой, включающей комплексные источники азота и углерода, где комплексный азотный источник может быть частично гидролизован, как описано в публикации WO 2004/003216.

Ферментацию можно проводить в виде периодического, повторяющегося периодического, периодического с подпиткой, повторяющегося периодического с подпиткой или непрерывного процесса ферментации.

В периодическом процессе с подпиткой перед началом ферментации к среде либо добавляют, либо не добавляют часть соединений, составляющих одно или несколько питательных веществ, и либо все, либо оставшуюся часть, соответственно, соединений, составляющих одно или несколько питательных веществ, вводят в ходе процесса ферментации. Соединения, выбранные для подпитки, можно вводить в процесс ферментации одновременно или отдельно.

В повторяющемся периодическом процессе с подпиткой или непрерывном процессе ферментации полная исходная среда дополнительно вводится в ходе ферментации. Исходную среду можно вводить одновременно с питанием структурным(и) элементом(ами) или отдельно от него(них). В повторяющемся периодическом процессе с подпиткой часть ферментационного бульона, содержащего биомассу, удаляют через регулярные интервалы времени, в то время как в непрерывном процессе удаление части ферментационного бульона происходит непрерывно. Процесс ферментации, таким образом, восполняется порцией свежей среды, соответствующей количеству отведенного из процесса ферментационного бульона.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предпочтителен ферментационный бульон, получаемый в периодическом процессе с подпиткой.

Температура

Неожиданно было обнаружено, что нагревание ферментационного бульона до температуры выше 65°C, например, выше 70°C, является эффективным способом снижения содержания ДНК в ферментационном бульоне.

Ферментационный бульон можно нагревать до температуры, равной или выше 65°C, 70°C, 75°C, 80°C или даже выше 85°.

Чтобы не допускать денатурации нужного белка, такого как фермент, важно поддерживать температуру ферментационного бульона ниже температуры денатурации белка.

Температуру можно поддерживать ниже 110°C, 100°C, 95°C или даже ниже 90°C.

Температуру можно повышать вплоть до температуры в интервале от 65°C до 110°C, от 65°C до 100°C, от 70°C до 110°C, от 70°C до 100°C, от 75°C до 110°C, от 75°C до 100°C, от 75°C до 95°C или от 80°C до 90°C.

В предпочтительном варианте осуществления нагревание ферментационного бульона не приводит к потере стабильности или активности белка или вызывает незначительное снижение этих параметров, например, снижение активности требуемого белка менее чем на 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20% или 25%. Снижение стабильности или активности белка можно определять путем измерения количества нужного белка, присутствующего в ферментационном бульоне, непосредственно перед и сразу после тепловой обработки.

В этой связи потерю белка или активности обычно измеряют, используя стандартный количественный анализ нужного белка, который не ограничивается каким-либо определенным типом анализа. В качестве примеров пригодных количественных анализов в данном изобретении можно упомянуть количественные анализы определения ферментативной активности, методы ELISA и иммунологические анализы. Если нужный белок является ферментом, количественный анализ для изменения снижения активности предпочтительно представляет собой количественный анализ, при котором измеряют ферментативную активность фермента.

Время

Ферментационный бульон можно нагревать в течение не менее 5, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 120, 150, 180 или даже вплоть до 240 минут или вплоть до 6 часов.

В предпочтительном варианте осуществления ферментационный бульон нагревают в течение менее чем 240, 200, 180, 150, 120 или даже менее чем 90 мин.

В определенном варианте осуществления ферментационный бульон можно нагревать в течение периода от 20 до 120 мин, например, от 30 до 90 мин.

Оборудование для нагревания

Для нагревания ферментационного бульона можно использовать любое подходящее оборудование, и последующее не должно рассматриваться как ограничение.

Температуру ферментационного бульона можно повышать вводом пара или применяя нагревательные рубашки. Другие возможные решения для проведения нагревания включают пассивное нагревание (выделяемое микробами тепло), теплообменник с последующим удерживанием в емкости или петле трубопровода, внешних петлях и проточных ячейках.

Способ данного изобретения может применяться к необработанному ферментационному бульону или ферментационному бульону, который сначала подвергался, но не ограничиваясь этим, например, регулированию рН.

Разбавление

Согласно настоящему изобретению ферментационный бульон можно разбавлять водой вплоть до 2000% (вес/вес); предпочтительно, чтобы ферментационный бульон был разбавлен водой на 10-2000% (вес/вес); более предпочтительно, чтобы ферментационный бульон был разбавлен водой на 100-1500% (вес/вес); более предпочтительно, чтобы ферментационный бульон был разбавлен водой на 100-1000% (вес/вес); более предпочтительно, чтобы ферментационный бульон был разбавлен водой на 200-800% (вес/вес).

Разбавление водой согласно настоящему изобретению означает, что разбавляющей средой может быть вода, или это может быть ультрафильтрат из производства нужного белка, или это может быть возвращаемая в цикл вода из производства нужного белка, или это может быть конденсат из нагревателя, или это может быть любая комбинация вышеупомянутого, например, смесь воды и ультрафильтрата.

Флокуляция

Для проведения флокуляции ферментационного бульона в него можно вводить двухвалентную соль, в частности, соль кальция и/или соль магния, например, хлорид кальция или хлорид магния. Предпочтительный вариант осуществления представляет собой соль кальция, в частности, хлорид кальция.

Концентрация вводимой в ферментационный бульон соли может составлять 0,01-10% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона (неразбавленного); предпочтительно - 0,5-10% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона (неразбавленного); более предпочтительно - 1-9% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона (неразбавленного); в частности, 2-8% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона (неразбавленного).

Поли-соединение алюминия

Чтобы дополнительно усовершенствовать удаление ДНК из ферментационного бульона, в него можно вводить поли-соединение алюминия. Известно, что многие соединения алюминия улучшают флокуляцию, например, Al₂(SO₄)₃, NaAlO₂, K₂Al₂O_4, AlCl₃, Al(NO₃)₃, ацетат Al и формиат Al.

Особенно полезные для применения полихлориды алюминия включают соединения формулы Al_n(OH)_mCl(_3n-m) и полихлориды алюминия и хлогридраты алюминия под CAS №: 1327-41-9.

Примеры полезных для применения полихлоридов алюминия включают хлоргидрат алюминия, GC850^TM (Al₂(OH)₅Cl), получаемые из Gulbrandsen или NordPac 18 (можно приобрести у Nordisk Aluminat A/S, Denmark), который представляет собой алюминиевый комплекс с суммарной формулой Al(OH)_1,2Cl_1,8. Другим примером полезного полихлорида алюминия с формулой Al(OH)_1,2Cl_1,8 является PAX-XL 100 (можно приобрести у Kemira). Другими двумя примерами полезного полихлорида алюминия являются PAC (можно приобрести у Shanghai Haotian Water Treatment Equipment Co., Ltd., поставляется в твердой форме) или PAC (можно приобрести у Tianjin Kairuite technology Ltd., поставляется в жидкой форме). Другим примером полезного полихлорида алюминия с формулой Al(OH)_1,2Cl_1,8 является PAX18 (можно приобрести у Kemira Water Solutions).

Концентрация полихлорида алюминия обычно должна быть в пределах 0,1-10% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона (неразбавленного); предпочтительно в пределах 0,5-5% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона (неразбавленного).

После введения полихлорида алюминия можно отрегулировать рН. рН можно довести до значения рН в интервале от рН 2 до рН 11. рН можно регулировать любой кислотой или основанием, известными в области техники.

Полихлорид алюминия можно также вводить после отделения микроорганизма от ферментационного бульона.

Полихлорид алюминия можно также вводить в две или более стадии, например: до удаления микроорганизма из ферментационного бульона; а затем еще раз после удаления микроорганизма, например, в жидкости способа ниже по технологическому потоку.

Полимеры

Полимеры широко используются для агрегирования частиц. Предпочтительны анионные и катионные полимеры. Полезным катионным полимером может быть полиамин, а полезным анионным полимером может быть полиакриламид. Полезные концентрации полимера обычно должны быть в пределах 0,5-20% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона (неразбавленного); предпочтительно в пределах 1-10% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона (неразбавленного).

Примером полезного анионного полимера является Superfloc™ A 130 (Kemira). Примерами полезных катионных полимеров являются Polycat ™ (Kemira), C521 (Kemira) и C591 (Kemira).

Последующие операции ниже по технологическому потоку

Выпавшие в осадок клетки можно удалять известными в данной области техники способами, такими как, но не ограничиваясь ими, фильтрация, например, барабанная фильтрация, мембранная фильтрация, тупиковая фильтрация на фильтр-прессе, фильтрация с поперечным течением или центрифугирование.

Получаемый раствор белка можно далее перерабатывать или очищать известными в данной области техники способами. Например, белок можно извлекать с помощью традиционных методик, включая, но не ограничиваясь этим, дополнительную фильтрацию, такую как сверхтонкая фильтрация и диафильтрация, экстракция, сушка распылением, выпаривание, осаждение или кристаллизация. Выделенный белок можно дополнительно очищать и/или модифицировать известными в данной области техники различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, хроматографию, например, ионобменную, аффинную, гидрофобную, хроматофокусирование и вытеснительную хроматографию, и/или электрофоретические методы, например, препаративное изоэлектрическое фокусирование, и/или дифференциальную растворимость, например, осаждение сульфатом аммония, и/или экстракцию.

Обнаружение остаточной ДНК клетки-хозяина

Термин остаточная ДНК клетки-хозяина включает геномную ДНК из штамма-продуцента и фрагмент ДНК, кодирующий нужный белок.

Обнаружение и количественное определение очень малых количеств остаточной ДНК клетки-хозяина можно выполнять различными способами, известными в области техники. Многие способы разработаны для измерения определенных одиночных целевых последовательностей. Примерами способов являются:

- Способ, основанный на гибридизации для обнаружения специфической ДНК определенного происхождения с помощью дот блоттинга и гибридизации меченных радиоизотопами ДНК-зондов с использованием случайных гексамеров для создания репрезентативных зондов, охватывающих полный геном клетки-хозяина.

- Количественный способ на основе ПЦР для обнаружения специфической ДНК определенного происхождения, нацеленной на специфическую генную последовательность, для амплификации и калибровки с использованием очищенной геномной ДНК с видовым соответствием.

- Качественный способ ПЦР для обнаружения специфической ДНК определенного происхождения, нацеленной на специфическую генную последовательность, для амплификации и калибровки с использованием очищенной геномной ДНК с видовым соответствием. Порог обнаружения определяют по самому малому количеству геномной ДНК, которое может быть обнаружено с использованием способа.

Согласно настоящему изобретению очистку от следовых количеств ДНК проводили, используя набор FastDNA™ Spin Kit (MP Biomedicals). Элюированный образец затем подвергали реакции ПЦР, используя специфические праймеры для хромосомных локусов на клетке-хозяине. Положительный контроль вводили, когда известные количества ДНК клетки-хозяина добавляли в реакции ПЦР в различных концентрациях. После реакции ПЦР образцы подвергали гель-электрофорезу и интенсивность полос ДНК сравнивали, чтобы оценить концентрацию ДНК клетки-хозяина в изначальном образце. Подробные протоколы ПЦР приведены в публикации lnnis et al. (1990) PCR ProtocoIs, A Guide to methods and applications, Academic Press inc., N.Y.

Обработка ферментационного бульона или другого белка с использованием настоящего способа приводит к значительному снижению количеств ДНК, присутствующих в ферментационном бульоне, и предпочтительно содержание ДНК снижается до уровня ниже обнаруживаемого. Считается, что уровень содержания находится за пределами обнаружения, если ПЦР-амплификация любого сегмента геномной ДНК, присутствующего в единственном числе в гаплоидном геноме, за которым следует окрашивание бромистым этидием, не дает видимой полосы.

Предпочтительно, чтобы уровень содержания ДНК в ферментационном бульоне снижался до уровня содержания ниже 1мкг/мл, предпочтительно - ниже 500 нг/мл, предпочтительно - ниже 200 нг/мл, предпочтительно - ниже 100 нг/мл, предпочтительно - ниже 50 нг/мл, предпочтительно - ниже 20 нг/мл, предпочтительно - ниже 10 нг/мл, предпочтительно - ниже 5 нг/мл, предпочтительно - ниже 2 нг/мл, предпочтительно - ниже 1 нг/мл, и особенно предпочтительно - ниже 500 пг/мл.

В примере типичного законодательного регулирования какое-либо обнаруживаемое содержание ДНК, которое может быть установлено с использованием исследования на основе ПЦР с пределом обнаружения в препарате фермента, составляющем, например, 1, 5, 10 или 20 нг/мл, не разрешается.

Кроме того, также предусматривается применение мгновенного способа в сочетании с традиционными способами удаления ДНК из ферментационных бульонов или другого белкового препарата.

Настоящее изобретение дополнительно кратко изложено в следующих параграфах:

1. Способ удаления ДНК из ферментационного бульона, содержащего нужный белок и микроорганизм, продуцирующий нужный белок, причем указанный способ включает:

a) нагревание ферментационного бульона до температуры не ниже 70°C.

2. Способ согласно параграфу 1, дополнительно включающий стадии:

b) введения в ферментационный бульон полихлорида алюминия, и

c) отделения выпавших хлопьями микроорганизмов от ферментационного бульона.

3. Способ согласно параграфу 1 или параграфу 2, где нужный белок представляет собой пептид или полипептид.

4. Способ согласно параграфу 3, где нужный белок представляет собой пептид, содержащий от 5 до 100 аминокислот.

5. Способ согласно параграфу 4, где нужный белок представляет собой пептид, содержащий от 10 до 80 аминокислот.

6. Способ согласно параграфу 5, где нужный белок представляет собой пептид, содержащий от 15 до 60 аминокислот.

7. Способ согласно параграфу 3, где нужный белок представляет собой противомикробный пептид, липопептид или браззеин.

8. Способ согласно параграфу 3, где нужный белок представляет собой фермент.

9. Способ по параграфу 8, где фермент выбирают из: гидролаз, лиаз, протеаз, амилаз, глюкоамилаз, пектиназ, пектатлиаз, целлюлаз, ксиланаз, арабиназ, арабинофуранозидаз, маннаназ, каррагинаназ, ксантаназ, эндоглюканаз, хитиназ, аспарагиназ, липаз, фосфолипаз, кутиназ, лизоцимов, фитаз, пероксидаз, лактаз, глюкозоизомераз, изомераз ксилозы, эстераз и фосфодиэстераз.

10. Способ согласно параграфу 8 или параграфу 9, где фермент представляет собой теплоустойчивый фермент.

11. Способ согласно параграфу 10, где теплоустойчивый фермент обладает теплоустойчивостью, измеренной как время полужизни при 70°C и pH 7,0, равной не менее чем 30 минутам.

12. Способ согласно параграфу 11, где теплоустойчивый фермент обладает теплоустойчивостью, измеренной как время полужизни при 70°C и pH 7,0, равной не менее чем 40 минутам.

13. Способ согласно параграфу 12, где теплоустойчивый фермент обладает теплоустойчивостью, измеренной как время полужизни при 70°C и pH 7,0, равной не менее чем 50 минутам.

14. Способ согласно параграфу 13, где теплоустойчивый фермент обладает теплоустойчивостью, измеренной как время полужизни при 70°C и pH 7,0, равной не менее чем 60 минутам.

15. Способ согласно параграфу 14, где теплоустойчивый фермент обладает теплоустойчивостью, измеренной как время полужизни при 70°C и pH 7,0, равной не менее чем 70 минутам.

16. Способ согласно параграфу 15, где теплоустойчивый фермент обладает теплоустойчивостью, измеренной как время полужизни при 70°C и pH 7,0, равной не менее чем 80 минутам.

17. Способ согласно параграфу 16, где теплоустойчивый фермент обладает теплоустойчивостью, измеренной как время полужизни при 70°C и pH 7,0, равной не менее чем 90 минутам.

18. Способ согласно параграфу 17, где теплоустойчивый фермент обладает теплоустойчивостью, измеренной как время полужизни при 70°C и pH 7,0, равной не менее чем 100 минутам.

19. Способ согласно любому из параграфов 10-18, где теплоустойчивый фермент представляет собой амилазу или аспарагиназу.

20. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где микроорганизм представляет собой бактерию или гриб.

21. Способ согласно параграфу 20, где микроорганизм представляет собой гриб, выбранный из группы, состоящей из клеток-хозяев Trichoderma и Aspergillus.

22. Способ согласно параграфу 21, где гриб представляет собой штамм Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viridel, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae.

23. Способ согласно параграфу 20, где микроорганизм представляет собой бактерию из группы, состоящей из грамположительных бактерий, таких как Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus или Streptomyces, или грамотрицательных бактерий, таких как Campylobacter, Escherichia, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella или Ureaplasma.

24. Способ согласно параграфу 23, где бактериальная клетка-хозяин представляет собой Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis.

25. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где температуру ферментационного бульона поднимают до не ниже чем 75°C.

26. Способ согласно параграфу 25, где температуру ферментационного бульона поднимают до не ниже чем 80°C.

27. Способ согласно любому из параграфов 1-24, где температуру ферментационного бульона поднимают до температуры в интервале от 70°C до 110°C.

28. Способ согласно параграфу 27, где температуру ферментационного бульона поднимают до температуры в интервале от 70°C до 100°C.

29. Способ согласно параграфу 28, где температуру ферментационного бульона поднимают до температуры в интервале от 70°C до 90°C.

30. Способ согласно параграфу 27, где температуру ферментационного бульона поднимают до температуры в интервале от 75°C до 110°C.

31. Способ согласно параграфу 30, где температуру ферментационного бульона поднимают до температуры в интервале от 75°C до 100°C.

32. Способ согласно параграфу 31, где температуру ферментационного бульона поднимают до температуры в интервале от 75°C до 90°C.

33. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени от 2 мин до 150 мин.

34. Способ согласно параграфу 33, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени от 5 мин до 135 мин.

35. Способ согласно параграфу 34, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени от 10 мин до 120 мин.

36. Способ согласно параграфу 35, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени от 20 мин до 100 мин.

37. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени не менее 10 мин.

38. Способ согласно параграфу 37, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени не менее 20 мин.

39. Способ согласно параграфу 38, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени не менее 30 мин.

40. Способ согласно параграфу 39, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени не менее 40 мин.

41. Способ согласно параграфу 40, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени не менее 50 мин.

42. Способ согласно параграфу 41, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени не менее 60 мин.

43. Способ согласно параграфу 42, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени не менее 70 мин.

44. Способ согласно параграфу 43, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течении периода времени не менее 80 мин.

45. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где полихлорид алюминия вводят в количестве 0,1-10% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона.

46. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где в дополнение к полихлориду алюминия вводят один или несколько флокулянтов.

47. Способ согласно параграфу 46, где флокулянты выбирают из группы, состоящей из солей и полимеров.

48. Способ согласно параграфу 47, где полимер представляет собой анионный или катионный полимер.

49. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где стадию разделения с) выполняют, используя центрифугирование или фильтрацию.

50. Способ согласно параграфу 2, где рН доводят до рН со значением в интервале от рН 2 до рН 11 после введения полихлорида алюминия.

51. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 1мкг/мл.

52. Способ согласно параграфу 51, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 500 нг/мл.

53. Способ согласно параграфу 52, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 200 нг/мл.

54. Способ согласно параграфу 53, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 100 нг/мл.

55. Способ согласно параграфу 54, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 50 нг/мл.

56. Способ согласно параграфу 55, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 20 нг/мл.

57. Способ согласно параграфу 56, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 10 нг/мл.

58. Способ согласно параграфу 57, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 5 нг/мл.

59. Способ согласно параграфу 58, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 2 нг/мл.

60. Способ согласно параграфу 59, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 1 нг/мл.

61. Способ согласно параграфу 60, где уровень содержания ДНК снижают до уровня содержания ниже 500 пг/мл.

62. Способ согласно параграфу 61, где уровень содержания ДНК снижают до уровня ниже предела обнаружения.

63. Способ согласно параграфу 62, где предел обнаружения определяют, используя ПЦР-амплификацию любого сегмента геномной ДНК, присутствующего в единственном числе в гаплоидном геноме, вслед за которой проводят гель-электрофорез и окрашивание бромистым этидием, при этом окрашивание не выявляет каких-либо видимых полос.

64. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где после стадии b) в ферментационном бульоне находится менее 10 нг ДНК клетки-хозяина на грамм ферментационного бульона.

65. Способ согласно любому из предыдущих параграфов, где ферментационный бульон можно разбавлять водой вплоть до 2000% (вес/вес).

Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не предполагаются как ограничивающие каким-либо образом объем заявляемого изобретения.

Примеры

Материалы и методы

Пример 1.

Удаление ДНК из ферментационного бульона варианта амилазы сочетанием тепловой обработки и флокуляции в полупромышленном масштабе

Глубинную ферментацию штамма Bacillus licheniformis, экспрессирующего вариант альфа-амилазы, проводили известным в области техники образом.

Ферментационный бульон, содержащий нужный белок и полученный бульон показали наличие содержания ДНК.

В конце стандартной ферментации температуру бульона повышали путем регулируемого ввода пара в чан. Температуру повышали до достижения 80°C и бульон выдерживали при этой температуре в течение 30 мин. После завершения тепловой обработки ферментационный бульон переносили в другую емкость, приспособленную для проведения охлаждения/нагревания с помощью рубашек вокруг емкости: бульон охлаждали до 35°C и выдерживали при этой температуре при постоянном перемешивании перед проведением последующей обработки.

Флокуляцию ферментационного бульона проводили периодическим образом согласно следующим инструкциям:

Компонент Количество Концентрация Поставщик Ферментационный бульон, прошедший тепловую обработку 20 кг - Водопроводная вода 100,7 кг - CaCl₂ 0,46 кг 100% Tetra, Helsingborg, Sweden GC850™ 0,41 кг 100% Kemira Water, Copenhagen, Denmark Superfloc C591™ 5,44 кг 10% Kemira Water, Copenhagen, Denmark Superfloc A130™ 2,3 кг 0,01% Kemira Water, Copenhagen, Denmark

Бульон разбавляли теплой водопроводной водой, чтобы поддерживать температуру при 35°C в ходе первой части процесса извлечения фермента. рН регулировали растворами уксусной кислоты и/или гидроксида натрия после введения соли полиалюминия GC850™, чтобы получить требуемое значение рН, установленное на 10,5.

Хлопья выпавшего в осадок материала затем подвергали процессу извлечения, сходным образом с используемым в стандартном производстве процессом, но масштабированного до полупромышленного уровня. Оборудование использовали в соответствии с соответствующими инструкциями изготовителя и/или в соответствии с протоколами, как принято в области техники. В процесс включены:

- Первичная фильтрация на одноразовых фильтрующих пластинах HS2000 (Pall, Lund, Sweden),

- Фильтрация микробов на одноразовых фильтрующих модулях EKS (Pall, Lund, Sweden),

- Сверхтонкая фильтрация (UF) на полупроницаемой мембране UFX10 (Alfa Laval, Lund, Sweden). Полученная при сверхтонкой фильтрации концентрация фермента была такой же, как и концентрация, наблюдаемая при стандартном производстве.

- Стабилизация UF-концентрата сахарозой, контролирование и регулирование pH. Количество сахарозы, используемой при стабилизации было таким же, что и количество, используемое при стандартном производстве.

Образцы отбирали из всех потоков, упомянутых выше, и проводили анализ на остаточную ДНК (набор FastDNA™ Spin Kit и ПЦР). Образец ферментационного бульона отбирали до тепловой обработки и содержание в нем остаточной ДНК анализировали одновременно с образцами из технологических потоков.

Только не прошедший обработку культуральный бульон характеризовался положительным ДНК-сигналом, о чем свидетельствовала ПЦР-полоса на агарозном геле (указано стрелками на Фигуре 1). Все другие образцы дали отрицательный ДНК-сигнал, о чем свидетельствует отсутствие ПЦР-полосы на том же самом на агарозном геле. Отрицательный контроль (вода) был добавлен для оценки качества анализа на ДНК.

Для сравнения наличие остаточной ДНК проверяли в не менее чем двух независимых стандартных промышленных партиях, в их соответствующем концентрате после сверхтонкой фильтрации фермента. Было обнаружено, что все образцы содержат значительные количества остаточной ДНК (данные не приведены).

Вывод:

Результаты указывают на то, что сочетание тепловой обработки с последующей флокуляцией ферментационного бульона оказывает положительный эффект на удаление остаточной ДНК клетки-хозяина из штамма-продуцента этого варианта амилазы.

Пример 2.

Удаление ДНК из ферментационного бульона аспарагиназы сочетанием тепловой обработки и флокуляции в полупромышленном масштабе и промышленном масштабе

Глубинную ферментацию штамма Bacillus subtilis, экспрессирующего аспарагиназу, проводили известным в области техники образом.

Ферментационный бульон, содержащий нужный белок (аспарагиназу) и полученный бульон показали наличие содержания ДНК.

В конце стандартной ферментации температуру бульона повышали путем регулируемого ввода пара в чан. Температуру повышали до достижения 80°C и бульон инкубировали при этой температуре в течение 80 мин. После завершения тепловой обработки ферментационный бульон переносили в другую емкость, приспособленную для проведения охлаждения/нагревания с помощью рубашек вокруг емкости: бульон охлаждали до примерно 15°C и выдерживали при этой температуре при постоянном перемешивании перед проведением последующей обработки.

Флокуляцию ферментационного бульона проводили периодическим образом в полупромышленном масштабе согласно следующим инструкциям:

Компонент Количество Концентрация Поставщик Ферментационный бульон, прошедший тепловую обработку 330 кг - Водопроводная вода 1460 кг - CaCl₂ 8,05 кг 100% Tetra, Helsingborg, Sweden GC850™ 8,15 кг 100% Kemira Water, Copenhagen, Denmark Superfloc C591™ 56,7 кг 10% Kemira Water, Copenhagen, Denmark Superfloc A130™ 17,9 кг 0,01% Kemira Water, Copenhagen, Denmark

Бульон разбавляли теплой водопроводной водой, чтобы достичь температуры 35°C в ходе первой части процесса извлечения фермента. рН регулировали растворами уксусной кислоты и/или гидроксида натрия после введения соли полиалюминия GC850™, чтобы получить требуемое значение рН, установленное на 9,0.

Хлопья выпавшего в осадок материала затем подвергали процессу извлечения, сходным образом с используемым в стандартном производстве процессом, но масштабированного до полупромышленного уровня. Оборудование использовали в соответствии с соответствующими инструкциями изготовителя и/или в соответствии с протоколами, как принято в области техники. В процесс включены:

- Барабанная фильтрация на ротационном барабанном вакуумном фильтре,

- Контрольная фильтрация на фильтре с центробежной выгрузкой осадка,

- Фильтрация микробов на одноразовых фильтрующих модулях EKS (Pall, Lund, Sweden),

- Сверхтонкая фильтрация на полупроницаемых мембранах UFX10 (Alfa Laval, Lund, Sweden),

- Окончательная фильтрация микробов на одноразовых фильтрующих модулях.

Образцы отбирали из всех потоков, упомянутых выше, и проводили анализ на остаточную ДНК (набор FastDNA™ Spin Kit и ПЦР). Образец ферментационного бульона отбирали до тепловой обработки и содержание в нем остаточной ДНК анализировали одновременно с образцами из технологических потоков.

Только не прошедший обработку культуральный бульон характеризовался положительным ДНК-сигналом, о чем свидетельствовала ПЦР-полоса на агарозном геле (указано стрелками на Фигуре 2). Все другие образцы дали отрицательный ДНК-сигнал, о чем свидетельствует отсутствие ПЦР-полосы на том же самом на агарозном геле. Отрицательный контроль (вода) добавили для оценки качества анализа на ДНК.

В качестве контроля, похожий ферментационный бульон выделяли согласно методике, описанной выше, но без предварительной тепловой обработки. Аналитическое исследование всех технологических потоков показало наличие остаточной ДНК на всех стадиях, причем особенно высокую концентрацию наблюдали в образце концентрата, полученного сверхтонкой фильтрацией (данные не приведены).

Пример 3.

Один дополнительный ферментационный бульон продуцирующего аспарагиназу штамма, полученный, как описано в Примере 2, обрабатывали теплом в полупромышленном масштабе введением пара и проводили флокуляцию по сходной с описанной выше прописи, которая была немного изменена в отношении дозирования химикатов, чтобы получить удовлетворительное разделение клеток (данные не приведены). Выделение фермента проводили в полупромышленном масштабе, используя способ, идентичный описанному выше. Все образцы из технологических потоков, отобранные в ходе проведения процесса извлечения, показали отсутствие остаточной ДНК за исключением самого культурального бульона и надосадочной жидкости обработанного теплом ферментационного бульона (фигура 3).

Это испытание особенно подчеркивает пользу от сочетания тепловой обработки с флокуляцией.

Пример 4.

Тепловую обработку ферментационного бульона аспарагиназы, полученного, как описано в примере 2, вводом пара в сочетании с последующей флокуляцией обработанного теплом ферментационного бульона проводили в промышленном масштабе на соответствующем промышленном оборудовании и согласно предписаниям, как принято в области техники. Здесь тоже, пропись для флокуляции была немного изменена в отношении дозирования химикатов, чтобы получить удовлетворительное разделение клеток; флокуляцию проводили в непрерывном, а не в периодическом режиме. Образцы из технологических потоков отбирали в трех экземплярах в ходе выполнения всего процесса извлечения; их анализ показал, что ДНК не определяется даже в наиболее концентрированных растворах фермента из узла сверхтонкой фильтрации (данные не приведены).

Это исследование показало, что методики, описанные выше, можно успешно масштабировать до промышленного уровня производства. Непрерывная флокуляция, использованная в производстве, не дала других результатов по сравнению с периодической флокуляцией, использованной в полупромышленном масштабе, это означает, что обе методики можно успешно применять в сочетании с тепловой обработкой ферментационного бульона.

Выводы из Примеров 2, 3 и 4:

Эти результаты в значительной степени подтверждают, что сочетание тепловой обработки и флокуляции оказывает положительный эффект на удаление остаточной ДНК клетки-хозяина из штамма-продуцента этого штамма аспарагиназы как в полупромышленном масштабе, так и - что особенно важно - в промышленном масштабе.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ удаления ДНК клетки-хозяина из ферментационного бульона. Способ включает нагревание ферментационного бульона до температуры от 70 до 110°C с последующим введением в него полихлорида алюминия в количестве 0,1-10% (вес/вес) и дополнительным введением одного или нескольких флокулянтов, состоящих из солей и полимеров. Хлопья выпавшего в осадок материала извлекают известными способами. Способ обеспечивает снижение содержания ДНК клетки-хозяина в ферментационном бульоне до уровня ниже обнаруживаемого. 17 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.

1. Способ удаления ДНК из ферментационного бульона, содержащего нужный белок и микроорганизм, продуцирующий нужный белок, причем указанный способ включает:

a) нагревание ферментационного бульона до температуры от 70 до 110°С,

b) введение в ферментационный бульон полихлорида алюминия, и

c) отделение выпавших хлопьями микроорганизмов от ферментационного бульона.

2. Способ согласно п. 1, где нужный белок представляет собой пептид, такой как противомикробный пептид, липопептид или браззеин, или полипептид, такой как фермент.

3. Способ согласно п. 2, где нужный белок представляет собой фермент, выбранный из гидролаз, лиаз, протеаз, амилаз, глюкоамилаз, пектиназ, пектатлиаз, целлюлаз, ксиланаз, арабиназ, арабинофуранозидаз, маннаназ, каррагинаназ, ксантаназ, эндоглюканаз, хитиназ, аспарагиназ, липаз, фосфолипаз, кутиназ, лизоцимов, фитаз, пероксидаз, лактаз, глюкозоизомераз, изомераз ксилозы, эстераз и фосфодиэстераз.

4. Способ согласно п. 3, где фермент представляет собой теплоустойчивый фермент.

5. Способ согласно п. 4, где теплоустойчивый фермент характеризуется теплоустойчивостью, измеренной как время полужизни при 70°C и pH 7,0, равное не менее чем 30 мин, предпочтительно не менее чем 40 мин, предпочтительно не менее чем 50 мин, предпочтительно не менее чем 60 мин, предпочтительно не менее чем 70 мин, предпочтительно не менее чем 80 мин, предпочтительно не менее чем 90 мин, предпочтительно не менее чем 100 мин.

6. Способ согласно п. 4 или 5, где теплоустойчивый фермент представляет собой амилазу или аспарагиназу.

7. Способ согласно любому из предыдущих пунктов, где микроорганизм представляет собой бактерию или гриб.

8. Способ согласно п. 7, где микроорганизм представляет собой гриб, выбранный из группы, состоящей из клеток-хозяев Trichoderma и Aspergillus, предпочтительно из Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viridel, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae.

9. Способ согласно п. 7, где микроорганизм представляет собой бактерию из группы, состоящей из грамположительных бактерий, таких как Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus или Streptomyces, или грамотрицательных бактерий, таких как Campylobacter, Escherichia, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, или Ureaplasma, таких как Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis.

10. Способ согласно любому из пп. 1-9, где температуру поддерживают при температуре выше 70°C в течение периода времени не менее 10 мин, предпочтительно не менее 20 мин, предпочтительно не менее 30 мин, предпочтительно не менее 40 мин, предпочтительно не менее 50 мин, предпочтительно не менее 60 мин, предпочтительно не менее 70 мин, предпочтительно не менее 80 мин.

11. Способ согласно любому из предыдущих пунктов, где полихлорид алюминия вводят в количестве 0,1-10% (вес/вес) в пересчете на кг ферментационного бульона.

12. Способ согласно любому из предыдущих пунктов, где в дополнение к полихлориду алюминия вводят один или несколько флокулянтов, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из солей и полимеров.

13. Способ согласно п. 12, где полимер представляет собой анионный или катионный полимер.

14. Способ согласно любому из предыдущих пунктов, где стадию разделения с) выполняют, используя центрифугирование или фильтрацию.

15. Способ согласно п. 1, где рН доводят до рН со значением в интервале от рН 2 до рН 11 после введения полихлорида алюминия.

16. Способ согласно п. 15, где уровень содержания ДНК снижают до уровня ниже предела обнаружения.

17. Способ согласно п. 16, где предел обнаружения определяют, используя ПЦР-амплификацию любого сегмента геномной ДНК, присутствующего в единственном числе в гаплоидном геноме, вслед за которой проводят гель-электрофорез и окрашивание бромистым этидием, при этом окрашивание не выявляет каких-либо видимых полос.

18. Способ согласно любому из предыдущих пунктов, где ферментационный бульон можно разбавлять водой вплоть до 2000% (вес/вес).