КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ALAS1 Российский патент 2019 года по МПК C12N15/113 C07H21/04 

Описание патента на изобретение RU2687223C2

Родственные заявки

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на выдачу патента США №13/835613, поданной 15 марта 2013, а также притязает на приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США №61/622288, поданной 10 апреля 2012. Полное содержание каждой из вышеупомянутых заявок включено в настоящее описание в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к специфичному ингибированию экспрессии гена ALAS1.

Уровень техники

Наследственные порфирии представляют собой семейство расстройств, возникающих в результате недостаточной активности специфичных ферментов в пути биосинтеза гема, также называемого в настоящем описании путем порфиринов. Недостаточность ферментов пути порфиринов приводит к недостаточной продукции гема и к накоплению предшественников порфирина и порфиринов, которые являются токсичными для ткани в высоких концентрациях.

Среди наследственных порфирий острую интермиттирующую порфирию (AIP, например, аутосомно-доминантную AIP), смешанную порфирию (VP, например, аутосомно-доминантную VP), наследственную копропорфирию (копропорфирию или HCP, например, аутосомно-доминантную HCP) и порфирию вследствие недостаточности дегидратазы 5'-аминолевулиновой кислоты (также известной как δ-аминолевулиновая кислота или ALA) (ADP, например, аутосомно-доминантную ADP) классифицируют как острые печеночные порфирии, и они проявляются острыми неврологическими приступами, которые могут угрожать жизни. Острые приступы характеризуются симптомами автономной, периферической и центральной нервной систем, включая тяжелую боль в области живота, гипертонию, тахикардии, запор, моторную слабость, паралич и судороги. В отсутствие правильного лечения может наступить квадриплегия, нарушение функции дыхания и смерть. Различные факторы, включая индуцирующие цитохром P450 лекарственные средства, диета и гормональные изменения, могут провоцировать острые приступы за счет повышения активности печеночной синтазы 5'-аминолевулиновой кислоты 1 (ALAS1), первого и лимитирующего скорость фермента пути биосинтеза гема. При острых порфириях, например, AIP, VP, HCP и ADP, недостаточности соответствующих ферментов приводят к продукции и накоплению в печени одного или нескольких веществ (например, порфиринов и/или предшественников порфиринов, например, ALA и/или PBG), которые могут быть нейротоксичными и могут приводить к возникновению острых приступов. См., например, Balwani M. and Desnick, R.J., Blood, 120: 4496-4504, 2012.

Современная терапия острых неврологических приступов заключается во внутривенном введении гемина (пангематин®, Lundbeck или нормосанг®, Orphan Europe), который обеспечивает экзогенный гем для ингибирования ALAS1 по принципу отрицательной обратной связи, и тем самым снижает продукцию ALA и PBG. Гемин применяют для лечения во время острого приступа и для профилактики приступов, в частности, у женщин с острыми порфириями, которые страдают от частых атак, с гормональными изменениями во время их менструальных циклов. Хотя пациенты обычно хорошо реагируют, его эффект является медленным, обычно занимающим от двух до четырех дней или дольше для нормализации концентраций ALA и PBG в моче до нормальных уровней. Так как внутривенно вводимый гемин быстро метаболизируется, обычно требуется от трех до четырех инфузий для эффективного лечения или профилактики острого приступа. Кроме того, многократные инфузии могут вызывать перенасыщение железом и флебит, который может нарушать доступ к периферическим венам. Хотя для лечения используют ортотропную трансплантацию печени, такая процедура связана со значительной заболеваемостью и смертностью и наличие доноров печени ограничено. Таким образом, необходим альтернативный терапевтический способ, который является более эффективным, быстродействующим и безопасным. Было бы особенно предпочтительно, чтобы такое лечение могло быть осуществлено путем подкожного введения, так как это могло бы исключить необходимость в инфузиях и длительной госпитализации.

AIP, также называемая недостаточностью дезаминазы порфобилиногена (PBGD) или недостаточностью синтазы гидроксиметилбилана (HMBS), является наиболее распространенной из острых печеночных порфирий. Она является аутосомно-доминантным расстройством, вызванным мутациями в гене HMBS, которые приводят к пониженной активности, например, активности, пониженной наполовину по сравнению с нормальной активностью фермента. Ранее с использованием гомологичной рекомбинации была создана мышиная модель AIP, в которой выявлено ~30% от активности HMBS дикого типа. Подобно больным людям у таких мышей повышена активность ALAS1 печени и накапливаются большие количества ALA и PBG в плазме и моче при введении порфириногенных лекарственных средств, таких как фенобарбитал. Таким образом, такие мыши служат в качестве прекрасной модели для оценки эффективности новых терапевтических средств для лечения острых печеночных порфирий.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении описаны способы и композиции и-РНК для модулирования экспрессии гена ALAS1. В некоторых вариантах экспрессию гена ALAS1 снижают или ингибируют, используя ALAS1-специфичную и-РНК. Такое ингибирование может быть полезным для лечения расстройств, связанных с экспрессией ALAS1 экспрессия, таких как порфирии.

Соответственно, в настоящей публикации описаны композиции и способы, которые вызывают опосредованное РНК-индуцируемым комплексом сайленсинга (RISC) расщепление РНК-транскриптов гена ALAS1, например, в клетке или у субъекта (например, у млекопитающего, такого как человек). Также описаны композиции и способы лечения расстройства, связанного с экспрессией гена ALAS1, такого как порфирия, например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ночная порфирия или ADP), острая интермиттирующая порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия (CEP), поздняя кожная порфирия (PCT), наследственная копропорфирия (копропорфирия или HCP), смешанная порфирия (VP), эритропоэтическая протопорфирия (EPP) или временная эритропорфирия новорожденных. В некоторых вариантах расстройство представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP), AIP, HCP или VP. В некоторых вариантах расстройство представляет собой порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) или AIP.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В используемом в настоящем описании смысле термин «и-РНК», «РНК-и», «и-РНК-средство» или «РНК-и-средство» относится к средству, которое содержит РНК, которая определена в настоящем описании и которая опосредует целенаправленное расщепление РНК-транскрипта, например, посредством пути РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC). В одном варианте и-РНК, которая описана в настоящей публикации, осуществляет ингибирование экспрессии ALAS1 в клетке или в организме млекопитающего.

И-РНК, входящие в состав композиций, охарактеризованных в настоящем описании, охватывают днРНК, имеющие нить РНК (антисмысловую нить), имеющую область, например, область длиной 30 нуклеотидов или меньше, обычно 19-24 нуклеотида, которая в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта мРНК гена ALAS1 (например, гена ALAS1 мыши или человека) (также называемую в настоящем описании «ALAS1-специфичной и-РНК»). Альтернативно или вместе с тем, и-РНК охватывают днРНК, имеющие нить РНК (антисмысловую нить), имеющую область, которая имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, обычно 19-24 нуклеотида, которая значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта мРНК гена ALAS1 (например, гена ALAS1 варианта 1 или 2 человека) (также называемую в настоящем описании «ALAS1- специфичной и-РНК»).

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК), описанная в настоящей публикации, содержит антисмысловую нить, имеющую область, которая в значительной степени комплементарна области ALAS1 человека. В некоторых вариантах ALAS1 человека имеет последовательность NM_000688.4 (SEQ ID NO: 1) или NM_000688.5 (SEQ ID NO: 382).

В других вариантах и-РНК охватывает днРНК, имеющую нить РНК (антисмысловую нить), имеющую область, которая в значительной степени комплементарна части мРНК ALAS1 согласно любой из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. В одном варианте и-РНК охватывает днРНК, имеющую нить РНК (антисмысловую нить), имеющую область, которая в значительной степени комплементарна части мРНК ALAS1, например, мРНК ALAS1 человека (например, мРНК ALAS1 человека, которая представлена в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 382).

В одном варианте и-РНК для ингибирования экспрессии гена ALAS1 включает в себя, по меньшей мер, две последовательности, которые комплементарны друг другу. и-РНК включает в себя смысловую нить, имеющую первую последовательность, и антисмысловую нить, имеющую вторую последовательность. Антисмысловая нить содержит нуклеотидную последовательность, которая в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части мРНК, кодирующей транскрипт ALAS1, и область комплементарности имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, и по меньшей мере, 15 нуклеотидов. Обычно и-РНК имеет длину 19-24 нуклеотида.

В некоторых вариантах и-РНК имеет длину 19-21 нуклеотид. В некоторых вариантах и-РНК имеет длину 19-21 нуклеотид и входит в состав липидного препарата, например, препарата в виде липидных наночастиц (LNP) (например, препарата LNP11).

В некоторых вариантах и-РНК имеет длину 21-23 нуклеотида. В некоторых вариантах и-РНК имеет длину 21-23 нуклеотида и находится в форме конъюгата, например, конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, которые описаны в настоящей публикации.

В некоторых вариантах и-РНК имеет длину примерно от 15 до примерно 25 нуклеотидов, и в других вариантах и-РНК имеет длину примерно от 25 до примерно 30 нуклеотидов. и-РНК, мишенью которой является ALAS1, при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 25%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35% или, по меньшей мере, на 40% или больше, так как в анализе способом, который описан в настоящей публикации. В одном варианте и-РНК, мишенью которой является ALAS1, приготовлена в виде стабильной частицы, состоящей из нуклеиновой кислоты и липида (SNALP).

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит первую последовательность днРНК, которая выбрана из группы, состоящей из смысловых последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15, и вторую последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15.

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит первую последовательность днРНК, которая выбрана из группы, состоящей из смысловых последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, и вторую последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20. В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, имеет смысловые и/или антисмысловые последовательности, выбранные из последовательностей AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, AD-59129, AD-59124, AD-58874, AD-59125, AD-59105, AD-59120, AD-59122, AD-59106, AD-59126 и AD-59107, которые раскрыты в настоящем описании в примерах. В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) имеет смысловые и/или антисмысловые последовательности, выбранные из последовательностей AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 и AD-59129.

Молекулы и-РНК, охарактеризованные в настоящем описании, могут содержать встречающиеся в природе нуклеотиды или могут содержать, по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид, включая без ограничения модифицированный 2'-O-метилом нуклеотид, нуклеотид, имеющий 5'-фосфоротиоатную группу, и концевой нуклеотид, связанный с холестериловым производным. Альтернативно модифицированный нуклеотид может быть выбран из группы, состоящей из: 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, закрытого нуклеотида, лишенного основания нуклеотида, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, содержащего фосфорамидат и неприродное основание нуклеотида. Такая модифицированная последовательность может быть основана, например, на первой последовательности указанной и-РНК, выбранной из группы, состоящей из смысловых последовательностей, указанных в таблице 2, и второй последовательности, выбранной из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей, указанных в таблице 2.

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит смысловую нить, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 376 и SEQ ID NO: 380.

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит антисмысловую нить, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 377 и SEQ ID NO: 381.

В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит смысловую нить, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 186 и SEQ ID NO: 190. В одном варианте и-РНК (например, днРНК), охарактеризованная в настоящем описании, содержит антисмысловую нить, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 187 и SEQ ID NO: 191.

В одном варианте мишенью и-РНК, которая описана в настоящей публикации, является вариант РНК-транскрипта ALAS1 дикого типа, и в другом варианте мишенью и-РНК является мутантный транскрипт (например, РНК ALAS1, несущая аллельный вариант). Например, мишенью и-РНК, охарактеризованной в изобретении, может быть полиморфный вариант, такой как вариант, возникший вследствие однонуклеотидного полиморфизма (SNP) ALAS1. В другом варианте мишенью и-РНК является как транскрипт дикого типа, так мутантный транскрипт ALAS1. В следующем варианте мишенью и-РНК является конкретный вариант транскрипта ALAS1 (например, вариант 1 ALAS1 человека). В следующем варианте мишенью и-РНК-средства являются множественные варианты транскриптов (например, как вариант 1, так и вариант 2 ALAS1 человека).

В одном варианте мишенью и-РНК, охарактеризованной в изобретении, является некодирующая область РНК-транскрипта ALAS1, такая как 5'- или 3'-нетранслируемая область транскрипта.

В некоторых вариантах и-РНК, которая описана в настоящей публикации, имеет форму конъюгата, например, конъюгата с углеводом, который может служить в качестве направляющего к мишени остатка и/или лиганда, который описан в настоящей публикации. В одном варианте конъюгат связан с 3'-концом смысловой нити днРНК. В некоторых вариантах конъюгат связан через линкер, например, через бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер.

В некоторых вариантах конъюгат содержит одно или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Такой конъюгат также называют в настоящем описании GalNAc-конъюгатом. В некоторых вариантах конъюгат направляет РНК-и-средство к конкретной клетке, например, клетке печени, например, к гепатоциту. GalNAc-производные могут быть связаны через линкер, например, бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер. В конкретных вариантах конъюгат представляет собой

В некоторых вариантах РНК-и-средство связано с углеводным конъюгатом через линкер, например, линкер, который показан на следующей схеме, где X означает O или S

В некоторых вариантах X означает O. В некоторых вариантах X означает S.

В некоторых вариантах РНК-и-средство конъюгировано с L96, который определен в таблице 1 и показан ниже

В одном аспекте в изобретении предлагается фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в организме, обычно у человека. Композиция обычно содержит одну или несколько и-РНК, описанных в настоящей публикации, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель для доставки. В одном варианте композицию применяют для лечения порфирии, например, AIP.

В одном аспекте и-РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, является двунитевой рибонуклеиновой кислотой (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить длиной 15-30 пар оснований, и антисмысловая нить комплементарна, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1 или 382.

В следующем аспекте и-РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, является двунитевой РНК-и (днРНК), содержащей смысловую нить, комплементарную антисмысловой нити, при этом указанная антисмысловая нить содержит область, комплементарную РНК-транскрипту ALAS1, при этом каждая нить имеет длину примерно от 14 до примерно 30 нуклеотидов, при этом указанное средство в виде двунитевой РНК-и представлено формулой (III):

смысловая: 5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y - Nb-(Z Z Z)j -Na - nq 3'

антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l -Na'- nq' 5'

(III)

где:

i, j, k и l каждый независимо означают 0 или 1;

p, p', q и q' каждый независимо равен 0-6;

каждый Na и Na' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо немодифицированы, либо представлены сочетанием модифицированных и немодифифированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит, по меньшей мере, два по-разному модифицированных нуклеотида;

каждый Nb и Nb' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые либо модифицированы, либо немодифицированы, либо представлены сочетанием модифицированных и немодифифированных нуклеотидов;

каждый np, np', nq и nq' независимо означает выступающий нуклеотид;

XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' каждый независимо означает один мотив из трех идентичных модификаций трех непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов;

модификации на Nb отличаются от модификации на Y, и модификации на Nb' отличаются от модификации на Y'.

В некоторых вариантах смысловая нить конъюгирована, по меньшей мере, с одним лигандом.

В некоторых вариантах i равен 1; j равен 1; или оба i и j равны 1.

В некоторых вариантах k равен 1; l равен 1; или оба k и l равны 1.

В некоторых вариантах XXX комплементарен X'X'X', YYY комплементарен Y'Y'Y', и ZZZ комплементарен Z'Z'Z'.

В некоторых вариантах мотив Y'Y'Y' встречается в 11, 12 и 13 положениях антисмысловой нити от 5'-конца.

В некоторых вариантах Y' означает 2'-O-метил.

В некоторых вариантах область дуплекса имеет длину 15-30 пар нуклеотидов.

В некоторых вариантах область дуплекса имеет длину 17-23 пар нуклеотидов.

В некоторых вариантах область дуплекса имеет длину 19-21 пар нуклеотидов.

В некоторых вариантах область дуплекса имеет длину 21-23 пары нуклеотидов.

В некоторых вариантах модификации нуклеотидов выбраны из группы, состоящей из LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтил, 2'-O-алкил, 2'-O-аллил, 2'-C-аллил, 2'-фтор, 2'-дезоксигруппы, 2'-гидроксила и их сочетаний.

В некоторых вариантах модификациями нуклеотидов являются 2'-O-метил, 2'-фтор или оба.

В некоторых вариантах лиганд содержит углевод.

В некоторых вариантах лиганд связан через линкер.

В некоторых вариантах линкер представляет собой бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер.

В некоторых вариантах лиганд представляет собой

В некоторых вариантах лиганд и линкер представляют собой лиганд и ликер, показанные в формуле XXIV:

В некоторых вариантах лиганд связан с 3'-концом смысловой нити.

В некоторых вариантах днРНК имеет (например, содержит) нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 2 и 3. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8 и 9. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, указанную в таблице 18. В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 14 и 15.

В некоторых вариантах днРНК имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 3 и 8.

В следующем аспекте и-РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой двунитевую рибонуклеиновую кислоту (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит область комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, и такая антисмысловая нить содержит, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от одной из антисмысловых последовательностей, перечисленных в любой из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. В некоторых таких вариантах смысловые и антисмысловые последовательности выбраны из последовательностей дуплексов AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, AD-59129, AD-59124, AD-58874, AD-59125, AD-59105, AD-59120, AD-59122, AD-59106, AD-59126 и AD-59107, которые раскрыты в настоящем описании в примерах. В некоторых вариантах смысловые и антисмысловые последовательности выбраны из последовательностей дуплексов AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 и AD-59129. В некоторых вариантах смысловые и антисмысловые последовательности представляют собой последовательности дуплекса AD-58632. В некоторых вариантах смысловые и антисмысловые последовательности выбраны из последовательностей дуплексов AD-59453, AD-59395, AD-59477 и AD-59492. В некоторых вариантах смысловые и антисмысловые последовательности представляют собой последовательности дуплекса, раскрытого в настоящем описании, который подавляет экспрессию мРНК ALAS1, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85% или 90%, например, судя по оценке с использованием анализа, описанного в примерах, предлагаемых в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах днРНК содержит, по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид.

В некоторых вариантах, по меньшей мере, один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из: модифицированного 2'-O-метилом нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-фосфоротиоатную группу, и концевого нуклеотида, связанного с группой холестерилового производного или бисдециламида додекановой кислоты.

В некоторых вариантах модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из: 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, закрытого нуклеотида, лишенного основания нуклеотида, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2′-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, содержащего фосфорамидат и нуклеотида, содержащего неприродное основание.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину, по меньшей мере, 17 нуклеотидов.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину от 19 до 21 нуклеотида.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину 19 нуклеотидов.

В некоторых вариантах каждая нить имеет длину, составляющую не более чем 30 нуклеотидов.

В некоторых вариантах, по меньшей мере, одна нить содержит 3'-липкий конец, состоящий, по меньшей мере, из 1 нуклеотида.

В некоторых вариантах, по меньшей мере, одна нить содержит 3'-липкий конец, состоящий, по меньшей мере, из 2 нуклеотидов.

В некоторых вариантах днРНК, описанная в настоящей публикации, дополнительно содержит лиганд.

В некоторых вариантах лигандом является лиганд GalNAc.

В некоторых вариантах лиганд направляет днРНК в гепатоциты.

В некоторых вариантах лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой нити днРНК.

В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблице 2 или таблице 3. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, AD-59129, AD-59124, AD-58874, AD-59125, AD-59105, AD-59120, AD-59122, AD- 59106, AD-59126 или AD-59107, которые раскрыты в настоящем описании в примерах. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности дуплекса AD-58632. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей AD-59453, AD-59395, AD-59477 и AD-59492. В некоторых вариантах область комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из дуплекса, раскрытого в настоящем описании, который подавляет экспрессию мРНК ALAS1, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85% или 90%, например, судя по оценке с использованием анализа, описанного в примерах, приведенных в настоящем описании.

В некоторых вариантах днРНК содержит смысловую нить, состоящую из последовательности смысловой нити, выбранной из последовательностей, указанных в таблице 2 или таблице 3, и антисмысловую нить, состоящую из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблице 2 или таблице 3.

В некоторых вариантах днРНК содержит смысловую нить, состоящую из последовательности смысловой нити, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15, и антисмысловую нить, состоящую из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15. В некоторых вариантах днРНК содержит пару соответствующих смысловых и антисмысловых последовательностей, выбранных из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15.

В некоторых вариантах днРНК содержит смысловую нить, состоящую из последовательности смысловой нити, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, и антисмысловую нить, состоящую из антисмысловой последовательности, выбранной из последовательностей, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. В некоторых вариантах днРНК содержит пару соответствующих смысловых и антисмысловых последовательностей, выбранных из последовательностей дуплексов, указанных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20.

В одном аспекте изобретение относится к клетке, содержащей, по меньшей мере, одну из и-РНК (например, днРНК), охарактеризованную в настоящем описании. Клетка обычно представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека. В некоторых вариантах клетка является эритроидной клеткой. В других вариантах клетка является клеткой печени (например, гепатоцитом).

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, при этом композиция содержит и-РНК (например, днРНК), описанную в настоящей публикации.

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, и-РНК (например, днРНК) вводят в небуферном растворе. В некоторых вариантах небуферным раствором является физиологический раствор или вода.

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, и-РНК (например, днРНК вводят в небуферном растворе. В некоторых вариантах небуферный раствор содержит ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любое их сочетание. В некоторых вариантах буферный раствор представляет собой фосфатно-солевой буфер (PBS).

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, и-РНК (например, днРНК) нацелена на гепатоциты.

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, композицию вводят внутривенно.

В некоторых вариантах фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, композицию вводят подкожно.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция содержит и-РНК (например, днРНК), описанную в настоящей публикации, которая содержит лиганд (например, лиганд GalNAc), который направляет и-РНК (например, днРНК) к гепатоцитам.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция содержит и-РНК (например, днРНК), описанную в настоящей публикации, которая содержит лиганд (например, лиганд GalNAc), и фармацевтическую композицию вводят подкожно. В некоторых вариантах лиганд направляет и-РНК (например, днРНК) к гепатоцитам.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция, например, композиция, описанная в настоящей публикации, включает липидный препарат. В некоторых вариантах РНК-и-средство находится в препарате LNP, например, препарате MC3. В некоторых вариантах препарат LNP направляет РНК-и-средство к конкретной клетке, например, клетке печени, например, к гепатоциту. В некоторых вариантах липидный препарат представляет собой препарат LNP11. В некоторых вариантах композицию вводят внутривенно.

В другом варианте фармацевтическую композицию готовят для введения согласно схеме дозирования, описанной в настоящей публикации, например, не более чем один раз каждые четыре недели, не более чем один раз каждые три недели, не более чем один раз каждые две недели или не более чем один раз в неделю. В другом варианте введение фармацевтической композиции можно осуществлять в течение месяца или дольше, например, один, два, три или шесть месяцев, или в течение одного года или дольше.

В другом варианте композицию, содержащую и-РНК, охарактеризованную в изобретении, например, днРНК, мишенью которой является ALAS1, вводят с терапевтическим средством, не являющимся и-РНК, таким как средство, которое, как известно, лечит порфирию (например, AIP) или симптом порфирии (например, боль). В другом варианте композицию, содержащую и-РНК, охарактеризованную в изобретении, например, днРНК, мишенью которой является AIP, вводят вместе с применением терапевтической схемы, в которой не используют и-РНК, такой как введение гемина или глюкозы (например, инфузия глюкозы (например, внутривенная глюкоза)). Например, и-РНК, охарактеризованную в изобретении, можно вводить до, после или одновременно с глюкозой, декстрозой или сходным средством лечения, которое служит для восстановления энергетического баланса (например, полное парентеральное питание). и-РНК, охарактеризованную в изобретении, также можно вводить до, после или одновременно с введением продукта гема (например, гемина, аргината гема или гемальбумина), и необязательно также с сочетании с глюкозой (например, внутривенной глюкозой) или тому подобным.

Обычно глюкозу, вводимую для лечения порфирии, вводят внутривенно (в/в). Введение глюкозы внутривенно в настоящем описании называют «в/в-глюкоза». Однако также предполагаются альтернативные варианты, в которых глюкозу вводят другими способами.

В одном варианте ALAS1-и-РНК вводят пациенту и затем пациенту вводят средство, не являющееся и-РНК, или терапевтическую схему без и-РНК (например, глюкозу и/или продукт гема) (или наоборот). В другом варианте ALAS1-и-РНК и терапевтическое средство, не являющееся и-РНК, или терапевтическую схему без и-РНК вводят одновременно.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, при этом способ включает в себя: (a) введение в клетку и-РНК (например, днРНК), описанной в настоящей публикации, и (b) поддержание клетки со стадии (a) в течение периода времени, достаточного для получения распада транскрипта мРНК гена ALAS1, с ингибированием, тем самым, экспрессии гена ALAS1 в клетке.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ снижения или ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке (например, эритроидной клетке или в клетке печени, такой как, например, гепатоцит). При этом способ включает в себя:

(a) введение в клетку двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК), при этом днРНК содержит, по меньшей мере, две последовательности, которые комплементарны друг другу. днРНК имеет смысловую нить, имеющую первую последовательность, и антисмысловую нить, имеющую вторую последовательность; при этом антисмысловая нить имеет область комплементарности, которая в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части мРНК, кодирующей ALAS1, и при этом область комплементарности имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, т.е., 15-30 нуклеотидов и обычно имеет длину 19-24 нуклеотида, и при этом днРНК при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1, по меньшей мере, на 10%, например, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 40% или больше; и

(b) поддержание клетки со стадии (a) в течение периода времени, достаточного для распада транскрипта мРНК гена ALAS1, тем самым, снижая или ингибируя экспрессию гена ALAS1 в клетке.

В некоторых вариантах описанных выше способов ингибирования экспрессии ALAS1 в клетку, клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo. В некоторых вариантах клетка представляет собой гепатоцит.

В некоторых вариантах клетка присутствует в организме субъекта, нуждающегося в лечении, профилактике и/или контроле расстройства, связанного с экспрессией ALAS1.

В некоторых вариантах расстройством является порфирия. В некоторых вариантах порфирия представляет собой острую интермиттирующую порфирию или порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия является гомозиготной доминантной печеночной порфирией (например, гомозиготной доминантной AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтической порфирией. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В некоторых вариантах экспрессию ALAS1 ингибируют, по меньшей мере, на 30%.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) имеет IC50 в диапазоне 0,01-1 нМ.

В некоторых вариантах клетка (например, гепатоцит) является клеткой млекопитающего (например, клеткой человека, примата, отличного от человека, или грызуна).

В одном варианте клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка присутствует в организме субъекта (например, пациента, нуждающегося в лечении, профилактике и/или контроле расстройства, связанного с экспрессией ALAS1).

В одном варианте субъектом является млекопитающее (например, человек) для которого существует риск или у которого диагностирована порфирия, например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP или ночная порфирия), острая интермиттирующая порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия (CEP), поздняя кожная порфирия (PCT), наследственная копропорфирия (копропорфирия или HCP), смешанная порфирия (VP), эритропоэтическая протопорфирия (EPP) или временная эритропорфирия новорожденных. В некоторых вариантах расстройством является острая печеночная порфирия, например, порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP), AIP, HCP или VP. В конкретных вариантах расстройством является порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) или AIP.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP) наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В одном варианте введенная днРНК снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 в клетке.

В одном варианте введенная днРНК снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 или уровень одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, δ-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфопилиногена (PBG), гидроксиметилбилана (HMB), уропорфириногена I или III, копропорфириногена I или III, протопорфириногена IX и протопорфирина IX) или продуктов или метаболитов порфирина, по меньшей мере, на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или больше по сравнению с эталоном (например, необработанной клеткой или клеткой, обработанной не направленной к мишени контрольной днРНК). Без связи с какой-либо теорией полагают, что ALAS1 является первым ферментов порфиринового пути. Поэтому снижение экспрессии гена ALAS1 вероятно снижает уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов.

В других аспектах изобретение относится к способам лечения, профилактики или контроля патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1 (например, патологических процессов, в которые вовлечены порфирины, предшественники порфиринов или дефекты порфиринового пути, такие как, например, порфирии). В одном варианте способ включает в себя введение субъекту, например, пациенту, нуждающемуся в таком лечении, профилактике или контроле, эффективного (например, терапевтически или профилактически эффективного) количества одной или нескольких и-РНК, охарактеризованных в настоящем описании.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения и/или профилактики расстройства, связанного с экспрессией ALAS1, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества и-РНК (например, днРНК), описанной в настоящей публикации, или композиции, содержащей и-РНК (например, днРНК), описанной в настоящей публикации.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения и/или профилактики порфирии, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК), при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить длиной 15-30 пар оснований, и антисмысловая нить комплементарна, по меньшей мере, 15 непрерывно следующим друг за другом нуклеотидам последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 382.

В одном варианте субъект (например, пациент) имеет порфирию. В другом варианте для субъекта (например, пациента) существует риск развития порфирии. В некоторых вариантах введение и-РНК, нацеленной на ALAS1, облегчает или ослабляет тяжесть, по меньшей мере, одного симптома расстройства, связанного с ALAS1, у пациента.

В одном варианте субъектом является млекопитающее (например, человек), который подвержен риску или у которого было диагностировано расстройство, связанное с экспрессией ALAS1, например, порфирия, например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ночная порфирия), острая интермиттирующая порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия (CEP), поздняя кожная порфирия (PCT), наследственная копропорфирия (копропорфирия или HCP), смешанная порфирия (VP), эритропоэтическая протопорфирия (EPP) или временная эритропорфирия новорожденных. В следующем варианте порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP), AIP, HCP или VP. В некоторых таких вариантах расстройством является порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) или AIP.

В некоторых вариантах субъект имеет или подвергается риску развития порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В некоторых вариантах порфирия, симптом порфирии, продром или приступ порфирии индуцированы воздействием провоцирующего фактора, который описан в настоящей публикации. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является химическое воздействие. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является лекарственное средство, например, отпускаемое по рецепту лекарственное средство или безрецептурное лекарственное средство. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, фаза лютеинизации.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК вводят после острого приступа порфирии.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят во время острого приступа порфирии.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят профилактически, чтобы предотвратить острый приступ порфирии.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) готовят в виде препарата LNP.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) находится в форме конъюгата с GalNAc.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) вводят в дозе 0,05-50 мг/кг.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) вводят в концентрации 0,01 мг/кг - 5 мг/кг массы тела субъекта.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) готовят в виде препарата LNP и вводят в дозе 0,05-5 мг/кг.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) находится в форме конъюгата с GalNAc, и его вводят в дозе 0,5-50 мг/кг.

В некоторых вариантах способ снижает уровень порфирина или предшественника порфирина у субъекта.

В некоторых вариантах уровень снижается, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. В одном варианте уровень снижается, по меньшей мере, на 30%.

В некоторых вариантах предшественником порфирина является δ-аминолевулиновая кислота (ALA) или порфопилиноген (PBG). В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) имеет IC50 в диапазоне 0,01-1 нМ.

В некоторых вариантах способ, описанный в настоящей публикации

(i) ослабляет симптом, ассоциированный с расстройством, связанным с ALAS1 (например, порфирией);

(ii) ингибирует экспрессию ALAS1 у субъекта,

(iii) снижает уровень предшественника порфирина (например, ALA или PBG) или порфирина у субъекта,

(iv) снижает частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта, или

(v) снижает частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта, когда субъект подвергается воздействию провоцирующего фактора (например, предменструальной фазы или фазы лютеинизации).

В некоторых вариантах способ облегчает боль и/или прогрессирующую нейропатию.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят согласно схеме дозирования.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят до или во время острого приступа порфирии. В некоторых вариантах и-РНК вводят до острого приступа порфирии.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят во время продрома. В некоторых вариантах продром характеризуется болью в животе, тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), беспокойством и/или бессонницей.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят во время конкретно фазы менструального цикла, например, во время фазы лютеинизации. В некоторых вариантах способ ослабляет или предотвращает периодические приступы порфирии, например, благодаря снижению тяжести, продолжительности или частоты приступов. В некоторых вариантах периодические приступы ассоциированы с провоцирующим фактором. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, фаза лютеинизации.

В некоторых вариантах субъект имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. В некоторых вариантах субъект имеет или подвержен риску развития порфирии, например, печеночной порфирии. В некоторых вариантах у субъекта нет симптомов. В некоторых вариантах субъект несет генетическое изменение (например, генную мутацию), ассоциированное с порфирией, которое описано в настоящей публикации.

В некоторых вариантах субъект имеет или подвержен риску развития порфирии и страдает от боли (например, хронической боли, например, хронической нейропатической боли) и/или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии). В некоторых вариантах субъект не страдает от острых приступов, но страдает от боли (например, хронической боли, например, хронической нейропатической боли) и/или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии). В некоторых вариантах боль представляет собой боль в области живота.

В некоторых вариантах субъект (a) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG и (b) страдает от боли (например, хронической боли, например, хронической нейропатической боли) и/или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии). В некоторых вариантах боль представляет собой боль в области живота.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень в плазме и/или уровень в моче ALA и/или PBG, который повышен. В некоторых вариантах повышенный уровень ALA и/или PBG сопровождается другими симптомами, например, болью (например, хронической болью, например, хронической нейропатической болью) или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). В некоторых вариантах боль представляет собой боль в области живота. В некоторых вариантах у субъекта нет симптомов. В некоторых вариантах субъект имеет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, например, мутацию, которая описана в настоящей публикации.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, который повышен, например, уровень выше или выше или равен эталонному значению. В некоторых вариантах уровень выше эталонного значения. В некоторых вариантах эталонное значение на два стандартных отклонения выше среднего уровня в образце от здоровых индивидуумов. В некоторых вариантах эталонное значение является верхним пределом для эталона.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень в плазме и/или уровень в моче ALA и/или PBG, который выше или выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5-кратному верхнему пределу эталона. В используемом в настоящем описании смысле «верхний предел эталона» относится к уровню, который является верхним пределом 95% доверительного интервала для эталонного образца, например, образца от нормальных (например, дикого типа) или здоровых индивидуумов, например, индивидуумов, которые не несут генетической мутации, ассоциированной с порфирией, и/или индивидуумов, которые не страдают от порфирии. В некоторых вариантах субъект имеет уровень ALA и/или PBG в моче, который в 2-4 раза превышает верхний предел эталона. В некоторых вариантах субъект имеет уровень ALA и/или PBG в моче, который в 4 раза превышает верхний предел эталона.

В некоторых вариантах эталонное значения PBG в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в плазме, который превышает или выше или равен 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в плазме, который превышает или выше или равен 0,48 мкмоль/л.

В некоторых вариантах эталонное значение для PBG в моче составляет 1,2 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах эталонное значение для ALA в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в плазме, который превышает или выше или равен 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек и он имеет уровень ALA в плазме, который превышает или выше или равен 0,48 мкмоль/л.

В некоторых вариантах эталонное значение для ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в моче, который превышает или выше или равен 3,1 ммоль/моль креатинина, 6,2 ммоль/моль креатинина, 9,3 ммоль/моль креатинина, 12,4 ммоль/моль креатинина или 15,5 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах способ снижает повышенный уровень ALA и/или PBG. В некоторых вариантах способ уменьшает боль (например, хроническую боль, например хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). В некоторых вариантах боль представляет собой боль в области живота. В некоторых вариантах боль представляет собой нейропатическую боль (например, боль, ассоциированную с прогрессирующей нейропатией при острых порфириях). Уменьшение боли может включать, например, предотвращение боли, задержку появления боли, снижение частоты болей и/или снижение тяжести боли.

В некоторых вариантах способ ослабляет или предотвращает острые приступы порфирии, например, уменьшая тяжесть, продолжительность или частоту приступов.

В некоторых вариантах способ уменьшает или предотвращает повреждение нервов.

В некоторых вариантах способ предотвращает нарушения (например, предотвращает развитие аномалий) или приводит к улучшению клинических показателей, например, клинических показателей мышечной и/или нервной функции, например, ЭМГ и/или скорости проводимости нервов.

В некоторых вариантах способ является эффективным в отношении снижения уровня ALA и/или PBG (например, уровня ALA и/или PBG в плазме или моче). В некоторых вариантах способ является эффективным в отношении получения предварительно определяемого снижения повышенного уровня ALA и/или PBG.

В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является снижение до значения, которое меньше или равно эталонному значению. В некоторых вариантах эталонное значение является верхним пределом эталона. В некоторых вариантах эталонным значением является значение, которое на два стандартных отклонения выше среднего уровня в эталонном образце.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят многократно, например, согласно схеме дозирования.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят профилактически субъекту, который подвергается риску развития порфирии. В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят профилактически, начиная с пубертатного периода. В некоторых вариантах субъект несет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или имеет повышенный уровень ALA и/или PBG (например, повышенный уровень ALA и/или PBG в плазме или моче). В некоторых вариантах мутация делает индивидуума чувствительным к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, питания или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, который раскрыт в настоящем описании). В некоторых вариантах мутация ассоциирована с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). В некоторых вариантах мутация ассоциирована с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией).

В некоторых вариантах мутация представляет собой мутацию гена ALAS1. В некоторых вариантах мутация представляет собой мутацию в промоторе гена ALAS1 или в областях выше или ниже гена ALAS1. В некоторых вариантах мутация представляет собой мутацию в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. В некоторых вариантах мутация представляет собой мутацию в гене, который кодирует фермент пути биосинтеза гема.

В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) или композицию, содержащую и-РНК, вводят подкожно. В некоторых вариантах и-РНК находится в форме конъюгата с GalNAc. В некоторых вариантах и-РНК (например, днРНК) вводят в дозе 0,5-50 мг/кг.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает в себя введение субъекту двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК), при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить длиной 15-30 пар оснований, и антисмысловая нить комплементарна, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидам последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 382.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества днРНК или композиции, содержащей днРНК, которая описана в настоящей публикации.

В некоторых вариантах способы, описанные в настоящей публикации, являются эффективными в отношении снижения уровня ALA и/или PBG. В некоторых вариантах уровень ALA и/или PBG снижен так, что он ниже или ниже или равен эталонному значению, например, верхнему пределу эталона. В другом аспекте изобретение относится к способам снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке (например, эритроидной клетке или клетке печени, такой как, например, гепатоцит). В одном варианте клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка присутствует в организме субъекта (например, пациента, нуждающегося в лечении, профилактике и/или контроле расстройства, связанного с экспрессией ALAS1). Способ включает в себя осуществление контакта клетки с эффективным количеством одной или нескольких и-РНК, мишенью которых является ALAS1, например, одной или нескольких и-РНК, раскрытых в настоящем описании, тем самым, снижая уровень порфирина или предшественника порфирина в клетке; или снижая уровень порфирина или предшественника порфирина в других клетках, тканях или жидкостях в организме субъекта, в котором клетка находится; относительно уровня до осуществления контакта. Такие способы можно применять для лечения (например, ослабления тяжести) расстройств, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии, например, AIP или порфирии вследствие недостаточности дегидратазы ALA.

В одном варианте стадию осуществления контакта осуществляют ex vivo, in vitro или in vivo. Например, клетка может присутствовать в организме субъекта, например, млекопитающего (например, человека), подверженного риску развития порфирии, или у которого диагностирована порфирия. В одном варианте порфирия представляет собой острую печеночную порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP), и гепатоэритропоэтической порфирии. В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке, включающий в себя осуществление контакта клетки с и-РНК (например, днРНК), которая описана в настоящей публикации, в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке. В некоторых вариантах клеткой является гепатоцит. В некоторых вариантах порфирином или предшественником порфирина является δ-аминолевулиновая кислота (ALA), порфопилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (HMB), уропорфириноген I или III, копропорфириноген I или III, протопорфириноген IX или протопорфирин IX. В некоторых вариантах предшественником порфирина является ALA или PBG.

В одном варианте клетка является эритроидной клеткой. В следующем варианте клетка является клеткой печени (например, гепатоцитом).

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается вектор, кодирующий, по меньшей мере, одну нить и-РНК (например, днРНК), которая описана в настоящей публикации.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается вектор, кодирующий, по меньшей мере, одну нить днРНК, при этом указанная днРНК содержит область комплементарности, по меньшей мере, с частью мРНК, кодирующей ALAS1, при этом указанная днРНК имеет длину 30 пар оснований или меньше, и при этом указанная днРНК целенаправленно воздействует на указанную мРНК, приводит к ее расщеплению.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину, по меньшей мере, 15 нуклеотидов.

В некоторых вариантах область комплементарности имеет длину от 19 до 21 нуклеотида. В одном аспекте изобретение относится к вектору для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. В одном варианте вектор содержит и-РНК, которая описана в настоящей публикации. В одном варианте вектор содержит, по меньшей мере, одну регуляторную последовательность, оперативно связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует, по меньшей мере, одну нить и-РНК, которая описана в настоящей публикации. В одном варианте вектор содержит, по меньшей мере, одну нить и-РНК ALAS1.

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается клетка, содержащая вектор, который описан в настоящей публикации. В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается клетка, содержащая вектор для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. Вектор содержит регуляторную последовательность, оперативно связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует, по меньшей мере, одну нить одной из и-РНК, которые описаны в настоящей публикации. В одном варианте клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит). В другом варианте клетка является эритроидной клеткой.

Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие ссылки, упоминаемые в настоящем описании, включены в виде ссылки в полном объеме.

Подробности различных вариантов осуществления изобретения указаны в описании ниже. Другие признаки, цели и преимущества изобретения будут понятны из описания и чертежей и из формулы изобретения.

Описание чертежей

На фиг. 1 изображен путь биосинтеза гема.

На фиг. 2 суммированы некоторые порфирии, ассоциированные с генетическими ошибками в метаболизме гема.

На фиг. 3 изображен вариант 1 транскрипта последовательности мРНК ALAS1 человека (эталонная последовательность NM_000688.4 (GI:40316942, запись, датированная 19 ноября 2011), SEQ ID NO: 1).

На фиг. 4 изображен вариант 2 транскрипта последовательности мРНК ALAS1 человека (эталонная последовательность NM_000688.5 (GI: 362999011, запись, датированная 1 апреля 2012), SEQ ID NO: 382).

На фиг. 5 показана зависимость доза-ответ для ми-РНК AD-53558 в подавлении мРНК ALAS1 мыши (mALAS1) относительно PBS-контроля. Также показаны результаты для контроля с люциферазой (LUC) AD-1955.

На фиг. 6 показана зависимость доза-ответ для ми-РНК AD-53558 в подавлении мРНК ALAS1 у крыс относительно PBS-контроля. Также показаны результаты для контроля с люциферазой (LUC) AD-1955.

На фиг. 7 показана продолжительность подавления мРНК ALAS1 мыши (mALAS1) под действием ми-РНК AD-53558 относительно PBS-контроля.

На фиг. 8 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровня ALA в плазме (в мкМ) исходного уровня и после обработки фенобарбиталом в экспериментальной (ми-РНК ALAS1) и контрольной (ми-РНК LUC) группах.

На фиг. 9 показаны уровни ALA в плазме (в мкМ) отдельных животных исходного уровня и после обработки фенобарбиталом у животных, которые получали обработку ми-РНК ALAS1 и контрольную обработку (ми-РНК LUC).

На фиг. 10 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровней PBG в плазме (в мкМ) исходного уровня и после обработки фенобарбиталом у животных, которые получали обработку ми-РНК ALAS1 и контрольную обработку (ми-РНК LUC).

На фиг. 11 показаны уровни PBG в плазме (в мкМ) отдельных животных исходного уровня и после обработки фенобарбиталом у животных, которые получали обработку ми-РНК ALAS1 и контрольную обработку (ми-РНК LUC).

На фиг. 12 показан относительный уровень мРНК mALAS1 в печени на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у выбранных соответствующих экспериментальных (ми-РНК ALAS1) и контрольных (PBS) животных.

На фиг. 13 показано влияние трех GalNAc-конъюгированных ми-РНК mALAS1 на экспрессию mALAS1 (относительно PBS-контроля) в ткани печени мышей.

На фиг. 14 показаны уровни ALA и PBG в плазме с течением времени после введения фенобарбитала и обработки ми-РНК ALAS1 или контрольной ми-РНК LUC.

На фиг. 15 показано влияние GalNAc-конъюгированной ми-РНК ALAS1 на уровни ALA в плазме и уровни PBG в плазме в мышиной модели индуцированной фенобарбиталом AIP.

Подробное описание изобретения

и-РНК нацелена на специфичный для последовательности распад мРНК в результате процесса, известного как РНК-интерференция (РНК-и). В настоящей публикации описаны и-РНК и способы их применения для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или в организме млекопитающего, при этом мишенью и-РНК является ген ALAS1. Также предлагаются композиции и способы лечения расстройств, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии (например, порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP или ночная порфирия), острая интермиттирующая порфирия, врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), смешанная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (EPP), X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA) и временная эритропорфирия новорожденных).

Порфирии являются врожденными или приобретенными расстройствами, которые могут быть вызваны сниженной или усиленной активностью конкретных ферментов в пути биосинтеза гема, также называемым в настоящем описании путем порфирина (См. фиг. 1). Порфирины являются основными предшественниками гема. Порфирины и предшественники порфиринов включают δ-аминолевулиновую кислоту (ALA), порфопилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (HMB), уропорфириноген I или III, копропорфириноген I или III, протопорфириноген IX и протопорфирин IX. Гем является важной частью гемоглобина, миоглобина, каталаз, пероксидаз и цитохромов, при этом последние включают цитохромы дыхательной цепи и цитохромы P450 печени. Гем синтезируется в большинстве или во всех клетках человека. Примерно 85% гема образуется в эритроидных клетках, главным образом, для гемоглобина. Большая часть остального гема образуется в печени, 80% которого используется для синтеза цитохромов. Недостаточность специфичных ферментов в порфириновом пути приводит к недостаточной продукции гема, а также к накоплению предшественников порфиринов и/или порфиринов, которые в высоких концентрациях могут быть токсичными для функционирования клетки или органа.

Порфирии могут проявляться неврологическими осложнениями («острыми»), проблемами с кожей («кожными») или и тем и другим. Порфирии можно классифицировать по первичному месту сверхпродукции и накопления порфиринов или их предшественников. В случае печеночных порфирий порфирины и предшественники порфиринов преимущественно сверхпродуцируются в печени, тогда как в случае эритропоэтических порфирий порфирины сверхпродуцируются в эритроидных клетках в костях. Острые или печеночные порфирии приводят к нарушению функции нервной системы и неврологическим проявлениям, которые могут влиять как на центральную, так и на периферическую нервную систему, приводя к таким симптомам как, например, боль (например, боль в области живота и/или хроническая нейропатическая боль), рвоте, нейропатии (например, острой нейропатии, прогрессирующей нейропатии), мышечной слабости, судорогам, психическим нарушениям (например, галлюцинациям, депрессии и тревоге, паранойе), аритмиям сердца, тахикардии, запору и диарее. Кожные или эритропоэтические порфирии, главным образом, поражают кожу, вызывая такие симптомы, как повышенная чувствительность к свету, которая может быть болезненной, буллезным поражениям, некрозу, зуду, опуханию и усиленному росту волос в таких областях, как лоб. Последующая инфекция поражений кожи может приводить к потере костной и тканевой массы, а также рубцеванию, обезображиванию и утрате пальцев (например, пальцев рук и ног). Большинство порфирий вызваны мутациями, которые кодируют ферменты пути биосинтеза гема. Краткое описание порфирий, ассоциированных с генетическими ошибками метаболизма гема, представлено на фиг. 2.

Не все порфирии являются генетическими расстройствами. Например, у пациентов с заболеванием печени может развиваться порфирия в результате нарушения функции печени, и временная форма эритропорфирии (временная эритропорфирия новорожденных) была описана у новорожденных (См. публикацию Crawford, R.I. с соавторами, J. Am. Acad. Dermatol. 1995 Aug; 33(2 Pt 2): 333-6). Пациенты с PCT могут приобретать недостаточность активности уропорфириногендекарбоксилазы (URO-D), вследствие образования фермента ORO-D с более низкой по сравнению с нормальной ферментативной активностью (См. публикацию Phillips с соавторами Blood, 98: 3179-3185, 2001).

Острая интермиттирующая порфирия (AIP) (также называемая недостаточностью порфобилиноген (PBG)-дезаминазы или недостаточностью гидроксиметилбилансинтазы (HMBS)) является наиболее распространенным типом острой печеночной порфирии. Другие типы острых печеночных порфирий включают наследственную копропорфирию (HCP), смешанную порфирия (VP) и порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP). Острые печеночные порфирии описаны, например, в публикации Balwani M. and Desnick R.J., Blood, 120: 4496-4504, 2012.

AIP обычно является аутосомным доминантным заболеванием, которое характеризуется недостаточностью фермента порфобилиногендезаминазы (PBG-дезаминазы); указанный фермент также известен как гидроксиметилбилансинтаза (HMB-синтаза или HMBS). PBG-дезаминаза является третьим ферментом в пути биосинтеза гема (См. фиг. 1) и катализирует конденсацию «голова к хвосту» четырех молекул порфобилиногена в линейный тетрапиррол, гидроксиметилбилан (HMB). Были описаны альтернативно сплайсируемые варианты транскриптов, кодирующих разные изоформы PBG-дезаминазы. Мутации в гене PBG-дезаминазы ассоциированы с AIP. Такие мутации могут приводить к пониженным количествам PBG-дезаминазы и/или пониженной активности PBG-дезаминазы (у пораженных индивидуумов обычно имеет место ~50% снижение активности PBG-дезаминазы).

Существует, по меньшей мере, две разных модели патофизиологии AIP и других острых печеночных порфирий (См., например, Lin CS-Y с соавторами, Clinical Neurophysiology, 2011; 122:2336-44). Согласно одной модели пониженная продукция гема, возникающая, вследствие недостаточности PBG-дезаминазы, приводит к дефициту энергии и дегенерации аксонов. Согласно другой, более предпочтительной в настоящее время модели, накопление предшественников порфиринов (например, ALA и PBG) приводит к нейротоксичности.

Было обнаружено, что AIP распространена в некоторых популяциях с частотой 1 на 10000 (например, в Северной Швеции; См. Floderus Y. С соавторами, Clin Genet. 2002; 62: 288-97). Распространенность в общей популяции в Соединенных Штатах и Европе, за исключением Великобритании, оценивается примерно от 1 на 10000 до 1 на 20000. Клиническое заболевание проявляется само по себе только примерно у 10-15% индивидуумов, которые несут мутации, которые, как известно, ассоциированы с AIP. Однако пенетрантность у индивидуумов с некоторыми мутациями достигает 40% (например, в случае мутации W198X). AIP обычно не проявляется до пубертатного периода. Симптомы более распространены у женщин, чем у мужчин. Распространенность заболевания вероятно недооценена из-за неполной пенетрантности и длительных латентных периодов. В Соединенных Штатах, судя по оценкам, живет примерно 2000 пациентов, которые страдали, по меньшей мере, от одного приступа. Судя по оценкам, имеется примерно 150 активных повторных случаев во Франции, Великобритании и Польше; такими пациентами преимущественно являются молодые женщины среднего возраста 30 лет. См., например, публикацию Elder с соавторами, J. Inherit. Metab. Dis., опубликованную он-лайн 1 ноября, 2012.

AIP поражает, например, висцеральную, периферическую, автономную и центральную нервные системы. Симптомы AIP изменчивы и включают симптомы желудочно-кишечного тракта (например, тяжелую и плохо локализованную боль в области живота, тошноту/рвоту, запор, диарею, непроходимость кишечника), симптомы мочевой системы (дизурию, задержку мочеиспускания/недержание мочи или темную мочу), неврологические симптомы (например, сенсорную нейропатию, моторную нейропатию (например, поражение черепно-мозговых нервов и/или симптомы, приводящие к слабости рук и ног), судороги, нейропатическую боль (например, боль, ассоциированную с прогрессирующей нейропатией, например, хроническую нейропатическую боль), нейропсихиатрические симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинации, истерию, бред, апатию, депрессию, фобии, психоз, бессонницу, сонливость, кому), вовлечение автономной нервной системы (приводящее, например, к сердечно-сосудистым симптомам, таким как тахикардия, гипертония и/или аритмии, а также другие симптомы, такие как, например, повышенные уровни циркулирующего катехоламина, потливость, возбужденное состояние и/или тремор), обезвоживание и электролитные аномалии. Наиболее распространенными симптомами являются боль в области живота и тахикардия. Кроме того, пациенты часто имеют хроническую нейропатическую боль, и у них развивается прогрессирующая нейропатия. Пациенты с повторными приступами, часто имеют предвестники заболевания. Может возникать длительный паралич после тяжелого приступа. Восстановление после тяжелых приступов, которые своевременно не лечили, может занимать недели или месяцы. Острый приступ может быть смертельным, например, вследствие паралича дыхательных мышц или сердечно-сосудистой недостаточности из-за дисбаланса электролитов (См., например, Thunell S. Hydroxymethylbilane Synthase Deficiency. 2005 Sep. 27 [новая версия 11 сентября 2011]. В: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editors. GeneReviews(TM) [интернет]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993 (далее Thunell (1993)), которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме). До появления возможности лечения гемином до 20% пациентов с AIP умирали от заболевания.

У индивидуумов, которые несут гены для AIP, повышен риск возникновения гепатоклеточных видов рака. У пациентов с повторяющимися приступами риск гепатоклеточного рака особенно велик: после 50 лет риск примерно в 100 раз выше, чем в общей популяции.

Приступы острой порфирии могут быть спровоцированы эндогенными или экзогенными факторами. Механизмы, посредством которых такие факторы индуцируют приступы, могут включать например, повышенную потребность в печеночных ферментах P450 и/или индукцию активности ALAS1 в печени. Повышенная потребность в печеночных ферментах P450 приводит к уменьшению свободного гема в печени и, тем самым, к индукции синтеза печеночной ALAS1.

Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или неполноценной калорийности потребляемой пищи, вследствие жестких диет, занятий бегом на длинные дистанции и т.д.), метаболические стрессы (например, инфекции, хирургическую операцию, международные авиационные перелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, растворимые в липидах чужеродные химические вещества (включая, например, химические вещества, присутствующие в табачном дыму, некоторые лекарственные средства, отпускаемые по рецепту, органические растворители, биоциды, компоненты алкогольных напитков), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения во время предменструального периода), синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормонозаместительную терапию). См., например, Thunell (1993).

Более 1000 лекарственных средства противопоказано при острых печеночных порфириях (например, AIP, HCP, ADP и VP), включая, например, спирт, барбитураты, карбамазепин, карисопродол, клоназепам (высокие дозы), даназол, диклофенак и возможно другие НПВС, алкалоиды спорыньи, эстрогены, этхлорвинол, глутетимид, гризеофульвин, мефенитоин, мепробамат (также мебутамат и тибутамат), метиприлон, методопрамид, фенитоин, примидон, прогестерон и синтетические прогестины, пиразинамид, пиразолоны (аминопурин и антипирин), рифампин, сукцинимиды (этосуксимид и метсуксимид), сульфонамидные антибиотики и вальпроевую кислоту.

Объективные симптомы AIP включают изменение окраски мочи во время острого приступа (моча может казаться красной или красно-коричневой) и повышенные концентрации PBG и ALA в моче во время острого приступа. Молекулярно-генетическое тестирование выявляет мутации в гене PBG-дезаминазы (также известной как HMBS) у более чем 98% пораженных заболеванием людей. Thunell (1993).

Дифференциальная диагностика порфирий может включать в себя определение типа порфирии путем измерения индивидуальных уровней порфиринов или предшественников порфиринов (например, ALA, PBG) в моче, кале и/или плазме (например, с использованием хроматографии и флуорометрии) во время приступа. Диагноз AIP может быть подтвержден, благодаря установлению того, что активность PBG-дезаминазы эритроцитов составляет 50% или меньше от нормального уровня. ДНК-тестирование в отношении мутаций может быть осуществлено у пациентов и подверженных риску членов семьи. Диагноз AIP обычно подтверждают, используя тестирование ДНК, чтобы идентифицировать специфичную вызывающую заболевание генную мутацию (например, мутацию HMBS).

Лечение острых приступов обычно требует госпитализации, чтобы контролировать и лечить острые симптомы, включая, например, боль в области живота, судороги, обезвоживание/гипонатриемию, тошноту/рвоту, тахикардию/гипертонию, задержку мочеиспускания/непроходимость кишечника. Например, боль в области живота можно лечить, например, наркотическими анальгетиками, судороги можно лечить, принимая превентивные меры против судорог и возможно лекарственные средства (хотя многие противосудорожные лекарственные средства противопоказаны), тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотиазинами, и тахикардию/гипертонию можно лечить, например, бета-блокаторами. Лечение может включать в себя отмену опасных лекарственных средств, мониторинг дыхательной функции, а также мышечной силы и неврологического статуса. Слабые приступы (например, приступы без пареза или гипонатриемии) можно лечить, используя, по меньшей мере, 300 г внутривенной 10% глюкозы в сутки, хотя в последнее время все чаще немедленно дают гемин. Тяжелые приступы следует лечить как можно скорее, используя внутривенный гемин (3-4 мг/кг сутки в течение 4-14 дней) и внутривенную глюкозу, пока ожидают эффекта от внутривенного введения гемина. Обычно приступы лечат, используя внутривенный гемин в течение 4 дней и внутривенную глюкозу в период ожидания эффекта от введения внутривенного гемина.

Гемин (пангематин® или гемин для инъекций, ранее известный как гематин) является единственным продуктом гема, разрешенным к применению в Соединенных Штатах, и был первым лекарственным средством, разрешенным законом о лекарственных средствах для лечения редких заболеваний. Пангематин® представляет собой гемин, полученный из обработанных эритроцитов (PRBC), и является протопорфирином IX, содержащим ион трехвалентного железа (гем B) с хлоридным лигандом. Гем действует, ограничивая синтез порфирина в печени и/или костном мозге. Точный механизм, посредством которого гемин вызывает симптоматическое улучшение у пациентов с острыми эпизодами печеночных порфирий, не установлен; однако его действие вероятно является следствием (обратного) ингибирования синтазы δ-аминолевулиновой кислоты (ALA), фермента, который ограничивает скорость пути биосинтеза порфирина/гема. См. этикетку к продукту пангемину®, Lundbeck, Inc., October 2010. Ингибирование ALA-синтазы должно приводить к пониженной продукции ALA и PBG, а также порфиринов и промежуточных продуктов синтеза порфиринов.

Недостатки гемина включают его замедленное влияние на клинические симптомы и его неспособность предотвращать рецидивы приступов. Неблагоприятные реакции, ассоциированные с введением гемина, могут включать тромбофлебит, антикоагулирующее действие, тромбоцитопению, остановку работы почек или перенасыщение железом, которое особенно вероятно у пациентов, которым требуются многократные курсы лечения гемином в связи с повторными приступами. Чтобы предотвратить флебит, необходим постоянный венозный катетер для доступа у пациентов с повторяющимися приступами. Необычные побочные эффекты включают лихорадку, болевые ощущения, недомогание, гемолиз, анафилаксию и циркуляционный коллапс. См. Anderson, K.E., Approaches to Treatment and Prevention of Human Porphyrias, in The Porphyrin Handbook: Medical Aspects of Porphyrins, Edited by Karl M. Kadish, Kevin M. Smith, Roger Guilard (2003)(далее Anderson).

Гем трудно получить в стабильной форме для внутривенного введения. Он нерастворим при нейтральном значении pH, но может быть получен в виде гидроксида гема при pH 8 или выше (Anderson). Пангематин представляет собой лиофилизированный препарат гемина. Когда лиофилизированный гемин растворяют для внутривенного введения, быстро образуются продукты распада; такие продукты распада ответственны за временное антикоагулянтное действие и флебит в месте инфузии (Anderson). Гемальбумин и аргинат гема (нормосанг, европейский вариант гемина) являются более стабильными и потенциально могут в меньшей степени вызывать тромбофлебит. Однако аргинат гема не разрешен для применения в Соединенных Штатах. Пангемин может быть стабилизирован при его солюбилизации для инфузии в 30% альбумине человека, а не в стерильной воде; однако, альбумин усиливает эффекты увеличения внутрисосудистого объема и повышает стоимость лечения, а также риск попадания патогенов, так как его выделяют из крови человека. См., например, публикацию Anderson.

Успешное лечение острого приступа не предотвращает или не задерживает появления рецидива. Возникает вопрос, может ли сам гемин запускать повторяющиеся приступы, вследствие индукции гемоксигеназы. При этом в некоторых регионах (особенно во Франции) молодых женщин с многократными повторяющимися приступами лечат еженедельным введением гемина в профилактических целях.

Ограниченный опыт по трансплантации печени свидетельствует о том, что в случае успеха это приводит к эффективному лечению AIP. Проведено примерно 12 трансплантаций пациентам в Европе с излечением или различными эффектами. Трансплантация печения может восстанавливать нормальную экскрецию ALA и PBG и предотвращать острые приступы. См., например, публикацию Dar F.S. с соавторами (Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 9(1): 93-96 (2010)). Кроме того, если печень пациента с AIP трансплантировать другому пациенту («трансплантация по принципу домино»), у пациента, получающего трансплантат, может развиваться AIP.

Среди длительных клинических эффектов острых порфирий имеет место хроническая нейропатическая боль, которая может возникать в результате прогрессирующей нейропатии, вследствие нейротоксических эффектов, например, повышенных уровней предшественников порфиринов (например, ALA и/или PBG). Пациенты могут страдать от нейропатической боли до или во время острого приступа. Пациенты пожилого возраста с возрастом могут испытывать усиленную нейропатическую боль, по поводу которой обычно назначают различные наркотические лекарственные средства. Нарушения на электромиограммах и уменьшенное время проведения возбуждения было документально подтверждено у пациентов с острыми печеночными порфириями. Следует отметить, что у необработанных, не подвергаемых индукции мышей с AIP (недостаточность PBG-дезаминазы) развивается прогрессирующая моторная нейропатия, которая, как было показано, вызывает прогрессирующую дегенерацию и утрату аксонов четырехглавой мышцы и, предположительно, вследствие конститутивно повышенных уровней предшественников порфирина (ALA и PBG), недостаточности порфиринов и/или гема (Lindberg с соавторами, J. Clin. Invest., 103(8): 1127-1134, 1999). У пациентов с острой порфирией (например, ADP, AIP, HCP или VP) уровни предшественников порфиринов (ALA и PBG) часто повышены у пациентов, не имеющих симптомов, и у пациентов с симптомами между приступами. Таким образом, предполагается, что снижение уровней предшественников порфиринов и восстановление нормального процесса биосинтеза гема за счет снижения уровня экспрессии и/или активности ALAS1, предотвращает и/или минимизирует развитие хронической и прогрессирующей нейропатии. Лечение, например, хроническое лечение (например, периодическое лечение с использованием и-РНК, которая описана в настоящей публикации, например, лечение в соответствии со схемой дозирования, которая описана в настоящей публикации, например, лечение еженедельно или раз в две недели) может непрерывно снижать экспрессию ALAS1 у пациентов с острой порфирией, которые имеют повышенные уровни предшественников порфиринов, порфиринов, продуктов порфиринов или их метаболитов. Такое лечение может быть осуществлено при необходимости, чтобы предотвратить или уменьшить частоту или тяжесть симптомов у отдельных пациентов (например, боль и/или нейропатию) и/или снизить уровень предшественника порфирина, порфирина, продукта или метаболита порфирина.

Существует необходимость в идентификации новых терапевтических средств, которые можно применять для лечения порфирий. Как обсуждалось выше, существующие средства лечения, такие гемин, имеют многочисленные недостатки. Например, влияние гемина на клинические симптомы замедлено, он дорого стоит, и он может иметь побочные эффекты (например, тромбофлебит, антикоагулирующее действие, тромбоцитопению, перенасыщение железом, остановку работы почек). Новые терапевтические средства, такие как средства, описанные в настоящей публикации, могут устранить такие недостатки и обеспечить неудовлетворенную потребность пациентов, например, действуя быстрее, не индуцируя флебит, обеспечивая возможность подкожного введения, успешно предотвращая повторные приступы, предотвращая или ослабляя боль (например, хроническую нейропатическую боль) и/или прогрессирующую нейропатию, и/или не вызывая некоторых неблагоприятных эффектов, ассоциированных с гемином (например, перенасыщение железом, повышенный риск возникновения гепатоклеточного рака).

Настоящее изобретение относится к способам и композициям и-РНК для модулирования экспрессии гена ALAS1. В некоторых вариантах экспрессию ALAS1 снижают или ингибируют, используя ALAS1-специфичную и-РНК, что приводит к пониженной экспрессии гена ALAS1. Пониженная экспрессия гена ALAS1 может снижать уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов. Пониженная экспрессия гена ALAS1, а также связанные снижения уровня одного или нескольких предшественников порфиринов и/или порфиринов могут быть полезны при лечении расстройств, связанных с экспрессией ALAS1, например, порфирий.

и-РНК в композициях, охарактеризованных в настоящем описании, включают РНК-нить (антисмысловую нить), имеющую область, которая имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, т.е., длиной 15-30 нуклеотидов, обычно длиной 19-24 нуклеотида, и такая область в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта мРНК гена ALAS1 (также называемую в настоящем описании «ALAS1-специфичной и-РНК»). Применение такой и-РНК делает возможным целенаправленный распад мРНК генов, которые вовлечены в патологии, ассоциированные с экспрессией ALAS1 у млекопитающих, например, порфирии, такие как порфирия с недостаточностью ALA-дегидрогеназы (ночная порфирия) или острая интермиттирующая порфирия. Очень низкие дозы ALAS1-специфичных и-РНК могут специфично и эффективно опосредовать РНК-и, приводящую к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1. и-РНК, мишенью которой является ALAS1, может специфично и эффективно опосредовать РНК-и, приводящую к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1, например, в основанных на клетках анализах. Таким образом, способы и композиции, содержащие такие и-РНК, применимы для лечения патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии (например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ночная порфирия), острая интермиттирующая порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), смешанная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (EPP) и временная эритропорфирия новорожденных).

В следующем далее описании раскрыто, как получать и применять композиции, содержащие и-РНК, чтобы ингибировать экспрессию гена ALAS1, а также композиции и способы лечения заболеваний и расстройств, вызванных или модулированных экспрессией такого гена. Варианты фармацевтических композиций, охарактеризованных в изобретении, включают и-РНК, имеющую антисмысловую нить, содержащую область, которая имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, обычно длиной 19-24 нуклеотида, и такая область в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта мРНК гена ALAS1, наряду с фармацевтически приемлемым носителем. Варианты композиций, охарактеризованных в изобретении, также включают в себя и-РНК, имеющую антисмысловую нить, содержащую область комплементарности, которая имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, обычно длиной 19-24 нуклеотида, и в значительной степени комплементарна, по меньшей мере, части транскрипта РНК гена ALAS1.

Соответственно, в некоторых аспектах в изобретении охарактеризованы фармацевтические композиции, содержащие и-РНК ALAS1 и фармацевтически приемлемый носитель, способы применения композиций для ингибирования экспрессии гена ALAS1 и способы применения фармацевтических композиций для лечения расстройств, связанных с экспрессией ALAS1.

I. Определения

Для удобства ниже приведены значения некоторых терминов и фраз, используемых в описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения. Если есть явное расхождение между использованием термина в других частях настоящего описания и его определением, приведенным в настоящем разделе, определение в данном разделе имеет преимущественную силу.

Каждый из «G», «C», «A», «T» и «U» означает нуклеотид, который содержит гуанин, цитозин, аденин, тимидин и урацил в качестве основания, соответственно. Однако, будет понятно, что термин «рибонуклеотид» или «нуклеотид» также может относиться к модифицированному нуклеотиду, который подробно описан ниже, или к заменяющему остатку. Специалисту хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть заменены другими остатками без существенного изменения, относящихся к спариванию оснований свойств олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такой заменяющий остаток. Например, и без ограничения нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может образовывать пары оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть заменены в нуклеотидных последовательностях днРНК, охарактеризованной в изобретении, нуклеотидом, содержащим, например, инозин. В другом примере, аденин и цитозин в любом месте олигонуклеотида могут быть заменены гуанином и урацилом, соответственно, с образованием неоднозначных пар оснований G-U с мРНК-мишенью. Последовательности, содержащие такие заменяющие остатки, являются подходящими для композиций и способов, охарактеризованных в изобретении.

В используемом в настоящем описании смысле «ALAS1» (также известный как ALAS-1; δ-аминолевулинатсинтаза 1; δ-ALA-синтаза 1; синтаза 1 5'-аминолевулиновой кислоты 1; ALAS-H; ALASH; ALAS-N; ALAS3; EC2.3.1.37; 5-аминолевулинатсинтаза, неспецифичная митохондриальная; ALAS; MIG4; OTTHUMP00000212619; OTTHUMP00000212620; OTTHUMP00000212621; OTTHUMP00000212622; индуцирующий миграцию белок 4; EC 2.3.1) относится к кодируемому в ядре митохондриальному ферменту, который является первым и обычно ограничивающим скорость ферментом в пути биосинтеза гема млекопитающих. ALAS1 катализирует конденсацию глицина с сукцинил-CoA с образованием δ-аминолевулиновой кислоты (ALA). Ген ALAS1 человека экспрессируется повсеместно, находится в хромосоме 3p21.1 и обычно кодирует последовательность из 640 аминокислот. Напротив, ген ALAS-2, который кодирует изозим, экспрессируется только в эритроцитах, находится в хромосоме Xp11.21 и обычно кодирует последовательность длиной 550 аминокислот. В используемом в настоящем описании смысле «белок ALAS1» означает любой вариант белка ALAS1 из любого вида (например, человека, мыши, примата, отличного от человека), а также любые его мутанты и фрагменты, которые сохраняют активность ALAS1. Подобным образом «транскрипт ALAS» относится к любому варианту транскрипта ALAS1 из любого вида (например, человека, мыши, примата, отличного от человека). Последовательность транскрипта мРНК варианта 1 ALAS1 человека можно найти под номером NM_000688.4 (фиг. 3; SEQ ID NO: 1). Другой вариант, транскрипт мРНК варианта 2 ALAS1 человека можно найти под номером NM_000688.5 (фиг. 4; SEQ ID NO: 382). Уровень зрелого кодируемого ALAS1 белка регулируется гемом: высокие уровни гема понижающим образом регулируют зрелый фермент в митохондриях, тогда как низкие уровни гема приводят к повышающей регуляции. Идентифицированы множественные альтернативно сплайсируемые варианты, кодирующие один и тот же белок.

В используемом в настоящем описании смысле термин «и-РНК», «РНК-и», «и-РНК-средство» или «РНК-и-средство» относится к средству, которое содержит РНК в соответствии с термином, который определен в настоящем описании, и которое опосредует целенаправленное расщепление РНК-транскрипта, например, посредством путем РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC). В одном варианте и-РНК, которая описана в настоящей публикации, осуществляет ингибирование экспрессии ALAS1. Ингибирование экспрессии ALAS1 можно оценить на основе снижения уровня мРНК ALAS1 или снижения уровня белка ALAS1. В используемом в настоящем описании смысле «последовательность-мишень» относится к непрерывной части нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образованной в ходе транскрипции гена ALAS1, включая мРНК, которая является продуктом РНК-процессинга первичного продукта транскрипции. Часть-мишень последовательности будет, по меньшей мере, такой длины, которая достаточна для того, чтобы она служила субстратом для и-РНК-направленного расщепления в такой части или вблизи такой части. Например, последовательность-мишень в общем может быть длиной 9-36 нуклеотидов, например, длиной 15-30 нуклеотидов, включая все поддиапазоны между указанными значениями. В качестве не ограничивающих примеров последовательность-мишень может быть длиной 15-30 нуклеотидов, 15-26 нуклеотидов, 15-23 нуклеотида, 15-22 нуклеотида, 15-21 нуклеотид, 15-20 нуклеотидов, 15-19 нуклеотидов, 15-18 нуклеотидов, 15-17 нуклеотидов, 18-30 нуклеотидов, 18-26 нуклеотидов, 18-23 нуклеотида, 18-22 нуклеотида, 18-21 нуклеотид, 18-20 нуклеотидов, 19-30 нуклеотидов, 19-26 нуклеотидов, 19-23 нуклеотида, 19-22 нуклеотида, 19-21 нуклеотид, 19-20 нуклеотидов, 20-30 нуклеотидов, 20-26 нуклеотидов, 20-25 нуклеотидов, 20-24 нуклеотида, 20-23 нуклеотида, 20-22 нуклеотида, 20-21 нуклеотид, 21-30 нуклеотидов, 21-26 нуклеотидов, 21-25 нуклеотидов, 21-24 нуклеотида, 21-23 нуклеотида или 21-22 нуклеотида.

В используемом в настоящем описании смысле термин «нить, содержащая последовательность» относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь нуклеотидов, которая описана последовательностью, обозначаемой с использованием стандартной номенклатуры нуклеотидов.

В используемом в настоящем описании смысле, и если не указано иное, термин «комплементарная» при использовании для описании первой нуклеотидной последовательности в сравнении со второй нуклеотидной последовательностью относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизоваться и образовывать структуру дуплекса в некоторых условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, что будет понятно специалисту. Такие условия могут представлять собой, например, жесткие условия, при этом жесткие условия могут включать: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES pH 6,4, 1 мМ EDTA, 50°C или 70°C в течение 12-16 часов с последующей промывкой. Могут быть применимы другие условия, такие как физиологически подходящие условия, которые могут иметь место в нутрии организма. Специалист сможет определить набор условий, наиболее подходящих для проверки комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизуемых нуклеотидов.

Комплементарные последовательности в и-РНК, например, в днРНК, которая описана в настоящей публикации, включают спаривание оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, по всей длине одной или обеих нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности могут быть названы в настоящем описании «полностью комплементарными» друг другу. Однако когда первую последовательность называют в настоящем описании «в значительной степени комплементарной» второй последовательности, две последовательности могут быть полностью комплементарными или они могут образовывать одну или несколько, но обычно не более 5, 4, 3 или 2 несовпадающих пар оснований при гибридизации в случае дуплекса длиной до 30 пар оснований, хотя при этом сохраняют способность гибридизоваться в условиях, наиболее подходящих для конечного применения, например, ингибирования экспрессии генов посредством пути RISC. Однако, когда два олигонуклеотида сконструированы для образования при гибридизации одного или нескольких однонитевых выступающих концов, такие выступающие концы не следует считать несовпадениями оснований при определении комплементарности. Например, днРНК, содержащая один олигонуклеотид длиной 21 нуклеотид и другой олигонуклеотид длиной 23 нуклеотида, в которой более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которые полностью комплементарны более короткому олигонуклеотиду, все еще можно называть «полностью комплементарной в целях, описанных в настоящей публикации.

«Комплементарные» последовательности в используемом в настоящем описании смысле также могут включать в себя или могут быть полностью образованы парами оснований, не соответствующими модели Уотосона-Крика, и/или парами оснований, образованными из неприродных и модифицированных нуклеотидов, в такой мере, чтобы были удовлетворены указанные выше требования в отношении их способности к гибридизации. Такие не соответствующие модели Уотсона-Крика пары оснований включают без ограничения неоднозначное спаривание оснований G:U или Хустиновские пары оснований.

Термины «комплементарные», «полностью комплементарные» и «в значительной степени комплементарные» в настоящем описании могут быть использованы по отношению к спариванию основания между смысловой нитью и антисмысловой нитью днРНК или между антисмысловой нитью и-РНК-средства и последовательностью-мишенью, что будет понятно в контексте их применения.

В используемом в настоящем описании смысле полинуклеотид, который «в значительной степени комплементарен», по меньшей мере, части матричной РНК (мРНК), относится к полинуклеотиду, который в значительной степени комплементарен непрерывной части, представляющей интерес мРНК (например, мРНК, кодирующей белок ALAS1). Например, полинуклеотид комплементарен, по меньшей мере, части мРНК ALAS1, если последовательность в значительной степени комплементарная непрерывной части мРНК, кодирующей ALAS1. В качестве другого примера полинуклеотид комплементарен, по меньшей мере, части мРНК ALAS1, если последовательность в значительной степени комплементарна непрерывной части мРНК, кодирующей ALAS1.

Термин «двунитевая РНК» или «днРНК» в используемом в настоящем описании смысле относится к и-РНК, которая включает молекулу РНК или комплекс молекул, имеющих гибридизуемую область дуплекса, которая содержит две антипараллельных и в значительной степени комплементарных нитей нуклеиновой кислоты, которые могут быть обозначены, как имеющие «смысловую» и «антисмысловую» ориентации по отношению к РНК-мишени. Область дуплекса может быть любой длины, которая обеспечивает возможность специфичного распада требуемой РНК-мишени, например, посредством пути RISC, но обычно будет иметь длину в диапазоне от 9 до 36 пар оснований, например, длину 15-30 пар оснований. При рассмотрении дуплекса длиной от 9 до 36 пар оснований дуплекс может быть любой длины в данном диапазоне, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36, и любом поддиапазоне в данном диапазоне, включая без ограничения 15-30 пар оснований, 15-26 пар оснований, 15-23 пары оснований, 15-22 пары оснований, 15-21 пару оснований, 15-20 пар оснований, 15-19 пар оснований, 15-18 пар оснований, 15-17 пар оснований, 18-30 пар оснований, 18-26 пар оснований, 18-23 пары оснований, 18-22 пары оснований, 18-21 пару оснований, 18-20 пар оснований, 19-30 пар оснований, 19-26 пар оснований, 19-23 пары оснований, 19-22 пары оснований, 19-21 пару оснований, 19-20 пар оснований, 20-30 пар оснований, 20-26 пар оснований, 20-25 пар оснований, 20-24 пары оснований, 20-23 пары оснований, 20-22 пары оснований, 20-21 пару оснований, 21-30 пар оснований, 21-26 пар оснований, 21-25 пар оснований, 21-24 пары оснований, 21-23 пары оснований или 21-22 пары оснований. днРНК, образованные в клетке в результате процессинга с участием дайсер-фермента и сходных ферментов обычно имеют длину в диапазоне 19-22 пары оснований. Одна нить области дуплекса днДНК содержит последовательность, которая в значительной степени комплементарна области РНК-мишени. Две нити, образующие структуру дуплекса, могут быть из одной молекулы РНК, имеющей, по меньшей мере, одну самокомплементарную область, или могут быть образованы из двух или более отдельных молекул РНК. В том случае, когда область дуплекса образована из двух нитей одной молекулы, молекула может иметь область дуплекса, разделенную однонитевой цепью нуклеотидов (называемой в настоящем описании «петлей типа шпильки»), находящейся между 3'-концом одной нити и 5'-концом соответствующей другой нити, образующих структуру дуплекса. Петля типа шпильки может содержать, по меньшей мере, одни неспаренный нуклеотид; в некоторых вариантах петля типа шпильки может содержать, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 23 или больше неспаренных нуклеотидов. В том случае, когда две в значительной степени комплементарные нити днРНК состоят из отдельных молекул РНК, такие молекулы не обязательно, но могут быть ковалентно связаны. В том случае, когда две нити ковалентно связаны другим образом, отличным от петли типа шпильки, соединяющую структуру называют «линкером». Термин «ми-РНК» также используют в настоящем описании по отношению к днРНК, которая описана выше.

В другом варианте и-РНК-средство может представлять собой «однонитевую ми-РНК», которую вводят в клетку или организм для ингибирования мРНК-мишени. Средства в виде однонитевых РНК-и связываются с RISC-эндонуклеазой Argonaute 2, которая затем расщепляет мРНК-мишень. Однонитевые ми-РНК обычно имеют длину 15-30 нуклеотидов и химически модифицированы. Конструирование и тестирование однонитевых ми-РНК описано в патенте США № 8101348 и в публикации Lima с соавторами (2012), Cell 150: 883-894, при этом полное содержание каждой из публикаций включено в настоящее описание в виде ссылки. Любую из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей публикации, (например, последовательности, представленные в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20) можно применять в качестве однонитевой ми-РНК, которая описана в настоящей публикации, или в после химической модификации способами, описанными Lima с соавторами, (2012) Cell 150: 883-894.

В другом аспекте РНК-средство представляет собой «однонитевую антисмысловую молекулу РНК». Однонитевая антисмысловая молекула РНК комплементарная последовательности в мРНК-мишени. Однонитевые антисмысловые молекулы РНК могут ингибировать трансляцию стехиометрическим образом за счет спаривания оснований с мРНК и создания физического препятствия для аппарата трансляции, См. публикацию Dias N. С соавторами (2002) Mol. Cancer. Ther. 1: 347-355. Альтернативно однонитевые антисмысловые молекулы ингибируют мРНК-мишень за счет гибридизации с мишенью и расщепления мишени в результате события расщепления РНК-азой H. Однонитевая антисмысловая молекула РНК может иметь длину примерно от 10 до примерно 30 нуклеотидов и иметь последовательность, которая комплементарна последовательности-мишени. Например, однонитевая антисмысловая молекула РНК может содержать последовательность, которая представляет собой, по меньшей мере, примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов из любой из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей публикации, например, последовательностей, представленных в любой из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20.

Специалисту в данной области будет понятно, что термины «молекула РНК» или «молекула рибонуклеиновой кислоты» охватывают не только молекулы РНК, которые экспрессируются и встречаются в природе, но также аналоги и производные РНК, содержащие один или несколько аналогов или производных рибонуклеотидов/рибонуклеозидов, которые описаны в настоящей публикации или которые известны в данной области. Строго говоря, «рибонуклеозид» включает нуклеозидное основание и сахар рибозу, а «рибонуклеотид» представляет собой рибонуклеозид с одним, двумя или тремя остатками фосфата. Однако термины «рибонуклеозид» и «рибонуклеотид» можно считать эквивалентными в используемом в настоящем описании смысле. РНК может быть модифицирована в структуре оснований нуклеотидов или в структуре рибозо-фосфатного остова, например, как описано в настоящей публикации ниже. Однако молекулы, содержащие аналоги или производные рибонуклеозидов, должны сохранять способность образовывать дуплекс. В качестве не ограничивающих примеров молекула РНК также включает в себя, по меньшей мере, один модифицированный рибонуклеозид, включая без ограничения модифицированный 2'-O-метилом нуклеозид, нуклеозид, содержащий 5'-фосфоротиоатную группу, концевой нуклеозид, связанный с производным холестерина или группой бисдециламида додекановой кислоты, закрытый нуклеозид, лишенный основания нуклеозид, модифицированный 2'-дезокси-2'-фтором нуклеозид, 2'-амино-модифицированный нуклеозид, 2'-алкил-модифицированный нуклеозид, морфолинонуклеозид, содержащий фосфорамидат или неприродное основание нуклеозид или любое их сочетание. Альтернативно молекула РНК может содержать, по меньшей мере, два модифицированных рибонуклеозида, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или больше до полной длины молекулы днРНК. Модификации не должны быть обязательно одинаковыми в случае каждого из множества модифицированных рибонуклеозидов в молекуле РНК. В одном варианте модифицированные РНК, которые предполагают применять в способах и композициях, описанных в настоящей публикации, представляют собой пептидонуклеиновые кислоты (ПНК), которые обладают способностью образовывать требуемую структуру дуплекса и которые обеспечивают возможность или опосредуют специфичный распад РНК-мишени, например, посредством пути RISC.

В одном аспекте модифицированный рибонуклеозид включает дезоксирибонуклеозид. В таком случае средство в виде и-РНК может содержать один или несколько дезоксинуклеозидов, включая, например, дезоксинуклеозидный липкий конец(цы) или один или несколько дезоксинуклеозидов в двунитевой части днРНК. Однако, само собой разумеется, что ни при каких обстоятельствах термин «и-РНК» не охватывает молекулу двунитевой ДНК.

В одном аспекте средство для РНК-интерференции включает однонитевую РНК, которая взаимодействует с последовательностью РНК-мишени, запуская расщепление РНК-мишени. Не имея намерения быть связанными с какой-либо теорией, полагают, что длинная двунитевая РНК, вводимая в клетки, разрушается с образованием ми-РНК эндонуклеазой типа III, известной как эндонуклеаза Дайсер (Sharp с соавторами, Genes Dev. 2001, 15: 485). Дайсер, фермент рибонуклеаза типа III, процессирует днРНК на короткие интерферирующие РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными 3'-линейными концами длиной в два основания (Bernstein с соавторами, (2001) Nature 409: 363). Затем ми-РНК включаются в РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга (RISC), где одна или несколько геликаз расплетают дуплекс ми-РНК, позволяя комплементарной антисмысловой нити осуществлять узнавание мишени (Nykanen с соавторами, (2001) Cell 107: 309). После связывания с соответствующей мРНК-мишенью, одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляют мишень, индуцируя сайленсинг (Elbashir с соавторами (2001) Genes Dev. 15: 188). Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к однонитевой РНК, которая стимулирует образование комплекса RISC, чтобы вызвать сайленсинг гена-мишени.

В используемом в настоящем описании смысле термин «нуклеотидный липкий конец» относится, по меньшей мере, к одному неспаренному нуклеотиду, который выдается из структуры дуплекса и-РНК, например, днРНК. Например, когда 3'-конец одной нити днРНК выступает за пределы 5'-конца другой нити или наоборот, имеет место нуклеотидный липкий конец. днРНК может содержать липкий конец длиной, по меньшей мере, в один нуклеотид; альтернативно липкий конец может содержать, по меньшей мере, два нуклеотида, по меньшей мере, три нуклеотида, по меньшей мере, четыре нуклеотида, по меньшей мере, пять нуклеотидов или больше. Нуклеотидный липкий конец может содержать или состоять из аналога нуклеотида/нуклеозида, включая дезоксинуклеотид/нуклеозид. липкий конец(цы) может быть на смысловой нити, антисмысловой нити или их сочетании. Кроме того, нуклеотид(ды) липкого конца может присутствовать на 5'-конце, 3'-конце или обоих концах либо антисмысловой, либо смысловой нити днРНК.

В одном варианте антисмысловая нить днРНК имеет липкий конец из 1-10 нуклеотидов на 3'-конце и/или 5'-конце. В одном варианте смысловая нить днРНК имеет липкий конец из 1-10 нуклеотидов на 3'-конце и/или 5'-конце. В другом варианте один или несколько нуклеотидов липкого конца заменяют тиофосфатом нуклеозида.

Термины «тупой» или «имеющий тупые концы» в используемом в настоящем описании смысле в отношении днРНК означает, что нет неспаренных нуклеотидов или аналогов нуклеотидов на данном конце днРНК, т.е., не нуклеотидного липкого конца. Один или оба конца днРНК могут быть тупыми. В том случае, когда оба конца днРНК являются тупыми, говорят, что днРНК имеет тупые концы. Для ясности «имеющая тупые концы» днРНК представляет собой днРНК, которая является тупой на обоих концах, т.е., нет нуклеотидного липкого конца ни одном конце молекулы. Чаще всего такая молекула будет двунитевой на протяжении всей ее длины.

Термин «антисмысловая нить» или «направляющая нить» относится к нити и-РНК, например, днРНК, которая содержит область, которая в значительной степени комплементарна последовательности-мишени. В используемом в настоящем описании смысле термин «область комплементарности» относится к области на антисмысловой нити, которая в значительной степени комплементарна последовательности, например, последовательности-мишени, которая определена в настоящем описании. В том случае, когда область комплементарности не полностью комплементарна последовательности-мишени, несоответствующие спаривания могут быть во внутренних или концевых областях молекулы. Обычно наиболее допустимые несоответствующие спаривания находятся в концевых областях, например, в пределах 5, 4, 3 или 2 нуклеотидов 5'- и/или 3'-конца.

Термин «смысловая нить» или «сопровождающая нить» в используемом в настоящем описании смысле относится к нити и-РНК, которая содержит область, которая в значительной степени комплементарна области антисмысловой нити в соответствии с термином, который определен в настоящем описании.

В используемом в настоящем описании смысле термин «SNALP» относится к стабильной частице нуклеиновой кислоты-липида. SNALP означает везикулу из липидов, покрывающих уменьшенное водное внутреннее пространство, содержащее нуклеиновую кислоту, такую как и-РНК или плазмида, с которой и-РНК транскрибируется. SNALP описаны, например, в публикациях заявок на выдачу патента США № 20060240093, 20070135372 и в международной заявке № WO 2009082817. Указанные заявки включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

«Введение в клетку» в отношении и-РНК означает облегчение или осуществление захвата или абсорбции в клетку, как понятно специалистам в данной области. Абсорбция или захват и-РНК могут быть осуществлены посредством самостоятельных диффузионных или активных клеточных процессов или посредством вспомогательных средств или устройств. Значение такого термина не ограничено клетками in vitro; и-РНК также может быть «введена в клетку» в том случае, когда клетка является частью живого организма. В таком случае введение в клетку будет включать доставку в организм. Например, в случае доставки in vivo и-РНК может быть инъецирована в участок ткани или введена системно. Доставка in vivo также может быть осуществлена с использованием системы доставки β-глюкана, такой как системы, описанные в патентах США №5032401 и 5607677 и в публикации США №2005/0281781, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. Введение in vitro в клетку включает способы, известные в данной области, такие как электропорация и липофекция. Дополнительные способы описаны в настоящей публикации ниже или известны в данной области.

В используемом в настоящем описании смысле термин «модулировать экспрессию» относится, по меньшей мере, к частичному «ингибированию» или частичной «активации» экспрессии гена ALAS1 в клетке, обработанной композицией и-РНК, которая описана в настоящей публикации, по сравнению с экспрессией ALAS1 в контрольной клетке. Контрольная клетка включает необработанную клетку или клетку, обработанную не направленной к мишени контрольной и-РНК.

Термины «активировать», «усиливать», «осуществлять повышающую регуляцию экспрессии», «увеличивать экспрессию», и тому подобные в той части, в которой они относятся к гену ALAS1, в настоящем описании относятся, по меньшей мере, к частичной активации экспрессии гена ALAS1, которая проявляется в увеличении количества мРНК ALAS1, которая может быть выделена или может быть выявлена в первой клетке или группе клеток, в которых ген ALAS1 транскрибируется, и которая была или которые были обработаны так, чтобы повысить экспрессию гена ALAS1, по сравнению со второй клеткой или группой клеток, по существу идентичных первой клетке или группе клеток, но которая не была или которые не были обработаны таким образом (контрольные клетки).

В одном варианте экспрессию гена ALAS1 активируют, по меньшей мере, примерно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% введением и-РНК, которая описана в настоящей публикации. В некоторых вариантах ген ALAS1 активируют, по меньшей мере, примерно на 60%, 70% или 80% введением и-РНК, охарактеризованной в изобретении. В некоторых вариантах экспрессию гена ALAS1 активируют, по меньшей мере, примерно на 85%, 90% или 95% или больше введением и-РНК, которая описана в настоящей публикации. В некоторых вариантах экспрессию гена ALAS1 увеличивают, по меньшей мере, в 1 раз, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере, в 10 раз, по меньшей мере, в 50 раз, по меньшей мере, в 100 раз, по меньшей мере, в 500 раз, по меньшей мере, в 1000 раз или больше в клетках, обработанных и-РНК, которая описана в настоящей публикации, по сравнению с экспрессией в необработанных клетках. Активация экспрессии малыми днРНК описана, например, в публикации Li с соавторами, 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 17337-42, и в US 20070111963 и US 2005226848, каждая из которых включена в настоящее описание в виде ссылки.

Термины «вызывать сайленсинг», «ингибировать экспрессию», «осуществлять понижающую регуляцию экспрессии», «подавлять экспрессию» и тому подобные в той части, в которой они относятся к гену ALAS1, в настоящем описании относятся, по меньшей мере, к частичному подавлению экспрессии гена ALAS1, которое оценивают, например, на основании экспрессии мРНК ALAS1, экспрессии белка ALAS1 или на основании другого параметра, функционально связанного с экспрессией гена ALAS1 (например, на основании концентраций ALA или PBG в плазме или моче). Например, ингибирование экспрессии ALAS1 может проявляться в виде снижения количества мРНК ALAS1, которая может быть выделена или может быть выявлена в первой клетке или группе клеток, в которых ген ALAS1 транскрибируется, и которая была или которые были обработаны так, чтобы ингибировать экспрессию гена ALAS1, по сравнению с контролем. Контролем может быть вторая клетка или группа клеток, по существу идентичных первой клетке или группе клеток, за исключением того, что вторая клетка или группа клеток не были обработаны таким образом (контрольные клетки). Степень ингибирования обычно выражают в виде процента от контрольного уровня, например,

Альтернативно степень ингибирования может быть приведена в виде уменьшения параметра, который функционально связан с экспрессией гена ALAS1, например, количества белка, кодируемого геном ALAS1, или уровня одного или нескольких порфиринов. Уменьшение параметра, функционально связанного с экспрессией гена ALAS1, можно подобным образом выразить в виде процента от контрольного уровня. В принципе, сайленсинг гена ALAS1 можно определить в любой клетке, экспрессирующей ALAS1 либо конститутивно, либо в результате конструирования генома и в любом подходящем анализе. Однако в том случае, когда необходим эталон для того, чтобы определить ингибирует ли данная и-РНК экспрессию гена ALAS1 в определенной степени и поэтому входит в объем настоящего изобретения, анализы, представленные в примерах ниже должны служить в качестве такого эталона.

Например, в некоторых случаях экспрессию гена ALAS1 подавляют, по меньшей мере, примерно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% введением и-РНК, охарактеризованной в изобретении. В некоторых вариантах ген ALAS1 подавляют, по меньшей мере, примерно на 60%, 65%, 70%, 75% или 80% введением и-РНК, охарактеризованной в изобретении. В некоторых вариантах ген ALAS1 подавляют, по меньшей мере, примерно на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или больше введением и-РНК, которая описана в настоящей публикации.

В используемом в настоящем описании смысле в контексте экспрессии ALAS1 термины «лечить», «процесс лечения», «лечение» и тому подобные относятся к облегчению или ослаблению патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1 (например, патологических процессов, в которые вовлечены порфирины или дефекты порфиринового пути, такие как, например, порфирии). В контексте настоящего изобретения в той части, которая относится к любому из других состояний, перечисленных в настоящем описании ниже (отличных от патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1), термины «лечить», «лечение» и тому подобные означают предотвращать, облегчать или ослаблять, по меньшей мере, один симптом, ассоциированный с таким состоянием, или замедлять или реверсировать прогрессирование такого состояния. Например, способы, охарактеризованные в настоящем описании, в случае применения для лечения порфирии, могут служить для уменьшения или предотвращения одного или нескольких симптомов ассоциированных с порфирией (например, боли), снижения тяжести или частоты приступов, ассоциированных с порфирией, уменьшения вероятности того, что приступ одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет происходить после воздействия провоцирующего условия, укорочения приступа, ассоциированного с порфирией, и/или уменьшения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, гепатоклеточного рака или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии)). Таким образом, если контекст ясно не указывает иное, подразумевается, что термины «лечить», «лечение» и тому подобные охватывают профилактику, например, предотвращение расстройств и/или симптомов расстройств, связанных с экспрессией ALAS1.

«Более низкий» в контексте заболевания показатель или симптом означает статистически или клинически значимое снижение такого уровня. Снижение может составлять, например, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40% или больше, и обычно снижается до уровня в приятом диапазоне нормы для индивидуума без такого расстройства.

В используемом в настоящем описании смысле фразы «терапевтически эффективное количество» и «профилактически эффективное количество» относится к количеству, которое дает терапевтическую пользу при лечении, профилактике или контролировании патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1. Конкретное количество, которое является терапевтически эффективным, легко может определить опытный лечащий врач, и количество может варьировать, в зависимости от факторов, известных в данной области, таких как, например, тип патологического процесса, история болезни и возраст пациента, стадия патологического процесса и введение других средств.

В используемом в настоящем описании смысле «фармацевтическая композиция» содержит фармакологически эффективное количество и-РНК и фармацевтически приемлемый носитель. В используемом в настоящем описании смысле «фармакологически эффективное количество», «терапевтически эффективное количество» или просто «эффективное количество» относится к такому количеству и-РНК, которое эффективно в отношении получения предполагаемого фармакологического, терапевтического или профилактического результата. Например, в способе лечения расстройства, связанного с экспрессией ALAS1 (например, в способе лечения порфирии), эффективное количество включает количество эффективное в отношении уменьшения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, количество, эффективное в отношении снижения частоты приступов, количество, эффективное в отношении снижения вероятности того, что приступ одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет происходить при воздействии провоцирующего фактора, или количество, эффективное в отношении снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоклеточного рака). Например, если данное клиническое лечение считают эффективным, когда имеет место снижение, по меньшей мере, на 10% измеряемого параметра, ассоциированного с заболеванием или расстройством, терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения такого заболевания или расстройства представляет собой количество, которое необходимо для получения уменьшения такого параметра, по меньшей мере, на 10%. Например, терапевтически эффективное количество и-РНК, мишенью которой является ALAS1, может снижать уровни белка ALAS1 на любое измеряемое количество, например, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителю для введения терапевтического средства. Такие носители включают без ограничения физиологический раствор, буферный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их сочетания. Из термина специально исключена среда для культивирования клеток. В случае лекарственных средств, вводимых перорально, фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как инертные разбавители, дезинтегрирующие средства, связывающие средства, скользящие вещества, подсластители, корригенты, красители и консерванты. Подходящие инертные разбавители включают карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция и лактозу, тогда как кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются подходящими дезинтегрирующими средствами. Связывающие средства могут включать крахмал и желатин, тогда как скользящим веществом, в случае его наличия, обычно будет стеарат магния, стериновая кислота или тальк. При необходимости таблетки могут быть покрыты таким материалом, как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина, чтобы замедлить всасывание в желудочно-кишечном тракте. Средства, включаемые в препараты лекарственных средств, дополнительно описаны в настоящей публикации ниже.

Термин «примерно» в отношении количества или числового диапазона означает, что указанное количество или числовой диапазон является приблизительным в пределах вариабельности эксперимента (или в пределах статистической погрешности эксперимента) и, таким образом, количество или числовой диапазон может варьировать, например, от 1% до 15% от указанного числа или числового диапазона.

II. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК)

В настоящей публикации описаны и-РНК-средства, которые ингибируют экспрессию гена ALAS1. В одном варианте и-РНК-средство включает молекулы двунитевой рибонуклеиновой кислоты (днРНК) для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или у субъекта (например, у млекопитающего, например, у человека, имеющего порфирию), при этом днРНК содержит антисмысловую нить, имеющую область комплементарности, которая комплементарна, по меньшей мере, части мРНК, образованной при экспрессии гена ALAS1, и при этом область комплементарности имеет длину 30 нуклеотидов или меньше, обычно длину 19-24 нуклеотида, и при этом днРНК при контакте с клеткой, экспрессирующей ген ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1, по меньшей мере, на 10%, что анализируют, например, с использованием ПЦР или основанного на разветвленной ДНК (bDNA) способа или основанного на белках способа, такого как Вестерн-блоттинг. В одном варианте и-РНК-средство активирует экспрессию гена ALAS1 в клетке или в организме млекопитающего. Экспрессию гена ALAS1 в культуре клеток, такой как клетки COS, клетки HeLa, первичные гепатоциты, клетки HepG2, первичные культивируемые клетки, или в биологическом образце, полученном от субъекта, можно анализировать, измеряя уровни мРНК ALAS1, например, с использованием анализа bDNA или TaqMan, или измеряя уровни белка, например в анализе иммунофлуоресценции, используя, например, Вестерн-блоттинг или проточно-цитометрический способ.

днРНК содержит две нити РНК, которые комплементарны в достаточной степени, чтобы гибридизоваться с образованием структуры дуплекса в условиях, в которых днРНК будет использована. Одна нить днРНК (антисмысловая нить) содержит область комплементарности, которая в значительной степени комплементарна и обычно полностью комплементарна последовательности-мишени, полученной из последовательности мРНК, образованной во время экспрессии гена ALAS1. Другая нить (смысловая нить) содержит область, которая комплементарна антисмысловой нити, так что две нити гибридизуются и образуют структуру дуплекса при объединении в подходящих условиях. Обычно структура дуплекса имеет длину от 15 до 30 включительно, чаще от 18 до 25 включительно, еще более часто от 19 до 24 включительно и наиболее часто от 19 до 21 пары оснований включительно. Подобным образом область комплементарности с последовательностью-мишенью имеет длину от 15 до 30 включительно, чаще от 18 до 25 включительно, еще более часто от 19 до 24 включительно и наиболее часто от 19 до 21 нуклеотида включительно. В некоторых вариантах днРНК имеет длину от 15 до 20 нуклеотидов включительно, и в других вариантах днРНК имеет длину от 25 до 30 нуклеотидов включительно. Как будет понятно специалисту область-мишень в РНК, являющейся мишенью расщепления, чаще всего является частью более крупной молекулы РНК, часто молекулы мРНК. В соответствующем случае «часть» мРНК-мишени представляет собой непрерывную последовательность мРНК-мишени достаточной длины, чтобы быть субстратом РНК-и-направленного расщепления (т.е., расщепления посредством пути RISC). днРНК, имеющие короткие дуплексы даже длиной 9 пар оснований в некоторых случаях могут опосредовать РНК-и-направленное расщепление РНК. Чаще всего мишень будет иметь длину, по меньшей мере, 15 нуклеотидов, например, длину 15-30 нуклеотидов.

Специалисту в данной области также будет понятно, что область дуплекса является основной функциональной частью днРНК, например, область дуплекса длиной от 9 до 36, например, 15-30 пар оснований. Таким образом, в одном варианте в случае, если молекула РНК или комплекс молекул РНК оказывается процессированным до функционального дуплекса, например, длиной 15-30 пар оснований, который целенаправленно приводит к расщеплению требуемой РНК, молекула РНК или комплекс молекул РНК, имеющих область дуплекса больше 30 пар оснований, является днРНК. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что в одном варианте ми-РНК является днРНК. В другом варианте днРНК не является встречающейся в природе ми-РНК. В другом варианте и-РНК-средство, применимое для целенаправленного действия на экспрессию ALAS1, не образуется в клетке-мишени в результате расщепления более крупной днРНК.

днРНК, которая описана в настоящей публикации, может дополнительно содержать один или несколько однонитевых нуклеотидных липких концов. днРНК может быть синтезирована стандартными способами, известными в данной области, которые дополнительно обсуждаются ниже, например, с использованием автоматического синтезатора ДНК, такого как коммерчески доступный синтезатор, например, из Biosearch, Applied Biosystems, Inc. В одном варианте ген ALAS1 представляет собой ген ALAS1 человека. В другом варианте ген ALAS1 представляет собой ген ALAS1 мыши или крысы. В конкретных вариантах первая последовательность является смысловой нитью днРНК, которая содержит смысловую последовательность, указанную в таблице 2 или таблице 3, и вторая последовательность является антисмысловой нитью днРНК, которая содержит антисмысловую последовательность, указанную в таблице 2 или таблице 3. В некоторых вариантах первая последовательность является смысловой нитью днРНК, которая содержит смысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15, и вторая последовательность является антисмысловой нитью днРНК, которая содержит антисмысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15. В некоторых вариантах первая последовательность является смысловой нитью днРНК, которая содержит смысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, и вторая последовательность является антисмысловой нитью днРНК, которая содержит антисмысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. Альтернативные днРНК-средства, мишенью которых являются другие последовательности, отличные от последовательностей днРНК, раскрытых в настоящем описании (например, в таблице 2 или таблице 3), легко могут быть определены с использованием последовательности-мишени и фланкирующей последовательности ALAS1.

В одном аспекте днРНК может содержать, по меньшей мере, смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловая нить выбрана из групп последовательностей, представленных в таблицах 2 и 3, и антисмысловая нить, соответствующая смысловой нити, выбрана из последовательностей, представленных в таблицах 2 и 3. В следующем аспекте днРНК может содержать, по меньшей мере, смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловая нить выбрана из групп последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15, и антисмысловая нить, соответствующая смысловой нити, выбрана из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15. В следующем аспекте днРНК может содержать, по меньшей мере, смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловая нить выбрана из групп последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, и антисмысловая нить, соответствующая смысловой нити, выбрана из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20. В таких аспектах одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, при этом одна из последовательностей по существу комплементарна последовательности мРНК, образуемой при экспрессии гена ALAS1. Как таковая, днРНК может содержать два олигонуклеотида, при этом один олигонуклеотид описан как смысловая нить в таблице 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, а второй олигонуклеотид описан как антисмысловая нить, соответствующая смысловой нити из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20. Как описано в настоящей публикации и как известно в данной области, комплементарные последовательности днРНК также могут быть представлены в виде самокомплементарных областей одной молекулы нуклеиновой кислоты, а не в виде отдельных олигонуклеотидов.

Специалисту хорошо известно, что днРНК, имеющая структуру дуплекса длиной от 20 до 23, но в частности 21 пару оснований, считается особенно эффективной в индукции РНК-интерференции (Elbashir с соавторами, EMBO 2001, 20: 6877-6888). Однако другими авторами было обнаружено, что также эффективными могут быть более короткие или более длинные структуры РНК-дуплексов. В описанных выше вариантах в силу природы олигонуклеотидных последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, днРНК, описанные в настоящей публикации, могут содержать, по меньшей мере, одну нить с минимальной длиной 21 нуклеотид. Обоснованно можно ожидать, что более короткие дуплексы, имеющие одну из последовательностей, указанных в таблице 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, в которых отсутствуют только несколько нуклеотидов на одном или обоих концах, могут быть также эффективными при сравнении с днРНК, описанными выше. Следовательно, согласно настоящему изобретению предусмотрены днРНК, имеющие неполную последовательность, по меньшей мере, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов из одной из последовательностей, указанных в таблице 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, и отличающиеся по своей способности ингибировать экспрессию гена ALAS1 не более чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от днРНК, содержащей полную последовательность.

Кроме того, РНК, представленные в таблицах 2 и 3, а также РНК, представленные в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, имеют участок транскрипта ALAS1, который чувствителен к RISC-опосредованному расщеплению. В связи с этим дополнительным характерным признаком настоящего изобретения являются и-РНК, мишень которых находится в пределах одной из таких последовательностей. В используемом в настоящем описании смысле говорят, что мишень и-РНК находится в пределах конкретного участка РНК-транскрипта, если и-РНК стимулирует расщепление транскрипта в любом месте в пределах конкретного участка. Такая и-РНК обычно будет содержать, по меньшей мере, 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов из одной из последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, связанных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, взятыми из области, являющейся соседней с выбранной последовательностью в гене ALAS1.

Хотя последовательность-мишень обычно имеет длину 15-30 нуклеотидов, имеет место широкая изменчивость в отношении применимости конкретных последовательностей в таком диапазоне для направленного расщепления любой данной РНК-мишени. В различных пакетах компьютерных программ и руководствах, указанных в настоящем описании, представлены инструкции по идентификации оптимальных последовательностей-мишеней для любого данного генной мишени, но также может быть использован эмпирический подход, в случае которого «окно» или «рамка» заданного размера (в качестве не ограничивающего примера, 21 нуклеотид) буквально или фигурально (включая, например, in silico) помещают на последовательность РНК-мишени, чтобы идентифицировать последовательности в данном размерном диапазоне, которые могут служить в качестве последовательностей-мишеней. Постепенно перемещая «окно» последовательности по одному нуклеотиду выше или ниже начального положения последовательности-мишени, можно идентифицировать следующую потенциальную последовательность-мишень, пока не будет идентифицирован полный набор возможных последовательностей для любого заданного выбранного размера мишени. Указанным способом вместе с последовательным синтезом и тестированием идентифицированных последовательностей (с использованием анализов, которые описаны в настоящей публикации или которые известны в данной области) для идентификации таких последовательностей, которые функционируют оптимально, можно идентифицировать такие последовательности РНК, которые в случае целенаправленного действия и-РНК-средства опосредуют наилучшее ингибирование экспрессии гена-мишени. Таким образом, хотя последовательности, указанные, например, в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, представляют собой эффективные последовательности-мишени, предполагается, что дополнительная оптимизация эффективности ингибирования может быть осуществлена последовательным «прохождением окна» по одному нуклеотиду вверх или вниз заданных последовательностей, чтобы идентифицировать последовательности с равными или лучшими характеристиками ингибирования.

Кроме того, предусмотрено, что в случае любой идентифицированной последовательности, например, указанной в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 14, 15, 18 и 20, дополнительная оптимизация может быть осуществлена последовательными добавлением или удалением нуклеотидов, чтобы создать более длинные или более короткие последовательности, и тестированием таких образованных последовательностей путем прохождения окна более длинного или более короткого размера вверх или вниз РНК-мишени от данной точки. И в этом случае сочетание такого способа создания новых кандидатов в мишени с тестированием в отношении эффективностей и-РНК, основанных на таких последовательностях-мишенях, в анализе ингибирования, который известен в данной области или который описан в настоящей публикации, может приводить к дополнительному повышению эффективности ингибирования. Более того, такие оптимизированные последовательности могут быть скорректированы, например, введением модифицированных нуклеотидов, которые описаны в настоящей публикации или которые известны в данной области, добавлением или изменениями липких концов или другими модификациями, которые известны в данной области и/или обсуждаются в настоящем описании, чтобы дополнительно оптимизировать молекулу (например, повышение стабильности в сыворотке или увеличение времени полужизни в циркуляции, повышение термостабильности, усиление трансмембранной доставки, направление в конкретное место или тип клеток, усиление взаимодействия с ферментами в пути сайленсинга, усиление высвобождения из эндосом и т.д.) в качестве ингибитора экспрессии.

Описанная в настоящей публикации и-РНК может содержать одно или несколько ошибочных спариваний с последовательностью-мишенью. В одном варианте и-РНК, которая описана в настоящей публикации, содержит не более 3 ошибочных спариваний. Если антисмысловая нить и-РНК имеет ошибочные спаривания с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы область ошибочного спаривания не была расположена в центре области комплементарности. Если антисмысловая нить и-РНК содержит ошибочные спаривания с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы ошибочное спаривание было ограничено в пределах последних 5 нуклеотидов либо от 5'-, либо от 3'-конца области комплементарности. Например, в случае нити РНК 23-нуклеотидного и-РНК-средства нить РНК, которая комплементарна области гена ALAS1, нить РНК обычно не содержит никакого ошибочного спаривания в пределах центральных 13 нуклеотидов. Способы, описанные в настоящей публикации, или способы, известные в данной области, можно использовать для определения того является ли и-РНК, содержащая ошибочное спаривание с последовательностью-мишенью, эффективной в ингибировании экспрессии гена ALAS1. Важно учитывать эффективность и-РНК с ошибочными спариваниями в ингибировании экспрессии гена ALAS1, особенно если известно, что для конкретной области комплементарности в гене ALAS1 в популяции существует обусловленная полиморфизмом изменчивость последовательности.

В одном варианте, по меньшей мере, один конец днРНК имеет однонитевой нуклеотидный липкий конец длиной от 1 до 4 нуклеотидов, обычно 1 или 2 нуклеотида. днРНК, имеющие, состоящий, по меньшей мере, из одного нуклеотида липкий конец, обладают неожиданно превосходными ингибирующими свойствами по сравнению с их аналогами с тупыми концами. В еще одном варианте РНК в и-РНК, например, днРНК, химически модифицирована для того, чтобы повысить стабильность или другие полезные характеристики. Нуклеиновые кислоты, охарактеризованные в изобретении, могут быть синтезированы и/или модифицированы способами, хорошо разработанными в данной области, такими как способы, описанные в публикации «Current protocols in nucleic acid chemistry», Beaucage, S.L. et al. (Edr.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, USA, которая включена в настоящее описание в виде ссылки. Модификации включают, например, (a) концевые модификации, например, 5'-концевые модификации (фосфорилирование, конъюгацию, связывание инвертированных повторов и т.д.), 3'-концевые модификации (конъюгации, ДНК-нуклеотиды, связывание инвертированных повторов и т.д.), (b) модификации оснований, например, замену стабилизирующими основаниями, дестабилизирующими основаниями или основаниями, которые, которые образуют пары оснований с более широким репертуаром партнеров, удаление оснований (нуклеотиды, лишенные оснований) или конъюгированные основания, (c) модификации сахаров (например, в 2'-положении или 4'-положении) или замену сахара, а также (d) модификации остова, включая модификацию или замену фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры РНК-соединений, применимых в настоящем изобретении, включают без ограничения РНК, содержащие модифицированные остовы или не содержащие природных межнуклеозидных связей. РНК, имеющие модифицированные остовы, включают наряду с прочими остовы, которые не имеют атома фосфора в остове. В целях настоящего описания и как иногда указывают в данной области, модифицированные РНК, которые не имеют атома фосфора в своем межнуклеозидном остове, также можно считать олигонуклеозидами. В конкретных вариантах модифицированная РНК может иметь атом фосфора в своем межнуклеозидном остове.

Модифицированные остовы РНК включают, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи, 2'-5'-связанные аналоги и тех и других), имеющие обратную ориентацию, в которых соседние пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.

Соответствующие патенты США, в которых содержатся инструкции по получению указанных выше фосфорсодержащих связей, включают без ограничения патенты США №3687808, 4469863, 4476301, 5023243, 5177195, 5188897, 5264423, 5276019, 5278302, 5286717, 5321131, 5399676, 5405939, 5453496, 5455233, 5466677, 5476925, 5519126, 5536821, 5541316, 5550111, 5563253, 5571799, 5587361, 5625050, 6028188, 6124445, 6160109, 6169170, 6172209, 6239265, 6277603, 6326199, 6346614, 6444423, 6531590, 6534639, 6608035, 6683167, 6858715, 6867294, 6878805, 7015315, 7041816, 7273933, 7321029 и патент США RE39464, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

Модифицированные РНК-остовы, которые не содержат атома фосфора, имеют остовы, которые образованы короткоцепочечными алкил- или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероматомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Такие остовы включают остовы, имеющие морфолиносвязи (образованные частично из представленной сахаром части нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; содержащие алкен остовы; сульфаматные остовы; метиленимино- и метиленгидразино-остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, имеющие смешанные компоненты N, O, S и CH2.

Соответствующие патенты США, в которых имеются инструкции по получению указанных выше олигонуклеозидов, включают без ограничения патенты США №5034506, 5166315, 5185444, 5214134, 5216141, 5235033, 564562, 5264564, 5405938, 5434257, 5466677, 5470967, 5489677, 5541307, 5561225, 5596086, 5602240, 5608046, 5610289, 5618704, 5623070, 5663312, 5633360, 5677437 и 5677439, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

В других миметиках РНК, подходящих или предполагаемых для применения в и-РНК, и сахар и межнуклеозидные связи, т.е. остов из нуклеотидных единиц, заменяют новыми группами. Единицы, представленные основаниями, сохраняют для гибридизации с соответствующим соединением-мишенью в виде нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик РНК, которое, как было показано, обладает превосходными свойствами в отношении гибридизации, называют пептидо-нуклеиновой кислотой (ПНК). В РНК-соединениях сахарный остов РНК заменяют остовом, содержащим амиды, в частности аминоэтилглициновым остовом. Основания нуклеотидов сохраняют, и они связаны прямо или опосредованно с атомами азота аза-группы в амидной части остова. Соответствующие патенты США, в которых содержатся руководства по получению соединений ПНК, включают без ограничения, патенты США №5539082, 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки. Дополнительные инструкции, касающиеся соединений ПНК, можно найти, например, в публикации Nielsen с соавторами, Science, 1991, 254, 1497-1500.

Некоторые варианты, охарактеризованные в изобретении, включают РНК с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеозиды с остовами, содержащими гетероатомы, и в частности --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2-- [известный как метилен(метилимино)- или MMI-остов], --CH2-O--N(CH3)--CH2--, --CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2-- и --N(CH3)--CH2--CH2-- [где нативный фосфодиэфирный остов представлен в виде -O-P-O--CH2--], описанные в указанном выше патенте США №5489677, и амидные остовы, описанные в указанном выше патенте США №5602240. В некоторых вариантах РНК, охарактеризованные в настоящем описании, имеют структуры морфолино-остова, описанные в указанном выше патенте США №5034506.

Модифицированные РНК также могут содержать один или несколько замещенных остатков сахаров. и-РНК, например, днРНК, охарактеризованные в настоящем описании, могут содержать одну из следующих групп в 2'-положении: OH; F; O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или O-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный C1-C10-алкил или C2-C10-алкенил и -алкинил. Примеры подходящих модификаций включают O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, где n и m составляют от 1 до примерно 10. В других вариантах днРНК содержат одну из следующих групп в 2'-положении: низший C1-C10-алкил, замещенный низший алкил, алкиларил, аралкил, O-алкиларил или O-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкиларил, аминоалкиламиногруппу, полиалкиламиногруппу, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств и-РНК или группу для улучшения фармакодинамических свойств и-РНК и другие заместители, обладающие сходными свойствами. В некоторых вариантах модификация включает 2'-метоксиэтоксигруппу (2'-O--CH2CH2OCH3, также известную как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-MOE) (Martin с соавторами, Helv. Chim. Acta, 1995, 78: 486-504) т.е., алкокси-алкоксигруппу. Другим примером модификации является 2'-диметиламинооксиэтоксигруппа, т.е., группа O(CH2)2ON(CH3)2, также известная как 2'-DMAOE, которая описана в настоящей публикации в примерах ниже, и 2'-диметиламиноэтоксиэтоксигруппа (также известная в данной области как 2'-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е., 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2, также описанная в настоящей публикации в примерах ниже.

Другие модификации включают 2'-метоксигруппу (2'-OCH), 2'-аминопропоксигруппу (2'-OCH2CH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации также могут быть получены в других положениях РНК в и-РНК, в частности в 3'-положении сахара 3'-концевого нуклеотида или в 2'-5'-связанных днРНК и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. и-РНК также могут содержать миметики сахара, такие как остатки циклобутила, вместо сахара пентофуранозила. Соответствующие патенты США, в которых описано получение таких структур модифицированных сахаров, включают без ограничения патенты США №4981957, 5118800, 5319080, 5359044, 5393878, 5446137, 5466786, 5514785, 5519134, 5567811, 5576427, 5591722, 5597909, 5610300, 5627053, 5639873, 5646265, 5658873, 5670633 и 5700920, авторы некоторых из которых также являются авторами настоящей заявки, и каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

и-РНК также может содержать модификации или замещения оснований нуклеотидов (часто называемых в данной области просто «основаниями»). В используемом в настоящем описании смысле «немодифицированные» или «природные» основания нуклеотидов включают пуриновые основания аденин (A) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные основания нуклеотидов включают другие синтетические и природные основания нуклеотидов, такие как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6-азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8- замещенные аденины и гуцанины, 5-галоген-, в частности 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные основания нуклеотидов включают основания, описанные в патенте США №3687808, основания, раскрытые в публикации «Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine», Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; основания, раскрытые в публикации «The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley and Sons, 1990, основания, раскрытые в публикации Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, и основания, раскрытые в публикации Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из таких оснований нуклеотидов особенно применимы для повышения аффинности связывания олигомерных соединений, охарактеризованных в изобретении. Такие основания включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и 0-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замены 5-метилцитозином повышают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и являются примером замен оснований, еще более предпочтительно в сочетании с 2'-O-метоксиэтильными модификациями сахара.

Соответствующие патенты США, в которых описано получение некоторых указанных выше модифицированных оснований нуклеотидов, а также другие модифицированных оснований нуклеотидов, включают без ограничения упомянутый выше патент США №3687808, а также патенты США №4845205, 513030, 5134066, 5175273, 5367066, 5432272, 5457187, 5459255, 5484908, 5502177, 5525711, 5552540, 5587469, 5594121, 5596091, 5614617, 5681941, 6015886, 6147200, 6166197, 6222025, 6235887, 6380368, 6528640, 6639062, 6617438, 7045610, 7427672 и 7495088, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки, и патент США №5750692, также включенный в настоящее описание в виде ссылки.

РНК в и-РНК также может быть модифицирована так, чтобы она содержала одну или несколько закрытых нуклеиновых кислот (LNA). Закрытая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотид, имеющий модифицированный остаток рибозы, при этом остаток рибозы содержит дополнительный мостик, связывающий 2'- и 4'-атомы углерода. Такая структура эффективно «запирает» рибозу в структурной 3'-эндо-конформации. Было показано, что добавление закрытых нуклеиновых кислот к ми-РНК повышает стабильность ми-РНК в сыворотке и снижает нецелевые эффекты (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).

Соответствующие патенты США, в которых описано получение закрытых нуклеотидов нуклеиновой кислоты, включают без ограничения следующие патенты: патенты США №6268490, 6670461, 6794499, 6998484, 7053207, 7084125 и 7399845, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

Потенциально стабилизирующие модификации на концах молекул РНК могут включать N-(ацетиламинокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-NHAc), N-(капроил-4-гидроксипролинол (Hyp-C6), N-(ацетил-4-гидроксипролинол (Hyp-NHAc), тимидин-2'-O-дезокситимидин (простой эфир), N-(аминокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-амино), 2-докозаноилуридин-3”-фосфат, инвертированное основание dT(idT) и другие. Описание такой модификации можно найти в публикации PCT № WO 2011/005861.

МОТИВЫ И-РНК

В одном варианте последовательность смысловой нити может быть представлена формулой (I):

5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' (I)

где:

i и j каждый независимо означают 0 или 1;

p и q каждый независимо означают 0-6;

каждый Na независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит, по меньшей мере, два по-разному модифицированных нуклеотида;

каждый Nb независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

каждый np и nq независимо означает выступающий нуклеотид;

где Nb и Y не имеют одной и той же модификации; и

XXX, YYY и ZZZ каждый независимо означают один мотив из трех идентичных модификаций трех следующих друг за другом нуклеотидов. Предпочтительно все YYY являются 2'-F-модифицированными нуклеотидами.

В одном варианте Na и/или Nb содержат модификации с изменяющегося характера.

В одном варианте мотив YYY находится в сайте расщепления или вблизи сайта расщепления смысловой нити. Например, когда РНК-и-средство имеет область дуплекса длиной 17-23 нуклеотида, мотив YYY может находиться в сайте расщепления или вблизи сайта расщепления (например: может находиться в положениях 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12 или 11, 12, 13) смысловой нити, при этом нумерация начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца; или необязательно нумерация начинается с 1-ого спаренного нуклеотида в области дуплекса от 5'-конца.

В одном варианте i равен 1 и j равен 0, или i равен 0 и j равен 1, или оба i и j равны 1. Поэтому, смысловую нить может быть представлена следующими формулами:

5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);

5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); или

5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).

В том случае, когда смысловая нить представлена формулой (Ib), Nb означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na независимо может означать олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда смысловая нить представлена формулой (Ic), Nb означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na независимо может означать олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда смысловая нить представлена формулой (Id), каждый Nb независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно Nb означает 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Каждый Na независимо может означать олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

Каждый X, Y и Z могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

В других вариантах i равен 0 и j равен 0, и смысловая нить может быть представлена формулой:

5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia).

В том случае, когда смысловая нить представлена формулой (Ia), каждый Na независимо может означать олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В одном варианте последовательность антисмысловой нити РНК-и может быть представлена формулой (II):

5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-Na'-np' 3' (II)

где:

k и l каждый независимо означают 0 или 1;

p' и q' каждый независимо означают 0-6;

каждый Na' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит, по меньшей мере, два по-разному модифицированных нуклеотида;

каждый Nb' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

каждый np' и nq' независимо означают выступающий нуклеотид;

при этом Nb' и Y' не имеют одной и той же модификации;

и

X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' каждый независимо означают один мотив из трех идентичных модификаций трех следующих друг за другом нуклеотидов.

В одном варианте Na' и/или Nb' содержат модификации изменяющегося характера.

Мотив Y'Y'Y' находится в сайте расщепления или вблизи сайта расщепления антисмысловой нити. Например, в том случае, когда РНК-и-средство имеет область дуплекса длиной 17-23 нуклеотида, мотив Y'Y'Y' может находиться в положениях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; или 13, 14, 15 антисмысловой нити, при этом нумерация начинается с 1-ого нуклеотида от 5'-конца; или необязательно нумерация начинается с 1-ого спаренного нуклеотида в области дуплекса от 5'-конца. Предпочтительно мотив Y'Y'Y' находится в положениях 11, 12, 13.

В одном варианте все нуклеотиды мотива Y'Y'Y' 2'-OMe-модифицированы.

В одном варианте k равен 1, и l равен 0, или k равен 0 и l равен 1, или оба k и l равны 1.

Таким образом, антисмысловая нить может быть представлена следующими формулами:

5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb);

5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc); или

5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np' 3′ (IId).

В том случае, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIb), Nb' означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIc), Nb' означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда антисмысловая нить представлена формулой (IId), каждый Nb' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно, Nb означает 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В других вариантах k равен 0, и l равен 0, и антисмысловая нить может быть представлена формулой:

5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 3' (Ia).

В том случае, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIa), каждый Na' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

Каждый из X', Y' и Z' могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

Каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити могут быть независимо модифицированы LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-O-метилом, 2'-O-аллилом, 2'-C-аллилом, 2'-гидроксилом или 2'-фтором. Например, каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован 2'-O-метилом или 2'-фтором. В частности, каждый X, Y, Z, X', Y' и Z' может означать модификацию 2'-O-метилом или модификацию 2'-фтором.

В одном варианте смысловая нить РНК-и-средства может содержать мотив YYY, находящийся в положениях 9, 10 и 11 нити, когда область дуплекса имеет длину 21 нуклеотид, при этом нумерация начинается с 1-ого нуклеотида от 5'-конца или необязательно нумерация начинается с 1-ого спаренного нуклеотида в области дуплекса от 5'-конца; и Y означает 2'-F-модификацию. Смысловая нить может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ, в качестве боковых модификаций на противоположных концах области дуплекса; и XXX и ZZZ каждый независимо означают 2'-Ome-модификацию или 2'-F-модификацию.

В одном варианте антисмысловая нить может содержать мотив Y'Y'Y', находящийся в положениях 11, 12, 13 нити, при этом нумерация начинается с 1-ого нуклеотида от 5'-конца или необязательно нумерация начинается с 1-ого нуклеотида в пределах области дуплекса от 5'-конца; и Y' означает модификацию 2'-O-метилом. Антисмысловая нить может дополнительно содержать мотив X'X'X' или мотивы Z'Z'Z' в качестве боковых модификаций на противоположных концах области дуплекса; и X'X'X' и Z'Z'Z' каждый независимо означают 2'-Ome-модификацию или 2'-F-модификацию.

Смысловая нить, представленная любой из указанных выше формул (Ia), (Ib), (Ic) и (Id), образует дуплекс с антисмысловой нитью, представленной любой из формул (IIa), (IIb), (IIc) и (IId), соответственно.

Соответственно, РНК-и-средства для применения в способах согласно изобретению могут содержать смысловую нить и антисмысловую нить, при этом каждая нить имеет длину от 14 до 30 нуклеотидов, и при этом дуплекс РНК-и представлен формулой (III):

смысловая: 5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'

антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5'

(III)

где:

i, j, k и l каждый независимо означают 0 или 1;

p, p', q и q' каждый независимо означают 0-6;

каждый Na и Na' независимо означают олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит, по меньшей мере, два по-разному модифицированных нуклеотида;

каждый Nb и Nb' независимо означают олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;

где

каждый np', np, nq' и nq, каждый из которых может присутствовать или может не присутствовать, независимо означает выступающий нуклеотид; и

XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' каждый независимо означают один мотив из трех идентичных модификаций трех следующих друг за другом нуклеотидов.

В одном варианте i равен 0 и j равен 0; или i равен 1 и j равен 0; или i равен 0 и j равен 1; или оба i и j равны 0; или оба i и j равны 1. В другом варианте k равен 0 и l равен 0; или k равен 1 и l равен 0; k равен 0 и l равен 1; или оба k и l равны 0; или оба k и l равны 1.

Примеры сочетаний смысловой нити и антисмысловой нити, образующих дуплекс РНК-и, включают приведенные ниже формулы:

5′ np - Na -Y Y Y -Na-nq 3′
3′ np'-Na'-Y′Y′Y′ -Na'nq' 5′
(IIIa) 5′ np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3′
3′ np'-Na'-Y′Y′Y′-Nb'-Z′Z′Z′-Na'nq' 5′
(IIIb) 5′ np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3′
3′ np'-Na'-X′X′X′-Nb'-Y′Y′Y′-Na'-nq' 5′
(IIIc) 5′ np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3′
3′ np'-Na'-X′X′X′-Nb'-Y′Y′Y′-Nb'-Z′Z′Z′-Na-nq' 5′
(IIId)

В том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIIa), каждый Na независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIIb), каждый Nb независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1-10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждый Na независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено в виде формулы (IIIc), каждый Nb, Nb' независимо означают олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено в виде формулы (IIId), каждый Nb, Nb' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na, Na' независимо означает олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждый Na, Na', Nb и Nb' независимо содержит модификации изменяющегося характера.

Каждый X, Y и Z в формулах (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), по меньшей мере, один из нуклеотидов Y может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Y'. Альтернативно, по меньшей мере, два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'; или все три нуклеотида Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIIb) или (IIId), по меньшей мере, один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Z'. Альтернативно, по меньшей мере, два нуклеотида Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'; или все три нуклеотида Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.

В том случае, когда РНК-и-средство представлено в виде формулы (IIIc) или (IIId), по меньшей мере, один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов X'. Альтернативно, по меньшей мере, два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'; или все три нуклеотида X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.

В одном варианте модификация нуклеотида Y отличается от модификации нуклеотида Y', модификация нуклеотида Z отличается от модификации нуклеотида Z' и/или модификация нуклеотида X отличается от модификации нуклеотида X'.

В одном варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIId), модификации Na представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором. В другом варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIId), модификации Na представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором и np' > 0 и, по меньшей мере, один np' связан с соседним нуклеотидом фосфоротиоатной связью. В еще одном варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIId), модификации Na представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором, np' > 0 и, по меньшей мере, один np' связан с соседним нуклеотидом фосфоротиоатной связью, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, связанными бивалентным или трехвалентным разветвленным линкером. В другом варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIId), модификации Na представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором, np' > 0 и, по меньшей мере, один np' связан с соседним нуклеотидом фосфоротиоатной связью, смысловая нить содержит, по меньшей мере, одну фосфоротиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, связанными бивалентным или трехвалентным разветвленным линкером.

В одном варианте в том случае, когда РНК-и-средство представлено формулой (IIIa), модификации Na представляют собой представляют собой модификации 2'-O-метилом или 2'-фтором, np' > 0 и, по меньшей мере, один np' связан с соседним нуклеотидом фосфоротиоатной связью, смысловая нить содержит, по меньшей мере, одну фосфоротиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, связанными бивалентным или трехвалентным разветвленным линкером.

В одном варианте РНК-и-средство является мультимером, содержащим, по меньшей мере, два дуплекса, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), при этом дуплексы связаны линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно мультимер дополнительно содержит лиганд. Дуплексы могут иметь в качестве мишени один и тот же ген или два разных гена; или каждый из дуплексов может иметь в качестве мишени один и тот же ген, но два разных сайта-мишени.

В одном варианте РНК-и-средство является мультимером, содержащим три, четыре, пять, шесть или больше дуплексов, представленных формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), при этом дуплексы связаны линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно мультимер дополнительно содержит лиганд. Дуплексы могут иметь в качестве мишени один и тот же ген или два разных гена; или дуплексы могут иметь в качестве мишени один и тот же ген, но два разных сайта-мишени.

В одном варианте два РНК-и-средства, представленные формулами (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) связаны друг с другом на 5'-конце и одном или обоих 3'-концах и необязательно конъюгированы с лигандом. Средства могут иметь в качестве мишени один и тот же ген или два разных гена; или средства могут иметь в качестве мишени один и тот же ген, но два разных сайта-мишени.

Конъюгаты и-РНК

и-РНК-средства, раскрытые в настоящем описании, могут быть в форме конъюгатов. Конъюгат может быть связан в любом подходящем положении в молекуле и-РНК, например, на 3'-конце или 5'-конце смысловой или антисмысловой нити. Конъюгаты необязательно связаны через линкер.

В некоторых вариантах и-РНК-средство, описанное в настоящей публикации, химически связано с одним или несколькими лигандами, остатками или конъюгатами, которые могут придавать функциональность, например, влияя (например, усиливая) на активность, распределение в клетке или захват и-РНК клеткой. Такие остатки включают без ограничения липидные остатки, такие как остаток холестерина (Letsinger с соавторами, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), холевой кислоты (Manoharan с соавторами, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4: 1053-1060), тиоэфира, например, берил-S-тритилтиола (Manoharan с соавторами, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan с соавторами, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765-2770), тиохолестерина (Oberhauser с соавторами, Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533-538), алифатической цепи, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), фосфолипида, например, дигексадецил-рац-глицерина или 1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-фосфоната триэтиламмония (Manoharan с соавторами, Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654; Shea с соавторами, Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777-3783), полиамина или цепи полиэтиленгликоля (Manoharan с соавторами, Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14: 969-973) или адамантануксусной кислоты (Manoharan с соавторами, Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654), остатка пальмитила (Mishra с соавторами, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229-237) или остатка окстадециламина или остатка гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke с соавторами, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923-937).

В одном варианте лиганд изменяет распределение, целенаправленное действие или время жизни и-РНК-средства, в которое он включен. В некоторых вариантах лиганд обеспечивает повышенную аффинность по отношению к выбранной мишени, например, молекуле, клетке или типу клеток, компартменту, например, клеточному или органному компартменту, ткани, органу или области тела, например, по сравнению с видами, в которых такой лиганд отсутствует. Типичные лиганды не будут принимать участия в спаривании дуплекса в образующей дуплекс нуклеиновой кислоте.

Лиганды могут включать встречающиеся в природе вещество, такое как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеид низкой плотности (ЛПНП) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновая кислота); или липид. Лиганд также может представлять собой рекомбинантную или синтетическую молекулу, такую как синтетический полимер, например, синтетическая полиаминокислота. Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту полилизин (PLL), поли-L-аспарагиновую кислоту, поли-L-глутаминовую кислоту, сополимер стирола-ангидрида малеиновой кислоты, сополимер поли(L-лактид-гликолид), сополимер дивиниловый эфир-малеиновый ангидрид, сополимер N-(2- гидроксипропил)метакриламид (HMPA), полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), полимеры N-изопропилакриламида или полифосфазин. Примеры полиаминов включают: полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, полиаминовый псевдопептид, полиаминовый пептидомиметик, дендримерный полиамин, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или α-спиральный пептид.

Лиганды также могут содержать направляющие к мишени группы, например, средство, направляющее к клетке или ткани в качестве мишени, например, лектин, гликопротеид, липид или белок, например, антитело, которое связывается с конкретным типом клеток, таким как клетка почки. Направляющая к мишени группа может представлять собой тиротропин, меланотропин, лектин, гликопротеид, поверхностно-активный белок A, углевод муцин, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу, поливалентную фукозу, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентную галактозу, трансферрин, бисфосфонат, полиглютамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчную кислоту, фолат, витамин B12, биотин или пептид RGD или миметик пептида RGD.

В некоторых вариантах лигандом является лиганд GalNAc, который содержит одно или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Дополнительное описание лигандов GalNAc представлено в разделе, озаглавленном «Конъюгаты с углеводами».

Другие примеры лигандов включают красители, интеркаляторы (например акридины), поперечные линкеры (например, псорален, митомицин C), порфирины (TPPC4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например EDTA), липофильные молекулы, например, холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бис-O(гексадецил)глицерин, жеранилоксигексильную группу, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, O3-(олеоил)литохолевую кислоту, O3-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин) и конъюгаты пептидов (например, пептида antennapedia, пептида Tat), алкилирующие агенты, фосфат, амино-, меркапто-, ПЭГ (например, ПЭГ-40K), MPEG, [MPEG]2, полиамино-, алкил, замещенный алкил, радиоактивно меченые маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), средства, облегчающие транспорт/всасывание (например, аспирин, витамин E, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, кластеры имидазола, конъюгаты акридина-имидазола, комплексы Eu3+ тетраазамакроциклов), динитрофенил, HRP или AP.

Лиганды могут представлять собой белки, например, гликопротеиды, или пептиды, например, молекулы, обладающие специфичной аффинностью по отношению к колиганду, или антитела, например, антитело, которое связывается с конкретным типом клеток, таким как раковая клетка, эндотелиальная клетка или костная клетка. Лиганды также могут включать гормоны и рецепторы гормонов. Лиганды также могут включать непептидные формы, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглукозамин, поливалентная манноза или поливалентная фукоза. Лигандом может быть, например, липополисахарид, активатор MAP-киназы p38 или активатор NF-κB.

Лигандом может быть вещество, например, лекарственное средство, которое может увеличивать захват и-РНК-средства в клетку, например, за счет разрушения клеточного цитоскелета, например, за счет разрушения клеточных микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов. Лекарственным средством может быть, например, таксол, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, джаплакинолид, латрункулин A, фаллоидин, свинхолид A, инданоцин или миосервин.

В некоторых вариантах лиганд, связанный с и-РНК, которая описана в настоящей публикации, действует в качестве фармакокинетического модулятора (ФК-модулятора). ФК-модуляторы включают липофильные вещества, желчные кислоты, стероиды, аналоги фосфолипидов, пептиды, связывающие белки средства, ПЭГ, витамины и т.д.. Примеры ФК-модуляторов включают без ограничения холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицерид, фосфолипиды, сфингодипиды, напроксен, ибупрофен, витамин E, биотин и т.д.. Также известно, что олигонуклеотиды, которые содержат множество фосфоротиоатных связей, связываются с сывороточным белком, таким образом, короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды длиной примерно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие множество фосфоротиоатных связей в остове, также приемлемы для настоящего изобретения в качестве лигандов (например, в качестве ФК-модулирующих лигандов). Кроме того, аптамеры, которые связывают компоненты сыворотки (например, сывороточные белки) также подходят для применения в качестве ФК-модулирующих лигандов в вариантах, описанных в настоящей публикации.

Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть синтезированы с использованием олигонуклеотида, который несет боковую реакционно-способную функциональную группу, такую как функциональная группа, полученная в результате связывания линкерной молекулы с олигонуклеотидом (описанным ниже). Такой реакционно-способный олигонуклеотид может непосредственно взаимодействовать с коммерчески доступными лигандами, лигандами, которые синтезируют, несущими любую из множества защитных групп, или лигандами, которые имеют связанный с ними линкерный остаток.

Олигонуклеотиды, используемые в конъюгатах согласно настоящему изобретению, могут быть получены удобным и обычным образом с применением хорошо известных способов твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими поставщиками, включая, например, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Дополнительно или альтернативно можно применять любые другие способы такого синтеза, известные в данной области. Также известно применение сходных способов для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоаты и алкилированные производные.

В случае конъюгированных с лигандами олигонуклеотидов и несущих молекулу лиганда связанных в специфичную последовательность нуклеозидов согласно настоящему изобретению, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды могут быть собраны на подходящем ДНК-синтезаторе с использованием стандартных предшественников нуклеотидов или нуклеозидов или предшественников конъюгатов нуклеотидов или нуклеозидов, которые уже несут связывающий остаток, предшественников лиганд-нуклеотидов или нуклеозидных конъюгатов, которые уже несут молекулу лиганда, или строительных блоков, несущих ненуклеозидные лиганды.

В случае использования предшественников нуклеотидных конъюгатов, которые уже несут линкерный остаток, обычно осуществляют синтез связанных в специфичную последовательность нуклеозидов и затем молекулу лиганда подвергают взаимодействию с линкерным остатком с образованием конъюгированного с лигандом олигонуклеотида. В некоторых вариантах олигонуклеотиды или связанные нуклеозиды согласно настоящему изобретению синтезируют с помощью автоматического синтезатора, используя фосфорамидиты, полученные из конъюгатов лиганд-нуклеозид, в дополнение в стандартным фосфорамидитам и нестандартным фосфорамидитам, которые коммерчески доступны и которые обычно используют для синтеза олигонуклеотидов.

Конъюгаты с липидами

В одном варианте лиганд является липидом или основанной на липиде молекулой. Такой липид или основанная на липиде молекула обычно может связываться с сывороточным белком, таким как сывороточный альбумин человека (HAS). Лиганд, связывающий HSA, обеспечивает возможность распределения конъюгата в ткань-мишень, например, непочечную ткань-мишень организма. Например, тканью-мишенью может быть печень, включая паренхиматозные клетки печени. В качестве лигандов также можно использовать другие молекулы, которые могут связываться с HSA. Например, можно использовать непроксин или аспирин. Липид или лиганд на основе липида могут (a) повышать устойчивость конъюгата к разложению, (b) улучшать направление к мишени или транспорт в клетку-мишень или клеточную мембрану, и/или (c) можно использовать для регуляции связывания с белком сыворотки, например, HSA.

Лиганд на основе липидов можно использовать для того, чтобы модулировать, например, контролировать (например, ингибировать) связывание конъюгата с тканью-мишенью. Например, липид или лиганд на основе липидов, который связывает с HSA более прочно, будет с меньшей вероятностью прицельно направлен в почки и, следовательно, с меньшей вероятностью будет выводиться из организма. Липид или лиганд на основе липидов, который связывается с HSA менее прочно, можно использовать для того, чтобы прицельно направить конъюгат в почки.

В одном варианте лиганд, основанный на липиде, связывается с HSA. Например, лиганд может связывать HSA с аффинностью, достаточной для того, чтобы усилить распределение конъюгата в непочечную ткань. Однако обычно аффинность не настолько высокая, чтобы связывание HAS с лигандом не могло быть обратимым.

В другом варианте лиганд, основанный на липиде, связывает HSA слабо или совсем не связывает, так что распределение конъюгата в почки усиливается. Другие остатки, которые нацеливают в почечные клетки, также можно использовать вместо или дополнительно к лиганду, основанному на липиде.

В другом аспекте лиганд представляет собой остаток, например витамин, который захватывается клеткой-мишенью, например пролиферирующей клеткой. Такие лиганды особенно применимы для лечения расстройств, характеризующихся нежелательной клеточной пролиферацией, например, злокачественного или доброкачественного типа, например раковых клеток. Примеры витаминов включают витамин A, E и K. Другие примеры витаминов включают витамин B, например фолиевую кислоту, B12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль или другие витамины или питательные вещества, захватываемые раковыми клетками. Также включены HSA и липопротеид низкой плотности (ЛПНП).

Средства для проникновения в клетку

В другом аспекте лиганд представляет собой средство для проникновения в клетку, предпочтительно спиральное средство для проникновения в клетку. В одном варианте средство является амфипатическим. Примером средства является пептид, такой как tat или antennopedia. Если средство представляет собой пептид, то оно может быть модифицировано, включая пептидилмиметики, инвертомеры, непептидные или псевдопептидные связи и применение D-аминокислот. Спиральное средство предпочтительно представляет собой средство в форме α-спирали и оно может иметь липофильную и липофобную фазу.

Лигандом может быть пептид или пептидомиметик. Пептидомиметик (также называемый в настоящем описании олигопептидомиметиком) представляет собой молекулу, способную укладываться в определенную трехмерную структуру, сходную со структурой природного пептида. Связывание пептида пептидомиметиков с и-РНК-средствами может влиять на фармакокинетическое распределение и-РНК, например за счет усиления клеточного распознавания и всасывания. Остаток пептида или пептидомиметика может иметь длину примерно 5-50 аминокислот, например, длиной примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот.

Пептидом или пептидомиметиком может быть, например, пептид для проникновения в клетку, катионный пептид, амфипатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий, главным образом, из Tyr, Trp или Phe). Пептидный остаток может представлять собой дендримерный пептид, конформационно ограниченный пептид или поперечно сшитый пептид. В другом альтернативном варианте пептидный остаток может содержать гидрофобную последовательность транслокации через мембрану (MTS). Примером пептида, содержащего гидрофобную MTS, является RFGF, имеющий аминокислотную последовательность AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 3367). Аналог RFGF (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 3368)), содержащий гидрофобную MTS, также может быть направляющим к мишени остатком. Пептидный остаток может представлять собой пептид «для доставки», который может нести крупные полярные молекулы, включая пептиды, олигонуклеотиды и белок, через клеточные мембраны. Например, было обнаружено, что последовательности из белка Tat ВИЧ (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 3369)) и белка Antennapedia Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 3370)) способны функционировать в качестве пептидов для доставки. Пептид или пептидомиметик могут кодироваться случайной последовательностью ДНК, например, как пептид, идентифицированный из библиотеки в фаговом дисплее или комбинаторной библиотеки «один шарик-одно соединение» (OBOC) (Lam с соавторами, Nature, 354: 82-84, 1991). Обычно пептид или пептидомиметик, связанный с днРНК-средством через включенную мономерную единицу, является направляющим в клетку-мишень пептидом, таким как пептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) или миметик RGD. Пептидный остаток может иметь длину в диапазоне примерно от 5 аминокислот до примерно 40 аминокислот. Пептидные остатки могут иметь структурную модификацию, в частности для повышения стабильности или прямых конформационных свойств. Можно использовать любую из структурных модификаций, описанных ниже.

Пептид RGD для применения в композициях и способах согласно изобретению может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным, например, гликозилированным или метилированным, чтобы облегчить нацеливание на конкретную ткань (ткани). RGD-содержащие пептиды и пептидомиметики могут содержать D-аминокислоты, а также синтетические миметики RGD. Кроме RGD можно использовать другие остатки, мишенью которых является лиганд интегрин. Мишенью предпочтительных конъюгатов такого лиганда является PECAM-1 или VEGF.

Пептидный остаток RGD можно использовать для целенаправленного действия на конкретный тип клеток, например, опухолевую клетку, такую как эндотелиальная опухолевая клетка или клетка рака молочной железы (Zitzmann с соавторами, Cancer Res., 62: 5139-43, 2002). Пептид RGD может облегчать целенаправленное действие днРНК-средства на опухоли множества других тканей, включая легкое, почки, селезенку или печень (Aoki с соавторами, Cancer Gene Therapy 8: 783-787, 2001). Обычно пептид RGD может способствовать целенаправленному действию и-РНК-средства на почки. Пептид RGD может быть линейным или циклическим, и может быть модифицирован, например, гликозилирован или метилирован для облегчения целенаправленного действия на конкретные ткани. Например, гликозилированный пептид RGD может доставлять и-РНК-средство к опухолевой клетке, экспрессирующей αvβ3 (Haubner с соавторами, Jour. Nucl. Med., 42: 326-336, 2001).

«Пептид для проникновения в клетку» способен обеспечивать проницаемость клетки, например, клетки микроорганизма, такой как бактериальная клетка или клетка гриба, или клетки млекопитающего, такой как клетка человека. Пептид для проницаемости клеток микроорганизмов может представлять собой, например, α-спиральный линейный пептид (например, LL-37 или церопорин PI), пептид, содержащий дисульфидную связь (например, α-дефензин, β-дефензин или бактенецин), или пептид, содержащий только одну или две преобладающие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Пептид для проникновения в клетку также может содержать сигнал ядерной локализации (NLS). Например, пептид для проникновения в клетку может представлять собой состоящий из двух частей амфипатический пептид, такой как MPG, который получен из слитого пептидного домена gp41 ВИЧ-1 и NLS большого T-антигена SV40 (Simeoni с соавторами, Nucl. Acids Res. 31: 2717-2724, 2003).

Конъюгаты с углеводами

В некоторых вариантах композиций и способов согласно изобретению олигонуклеотид и-РНК дополнительно содержит углевод. Конъюгированные с углеводами и-РНК являются предпочтительными для доставки in vivo нуклеиновых кислот, а также композиций, подходящих для терапевтического применения in vivo, которые описаны в настоящей публикации. В используемом в настоящем описании смысле «углевод» относится к соединению, которое является либо углеводом как таковым, состоящим из одной или нескольких моносахаридных единиц, имеющих, по меньшей мере, 6 атомов углерода (который может быть линейным, разветвленным или циклическим), при этом с каждым атомом углерода связан атом кислорода, азота или серы; либо соединением, имеющим в качестве его части остаток углевода, состоящий из одной или нескольких моносахаридных единиц, каждая из которых имеет, по меньшей мере, шесть атомов углерода (который может быть линейным, разветвленным или циклическим), при этом с каждым атомом углерода связан атом кислорода, азота или серы. Соответствующие углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие примерно 4, 5, 6, 7, 8 или 9 моносахаридных единиц), и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные камеди. Конкретные моносахариды включают C5-сахара и выше (например, C5, C6, C7 или C8); ди- и трисахариды включают сахара, имеющие две или три моносахаридных единицы (например, C5, C6, C7 или C8).

В одном варианте конъюгат с углеводом содержит моносахарид. В одном варианте моносахаридом является N-ацетилгалактозамин (GalNAc). GalNAc-конъюгаты описаны, например, в патенте США № 8106022, полное содержание которого включено в настоящее описание в виде ссылки. В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат служит в качестве лиганда, который направляет и-РНК к конкретным клеткам. В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат направляет и-РНК в клетки печени, например, за счет того, что он служит в качестве лиганда рецептора асиалогликопротеида клеток печени (например, гепатоцитов).

В некоторых вариантах углеводный конъюгат содержит одно или несколько производных GalNAc. Производные GalNAc могут быть связаны через линкер, например, бивалентный или трехвалентный разветвленный линкер. В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат конъюгирован с 3'-концом смысловой нити. В некоторых вариантах GalNac-конъюгат конъюгирован с и-РНК-средством (например, с 3'-концом смысловой нити) через линкер, например, линкер, который описан в настоящей публикации.

В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат представляет собой

В некоторых вариантах РНК-и-средство связано в конъюгате с углеводом через линкер, который показан на следующей схеме, где X означает O или S.

В некоторых вариантах РНК-и-средство конъюгировано с L96, который определен в таблице 1 и показан ниже

В некоторых вариантах углеводный конъюгат для применения в композициях и способах согласно изобретению выбран из группы, состоящей из:

Другой типичный углеводный конъюгат для применения в вариантах, описанных в настоящей публикации, включает без ограничения

(формула XXIII), где один из X или Y означает олигонуклеотид, а другой означает водород.

В некоторых вариантах углеводный конъюгат дополнительно содержит один или несколько дополнительных лигандов, которые описаны выше, например, но без ограничения ФК-модулятор и/или пептид для проникновения в клетку.

В одном варианте и-РНК согласно изобретению конъюгирована с углеводом через линкер. Не ограничивающие примеры и-РНК-углеводных конъюгатов с линкерами в композициях и способы согласно изобретению включают без ограничения

(формула XXX), где один из X или Y означает олигонуклеотид, а другой означает водород.

Линкеры

В некоторых вариантах конъюгат или лиганд, описанный в настоящей публикации, может быть связан с олигонуклеотидом и-РНК с использованием различных линкеров, которые могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.

Термин «линкер» или «линкерная группа» означает органический остаток, который связывает две части соединения, например, ковалентно связывает две части соединения. Линкеры обычно содержат непосредственную связь или такой атом как атом кислорода или серы, такую единицу как NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH или цепь из атомов, такую как без ограничения замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероарилалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкенилгетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкенилгетероарилалкинил, алкинилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетероциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил, алкинилгетероциклилалкенил, алкинилгетероциклилалкинил, алкиларил, алкениларил, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, при этом один или несколько метиленов могут быть прерваны или иметь на конце O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероцикл; где R8 означает водород, ацил, алифатическую или замещенную алифатическую группу. В одном варианте линкер содержит примерно 1-24 атома, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 атомов, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 или 8-16 атомов.

В одном варианте днРНК согласно изобретению конъюгирована с бивалентным или трехвалентным разветвленным линкером, выбранным из группы структур, показанных в любой из формул (XXXI) - (XXXIV):

где:

q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B и q5C независимо в каждом случае означают 0-20, и где повторяющиеся единицы могут быть одинаковыми или разными;

P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T5A, T5B, T5C независимо в каждом случае отсутствуют, означают CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH или CH2O;

Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C независимо в каждом случае отсутствуют, означают алкилен, замещенный алкилен, где один или несколько метиленов могут быть прерваны или иметь на конце один или несколько из O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R”), C≡С или C(O);

R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C каждый независимо в каждом случае отсутствует, означает NH, O, S, CH2, C(O)0, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-0,

или гетероциклил;

L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B и L5C означают лиганд; т.е. каждый независимо в каждом случае означает моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид; и Ra означает H или боковую цепь аминокислоты. Трехвалентный конъюгируемые производные GalNAc особенно полезны в случае применения с РНК-и-средствами для ингибирования экспрессии гена-мишени, такие как соединения формулы (XXXV):

Формула XXXV

где L5A, L5B и L5C означают моносахарид, такой как производное GalNAc.

Примеры подходящих бивалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп конъюгируемых производных GalNAc включают без ограничения структуры, перечисленные выше, представленные формулами II, VII, XI, X и XIII.

Расщепляемой линкерной группой является группа, которая в достаточной мере стабильна вне клетки, но которая при проникновении в клетку-мишень расщепляется, высвобождая две части, удерживаемые вместе в линкере. В предпочтительном варианте расщепляемая линкерная группа расщепляется, по меньшей мере, примерно в 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или больше или, по меньшей мере, примерно в 100 раз быстрее в клетке-мишени или в определенных эталонных условиях (которые могут быть, например, выбраны для того, чтобы имитировать или представить условия внутри клетки), чем в крови субъекта или в случае других эталонных условий (которые могут быть, например, выбраны для того, чтобы имитировать или представить условия, встречающиеся в крови или сыворотке).

Расщепляемые линкерные группы чувствительны к расщепляющим агентам, например, pH, окислительно-восстановительному потенциалу или присутствию вызывающих распад молекул. Обычно расщепляющие агенты преобладают или встречаются на более высоких уровнях или с более высокими активностями внутри клеток, чем в сыворотке или крови. Примеры таких агентов, вызывающих распад, включают: окислительно-восстановительные агенты, которые выбраны для конкретных субстратов или которые не обладают субстратной специфичностью, включая, например, окислительные или восстановительные ферменты или такие восстановители, как меркаптаны, которые присутствуют в клетках, которые могут вызывать распад расщепляемых в реакции окисления-восстановления линкерных групп в результате восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые могут создавать кислую среду, например, средства, которые приводят к значению pH пять или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или приводить к распаду расщепляемой кислотами линкерной группы, действуя как обычная кислота, пептидазы (которые могут обладать субстратной специфичностью) и фосфатазы.

Расщепляемая линкерная группа, такая как дисульфидная связь, может быть чувствительной к pH. Значение pH сыворотки человека равно 7,4, тогда как среднее значение внутриклеточного pH немного ниже в диапазоне примерно от 7,1 до 7,3. Эндосомы имеют более кислое значение pH, в диапазоне 5,5-6,0, и лизосомы имеют еще более кислый pH около 5,0. Некоторые линкеры будут иметь расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется при предпочтительном значении pH, высвобождая при этом катионный липид из лиганда в клетку или в требуемый компартмент клетки.

Линкер может содержать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется конкретным ферментом. Тип расщепляемой линкерной группы, включенной в линкер, может зависеть от клетки, которая является мишенью. Например, направляющий в печень лиганд может быть связан с катионным липидом через линкер, который содержит сложноэфирную группу. Клетки печени богаты эстеразами, и поэтому линкер будет расщепляться более эффективно в клетках печени, чем в типах клеток, которые не богаты эстеразами. Другие типы клеток, богатых эстеразами, включают клетки легкого, коркового вещества почки и семенников.

Линкеры, которые содержат пептидные связи, можно использовать в том случае, когда типы клеток-мишеней богаты пептидазами, такие как клетки печени и синовиоциты.

В общем, чувствительность расщепляемых линкерных групп-кандидатов можно оценить, тестируя способность вызывающего распад агента (или условия) расщеплять выбранную для исследования линкерную группу. Также может требоваться тестирование выбранной для исследования линкерной группы в отношении способности быть резистентной к расщеплению в крови или в случае контакта с другой тканью, не являющейся мишенью. Таким образом, можно определить относительную чувствительность к расщеплению в случае первого и второго условия, при этом первое выбирают так, чтобы оно указывало на расщепление в клетке-мишени, а второе выбирают так, чтобы оно указывало на расщепление в других тканях или биологических жидкостях, например, в крови или сыворотке. Оценки можно осуществлять в бесклеточных системах, в клетках, в культуре клеток, в культуре органа или ткани или в целом организме животного. Могут быть полезными начальные оценки в бесклеточных условиях или в условиях культуры и для подтверждения дальнейшие оценки в целом организме животного. В предпочтительных вариантах применимые выбранные для исследования соединения расщепляются, по меньшей мере, примерно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или примерно 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных с целью имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью или сывороткой (или в условиях in vitro, выбранных с целью имитации внеклеточных условий).

Расщепляемые при окислении-восстановлении линкерные группы

В одном варианте расщепляемая линкерная группа представляет собой расщепляемую при окислении-восстановлении линкерную группу, которая расщепляется при восстановлении или окислении. Примером расщепляемой при восстановлении линкерной группы является дисульфидная линкерная группа (-S-S-). Чтобы определить, является ли выбранная для исследования расщепляемая линкерная группа подходящей «расщепляемой при восстановлении линкерной группой» или, например, подходящей для применения с конкретным остатком и-РНК и конкретным направляющим к мишени агентом, можно обратиться к способам, описанным в настоящей публикации. Например, кандидата можно оценивать посредством инкубации с дитиотреитолом (DTT) или другим восстановителем, используя реагенты, известные в данной области, которые имитируют скорость расщепления, которую можно наблюдать в клетке, например, в клетке-мишени. Выбранных для исследования кандидатов также можно оценивать в условиях, которые выбирают так, чтобы имитировать условия в крови или сыворотке. В одном варианте выбранные для исследования соединения расщепляются не больше чем примерно на 10% в крови. В других вариантах полезные выбранные для исследования соединения распадаются, по меньшей мере, примерно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или примерно в 100 раз быстрее в клетке (или в условиях in vitro, выбранных так, чтобы они имитировали внутриклеточные условия) по сравнению с кровью (или в условиях in vitro, выбранных так, чтобы они имитировали внутриклеточные условия). Скорость расщепления выбранных для исследования соединений также можно определить, используя стандартные ферментативные кинетические анализы в условиях, выбранных так, чтобы они имитировали внутриклеточную среду, и сравнивая с условиями, выбранными так, чтобы они имитировали внеклеточную среду.

Основанные на фосфате расщепляемые линкерные группы

В другом варианте расщепляемый линкер содержит основанную на фосфате расщепляемую линкерную группу. Основанная на фосфате расщепляемая линкерная группа расщепляется агентами, которые или вызывают распад или гидролизируют фосфатную группу. Примерами средства, которое расщепляет фосфатные группы в клетках, являются ферменты, такие как фосфатаза в клетках. Примерами основанных на фосфате линкерных групп являются -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Предпочтительными вариантами являются -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -0-P(S)(H)-0-, -S-P(O)(H)-0, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительным вариантом является -O-P(O)(OH)-O-. Указанные выбранные для исследования кандидаты можно оценить, используя способы, аналогичные описанным выше способам.

Расщепляемая кислотой линкерная группа

В другом варианте расщепляемый линкер содержит расщепляемую кислотой линкерную группу. Расщепляемая кислотой линкерная группа представляет собой группу, которая расщепляется в кислых условиях. В предпочтительных вариантах расщепляемые кислотой линкерные группы расщепляются в кислой среде с pH примерно 6,5 или ниже (например, примерно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 или ниже) или такими агентами, как ферменты, которые могут действовать как обычная кислота. В клетке специальные органеллы с низким pH, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечивать среду для расщепления расщепляемых кислотой линкерных групп. Примеры расщепляемых кислотой линкерных групп включают без ограничения гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Расщепляемые кислотой группы могут иметь общую формулу -C=NN-, C(O)O или -OC(O). Предпочтительным вариантом в том случае, когда атом углерода связан с атомом кислорода сложного эфира (алкоксигруппа) является арильная группа, замещенная алкильная группа или третичная алкильная группа, такая как диметилпентил или трет-бутил. Такие кандидаты можно оценить, используя способы, аналогичные описанным выше способам.

Основанные на сложных эфирах расщепляемые линкерные группы

В другом варианте расщепляемый линкер содержит основанную на сложном эфире расщепляемую линкерную группу. Основанная на сложном эфире расщепляемая линкерная группа расщепляется в клетке такими ферментами как эстеразы и амидазы. Примеры основанных на сложных эфирах расщепляемых линкерных групп включают без ограничения сложные эфиры групп алкилена, алкенилена и алкинилена. Сложноэфирные расщепляемые линкерные группы имеют общую формулу -C(O)O- или -OC(O)-. Такие кандидаты можно оценить, используя способы, аналогичные описанным выше способам.

Основанные на пептидах расщепляемые линкерные группы

В еще одном варианте расщепляемый линкер содержит основанную на пептиде расщепляемую линкерную группу. Основанная на пептиде расщепляемая линкерная группа расщепляется в клетке такими ферментами, как пептидазы и протеазы. Основанные на пептидах расщепляемые линкерные группы представляют собой пептидные связи, образованные между аминокислотами, которые приводят к образованию олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.д.) и полипептидов. Основанные на пептидах расщепляемые группы не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может быть образована между любыми алкиленами, алкениленами или алкиниленами. Пептидная связь представляет собой специальный тип амидной связи, образованной между аминокислотами и приводящей к образованию пептидов и белков. Основанная на пептиде расщепляемая группа обычно ограничена пептидной связью (т.е. амидной связью), образованной между аминокислотами с получением пептидов и белков и не включает полную амидную функциональную группу. Основанные на пептидах расщепляемые линкерные группы имеют общую формулу - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O) - (SEQ ID NO: 13), где RA и RB представляют собой R-группы двух соседних аминокислот. Такие кандидаты можно оценивать с использованием способов, аналогичных описанным выше способам.

Соответствующие патенты США, в которых описано получение конъюгатов РНК, включают без ограничения патенты США №4828979, 4948882, 5218105, 5525465, 5541313, 5545730, 5552538, 5578717, 5580731, 5591584, 5109124, 5118802, 5138045, 5414077, 5486603, 5512439, 5578718, 5608046, 4587044, 4605735, 4667025, 4762779, 4789737, 4824941, 4835263, 4876335, 4904582, 4958013, 5082830, 5112963, 5214136, 5082830, 5112963, 5214136, 5245022, 5254469, 5258506, 5262536, 5272250, 5292873, 5317098, 5371241, 5391723, 5416203, 5451463, 5510475, 5512667, 5514785, 5565552, 5567810, 5574142, 5585481, 5587371, 5595726, 5597696, 5599923, 5599928 и 5688941, 6294664, 6320017, 6576752, 6783931, 6900297, 7037646, 8106022, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание в виде ссылки.

Необязательно, чтобы данное соединение было единообразно модифицировано во всех положениях, и в действительности в одно соединение или даже в один нуклеозид в и-РНК может быть включено более одной из вышеуказанных модификаций. Настоящее изобретение также относится к соединениям и-РНК, которые являются химерными соединениями.

«Химерные» соединения и-РНК или «химеры» в контексте настоящего изобретения представляют собой соединения и-РНК, например, днРНК, которые содержат две или больше химически отличающихся областей, каждая из которых состоит, по меньшей мере, из одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае соединения днРНК. Такие и-РНК обычно содержат, по меньшей мере, одну область, в которой РНК модифицирована так, чтобы придать и-РНК повышенную устойчивость к расщеплению нуклеазами, увеличенный захват в клетки и/или повышенную аффинность связывания нуклеиновой кислоты-мишени. Дополнительная область и-РНК может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера РНК-аза H является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет нить РНК дуплекса РНК:ДНК. Поэтому активация РНК-азы H приводит к расщеплению РНК-мишени, тем самым значительно повышая эффективность ингибирования экспрессии генов под действием и-РНК. Следовательно, при использовании химерных днРНК часто можно получить сравнимые результаты в случае более коротких и-РНК по сравнению с фосфоротиоатными дезокси-днРНК, гибридизующимися с той же областью-мишенью. Расщепление РНК-мишени можно выявить обычным образом, используя гель-электрофорез, и при необходимости ассоциированные способы гибридизации нуклеиновых кислот, известные в данной области.

В некоторых случаях РНК в и-РНК может быть модифицирована нелигандной группой. Множество нелигандных молекул было конъюгировано с и-РНК, чтобы повысить активность, распределение в клетках или клеточный захват и-РНК, и способы получения таких конъюгатов доступны в научной литературе. Такие нелигандные остатки включали липидные остатки, такие как холестерин (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1): 54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 6553), холевую кислоту (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4: 1053), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660: 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например, дигексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-O-гексадецил-рац-глицеро-3-H-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777), полиамин или цепь полиэтиленгликоля (Manoharan et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14: 969), или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651), остаток пальмитоила (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229), или остаток октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923). Соответствующие патенты США, в которых описано получение таких конъюгатов РНК, было описано выше. Типичные протоколы конъюгации включают синтез РНК, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях последовательности. Затем аминогруппу подвергают взаимодействию с конъюгируемой молекулой, используя соответствующие реагенты для связывания или активации. Реакция конъюгации может быть осуществлена либо с РНК, все еще связанной с твердой подложкой, либо после отщепления РНК в фазе раствора. Очистку РНК-конъюгата с использованием ВЭЖХ обычно дает чистый конъюгат.

Доставка и-РНК

Доставка и-РНК в организм субъекта, нуждающегося в такой доставке, может быть осуществлена несколькими различными путями. Доставка in vivo может быть осуществлена непосредственно введением композиции, содержащей и-РНК, например, днРНК, субъекту. Альтернативно, доставка может быть осуществлена опосредованно введением одного или нескольких векторов, которые кодируют и направляют экспрессию и-РНК. Такие альтернативные варианты дополнительно обсуждаются ниже.

Прямая доставка

В общем, любой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты может быть адаптирован для применения с и-РНК (См., например, публикации Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5): 139-144 и WO94/02595, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме). Однако существует три фактора, которые важно учитывать, чтобы успешно доставить молекулу и-РНК in vivo: (a) биологическая стабильность доставляемой молекулы, (2) предотвращение неспецифичных эффектов и (3) накопление доставляемой молекулы в ткани-мишени. Неспецифичные эффекты и-РНК могут быть минимизированы при локальном введении, например, посредством прямой инъекции или имплантации в ткань (в качестве не ограничивающего примера, в опухоль) или местом введении препарата. Локальное введение в место лечения максимизирует местную концентрацию средства, ограничивает воздействие средства на ткани всего организма, которые могут в ином случае могут пострадать при действии средства или которые могут вызвать распад средства, и позволяет вводить более низкую общую дозу молекулы и-РНК. В нескольких исследованиях показан успешный нокдаун генных продуктов при локальном введении и-РНК. Например, было показано, что внутриглазная доставка днРНК VEGF посредством инъекции в стекловидное тело макакам-крабоедам (Tolentino, ML, et al. (2004) Retina 24: 132-138) и субретинальные инъекции у мышей (Reich, SL, et al. (2003) Mol. Vis. 9: 210-216) предотвращают неоваскуляризацию в экспериментальной модели возрастной макулярной дегенерации. Кроме того, прямая внутриопухолевая инъекция днРНК мышам уменьшает объем опухоли (Pille, L, et al. (2005) Mol. Ther. 11: 267-274) и может увеличивать продолжительность жизни мышей, несущих опухоли (Kim, WL, et al. (2006) Mol. Ther. 14: 343-350; Li, S., et al. (2007) Mol. Ther. 15: 515-523). Также была показана успешная интерференция РНК в случае локальной доставки в ЦНС посредством прямой инъекции (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) и в легкие посредством интраназального введения (Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55). В случае системного введения и-РНК для лечения заболевания РНК может быть модифицирована или альтернативно доставлена с использованием системы доставки лекарственного средства; при этом оба способа действуют, предотвращая быстрый распад днРНК под действием эндо- и экзонуклеаз in vivo.

Модификация РНК или фармацевтического носителя также может позволять направлять композицию и-РНК в ткань-мишень и избегать нежелательных нецелевых эффектов. Молекулы и-РНК могут быть модифицированы в результате химической конъюгации с другими группами, например, липидной или углеводной группой, которые описаны в настоящей публикации. Такие конъюгаты можно применять для того, чтобы направить и-РНК в конкретные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты. Например, препараты GalNAc-конъюгатов или липидные (например, LNP) можно использовать для того, чтобы направить и-РНК в конкретные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты.

Липофильные группы, такие как холестерин, усиливают захват клетками и предотвращают распад. Например, и-РНК, направленную против ApoB, конъюгированного с липофильным остатком холестерина, инъецировали системно мышам, что приводило к нокдауну мРНК apoB как в печени, так и в тонкой кишке (Soutschek, J., et al. (2004) Nature 432: 173-178). Было показано, что конъюгация и-РНК с аптамером ингибирует рост опухолей и опосредует регрессию опухоли в мышиной модели рака простаты (McNamara, JO., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1005-1015). В альтернативном варианте и-РНК может быть доставлена с использованием систем доставки лекарственных средств, таких как наночастица, дендример, полимер, липосомы или катионные системы доставки. Положительно заряженные катионные системы доставки способствуют связыванию молекулы и-РНК (отрицательно заряженной), а также усиливают взаимодействия в отрицательно заряженной клеточной мембране, обеспечивая возможность эффективного захвата и-РНК клеткой. Катионные липиды, дендримеры или полимеры могут либо быть связаны с и-РНК, либо индуцированы с целью образования везикулы или мицеллы (См., например, Kim SH., et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2): 107-116), которая заключает в себе и-РНК. Образование везикул или мицелл дополнительно предотвращает распад и-РНК при системном введении. Способы получения и введения катионных и-РНК-комплексов может осуществить специалист в данной области (См., например, публикации Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме). Некоторые не ограничивающие примеры систем доставки лекарственных средств, применимых для системной доставки и-РНК, включают DOTAP (Sorensen, DR., et al. (2003), выше; Verma, UN., et al. (2003), выше), олигофектамин, «твердые частицы нуклеиновой кислоты-липида» (Zimmermann, TS., et al. (2006) Nature 441: 111-114), кардиолипин (Chien, PY., et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12: 321-328; Pal, A., et al. (2005) Int. J. Oncol. 26: 1087-1091), полиэтиленимин (Bonnet ME., et al. (2008) Pharm. Res. Aug. 16 Epub. ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), пептиды Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3: 472-487) и полиамидоамины (Tomalia, DA., et al. (2007) Biochem. Soc. Trans. 35: 61-67; Yoo, H., et al. (1999) Pharm. Res. 16: 1799-1804). В некоторых вариантах и-РНК образует комплекс с циклодекстрином для системного введения. Способы введения и фармацевтические композиции и-РНК и циклодекстринов можно найти в патенте США №7427605, который включен в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.

Кодируемые вектором и-РНК

В другом аспекте и-РНК, мишенью которой является ген ALAS1, может быть экспрессирована с транскрипционных единиц, встроенных в ДНК- или РНК-векторы (См., например, Couture, A с соавторами, TIG. (1996), 12: 5-10; Skillern, A. с соавторами, международная публикация PCT № WO 00/22113, Conrad, международная публикация PCT № WO 00/22114 и Conrad, патент США №6054299). Экспрессия может быть временной (порядка от нескольких часов до недель) или продолжительной (от недель до месяцев и дольше), в зависимости от конкретной используемой конструкции и ткани-мишени или типа клеток-мишеней. Такие трансгены могут быть введены в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может представлять собой интегрируемый или неинтегрируемый вектор. Трансген также может быть сконструирован так, чтобы обеспечить его наследование в виде внехромосомной плазмиды (Gassmann с соавторами, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292).

Отдельная нить или нити и-РНК могут быть транскрибированы с промотора, имеющегося в экспрессирующем векторе. В том случае, когда необходимо экспрессировать две отдельных нити, чтобы создать, например, днРНК, в клетку-мишень могут быть совместно введены два отдельных экспрессирующих вектора (например, посредством трансфекции или инфекции). Альтернативно каждая отдельная нить днРНК может быть транскрибирована с промоторов, которые оба находятся в одной и той же экспрессирующей плазмиде. В одном варианте днРНК экспрессируется в виде инвертированного повтора, соединенного линкерной полинуклеотидной последовательностью, так что днРНК имеет структуру «стебель-петля».

Вектор, экспрессирующий и-РНК, обычно представляет собой ДНК-плазмиду или вирусный вектор. Экспрессирующий вектор, совместимый с эукариотическими клетками, например, с клетками позвоночных, можно использовать для получения рекомбинантных конструкций для экспрессии и-РНК, которая описана в настоящей публикации. Векторы экспрессии в эукариотических клетках хорошо известны в данной области и доступны из множества коммерческих источников. Обычно такие векторы содержат подходящие сайты рестрикции для инсерции требуемого участка нуклеиновой кислоты. Доставка векторов, экспрессирующих и-РНК, может быть системной, такой как внутривенное или внутримышечное введение, путем введения в клетки-мишени, эксплантированных из организма пациента с последующим повторным введением в организм пациента или любыми другими способами, которые позволяют осуществлять введение в требуемую клетку-мишень.

Плазмида, экспрессирующая и-РНК, может быть трансфицирована в клетку-мишень в виде комплекса с катионным липидным носителем (например, олигофектамином) или не основанном на катионном липиде носителем (например, Transit-TKO™). Многократные трансфекции с использованием липидов для и-РНК-опосредованных нокдаунов, нацеленных на разные области РНК-мишени, в течение периода времени, составляющего неделю или больше, также предусмотрены в изобретении. Успешное введение векторов в клетки-хозяева можно наблюдать, используя различные известные способы. Например, сигналы, свидетельствующие о временной трансфекции, можно получать, благодаря репортеру, такому как флуоресцирующий маркер, такой как зеленый флуоресцирующий белок (GFP). В стабильной трансфекции клеток ex vivo можно удостовериться, используя маркеры, которые придают трансфицированной клетке резистентность к конкретным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), такую как резистентность к гигромицину B.

Системы вирусных векторов, которые можно использовать в способах и композициях, описанных в настоящей публикации, включают без ограничения (a) аденовирусные векторы; (b) ретровирусные векторы, включая без ограничения лентивирусные векторы, вирус лейкоза мышей Молони и т.д.; (c) векторы на основе аденоассоциированных вирусов; (d) векторы на основе вируса простого герпеса; (e) векторы SV40; (f) векторы на основе вируса полиомы; (g) векторы на основе вируса папилломы; (h) пикорнавирусные векторы; (i) векторы на основе поксвирусов, таких как ортопоксвирус, например, векторы на основе вируса вакцинии или авипоксвируса, например, поксвируса канареек или вируса оспы птиц; и (j) зависимый от хелперов или имеющий усеченный геном аденовирус. Дефектные по репликации вирусы также могут быть предпочтительными. Разные векторы будут включаться или не будут включаться в геном клеток. Конструкции при необходимости могут содержать вирусные последовательности для трансфекции. Альтернативно, конструкция может быть включена в векторы, способные к эписомной репликации, например, векторы EPV и EBV. Конструкции для рекомбинантной экспрессии и-РНК обычно могут требовать регуляторных элементов, например, промоторов, энхансеров и т.д., чтобы обеспечить экспрессию и-РНК в клетках-мишенях. Другие аспекты, которые следует учитывать в случае векторов и конструкций, дополнительно описаны ниже.

Векторы, применимые для доставки и-РНК, будут содержать регуляторные элементы (промотор, энхансер и т.д.), достаточные для экспрессии и-РНК в требуемой клетке-мишени или ткани-мишени. Регуляторные элементы могут быть выбраны так, чтобы они обеспечивали либо конститутивную, либо регулируемую/индуцируемую экспрессию.

Экспрессия и-РНК можно точно регулировать, например, используя индуцируемую регуляторную последовательность, которая чувствительна к некоторым физиологическим регуляторам, например, уровням глюкозы в циркуляции или гормонам (Docherty с соавторами, 1994, FASEB J. 8:20-24). Такие индуцируемые системы экспрессии, подходящие для регуляции экспрессии днРНК в клетках или в организмах млекопитающих, включают, например, регуляцию экдизоном, прогестероном, тетрациклином, химическими индукторами димеризации и изопропил-β-D1-тиогалактопиранозидом (IPTG). Специалист в данной области сможет выбрать подходящую регуляторную/промоторную последовательность на основе предполагаемого применения трансгена и-РНК.

В конкретном варианте можно использовать вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие и-РНК. Например, можно использовать ретровирусный вектор (См. публикацию Miller с соавторами, Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Такие ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие и-РНК, клонируют в одном или нескольких векторах, которые обеспечивают доставку нуклеиновой кислоты в организм пациента. Более подробную информацию о ретровирусных векторах можно найти, например, в публикации Boesen с соавторами (Biotherapy 6: 291-302 (1994)), в которой описано применение ретровирусного вектора для доставки гена mdr1 в гематопоэтические стволовые клетки, чтобы получить стволовые клетки, более устойчивые к химиотерапии. Другими публикациями, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); and Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Лентивирусные векторы, предполагаемые для применения, включают, например, векторы на основе ВИЧ, описанные в патентах США №6143520, 5665557 и 5981276, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Аденовирусы также предполагаются для применения для доставки и-РНК. Аденовирусы являются особенно привлекательными носителями, например, для доставки генов в эпителий дыхательных путей. Аденовирусы в природе инфицируют эпителий дыхательных путей, при этом они вызывают легкое заболевание. Другими мишенями основанных на вирусах систем доставки являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышцы. Аденовирусы имеют преимущество, так как способны инфицировать неделящиеся клетки. Kozarsky и Wilson (Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 (1993)) представили обзор генной терапии на основе аденовирусов. Bout с соавторами (Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994)) продемонстрировали применение аденовирусных векторов для переноса генов в эпителий дыхательных путей макак-резус. Другие случаи применения аденовирусов для генной терапии можно найти в публикациях Rosenfeld с соавторами, (Science 252: 431-434 (1991)), Rosenfeld с соавторами (Cell 68: 143-155 (1992)), Mastrangeli с соавторами (J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993)), в публикации PCT WO94/12649; и в публикации Wang с соавторами (Gene Therapy 2: 775-783 (1995)). Подходящий AV-вектор для экспрессии и-РНК, охарактеризованной в изобретении, способ конструирования рекомбинантного AV-вектора и способ доставки вектора в клетки-мишени описаны Xia H. с соавторами ((2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010).

Также предполагается применение векторов на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) (Walsh с соавторами, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993); патент США №5436146). В одном варианте и-РНК может быть экспрессирована в виде двух отдельных комплементарных однонитевых молекул РНК с рекомбинантного AAV-вектора, имеющего, например, промоторы либо U6-, либо H1-РНК, или промотор цитомегаловируса (CMV). Подходящие AAV-векторы для экспрессии днРНК, охарактеризованной в изобретении, способы конструирования рекомбинантного AV-вектора и способы доставки векторов в клетки-мишени описаны в Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826;

в патенте США №5252479, патенте США №5139941, международной заявке на выдачу патента № WO 94/13788 и международной заявке на выдачу патента № WO 93/24641, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.

Другим типичным вирусным вектором является поксвирус, такой как вирус вакцинии, например, ослабленный вирус вакцинии, такой как модифицированный вирус Ankara (MVA) или NYVAC, авипоксвирус, такой как вирус оспы птиц или поксвирус канареек.

Тропизм вирусных векторов можно модифицировать, псевдотипируя векторы с использованием белков оболочки или других поверхностных антигенов из других вирусов, или при необходимости заменяя другими вирусными капсидными белками. Например, лентивирусные векторы могут быть псевдотипированы с использованием поверхностных белков из вируса везикулярного стоматита (VSV), бешенства, Эбола, Мокола и тому подобного. Могут быть получены AAV-векторы для целенаправленного действия на разные клетки путем конструирования векторов, экспрессирующих разные серотипа капсидных белков; См., например, публикацию Rabinowitz J. E. с соавторами ((2002), J. Virol. 76: 791-801), полное содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки.

Фармацевтический препарат вектора может содержать вектор в приемлемом разбавителе или может содержать матрикс для медленного высвобождения, в который помещен носитель для доставки генов. Альтернативно, в том случае, когда полный вектор для доставки генов может быть получен интактным из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, фармацевтический препарат может содержать одну или несколько клеток, которые продуцируют систему доставки генов.

III. Фармацевтические композиции, содержащие и-РНК

В одном варианте изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим и-РНК, которые описаны в настоящей публикации, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая и-РНК, применима для лечения заболевания или расстройства, связанного с экспрессией или активностью гена ALAS1 (например, расстройства, в которое вовлечен путь порфирина). Такие фармацевтические композиции готовят на основе способа доставки. Например, композиции могут быть приготовлены для системного введения посредством парентеральной доставки, например, с использованием внутривенной (в/в) доставки. В некоторых вариантах композицию, предлагаемую в настоящем изобретении (например, препарат LNP), готовят для внутривенной доставки. В некоторых вариантах композицию, предлагаемую в настоящем изобретении (например, композицию, содержащую GalNAc-конъюгат) готовят для подкожной доставки.

Фармацевтические композиции, охарактеризованные в настоящем описании, вводят в дозе, достаточной для ингибирования экспрессии гена ALAS1. В общем, подходящая доза и-РНК будет в диапазоне от 0,01 до 200,0 миллиграмм на килограмм массы тела реципиента в сутки, обычно в диапазоне от 1 до 50 мг на килограмм массы тела в сутки. Например, днРНК можно вводить в количестве 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг на одну дозу. Фармацевтическую композицию можно вводить один раз в сутки или и-РНК можно вводить в виде двух, трех или большего количества поддоз с соответствующими интервалами на протяжении суток или даже с использованием непрерывной инфузии или доставки посредством препарата с контролируемым высвобождением. В таком случае количество и-РНК в каждой поддозе должно быть соответственно меньше, чтобы достичь суммарную суточную дозу. Единичная доза также может быть составлена для доставки в течение нескольких суток, например, с использованием подходящего препарата замедленного высвобождения, который обеспечивает длительное высвобождение и-РНК в течение периода времени, составляющего несколько суток. Препараты длительного высвобождения хорошо известны в данной области и особенно применимы для доставки средств в конкретное место, и в частности, могут быть использованы в случае средств согласно настоящему изобретению. В указанном варианте единичная доза содержит соответствующее количество суточных доз.

Влияние однократной дозы на уровни ALAS1 может быть длительным, так что последующие дозы вводят с интервалами, составляющими не более чем 3, 4 или 5 дней или с интервалами, составляющими не более чем 1, 2, 3 или 4 недели.

Специалисту в данной области будет понятно, что некоторые факторы могут влиять на дозу и время введения, необходимые для того, чтобы эффективно лечить субъекта, включая без ограничения тяжесть заболевания или расстройства, предварительное лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие присутствующие заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать одно введение или серию введений. Оценки эффективных доз и времени полужизни in vivo для отдельных и-РНК, входящих в объем изобретения, можно осуществлять, используя обычные способы, или на основе тестирования in vivo с использованием подходящей животной модели, как описано в настоящей публикации.

Успехи в генетике мышей позволили создать ряд мышиных моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические процессы, связанные с экспрессией ALAS1 (например, патологические процессы, в которые вовлечены порфирины или дефекты пути порфиринов, такие как, например, порфирии). Такие модели можно использовать для тестирования и-РНК in vivo, а также для определения терапевтически эффективной дозы и/или эффективной схемы дозирования.

Подходящей мышиной моделью является, например, мышь, содержащая трансген, экспрессирующий ALAS1 человека. Мыши, которые имеют нокин-мутации (например, мутации, которые ассоциированы с острыми печеночными порфириями у человека), можно использовать для определения терапевтически эффективной дозы и/или продолжительности введения ми-РНК ALAS1. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям и препаратам, которые содержат соединения и-РНК, охарактеризованные в изобретении. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить несколькими путями, в зависимости от того, требуется ли локальное или системное лечение, и от области, которую необходимо лечить. Введение может быть местным (например, посредством трансдермального пластыря), легочным, например, посредством ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая использование ингалятора; внутритрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; субдермальное, например, посредством имплантируемого устройства; или внутричерепное, например, интрапаренхимное, интратекальное или внутрижелудочковое введение.

и-РНК может быть доставлена таким образом, чтобы целенаправленно воздействовать на конкретную ткань, такую как ткань, которая продуцирует эритроциты. Например, и-РНК может быть доставлена в костный мозг, печень (например, гепатоциты печени), лимфатические узлы, селезенку, легкие (например, плевру легких) или спинной мозг. В одном варианте и-РНК доставляют в костный мозг.

Фармацевтические композиции и препараты для местного введения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Могут быть необходимы или желательны обычные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и тому подобное. Также могут быть применимы покрытые слоем презервативы, перчатки и тому подобное. Подходящие местные препараты включают препараты, в которых и-РНК, охарактеризованные в изобретении, находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие средства и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин DOPE, димиристоилфосфатидилхолин DMPC, дистеароилфосфатидилхолин), отрицательные (например, димеристоилфосфатидилглицерин DMPG) и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеоилфосфатидилэтаноламин DOTMA). и-РНК, охарактеризованные в изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомы или могут образовывать с ними комплексы, в частности с катионными липосомами. Альтернативно, и-РНК могут быть в комплексе с липидами, в частности, с катионными липидами. Подходящие жирные кислоты и сложные эфиры включают без ограничения арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или сложный C1-20-алкиловый эфир (например, изопропилмиристат IPM), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемая соль. Местные препараты подробно описаны в патенте США №6747014, который включен в настоящее описание в виде ссылки.

Липосомные препараты

Существует множество организованных поверхностно-активных структур кроме микроэмульсий, которые были исследованы и использованы для приготовления препаратов лекарственных средств. Такие структуры включают монослои, мицеллы, бислои и везикулы. Везикулы, такие как липосомы, привлекли большой интерес, вследствие их специфичности и продолжительности действия, которые они обеспечивают с точки зрения доставки лекарственных средств. В используемом в настоящем описании смысле термин «липосома» означает везикулу, состоящую из амфипатических липидов в сферическом бислое или бислоях.

Липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала и водной внутренней части. Водная часть содержит композицию, которую необходимо доставить. Катионные липосомы обладают преимуществом, которое заключается в их способности сливаться с клеточной стенкой. Некатионные липосомы, хотя и не способны сливаться так эффективно с клеточной стенкой, захватываются макрофагами in vivo.

Чтобы пройти через интактную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны пройти через серию мелких пор, каждая из которых имеет диаметр менее 50 нм, под действием подходящего трансдермального градиента. Поэтому желательно использовать липосому, которая легко деформируется и способна проходить через такие тонкие поры.

Дополнительные преимущества липосом включают: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биологически совместимыми и поддаются биологическому разрушению; липосомы могут включать в себя широкое множество растворимых в воде и растворимых в липидах лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства в своих внутренних отсеках от метаболизма и разрушения (Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., v. 1, p. 245). Важными факторами, которые необходимо учитывать при получении липосомных препаратов, являются поверхностный заряд липидов, размер везикул и объем водной части липосом.

Липосомы применимы для переноса и доставки активных ингредиентов к месту действия. Поскольку мембрана липосом структурно сходна с биологическими мембранами, в том случае, когда липосомы наносят на ткань, липосомы начинают сливаться с клеточными мембранами и по мере слияния липосомы и клетки содержимое липосомы перетекает в клетку, в которой может действовать активное средство.

На липосомных препаратах было сфокусировано всестороннее исследование, в котором их использовали в качестве средств доставки множества лекарственных средств. Появляется все больше доказательств того, что для местного введения липосомы обладают несколькими преимуществами по сравнению с другими препаратами. Такие преимущества включают сниженные побочные эффекты, связанные с высоким системным поглощением вводимого лекарственного средства, повышенным накоплением вводимого лекарственного средства в требуемой мишени и возможностью вводить широкое множество лекарственных средств, как гидрофильных, так и гидрофобных, в кожу.

В нескольких сообщениях подробно описана способность липосом доставлять средства, включая высокомолекулярную ДНК, в кожу. В кожу вводили разные соединения, включая анальгетики, антибиотики, гормоны и высокомолекулярные ДНК. Большинство применений приводило к целенаправленному воздействию на верхний эпидермис.

Липосомы делятся на два больших класса. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосома связывается с отрицательно заряженной поверхностью клетки и интернализуется в эндосому. Благодаря кислому pH в эндосоме липосомы разрываются, высвобождая свое содержимое в цитоплазму клеток (Wang с соавторами, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

Липосомы, которые являются pH-чувствительными или отрицательно заряженными, улавливают ДНК, а не комплекс с ДНК. Так как и ДНК и липид заряжены сходным образом, то происходит отталкивание, а не образование комплекса. Тем не менее, некоторое количество ДНК захватывается в водную внутреннюю часть таких липосом. pH-чувствительные липосомы использовали для доставки ДНК, кодирующей ген тимидинкиназы, в клеточный монослой в культуре. В клетках-мишенях выявляли экспрессию экзогенного гена (Zhou с соавторами, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).

Один из основных типов липосомной композиции содержит другие фосфолипиды, отличные от природно получаемого фосфатидилхолина. Нейтральные липосомные композиции могут быть образованы, например, из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Анионные липосомные композиции обычно образованы из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные способные к слиянию липосомы в основном образованы из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Липосомная композиция другого типа образована из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, PC сои и PC яиц. Другой тип образован из смеси фосфолипида и/или фосфатидилхолина и/или холестерина.

В нескольких исследованиях оценивали местную доставку липосомных препаратов лекарственных средств в кожу. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морских свинок приводило к снижению количества герпесных язв, тогда как доставка интерферона другими способами (например, в виде раствора или в виде эмульсии) была неэффективной (Weiner с соавторами, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Кроме того, в дополнительном исследовании тестировали эффективность интерферона, вводимого в виде части липосомного препарата по сравнению с введением интерферона с использованием водной системы и пришли к выводу, что липосомный препарат превосходил введение в водной системе (du Plessis с соавторами, Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).

Также исследовали неионогенные липосомные системы, чтобы определить их применимость для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионогенные липосомные препараты, содержащие новасом™ I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и новасом™ II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), использовали для доставки циклоспорина-A в дерму кожи мышей. Результаты показали, что такие неионогенные липосомные системы эффективны в обеспечении отложения циклоспорина-A в разных слоях кожи (Hu с соавторами, S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).

Липосомы также включают «стерически стабилизированные» липосомы, термин, который в используемом в настоящем описании смысле относится к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к повышению времени жизни в циркуляции по сравнению с липосомами, в которых отсутствуют такие специализированные липиды. Примерами стерически стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть образующих везикулы липидов липосомы (A) содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид GM1, или (B) дериватизована одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как остаток полиэтиленгликоля (ПЭГ). Не имея намерения быть связанными с какой-либо конкретной теорией, в данной области полагают, что, по меньшей мере, в случае стерически стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или ПЭГ-дериватизованные липиды, увеличенное время жизни таких стерически стабилизированных липосом в циркуляции происходит, вследствие пониженного захвата в клетки ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen с соавторами, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu с соавторами, Cancer Research, 1993, 53, 3765).

Различные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны в данной области. Papahadjopoulos с соавторами (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) сообщили о способности моносиалоганглиозида GM1, галактоцереброзидсульфата и фосфатидилинозитола увеличивать время полужизни липосом в крови. Такие данные были уточнены Gabizon с соавторами (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). В патенте США №4837028 и в публикации WO 88/04924 Allen с соавторами раскрыли липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GM1 или сложный эфир галактоцереброзидсульфата. В патенте США №5543152 (Webb с соавторами) раскрыты липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn-димиристоилфосфатидилхолин, раскрыты в WO 97/13499 (Lim с соавторами).

Многие липосомы, содержащие липиды, дериватизованные одним или несколькими гидрофильными полимерами, и способы их получения известны в данной области. В публикации Sunamoto с соавторами (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) описаны липосомы, содержащие неионогенный детергент, 2C1215G, которые содержат молекулу ПЭГ. В публикации Illum с соавторами (FEBS Lett., 1984, 167, 79) отмечено, что гидрофильное покрытие полистироловых частиц полимерными гликолями приводит к значительному увеличению времени полужизни в крови. Синтетические фосфолипиды, модифицированные путем присоединения карбоксильных групп полиалкиленгликолей (например, ПЭГ), описаны Sears (патенты США №№4426330 и 4534899). В публикации Klibanov с соавторами (FEBS Lett., 1990, 268, 235) описаны эксперименты, демонстрирующие, что липосомы, содержащие фосфатидилэтаноламин (PE), дериватизованный ПЭГ или стеаратом ПЭГ, имеют значительно более длительное время полужизни в кровотоке. В публикации Blume с соавторами (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) такие наблюдения были продолжены с использованием других ПЭГ-дериватизованных фосфолипидов, например, DSPE-ПЭГ, образованных в результате сочетания дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE) и ПЭГ. Липосомы, имеющие ковалентно связанные остатки ПЭГ на своей наружной поверхности, описаны в европейском патенте № EP 0445131 B1 и в WO 90/04384, Fisher. Липосомные композиции, содержащие 1-20 моль % ПЭГ-дериватизованного PE, и способы их применения описаны Woodle с соавторами (патенты США №№5013556 и 5356633) и Martin с соавторами (патент США №5213804 и европейский патент № EP 0496813 B1). Липосомы, содержащие ряд других конъюгатов “липид-полимер”, описаны в WO 91/05545 и в патенте США №5225212 (обе публикации Martin с соавторами), и в WO 94/20073 (Zalipsky с соавторами). Липосомы, содержащие ПЭГ-модифицированные церамидные липиды, описаны в WO 96/10391 (Choi с соавторами). В патенте США №5540935 (Miyazaki с соавторами) и в патенте США №5556948 (Tagawa с соавторами) описаны ПЭГ-содержащие липосомы, которые на своих поверхностях могут быть дополнительно дериватизованы функциональными остатками.

Ряд липосом, содержащих нуклеиновые кислоты, известны в данной области. В WO 96/4062 Thierry с соавторами описали способы инкапсулирования высокомолекулярных нуклеиновых кислот в липосомы. В патенте США №5264221 Tagawa с соавторами описали связанные с белком липосомы и утверждают, что содержимое таких липосом может включать днРНК. В патенте США №5665710 Rahman с соавторами описали некоторые способы инкапсулирования олигодезоксинуклеотидов в липосомы. В WO 97/04787 Love с соавторами описали липосомы, содержащие днРНК, нацеленные на ген raf.

Трансферсомы представляют собой еще один тип липосом, являющихся в высокой степени деформируемыми липидными агрегатами, которые могут быть привлекательными кандидатами на использование их в качестве везикул для доставки лекарственных средств. Трансферсомы могут быть описаны как липидные капельки, степень деформируемости которых настолько высока, что они могут легко проникать через поры, размеры которых меньше, чем сами капли. Трансферсомы могут быть адаптированы к условиям окружающей среды, в которых они используются, например, они подвергаются самооптимизации (адаптируются к форме пор в коже), саморепарации, часто достигают своих мишеней без фрагментации и подвергаются самозагрузке. Для получения трансферсом в стандартную липосомную композицию могут быть добавлены активаторы поверхности раздела фаз, обычно поверхностно-активные вещества. Трансферсомы были использованы для доставки сывороточного альбумина в кожу. Было показано, что опосредуемая трансферсомами доставка сывороточного альбумина является эффективной при подкожной инъекции раствора, содержащего сывороточный альбумин.

Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в таких препаратах, как эмульсии (включая микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным путем классификации и ранжирования свойств многих поверхностно-активных веществ различных типов, как природных, так и синтетических, заключается в использовании гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ). Природа гидрофильной группы (также известной как «головка») является наиболее часто применяемым критерием для определения категории различных поверхностно-активных веществ, используемых в препаратах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

Если молекула поверхностно-активного вещества не ионизована, то такая молекула принадлежит к классу неионогенных поверхностно-активных веществ. Неионогенные поверхностно-активные вещества широко применяются в фармацевтических и косметических продуктах и используются в широком интервале значений рН. Обычно значения их ГЛБ находятся в диапазоне от 2 до примерно 18, в зависимости от их структуры. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают неионогенные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, глицериловые сложные эфиры, полиглицериловые сложные эфиры, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. В класс таких соединений также включены неионогенные алканоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирного спирта, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блоксополимеры. Наиболее известными представителями класса неионогенных поверхностно-активных веществ являются полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества.

Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд, в том случае, когда она растворена или диспергирована в воде, то такое поверхностно-активное вещество классифицируют как анионогенное. Анионогенными поверхностно-активными веществами являются карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными представителями класса анионогенных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и мыла.

Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд, в том случае, когда она растворена или диспергирована в воде, то такое поверхностно-активное вещество классифицируют как катионогенное. Катионогенными поверхностно-активными веществами являются четвертичные аммониевые соли и этоксилированные амины. Наиболее часто используемыми представителями такого класса являются четвертичные аммониевые соли.

Если молекула поверхностно-активного вещества способна нести либо положительный, либо отрицательный заряд, то такое поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.

Был опубликован обзор применения поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, препаратах и в эмульсиях (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

Частица нуклеиновая кислота-липид

В одном варианте днРНК ALAS1, охарактеризованная в изобретении, полностью инкапсулирована в липидный препарат, например, с образованием SPLP, pSPLP, SNALP или другой частицы нуклеиновой кислоты-липида. В используемом в настоящем описании смысле термин «SNALP» относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид, включая SPLP. В используемом в настоящем описании смысле термин «SPLP» относится к частице нуклеиновая кислота-липид, содержащей плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидную везикулу. SNALP и SPLP обычно содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предотвращает агрегацию частицы (например, конъюгат ПЭГ-липид). SNALP и SPLP особенно полезны для системного применения, так как они имеют увеличенное время полужизни в циркуляции после внутривенной (в/в) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, участках, физически отделенных от места введения). SPLP включают «pSPLP», которые содержат инкапсулированный комплекс конденсирующее средство-нуклеиновая кислота, который описан в публикации PCT № WO 00/03683. Частицы согласно настоящему изобретению обычно имеют средний диаметр примерно от 50 нм до примерно 150 нм, чаще примерно от 60 нм до примерно 130 нм, чаще примерно от 70 нм до примерно 110 нм, чаще всего примерно от 70 нм до примерно 90 нм и по существу являются нетоксичными. Кроме того, нуклеиновые кислоты в том случае, когда они присутствуют в частицах нуклеиновая кислота-липид согласно настоящему изобретению, устойчивы в водном растворе к разрушению нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и способ их получения описаны, например, в патентах США №5976567, 5981501, 6534484, 6586410, 6815432 и в публикации PCT № WO 96/40964.

В одном варианте отношение липида к лекарственному средству (масс./масс.-отношение) (например, отношение липида к днРНК) будет в диапазоне примерно от 1:1 до примерно 50:1, примерно от 1:1 до примерно 25:1, примерно от 3:1 до примерно 15:1, примерно от 4:1 до примерно 10:1, примерно от 5:1 до примерно 9:1 или примерно от 6:1 до примерно 9:1.

Катионным липидом может быть, например, хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония (DODAC), бромид N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония (DDAB), хлорид N-(I-(2,3-диолеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTAP), хлорид N-(I-(2,3-диолеилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), N,N-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA), 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолеилокси-3- (диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеилокси-3-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2-дилинолеоил-3-диметиламинопропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (DLin-S-DMA), 1-линолеоил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлоридная соль 1,2-дилинолеилокси-3-триметиламинопропана (DLin-TMA.Cl), хлоридная соль 1,2-дилинолеоил-3-триметиламинопропана (DLin-TAP.Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(N-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(N,N-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(N,N-диолеиламино)-1,2-пропандио (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или их аналоги, (3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12-диенил)тетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-5-амин (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (Tech G1) или их смесь. Катионный липид может составлять примерно от 20 моль % до примерно 50 моль % или примерно от 40 моль % от общего содержания липидов в частице.

В другом варианте можно использовать соединение 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан для получения наночастиц липид-ми-РНК. Синтез 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана описан в предварительной заявке на выдачу патента США номер 61/107998, поданной 23 октября 2008, который включен в настоящее описание в виде ссылки.

В одном варианте частица липид-ми-РНК содержит 40% 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан: 10% DSPC: 40% холестерина: 10% ПЭГ-C-DOMG (молярных процентов) с размером частиц 63,0±20 нм и соотношением ми-РНК/липид 0,027.

Некатионным липидом может быть анионный липид или нейтральный липид, включая без ограничения дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (POPC), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), 16-O-монометил-PE, 16-O-диметил-PE, 18-1-транс-PE, 1-стеароил-2-олеоилфосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Некатионный липид может составлять примерно от 5 моль % до примерно 90 моль %, примерно 10 моль % или примерно 58 моль %, если включен холестерин, от общего содержания липидов в частице.

Конъюгированным липидом, который ингибирует агрегацию частиц, может быть, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ)-липид, включая без ограничения ПЭГ-диацилглицерин (DAG), ПЭГ-диалкилоксипропил (DAA), ПЭГ-фосфолипид, ПЭГ-церамид (Cer) или их смесь. Конъюгат ПЭГ-DAA может представлять собой, например, ПЭГ-дилаурилоксипропил (Ci2), ПЭГ-димиристилоксипропил (Ci4), ПЭГ-дипальмитилоксипропил (Ci6) или ПЭГ-дистеарилоксипропил (Ci8). Конъюгированный липид, который предотвращает агрегацию частиц, может составлять от 0 моль % до примерно 20 моль % или примерно 2 моль % от общего содержания липидов в частице.

В некоторых вариантах частица нуклеиновая кислота-липид дополнительно содержит холестерин, например, примерно от 10 моль % до примерно 60 моль % или примерно 48 моль % от общего содержания липидов в частице.

В некоторых вариантах и-РНК готовят в липидной наночастице (LNP).

LNP01

В одном варианте липидоид ND98-4HC1 (М.м. 1487) (См. заявку на выдачу патента США №12/056230, поданную 3/26/2008, которая включена в настоящее описание в виде ссылки), холестерин (Sigma-Aldrich) и ПЭГ-церамид C16 (Avanti Polar Lipids) можно использовать для получения наночастиц липид-днРНК (например, частиц LNP01). Маточные растворы каждого из них в этаноле можно получить следующим образом: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, ПЭГ-церамид C16, 100 мг/мл. Затем маточные растворы ND98, холестерина и ПЭГ-церамида C16 могут быть объединены, например, в молярном соотношении 42:48:10. Раствор объединенных липидов можно смешать с водным раствором днРНК (например, в ацетате натрия, pH 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла примерно 35-45% и конечная концентрация ацетата натрия составляла примерно 100-300 мМ. Наночастицы липид-днРНК обычно образуются спонтанно при смешивании. В зависимости от требуемого распределения по размеру частиц полученная смесь наночастиц может быть подвергнута экструзии через поликарбонатную мембрану (например, с пределом отсечения 100 нм), с использованием, например, экструдера Thermobarrel, такого как экструдер Lipex (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадия экструзии может быть исключена. Удаление этанола и одновременная замена буфера могут быть осуществлены, например, посредством диализа или тангенциальной проточной фильтрацией. Буфер может быть заменен, например, фосфатно-солевым буфером (PBS) с pH примерно 7, например, pH примерно 6,9, pH примерно 7,0, pH примерно 7,1, pH примерно 7,2, pH примерно 7,3 или pH примерно 7,4.

Препараты LNP01 описаны, например, в международной публикации заявки № WO 2008/042973, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Дополнительные примеры препаратов липид-днРНК представлены в следующей таблице.

Таблица 10
Примеры липидных препаратов
Катионный липид Катионный липид/некатионный липид/холестерин/конъюгат ПЭГ-липид
Соотношение липид:ми-РНК
SNALP 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA) DLinDMA/DPPC/Холестерин/ПЭГ-cDMA
(57.1/7.1/34.4/1.4)
липид:ми-РНК ~ 7:1

S-XTC 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DPPC/Холестерин/ПЭГ-cDMA
57.1/7.1/34.4/1.4
липид:ми-РНК ~ 7:1
LNP05 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
57.5/7.5/31.5/3.5
липид:ми-РНК ~ 6:1
LNP06 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
57.5/7.5/31.5/3.5
липид:ми-РНК ~ 11:1
LNP07 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
60/7.5/31/1.5,
липид:ми-РНК ~ 6:1
LNP08 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
60/7.5/31/1.5,
липид:ми-РНК ~ 11:1
LNP09 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (XTC) XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК 10:1
LNP10 3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12-диенил)тетрагидро-3aH-циклопента[d][1,3]диоксол-5-амин (ALN 100) ALN100/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК 10:1
LNP11 (6Z,9Z,28Z,31Z)гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (MC3) MC-3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК 10:1
LNP12 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (C12-200) C12-200/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК 10:1
LNP13 XTC XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
50/10/38.5/1.5

Липид:ми-РНК: 33:1 LNP14 MC3 MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
40/15/40/5
Липид:ми-РНК: 11:1
LNP15 MC3 MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DSG/GalNAc-PEG-DSG
50/10/35/4.5/0.5
Липид:ми-РНК: 11:1
LNP16 MC3 MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК: 7:1
LNP17 MC3 MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DSG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК: 10:1
LNP18 MC3 MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК: 12:1
LNP19 MC3 MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DMG
50/10/35/5
Липид:ми-РНК: 8:1
LNP20 MC3 MC3/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DPG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК: 10:1
LNP21 C12-200 C12-200/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DSG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК: 7:1
LNP22 XTC XTC/DSPC/Холестерин/ПЭГ-DSG
50/10/38.5/1.5
Липид:ми-РНК: 10:1

DSPC: дистерароилфосфатидилхолин

DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин

ПЭГ-DMG: ПЭГ-дидимиристоилглицерин (C14-ПЭГ или ПЭГ-C14) (ПЭГ со средней молекулярной массой 2000)

ПЭГ-DSG: ПЭГ-дистирилглицерин (C18-ПЭГ или ПЭГ-C18) (ПЭГ со средней молекулярной массой 2000)

ПЭГ-cDMA: ПЭГ-карбамоил-1,2-димиристилоксипропиламин (ПЭГ со средней молекулярной массой 2000)

Препараты, содержащие SNALP (1,2-дилиноленилокси-N,N-диметиламинопропан (DLinDMA)), описаны в международной публикации № WO 2009/127060, поданной 15 апреля 2009, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Препараты, содержащие XTC, описаны, например, в предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным № 61/148366, поданной 29 января 2009; предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/156851, поданной 2 марта 2009; предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №, поданной 10 июня 2009; предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/228373, поданной 24 июля 2009; предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/239686, поданной 3 сентября 2009, и в международной заявке № PCT/US 2010/022614, поданной 29 января 2010, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Препараты, содержащие MC, описаны, например, в предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/244834, поданной 22 сентября 2009, предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/185800, поданной 10 июня 2009, и международной заявке No. PCT/US 10/28224, поданной 10 июня 2010, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Препараты, содержащие ALNY-100, описаны, например, в международной заявке на выдачу патента номер PCT/US 09/63933, поданной 10 ноября 2009, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Препараты, содержащие C12-200, описаны в предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным №61/175770, поданной 5 мая 2009, и международной заявке № PCT/US 10/33777, поданной 5 мая 2010, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Синтез катионных липидов

Любое из соединений, например, катионные липиды и тому подобные, используемые в частицах нуклеиновая кислота-липид, охарактеризованных в изобретении, могут быть получены известными способами органического синтеза, включая способы, описанные более подробно в примерах. Все заместители имеют значение, которое определено ниже, если не указано иное.

«Алкил» означает имеющий прямую цепь или разветвленный, нециклический или циклический, насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 24 атомов углерода. Типичные насыщенные алкилы с прямой цепью включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и тому подобные; тогда как насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и тому подобные. Типичные насыщенные циклические алкилы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и тому подобные; в то время как ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил и циклогексенил и тому подобные.

«Алкенил» означает алкил, который описан выше, содержащий, по меньшей мере, одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы включают как цис-, так и транс-изомеры. Типичные, имеющие прямую цепь и разветвленные алкенилы, включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил и тому подобные.

«Алкинил» означает любой алкил или алкенил, который определен выше, который дополнительно содержит, по меньшей мере, одну тройную связь между соседними атомами углерода. Типичные, имеющие прямую цепь и разветвленные алкинилы, включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутенил и тому подобные.

«Ацил» означает любой алкил, алкенил или алкинил, в котором атом углерода в точке связывания замещен оксогруппой, которая определена ниже. Например, -C(=O)алкил, -C(=O)алкенил и -C(=O)алкинил являются ацильными группами.

«Гетероцикл» означает 5-7-членное моноциклическое или 7-10-членное бицилическое гетероциклическое кольцо, которое является насыщенным, ненасыщенным или ароматическим и которое содержит 1 или 2 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и в котором гетероатомы азота и серы необязательно могут быть окислены, и гетероатом азота необязательно может быть кватернизован, включая бициклические кольца, в которых указанные выше гетероциклы слиты с бензольным циклом. Гетероцикл может быть связан через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы включают гетероарилы, которые определены ниже. Гетероциклы включают морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и тому подобные.

Термины «необязательно замещенный алкил», «необязательно замещенный алкенил», «необязательно замещенный алкинил», «необязательно замещенный ацил» и «необязательно замещенный гетероцикл» означает, что в том случае, когда он замещен, по меньшей мере, один атом водорода заменен заместителем. В случае оксо-заместителя (=O) заменены два атома водорода. В этом отношении заместители включают оксогруппу, галоген, гетероцикл, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx и -SOnNRxRy, где n равен 0, 1 или 2, Rx и Ry являются одинаковыми или разными и независимо означают водород, алкил или гетероцикл, и каждый из указанных заместителей алкила и гетероцикла может быть дополнительно замещен одним или несколькими заместителями: оксогруппой, галогеном, -OH, -CN, алкилом, -ORx, гетероциклом, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx и -SOnNRxRy.

«Галоген» означает фтор, хлор, бром и йод.

В некоторых вариантах в способах, охарактеризованных в изобретении, может требоваться применение защитных групп. Методика использования защитных групп хорошо известна в данной области (См., например, Protective groups in organic synthesis, Green, T.W. et al, Wiley-Interscience, New York City, 1999). Коротко, защитные группы в контексте настоящего изобретения представляют собой любую группу, которая снижает или исключает нежелательную реактивность функциональной группы. Защитная группа может быть добавлена к функциональной группе, чтобы маскировать ее реактивность во время некоторых реакций, и затем удалена, чтобы демаскировать исходную функциональную группу. В некоторых вариантах используют «защитную группу спирта». «Защитная группа спирта» представляет собой любую группу, которая уменьшает или исключает нежелательную реактивность спиртовой функциональной группы. Защитные группы могут быть добавлены и удалены с использованием способов, хорошо известных в данной области.

Синтез соединений формулы A

В одном варианте частицы нуклеиновая кислота-липид, охарактеризованные в изобретении, готовят, используя катионный липид формулы A:

где R1 и R2 независимо означают алкил, алкенил или алкинил, каждый из которых необязательно может быть замещен, и R3 и R4, каждый независимо, означают низший алкил, или R3 и R4, вместе взятые, могут образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо. В некоторых вариантах катионный липид представляет собой XTC (2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан). В общем, липид формулы A, указанной выше, может быть получен с использованием следующих схем реакций 1 или 2, где все заместители имеют значение, которое определено выше, если не указано иное.

Схема 1

Липид A, в котором R1 и R2 независимо означают алкил, алкенил или алкинил, каждый из которых необязательно может быть замещен, и R3 и R4 независимо означают низший алкил, или R3 и R4, вместе взятые могут образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо, может быть получен согласно схеме 1. Кетон 1 и бромид 2 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным в данной области. Взаимодействие 1 и 2 дает кеталь 3. Обработка кеталя 3 амином 4 дает липиды формулы A. Липиды формулы A могут быть превращены в соответствующую соль аммония с использованием органической соли формулы 5, где X означает анионный противоион, выбранный из галогена, гидроксида, фосфата, сульфата или тому подобного.

Схема 2

Альтернативно, исходное вещество кетон 1 может быть получен согласно схеме 2. Реактив Гриньяра 6 и цианид 7 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалистам в данной области. Взаимодействие 6 и 7 дает кетон 1. Превращение кетона 1 в соответствующие липиды формулы A осуществляют, как описано на схеме 1.

Синтез MC3

Получение DLin-M-C3-DMA (т.е., (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноата) осуществляли следующим образом. Раствор (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ола (0,53 г), гидрохлорида 4-N,N-диметиламиномасляной кислоты (0,51 г), 4-N,N-диметиламинопиридина (0,61 г) и гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (0,53 г) в дихлорметане (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, затем разбавленным водным раствором бикарбоната натрия. Органические фракции сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и растворитель удаляли на роторном вакуумной испарителе. Остаток пропускали через колонку с силикагелем (20 г), используя градиентное элюирование 1-5% метанолом/дихлорметаном. Фракции, содержащие очищенный продукт, объединяли и растворитель удаляли, получая бесцветное масло (0,54 г).

Синтез ALNY-100

Синтез кеталя 519 [ALNY-100] осуществляли, используя следующую схему 3:

Синтез 515:

К перемешиваемой суспензии LiA1H4 (3,74 г, 0,09852 моль) в 200 мл безводного ТГФ в двугорлой круглодонной колбе (1 л) медленно добавляли раствор 514 (10 г, 0,04926 моль) в 70 мл ТГФ при 0°C в атмосфере азота. После завершения добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и затем кипятили с обратным холодильником в течение 4 часов. Протекание реакции контролировали, используя ТСХ. После завершения реакции (по данным ТСХ) смесь охлаждали до 0°C и гасили, осторожно добавляя насыщенный раствор Na2SO4. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре и фильтровали. Остаток тщательно промывали ТГФ. Фильтрат и промывки смешивали и разбавляли, используя 400 мл диоксана и 26 мл концентрированной HCl, и перемешивали в течение 20 минут при комнатной температуре. Летучие вещества удаляли в вакууме, получая гидрохлоридную соль 515 в виде белого твердого вещества. Выход: 7,12 г. 1H-ЯМР (ДМСО, 400 МГц): δ = 9,34 (уширенный, 2H), 5,68 (с, 2H), 3,74 (м, 1H), 2,66-2,60 (м, 2H), 2,50-2,45 (м, 5H).

Синтез 516:

К перемешиваемому раствору соединения 515 в 100 мл безводного ДХМ в двугорлой круглодонной колбе объемом 250 мл добавляли NEt3 (37,2 мл, 0,2669 моль) и охлаждали до 0°C в атмосфере азота. После медленного добавления N-(бензилоксикарбонилокси)сукцинимида (20 г, 0,08007 моль) в 50 мл безводного ДХМ реакционной смеси давали возможность нагреться до комнатной температуры. После завершения реакции (2-3 часа по данным ТСХ) смесь последовательно промывали 1N раствором HCl (1×100 мл) и насыщенным раствором NaHCO3 (1×50 мл). Затем органический слой сушили над безводным Na2SO4 и растворитель выпаривали, получая неочищенное вещество, которое очищали хроматографией на колонке с силикагелем, получая 516 в виде липкой массы. Выход: 11 г (89%). 1H-ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ = 7,36-7,27(м, 5H), 5,69 (с, 2H), 5,12 (с, 2H), 4,96 (уш., 1H), 2,74 (с, 3H), 2,60(м, 2H), 2,30-2,25(м, 2H). ЖХ-МС [M+H]-232,3 (96,94%).

Синтез 517A и 517B:

Циклопентен 516 (5 г, 0,02164 моль) растворяли в растворе 220 мл ацетона и воды (10:1) в одногорлой круглодонной колбе объемом 500 мл и к ней добавляли N-метилморфолин-N-оксид (7,6 г, 0,06492 моль), затем 4,2 мл 7,6% раствора OsO4 (0,275 г, 0,00108 моль) в трет-бутаноле при комнатной температуре. После завершения реакции (~ 3 часа) смесь гасили добавлением твердого Na2SO3 и полученную смесь перемешивали в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (300 мл) и промывали водой (2×100 мл), затем насыщенным раствором NaHCO3 (1×50 мл), водой (1×30 мл) и, наконец, насыщенным раствором соли (1×50 мл). Органическую фазу сушили над безводным Na2SO4 и растворитель удаляли в вакууме. Хроматографическая очистка на колонке с силикагелем сырого вещества давала смесь диастереомеров, которые разделяли препаративной ВЭЖХ. Выход: - грубый 6 г.

517A - пик-1 (белок твердого вещества), 5,13 г (96%). 1H-ЯМР (ДМСО, 400 МГц): δ = 7,39-7,31(м, 5H), 5,04(с, 2H), 4,78-4,73 (м, 1H), 4,48-4,47(d, 2H), 3,94-3,93(м, 2H), 2,71(с, 3H), 1,72- 1,67(м, 4H). ЖХ-МС - [M+H]-266,3, [M+NH4 +]-283,5 фактический, ВЭЖХ-97,86%.

Стереохимию подтверждали рентгенографией.

Синтез 518:

Применяя способ, аналогичный способу, описанному для синтеза соединения 505, получали соединение 518 (1,2 г, 41%) в виде бесцветного масла. 1H-ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ= 7,35-7,33 (м, 4H), 7,30-7,27 (м, 1H), 5,37-5,27 (м, 8H), 5,12 (с, 2H), 4,75 (м,1H), 4,58-4,57 (м, 2H), 2,78-2,74 (м, 7H), 2,06-2,00 (м, 8H), 1,96-1,91 (м, 2H), 1,62 (м, 4H), 1,48 (м, 2H), 1,37-1,25 (уш.м, 36H), 0,87 (м, 6H). ВЭЖХ-98,65%.

Общий способ синтеза соединения 519:

Раствор соединения 518 (1 экв.) в гексане (15 мл) добавляли по каплям в ледяной раствор LAH в ТГФ (1 М, 2 экв.). После завершения добавления смесь нагревали при 40°C в течение 0,5 часа, затем снова охлаждали на бане со льдом. Смесь осторожно гидролизовали насыщенным водным раствором Na2SO4, затем фильтровали через целит, и восстанавливали до масла. Хроматография на колонке давала чистый 519 (1,3 г, 68%), который получали в виде бесцветного масла. 13C ЯМР = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 (x2), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; электроспрей МС (+ve): молекулярная масса для C44H80NO2 (M+H)+ вычисленная 654,6, найденная 654,6.

Препараты, полученные либо стандартным способом, либо способом без экструзии, могут быть охарактеризованы сходным образом. Например, препараты обычно характеризуют, используя визуальный просмотр. Они должны представлять собой беловатые прозрачные растворы, не содержащие агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение частиц по размеру в случае липидных наночастиц можно измерить на основании светорассеяния, используя, например, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Частицы должны иметь размер примерно 20-300 нм, например, размер 40-100 нм. Распределение по размеру частиц должно быть унимодальным. Концентрацию суммарной днРНК в препарате, а также улавливаемой фракции оценивают в основанном на исключении анализе с использованием красителя. Образец приготовленной днРНК можно подвергнуть инкубации с РНК-связывающим красителем, таким как Ribogreen (Molecular Probes), в присутствии или в отсутствие разрушающего препарат поверхностно-активного вещества, например, 0,5% тритона-X100. Суммарную днРНК в препарате можно определить по сигналу от образца, содержащего поверхностно-активное вещество, по сравнению со стандартной кривой. Улавливаемую фракцию можно определить, вычитая содержание «свободной» днРНК (которое измеряют по сигналу в отсутствие поверхностно-активного вещества) из содержания суммарной днРНК. Процентное содержание улавливаемой днРНК обычно >85%. В случае препарата SNALP размер частиц составляет, по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящий диапазон обычно составляет от примерно, по меньшей мере, 50 нм до примерно, по меньшей мере, 110 нм, примерно, по меньшей мере, от 60 нм до примерно, по меньшей мере, 100 нм или примерно, по меньшей мере, от 80 нм до примерно, по меньшей мере, 90 нм.

Композиции и препараты для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или в безводных средах, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или мини-таблетки. Для их получения может оказаться желательным использование загустителей, ароматизаторов, разбавителей, эмульгаторов, диспергирующих добавок или связующих агентов. В некоторых вариантах пероральными препаратами являются препараты, в случае которых днРНК, охарактеризованную в изобретении, вводят в сочетании с одним или несколькими усилителями проницаемости, поверхностно-активными веществами и хелатообразующими агентами. Подходящие поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящими желчными кислотами/солями являются хенодезоксихолевая кислота (CDCA) и урзодезоксихенодезоксихолевая кислота (UDCA), холевая кислота, дегидрохолевая кислота, дезоксихолевая кислота, глюкохолевая кислота, гликохолевая кислота, гликодезоксихолевая кислота, таурохолевая кислота, тауродезоксихолевая кислота, тауро-24,25-дигидрофузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящими жирными кислотами являются арахидоновая кислота, ундекановая кислота, олеиновая кислота, лауриновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемые соли (например, соли натрия). В некоторых вариантах используют комбинации усилителей проницаемости, например жирных кислот/солей в сочетании с желчными кислотами/солями. Одним примером комбинации является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Другими усилителями проницаемости являются полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. днРНК, охарактеризованные в изобретении, могут быть доставлены перорально, в гранулярной форме, включая распыляемые сухие частицы, или в комплексе с образованием микро- или наночастиц. Агенты, образующие комплексы с днРНК, включают полиаминокислоты; полимимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты; катионизированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (ПЭГ) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; DEAE-дериватизированные полиимины, пуллуланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящими комплексообразующими агентами являются хитозан, N-триметилхитозан, поли-L-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен P(TDAE), полиаминостирол (например, п-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAE-альбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(D,L-молочная кислота), сополимер DL-молочной и гликолевой кислоты (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Пероральные препараты днРНК и их получение подробно описаны в патенте США 6887906, публикации патента США №20030027780 и в патенте США №6747014, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.

Композиции и препараты для парентерального, интрапаренхимного (в головной мозг), интратекального, внутрижелудочкового введения или введения в печень могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как без ограничения усилители проницаемости, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут включать без ограничения растворы, эмульсии и препараты, содержащие липосомы. Такие композиции могут быть созданы из различных компонентов, которые включают без ограничения предварительно приготовленные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.

Фармацевтические препараты, охарактеризованные в настоящем изобретении, которые обычно могут представлять собой стандартную лекарственную форму, могут быть получены обычными способами, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие способы включают в себя стадию смешивания активных ингредиентов с фармацевтически приемлемым(и) носителем(ями) и эксципиентом(ами). В общем, препараты получают путем равномерного и тщательного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями и с тонко измельченными твердыми носителями или с теми и другими, с последующим, если это необходимо, формованием продукта.

Композиции, охарактеризованные в настоящем изобретении, могут быть приготовлены в любой из многих возможных дозированных форм, таких как без ограничения таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции также могут быть приготовлены в виде суспензий в водной, безводной или смешанной среде. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Такая суспензия может также содержать стабилизаторы.

Дополнительные препараты

Эмульсии

Композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены и приготовлены в виде эмульсий. Эмульсии обычно представляют собой гетерогенные системы, состоящие из одной жидкости, диспергированной в другой жидкости в виде капелек, диаметр которых обычно превышает 0,1 мкм (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington′s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Эмульсии часто представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешивающиеся жидкие фазы, однородно смешанные и диспергированные одна в другой. В общем, эмульсии могут представлять собой либо эмульсии типа «вода в масле» (в/м), либо «масло в воде» (м/в). Если водная фаза является тонкодисперсной и диспергирована в виде небольших капелек в объемной масляной фазе, то получаемую в результате композицию называют эмульсией типа «вода в масле» (в/м). Альтернативно, если масляная фаза является тонкодисперсной и диспергирована в виде небольших капелек в объемной водной фазе, то получаемую в результате композицию называют эмульсией типа «масло в воде» (м/в). Помимо диспергированных фаз, эмульсии могут содержать дополнительные компоненты и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора в водной фазе, масляной фазе или в виде отдельной фазы. При необходимости, в эмульсии могут быть также добавлены фармацевтические эксципиенты, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты. Фармацевтические эмульсии могут также представлять собой многосоставные эмульсии, состоящие более чем из двух фаз, например, в случае эмульсий типа «масло - в воде - в масле» (м/в/м) и типа «вода - в масле - в воде» (в/м/в). Такие сложные препараты часто имеют определенные преимущества, которыми не обладают простые бинарные эмульсии. Многосоставные эмульсии, в которых отдельные масляные капельки эмульсии типа м/в заключены в небольшие водные капельки, составляют эмульсию типа в/м/в. Подобным образом, система масляных капелек, включенных в глобулы воды, стабилизированные в масляной непрерывной фазе, составляют эмульсию типа м/в/м.

Эмульсии характеризуются невысокой термодинамической стабильностью или ее отсутствием. Часто дисперсная или прерывистая фаза эмульсии хорошо диспергируется во внешней или в непрерывной фазе и поддерживается в этой форме, благодаря эмульгаторам или вязкости данного препарата. Любая из фаз эмульсии может быть полутвердой или твердой, как в случае основ для мазей типа эмульсии и кремов. Другой способ стабилизации эмульсий заключается в использовании эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу эмульсии. В общих чертах, эмульгаторы могут быть подразделены на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, встречающиеся в природе эмульгаторы, абсорбционные основы и тонкодисперсные твердые вещества (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как поверхностно-активные агенты, находят широкое применение в изготовлении эмульсионных препаратов и описаны в литературе (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Отношение гидрофильности к гидрофобности поверхностно-активного вещества называется гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ) и является ценным инструментом при определении категорий и при отборе поверхностно-активных веществ для приготовления препаратов. Поверхностно-активные вещества могут быть разделены на разные классы на основе природы их гидрофильной группы: неионогенные, анионогенные, катионогенные и амфотерные (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).

Природными эмульгаторами, используемыми в эмульсионных препаратах, являются ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и аравийская камедь. Абсорбционные основы обладают гидрофильными свойствами, и поэтому они могут впитывать воду и образовывать эмульсии типа в/м, которые еще сохраняют свою полутвердую консистенцию, и такими основами являются безводный ланолин и гидрофильный вазелин. Тонко измельченные твердые вещества также применяли в качестве хороших эмульгаторов, особенно в сочетании с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Указанные вещества включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, ненабухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный силикат магния-алюминия, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как уголь или глицерилтристеарат.

Большое разнообразие эмульгирующих веществ также включают в эмульсионные препараты, и такие вещества вносят вклад в определенные свойства эмульсий. Такими веществами являются жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).

Гидрофильными коллоидами или гидроколлоидами являются встречающиеся в природе смолы и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, аравийская камедь, агар, альгиновая кислота, каррагенан, гуаровая камедь, камедь карайи и трагакантовая камедь), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлоза и карбоксипропилцеллюлоза) и синтетические полимеры (например, карбомеры, эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Такие вещества диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсию за счет образования прочных межфазных пленок вокруг капелек дисперсионной фазы и посредством повышения вязкости внешней фазы.

Так как эмульсии часто содержат ряд ингредиентов, таких как углеводы, белки, стиролы и фосфатиды, которые могут хорошо поддерживать рост микробов, то часто в такие препараты включают консерванты. Широко используемыми консервантами, включаемыми в эмульсионные препараты, являются метилпарабен, пропилпарабен, четвертичные аммониевые соли, хлорид бензалкония, сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты и борная кислота. В эмульсионные препараты также обычно добавляют антиоксиданты для предотвращения разложения препарата. Используемыми антиоксидантами могут быть акцепторы свободных радикалов, такие как токоферолы, алкилгаллаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановители, такие как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и антиоксиданты-синергисты, такие как лимонная кислота, винная кислота и лецитин.

Применение эмульсионных препаратов чрескожным, пероральным и парентеральным путями и способы их производства описаны в литературе (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Эмульсионные препараты для пероральной доставки очень широко применяли, вследствие простоты их приготовления, а также их эффективности с точки зрения всасывания и биологической доступности (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Слабительные на основе минерального масла, растворимые в масле витамины и питательные препараты с высоким содержание жира относятся к веществам, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий «м/в».

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции и-РНК и нуклеиновых кислот готовят в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система, состоящая из воды, масла и амфифильного вещества, которая представляет собой оптически изотропный и термодинамически стабильный жидкий раствор (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Обычно микроэмульсии представляют собой системы, которые получают сначала путем диспергирования масла в водном растворе поверхностно-активного вещества с последующим добавлением достаточного количества четвертого компонента, обычно спирта со средней длиной цепи, с образованием прозрачной системы. Поэтому микроэмульсии были также описаны как термодинамически стабильные изотропно чистые дисперсии двух несмешивающихся жидкостей, которые стабилизируются межфазными пленками, состоящими из поверхностно-активных молекул (Leung and Shah, в: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, p. 185-215). Микроэмульсии обычно получают путем объединения от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. Является ли микроэмульсия микроэмульсией типа «вода в масле» (в/м) или «масло в воде» (м/в), зависит от свойств масла и используемого поверхностно-активного вещества и от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов поверхностно-активных молекул (Schott, in Remington′s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).

Были проведены всесторонние исследования фазовых диаграмм с использованием феноменологического подхода и были получены исчерпывающие сведения о том, как специалист в данной области может приготовить микроэмульсии (См., например, Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). По сравнению со стандартными эмульсиями микроэмульсии обеспечивают преимущество, которое заключается в солюбилизации не растворимых в воде лекарственных средств в препарате, состоящем из термодинамически стабильных капелек, которые образуются спонтанно.

Поверхностно-активные вещества, используемые для получения микроэмульсий, включают без ограничения ионогенные поверхностно-активные вещества, неионогенные поверхностно-активные вещества, Brij 96, простые олеиловые эфиры полиоксиэтилена, сложные эфиры полиглицерина и жирных кислот, монолаурат тетраглицерина (ML310), моноолеат тетраглицерина (MO310), моноолеат гексаглицерина (PO310), пентаолеат гексаглицерина (PO500), монокапрат декаглицерина (MCA750), моноолеат декаглицерина (MO750), секвиолеат декаглицерина (SO750), декаолеат декаглицерина (DAO750), отдельно или в сочетании со вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, обычно спирт с короткой цепью, такой как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для повышения текучести за счет проникновения в пленку поверхностно-активного вещества с последующим образованием неупорядоченной пленки в результате образования пустого пространства между молекулами поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены и без использования вторичных поверхностно-активных веществ, и в данной области известны самоэмульгирующиеся микроэмульсионные системы, не содержащие спирта. Водной фазой обычно могут служить без ограничения вода, водный раствор лекарственного средства, глицерин, ПЭГ300, ПЭГ400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляной фаза может содержать без ограничения такие вещества, как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, моно-, ди- и триглицериды со средней длиной цепи (C8-C12), полиоксиэтилированные эфиры глицерина и жирных кислот, жирные спирты, полигликолевые глицериды, насыщенные полигликолизированные С8-С10-глицериды, растительные масла и силиконовое масло.

Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения солюбилизации и усиления всасывания лекарственных средств. Было высказано предположение, что микроэмульсии на основе липидов (как м/в, так и в/м) повышают пероральную биологическую доступность лекарственных средств, включая пептиды (См., например, патенты США №6191105, 7063860, 7070802, 7157099; публикацию Constantinides с соавторами, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Преимущества микроэмульсий заключаются в улучшенной солюбилизации лекарственных средств, защите лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможном усилении всасывания лекарственного средства, обусловленном индуцированным поверхностно-активным веществом изменением текучести и проницаемости мембраны, легкости приготовления, легкости перорального введения в виде твердых лекарственных форм, улучшенной клинической эффективности и пониженной токсичности (См., например, патенты США №6191105, 7063860, 7070802, 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться спонтанно при взаимодействии их компонентов при температуре окружающей среды. Это может быть особенно предпочтительным в случае приготовления термолабильных лекарственных средств, пептидов или и-РНК. Микроэмульсии также являются эффективными при трансдермальной доставке активных компонентов в случае как косметических, так и фармацевтических применений. Предполагается, что имеющие форму микроэмульсий композиции и препараты согласно настоящему изобретению будут способствовать повышению уровня системного всасывания и-РНК и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также повышению локального поглощения и-РНК и нуклеиновых кислот клетками.

Микроэмульсии согласно настоящему изобретению могут также содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как моностеарат сорбитана (Grill 3), лабразол и усилители проницаемости, улучшающие свойства препарата и усиливающие всасывание и-РНК и нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Усилители проницаемости, используемые в микроэмульсиях согласно настоящему изобретению, могут быть классифицированы как вещества, принадлежащие к одной из пяти широких категорий, а именно поверхностно-активным веществам, жирным кислотам, солям желчных кислот, хелатообразующим агентам и веществам, не являющимся ни хелатообразующими, ни поверхностно-активными веществами (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из таких классов обсуждался выше.

Усилители проницаемости

В одном варианте осуществления настоящего изобретения используют различные усилители проницаемости в целях обеспечения эффективной доставки нуклеиновых кислот, в частности и-РНК, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствует в растворе как в ионизованной, так и в неионизованной формах. Однако обычно через клеточные мембраны легко проходят только растворимые в липидах или липофильные лекарственные средства. Было обнаружено, что через клеточные мембраны могут проходить даже нелипофильные лекарственные средства, если такая пересекаемая мембрана обработана усилителем проницаемости. Усилители проницаемости, помимо стимуляции диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, также повышают проницаемость для липофильных лекарственных средств.

Усилители проницаемости могут быть классифицированы как соединения, принадлежащие к одной из пяти широких категорий, то есть поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатообразующие агенты и соединения, не образующие хелатные комплексы и не являющиеся поверхностно-активными веществами (См., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Каждый из вышеупомянутых классов усилителей проницаемости более подробно описан ниже.

Поверхностно-активные вещества: В соответствии с настоящим изобретением, поверхностно-активные вещества (или «поверхностно-активные агенты) представляют собой химические молекулы, которые при их растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межфазное поверхностное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, в результате чего повышается уровень всасывания и-РНК через слизистую оболочку. Помимо солей желчных кислот и жирных кислот, такими усилителями проницаемости являются, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (См., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); и перфторированные эмульсии, такие как FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).

Жирные кислоты: Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют как усилители проницаемости, включают, например, олеиновую кислоту, лауриловую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рац-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, 1-монокапрат глицерина, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины или их сложные С1-20 алкиловые эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и моно- и диглицериды (т.е., олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.п.) (См., например, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).

Соли желчных кислот: Физиологическая роль желчи состоит в облегчении диспергирования и всасывания липидов и жирорастворимых витаминов (См., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Различные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как усилители проницаемости. Таким образом, термин «соли желчных кислот» включает любой из встречающихся в природе компонентов желчи, а также любое из их синтетических производных. Подходящие соли желчных кислот включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюкохолевую кислоту (глюкохолат натрия), гликохолевую кислоту (гликохолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (STDHF), гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (POE) (См., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).

Хелатообразующие агенты: Хелатообразующие агенты, используемые в настоящем изобретении, могут быть определены как соединения, которые удаляют ионы металлов из раствора посредством образования комплексов с такими ионами, что приводит к усилению всасывания и-РНК через слизистую оболочку. Что касается использования таких агентов в качестве усилителей проницаемости в настоящем изобретении, то такие хелатообразующие агенты имеют дополнительное преимущество, которое состоит в том, что они также служат в качестве ингибиторов ДНКазы, поскольку наиболее известным ДНК-нуклеазам для осуществления катализа необходим ион двухвалентного металла, и поэтому они ингибируются хелатообразующими агентами (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатообразующие агенты включают без ограничения этилендиаминотетраацетат динатрия (EDTA), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомованилат), N-ацильные производные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацильные производные β-дикетонов (енаминов) (См., например, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).

Соединения, не образующие хелатные комплексы и не являющиеся поверхностно-активными веществами: В используемом в настоящем описании смысле усилители проницаемости, не образующие хелатные комплексы и не являющиеся поверхностно-активными веществами, могут быть определены как соединения, которые проявляют незначительную активность в качестве хелатообразующих агентов или в качестве поверхностно-активных веществ, но, тем не менее, усиливают всасывание и-РНК через слизистую оболочку пищеварительного тракта (См., например, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Такой класс усилителей проницаемости включает, например, ненасыщенные циклические мочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканонов (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак-натрий, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

Средства для усиления захвата и-РНК на клеточном уровне также могут быть добавлены в фармацевтические и другие композиции согласно настоящему изобретению. Например, известно, что катионные липиды, такие как липофектин (Junichi с соавторами, патент США №5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo с соавторами, заявка PCT WO 97/30731), усиливают захват днРНК клетками. Примеры коммерчески доступных реагентов для трансфекции наряду с другими включают, например, липофектамин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), липофектамин 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293-фектин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), селлфектин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), липофектамин™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), липофектамин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), олигофектамин™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), оптифект™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), реагент для трансфекции X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland), реагент для липосомной трансфекции DOTAP (Grenzacherstrasse, Switzerland), реагент для липосомной трансфекции DOSPER (Grenzacherstrasse, Switzerland) или Fugene (Grenzacherstrasse, Switzerland), реагент трансфектам® (Promega; Madison, WI), реагент для трансфекции TransFast™ (Promega; Madison, WI), реагент Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), реагент Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, France), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, France), реагент для трансфекции TransPassa D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, USA), LyoVec™/LipoGen™ (Invivogen; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции цитофектин (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, USA), реагент для трансфекции TroganPORTER™ (Genlants; San Diego, CA, USA), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), или HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA).

Другие средства, которые могут быть использованы для усиления проницаемости для вводимых нуклеиновых кислот, включают гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.

Носители

Некоторые композиции согласно настоящему изобретению в препарате также содержат соединения-носители. В используемом в настоящем описании смысле термины «соединение-носитель» или «носитель» могут относиться к нуклеиновой кислоте или ее аналогу, которые являются инертными (т.е. не обладают биологической активностью как таковые), но распознаются как нуклеиновая кислота в процессах in vivo, которые снижают биологическую доступность нуклеиновой кислоты, обладающей биологической активностью, посредством, например, расщепления биологически активной нуклеиновой кислоты или стимуляции ее удаления из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего вещества, может приводить к значительному снижению количества нуклеиновой кислоты, извлекаемой в печени, почках или в других не относящихся к циркуляции резервуарах, вероятно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за их общий рецептор. Например, извлечение частично фосфортиоатной днРНК в ткани печени может быть уменьшено при совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо-4'-изотиоцианостильбен-2,2'-дисульфоновой кислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).

Эксципиенты

В отличие от соединения-носителя «фармацевтический носитель» или «эксципиент» представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующий агент или любой другой фармакологически инертный носитель для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Эксципиент может быть жидким или твердым, и он может быть выбран в соответствии с планируемым способом введения, так чтобы при объединении с нуклеиновой кислотой и с другими компонентами данной фармацевтической композиции он обеспечивал желаемый объем, консистенцию и т.д.. Типичные фармацевтические носители включают без ограничения связывающие вещества (например, предварительно желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или бифосфат кальция и т.д.); скользящие вещества (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); дезинтегрирующие средства (например, крахмал, гликолят натрия-крахмала и т.д.); и увлажнители (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).

Фармацевтически приемлемые органические или неорганические эксципиенты, подходящие для непарентерального введения, которые не вступают во взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, вызывающими их разрушение, также могут быть использованы для приготовления композиций согласно настоящему изобретению. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и тому подобное.

Препараты для местного введения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в стандартных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Такие растворы также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Могут быть также использованы фармацевтически приемлемые органические или неорганические эксципиенты, подходящие для непарентерального введения, которые не вступают во взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, которые приводят к их разрушению.

Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты включают без ограничения воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и тому подобное.

Другие компоненты

Композиции согласно изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, обычно присутствующие в фармацевтических композициях на уровнях применения, установленных в данной области. Таким образом, композиции могут содержать, например, дополнительные совместимые фармацевтически активные вещества, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, либо они могут содержать дополнительные вещества, применимые при физическом приготовлении различных дозированных форм композиций согласно настоящему изобретению, такие как красители, корригенты, консерванты, антиоксиданты, вещества для придания светопоглощающих свойств, загустители и стабилизаторы. Однако такие вещества при их добавлении не должны оказывать чрезмерного влияния на биологическую активность компонентов композиций согласно настоящему изобретению. Препараты можно стерилизовать и при необходимости смешивать с вспомогательными средствами, например, скользящими веществами, консервантами, стабилизаторами, увлажнителями, эмульгаторами, солями, влияющими на осмотическое давление, буферами, красителями, корригентами и/или ароматизириюущими веществами и тому подобными, которые не вступают во взаимодействие с нуклеиновой кислотой (кислотами) в препарате, вызывающими из разрушение.

Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.

В некоторых вариантах фармацевтические композиции, охарактеризованные в изобретении, содержат (a) одно или несколько и-РНК-соединение и (b) одно или несколько биологических средств, которые действуют по механизму, отличному от механизма РНК-и. Примерами таких биологических средств включают средства, которые мешают взаимодействию ALAS1 и, по меньшей мере, одного партнера, связывающегося с ALAS1.

Токсичность и терапевтическую эффективность таких соединений можно определять стандартными фармацевтическими способами с использованием клеточных культур или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Отношение дозы, оказывающей токсическое действие, к дозе, оказывающей терапевтическое действие, является терапевтическим индексом и может быть выражено в виде отношения LD50/ED50. Обычными являются соединения, которые имеют высокие терапевтические индексы.

Данные, полученные в результате анализов клеточной культуры или в исследованиях на животных, могут быть использованы в целях приготовления доз в определенном диапазоне для применения на человеке. Дозы композиций, охарактеризованных в изобретении, обычно лежат в диапазоне концентрации в кровотоке, который включает ED50, с небольшой токсичностью или в отсутствие токсичности. Доза может варьировать в таком диапазоне, в зависимости от используемой лекарственной формы и от применяемого способа введения. Для любого соединения, используемого в способах, охарактеризованных в изобретении, терапевтически эффективную дозу сначала можно оценить в анализах на культуре клеток. В случае моделей на животных доза может быть приготовлена так, чтобы достичь циркулирующего в плазме диапазона концентраций соединения или, в соответствующем случае, полипептидного продукта последовательности-мишени (например, достижение пониженной концентрации полипептида), который включает IC50 (т.е., концентрацию тестируемого соединения, которая приводит к полумаксимальному подавлению симптомов), которую определяют в культуре клеток. Такая информация может быть использована для более точного определения доз для человека. Уровни в плазме могут быть измерены, например, с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Помимо обсуждаемого выше введения и-РНК, охарактеризованные в изобретении, можно вводить в сочетании с другими известными средствами, эффективными при лечении заболеваний или расстройств, связанных с экспрессией ALAS1. В любом случае, лечащий врач может скорректировать количество и время введения и-РНК на основе результатов, получаемых с использованием стандартных критериев эффективности, известных в данной области или описанных в настоящей публикации.

Способы лечения заболеваний, связанных с экспрессией гена ALAS1

Изобретение, в частности, относится к применению и-РНК, мишенью которой является ALAS1, для ингибирования экспрессии ALAS1 и/или лечения заболевания, расстройства или патологического процесса, который связан с экспрессией ALAS1.

В используемом в настоящем описании смысле термины «расстройство, связанное с экспрессией ALAS1», «заболевание, связанное с экспрессией ALAS1», «патологический процесс, связанный с экспрессией ALAS1»" или тому подобные включают любое состояние, расстройство или заболевание, при котором экспрессия ALAS1 изменена (например, повышена), уровень одного или нескольких порфиринов изменен (например, повышен), уровень или активность одного или нескольких ферментов в пути биосинтеза гема (пути порфирина) изменены, или действуют другие механизмы, которые приводят к патологическим изменениям пути биосинтеза гема. Например, и-РНК, мишенью которой является ген ALAS1, или ее сочетания можно использовать для лечения состояний, при которых уровни порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) повышены (например, некоторых порфирий), или состояний, при которых существуют дефекты ферментов в пути биосинтеза гема (например, некоторых порфирий). Расстройства, связанные с экспрессией ALAS1, включают, например, X-сцепленную сидеробластную анемию (XLSA), порфирию вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ночную порфирию), острую интермиттирующую порфирию (AIP), врожденную эритропоэтическую порфирию, позднюю кожную порфирию, наследственную копропорфирию (копропорфирию), смешанную порфирию, эритропоэтическую протопорфирию (EPP), и временную эритропорфирию новорожденных.

В используемом в настоящем описании смысле «субъектом», подвергаемым лечению согласно способам, описанным в настоящей публикации, является человек или животное, отличное от человека, например, млекопитающее. Млекопитающим может быть, например, грызун (например, крыса или мышь) или примат (например, обезьяна). В некоторых вариантах субъектом является человек.

В некоторых вариантах субъект страдает от расстройства, связанного с экспрессией ALAS1 (например, у него диагностирована порфирия или он страдает от одного или нескольких симптомов порфирии и является носителем мутации, ассоциированной с порфирией), или для него существует риск развития расстройства, связанного с экспрессией ALAS1 (например, субъект с порфирией в семейном анамнезе или субъект, который является носителем генетической мутации, ассоциированной с порфирией).

Классификация порфирий, включая острые печеночные порфирии, описана, например, в работе Balwani, M. и Desnick, R.J., Blood, 120(23), опубликованной он-лайн: Blood First Edition paper, 12 июля, 102; DOI 10.1182/blood-2012-05-423186. Как описано в публикации Balwain и Desnick, острая интермиттирующая порфирия (AIP), наследственная копропорфирия (HCP), смешанная порфирия (VP) являются аутосомно-доминантными порфириями, а порфирия вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) является аутосомно-рецессивной. В редких случаях AIP, HCP, и VP встречаются в виде гомозиготных доминантных форм. Кроме того, существует редкая гомозиготная рецессивная форма поздней кожной порфирии (PCT), которая является единственной кожной формой печеночной порфирии и также известна как гепатоэритропоэтическая порфирия. Клинические и лабораторные признаки таких порфирий описаны в таблице 11 ниже.

Таблица 11
Печеночные порфирии человека: клинические и лабораторные признаки
Порфирия Недостаточность фермента Наследование Основные симптомы, NV или CP Ферментативная активность, в % от нормальной Повышенный уровень предшественников порфиринов и/или порфиринов Эритроциты Моча Кал Острые печеночные порфирии ADP ALA-дегидратаза AR NV ~5 Zn-протопорфирин ALA, копропорфирин III _ AIP HMB-синтаза AD NV ~50 _ ALA, PBG, уропорфирин _ HCP копро-оксидаза AD NV и CP ~50 _ ALA, PBG, копропорфирин III копропорфирин III VP прото-оксидаза AD NV и CP ~50 _ ALA, PBG копропорфирин III копропорфирин III, протопорфирин Кожная форма печеночной порфирии PCT URO-декарбоксилаза спорадическая или AD CP <20 _ уропорфирин, 7-карбоксилатпорфирин уропорфирин, 7-карбоксилатпорфирин AR означает аутосомно-рецессивное; AD, аутосомно-доминантное; NV, нейровисцеральное; CP, кожная фоточувствительность; и -, не применимо.
* Повышение, которое может быть важным для диагностики.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или для него существует риск развития порфирии, например, печеночной порфирии например, AIP, HCP, VP, ADP или гепатоэритропоэтической порфирии.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, острую печеночную порфирию, выбранную из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), и порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP).

В некоторых вариантах порфирия представляет собой двойную порфирию, например, по меньшей мере, две порфирии. В некоторых вариантах двойная порфирия включает две или более порфирий, выбранных из острой интермиттирующей порфирии (AIP) наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP) и порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP).

В некоторых вариантах порфирия представляет собой гомозиготную доминантную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, HCP, или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP, HCP, VP или гепатоэритропоэтическую порфирию или их сочетание (например, двойную порфирию). В некоторых вариантах AIP, HCP или VP являются либо гетерозиготными доминантными, либо гомозиготными доминантными.

В некоторых вариантах субъект подвергается риску развития порфирии, например, ADP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) ALA и/или копропорфирина III. В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, ADP, и у него наблюдают повышенный уровень Zn-протопорфирина в эритроцитах.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, AIP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) ALA, PBG и/или уропорфирина.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, HCP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) ALA, PBG и/или копропорфирина III. В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, HCP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в кале) копропорфирина III.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, VP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) ALA, PBG, и/или копропорфирина III.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, HCP, и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в кале) копропорфирина III и/или протопорфирина.

В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, PCT, (например, гепатоэритропоэтической порфирии), и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в моче) уропорфирина и/или 7-карбоксилатпорфирина. В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например, PCT, (например, гепатоэритропоэтической порфирии), и у него наблюдают повышенный уровень (например, повышенный уровень в кале) уропорфирина и/или 7-карбоксилатпорфирина.

Мутация, ассоциированная с порфирией, включает любую мутацию в гене, кодирующую фермент в пути биосинтеза гема (пути порфирина), или в гене, который изменяет экспрессию гена в пути биосинтеза гема. Во многих вариантах субъект несет одну или несколько мутаций в ферменте пути порфирина (например, мутацию ALA-дегидратазы или PBG-дезаминазы). В некоторых вариантах субъект страдает от острой порфирии (например, AIP, порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы).

В некоторых случаях пациенты с острой печеночной порфирией (например, AIP), или пациенты, которые несут мутации, ассоциированные с острой печеночной порфирией (например, AIP), но у которых нет симптомов, имеют повышенные уровни ALA и/или PBG по сравнению со здоровыми людьми. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. В таких случаях уровень ALA и/или PBG может быть повышен даже в том случае, когда у пациента нет или никогда не было приступа. В некоторых подобных случаях у пациента совсем нет симптомов. В некоторых подобных случаях пациент страдает от боли, например, нейропатической боли, которая может представлять собой хроническую боль (например, хроническую нейропатическую боль). В некоторых случаях пациент имеет нейропатию. В некоторых случаях пациент имеет прогрессирующую нейропатию.

В некоторых вариантах субъект, подвергаемый лечению согласно способам, описанным в настоящей публикации, имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Уровни порфирина или предшественника порфирина можно оценить, используя способы, известные в данной области, или способы, описанные в настоящей публикации. Например, способы оценки уровней ALA и PBG в моче и плазме, а также уровней порфирина в моче и плазме описаны в публикациях Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; and Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007, полное содержание которых включено в настоящее описание в полном объеме.

В некоторых вариантах субъектом является животное, которое является моделью порфирии, например, мышиной моделью порфирии (например, мутантная мышь, которая описана в публикации Lindberg с соавторами Nature Genetics, 12: 195-199, 1996). В некоторых вариантах субъектом является человек, например, человек, который имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, которая описана в настоящей публикации. В некоторых вариантах у субъекта в данный момент нет острого приступа порфирии. В некоторых вариантах у субъекта никогда не было приступа. В некоторых вариантах пациент страдает от хронической боли. В некоторых вариантах у пациента имеется повреждение нерва. В некоторых вариантах субъект имеет изменение на ЭМГ и/или изменения в скорости проводимости нерва. В некоторых вариантах у субъекта нет симптомов. В некоторых вариантах субъект подвергается риску развития порфирии (например, несет генную мутацию, ассоциированную с порфирией) и не имеет симптомов. В некоторых вариантах субъект ранее имел острый приступ, но во время лечения не имеет симптомов.

В некоторых вариантах субъект подвергается риску развития порфирии и подвергается профилактическому лечению, чтобы предотвратить развитие порфирии. В некоторых вариантах субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. В некоторых вариантах профилактическое лечение начинается в пубертатный период. В некоторых вариантах лечение снижает уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. В некоторых вариантах лечение предотвращает развитие повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. В некоторых вариантах лечение предотвращает развитие или уменьшает частоту или тяжесть симптома, ассоциированного с порфирией, например, боли или повреждения нерва.

В некоторых вариантах уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, повышен, например, в образце плазмы или моче субъекта. В некоторых вариантах уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе абсолютного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG в образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе относительного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах относительный уровень определяют по отношению к уровню другого белка или соединения, например, к уровню креатинина в образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах образец представляет собой образец мочи. В некоторых вариантах образец представляет собой образец плазмы. В некоторых вариантах образец представляет собой образец кала.

Повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, может быть установлен, например, в том случае, когда показано, что субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG (например, уровень ALA и/или PBG в плазме или моче), который превышает или выше или равен эталонному значению. Лечащий врач, компетентный в отношении лечения порфирий может определить, является ли уровень порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) повышенным, например, в целях диагностики порфирии или для определения того, подвергается ли субъект риску развития порфирии, например, субъект может быть предрасположен к острому приступу или к патологии, ассоциированной с порфирией, такой как, например, хроническая боль (например, нейропатическая боль) и нейропатия (например, прогрессирующая нейропатия).

В используемом в настоящем описании смысле «эталонное значение» относится к значению, полученному для субъекта в том случае, когда у субъекта нет патологического заболевания, или значению, полученному для нормального или здорового субъекта, или значению для эталонного образца или популяции, например, группы нормальных или здоровых субъектов (например, группы субъектов, которые не несут мутации, ассоциированной с порфирией, и/или группы субъектов, которые не страдают от симптомов, ассоциированных с порфирией).

В некоторых вариантах эталонным значением является значение, полученное до заболевания для того же самого индивидуума. В некоторых вариантах эталонным значением является уровень в эталонном образце или популяции. В некоторых вариантах эталонным значением является среднее или медианное значение в эталонном образце или популяции. В некоторых вариантах эталонным значением является значение, которое на два стандартных отклонения выше среднего значения в эталонном образце или популяции. В некоторых вариантах эталонным значением является значение, которое на 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5 стандартных отклонений выше среднего в эталоннм образце или популяции.

В некоторых вариантах, когда субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, субъект имеет уровень ALA и/или PBG, который, по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% выше, чем эталонное значение. В некоторых вариантах субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, который, по меньшей мере, в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз выше, чем эталонное значение.

В некоторых вариантах эталонное значение является верхним пределом эталона. В используемом в настоящем описании смысле «верхний предел эталона» относится к уровню, который является верхним пределом 95% доверительного интервала для эталонного образца или популяции, например, группы нормальных (например, дикого типа) или здоровых индивидуумов, например, индивидуумов, которые не несут генетической мутации, ассоциированной с порфирией, и/или индивидуумов, которые не страдают от порфирии. Соответственно, нижний предел эталона относится к уровню, который является нижним пределом того же 95% доверительного интервала.

В некоторых вариантах, когда субъект имеет повышенный уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче, порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, уровень выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5-кратному эталонному значению, например, верхнему пределу эталона. В некоторых вариантах субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в моче, которые более чем в 4 раза превышают верхний предел эталона.

В некоторых вариантах эталонным значением является значение, приведенное в публикации Floderus, Y. с соавторами (Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006) или Sardh с соавторами (Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007). В некоторых вариантах эталонным значением является значение, приведенное в таблице 1 в публикации Sardh с соавторами.

В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен примерно 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах эталонное значение PBG в плазме равно 0,12 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в плазме, который превышает или выше или равен 0,10 мкмоль/л, 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в плазме, который превышает или выше или равен 0,48 мкмоль/л.

В некоторых вариантах эталонное значение PBG в моче равно 1,2 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен 1,0 ммоль/моль креатинина, 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень PBG в моче, который превышает или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах эталонное значение ALA в плазме равно 0,12 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в плазме, который превышает или выше или равен 0,10 мкмоль/л, 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в плазме, который превышает или выше или равен 0,48 мкмоль/л.

В некоторых вариантах эталонное значение ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень ALA в моче, который превышает или выше или равен 2,5 ммоль/моль креатинина, 3,1 ммоль/моль креатинина, 6,2 ммоль/моль креатинина, 9,3 ммоль/моль креатинина, 12,4 ммоль/моль креатинина или 15,5 ммоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах эталонное значение порфирина в плазме равно 10 нмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в плазме, который превышает или выше или равен 10 нмоль/л. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в плазме, который превышает или выше или равен 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нмоль/л, субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в плазме, который превышает или выше или равен 40 нмоль/л. В некоторых вариантах эталонное значение порфирина в моче составляет 25 мкмоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в моче, который превышает или выше или равен 25 мкмоль/моль креатинина. В некоторых вариантах субъектом является человек, и он имеет уровень порфирина в моче, который выше или равен 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, или 80 мкмоль/моль креатинина.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, который выше чем уровень у 99% индивидуумов в образце от здоровых индивидуумов.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче ALA или PBG, который на два стандартных отклонения превышает средний уровень в образце от здоровых индивидуумов.

В некоторых вариантах субъект имеет уровень ALA в моче, который в 1,6 или большее число раз превышает средний уровень у нормального субъекта (например, субъекта, который не несет мутацию, ассоциированную с порфирией). В некоторых вариантах субъект имеет уровень ALA в плазме, который в 2 или 3 раза выше среднего уровня у нормального субъекта. В некоторых вариантах субъект имеет уровень PBG в моче, который в четыре или большее число раз превышает средний уровень у нормального субъекта. В некоторых вариантах субъект имеет уровень PBG в плазме, который в четыре или большее число раз превышает средний уровень у нормального субъекта.

В некоторых вариантах способ эффективно снижает уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. В некоторых вариантах способ является эффективным в отношении получения предварительно определяемого снижения повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG. В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является уменьшение, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%. В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является снижение, которое эффективно предотвращает или ослабляет симптомы, например, боль или рецидивы приступов.

В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является снижение, которое составляет, по меньшей мере, 1, 2, 3 или больше стандартных отклонений, при этом стандартное отклонение определяют на основе значений для эталонного образца, например, эталонного образца, который описан в настоящей публикации.

В некоторых вариантах предварительно определяемым снижением является снижение, которое приводит уровень порфирина или предшественника порфирина к уровню, который меньше эталонного значения, или к уровню, который меньше или равен эталонному значению (например, эталонному значению, которое описано в настоящей публикации).

В некоторых вариантах субъект, подвергаемый лечению согласно описанным способам, страдает от боли, например, хронической боли. В некоторых вариантах субъект имеет порфирию или подвергается риску развития порфирии, например острой печеночной порфирии, например, AIP. В некоторых вариантах способ эффективен в лечении боли, например, благодаря снижению тяжести боли или излечению от боли. В некоторых вариантах способ эффективен в снижении или предотвращении повреждения нервов.

В некоторых вариантах субъект, подвергаемый лечению согласно способам, описанным в настоящей публикации, (a) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и (b) страдает от боли, например, хронической боли. В некоторых вариантах способ эффективен в снижении повышенного уровня ALA и/или PBG и/или в лечении боли, например, благодаря снижению тяжести боли или излечению от боли.

В некоторых вариантах субъектом является животное, которое служит в качестве модели расстройства, связанного с экспрессией ALAS1.

В некоторых вариантах субъектом является животное, которое служит в качестве модели порфирии (например, генетически модифицированное животное с одной или несколькими мутациями). В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP, и субъектом является животное, представляющее собой модель AIP. В одном таком варианте субъектом является генетически модифицированная мышь, имеющая недостаточность порфобилиногендезаминазы, такая как, например, мышь, описанная в публикации Lindberg с соавторами (Nature Genetics, 12: 195-199, 1996), или гомозиготная R167Q-мышь, описанная в публикации Yasuda, M., Yu, C. Zhang, J., Clavero, S., Edelmann, W., Gan, L., Phillips, J.D., & Desnick, R.J. Acute intermittent porphyria: A severely affected knock-in mouse that mimics the human homozygous dominant phenotype. (Abstract of Presentation on October 14, 2011 at the American Society of Human Genetics; Program No. 1308F; опубликованной он-лайн 4 апреля 2012 на сайте ichg2011.org/cgi-bin/showdetail.pl?absno=21167); обе указанных публикации включены в настоящее описание в полном объеме. Было создано несколько нокин-моделей с мутациями, вызывающими гомозиготную доминантную AIP у человека. Используемые мутации включают, например, R167Q, R173Q и R173W в PBG-дезаминазе. Жизнеспособные гомозиготы содержали R167Q/R176Q и R167Q/R173Q, и в обоих случаях у них наблюдали конститутивно повышенные уровни ALA и PBG, аналогичные фенотипу при гомозиготной доминантной AIP человека; в некоторых вариантах такая жизнеспособная гомозиготная мышиная модель AIP является субъектом.

В одном варианте субъект, которого необходимо лечить согласно способам, описанным в настоящей публикации (например, человек (субъект или пациент)), подвергается риску развития или у которого было диагностировано расстройство, связанное с экспрессией ALAS1, например, порфирии. В некоторых вариантах субъектом является субъект, который страдал от одного или нескольких острых приступов одного или нескольких симптомов порфирии. В других вариантах субъектом является субъект, который хронически страдал от одного или нескольких симптомов порфирии (например, боли, например, нейропатической боли и или нейропатии, например, прогрессирующей нейропатии). В некоторых вариантах субъект несет генетическое изменение (например, мутацию), которая описана в настоящей публикации, но не имеет никаких иных симптомов. В некоторых вариантах субъект ранее подвергался лечению продуктом гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином), который описан в настоящей публикации.

В некоторых вариантах субъект (например, субъект с порфирией, такой как, например, AIP), подвергаемый лечению согласно способам, описанным в настоящей публикации, недавно перенес или в настоящее время переживает состояние продрома. В некоторых таких вариантах субъекту проводят комбинированное лечение, например, используя и-РНК, которая описана в настоящей публикации, и одно или несколько дополнительных средств лечения, которые, как известно, эффективны против порфирии (например, глюкозу и/или продукт гема, такой как гемин, который описан в настоящей публикации) или ассоциированных с ней симптомов.

В одном варианте и-РНК, которая описана в настоящей публикации, вводят в сочетании с глюкозой или декстрозой. Например, может быть введено 10-20% декстрозы в физиологическом растворе внутривенно. Обычно, когда вводят глюкозу, ежедневно вводят, по меньшей мере, 300 г 10% глюкозы внутривенно. и-РНК (например, и-РНК в LNP-препарате) также может быть введена внутривенно, в виде части той же процедуры инфузии, которую используют для введения глюкозы или декстрозы, или в виде отдельной инфузии, которую проводят до, одновременно или после введения глюкозы или декстрозы. В некоторых вариантах и-РНК вводят другим путем введения (например, подкожно). В еще одном варианте и-РНК вводят в сочетании с полным парентеральным питанием. и-РНК можно вводить до, одновременно или после введения полного парентерального питания.

В одном варианте и-РНК вводят в сочетании с продуктом гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином). В следующем варианте и-РНК вводят в сочетании с продуктом гема и глюкозой, продуктом гема и декстрозой или продуктом гема и полным парентеральным питанием.

«Продром» в используемом в настоящем описании смысле включает любой симптом, который отдельный субъект перенес ранее, непосредственно перед развитием острого приступа. Типичные симптомы продрома включают, например, боль в области живота, тошноту, головные боли, психологические симптомы (например, тревожность), беспокойное состояние и/или бессонницу. В некоторых вариантах субъект претерпевает боль (например, боль в области живота и/или головную боль) во время продрома. В некоторых вариантах субъект чувствует тошноту во время продрома. В некоторых вариантах у субъекта проявляются психологические симптомы (например, тревожность) во время продрома. В некоторых вариантах субъект испытывает беспокойство и/или страдает от бессонницы во время продрома.

Острый «приступ» порфирии заключается в появлении одного или нескольких симптомов порфирии, обычно у пациента, который несет мутацию, ассоциированную с порфирией (например, мутацию в гене, который кодирует фермент в пути порфирина).

В некоторых вариантах введение и-РНК ALAS1 приводит к снижению уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов, которые описаны в настоящей публикации (например, ALA и/или PBG). Снижение может быть измерено относительно любого подходящего контрольного или эталонного значения. Например, снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов может быть установлено у отдельного субъекта, например, в виде снижения, по меньшей мере, на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или больше по сравнению с уровнем до лечения (например, непосредственно перед лечением). Снижение уровня предшественника порфирина, порфирина или метаболита порфирина можно измерить, используя любой способ, известный в данной области. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценить, используя тест Уотсона-Шварца, ионообменную хроматографию или высокоэффективную жидкостную хроматографию - масс-спектрометрию. См., например, Thunell (1993).

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно снижает уровень ALA и/или PBG у субъекта. Уровень ALA или PBG у субъекта можно оценить, например, на основе абсолютного уровня ALA или PBG или на основе относительного уровня ALA или PBG (например, относительно уровня другого белка или соединения, например, уровня креатинина) в образце от субъекта. В некоторых вариантах образец представляет собой образец мочи. В некоторых вариантах образец представляет собой образец плазмы.

В некоторых вариантах и-РНК, мишенью которой является ALAS1, вводят в сочетании с одним или несколькими дополнительными средствами лечения, например, с другим средством лечения, которое, как известно, является эффективным в лечении порфирии или симптомов порфирии. Например, другим средством лечения может быть глюкоза (например, глюкоза в/в) или продукт гема (например, гемин, аргинат гема или гемальбумин). Дополнительное средство (средства) лечения можно вводить до, после или одновременно с введением и-РНК.

и-РНК и дополнительное терапевтическое средство можно вводить в сочетании в одной и той же композиции, например, внутривенно, или дополнительное терапевтическое средство можно вводить в виде части отдельной композиции или другим способом, описанным в настоящей публикации.

В некоторых вариантах введение и-РНК или введение и-РНК в сочетании с одним или несколькими дополнительными средствами лечения (например, глюкозой, декстрозой или тому подобным) уменьшает частоту острых приступов (например, за счет предотвращения острых приступов, так чтобы они больше не происходили, или за счет снижения количества приступов, которые происходят в определенный период времени, например, происходит меньшее количество приступов в год). В некоторых таких вариантах и-РНК вводят согласно схеме регулярного введения доз, например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно.

В некоторых вариантах и-РНК вводят после острого приступа порфирии. В некоторых таких вариантах и-РНК находится в композиции, например, в композиции, содержащей липидный препарат, например, LNP-препарат.

В некоторых вариантах и-РНК вводят во время острого приступа порфирии. В некоторых таких вариантах и-РНК находится в композиции, например, в композиции, содержащей липидный препарат (например, LNP-препарат), или в композиции, содержащей GalNAc-конъюгат.

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 является эффективным в снижении тяжести приступа (например, благодаря ослаблению одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 является эффективным в уменьшении продолжительности приступа. В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 является эффективным в отношении остановки приступа. В некоторых вариантах и-РНК вводят профилактически, чтобы предотвратить острый приступ порфирии. В некоторых таких вариантах и-РНК находится в форме GalNAc-конъюгата, например, в композиции, содержащей GalNAc-конъюгат. В некоторых вариантах профилактическое введение осуществляют до, во время или после воздействия или появления провоцирующего фактора. В некоторых вариантах субъект подвергается риску развития порфирии.

В некоторых вариантах ми-РНК вводят во время продрома. В некоторых вариантах продром характеризуется болью (например, головной болью и/или болью в области живота), тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), беспокойным состоянием и/или бессонницей.

В некоторых вариантах ми-РНК вводят во время конкретной фазы менструального цикла, например, во время фазы лютеинизации.

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращает приступы (например, рецидивы приступов, которые ассоциированы с продромом и/или с провоцирующим фактором, например, с конкретной фазой менструального цикла, например, фазой лютеинизации). В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно снижает частоту приступов. В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно уменьшает тяжесть приступа (например, благодаря ослаблению одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно уменьшает продолжительность приступа. В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно в отношении остановки приступа.

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращает или снижает частоту или тяжесть боли, например, нейропатической боли.

В некоторых вариантах введение ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращает или снижает частоту или тяжесть нейропатии.

Эффекты введения ми-РНК ALAS1 могут быть установлены, например, при сравнении с соответствующим контролем. Например, снижение частоты острых приступов, а также снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов могут быть установлены, например, в группе пациентов с AIP в виде пониженной частоты по сравнению с соответствующей контрольной группой. Контрольная группа (например, группа сходных индивидуумов или такая же группа индивидуумов в перекрестном исследовании) может включать, например, не подвергаемую лечению популяцию, популяцию, которая получала лечение с использованием обычного средства лечения порфирии (например, обычное средство лечения AIP может включать глюкозу, гемин или оба средства); популяцию, которую лечили с использованием плацебо или не направленной к мишени и-РНК, необязательно в сочетании с одним или несколькими обычными средствами лечения порфирии (например, глюкозы, например, в/в-глюкозы) и тому подобными.

Субъектом, подвергаемым «риску» развития порфирии, в используемом в настоящем описании смысле является субъект с порфирией в семейном анамнезе и/или с одним или несколькими рецидивами или хроническими симптомами порфирии и/или субъект, который несет генетическое изменение (например, мутацию) в гене, кодирующем фермент пути биосинтеза гема, и субъект, который несет генетическое изменение, например, мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией.

В некоторых вариантах изменение, например, мутация, делает индивидуумов чувствительными к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, питания или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, который раскрыт в настоящем описании). В некоторых вариантах изменение, например, мутация, ассоциировано с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). В некоторых вариантах изменение, например, мутация, ассоциирована с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). В некоторых вариантах изменение, например, мутация, ассоциировано с изменениями в ЭМГ и/или скорости проводимости нерва.

В некоторых вариантах изменением является мутация в гене ALAS1. В некоторых вариантах изменением является мутация в промоторе гена ALAS1 или в областях выше или ниже гена ALAS1. В некоторых вариантах изменением является мутация в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. В некоторых вариантах изменение представляет собой изменение, например, мутацию, в гене, который кодирует фермент пути биосинтеза гема.

В некоторых вариантах субъект имеет генетическое изменение, которое описано в настоящей публикации (например, генетическую мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией). В некоторых таких вариантах субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в моче или в плазме) ALA и/или PBG. В некоторых таких вариантах субъект не имеет повышенного уровня ALA и/или PBG. В некоторых вариантах субъект имеет генетическое изменение, которое описано в настоящей публикации, и имеет другие симптомы, например, хроническую боль, изменения ЭМГ, изменения скорости проводимости нерва и/или другие симптомы, ассоциированные с порфирией. В некоторых вариантах субъект имеет генетическое изменение, но не страдает от острых приступов.

В некоторых вариантах субъект имеет мутацию, ассоциированную с AIP, HCP, VP или ADP.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP. В некоторых таких вариантах субъект имеет изменение, например, по меньшей мере, одну мутацию, в гене PBG-дезаминазы. В данной области известно множество мутаций PBG-дезаминазы, например, мутации, описанные в публикации Hrdinka, M. с соавторами (Physiological Research, 55 (Suppl. 2): S119-136 (2006)). В некоторых вариантах субъект является гетерозиготным по мутации PBG-дезаминазы. В других вариантах субъект является гомозиготным по мутации PBG-дезаминазы. Гомозиготный субъект может нести две идентичные мутации или две разные мутации в гене PBG-дезаминазы.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой HCP. В некоторых таких вариантах субъект имеет изменение, например, по меньшей мере, одну мутацию в гене, который кодирует фермент копропорфириноген III-оксидазы.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой VP. В некоторых таких вариантах субъект имеет изменение, например, по меньшей мере, одну мутацию в гене, который кодирует протопорфириногеноксидазу.

В некоторых вариантах порфирия представляет собой ADP, например, аутосомно-рецессивную ADP. В некоторых таких вариантах субъект имеет изменение, например, по меньшей мере, одну мутацию, в гене, который кодирует ALA-дегидратазу.

Способы лечения, предлагаемые в настоящем изобретении, могут служить для облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ с проявлением одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет возникать при воздействии провоцирующего фактора, или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией {например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоклеточного рака). Кроме того, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут служить для снижения уровня одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов и/или родственных продуктов или метаболитов порфиринов. Уровень предшественника порфирина или порфирина можно измерить в любом биологическом образце, таком как, например, образец мочи, крови, кали, спинномозговой жидкости или ткани. Образец может находиться в организме субъекта или может быть получен или выделен из организма субъекта. В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP, и уровень PBG и/или ALA снижен. В некоторых вариантах продуктом или метаболитом порфирина является порфобилин, порфобилиноген или уропорфирин. Снижение уровня продукта или метаболита порфирина можно измерить любым способом, известным в данной области. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценить, используя тест Уотсона-Шварца, ионообменную хроматографию или высокоэффективную жидкостную хроматографию - масс-спектрометрию. См., например, Thunell (1993).

Способы, описанные в настоящей публикации, также могут служить для снижения хронически повышенных уровней предшественников порфирина (например, ALA и/или PBG) у субъектов, страдающих от порфирии (например, острой печеночной порфирии, например, AIP), или подвергающихся риску развития порфирии. Способы оценки уровней в плазме и в моче (например, хронически повышенных уровней) предшественников порфиринов включают, например, ВЭЖХ-масс-спектрометрию и ионообменную хроматографию. Уровни предшественников порфиринов могут быть выражены в виде уровня относительно другого белка или соединения, например, креатинина. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007.

Термин «провоцирующий фактор» в используемом в настоящем описании смысле относится к эндогенному или экзогенному фактору, который может индуцировать острый приступ в виде одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией. Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или неадекватной калорийности потребляемой пищи, вследствие жестких диет, занятий бегом на длинные дистанции и т.д.), метаболические стрессы (например, инфекции, хирургическую операцию, международные авиационные перелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, растворимые в липидах чужеродные химические вещества (включая, например, химические вещества, присутствующие в табачном дыму, некоторые лекарственные средства, отпускаемые по рецепту, органические растворители, биоциды, компоненты алкогольных напитков), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения во время предменструального периода), синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормонозаместительную терапию). См., например, Thunell (1993). Обычно провоцирующими факторами являются индуцирующие цитохром P450 лекарственные средства и фенобарбитал.

Симптомы, ассоциированные с порфирией, могут включать боль или спазмы в области живота, головные боли, эффекты, вызванные аномалиями нервной системы и светочувствительность, вызывающая сыпи, нарывы и рубцевание кожи (световой дерматоз). В некоторых вариантах порфирия представляет собой AIP. Симптомы AIP включают симптомы, проявляющиеся в желудочно-кишечном тракте (например, тяжелую и плохо локализуемую боль в области живота, тошноту/рвоту, запор, диарею, непроходимость кишечника), симптомы мочевой системы (дизурию, задержку мочеиспускания/недержание мочи или темную мочу), неврологические симптомы (например, сенсорную нейропатию, моторную нейропатию (например, поражение черепно-мозговых нервов и/или симптомы, приводящие к слабости рук и ног), судороги, нейропатическую боль, прогрессирующую нейропатию, головные боли, нейропсихиатрические симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинации, истерию, бред, апатию, депрессию, фобии, психоз, бессонницу, сонливость, кому), вовлечение автономной нервной системы (приводящее, например, к сердечно-сосудистым симптомам, таким как тахикардия, гипертония и/или аритмии, а также другим симптомам, таким как, например, повышенные уровни циркулирующего катехоламина, потливость, возбужденное состояние и/или тремор), обезвоживание и электролитные аномалии.

В некоторых вариантах и-РНК, мишенью которой является ALAS1, вводят вместе (например, до, после или одновременно с другим средством лечения, которое может служить для облегчения одного или нескольких указанных выше симптомов. Например, боль в области живота можно лечить, например, наркотическим анальгетиком, судороги можно лечить, например, противосудорожными лекарственными средствами, тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотриазинами, и тахикардию/гипертонию можно лечить, например, бета-блокаторами.

Подразумевается, что термин «снижение» (или «повышение») относится к измеряемому изменению, например, статистически значимому изменению. Изменение может составлять, например, изменение, по меньшей мере, на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или больше (например, снижение (или повышение) относительно эталонного значения, например, эталона, получаемого в том случае когда и-РНК не вводят).

Изобретение, кроме того, относится к применению и-РНК или ее фармацевтической композиции, например, для лечения расстройства, связанного с экспрессией ALAS1, в сочетании с другими фармацевтическими средствами и/или другими способами терапии, например, с известными фармацевтическими средствами и/или известными терапевтическими способами, такими как, например, средства и способы, используемые в настоящее время для лечения расстройства. В одном варианте и-РНК или его фармацевтическую композицию можно вводить вместе с продуктом гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином, которые описаны в настоящей публикации,) и/или вместе с внутривенными инфузиями глюкозы. В некоторых вариантах и-РНК или ее фармацевтическую композицию применяют профилактически, например, чтобы предотвратить или ослабить симптомы ожидаемых приступов острой порфирии. Профилактическое применение может быть приурочено к воздействию или ожидаемому воздействию на субъекта провоцирующего фактора. Как описано в настоящей публикации, провоцирующим фактором может быть любой эндогенный или экзогенный фактор, который, как известно, провоцирует острый приступ. Например, предменструальная фаза является эндогенным провоцирующим фактором, а индуцирующее цитохром P450 лекарственное средство является экзогенным провоцирующим фактором.

Эффективное количество лекарственного средства для лечения расстройства, связанного с экспрессией ALAS1 (например, порфирии, такой как AIP) зависит от типа расстройства, подвергаемого лечению, тяжести симптомов, субъекта, подвергаемого лечению, пола, возраста и общего состояния субъекта, способа введения и так далее. В любом конкретном случае соответствующее «эффективное количество» может определить специалист в данной области, используя обычное экспериментирование. Специалист в данной области может контролировать эффективность лечения или профилактики, измеряя любой из таких параметров или любое сочетание параметров. В связи с введением и-РНК, нацеленной на ALAS1, или ее фармацевтической композиции фраза «эффективна против» расстройства, связанного с экспрессией ALAS1, указывает, что введение клинически подходящим способом приводит к полезному эффекту, например, у отдельного пациента или, по меньшей мере, у части пациентов, например, статистически значимой части пациентов. Полезные эффекты включают, например, предотвращение или снижение симптомов или другие эффекты. Например, полезные эффекты включают, например, улучшение (например, снижение тяжести или частоты) симптомов, уменьшение тяжести или частоты приступов, пониженный риск развития ассоциированного заболевания (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоклеоточного рака), повышенной способности переносить действие провоцирующего фактора, улучшенное качество жизни, снижение экспрессии ALAS1, снижение уровня (например, уровня в плазме или моче) порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) или другой эффект, обычно расцениваемый как позитивный лечащими врачами, которым известно лечение конкретного типа расстройства.

Лечебный или профилактический эффект очевиден, когда имеет место улучшение, например, статистически значимое улучшение одного или нескольких параметров патологического состояния, или когда нет ухудшения или развития симптомов, тогда как в ином случае они ожидаются. В качестве примера, благоприятное изменение измеряемого параметра заболевания, по меньшей мере, на 10%, например, по меньшей мере, на 20%, 30%, 40%, 50% или больше может быть показателем эффективного лечения. Об эффективности данного основанного на и-РНК лекарственного средства или препарата данного лекарственного средства также можно судить, используя экспериментальную животную модель такого заболевания, которая известна в данной области. При использовании экспериментальной животной модели эффективность лечения доказана в том случае, когда наблюдают статистически значимое снижение маркера (например, уровня ALA или PBG в плазме или моче) или симптома.

Пациентам можно вводить терапевтическое количество и-РНК. Терапевтическое количество может составлять, например, 0,05-50 мг/кг. Например, терапевтическое количество может составлять 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0 или 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, или 50 мг/кг днРНК.

В некоторых вариантах и-РНК готовят в виде липидного препарата, например, LNP-препарата, который описан в настоящей публикации. В некоторых таких вариантах терапевтическое количество составляет 0,05-5 мг/кг, например, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 или 5,0 мг/кг днРНК. В некоторых вариантах липидный препарат, например, LNP-препарат, вводят внутривенно.

В некоторых вариантах и-РНК вводят посредством внутривенной инфузии в течение такого периода времени как более чем 5-минутный, 10-минутный, 15-минутный, 20-минутный или 25-минутный период.

В некоторых вариантах и-РНК находится в форме GalNAc-конъюгата, который описан в настоящей публикации. В некоторых таких вариантах терапевтическое количество составляет 0,5-50 мг, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг днРНК. В некоторых вариантах GalNAc-конъюгат вводят подкожно.

В некоторых вариантах введение повторяют, например, на регулярной основе, например, ежедневно, раз в две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или дольше. После осуществления начальной схемы лечения средства лечения можно вводить менее часто. Например, после введения раз в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять один раз в месяц в течение шести месяцев или года или дольше.

В некоторых вариантах и-РНК-средство вводят в виде двух или большего количества доз. В некоторых вариантах число или количество последующих доз зависит от достижения требуемого эффекта, например, подавления гена ALAS, снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или предотвращения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией (например, боли, например, нейропатической боли), и/или предотвращения приступов или уменьшения частоты и/или тяжести приступов, ассоциированных с порфирией.

В некоторых вариантах и-РНК-средство вводят согласно схеме. Например, и-РНК-средство можно вводить один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю или пять раз в неделю. В некоторых вариантах схема включает в себя введения, разделенные регулярными интервалами, например, ежечасно, каждые четыре часа, каждые шесть часов, каждые восемь часов, каждые двенадцать часов, ежедневно, каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно. В некоторых вариантах и-РНК-средство вводят еженедельно или раз в две недели, чтобы добиться требуемого эффекта, например, снижения уровня ALA и/или PBG, снижения боли и/или предотвращения острых приступов.

В некоторых вариантах схема включает введения, разделенные короткими интервалами с последующим более длительным периодом времени, в течение которого средство не вводят. Например, схема может включать начальный набор доз, которые вводят в относительно короткий период времени (например, примерно каждые 6 часов, примерно каждые 12 часов, примерно каждые 24 часа, примерно каждые 48 часов или примерно каждые 72 часа) с последующим более длительным периодом времени (например, примерно 1 неделю, примерно 2 недели, примерно 3 недели, примерно 4 недели, примерно 5 недель, примерно 6 недель, примерно 7 недель или примерно 8 недель), в течении которого и-РНК-средство не вводят. В одном варианте и-РНК-средство сначала вводят ежечасно, а позже вводят с более длительным интервалом (например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно). В другом варианте и-РНК-средство сначала вводят ежедневно, а затем вводят с более длительным интервалом (например, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно). В некоторых вариантах более длительный интервал увеличивается с течением времени, или его определяют на основе достижения требуемого эффекта. В конкретном варианте и-РНК-средство вводят один раз в день во время острого приступа с последующим еженедельным введением дозы, начиная с восьмого дня введения. В другом конкретном варианте и-РНК-средство вводят через день в течение первой недели с последующим еженедельным введением дозы, начиная с восьмого дня введения.

В одном варианте и-РНК-средство вводят для предотвращения или снижения тяжести или частоты рецидивов приступов, например, циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором. В некоторых вариантах провоцирующим фактором является менструальный цикл. В некоторых вариантах и-РНК вводят многократно, например, с регулярными интервалами, чтобы предотвратить или уменьшить тяжесть или частоту рецидивов приступов, например, циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором, например, менструальным циклом, например, с конкретной фазой менструального цикла, например, фазой лютеинизации. В некоторых вариантах и-РНК вводят во время конкретной фазы менструального цикла или на основе уровней гормонов у пациента, подвергаемого лечению (например, на основе уровней гормонов, которые ассоциированы с конкретной фазой менструального цикла). В некоторых вариантах и-РНК вводят в один или несколько конкретных дней менструального цикла, например, в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 день (или позже в случае субъектов, которые имеют более длительный менструальный цикл). В некоторых вариантах и-РНК вводят во время фазы лютеинизации, например, в один или несколько дней в период от 14 до 28 дня менструального цикла (или позже в случае субъектов, которые имеют менструальный цикл длиннее, чем 28 дней). В некоторых вариантах оценивают овуляцию у субъекта (например, используя тестирование крови или мочи, при котором выявляют гормон, ассоциированный с овуляцией, например, LH), и и-РНК вводят в предварительно определенный интервал времени после овуляции. В некоторых вариантах и-РНК вводят сразу после овуляции. В некоторых вариантах и-РНК вводят через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 дней после овуляции. Любую из указанных схем необязательно можно повторять один или несколько раз. Количество повторений может зависеть от достижения требуемого эффекта, например, подавления гена ALAS1 и/или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или подавления одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией.

В некоторых вариантах вводят начальную дозу и-РНК-средства и тестируют уровень ALA или PBG, например, через 1-48 часов, например, через 2, 4, 8, 12 или 24 часа после введения начальной дозы. В некоторых вариантах в том случае, если уровень ALA и/или PBG снизился (например, достигнуто предварительно определяемое снижение, например, нормализация) и/или если симптомы, ассоциированные с порфирией (например, боль), улучшились (например, так что у пациента не проявляются симптомы), больше дозу не вводят, тогда как в случае, когда уровень ALA и/или PBG не снизился (например, не было достигнуто предварительно определяемое снижение, например, не произошла нормализация), вводят дополнительную дозу ALA или PBG. В некоторых вариантах дополнительную дозу вводят через 12, 24, 36, 48, 60 или 72 часа после начальной дозы. В некоторых вариантах в том случае, когда начальная доза является неэффективной в снижении уровня ALA и/или PBG, дополнительную дозу модифицируют, например, увеличивают, чтобы добиться требуемого снижения (например, предварительно определяемого снижения, например, нормализации) уровней ALA или PBG.

В некоторых вариантах предварительно определяемое снижение представляет собой снижение, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%. В некоторых вариантах предварительно определяемое снижение представляет собой снижение, которое эффективно предотвращает или ослабляет симптомы, например, боль, симптомы продрома или рецидивы приступов.

В некоторых вариантах предварительно определяемое снижение представляет собой снижение, по меньшей мере, на 1, 2, 3 или больше стандартных отклонений, при этом стандартное отклонение определяют на основе значений, полученных для эталонного образца, например, эталонного образца, который описан в настоящей публикации.

В некоторых вариантах предварительно определяемое снижение представляет собой снижение, которое приводит уровень порфирина или предшественника порфирина к уровню, который ниже, или к уровню, который ниже или равен эталонному значению (например, эталонному значению, которое описано в настоящей публикации).

В используемом в настоящем описании смысле термин «нормализация» уровней ALA или PBG (или «нормальный» или «нормализованный» уровень) относится к уровню (например, уровню в моче и/или в плазме) либо ALA, либо PBG, либо обоих, который находится в ожидаемом диапазоне для здорового индивидуума, для индивидуума, у которого нет симптомов (например, индивидуума, который не испытывает боли и/или не страдает от нейропатии), или для индивидуума, который не имеет мутации, ассоциированной с порфирией. Например, в некоторых вариантах нормализованный уровень находится в пределах двух стандартных отклонений от нормального среднего значения. В некоторых вариантах нормализованный уровень находится в пределах нормального эталона, например, в 95% доверительном интервале для соответствующего контрольного образца, например, образца от здоровых индивидуумов или индивидуумов, которые не несут генной мутации, ассоциированной с порфирией. В некоторых вариантах уровень ALA и/или PBG у субъекта (например, уровень ALA и/или PBG в моче и/или плазме) контролируют с определенными интервалами, и дополнительную дозу и-РНК-средства вводят в том случае, когда уровень возрастает выше эталонного значения.

Введение и-РНК может снижать уровни мРНК или белка ALAS1, например, в клетке, ткани, крови, моче или другом отделе организма пациента, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 15%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 25%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80% или, по меньшей мере, на 90% или больше. Введение и-РНК может снижать уровни продуктов, ассоциированных с экспрессией гена ALAS1, например, уровни одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, уровень of ALA и/или PBG). Введение и-РНК-средства также может ингибировать или предотвращать повышающую регуляцию уровней мРНК или белка ALAS1 во время острого приступа AIP.

Перед введением полной дозы и-РНК пациентам можно вводить меньшую дозу, такую как 5% инфузионной дозы, и контролировать неблагоприятные эффекты, такие как аллергическая реакция или повышенные уровни липидов или давления крови. В другом примере можно контролировать нежелательные эффекты у пациента.

Способы модулирования экспрессии гена ALAS1

В еще одном аспекте изобретение относится к способу модулирования (например, ингибирования или активации) экспрессии гена ALAS1, например, в клетке или в организме субъекта. В некоторых вариантах клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. В некоторых вариантах клеткой является эритроидная клетка или гепатоцит. В некоторых вариантах клетка находится в организме субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек). В некоторых вариантах субъект (например, человек) подвергается риску или у него диагностировано заболевание, связанное с экспрессией ALAS1, которое описано выше.

В одном варианте способ включает в себя осуществление контакта клетки с и-РНК, которая описана в настоящей публикации, в количестве, эффективном для снижения экспрессии гена ALAS1 в клетке. «Осуществление контакта» в используемом в настоящем описании смысле включает непосредственный контакт клетки, а также опосредованный контакт клетки. Например, клетка в организме субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть подвергнута контакту в том случае, когда субъекту вводят (например, внутривенно или подкожно) композицию, содержащую и-РНК.

Экспрессию гена ALAS1 можно оценить на основе уровня экспрессии мРНК ALAS1, белка ALAS1 или уровня параметра, функционально связанного с уровнем экспрессии гена ALAS1 (например, уровня порфирина или частоты или тяжести симптома, связанного с порфирией). В некоторых вариантах экспрессию ALAS1 ингибируют, по меньшей мере, на 5%, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 15%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 25%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90% или, по меньшей мере, на 95%. В некоторых вариантах и-РНК имеет IC50 в диапазоне 0,001-0,01 нМ, 0,001-0,10 нМ, 0,001-1,0 нМ, 0,001-10 нМ, 0,01-0,05 нМ, 0,01-0,50 нМ, 0,02-0,60 нМ, 0,01-1,0 нМ, 0,01-1,5 нМ, 0,01-10 нМ. Значение IC50 может быть нормализовано по сравнению с соответствующим контрольным значением, например, IC50 и-РНК, не нацеленной на данную мишень.

В некоторых вариантах способ включает в себя введение в клетку и-РНК, которая описана в настоящей публикации, и поддерживание клетки в течение периода времени, достаточного для получения распада транскрипта мРНК гена ALAS1, и тем самым, ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке.

В одном варианте способ включает в себя введение композиции, описанной в настоящей публикации, например, композиции, содержащей и-РНК, мишенью которой является ALAS1, млекопитающему так, чтобы экспрессия гена-мишени ALAS1 снизилась, например, на длительный период времени, например, по меньшей мере, на два, три, четыре дня или больше, например, одну неделю, две недели, три недели или четыре недели или дольше. В некоторых вариантах снижение экспрессии ALAS1 выявляют в пределах 1 часа, 2 часов, 4 часов, 8 часов, 12 часов или 24 часов после первого введения.

В другом варианте способ включает в себя введение композиции, которая описана в настоящей публикации, млекопитающему, так что экспрессия гена-мишени ALAS1 увеличивается, например, по меньшей мере, на 10% по сравнению с животным, не подвергаемым лечению. В некоторых вариантах активация ALAS1 происходит в течение длительного периода, например, по меньшей мере, два, три, четыре дня или больше, например, одну неделю, две недели, три недели, четыре недели или больше. Не имея намерения быть связанными с какой-либо теорией, полагают, что и-РНК может активировать экспрессию ALAS1 за счет стабилизации транскрипта мРНК ALAS1, взаимодействия с промотором в геноме и/или ингибирования ингибитора экспрессии ALAS1.

и-РНК, применимые в способах и композициях, охарактеризованных в изобретении, специфично целенаправленно действуют на РНК (первичную или процессированную) гена ALAS1. Композиции и способы ингибирования экспрессии гена ALAS1 с использованием и-РНК могут быть получены и осуществлены в соответствии с описанием, приведенным в настоящей публикации.

В одном варианте способ включает в себя введение композиции, содержащей и-РНК, при этом и-РНК содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна, по меньшей мере, части РНК-транскрипта гена ALAS1 млекопитающего, подвергаемого лечению. В том случае, когда организмом, подвергаемым лечению, является млекопитающее, такое как человек, композицию можно вводить любыми способами, известными в данной области, включая без ограничения пероральный, внутрибрюшинный или парентеральный пути, включая внутричерепное (например, внутрижелудочковое, интрапаренхимальное и интратекальное), внутривенное, внутримышечное, подкожное, трансдермальное введение, введение через дыхательные пути (аэрозольное), назальное, ректальное и местное (включая буккальное и подъязычное) введение.

В некоторых вариантах композиции вводят путем внутривенной инфузии или инъекции. В некоторых таких вариантах композиции содержат приготовленную в липидном препарате ми-РНК (например, LNP-препарат, такой как LNP11-препарат) для внутривенной инфузии. В конкретных вариантах такие композиции можно использовать для лечения острых приступов порфирии и/или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).

В других вариантах композиции вводят подкожно. В некоторых таких вариантах композиции содержат и-РНК, конъюгированную с GalNAc-лигандом. В конкретных вариантах такие композиции можно использовать для лечения острых приступов порфирии или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).

Способы снижения уровня порфирина или предшественника порфирина

В другом аспекте изобретение относится к способу снижения уровня порфирина или предшественника порфирина, например, в клетке или в организме субъекта.

В некоторых вариантах клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. В некоторых вариантах клеткой является эритроидная клетка или гепатоцит. В некоторых вариантах клетка представляет собой гепатоцит. В некоторых вариантах клетка находится в организме субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек).

В некоторых вариантах субъект (например, человек) подвергается риску или у него диагностирована порфирия, которая описана в настоящей публикации. В некоторых вариантах способ является эффективным для лечения порфирии, которая описана в настоящей публикации (например, благодаря ослаблению одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижению частоты приступов, ассоциированных с порфирией, уменьшению вероятности того, что приступ одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет происходить после воздействия провоцирующего условия или снижению риска развития состояний ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоклеточного рака). В одном варианте способ включает в себя осуществление контакта клетки с РНК-и, которая описана в настоящей публикации, в количестве, достаточном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в данной клетке или в другой связанной клетке или группе клеток или в организме субъекта. «Осуществление контакта» в используемом в настоящем описании смысле относится к непосредственному контакту клетки, а также опосредованному контакту клетки. Например, клетка в организме субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть подвергнута контакту в том случае, когда субъекту вводят (например, внутривенно или подкожно) композицию, содержащую и-РНК. «Другая связанная клетка или группа клеток» в используемом в настоящем описании смысле включает любую клетку или группу клеток, в которых уровень порфирина или предшественника порфирина снижается в результате контакта. Например, клетка может быть частью ткани, присутствующей в организме субъекта (например, клетка печени, присутствующая в организме субъекта), и контактирование клетки в организме субъекта (например, контактирование одной или нескольких клеток печени, присутствующих в организме субъекта) с РНК-и может приводить к снижению уровня порфирина или предшественник порфирина в другой связанной клетке или группе клеток (например, в нервных клетках субъекта) или в ткани или жидкости в организме субъекта (например, в моче, крови, плазме или спинномозговой жидкости субъекта).

В некоторых вариантах порфирин или предшественник порфирина выбран из группы, состоящей из δ-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфопилиногена (PBG), гидроксиметилбилана (HMB), уропорфириногена III, копропорфириногена III, протопорфириногена IX и протопорфирина IX. В некоторых вариантах предшественником порфирина является ALA. В некоторых вариантах предшественником порфирина является PBG. В некоторых вариантах способ снижает уровень ALA и PBG. Уровень порфирина или предшественника порфирина можно измерить как описано в настоящей публикации и как известно в данной области.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевает специалист в той области, к которой относится изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании и-РНК и способов, охарактеризованных в изобретении, могут быть использованы способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящей публикации, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты и другие ссылки, приведенные в настоящем описании, включены в виде ссылки в полном объеме. В случае конфликта настоящее описание, включая определение, будет проверено. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Синтез ми-РНК

Источник реагентов

В том случае, когда источник реагента специально не указан в настоящем описании, такой реагент может быть получен от любого поставщика реагентов для молекулярной биологии в соответствии со стандартом качества/чистоты для применения в молекулярной биологии.

Синтез олигонуклеотидов.

Все олигонуклеотиды синтезировали на синтезаторе AKTAoligopilot. Для синтеза олигонуклеотидов использовали твердую подложку из стекла с контролируемым размером пор (dT-CPG, 500A, Prime Synthesis) и РНК-фосфорамидиты со стандартными защитными группами, 5'-O-диметокситритил-N6-бензоил-2'-трет- бутилдиметилсилиладенозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-O-диметокситритил-N4-ацетил-2'-трет-бутилдиметилсилилцитидин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-O-диметокситритил-N2-изобутирил-2'-трет-бутилдиметилсилилгуанозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-O-диметокситритил-2'-трет- бутилдиметилсилилуридин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит (Pierce Nucleic Acids Technologies). 2'-F-фосфорамидиты, 5'-O-диметокситритил-N4-ацетил-2'-фторцитидин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-O-диметокситритил-2'-фторуридин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит приобретали из (Promega). Все фосфорамидиты использовали в концентрации 0,2 М в ацетонитриле (CH3CN), за исключением гуанозина, который использовали в концентрации 0,2 М в 10% ТГФ/ANC (об./об.). Использовали время связывания/рециклинга, равное 16 минутам. Активатором был 5-этилтиотетразол (0,75 М, American International Chemicals); для PO-окисления использовали йод/воду/пиридин, и для PS-окисления использовали PADS (2%) в 2,6-лутидине/ACN (1:1 об./об.).

3'-конъюгированные с лигандом нити синтезировали, используя твердую подложку, содержащую соответствующий лиганд. Например, введение холестериновой единицы в последовательность осуществляли из гидроксипролинолхолестеринфосфорамидита. Холестерин связывали с транс-4-гидроксипролинолом 6-аминогексаноатной связью, получая остаток гидроксипролинолхолестерина. и-РНК, меченые на 5'-конце с использованием Cy-3 и Cy-5.5 (флуорофор), которые были синтезированы из соответствующего фосфорамидита Quasar-570 (Cy-3), приобретали из Biosearch Technologies. Конъюгацию лигандов с 5'-концом и/или внутренним положением осуществляли, используя соответствующим образом защищенный строительный блок лиганд-фосфорамидит. Осуществляли длительное 15-минутное связывание 0,1 М раствора фосфорамидита в безводном CH3CN в присутствии активатора 5-(этилтио)-1H-тетразола со связанным с твердой подложкой олигонуклеотидом. Окисление межнуклеотидного фосфита до фосфата осуществляли, используя стандартный раствор йод-вода, как сообщается в публикации (1), или путем обработки смесью трет-бутилгидропероксид/ацетонитрил/вода (10:87:3) c 10-минутным периодом ожидания окисления конъюгированного олигонуклеотида. Фосфоротиоат вводили посредством окисления фосфита в фосфоротиоат с использованием реагента для переноса атома серы, такого как DDTT (приобретенного из AM Chemicals), PADS и/или реагента Бокажа. Холестеринфосфорамидит синтезировали самостоятельно и использовали в концентрации 0,1 М в дихлорметане. Время связывания холестеринфосфорамидита составляло 16 минут.

Удаление защиты I (удаление защиты нуклеотидного основания)

После завершения синтеза подложку переносили в стеклянный флакон объемом 100 мл (VWR). Олигонуклеотид отщепляли от подложки с одновременным удалением защиты основания и фосфатных групп с использованием 80 мл смеси этанольного раствора аммиака [аммиак:этанол (3:1)] в течение 6,5 часов при 55°C. Флакон недолго охлаждали на льду и затем этанольный раствор аммиака фильтровали в новый флакон объемом 250 мл. CPG промывали 2 частями по 40 мл смеси этанол/вода (1:1 об./об.). Затем объем смеси уменьшали до ~ 30 мл в роторном испарителе. Затем смесь замораживали, используя сухой лед, и сушили в вакууме на Speed vac.

Удаление защиты II (удаление группы 2'-TBDMS)

Высушенный остаток ресуспендировали в 26 мл триэтиламина, тригидрофторида триэтиламина (TEA⋅3HF) или пиридина-HF и ДМСО (3:4:6) и нагревали при 60°C в течение 90 минут, чтобы удалить группы трет-бутилдиметилсилила (TBDMS) в 2'-положении. Затем реакцию гасили, используя 50 мл 20 мМ ацетата натрия, и pH доводили до 6,5. Олигонуклеотид хранили в морозильной камере вплоть до очистки.

Анализ

Олигонуклеотиды анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) перед очисткой, и выбор буфера и колонки при этом зависит от природы последовательности и/или конъюгируемого лиганда.

Очистка с использованием ВЭЖХ

Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды очищали обращено-фазовой препаративной ВЭЖХ. Неконъюгированные олигонуклеотиды очищали анионообменной ВЭЖХ на колонке с гелем TSK, упакованной своими силами. Буферы представляли собой 20 мМ фосфат натрия (pH 8,5) в 10% CH3CN (буфер A) и 20 мМ фосфат натрия (pH 8,5) в 10% CH3CN, 1 М NaBr (буфер B). Фракции, содержащие полноразмерные олигонуклеотиды, объединяли, обессоливали и лиофилизировали. Примерно 0,15 OD обессоленных олигонуклеотидов разбавляли в воде до 150 мкл и затем пипеткой переносили в специальные флаконы для КГЭ и ЖХ-МС-анализа. Затем соединения анализировали, используя ЖХ-ESMS и КГЭ.

Получение ми-РНК

Для обычного получения ми-РНК эквимолярные количества смысловой и антисмысловой нитей нагревали в 1 x PBS при 95°C в течение 5 минут и медленно охлаждали до комнатной температуры. Целостность дуплекса подтверждали в ВЭЖХ-анализе.

Последовательности нуклеиновых кислот представлены ниже с использованием стандартной номенклатуры и специальных сокращений, указанных в таблице 1.

Таблица 1

Сокращенные обозначения нуклеотидных мономеров, используемые для представления последовательностей нуклеиновых кислот. Будет понятно, что такие мономеры, в том случае, когда они присутствуют в олигонуклеотиде, связаны друг с другом 5'-3'-фосфодиэфирными связями.

Сокращение Нуклеотид(ды) A аденозин-3'-фосфат Ab бета-L-аденозин- 3'-фосфат Abs бета-L-аденозин- 3'-фосфоротиоат Af 2'-фтораденозин-3'-фосфат Afs 2'-фтораденозин-3'-фосфоротиоат As аденозин-3'-фосфоротиоат C цитидин-3'-фосфат Cb бета-L-цитидин-3'-фосфат Cbs бета-L-цитидин-3'-фосфоротиоат Cf 2'-фторцитидин-3'-фосфат Cfs 2'-фторцитидин-3'-фосфоротиоат (Chd) 2'-O-гексадецилцитидин-3'-фосфат (Chds) 2'-O-гексадецилцитидин-3'-фосфоротиоат Cs цитидин-3'-фосфоротиоат G гуанозин-3'-фосфат Gb бета-L-гуанозин-3'-фосфат Gbs бета-L-гуанозин-3'-фосфоротиоат Gf 2'-фторгуанозин-3'-фосфат Gfs 2'-фторгуанозин-3'-фосфоротиоат Gs гуанозин-3'-фософротиоат T 5'-метилуридин-3'-фосфат Tb бета-L-тимидин-3'-фосфат Tbs бета-L-тимидин-3'-фосфоротиоат

Tf 2'-фтор-5-метилуридин-3'-фосфат Tbs 2'-фтор-5-метилуридин-3'-фосфоротиоат Ts 5-метилуридин-3'-фосфоротиоат U уридин-3'-фосфат Ub бета-L-уридин-3'-фосфат Ubs бета-L-уридин-3'-фосфоротиоат Uf 2'-фторуридин-3'-фосфат Ufs 2'-фторуридин-3'-фосфоротиоат (Uhd) 2'-O-гексадецилуридин-3'-фосфат (Uhds) 2′-O-гексадецилуридин-3'-фосфоротиоат Us уридин-3'-фосфоротиоат N любой нуклеотид ( G, A, C, T или U) a 2'-O-метиладенозин-3'-фосфат as 2'-O-метиладенозин-3'-фосфоротиоат c 2'-O-метилцитидин-3'-фосфат cs 2'-O-метилцитидин-3'-фосфоротиоат g 2'-O-метилгуанозин-3'-фосфат gs 2'-O-метилгуанозин-3'-фосфоротиоат t 2'-O-метил-5-метилуридин-3'-фосфат ts 2'-O-метил-5-метилуридин-3'-фосфоротиоат u 2'-O-метилуридин-3'-фосфат us 2'-O-метилуридин-3'-фосфоротиоат dA 2'-дезоксиаденозин-3'-фосфат dAs 2'-дезоксиаденозин-3'-фосфоротиоат dC 2'-дезоксицитидин-3'-фосфат dCs 2'-дезоксицитидин-3'-фосфоротиоат dG 2'-дезоксигуанозин-3'-фосфат dGs 2'-дезоксигуанозин-3'-фосфоротиоат dT 2'-дезокситимидин dTs 2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат dU 2'-дезоксиуридин s фосфоротиоатная связь L961 N-[трис(GalNAc-алкил)амидодеканоил)]-4-гидроксипролинол Hyp-(GalNAc-алкил)3 (Aeo) 2'-O-метоксиэтиладенозин-3'-фосфат (Aeos) 2'-O-метоксиэтиладенозин-3'-фосфоротиоат

(Geo) 2'-O-метоксиэтилгуанозин-3'-фосфат (Geos) 2'-O-метоксиэтилгуанозин-3'-фосфоротиоат (Teo) 2'-O-метоксиэтил-5-метилуридин-3'-фосфат (Teos) 2'-O-метоксиэтил-5-метилуридин-3'-фосфоротиоат (m5Ceo) 2'-O-метоксиэтил-5-метилцитидин-3'-фосфат (m5Ceos) 2'-O-метоксиэтил-5-метилцитидин-3'-фосфоротиоат 1 L96 имеет следующую химическую структуру:

Пример 2. Конструирование и синтез ми-РНК ALAS1

Экспериментальные способы

Биоинформатика

Транскрипты

Осуществляли конструирование ми-РНК, чтобы идентифицировать ми-РНК, мишенью которых являются транскрипты ALAS1 человека, макака-резус (Macaca mulatto), мыши и крысы, описанные в базе данных о генах NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). Для конструирования использовали следующие транскрипты из коллекции NCBI RefSeq: человек - NM_000688.4 (См. фиг. 3), NM_199166,1; резус - XM_001090440.2, XM_001090675.2; мышь - NM_020559.2; крыса - NM_024484.2. Вследствие высокой дивергенции последовательностей высших приматов/грызунов дуплексы ми-РНК конструировали несколькими отдельными партиями, включая без ограничения партии, содержащие дуплексы, соответствующие только транскриптам человека и макака-резус; только транскриптам человека, макака-резус, мыши и крысы; и только транскриптам мыши и крысы. Было сконструировано большинство дуплексов ми-РНК, которые имели 100% идентичность с указанным транскриптом человека и транскриптами других видов, предполагаемыми в каждой конструируемой партии (выше). В некоторых случаях (См. таблицу 8) были допустимы ошибочные спаривания между дуплексом и мРНК-мишенью в первом антисмысловом (последнем смысловом) положении, когда комплементарной парой оснований антисмысловая нить:мРНК-мишень была пара GC или CG. В указанных случаях конструировали дуплексы с парами UA или AU в паре первого антисмыслового:последнего смыслового положения. Таким образом, дуплексы сохраняли комплементарность, но имели несовпадения по отношению к мишени (U:C, U:G, A:C или A:G). Сконструировали восемнадцать таких дуплексов «с подстановкой UA» в виде части набора дуплексов человек/макак-резус/мышь/крыса (См. дуплексы в таблице 8 с пометкой «C19U», «G19U», «C19A» или «G19A» в колонке «Положение»).

Конструирование, прогноз специфичности и эффективности ми-РНК

Предположительную специфичность всех возможных 19-меров прогнозировали на основании каждой последовательности. Затем отбирали такие 19-мерные последовательности-кандидаты, в которых не было повторов длиннее 7 нуклеотидов. Такие выбранные для исследования 1510 ми-РНК человека/макака-резус, 114 ми-РНК человека/макака-резус/мыши/крысы и 717 ми-РНК мыши/крысы использовали в широких поисках против соответствующих транскриптомов (определяемых как набор данных NM_ и XM_ в наборах последовательностей NCBI Refseq человека, макака-резус, собаки, мыши или крысы) с помощью алгоритма полного «грубого перебора» вариантов, воплощенного в «BruteForce.py» с использованием скрипта Ppython. Скрипт подробно анализирует выравнивания олигомерных транскриптов, чтобы получить оценку на основании положения и количества несовпадений между ми-РНК и любым возможным транскриптом «вне мишени». Оценка вне мишени взвешивается, чтобы подчеркнуть отличия в области «затравки» ми-РНК, в положениях 2-9 от 5'-конца молекулы. Для каждой пары олиго-транскриптов, полученной в результате поиска с помощью «грубого перебора» вариантов, была дана оценка несовпадений посредством суммирования оценок отдельных несовпадений; несовпадения в положении 2-9 оценивали как 2,8, несовпадения положениях сайта расщепления 10-11 оценивали как 1,2, и несовпадения в области 12-19 оценивали как 1,0. Дополнительный прогноз вне мишени осуществляли путем сравнения частоты гептамеров и октомеров, полученных из 3 отдельных происходящих из затравки гексамеров каждого олигонуклеотида. Гексамеры из положений 2-7 относительно 5'-старта использовали для создания 2 гептамеров и одного октомера. Авторы создали «гептамер1», добавляя 3'-A к гексамеру; авторы создали гептамер2, добавляя 5'-A к гексамеру; авторы создали октомер, добавляя A как к 5'-, так и к 3'-концу гексамера. Предварительно вычисляли частоту октомеров и гептамеров в 3'UTRome человека, макака-резус, мыши или крысы (определяемым, как подпоследовательность транскриптома из базы данных NCBI Refseq, где конец кодирующей области «CDS» ясно определен). Частоту октомера нормализовали по отношению к частоте гептамеров, используя медианное значение из диапазоне частот октомера. Затем вычисляли «mirSeedScore», определяя сумму ((3 X нормализованная оценка октомера) + (2 X оценка гептамера2) + (1 X оценка гептамера1)).

Обе нити ми-РНК относили к определенной категории специфичности в соответствии с рассчитанными оценками в баллах: оценка выше 3 расценивается как высоко специфичная, равная 3 как специфичная и от 2,2 до 2,8 как умеренно специфичная. Авторы осуществляли сортировку по специфичности антисмысловой нити. Затем авторы отбирали дуплексы, в антисмысловых олигонуклеотидах, в которых отсутствовали GC в первом положении, отсутствовал G в обоих положениях 13 и 14, и которые имели 3 или больше Us или As в области затравки (характеристики дуплексов с высокой прогнозируемой эффективностью).

GalNac-конъюгированные дуплексы-кандидаты длиной 21 и 23 нуклеотида в смысловой и антисмысловой нитях, соответственно, конструировали, удлиняя антисмысловые 19-меры на 4 дополнительных нуклеотида в 3'-направлении (сохраняя точную комплементарность с транскриптом-мишенью). Смысловую нить определяли как обратный комплемент первых 21 нуклеотидов антисмыслового 23-мера. Отбирали дуплексы, которые сохраняли превосходные совпадения со всеми транскриптами выбранных видов на протяжении всех 23 нуклеотидов.

Отбор последовательностей ми-РНК

В общей сложности 90 смысловых и 90 антисмысловых, полученных для человека/макака-резус, 40 смысловых и 40 антисмысловых, полученных для человека/макака-резус/мыши/мыши/крысы, и 40 смысловых и 40 антисмысловых, полученных для мыши/крысы, 19-мерных олигомеров ми-РНК были синтезированы и сформированы в виде дуплексов. Всего синтезировали 45 смысловых и 45 антисмысловых полученных для человека/макака-резус 21/23-мерных олигонуклеотидов для получения 45 GalNac-конъюгированных дуплексов. Последовательности смысловых и антисмысловых нитей модифицированных дуплексов показаны в таблице 2, и последовательности смысловых и антисмысловых нитей немодифицированных дуплексов показаны в таблице 3.

Синтез последовательностей ALAS1

Последовательности ALAS1 синтезировали на синтезаторе MerMade 192 в масштабе либо 1, либо 0,2 мкмоль. Отдельные нити получали с 2'-O-метил-модификациями для скрининга in vitro с использованием реагентов для трансфекции. 3'-GalNAc-конъюгаты получали с использованием последовательностей, содержащих 2'-F- и 2'-O-метил-модификации в смысловой нити в 21-23-мерных конструкциях для свободного захвата клетками. В случае всех 21-мерных последовательностей в списке, применяли химию «endolight» («с ограниченной модификацией»), которая подробно описана ниже.

- Все пиримидины (цитозин и уридин) в смысловой нити содержали 2'-O-метил-основания (2'-O-метил-C и 2'-O-метил-U).

- В антисмысловой нити пиримидины, лежащие рядом (по направлению к 5'-положению) с рибо-A-нуклеозидом заменяли соответствующими им 2-O-метил-нуклеозидами.

- Вводили удлинение на два основания dTsdT на 3'-конце обеих смысловой и антисмысловой последовательностей.

- Файл с последовательностями преобразовывали в текстовый файл, чтобы сделать его совместимым в случае загрузки в программное обеспечение для синтеза MerMade 192.

В случае GalNAc-конъюгированных смысловых нитей и комплементарных антисмысловых последовательностей 2'F- и другие модифицированные нуклеозиды вводили в сочетании с 2'O-метил-рибонуклеозидами. Синтез осуществляли на GalNAc-модифицированной подложке на CPG в случае смысловой нити и на CPG, модифицированном универсальным носителем, в случае антисмысловой последовательности.

Синтез, отщепление и удаление защиты:

Для синтеза последовательностей ALAS1 использовали синтез олигонуклеотидов на твердой подложке с применением химии фосфорамидитов. Для 21-мерных последовательностей с ограниченной модификацией использовали дезокситимидин-CPG в качестве твердой подложки, тогда как в случае GalNAc-конъюгатов использовали GalNAc-твердую подложку для смысловой нити и универсальную CPG-подложку для антисмысловой нити.

Синтез указанных выше последовательностей осуществляли в масштабе либо 1, либо 0,2 мкмоль в 96-луночных планшетах. Растворы амидитов готовили в концентрации 0,1 М и использовали этилтиотетразол (0,6 М в ацетонитриле) в качестве активатора.

Синтезированные последовательности отщепляли и осуществляли удаление защиты в 96-луночных планшетах, используя метиламин на первой стадии и фторидный реагент на второй стадии. В случае последовательностей, содержащих GalNAc и 2'F-нуклеозиды, условия удаления защиты модифицировали. Последовательности после отщепления и удаления защиты преципитировали, используя смесь ацетон:этанол (80:20) и осадок ресуспендировали в 0,2 М натрий-ацетатном буфере. Образцы каждой последовательности анализировали, используя ЖХ-МС, чтобы подтвердить идентичность, используя УФ для количественной оценки, отобранный набор образцов анализировали, используя IEX-хроматографию, чтобы определить чистоту.

Очистка и обессоливание:

Последовательности ALAS1 преципитировали и очищали с помощью системы AKTA Purifier, используя колонку с сефадексом. Последовательности ALAS1 прогоняли при комнатной температуре. Инъекцию и сбор образцом осуществляли в 96-луночных планшетах (с глубиной лунок 1,8 мл). В элюенте собирали один пик, соответствующий полноразмерной последовательности. Обессоленные последовательности ALAS1 анализировали в отношении концентрации (используя УФ-измерения при A260) и чистоты (используя ионообменную ВЭЖХ). Затем отдельные комплементарные нити объединяли в стехиометрическом соотношении 1:1 с образованием дуплексов ми-РНК.

Таблица 2
Отдельные модифицированные нити ALAS1 человека и последовательности дуплексов
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Положение в транскрипте NM_ 000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность
(5'-3')
Антисмысловая последовательность (5'-3')
2 3 522-540 AD-55078.2 cuccGGccAGuGAGAAAGAdTsdT UCUUUCUcACUGGCCGGAGdTsdT 4 5 669-687 AD-55084.2 uGGcAGcAcAGAuGAAucAdTsdT UGAUUcAUCUGUGCUGCcAdTsdT 6 7 790-808 AD-55090.2 cAGuGuGGuuAGuGuGAAAdTsdT UUUcAcACuAACcAcACUGdTsdT 8 9 853-871 AD-55096.2 cAucAuGcAAAAGcAAAGAdTsdT UCUUUGCUUUUGcAUGAUGdTsdT 10 11 876-894 AD-55102.2 AAAGAGuGucucAucuucudTsdT AGAAGAUGAGAcACUCUUUdTsdT 12 13 877-895 AD-55106.2 AAGAGuGucucAucuucuudTsdT AAGAAGAUGAGAcACUCUUdTsdT 14 15 914-932 AD-55111.2 ucuGuuuccAcuuuucAGudTsdT ACUGAAAAGUGGAAAcAGAdTsdT 16 17 923-941 AD-55073.2 AcuuuucAGuAuGAucGuudTsdT AACGAUcAuACUGAAAAGUdTsdT 18 19 926-944 AD-55079.2 uuucAGuAuGAucGuuucudTsdT AGAAACGAUcAuACUGAAAdTsdT 20 21 927-945 AD-55085.2 uucAGuAuGAucGuuucuudTsdT AAGAAACGAUcAuACUGAAdTsdT 22 23 928-946 AD-55091.2 ucAGuAuGAucGuuucuuudTsdT AAAGAAACGAUcAuACUGAdTsdT 24 25 932-950 AD-55097.2 uAuGAucGuuucuuuGAGAdTsdT UCUcAAAGAAACGAUcAuAdTsdT 26 27 973-991 AD-55103.2 uGAccAcAccuAucGAGuudTsdT AACUCGAuAGGUGUGGUcAdTsdT 28 29 975-993 AD-55107.2 AccAcAccuAucGAGuuuudTsdT AAAACUCGAuAGGUGUGGUdTsdT 30 31 1029-1047 AD-55112.2 uGGcAGAuGAcuAuucAGAdTsdT UCUGAAuAGUcAUCUGCcAdTsdT 32 33 1077-1095 AD-55074.2 ucuGGuGcAGuAAuGAcuAdTsdT uAGUcAUuACUGcACcAGAdTsdT 34 35 1124-1142 AD-55080.2 uGuGGGGcAGuuAuGGAcAdTsdT UGUCcAuAACUGCCCcAcAdTsdT 36 37 1137-1155 AD-55086.2 uGGAcAcuuuGAAAcAAcAdTsdT UGUUGUUUcAAAGUGUCcAdTsdT 38 39 1182-1200 AD-55098.2 AuAuuucuGGAAcuAGuAAdTsdT UuACuAGUUCcAGAAAuAUdTsdT 40 41 1184-1202 AD-55104.2 AuuucuGGAAcuAGuAAAudTsdT AUUuACuAGUUCcAGAAAUdTsdT 42 43 1185-1203 AD-55108.2 uuucuGGAAcuAGuAAAuudTsdT AAUUuACuAGUUCcAGAAAdTsdT 44 45 1188-1206 AD-55113.2 cuGGAAcuAGuAAAuuccAdTsdT UGGAAUUuACuAGUUCcAGdTsdT 46 47 1325-1343 AD-55075.2 uGuGAGAuuuAcucuGAuudTsdT AAUcAGAGuAAAUCUcAcAdTsdT 48 49 1364-1382 AD-55081.2 AuccAAGGGAuucGAAAcAdTsdT UGUUUCGAAUCCCUUGGAUdTsdT 50 51 1382-1400 AD-55087.2 AGccGAGuGccAAAGuAcAdTsdT UGuACUUUGGcACUCGGCUdTsdT 52 53 1478-1496 AD-55093.2 uuuGAAAcuGuccAuucAAdTsdT UUGAAUGGAcAGUUUcAAAdTsdT 54 55 1531-1549 AD-55099.2 uGAuGuGGcccAuGAGuuudTsdT AAACUcAUGGGCcAcAUcAdTsdT 56 57 1631-1649 AD-53573.3 GucAuGccAAAAAuGGAcAdTsdT UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTsdT 58 59 1637-1655 AD-55109.2 ccAAAAAuGGAcAucAuuudTsdT AAAUGAUGUCcAUUUUUGGdTsdT 60 61 1706-1724 AD-55114.2 AcGAGuucucuGAuuGAcAdTsdT UGUcAAUcAGAGAACUCGUdTsdT 62 63 1962-1980 AD-55076.2 AAGucuGuGAuGAAcuAAudTsdT AUuAGUUcAUcAcAGACUUdTsdT 64 65 1967-1985 AD-55082.2 uGuGAuGAAcuAAuGAGcAdTsdT UGCUcAUuAGUUcAUcAcAdTsdT 66 67 1977-1995 AD-55088.2 uAAuGAGcAGAcAuAAcAudTsdT AUGUuAUGUCUGCUcAUuAdTsdT 68 69 2189-2207 AD-55094.2 uuuGAAGuGAuGAGuGAAAdTsdT UUUcACUcAUcACUUcAAAdTsdT 70 71 2227-2245 AD-55100.2 AGGcuuGAGcAAGuuGGuAdTsdT uACcAACUUGCUcAAGCCUdTsdT

72 73 2313-2331 AD-55105.2 ucuucAGAGuuGucuuuAudTsdT AuAAAGAcAACUCUGAAGAdTsdT 74 75 2317-2335 AD-55110.2 cAGAGuuGucuuuAuAuGudTsdT AcAuAuAAAGAcAACUCUGdTsdT 76 77 2319-2337 AD-55115.2 GAGuuGucuuuAuAuGuGAdTsdT UcAcAuAuAAAGAcAACUCdTsdT 78 79 2320-2338 AD-55077.2 AGuuGucuuuAuAuGuGAAdTsdT UUcAcAuAuAAAGAcAACUdTsdT 80 81 2344-2362 AD-55083.2 uuAuAuuAAAuuuuAAucudTsdT AGAUuAAAAUUuAAuAuAAdTsdT 82 83 2352-2370 AD-55089.2 AAuuuuAAucuAuAGuAAAdTsdT UUuACuAuAGAUuAAAAUUdTsdT 84 85 2353-2371 AD-55095.2 AuuuuAAucuAuAGuAAAAdTsdT UUUuACuAuAGAUuAAAAUdTsdT 86 87 2376-2394 AD-55101.2 AGuccuGGAAAuAAAuucudTsdT AGAAUUuAUUUCcAGGACUdTsdT 88 89 358-376 AD-53511.1 cuGcccAuucuuAucccGAdTsdT UCGGGAuAAGAAUGGGcAGdTsdT 90 91 789-807 AD-53512.1 ccAGuGuGGuuAGuGuGAAdTsdT UUcAcACuAACcAcACUGGdTsdT 92 93 1076-1094 AD-53513.1 GucuGGuGcAGuAAuGAcudTsdT AGUcAUuACUGcACcAGACdTsdT 94 95 1253-1271 AD-53514.1 GcAcucuuGuuuuccucGudTsdT ACGAGGAAAAcAAGAGUGCdTsdT 96 97 1544-1562 AD-53515.1 GAGuuuGGAGcAAucAccudTsdT AGGUGAUUGCUCcAAACUCdTsdT 98 99 2228-2246 AD-53516.1 GGcuuGAGcAAGuuGGuAudTsdT AuACcAACUUGCUcAAGCCdTsdT 100 101 404-422 AD-53517.1 GGcAAAucucuGuuGuucudTsdT AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsdT 102 103 404-422 AD-53517.1 GGcAAAucucuGuuGuucudTsdT AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsdT 104 105 866-884 AD-53518.1 cAAAGAccAGAAAGAGuGudTsdT AcACUCUUUCUGGUCUUUGdTsdT 106 107 1080-1098 AD-53519.1 GGuGcAGuAAuGAcuAccudTsdT AGGuAGUcAUuACUGcACCdTsdT 108 109 1258-1276 AD-53520.1 cuuGuuuuccucGuGcuuudTsdT AAAGcACGAGGAAAAcAAGdTsdT 110 111 1616-1634 AD-53521.1 GGGGAucGGGAuGGAGucAdTsdT UGACUCcAUCCCGAUCCCCdTsdT 112 113 2230-2248 AD-53522.1 cuuGAGcAAGuuGGuAucudTsdT AGAuACcAACUUGCUcAAGdTsdT 114 115 436-454 AD-53523.1 ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsdT AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTsdT 116 117 436-454 AD-53523.1 ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsdT AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTsdT 118 119 885-903 AD-53524.1 cucAucuucuucAAGAuAAdTsdT UuAUCUUGAAGAAGAUGAGdTsdT 120 121 1127-1145 AD-53525.1 GGGGcAGuuAuGGAcAcuudTsdT AAGUGUCcAuAACUGCCCCdTsdT 122 123 1315-1333 AD-53526.1 GAuGccAGGcuGuGAGAuudTsdT AAUCUcAcAGCCUGGcAUCdTsdT 124 125 1870-1888 AD-53527.1 GAGAcAGAuGcuAAuGGAudTsdT AUCcAUuAGcAUCUGUCUCdTsdT 126 127 2286-2304 AD-53528.1 ccccAGGccAuuAucAuAudTsdT AuAUGAuAAUGGCCUGGGGdTsdT 128 129 489-507 AD-53529.1 cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTsdT 130 131 489-507 AD-53529.1 cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTsdT 132 133 915-933 AD-53530.1 cuGuuuccAcuuuucAGuAdTsdT uACUGAAAAGUGGAAAcAGdTsdT 134 135 1138-1156 AD-53531.1 GGAcAcuuuGAAAcAAcAudTsdT AUGUUGUUUcAAAGUGUCCdTsdT 136 137 1324-1342 AD-53532.1 cuGuGAGAuuuAcucuGAudTsdT AUcAGAGuAAAUCUcAcAGdTsdT 138 139 1927-1945 AD-53533.1 cccuGuGcGGGuuGcAGAudTsdT AUCUGcAACCCGcAcAGGGdTsdT 140 141 2312-2330 AD-53534.1 GucuucAGAGuuGucuuuAdTsdT uAAAGAcAACUCUGAAGACdTsdT 142 143 646-664 AD-53535.1 cAcuGcAAGcAAAuGcccudTsdT AGGGcAUUUGCUUGcAGUGdTsdT 144 145 922-940 AD-53536.1 cAcuuuucAGuAuGAucGudTsdT ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTsdT 146 147 1163-1181 AD-53537.1 GGGGcAGGuGGuAcuAGAAdTsdT UUCuAGuACcACCUGCCCCdTsdT 148 149 1347-1365 AD-53538.1 GGAAccAuGccuccAuGAudTsdT AUcAUGGAGGcAUGGUUCCdTsdT 150 151 1964-1982 AD-53539.1 GucuGuGAuGAAcuAAuGAdTsdT UcAUuAGUUcAUcAcAGACdTsdT 152 153 2321-2339 AD-53540.1 GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsdT AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsdT 154 155 671-689 AD-53541.1 GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsdT UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdTsdT 156 157 924-942 AD-53542.1 cuuuucAGuAuGAucGuuudTsdT AAACGAUcAuACUGAAAAGdTsdT 158 159 1164-1182 AD-53543.1 GGGcAGGuGGuAcuAGAAAdTsdT UUUCuAGuACcACCUGCCCdTsdT 160 161 1460-1478 AD-53544.1 GuccccAAGAuuGuGGcAudTsdT AUGCcAcAAUCUUGGGGACdTsdT 162 163 1976-1994 AD-53545.1 cuAAuGAGcAGAcAuAAcAdTsdT UGUuAUGUCUGCUcAUuAGdTsdT 164 165 786-804 AD-53546.1 GccccAGuGuGGuuAGuGudTsdT AcACuAACcAcACUGGGGCdTsdT 166 167 935-953 AD-53547.1 GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsdT UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTsdT 168 169 1165-1183 AD-53548.1 GGcAGGuGGuAcuAGAAAudTsdT AUUUCuAGuACcACCUGCCdTsdT 170 171 1530-1548 AD-53549.1 GuGAuGuGGcccAuGAGuudTsdT AACUcAUGGGCcAcAUcACdTsdT

172 173 2003-2021 AD-53550.1 cAAGcAAucAAuuAcccuAdTsdT uAGGGuAAUUGAUUGCUUGdTsdT 174 175 788-806 AD-53551.1 cccAGuGuGGuuAGuGuGAdTsdT UcAcACuAACcAcACUGGGdTsdT 176 177 974-992 AD-53552.1 GAccAcAccuAucGAGuuudTsdT AAACUCGAuAGGUGUGGUCdTsdT 178 179 1191-1209 AD-53553.1 GAAcuAGuAAAuuccAuGudTsdT AcAUGGAAUUuACuAGUUCdTsdT 180 181 1541-1559 AD-53554.1 cAuGAGuuuGGAGcAAucAdTsdT UGAUUGCUCcAAACUcAUGdTsdT 182 183 2075-2093 AD-53555.1 ccccAGAuGAuGAAcuAcudTsdT AGuAGUUcAUcAUCUGGGGdTsdT 184 185 360-378 AD-53561.1 GcccAuucuuAucccGAGudTsdT ACUCGGGAuAAGAAUGGGCdTsdT 186 187 1356-1374 AD-53567.1 ccuccAuGAuccAAGGGAudTsdT AUCCCUUGGAUcAUGGAGGdTsdT 188 189 1631-1649 AD-53573.1 GucAuGccAAAAAuGGAcAdTsdT UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTsdT 190 191 1634-1652 AD-53579.1 AuGccAAAAAuGGAcAucAdTsdT UGAUGUCcAUUUUUGGcAUdTsdT

Таблица 3
Отдельные немодифицированные нити ALAS1 человека и последовательности дуплексов
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Положение в транскрипте NM_ 000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') 192 193 522-540 AD-55078.2 CUCCGGCCAGUGAGAAAGA UCUUUCUCACUGGCCGGAG 194 195 669-687 AD-55084.2 UGGCAGCACAGAUGAAUCA UGAUUCAUCUGUGCUGCCA 196 197 790-808 AD-55090.2 CAGUGUGGUUAGUGUGAAA UUUCACACUAACCACACUG 198 199 853-871 AD-55096.2 CAUCAUGCAAAAGCAAAGA UCUUUGCUUUUGCAUGAUG 200 201 876-894 AD-55102.2 AAAGAGUGUCUCAUCUUCU AGAAGAUGAGACACUCUUU 202 203 877-895 AD-55106.2 AAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUU 204 205 914-932 AD-55111.2 UCUGUUUCCACUUUUCAGU ACUGAAAAGUGGAAACAGA 206 207 923-941 AD-55073.2 ACUUUUCAGUAUGAUCGUU AACGAUCAUACUGAAAAGU 208 209 926-944 AD-55079.2 UUUCAGUAUGAUCGUUUCU AGAAACGAUCAUACUGAAA 210 211 927-945 AD-55085.2 UUCAGUAUGAUCGUUUCUU AAGAAACGAUCAUACUGAA 212 213 928-946 AD-55091.2 UCAGUAUGAUCGUUUCUUU AAAGAAACGAUCAUACUGA 214 215 932-950 AD-55097.2 UAUGAUCGUUUCUUUGAGA UCUCAAAGAAACGAUCAUA 216 217 973-991 AD-55103.2 UGACCACACCUAUCGAGUU AACUCGAUAGGUGUGGUCA 218 219 975-993 AD-55107.2 ACCACACCUAUCGAGUUUU AAAACUCGAUAGGUGUGGU 220 221 1029-1047 AD-55112.2 UGGCAGAUGACUAUUCAGA UCUGAAUAGUCAUCUGCCA 222 223 1077-1095 AD-55074.2 UCUGGUGCAGUAAUGACUA UAGUCAUUACUGCACCAGA 224 225 1124-1142 AD-55080.2 UGUGGGGCAGUUAUGGACA UGUCCAUAACUGCCCCACA 226 227 1137-1155 AD-55086.2 UGGACACUUUGAAACAACA UGUUGUUUCAAAGUGUCCA 228 229 1182-1200 AD-55098.2 AUAUUUCUGGAACUAGUAA UUACUAGUUCCAGAAAUAU 230 231 1184-1202 AD-55104.2 AUUUCUGGAACUAGUAAAU AUUUACUAGUUCCAGAAAU 232 233 1185-1203 AD-55108.2 UUUCUGGAACUAGUAAAUU AAUUUACUAGUUCCAGAAA 234 235 1188-1206 AD-55113.2 CUGGAACUAGUAAAUUCCA UGGAAUUUACUAGUUCCAG 236 237 1325-1343 AD-55075.2 UGUGAGAUUUACUCUGAUU AAUCAGAGUAAAUCUCACA 238 239 1364-1382 AD-55081.2 AUCCAAGGGAUUCGAAACA UGUUUCGAAUCCCUUGGAU 240 241 1382-1400 AD-55087.2 AGCCGAGUGCCAAAGUACA UGUACUUUGGCACUCGGCU 242 243 1478-1496 AD-55093.2 UUUGAAACUGUCCAUUCAA UUGAAUGGACAGUUUCAAA 244 245 1531-1549 AD-55099.2 UGAUGUGGCCCAUGAGUUU AAACUCAUGGGCCACAUCA 246 247 1631-1649 AD-53573.3 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC 248 249 1637-1655 AD-55109.2 CCAAAAAUGGACAUCAUUU AAAUGAUGUCCAUUUUUGG 250 251 1706-1724 AD-55114.2 ACGAGUUCUCUGAUUGACA UGUCAAUCAGAGAACUCGU 252 253 1962-1980 AD-55076.2 AAGUCUGUGAUGAACUAAU AUUAGUUCAUCACAGACUU 254 255 1967-1985 AD-55082.2 UGUGAUGAACUAAUGAGCA UGCUCAUUAGUUCAUCACA

256 257 1977-1995 AD-55088.2 UAAUGAGCAGACAUAACAU AUGUUAUGUCUGCUCAUUA 258 259 2189-2207 AD-55094.2 UUUGAAGUGAUGAGUGAAA UUUCACUCAUCACUUCAAA 260 261 2227-2245 AD-55100.2 AGGCUUGAGCAAGUUGGUA UACCAACUUGCUCAAGCCU 262 263 2313-2331 AD-55105.2 UCUUCAGAGUUGUCUUUAU AUAAAGACAACUCUGAAGA 264 265 2317-2335 AD-55110.2 CAGAGUUGUCUUUAUAUGU ACAUAUAAAGACAACUCUG 266 267 2319-2337 AD-55115.2 GAGUUGUCUUUAUAUGUGA UCACAUAUAAAGACAACUC 268 269 2320-2338 AD-55077.2 AGUUGUCUUUAUAUGUGAA UUCACAUAUAAAGACAACU 270 271 2344-2362 AD-55083.2 UUAUAUUAAAUUUUAAUCU AGAUUAAAAUUUAAUAUAA 272 273 2352-2370 AD-55089.2 AAUUUUAAUCUAUAGUAAA UUUACUAUAGAUUAAAAUU 274 275 2353-2371 AD-55095.2 AUUUUAAUCUAUAGUAAAA UUUUACUAUAGAUUAAAAU 276 277 2376-2394 AD-55101.2 AGUCCUGGAAAUAAAUUCU AGAAUUUAUUUCCAGGACU 278 279 358-376 AD-53511.1 CUGCCCAUUCUUAUCCCGA UCGGGAUAAGAAUGGGCAG 280 281 789-807 AD-53512.1 CCAGUGUGGUUAGUGUGAA UUCACACUAACCACACUGG 282 283 1076-1094 AD-53513.1 GUCUGGUGCAGUAAUGACU AGUCAUUACUGCACCAGAC 284 285 1253-1271 AD-53514.1 GCACUCUUGUUUUCCUCGU ACGAGGAAAACAAGAGUGC 286 287 1544-1562 AD-53515.1 GAGUUUGGAGCAAUCACCU AGGUGAUUGCUCCAAACUC 288 289 2228-2246 AD-53516.1 GGCUUGAGCAAGUUGGUAU AUACCAACUUGCUCAAGCC 290 291 404-422 AD-53517.1 GGCAAAUCUCUGUUGUUCU AGAACAACAGAGAUUUGCC 292 293 404-422 AD-53517.1 GGCAAAUCUCUGUUGUUCU AGAACAACAGAGAUUUGCC 294 295 866-884 AD-53518.1 CAAAGACCAGAAAGAGUGU ACACUCUUUCUGGUCUUUG 296 297 1080-1098 AD-53519.1 GGUGCAGUAAUGACUACCU AGGUAGUCAUUACUGCACC 298 299 1258-1276 AD-53520.1 CUUGUUUUCCUCGUGCUUU AAAGCACGAGGAAAACAAG 300 301 1616-1634 AD-53521.1 GGGGAUCGGGAUGGAGUCA UGACUCCAUCCCGAUCCCC 302 303 2230-2248 AD-53522.1 CUUGAGCAAGUUGGUAUCU AGAUACCAACUUGCUCAAG 304 305 436-454 AD-53523.1 CCCCAAGAUGAUGGAAGUU AACUUCCAUCAUCUUGGGG 306 307 436-454 AD-53523.1 CCCCAAGAUGAUGGAAGUU AACUUCCAUCAUCUUGGGG 308 309 885-903 AD-53524.1 CUCAUCUUCUUCAAGAUAA UUAUCUUGAAGAAGAUGAG 310 311 1127-1145 AD-53525.1 GGGGCAGUUAUGGACACUU AAGUGUCCAUAACUGCCCC 312 313 1315-1333 AD-53526.1 GAUGCCAGGCUGUGAGAUU AAUCUCACAGCCUGGCAUC 314 315 1870-1888 AD-53527.1 GAGACAGAUGCUAAUGGAU AUCCAUUAGCAUCUGUCUC 316 317 2286-2304 AD-53528.1 CCCCAGGCCAUUAUCAUAU AUAUGAUAAUGGCCUGGGG 318 319 489-507 AD-53529.1 CAGCAGUACACUACCAACA UGUUGGUAGUGUACUGCUG 320 321 489-507 AD-53529.1 CAGCAGUACACUACCAACA UGUUGGUAGUGUACUGCUG 322 323 915-933 AD-53530.1 CUGUUUCCACUUUUCAGUA UACUGAAAAGUGGAAACAG 324 325 1138-1156 AD-53531.1 GGACACUUUGAAACAACAU AUGUUGUUUCAAAGUGUCC 326 327 1324-1342 AD-53532.1 CUGUGAGAUUUACUCUGAU AUCAGAGUAAAUCUCACAG 328 329 1927-1945 AD-53533.1 CCCUGUGCGGGUUGCAGAU AUCUGCAACCCGCACAGGG 330 331 2312-2330 AD-53534.1 GUCUUCAGAGUUGUCUUUA UAAAGACAACUCUGAAGAC 332 333 646-664 AD-53535.1 CACUGCAAGCAAAUGCCCU AGGGCAUUUGCUUGCAGUG 334 335 922-940 AD-53536.1 CACUUUUCAGUAUGAUCGU ACGAUCAUACUGAAAAGUG 336 337 1163-1181 AD-53537.1 GGGGCAGGUGGUACUAGAA UUCUAGUACCACCUGCCCC 338 339 1347-1365 AD-53538.1 GGAACCAUGCCUCCAUGAU AUCAUGGAGGCAUGGUUCC 340 341 1964-1982 AD-53539.1 GUCUGUGAUGAACUAAUGA UCAUUAGUUCAUCACAGAC 342 343 2321-2339 AD-53540.1 GUUGUCUUUAUAUGUGAAU AUUCACAUAUAAAGACAAC 344 345 671-689 AD-53541.1 GCAGCACAGAUGAAUCAGA UCUGAUUCAUCUGUGCUGC 346 347 924-942 AD-53542.1 CUUUUCAGUAUGAUCGUUU AAACGAUCAUACUGAAAAG 348 349 1164-1182 AD-53543.1 GGGCAGGUGGUACUAGAAA UUUCUAGUACCACCUGCCC 350 351 1460-1478 AD-53544.1 GUCCCCAAGAUUGUGGCAU AUGCCACAAUCUUGGGGAC 352 353 1976-1994 AD-53545.1 CUAAUGAGCAGACAUAACA UGUUAUGUCUGCUCAUUAG 354 355 786-804 AD-53546.1 GCCCCAGUGUGGUUAGUGU ACACUAACCACACUGGGGC

356 357 935-953 AD-53547.1 GAUCGUUUCUUUGAGAAAA UUUUCUCAAAGAAACGAUC 358 359 1165-1183 AD-53548.1 GGCAGGUGGUACUAGAAAU AUUUCUAGUACCACCUGCC 360 361 1530-1548 AD-53549.1 GUGAUGUGGCCCAUGAGUU AACUCAUGGGCCACAUCAC 362 363 2003-2021 AD-53550.1 CAAGCAAUCAAUUACCCUA UAGGGUAAUUGAUUGCUUG 364 365 788-806 AD-53551.1 CCCAGUGUGGUUAGUGUGA UCACACUAACCACACUGGG 366 367 974-992 AD-53552.1 GACCACACCUAUCGAGUUU AAACUCGAUAGGUGUGGUC 368 369 1191-1209 AD-53553.1 GAACUAGUAAAUUCCAUGU ACAUGGAAUUUACUAGUUC 370 371 1541-1559 AD-53554.1 CAUGAGUUUGGAGCAAUCA UGAUUGCUCCAAACUCAUG 372 373 2075-2093 AD-53555.1 CCCCAGAUGAUGAACUACU AGUAGUUCAUCAUCUGGGG 374 375 360-378 AD-53561.1 GCCCAUUCUUAUCCCGAGU ACUCGGGAUAAGAAUGGGC 376 377 1356-1374 AD-53567.1 CCUCCAUGAUCCAAGGGAU AUCCCUUGGAUCAUGGAGG 378 379 1631-1649 AD-53573.1 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC 380 381 1634-1652 AD-53579.1 AUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAU

Пример 3. Скрининг дуплексов ми-РНК ALAS1 in vitro в отношении активности в нокдауне ALAS1.

Дуплексы ми-РНК ALAS1 подвергали скринингу в отношении их способности вызывать нокдаун экспрессии ALAS1 in vitro.

Скрининг in vitro

Культура клеток и трансфекции

Клетки Hep3B (ATCC, Manassas, VA) выращивали почти до слияния при 37°C в атмосфере 5% CO2 в MEM (ATCC) с добавлением 10% FBS, затем снимали с планшета обработкой трипсином. Трансфекцию осуществляли, добавляя 14,8 мкл Opti-MEM плюс 0,2 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad CA, № в каталоге 13778-150) к 5 мкл дуплексов ми-РНК на лунку в 96-луночный планшет и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем к смеси ми-РНК добавляли 80 мкл полной ростовой среды, содержащей ~2×104 клеток Hep3B. Клетки инкубировали либо в течение 24 часов, либо в течение 120 часов до очистки РНК. Эксперименты с одной дозой осуществляли с использованием конечной концентрации дуплекса 10 нМ и 0,1 нМ, а эксперименты по определению зависимости доза-ответ осуществляли, используя конечную концентрацию дуплекса 10, 1,67, 0,27, 0,046, 0,0077, 0,0013, 0,00021, 0,00004 нМ.

Выделение суммарной РНК с использованием набора для выделения мРНК DYNABEADS (Invitrogen, серия №: 610-12)

Клетки собирали и лизировали в 150 мкл буфера для лизиса/связывания, затем перемешивали в течение 5 минут при 850 об./мин, используя термомиксер Eppendorf (скорость перемешивания была одинаковой на протяжении всего процесса). Добавляли десять микролитров магнитных шариков и 80 мкл буфера для лизиса/связывания в лунки планшета с круглым дном и перемешивали в течение 1 минуты. Магнитные шарики улавливали, используя магнитную подставку, и надосадок удаляли, не нарушая шарики. После удаления надосадка к оставшимся шарикам добавляли лизированные клетки и перемешивали в течение 5 минут. После удаления надосадка магнитные шарики промывали 2 раза, используя 150 мкл буфера для промывки A, и перемешивали в течение 1 минуты. Шарики снова улавливали и надосадок удаляли. Затем шарики промывали, используя 150 мкл буфера для промывки B, улавливали и надосадок удаляли. Шарики снова промывали 150 мкл буфера для элюирования, улавливали и надосадок удаляли. Шарикам давали возможность высохнуть в течение 2 минут. После сушки добавляли 50 мкл буфера для элюирования и перемешивали в течение 5 минут при 70°C. Шарики улавливали на магните в течение 5 минут. 40 мкл надосадка извлекали и добавляли в другой 96-луночный планшет.

Синтез кДНК с использованием набора для высокопроизводительной обратной транскрипции кДНК ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, № в каталоге 4368813)

Маточную смесь, состоящую из 2 мкл 10X буфера, 0,8 мкл 25X dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКаз и 3,2 мкл H2O на реакцию, добавляли к 10 мкл суммарной РНК. кДНК получали, используя термоциклер Bio-Rad C-1000 или S-1000 (Hercules, CA), выполняя следующие стадии: 25°C 10 минут, 37°C 120 минут, 85°C 5 секунд, 4°C - хранение.

ПЦР в реальном времени

2 мкл кДНК добавляли к маточной смеси, содержащей 0,5 мкл зонда GAPDH TaqMan (Applied Biosystems, № в каталоге 4326317E), 0,5 мкл зонда ALAS1 TaqMan (Applied Biosystems, № в каталоге Hs00167441_m1) и 5 мкл маточной смеси зонда Lightcycler 480 (Roche, № в каталоге 04887301001), на лунку в 384-луночный планшет (Roche, № в каталоге 04887301001). ПЦР в реальном времени осуществляли в системе для ПЦР в реальном времени Roche LC480 (Roche), используя анализ ΔΔCt(RQ). Каждый дуплекс тестировали, используя две независимых трансфекции с двумя биологическими повторами в каждом случае, и каждую трансфекцию анализировали в двух повторах, если не указано иное в сводных таблицах.

Чтобы вычислить относительное кратное изменение, данные, полученные в реальном времени, анализировали, используя способ ΔΔCt, и нормализовали по отношению к данным анализов, осуществляемых с использованием клеток, трансфицированных 10 нм AD-1955, или ложно трансфицированных клеток. IC50 вычисляли с помощью модели подгонки по 4 параметрам, используя XLFit, и нормализовали по отношению к клеткам, трансфицированным AD-1955, или наивным клеткам в том же диапазоне доз или по отношению к собственной наименьшей дозе.

Нокдаун in vitro эндогенной экспрессии ALAS1 дуплексами ми-РНК ALAS1

Таблица 4 иллюстрирует нокдаун ALAS1 в клетках Hep3B под действием дуплексов модифицированных ми-РНК ALAS1 (См. таблицу 2). Сайленсинг выражали в виде доли оставшейся матричной РНК относительно негативной (люцифераза) контрольной ми-РНК AD- 1955. Данные получали, как описано выше, после трансфекции 10 нМ или 0,1 нМ каждой ми-РНК. кПЦР осуществляли, используя зонд ALAS1 TaqMan Hs00167441_m1.

Таблица 4
Экспрессия ALAS1 в клетках Hep3B после трансфекции ми-РНК ALAS1
Идентификационный номер дуплекса 10 нМ Среднее 0,1 нМ Среднее 10 нМ Стандартное отклонение 0,1 нМ Стандартное отклонение AD-55078.2 0,7 0,87 0,001 0,089 AD-55084.2 0,08 0,3 0 0,04 AD-55090.2 0,06 0,08 0,002 0,003 AD-55096.2 0,61 0,92 0,171 0,34 AD-55102.2 0,63 0,62 0,005 0,069 AD-55106.2 0,07 0,08 0,004 0,027 AD-55111.2 0,06 0,23 0,013 0,062

AD-55073.2 0,21 0,4 0,018 0,061 AD-55079.2 0,17 0,43 0,033 0,089 AD-55085.2 0,13 0,21 0,011 0,019 AD-55091.2 0,27 0,55 0,033 0,009 AD-55097.2 0,31 0,38 0,051 0,059 AD-55103.2 0,05 0,11 0,017 0,006 AD-55107.2 0,12 0,24 0,007 0,008 AD-55112.2 0,15 0,2 0,036 0,025 AD-55074.2 0,16 0,45 0,008 0,002 AD-55080.2 0,79 0,99 0,095 0,304 AD-55086.2 0,09 0,22 0,005 0,035 AD-55098.2 0,25 0,51 0,03 0,07 AD-55104.2 0,06 0,1 0,017 0,001 AD-55108.2 0,47 0,65 0,03 0,015 AD-55113.2 0,38 0,62 0,068 0,039 AD-55075.2 0,12 0,28 0,007 0,051 AD-55081.2 0,21 0,51 0,036 0,066 AD-55087.2 0,1 0,19 0,017 0,02 AD-55093.2 0,24 0,56 0,029 0,053 AD-55099.2 0,05 0,18 0,001 0,038 AD-53573.3 0,67 1,07 0,16 0,153 AD-55109.2 0,07 0,23 0,006 0,052 AD-55114.2 0,08 0,16 0,004 0,017 AD-55076.2 0,05 0,14 0,007 0,035 AD-55082.2 0,08 0,3 0,019 0,016 AD-55088.2 0,06 0,12 0,008 0,02 AD-55094.2 0,06 0,18 0,005 0,023 AD-55100.2 0,45 0,83 0,02 0,05 AD-55105.2 0,02 0,05 0,005 0,004 AD-55110.2 0,15 0,19 0,031 0,016 AD-55115.2 0,35 0,58 0,045 0,052 AD-55077.2 0,14 0,14 0,006 0,019 AD-55083.2 0,56 0,98 0,24 0,188 AD-55089.2 0,62 0,79 0,036 0,094

AD-55095.2 0,59 0,92 0,12 0,079 AD-55101.2 0,71 0,97 0,074 0,097 AD-1955 1,00 1,01 0,03 0,04 AD-53511.1 0,84 1,08 0,028 0,0515 AD-53512.1 0,15 0,65 0,062 0,023 AD-53513.1 0,34 0,86 0,055 0,011 AD-53514.1 0,12 0,61 0,003 0,008 AD-53515.1 0,25 0,66 0,005 0,004 AD-53516.1 1,05 1,02 0,032 0,011 AD-53517.1 0,145 0,725 0,025 0,0155 AD-53518.1 0,72 0,85 0,045 0,028 AD-53519.1 0,18 0,66 0,061 0,004 AD-53520.1 0,18 0,9 0,041 0,001 AD-53521.1 0,97 1,07 0,01 0,003 AD-53522.1 0,87 1,1 0,065 0,112 AD-53523.1 0,48 0,96 0,0305 0,0255 AD-53524.1 0,11 0,66 0,02 0,006 AD-53525.1 0,71 1,03 0,016 0,01 AD-53526.1 0,23 0,85 0,075 0,01 AD-53527.1 0,25 0,83 0,015 0,017 AD-53528.1 0,44 0,93 0,037 0,006 AD-53529.1 0,185 0,73 0,015 0,014 AD-53530.1 0,1 0,62 0,02 0,003 AD-53531.1 0,48 0,93 0,019 0,045 AD-53532.1 0,06 0,17 0 0,003 AD-53533.1 0,36 0,93 0,025 0,034 AD-53534.1 0,1 0,36 0,014 0,012 AD-53535.1 0,58 1,05 0,036 0,071 AD-53536.1 0,12 0,45 0,009 0,026 AD-53537.1 0,73 0,96 0,101 0,015 AD-53538.1 0,74 1,07 0 0,046 AD-53539.1 0,52 0,97 0,057 0,032 AD-53540.1 0,1 0,47 0,017 0,012 AD-53541.1 0,11 0,29 0,026 0,015

AD-53542.1 0,08 0,23 0,008 0,006 AD-53543.1 0,62 1,01 0,027 0,014 AD-53544.1 0,8 1,04 0,002 0,001 AD-53545.1 0,17 0,73 0,007 0,007 AD-53546.1 0,27 0,93 0,058 0,019 AD-53547.1 0,12 0,28 0,008 0,01 AD-53548.1 0,1 0,34 0,022 0,002 AD-53549.1 0,8 1,04 0,011 0,026 AD-53550.1 0,05 0,54 0,02 0,003 AD-53551.1 0,96 1,16 0,029 0,044 AD-53552.1 0,13 0,5 0,002 0,009 AD-53553.1 0,92 1,1 0,027 0,02 AD-53554.1 0,76 0,67 0,005 0,004 AD-53555.1 0,11 0,53 0,009 0,007 AD-53561.1 0,72 0,94 0,014 0,001 AD-53567.1 0,16 0,66 0,019 0,003 AD-53573.1 1,06 1,10 0,019 0,037 AD-53579.1 0,19 0,76 0,036 0,019

IC50 выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1 в скрининге in vitro

Таблица 5 иллюстрирует значения IC50 выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1, определенные на основании нокдауна эндогенно экспрессируемого ALAS1 в линии клеток Hep3B дуплексами модифицированной ми-РНК ALAS1 (См. таблицу 2). Данные получали, как описано выше, через 24 или 120 часов после трансфекции каждым дуплексом ми-РНК. Сайленсинг ALAS1 выражали в виде доли оставшейся мРНК относительно ми-РНК AD-1955, т.е. ми-РНК, не неправленой к мишени, которую использовали в качестве негативного контроля. Данные из экспериментов по трансфекции с повторами использовали для подгонки к одной линии, чтобы определить IC50. Несколько дуплексов (например, AD-53541.1, AD-53542.1 и AD-53547.1) имели низкие IC50 примерно до 0,03 нМ во временной точке 24 часа. Множество дуплексов имели IC50 меньше 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53536.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53548.1, AD-53550.1, AD-53552.1) во временной точке 24 часа, и некоторые из них также имели IC50 меньше 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53552.1) во временной точке 120 часа.

Таблица 5
IC50 выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1, нормализованные по отношению к AD-1955
IC50 (нМ) Идентификационный номер дуплекса 24 часа 120 часов AD-53534.1 0,045 0,076 AD-53536.1 0,049 0,105 AD-53540.1 0,054 0,077 AD-53541.1 0,032 0,062 AD-53542.1 0,028 0,093 AD-53547.1 0,03 0,062 AD-53548.1 0,044 0,101 AD-53550.1 0,085 0,152 AD-53552.1 0,077 0,063 AD-53567.1 0,219 0,357 AD-53579.1 0,217 0,566

Пример 4. Сайленсинг in vivo с использованием ми-РНК ALAS1 мыши/крысы, приготовленной в виде LNP

Последовательности модифицированного дуплекса AD-53558 показаны в таблице 6 ниже.

Таблица 6
Последовательности дуплекса ми-РНК ALAS1 AD-53558.4
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Положение старта в транскрипте NM_020559.2 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') 383 384 1184 AD-53558 cuGuGAAAuuuAcucuGAudTsdT AUcAGAGuAAAUUUcAcAGdTsdT

Такой дуплекс готовили в виде препарата LNP11 (См. таблицу 10 выше). Приготовленную в виде LNP-препарата ми-РНК AD-53558 тестировали in vivo у мышей (N=25 животных; 5 животных на группу) и крыс (N=20 животных; 4 животных на группу) и был подтвержден сайленсинг мРНК ALAS1 in vivo. Результаты показаны на фиг. 5 и фиг. 6.

На фиг. 5 показано, что ми-РНК оказывала зависимый от дозы эффект у мышей. Экспрессия мышиной мРНК ALAS1 (mALAS1) снижалась примерно на 78% при введении ми-РНК в дозе 1 мг/кг; количество мышиной мРНК ALAS1 снижалось примерно на 60% при введении ми-РНК в дозе 0,3 мг/кг; и количество мышиной мРНК ALAS1 снижалось примерно на 49% при введении ми-РНК в дозе 0,1 мг/кг. Указанные снижения выражали относительно контроля с PBS. Также использовали контроль AD-1955 LUC, как показано на фиг. 5.

Подобным образом, на фиг. 6 показано, что ми-РНК проявляет зависимый от дозы эффект у крыс. Экспрессия РНК ALAS1 была снижена примерно на 70% при введении ми-РНК в дозе 1 мг/кг; количество мРНК ALAS1 было снижено примерно на 62% при введении ми-РНК в дозе 0,3 мг/кг; и количество ALAS1 было снижено примерно на 34% при введении ми-РНК в дозе 0,1 мг/кг.

Также тестировали продолжительность сайленсинга у мышей (N=15; 3 животных на временную точку. Результаты показаны на фиг. 7, на которой показано, что AD-53558 подавляла мРНК mALAS1 примерно на 80% в течение, по меньшей мере, 9 суток. Подавление, по меньшей мере, примерно на 50% длилось, по меньшей мере, 14 суток.

Пример 5. Эффективность ми-РНК ALAS1 в животной модели AIP

Влияние LNP11-препарата AD-53558 (ми-РНК ALAS1 мыши/крысы, описанная в предыдущем примере) исследовали в мышиной модели AIP. При нокауте PBGD животные нежизнеспособны (-/-, 0% активность). Доступны гетерозиготные нокаутированные по PBGD мыши (+/-, ~ 50% активность), но они не имеют полного биохимического фенотипа и поэтому не могут повторять фенотип заболевания человека. Таким образом, была разработана мышиная модель AIP, которая является сложной гетерозиготой с аллелями T1/T2, содержащей нарушение промотора T1 (+/-) и изменение сайта сплайсинга T2 (-/-). Было показано, что такие мыши имеют остаточную активность PBGD в печени, которая составляет примерно ~30% от уровня дикого типа, и нормальные или слегка повышенные исходные уровни ALA и PBG в плазме. Было обнаружено, что мыши выглядят нормальными в раннем возрасте и становятся немного медлительными и атаксическими с возрастом. При функциональном исследовании было документально показано, что к шестимесячному возрасту у мышей развивается нарушенная координация движений и работа мышц, и дегенерация аксонов. Исследование патологии в мышиной модели показывает дегенерацию аксонов, нарушенную координацию движений и работу мышц у старых мышей. Обнаружено, что уровни ALA и PBG в моче и плазме заметно возрастают при периодическом внутрибрюшинном введении фенобарбитала (См. Lindberg et al., (1996), Nature Genetics, 12:195-219 and Lindberg et al., (1999), Journal of Clinical Investigation, 103:1127-34). Мышей спасали посредством AAV-опосредованной экспрессии PBGD в печени Yasuda et al., (2010), Molecular Medicine, 1:17-22 and Unsu et al., (2011), Molecular Medicine, 2:243-50).

В 1 день мышам вводили 1 мг/кг ми-РНК ALAS1 (n=5) или контрольной LUC AD-1955 (n=3) путем внутривенной инъекции. Вводили три инъекции фенобарбитала (1 инъекция в сутки в 2, 3 и 4 день), чтобы индуцировать печеночную ALAS1 и предшественники порфирина, ALA и PBG. Образцы плазмы и утренней мочи собирали на 5 день и измеряли уровни метаболитов, используя ЖХ-МС. Уровни метаболитов измеряли в плазме, используя ЖХ-МС, а также измеряли в моче. Исходные уровни метаболитов измеряли перед первой обработкой в 1 день. Результаты показаны на фиг. 8-12 и в таблицах 12 и 13.

На фиг. 8 и фиг. 9 показаны уровни ALA в плазме в мкМ. Исходные уровни ALA были низкими (n=4), и обработка фенобарбиталом индуцировала значимое повышение уровней ALA в плазме у контрольных обработанных ми-РНК LUC животных (n=3). Обработка ми-РНК ALAS1 ингибировала индукцию ALA в плазме (n=5), как показано на фиг. 8. ми-РНК ALAS1 в равной мере эффективно блокировала индукцию ALA в плазме у каждого отдельного исследуемого животного (См. фиг. 9). Полученные результаты показывают, что обработка ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращала повышения уровней ALA в плазме, ассоциированные с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в данной животной модели AIP.

На фиг. 10 и фиг. 11 показаны уровни PBG в плазме в мкМ. Исходные уровни PBG были низкими (n=4), и обработка фенобарбиталом индуцировала значимое повышение уровней PBG в плазме у контрольных обработанных ми-РНК LUC животных (n=3). Обработка ми-РНК ALAS1 ингибировала индукцию PBG в плазме (n=5), как показано на фиг. 10. ми-РНК ALAS1 в равной мере эффективно блокировала индукцию PBG в плазме у каждого отдельного исследуемого животного (См. фиг. 11). Полученные результаты показывают, что обработка ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращала повышения уровней PBG в плазме, ассоциированные с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в данной животной модели AIP.

В таблицах 12 и 13 показаны уровни ALA и PBG в моче на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом в случае животных, обработанных ми-РНК LUC (n=2), в контроле (CTR, который относится к животному, обработанному буфером PBS, n=1), и у животных, обработанных ми-РНК ALAS1 (n=5).

Таблица 12
Данные, полученные для образцов мочи от отдельных животных, показывающие предотвращение индуцированного острого приступа
Номер мыши ALA (микроМ/л) PBG (микроМ/л) Креатин (мг/дл) ALA (микроМ/мг креатинина) PBG (микроМ/мг креатинина) ми-РНК PB Ha-17-4-6 29,7 7,9 Исходный уровень - Ha-19-5-4/2 15,7 5,1 Исходный уровень - Ha-20-39-4/3 28,6 6,7 Исходный уровень - Ha-20-38-4 21,4 4,7 Исходный уровень - Ha-21-33-4 934,92 483,71 0,4205 222,33 115,03 Luc + Ha-21-36-9 944,08 563,53 0,5055 186,76 111,48 Luc + Ha-21-18-8 32,88 8,69 0,133 24,72 6,53 ALAS1;
1 мг/кг
+
Ha-21-33-7 83,07 23,28 0,426 19,50 5,46 ALAS1;
1 мг/кг
+
Ha-21-34-5 59,15 18,41 0,263 22,49 7,00 ALAS1;
1 мг/кг
+

PB означает фенобарбитал. «+» означает, что вводили фенобарбитал. Таблица 13
Средние данные для образцов мочи
Среднее значение ALA (микроМ/мг креатинина) Среднее значение PBG (микроМ/мг креатинина) 23,8 6.1 AIP Исходный уровень 204,55 113.26 Luc-ми-РНК 22,24 6.33 ALAS1-ми-РНК

Обработка фенобарбиталом индуцировала сильное повышение уровня (повышение ~25-30 раз) ALA в моче (~9-кратное по сравнению с исходными уровнями) и PBG (~ 19-кратное по сравнению с исходными уровнями) у мышей, обработанных ми-РНК LUC, в контроле, тогда как такое увеличение не наблюдали у животных, обработанных ми-РНК ALAS1. Таким образом, ми-РНК ALAS1 блокировала индуцированное фенобарбиталом повышение ALA и PBG в моче. Полученные результаты согласуются с измерениями в плазме и показывают, что обработка ми-РНК ALAS1 эффективно предотвращала повышение уровней метаболитов в моче (ALA и PBG), ассоциированное с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в модели AIP на животных.

В следующих экспериментах (фиг. 12) было обнаружено, что обработка фенобарбиталом индуцировала значительное повышение (~25 раз) экспрессии мРНК ALAS1 в печени модельной мыши. Введение ми-РНК ALAS1 полностью блокировало индукцию такой мРНК ALAS1. Полученные результаты являются дополнительным доказательством того, что ми-РНК ALAS1 эффективна в животной модели AIP.

Результаты, представленные в данном примере, вместе взятые, показывают, что ми-РНК ALAS1 является эффективной в лечении острых приступов в животной модели острой печеночной порфирии AIP. Многочисленные измерения результатов подтверждают такое заключение, включая уровни ALA в плазме, уровни PBG в плазме, уровни ALA в моче, уровни PBG в моче и уровни экспрессии мРНК ALAS1 в печени.

Пример 6. Сайленсинг in vivo с использованием GalNAc-конъюгированной ми-РНК ALAS1 мыши

В экспериментах, описанных в данном примере, исследовали эффективность in vivo трех GalNAc-конъюгированных ми-РНК (См. таблицу 7). Такие ми-РНК конструировали и получали такими способами, как способы, описанные в примере 2.

Таблица 7
Последовательности AD-57929
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Положение смысловой последовательности в транскрипте Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность
(5'-3')
Положение антисмысловой последовательности в транскрипте NM_020559.2
385 386 775-795 AD-56211 AfaGfuCfuGfuUfUfCfcAfcUfuUfuCfaAfL96 uUfgAfaAfaGfuGfgaaAfcAfgAfcUfusUfsg 773-795 387 388 2168-2188 AD-56173 AfcAfuAfgUfaGfCfCfaGfaAfuUfgUfcUfL96 aGfaCfaAfuUfcUfggcUfaCfuAfuGfusGfsg 2166-2188 389 390 775-795 AD-57929 AfsasGfuCfuGfuUfUfCfcAfcUfuUfuCfaAfL96 usUfsgAfaAfaGfuGfgaaAfcAfgAfcUfususg 773-795

Мышей (n=40; n=4 на экспериментальное условие) делили на группы, которые получали PBS или дозы 3 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг ми-РНК, вводимые подкожно. Уровень мРНК mALAS1/mGAPDH относительно PBS-контроля определяли в клетках печени через 72 часа после введения. Результаты показаны на фиг. 13. Имела место неясная зависимость эффекта от дозы в случае ми-РНК AD-56211 и AD-56173. Напротив, в случае ми-РНК ALAS1 AD-57929 наблюдали зависимый от дозы эффект в отношении ингибирования экспрессии mALAS1. Полученные результаты показывают, что конъюгат GalNAc-конъюгат ALAS1 эффективно ингибировал экспрессию мРНК ALAS1 мРНК in vivo и оказывал зависимый от дозы эффект.

Пример 7. ми-РНК человека

Дополнительные ми-РНК человека конструировали и получали, как описано в примере 2. 45 наилучших ми-РНК отбирали на основе их прогнозируемой эффективности. Последовательности таких 45 ми-РНК представлены в таблице 8.

Таблица 8
Смысловые и антисмысловые последовательности ми-РНК ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Положение в транскрипте NM_ 000688.4 Смысловая последовательность
(5'-3')
Антисмысловая последовательность (5'-3')
391 392 1635-1657 CAUGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCAUGAC 393 394 2352-2374 UAAAUUUUAAUCUAUAGUAAA UUUACUAUAGAUUAAAAUUUAAU 395 396 1324-1346 GGCUGUGAGAUUUACUCUGAU AUCAGAGUAAAUCUCACAGCCUG 397 398 1637-1659 UGCCAAAAAUGGACAUCAUUU AAAUGAUGUCCAUUUUUGGCAUG 399 400 1363-1385 AUGAUCCAAGGGAUUCGAAAC GUUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGG 401 402 925-947 ACUUUUCAGUAUGAUCGUUUC GAAACGAUCAUACUGAAAAGUGG 403 404 790-812 CCCAGUGUGGUUAGUGUGAAA UUUCACACUAACCACACUGGGGC 405 406 1531-1553 UGUGAUGUGGCCCAUGAGUUU AAACUCAUGGGCCACAUCACACA 407 408 2189-2211 AUUUUGAAGUGAUGAGUGAAA UUUCACUCAUCACUUCAAAAUGC 409 410 929-951 UUCAGUAUGAUCGUUUCUUUG CAAAGAAACGAUCAUACUGAAAA 411 412 872-894 GACCAGAAAGAGUGUCUCAUC GAUGAGACACUCUUUCUGGUCUU 413 414 706-728 UUCUGCAAAGCCAGUCUUGAG CUCAAGACUGGCUUUGCAGAAGA 415 416 1362-1384 CAUGAUCCAAGGGAUUCGAAA UUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGGA 417 418 1634-1656 UCAUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAUGACU 419 420 1325-1347 GCUGUGAGAUUUACUCUGAUU AAUCAGAGUAAAUCUCACAGCCU 421 422 2208-2230 AAGAGAGAAGUCCUAUUUCUC GAGAAAUAGGACUUCUCUCUUUC 423 424 2344-2366 AGUUAUAUUAAAUUUUAAUCU AGAUUAAAAUUUAAUAUAACUUA 425 426 924-946 CACUUUUCAGUAUGAUCGUUU AAACGAUCAUACUGAAAAGUGGA 427 428 873-895 ACCAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUGGUCU 429 430 759-781 GAGGAAAGAGGUUGCUGAAAC GUUUCAGCAACCUCUUUCCUCAC 431 432 871-893 AGACCAGAAAGAGUGUCUCAU AUGAGACACUCUUUCUGGUCUUU 433 434 1183-1205 AAUAUUUCUGGAACUAGUAAA UUUACUAGUUCCAGAAAUAUUUC 435 436 2229-2251 AGGCUUGAGCAAGUUGGUAUC GAUACCAACUUGCUCAAGCCUGA

437 438 671-693 UGGCAGCACAGAUGAAUCAGA UCUGAUUCAUCUGUGCUGCCAGG 439 440 2187-2209 GCAUUUUGAAGUGAUGAGUGA UCACUCAUCACUUCAAAAUGCAG 441 442 913-935 AAAUCUGUUUCCACUUUUCAG CUGAAAAGUGGAAACAGAUUUUG 443 444 1977-1999 ACUAAUGAGCAGACAUAACAU AUGUUAUGUCUGCUCAUUAGUUC 445 446 1174-1196 GGUACUAGAAAUAUUUCUGGA UCCAGAAAUAUUUCUAGUACCAC 447 448 1810-1832 AUCCUGAAGAGCGCUGAGGGA UCCCUCAGCGCUCUUCAGGAUCC 449 450 892-914 CUUCUUCAAGAUAACUUGCCA UGGCAAGUUAUCUUGAAGAAGAU 451 452 877-899 GAAAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUUUCUG 453 454 935-957 AUGAUCGUUUCUUUGAGAAAA UUUUCUCAAAGAAACGAUCAUAC 455 456 1975-1997 GAACUAAUGAGCAGACAUAAC GUUAUGUCUGCUCAUUAGUUCAU 457 458 1478-1500 CAUUUGAAACUGUCCAUUCAA UUGAAUGGACAGUUUCAAAUGCC 459 460 2366-2388 UAGUAAAAACAUAGUCCUGGA UCCAGGACUAUGUUUUUACUAUA 461 462 853-875 GACAUCAUGCAAAAGCAAAGA UCUUUGCUUUUGCAUGAUGUCCU 463 464 1966-1988 GUCUGUGAUGAACUAAUGAGC GCUCAUUAGUUCAUCACAGACUU 465 466 928-950 UUUCAGUAUGAUCGUUUCUUU AAAGAAACGAUCAUACUGAAAAG 467 468 1186-1208 AUUUCUGGAACUAGUAAAUUC GAAUUUACUAGUUCCAGAAAUAU 469 470 1189-1211 UCUGGAACUAGUAAAUUCCAU AUGGAAUUUACUAGUUCCAGAAA 471 472 973-995 AAUGACCACACCUAUCGAGUU AACUCGAUAGGUGUGGUCAUUCU 473 474 983-1005 CCUAUCGAGUUUUUAAAACUG CAGUUUUAAAAACUCGAUAGGUG 475 476 1185-1207 UAUUUCUGGAACUAGUAAAUU AAUUUACUAGUUCCAGAAAUAUU 477 478 2353-2375 AAAUUUUAAUCUAUAGUAAAA UUUUACUAUAGAUUAAAAUUUAA 479 480 875-897 CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUC GAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU 481 482 360-378 GCCCAUUCUUAUCCCGAGU ACUCGGGAUAAGAAUGGGC 483 484 428-446 CAAAACUGCCCCAAGAUGA UCAUCUUGGGGCAGUUUUG 485 486 873-891 CAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUG 487 488 874-892 AGAAAGAGUGUCUCAUCUU AAGAUGAGACACUCUUUCU 489 490 877-895 AAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUU 491 492 1295-1313 CUCUUCACCCUGGCUAAGA UCUUAGCCAGGGUGAAGAG 493 494 1296-1314 UCUUCACCCUGGCUAAGAU AUCUUAGCCAGGGUGAAGA 495 496 1299-1317 UCACCCUGGCUAAGAUGAU AUCAUCUUAGCCAGGGUGA 497 498 1347-1365 GGAACCAUGCCUCCAUGAU AUCAUGGAGGCAUGGUUCC 499 500 1355-1373 GCCUCCAUGAUCCAAGGGA UCCCUUGGAUCAUGGAGGC 501 502 1356-1374 CCUCCAUGAUCCAAGGGAU AUCCCUUGGAUCAUGGAGG 503 504 1357-1375 CUCCAUGAUCCAAGGGAUU AAUCCCUUGGAUCAUGGAG 505 506 1631-1649 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC 507 508 1634-1652 AUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAU 509 510 1635-1653 UGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCA 511 512 1791-1809 CCCUGGAGUCUGUGCGGAU AUCCGCACAGACUCCAGGG 513 514 1794-1812 UGGAGUCUGUGCGGAUCCU AGGAUCCGCACAGACUCCA 515 516 1921-1939 CAUCAUCCCUGUGCGGGUU AACCCGCACAGGGAUGAUG 517 518 359-377 UGCCCAUUCUUAUCCCGAA UUCGGGAUAAGAAUGGGCA 519 520 362-380 CCAUUCUUAUCCCGAGUCA UGACUCGGGAUAAGAAUGG 521 522 363-381 CAUUCUUAUCCCGAGUCCA UGGACUCGGGAUAAGAAUG 523 524 434-452 UGCCCCAAGAUGAUGGAAU AUUCCAUCAUCUUGGGGCA 525 526 872-890 CCAGAAAGAGUGUCUCAUA UAUGAGACACUCUUUCUGG 527 528 875-893 GAAAGAGUGUCUCAUCUUA UAAGAUGAGACACUCUUUC 529 530 1112-1130 CACCCACGGGUGUGUGGGA UCCCACACACCCGUGGGUG 531 532 1113-1131 ACCCACGGGUGUGUGGGGA UCCCCACACACCCGUGGGU 533 534 1297-1315 CUUCACCCUGGCUAAGAUA UAUCUUAGCCAGGGUGAAG 535 536 1300-1318 CACCCUGGCUAAGAUGAUA UAUCAUCUUAGCCAGGGUG

537 538 1301-1319 ACCCUGGCUAAGAUGAUGA UCAUCAUCUUAGCCAGGGU 539 540 1348-1366 GAACCAUGCCUCCAUGAUA UAUCAUGGAGGCAUGGUUC 541 542 1481-1499 GAAACUGUCCAUUCAAUGA UCAUUGAAUGGACAGUUUC 543 544 1786-1804 UGGAGCCCUGGAGUCUGUA UACAGACUCCAGGGCUCCA 545 546 1795-1813 GGAGUCUGUGCGGAUCCUA UAGGAUCCGCACAGACUCC 547 548 1919-1937 CACAUCAUCCCUGUGCGGA UCCGCACAGGGAUGAUGUG 549 550 1922-1940 AUCAUCCCUGUGCGGGUUA UAACCCGCACAGGGAUGAU 551 552 1923-1941 UCAUCCCUGUGCGGGUUGA UCAACCCGCACAGGGAUGA

Пример 8. ми-РНК человека

Создавали дополнительные 19-мерные ми-РНК человека. Последовательности таких ми-РНК представлены в таблице 9. Такие ми-РНК могут быть протестированы в отношении эффективности с использованием способов, описанных в настоящей публикации, и/или способов, известных в данной области.

Таблица 9
Смысловые и антисмысловые последовательности ми-РНК ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Положение в транскрипте NM_ 000688.4 Смысловая последовательность
(5'-3')
Антисмысловая последовательность (5'-3')
553 554 4-22 UAUAUUAAGGCGCCGGCGA UCGCCGGCGCCUUAAUAUA 555 556 5-23 AUAUUAAGGCGCCGGCGAU AUCGCCGGCGCCUUAAUAU 557 558 6-24 UAUUAAGGCGCCGGCGAUC GAUCGCCGGCGCCUUAAUA 559 560 7-25 AUUAAGGCGCCGGCGAUCG CGAUCGCCGGCGCCUUAAU 561 562 8-26 UUAAGGCGCCGGCGAUCGC GCGAUCGCCGGCGCCUUAA 563 564 9-27 UAAGGCGCCGGCGAUCGCG CGCGAUCGCCGGCGCCUUA 565 566 10-28 AAGGCGCCGGCGAUCGCGG CCGCGAUCGCCGGCGCCUU 567 568 11-29 AGGCGCCGGCGAUCGCGGC GCCGCGAUCGCCGGCGCCU 569 570 12-30 GGCGCCGGCGAUCGCGGCC GGCCGCGAUCGCCGGCGCC 571 572 13-31 GCGCCGGCGAUCGCGGCCU AGGCCGCGAUCGCCGGCGC 573 574 14-32 CGCCGGCGAUCGCGGCCUG CAGGCCGCGAUCGCCGGCG 575 576 81-99 CUUGAGUGCCCGCCUCCUU AAGGAGGCGGGCACUCAAG 577 578 82-100 UUGAGUGCCCGCCUCCUUC GAAGGAGGCGGGCACUCAA 579 580 83-101 UGAGUGCCCGCCUCCUUCG CGAAGGAGGCGGGCACUCA 581 582 84-102 GAGUGCCCGCCUCCUUCGC GCGAAGGAGGCGGGCACUC 583 584 85-103 AGUGCCCGCCUCCUUCGCC GGCGAAGGAGGCGGGCACU 585 586 86-104 GUGCCCGCCUCCUUCGCCG CGGCGAAGGAGGCGGGCAC 587 588 87-105 UGCCCGCCUCCUUCGCCGC GCGGCGAAGGAGGCGGGCA 589 590 88-106 GCCCGCCUCCUUCGCCGCC GGCGGCGAAGGAGGCGGGC 591 592 89-107 CCCGCCUCCUUCGCCGCCG CGGCGGCGAAGGAGGCGGG 593 594 90-108 CCGCCUCCUUCGCCGCCGC GCGGCGGCGAAGGAGGCGG 595 596 91-109 CGCCUCCUUCGCCGCCGCC GGCGGCGGCGAAGGAGGCG 597 598 92-110 GCCUCCUUCGCCGCCGCCU AGGCGGCGGCGAAGGAGGC 599 600 93-111 CCUCCUUCGCCGCCGCCUC GAGGCGGCGGCGAAGGAGG 601 602 356-374 CGCUGCCCAUUCUUAUCCC GGGAUAAGAAUGGGCAGCG 603 604 357-375 GCUGCCCAUUCUUAUCCCG CGGGAUAAGAAUGGGCAGC 605 606 359-377 UGCCCAUUCUUAUCCCGAG CUCGGGAUAAGAAUGGGCA 607 608 361-379 CCCAUUCUUAUCCCGAGUC GACUCGGGAUAAGAAUGGG

609 610 362-380 CCAUUCUUAUCCCGAGUCC GGACUCGGGAUAAGAAUGG 611 612 363-381 CAUUCUUAUCCCGAGUCCC GGGACUCGGGAUAAGAAUG 613 614 364-382 AUUCUUAUCCCGAGUCCCC GGGGACUCGGGAUAAGAAU 615 616 365-383 UUCUUAUCCCGAGUCCCCC GGGGGACUCGGGAUAAGAA 617 618 366-384 UCUUAUCCCGAGUCCCCCA UGGGGGACUCGGGAUAAGA 619 620 367-385 CUUAUCCCGAGUCCCCCAG CUGGGGGACUCGGGAUAAG 621 622 368-386 UUAUCCCGAGUCCCCCAGG CCUGGGGGACUCGGGAUAA 623 624 369-387 UAUCCCGAGUCCCCCAGGC GCCUGGGGGACUCGGGAUA 625 626 370-388 AUCCCGAGUCCCCCAGGCC GGCCUGGGGGACUCGGGAU 627 628 371-389 UCCCGAGUCCCCCAGGCCU AGGCCUGGGGGACUCGGGA 629 630 372-390 CCCGAGUCCCCCAGGCCUU AAGGCCUGGGGGACUCGGG 631 632 373-391 CCGAGUCCCCCAGGCCUUU AAAGGCCUGGGGGACUCGG 633 634 374-392 CGAGUCCCCCAGGCCUUUC GAAAGGCCUGGGGGACUCG 635 636 375-393 GAGUCCCCCAGGCCUUUCU AGAAAGGCCUGGGGGACUC 637 638 376-394 AGUCCCCCAGGCCUUUCUG CAGAAAGGCCUGGGGGACU 639 640 377-395 GUCCCCCAGGCCUUUCUGC GCAGAAAGGCCUGGGGGAC 641 642 378-396 UCCCCCAGGCCUUUCUGCA UGCAGAAAGGCCUGGGGGA 643 644 379-397 CCCCCAGGCCUUUCUGCAG CUGCAGAAAGGCCUGGGGG 645 646 380-398 CCCCAGGCCUUUCUGCAGA UCUGCAGAAAGGCCUGGGG 647 648 381-399 CCCAGGCCUUUCUGCAGAA UUCUGCAGAAAGGCCUGGG 649 650 382-400 CCAGGCCUUUCUGCAGAAA UUUCUGCAGAAAGGCCUGG 651 652 383-401 CAGGCCUUUCUGCAGAAAG CUUUCUGCAGAAAGGCCUG 653 654 384-402 AGGCCUUUCUGCAGAAAGC GCUUUCUGCAGAAAGGCCU 655 656 385-403 GGCCUUUCUGCAGAAAGCA UGCUUUCUGCAGAAAGGCC 657 658 386-404 GCCUUUCUGCAGAAAGCAG CUGCUUUCUGCAGAAAGGC 659 660 387-405 CCUUUCUGCAGAAAGCAGG CCUGCUUUCUGCAGAAAGG 661 662 388-406 CUUUCUGCAGAAAGCAGGC GCCUGCUUUCUGCAGAAAG 663 664 389-407 UUUCUGCAGAAAGCAGGCA UGCCUGCUUUCUGCAGAAA 665 666 390-408 UUCUGCAGAAAGCAGGCAA UUGCCUGCUUUCUGCAGAA 667 668 391-409 UCUGCAGAAAGCAGGCAAA UUUGCCUGCUUUCUGCAGA 669 670 392-410 CUGCAGAAAGCAGGCAAAU AUUUGCCUGCUUUCUGCAG 671 672 393-411 UGCAGAAAGCAGGCAAAUC GAUUUGCCUGCUUUCUGCA 673 674 394-412 GCAGAAAGCAGGCAAAUCU AGAUUUGCCUGCUUUCUGC 675 676 395-413 CAGAAAGCAGGCAAAUCUC GAGAUUUGCCUGCUUUCUG 677 678 396-414 AGAAAGCAGGCAAAUCUCU AGAGAUUUGCCUGCUUUCU 679 680 397-415 GAAAGCAGGCAAAUCUCUG CAGAGAUUUGCCUGCUUUC 681 682 398-416 AAAGCAGGCAAAUCUCUGU ACAGAGAUUUGCCUGCUUU 683 684 399-417 AAGCAGGCAAAUCUCUGUU AACAGAGAUUUGCCUGCUU 685 686 400-418 AGCAGGCAAAUCUCUGUUG CAACAGAGAUUUGCCUGCU 687 688 401-419 GCAGGCAAAUCUCUGUUGU ACAACAGAGAUUUGCCUGC 689 690 402-420 CAGGCAAAUCUCUGUUGUU AACAACAGAGAUUUGCCUG 691 692 403-421 AGGCAAAUCUCUGUUGUUC GAACAACAGAGAUUUGCCU 693 694 405-423 GCAAAUCUCUGUUGUUCUA UAGAACAACAGAGAUUUGC 695 696 406-424 CAAAUCUCUGUUGUUCUAU AUAGAACAACAGAGAUUUG 697 698 407-425 AAAUCUCUGUUGUUCUAUG CAUAGAACAACAGAGAUUU 699 700 408-426 AAUCUCUGUUGUUCUAUGC GCAUAGAACAACAGAGAUU 701 702 409-427 AUCUCUGUUGUUCUAUGCC GGCAUAGAACAACAGAGAU 703 704 410-428 UCUCUGUUGUUCUAUGCCC GGGCAUAGAACAACAGAGA 705 706 411-429 CUCUGUUGUUCUAUGCCCA UGGGCAUAGAACAACAGAG 707 708 412-430 UCUGUUGUUCUAUGCCCAA UUGGGCAUAGAACAACAGA

709 710 413-431 CUGUUGUUCUAUGCCCAAA UUUGGGCAUAGAACAACAG 711 712 414-432 UGUUGUUCUAUGCCCAAAA UUUUGGGCAUAGAACAACA 713 714 415-433 GUUGUUCUAUGCCCAAAAC GUUUUGGGCAUAGAACAAC 715 716 416-434 UUGUUCUAUGCCCAAAACU AGUUUUGGGCAUAGAACAA 717 718 417-435 UGUUCUAUGCCCAAAACUG CAGUUUUGGGCAUAGAACA 719 720 418-436 GUUCUAUGCCCAAAACUGC GCAGUUUUGGGCAUAGAAC 721 722 419-437 UUCUAUGCCCAAAACUGCC GGCAGUUUUGGGCAUAGAA 723 724 420-438 UCUAUGCCCAAAACUGCCC GGGCAGUUUUGGGCAUAGA 725 726 421-439 CUAUGCCCAAAACUGCCCC GGGGCAGUUUUGGGCAUAG 727 728 422-440 UAUGCCCAAAACUGCCCCA UGGGGCAGUUUUGGGCAUA 729 730 423-441 AUGCCCAAAACUGCCCCAA UUGGGGCAGUUUUGGGCAU 731 732 424-442 UGCCCAAAACUGCCCCAAG CUUGGGGCAGUUUUGGGCA 733 734 425-443 GCCCAAAACUGCCCCAAGA UCUUGGGGCAGUUUUGGGC 735 736 426-444 CCCAAAACUGCCCCAAGAU AUCUUGGGGCAGUUUUGGG 737 738 427-445 CCAAAACUGCCCCAAGAUG CAUCUUGGGGCAGUUUUGG 739 740 429-447 AAAACUGCCCCAAGAUGAU AUCAUCUUGGGGCAGUUUU 741 742 430-448 AAACUGCCCCAAGAUGAUG CAUCAUCUUGGGGCAGUUU 743 744 431-449 AACUGCCCCAAGAUGAUGG CCAUCAUCUUGGGGCAGUU 745 746 432-450 ACUGCCCCAAGAUGAUGGA UCCAUCAUCUUGGGGCAGU 747 748 433-451 CUGCCCCAAGAUGAUGGAA UUCCAUCAUCUUGGGGCAG 749 750 434-452 UGCCCCAAGAUGAUGGAAG CUUCCAUCAUCUUGGGGCA 751 752 435-453 GCCCCAAGAUGAUGGAAGU ACUUCCAUCAUCUUGGGGC 753 754 437-455 CCCAAGAUGAUGGAAGUUG CAACUUCCAUCAUCUUGGG 755 756 438-456 CCAAGAUGAUGGAAGUUGG CCAACUUCCAUCAUCUUGG 757 758 439-457 CAAGAUGAUGGAAGUUGGG CCCAACUUCCAUCAUCUUG 759 760 440-458 AAGAUGAUGGAAGUUGGGG CCCCAACUUCCAUCAUCUU 761 762 441-459 AGAUGAUGGAAGUUGGGGC GCCCCAACUUCCAUCAUCU 763 764 442-460 GAUGAUGGAAGUUGGGGCC GGCCCCAACUUCCAUCAUC 765 766 443-461 AUGAUGGAAGUUGGGGCCA UGGCCCCAACUUCCAUCAU 767 768 444-462 UGAUGGAAGUUGGGGCCAA UUGGCCCCAACUUCCAUCA 769 770 445-463 GAUGGAAGUUGGGGCCAAG CUUGGCCCCAACUUCCAUC 771 772 446-464 AUGGAAGUUGGGGCCAAGC GCUUGGCCCCAACUUCCAU 773 774 447-465 UGGAAGUUGGGGCCAAGCC GGCUUGGCCCCAACUUCCA 775 776 448-466 GGAAGUUGGGGCCAAGCCA UGGCUUGGCCCCAACUUCC 777 778 449-467 GAAGUUGGGGCCAAGCCAG CUGGCUUGGCCCCAACUUC 779 780 450-468 AAGUUGGGGCCAAGCCAGC GCUGGCUUGGCCCCAACUU 781 782 451-469 AGUUGGGGCCAAGCCAGCC GGCUGGCUUGGCCCCAACU 783 784 452-470 GUUGGGGCCAAGCCAGCCC GGGCUGGCUUGGCCCCAAC 785 786 453-471 UUGGGGCCAAGCCAGCCCC GGGGCUGGCUUGGCCCCAA 787 788 454-472 UGGGGCCAAGCCAGCCCCU AGGGGCUGGCUUGGCCCCA 789 790 455-473 GGGGCCAAGCCAGCCCCUC GAGGGGCUGGCUUGGCCCC 791 792 456-474 GGGCCAAGCCAGCCCCUCG CGAGGGGCUGGCUUGGCCC 793 794 457-475 GGCCAAGCCAGCCCCUCGG CCGAGGGGCUGGCUUGGCC 795 796 458-476 GCCAAGCCAGCCCCUCGGG CCCGAGGGGCUGGCUUGGC 797 798 459-477 CCAAGCCAGCCCCUCGGGC GCCCGAGGGGCUGGCUUGG 799 800 460-478 CAAGCCAGCCCCUCGGGCA UGCCCGAGGGGCUGGCUUG 801 802 461-479 AAGCCAGCCCCUCGGGCAU AUGCCCGAGGGGCUGGCUU 803 804 462-480 AGCCAGCCCCUCGGGCAUU AAUGCCCGAGGGGCUGGCU 805 806 463-481 GCCAGCCCCUCGGGCAUUG CAAUGCCCGAGGGGCUGGC 807 808 464-482 CCAGCCCCUCGGGCAUUGU ACAAUGCCCGAGGGGCUGG

809 810 465-483 CAGCCCCUCGGGCAUUGUC GACAAUGCCCGAGGGGCUG 811 812 466-484 AGCCCCUCGGGCAUUGUCC GGACAAUGCCCGAGGGGCU 813 814 467-485 GCCCCUCGGGCAUUGUCCA UGGACAAUGCCCGAGGGGC 815 816 468-486 CCCCUCGGGCAUUGUCCAC GUGGACAAUGCCCGAGGGG 817 818 469-487 CCCUCGGGCAUUGUCCACU AGUGGACAAUGCCCGAGGG 819 820 470-488 CCUCGGGCAUUGUCCACUG CAGUGGACAAUGCCCGAGG 821 822 471-489 CUCGGGCAUUGUCCACUGC GCAGUGGACAAUGCCCGAG 823 824 472-490 UCGGGCAUUGUCCACUGCA UGCAGUGGACAAUGCCCGA 825 826 473-491 CGGGCAUUGUCCACUGCAG CUGCAGUGGACAAUGCCCG 827 828 474-492 GGGCAUUGUCCACUGCAGC GCUGCAGUGGACAAUGCCC 829 830 475-493 GGCAUUGUCCACUGCAGCA UGCUGCAGUGGACAAUGCC 831 832 476-494 GCAUUGUCCACUGCAGCAG CUGCUGCAGUGGACAAUGC 833 834 477-495 CAUUGUCCACUGCAGCAGU ACUGCUGCAGUGGACAAUG 835 836 478-496 AUUGUCCACUGCAGCAGUA UACUGCUGCAGUGGACAAU 837 838 479-497 UUGUCCACUGCAGCAGUAC GUACUGCUGCAGUGGACAA 839 840 480-498 UGUCCACUGCAGCAGUACA UGUACUGCUGCAGUGGACA 841 842 481-499 GUCCACUGCAGCAGUACAC GUGUACUGCUGCAGUGGAC 843 844 482-500 UCCACUGCAGCAGUACACU AGUGUACUGCUGCAGUGGA 845 846 483-501 CCACUGCAGCAGUACACUA UAGUGUACUGCUGCAGUGG 847 848 484-502 CACUGCAGCAGUACACUAC GUAGUGUACUGCUGCAGUG 849 850 485-503 ACUGCAGCAGUACACUACC GGUAGUGUACUGCUGCAGU 851 852 486-504 CUGCAGCAGUACACUACCA UGGUAGUGUACUGCUGCAG 853 854 487-505 UGCAGCAGUACACUACCAA UUGGUAGUGUACUGCUGCA 855 856 488-506 GCAGCAGUACACUACCAAC GUUGGUAGUGUACUGCUGC 857 858 490-508 AGCAGUACACUACCAACAG CUGUUGGUAGUGUACUGCU 859 860 491-509 GCAGUACACUACCAACAGA UCUGUUGGUAGUGUACUGC 861 862 492-510 CAGUACACUACCAACAGAU AUCUGUUGGUAGUGUACUG 863 864 493-511 AGUACACUACCAACAGAUC GAUCUGUUGGUAGUGUACU 865 866 494-512 GUACACUACCAACAGAUCA UGAUCUGUUGGUAGUGUAC 867 868 495-513 UACACUACCAACAGAUCAA UUGAUCUGUUGGUAGUGUA 869 870 496-514 ACACUACCAACAGAUCAAA UUUGAUCUGUUGGUAGUGU 871 872 497-515 CACUACCAACAGAUCAAAG CUUUGAUCUGUUGGUAGUG 873 874 498-516 ACUACCAACAGAUCAAAGA UCUUUGAUCUGUUGGUAGU 875 876 499-517 CUACCAACAGAUCAAAGAA UUCUUUGAUCUGUUGGUAG 877 878 500-518 UACCAACAGAUCAAAGAAA UUUCUUUGAUCUGUUGGUA 879 880 501-519 ACCAACAGAUCAAAGAAAC GUUUCUUUGAUCUGUUGGU 881 882 502-520 CCAACAGAUCAAAGAAACC GGUUUCUUUGAUCUGUUGG 883 884 523-541 UCCGGCCAGUGAGAAAGAC GUCUUUCUCACUGGCCGGA 885 886 524-542 CCGGCCAGUGAGAAAGACA UGUCUUUCUCACUGGCCGG 887 888 525-543 CGGCCAGUGAGAAAGACAA UUGUCUUUCUCACUGGCCG 889 890 526-544 GGCCAGUGAGAAAGACAAA UUUGUCUUUCUCACUGGCC 891 892 527-545 GCCAGUGAGAAAGACAAAA UUUUGUCUUUCUCACUGGC 893 894 528-546 CCAGUGAGAAAGACAAAAC GUUUUGUCUUUCUCACUGG 895 896 529-547 CAGUGAGAAAGACAAAACU AGUUUUGUCUUUCUCACUG 897 898 530-548 AGUGAGAAAGACAAAACUG CAGUUUUGUCUUUCUCACU 899 900 531-549 GUGAGAAAGACAAAACUGC GCAGUUUUGUCUUUCUCAC 901 902 570-588 CUCCUGAUGGAUCCCAGCA UGCUGGGAUCCAUCAGGAG 903 904 571-589 UCCUGAUGGAUCCCAGCAG CUGCUGGGAUCCAUCAGGA 905 906 572-590 CCUGAUGGAUCCCAGCAGA UCUGCUGGGAUCCAUCAGG 907 908 573-591 CUGAUGGAUCCCAGCAGAG CUCUGCUGGGAUCCAUCAG

909 910 574-592 UGAUGGAUCCCAGCAGAGU ACUCUGCUGGGAUCCAUCA 911 912 575-593 GAUGGAUCCCAGCAGAGUC GACUCUGCUGGGAUCCAUC 913 914 576-594 AUGGAUCCCAGCAGAGUCC GGACUCUGCUGGGAUCCAU 915 916 577-595 UGGAUCCCAGCAGAGUCCA UGGACUCUGCUGGGAUCCA 917 918 578-596 GGAUCCCAGCAGAGUCCAG CUGGACUCUGCUGGGAUCC 919 920 579-597 GAUCCCAGCAGAGUCCAGA UCUGGACUCUGCUGGGAUC 921 922 580-598 AUCCCAGCAGAGUCCAGAU AUCUGGACUCUGCUGGGAU 923 924 581-599 UCCCAGCAGAGUCCAGAUG CAUCUGGACUCUGCUGGGA 925 926 582-600 CCCAGCAGAGUCCAGAUGG CCAUCUGGACUCUGCUGGG 927 928 583-601 CCAGCAGAGUCCAGAUGGC GCCAUCUGGACUCUGCUGG 929 930 584-602 CAGCAGAGUCCAGAUGGCA UGCCAUCUGGACUCUGCUG 931 932 585-603 AGCAGAGUCCAGAUGGCAC GUGCCAUCUGGACUCUGCU 933 934 586-604 GCAGAGUCCAGAUGGCACA UGUGCCAUCUGGACUCUGC 935 936 587-605 CAGAGUCCAGAUGGCACAC GUGUGCCAUCUGGACUCUG 937 938 588-606 AGAGUCCAGAUGGCACACA UGUGUGCCAUCUGGACUCU 939 940 589-607 GAGUCCAGAUGGCACACAG CUGUGUGCCAUCUGGACUC 941 942 590-608 AGUCCAGAUGGCACACAGC GCUGUGUGCCAUCUGGACU 943 944 591-609 GUCCAGAUGGCACACAGCU AGCUGUGUGCCAUCUGGAC 945 946 592-610 UCCAGAUGGCACACAGCUU AAGCUGUGUGCCAUCUGGA 947 948 593-611 CCAGAUGGCACACAGCUUC GAAGCUGUGUGCCAUCUGG 949 950 594-612 CAGAUGGCACACAGCUUCC GGAAGCUGUGUGCCAUCUG 951 952 595-613 AGAUGGCACACAGCUUCCG CGGAAGCUGUGUGCCAUCU 953 954 596-614 GAUGGCACACAGCUUCCGU ACGGAAGCUGUGUGCCAUC 955 956 597-615 AUGGCACACAGCUUCCGUC GACGGAAGCUGUGUGCCAU 957 958 598-616 UGGCACACAGCUUCCGUCU AGACGGAAGCUGUGUGCCA 959 960 599-617 GGCACACAGCUUCCGUCUG CAGACGGAAGCUGUGUGCC 961 962 600-618 GCACACAGCUUCCGUCUGG CCAGACGGAAGCUGUGUGC 963 964 601-619 CACACAGCUUCCGUCUGGA UCCAGACGGAAGCUGUGUG 965 966 602-620 ACACAGCUUCCGUCUGGAC GUCCAGACGGAAGCUGUGU 967 968 603-621 CACAGCUUCCGUCUGGACA UGUCCAGACGGAAGCUGUG 969 970 604-622 ACAGCUUCCGUCUGGACAC GUGUCCAGACGGAAGCUGU 971 972 605-623 CAGCUUCCGUCUGGACACC GGUGUCCAGACGGAAGCUG 973 974 606-624 AGCUUCCGUCUGGACACCC GGGUGUCCAGACGGAAGCU 975 976 607-625 GCUUCCGUCUGGACACCCC GGGGUGUCCAGACGGAAGC 977 978 608-626 CUUCCGUCUGGACACCCCU AGGGGUGUCCAGACGGAAG 979 980 609-627 UUCCGUCUGGACACCCCUU AAGGGGUGUCCAGACGGAA 981 982 610-628 UCCGUCUGGACACCCCUUG CAAGGGGUGUCCAGACGGA 983 984 611-629 CCGUCUGGACACCCCUUGC GCAAGGGGUGUCCAGACGG 985 986 612-630 CGUCUGGACACCCCUUGCC GGCAAGGGGUGUCCAGACG 987 988 613-631 GUCUGGACACCCCUUGCCU AGGCAAGGGGUGUCCAGAC 989 990 614-632 UCUGGACACCCCUUGCCUG CAGGCAAGGGGUGUCCAGA 991 992 615-633 CUGGACACCCCUUGCCUGC GCAGGCAAGGGGUGUCCAG 993 994 616-634 UGGACACCCCUUGCCUGCC GGCAGGCAAGGGGUGUCCA 995 996 617-635 GGACACCCCUUGCCUGCCA UGGCAGGCAAGGGGUGUCC 997 998 618-636 GACACCCCUUGCCUGCCAC GUGGCAGGCAAGGGGUGUC 999 1000 619-637 ACACCCCUUGCCUGCCACA UGUGGCAGGCAAGGGGUGU 1001 1002 620-638 CACCCCUUGCCUGCCACAA UUGUGGCAGGCAAGGGGUG 1003 1004 621-639 ACCCCUUGCCUGCCACAAG CUUGUGGCAGGCAAGGGGU 1005 1006 622-640 CCCCUUGCCUGCCACAAGC GCUUGUGGCAGGCAAGGGG 1007 1008 623-641 CCCUUGCCUGCCACAAGCC GGCUUGUGGCAGGCAAGGG

1009 1010 624-642 CCUUGCCUGCCACAAGCCA UGGCUUGUGGCAGGCAAGG 1011 1012 625-643 CUUGCCUGCCACAAGCCAG CUGGCUUGUGGCAGGCAAG 1013 1014 626-644 UUGCCUGCCACAAGCCAGG CCUGGCUUGUGGCAGGCAA 1015 1016 627-645 UGCCUGCCACAAGCCAGGG CCCUGGCUUGUGGCAGGCA 1017 1018 628-646 GCCUGCCACAAGCCAGGGC GCCCUGGCUUGUGGCAGGC 1019 1020 629-647 CCUGCCACAAGCCAGGGCA UGCCCUGGCUUGUGGCAGG 1021 1022 630-648 CUGCCACAAGCCAGGGCAC GUGCCCUGGCUUGUGGCAG 1023 1024 631-649 UGCCACAAGCCAGGGCACU AGUGCCCUGGCUUGUGGCA 1025 1026 632-650 GCCACAAGCCAGGGCACUG CAGUGCCCUGGCUUGUGGC 1027 1028 633-651 CCACAAGCCAGGGCACUGC GCAGUGCCCUGGCUUGUGG 1029 1030 634-652 CACAAGCCAGGGCACUGCA UGCAGUGCCCUGGCUUGUG 1031 1032 635-653 ACAAGCCAGGGCACUGCAA UUGCAGUGCCCUGGCUUGU 1033 1034 636-654 CAAGCCAGGGCACUGCAAG CUUGCAGUGCCCUGGCUUG 1035 1036 637-655 AAGCCAGGGCACUGCAAGC GCUUGCAGUGCCCUGGCUU 1037 1038 638-656 AGCCAGGGCACUGCAAGCA UGCUUGCAGUGCCCUGGCU 1039 1040 639-657 GCCAGGGCACUGCAAGCAA UUGCUUGCAGUGCCCUGGC 1041 1042 640-658 CCAGGGCACUGCAAGCAAA UUUGCUUGCAGUGCCCUGG 1043 1044 641-659 CAGGGCACUGCAAGCAAAU AUUUGCUUGCAGUGCCCUG 1045 1046 642-660 AGGGCACUGCAAGCAAAUG CAUUUGCUUGCAGUGCCCU 1047 1048 643-661 GGGCACUGCAAGCAAAUGC GCAUUUGCUUGCAGUGCCC 1049 1050 644-662 GGCACUGCAAGCAAAUGCC GGCAUUUGCUUGCAGUGCC 1051 1052 645-663 GCACUGCAAGCAAAUGCCC GGGCAUUUGCUUGCAGUGC 1053 1054 647-665 ACUGCAAGCAAAUGCCCUU AAGGGCAUUUGCUUGCAGU 1055 1056 648-666 CUGCAAGCAAAUGCCCUUU AAAGGGCAUUUGCUUGCAG 1057 1058 649-667 UGCAAGCAAAUGCCCUUUC GAAAGGGCAUUUGCUUGCA 1059 1060 650-668 GCAAGCAAAUGCCCUUUCC GGAAAGGGCAUUUGCUUGC 1061 1062 651-669 CAAGCAAAUGCCCUUUCCU AGGAAAGGGCAUUUGCUUG 1063 1064 652-670 AAGCAAAUGCCCUUUCCUG CAGGAAAGGGCAUUUGCUU 1065 1066 653-671 AGCAAAUGCCCUUUCCUGG CCAGGAAAGGGCAUUUGCU 1067 1068 654-672 GCAAAUGCCCUUUCCUGGC GCCAGGAAAGGGCAUUUGC 1069 1070 655-673 CAAAUGCCCUUUCCUGGCA UGCCAGGAAAGGGCAUUUG 1071 1072 656-674 AAAUGCCCUUUCCUGGCAG CUGCCAGGAAAGGGCAUUU 1073 1074 657-675 AAUGCCCUUUCCUGGCAGC GCUGCCAGGAAAGGGCAUU 1075 1076 658-676 AUGCCCUUUCCUGGCAGCA UGCUGCCAGGAAAGGGCAU 1077 1078 659-677 UGCCCUUUCCUGGCAGCAC GUGCUGCCAGGAAAGGGCA 1079 1080 660-678 GCCCUUUCCUGGCAGCACA UGUGCUGCCAGGAAAGGGC 1081 1082 661-679 CCCUUUCCUGGCAGCACAG CUGUGCUGCCAGGAAAGGG 1083 1084 662-680 CCUUUCCUGGCAGCACAGA UCUGUGCUGCCAGGAAAGG 1085 1086 663-681 CUUUCCUGGCAGCACAGAU AUCUGUGCUGCCAGGAAAG 1087 1088 664-682 UUUCCUGGCAGCACAGAUG CAUCUGUGCUGCCAGGAAA 1089 1090 665-683 UUCCUGGCAGCACAGAUGA UCAUCUGUGCUGCCAGGAA 1091 1092 666-684 UCCUGGCAGCACAGAUGAA UUCAUCUGUGCUGCCAGGA 1093 1094 667-685 CCUGGCAGCACAGAUGAAU AUUCAUCUGUGCUGCCAGG 1095 1096 668-686 CUGGCAGCACAGAUGAAUC GAUUCAUCUGUGCUGCCAG 1097 1098 670-688 GGCAGCACAGAUGAAUCAG CUGAUUCAUCUGUGCUGCC 1099 1100 672-690 CAGCACAGAUGAAUCAGAG CUCUGAUUCAUCUGUGCUG 1101 1102 692-710 GGCAGCAGUGUCUUCUGCA UGCAGAAGACACUGCUGCC 1103 1104 693-711 GCAGCAGUGUCUUCUGCAA UUGCAGAAGACACUGCUGC 1105 1106 694-712 CAGCAGUGUCUUCUGCAAA UUUGCAGAAGACACUGCUG 1107 1108 695-713 AGCAGUGUCUUCUGCAAAG CUUUGCAGAAGACACUGCU

1109 1110 696-714 GCAGUGUCUUCUGCAAAGC GCUUUGCAGAAGACACUGC 1111 1112 697-715 CAGUGUCUUCUGCAAAGCC GGCUUUGCAGAAGACACUG 1113 1114 698-716 AGUGUCUUCUGCAAAGCCA UGGCUUUGCAGAAGACACU 1115 1116 699-717 GUGUCUUCUGCAAAGCCAG CUGGCUUUGCAGAAGACAC 1117 1118 700-718 UGUCUUCUGCAAAGCCAGU ACUGGCUUUGCAGAAGACA 1119 1120 701-719 GUCUUCUGCAAAGCCAGUC GACUGGCUUUGCAGAAGAC 1121 1122 702-720 UCUUCUGCAAAGCCAGUCU AGACUGGCUUUGCAGAAGA 1123 1124 703-721 CUUCUGCAAAGCCAGUCUU AAGACUGGCUUUGCAGAAG 1125 1126 704-722 UUCUGCAAAGCCAGUCUUG CAAGACUGGCUUUGCAGAA 1127 1128 705-723 UCUGCAAAGCCAGUCUUGA UCAAGACUGGCUUUGCAGA 1129 1130 706-724 CUGCAAAGCCAGUCUUGAG CUCAAGACUGGCUUUGCAG 1131 1132 707-725 UGCAAAGCCAGUCUUGAGC GCUCAAGACUGGCUUUGCA 1133 1134 708-726 GCAAAGCCAGUCUUGAGCU AGCUCAAGACUGGCUUUGC 1135 1136 709-727 CAAAGCCAGUCUUGAGCUU AAGCUCAAGACUGGCUUUG 1137 1138 710-728 AAAGCCAGUCUUGAGCUUC GAAGCUCAAGACUGGCUUU 1139 1140 711-729 AAGCCAGUCUUGAGCUUCA UGAAGCUCAAGACUGGCUU 1141 1142 712-730 AGCCAGUCUUGAGCUUCAG CUGAAGCUCAAGACUGGCU 1143 1144 713-731 GCCAGUCUUGAGCUUCAGG CCUGAAGCUCAAGACUGGC 1145 1146 714-732 CCAGUCUUGAGCUUCAGGA UCCUGAAGCUCAAGACUGG 1147 1148 715-733 CAGUCUUGAGCUUCAGGAG CUCCUGAAGCUCAAGACUG 1149 1150 716-734 AGUCUUGAGCUUCAGGAGG CCUCCUGAAGCUCAAGACU 1151 1152 717-735 GUCUUGAGCUUCAGGAGGA UCCUCCUGAAGCUCAAGAC 1153 1154 718-736 UCUUGAGCUUCAGGAGGAU AUCCUCCUGAAGCUCAAGA 1155 1156 719-737 CUUGAGCUUCAGGAGGAUG CAUCCUCCUGAAGCUCAAG 1157 1158 720-738 UUGAGCUUCAGGAGGAUGU ACAUCCUCCUGAAGCUCAA 1159 1160 721-739 UGAGCUUCAGGAGGAUGUG CACAUCCUCCUGAAGCUCA 1161 1162 722-740 GAGCUUCAGGAGGAUGUGC GCACAUCCUCCUGAAGCUC 1163 1164 723-741 AGCUUCAGGAGGAUGUGCA UGCACAUCCUCCUGAAGCU 1165 1166 724-742 GCUUCAGGAGGAUGUGCAG CUGCACAUCCUCCUGAAGC 1167 1168 725-743 CUUCAGGAGGAUGUGCAGG CCUGCACAUCCUCCUGAAG 1169 1170 726-744 UUCAGGAGGAUGUGCAGGA UCCUGCACAUCCUCCUGAA 1171 1172 727-745 UCAGGAGGAUGUGCAGGAA UUCCUGCACAUCCUCCUGA 1173 1174 728-746 CAGGAGGAUGUGCAGGAAA UUUCCUGCACAUCCUCCUG 1175 1176 729-747 AGGAGGAUGUGCAGGAAAU AUUUCCUGCACAUCCUCCU 1177 1178 730-748 GGAGGAUGUGCAGGAAAUG CAUUUCCUGCACAUCCUCC 1179 1180 731-749 GAGGAUGUGCAGGAAAUGA UCAUUUCCUGCACAUCCUC 1181 1182 732-750 AGGAUGUGCAGGAAAUGAA UUCAUUUCCUGCACAUCCU 1183 1184 733-751 GGAUGUGCAGGAAAUGAAU AUUCAUUUCCUGCACAUCC 1185 1186 734-752 GAUGUGCAGGAAAUGAAUG CAUUCAUUUCCUGCACAUC 1187 1188 735-753 AUGUGCAGGAAAUGAAUGC GCAUUCAUUUCCUGCACAU 1189 1190 755-773 GUGAGGAAAGAGGUUGCUG CAGCAACCUCUUUCCUCAC 1191 1192 756-774 UGAGGAAAGAGGUUGCUGA UCAGCAACCUCUUUCCUCA 1193 1194 757-775 GAGGAAAGAGGUUGCUGAA UUCAGCAACCUCUUUCCUC 1195 1196 758-776 AGGAAAGAGGUUGCUGAAA UUUCAGCAACCUCUUUCCU 1197 1198 759-777 GGAAAGAGGUUGCUGAAAC GUUUCAGCAACCUCUUUCC 1199 1200 760-778 GAAAGAGGUUGCUGAAACC GGUUUCAGCAACCUCUUUC 1201 1202 761-779 AAAGAGGUUGCUGAAACCU AGGUUUCAGCAACCUCUUU 1203 1204 762-780 AAGAGGUUGCUGAAACCUC GAGGUUUCAGCAACCUCUU 1205 1206 763-781 AGAGGUUGCUGAAACCUCA UGAGGUUUCAGCAACCUCU 1207 1208 764-782 GAGGUUGCUGAAACCUCAG CUGAGGUUUCAGCAACCUC

1209 1210 765-783 AGGUUGCUGAAACCUCAGC GCUGAGGUUUCAGCAACCU 1211 1212 766-784 GGUUGCUGAAACCUCAGCA UGCUGAGGUUUCAGCAACC 1213 1214 787-805 CCCCAGUGUGGUUAGUGUG CACACUAACCACACUGGGG 1215 1216 791-809 AGUGUGGUUAGUGUGAAAA UUUUCACACUAACCACACU 1217 1218 792-810 GUGUGGUUAGUGUGAAAAC GUUUUCACACUAACCACAC 1219 1220 812-830 GAUGGAGGGGAUCCCAGUG CACUGGGAUCCCCUCCAUC 1221 1222 813-831 AUGGAGGGGAUCCCAGUGG CCACUGGGAUCCCCUCCAU 1223 1224 833-851 CUGCUGAAGAACUUCCAGG CCUGGAAGUUCUUCAGCAG 1225 1226 834-852 UGCUGAAGAACUUCCAGGA UCCUGGAAGUUCUUCAGCA 1227 1228 835-853 GCUGAAGAACUUCCAGGAC GUCCUGGAAGUUCUUCAGC 1229 1230 836-854 CUGAAGAACUUCCAGGACA UGUCCUGGAAGUUCUUCAG 1231 1232 837-855 UGAAGAACUUCCAGGACAU AUGUCCUGGAAGUUCUUCA 1233 1234 838-856 GAAGAACUUCCAGGACAUC GAUGUCCUGGAAGUUCUUC 1235 1236 839-857 AAGAACUUCCAGGACAUCA UGAUGUCCUGGAAGUUCUU 1237 1238 840-858 AGAACUUCCAGGACAUCAU AUGAUGUCCUGGAAGUUCU 1239 1240 841-859 GAACUUCCAGGACAUCAUG CAUGAUGUCCUGGAAGUUC 1241 1242 842-860 AACUUCCAGGACAUCAUGC GCAUGAUGUCCUGGAAGUU 1243 1244 843-861 ACUUCCAGGACAUCAUGCA UGCAUGAUGUCCUGGAAGU 1245 1246 844-862 CUUCCAGGACAUCAUGCAA UUGCAUGAUGUCCUGGAAG 1247 1248 845-863 UUCCAGGACAUCAUGCAAA UUUGCAUGAUGUCCUGGAA 1249 1250 846-864 UCCAGGACAUCAUGCAAAA UUUUGCAUGAUGUCCUGGA 1251 1252 847-865 CCAGGACAUCAUGCAAAAG CUUUUGCAUGAUGUCCUGG 1253 1254 848-866 CAGGACAUCAUGCAAAAGC GCUUUUGCAUGAUGUCCUG 1255 1256 849-867 AGGACAUCAUGCAAAAGCA UGCUUUUGCAUGAUGUCCU 1257 1258 850-868 GGACAUCAUGCAAAAGCAA UUGCUUUUGCAUGAUGUCC 1259 1260 851-869 GACAUCAUGCAAAAGCAAA UUUGCUUUUGCAUGAUGUC 1261 1262 852-870 ACAUCAUGCAAAAGCAAAG CUUUGCUUUUGCAUGAUGU 1263 1264 854-872 AUCAUGCAAAAGCAAAGAC GUCUUUGCUUUUGCAUGAU 1265 1266 855-873 UCAUGCAAAAGCAAAGACC GGUCUUUGCUUUUGCAUGA 1267 1268 856-874 CAUGCAAAAGCAAAGACCA UGGUCUUUGCUUUUGCAUG 1269 1270 857-875 AUGCAAAAGCAAAGACCAG CUGGUCUUUGCUUUUGCAU 1271 1272 858-876 UGCAAAAGCAAAGACCAGA UCUGGUCUUUGCUUUUGCA 1273 1274 859-877 GCAAAAGCAAAGACCAGAA UUCUGGUCUUUGCUUUUGC 1275 1276 860-878 CAAAAGCAAAGACCAGAAA UUUCUGGUCUUUGCUUUUG 1277 1278 861-879 AAAAGCAAAGACCAGAAAG CUUUCUGGUCUUUGCUUUU 1279 1280 862-880 AAAGCAAAGACCAGAAAGA UCUUUCUGGUCUUUGCUUU 1281 1282 863-881 AAGCAAAGACCAGAAAGAG CUCUUUCUGGUCUUUGCUU 1283 1284 864-882 AGCAAAGACCAGAAAGAGU ACUCUUUCUGGUCUUUGCU 1285 1286 865-883 GCAAAGACCAGAAAGAGUG CACUCUUUCUGGUCUUUGC 1287 1288 867-885 AAAGACCAGAAAGAGUGUC GACACUCUUUCUGGUCUUU 1289 1290 868-886 AAGACCAGAAAGAGUGUCU AGACACUCUUUCUGGUCUU 1291 1292 869-887 AGACCAGAAAGAGUGUCUC GAGACACUCUUUCUGGUCU 1293 1294 870-888 GACCAGAAAGAGUGUCUCA UGAGACACUCUUUCUGGUC 1295 1296 871-889 ACCAGAAAGAGUGUCUCAU AUGAGACACUCUUUCUGGU 1297 1298 872-890 CCAGAAAGAGUGUCUCAUC GAUGAGACACUCUUUCUGG 1299 1300 875-893 GAAAGAGUGUCUCAUCUUC GAAGAUGAGACACUCUUUC 1301 1302 878-896 AGAGUGUCUCAUCUUCUUC GAAGAAGAUGAGACACUCU 1303 1304 879-897 GAGUGUCUCAUCUUCUUCA UGAAGAAGAUGAGACACUC 1305 1306 880-898 AGUGUCUCAUCUUCUUCAA UUGAAGAAGAUGAGACACU 1307 1308 881-899 GUGUCUCAUCUUCUUCAAG CUUGAAGAAGAUGAGACAC

1309 1310 882-900 UGUCUCAUCUUCUUCAAGA UCUUGAAGAAGAUGAGACA 1311 1312 883-901 GUCUCAUCUUCUUCAAGAU AUCUUGAAGAAGAUGAGAC 1313 1314 884-902 UCUCAUCUUCUUCAAGAUA UAUCUUGAAGAAGAUGAGA 1315 1316 886-904 UCAUCUUCUUCAAGAUAAC GUUAUCUUGAAGAAGAUGA 1317 1318 887-905 CAUCUUCUUCAAGAUAACU AGUUAUCUUGAAGAAGAUG 1319 1320 888-906 AUCUUCUUCAAGAUAACUU AAGUUAUCUUGAAGAAGAU 1321 1322 889-907 UCUUCUUCAAGAUAACUUG CAAGUUAUCUUGAAGAAGA 1323 1324 890-908 CUUCUUCAAGAUAACUUGC GCAAGUUAUCUUGAAGAAG 1325 1326 891-909 UUCUUCAAGAUAACUUGCC GGCAAGUUAUCUUGAAGAA 1327 1328 892-910 UCUUCAAGAUAACUUGCCA UGGCAAGUUAUCUUGAAGA 1329 1330 893-911 CUUCAAGAUAACUUGCCAA UUGGCAAGUUAUCUUGAAG 1331 1332 894-912 UUCAAGAUAACUUGCCAAA UUUGGCAAGUUAUCUUGAA 1333 1334 895-913 UCAAGAUAACUUGCCAAAA UUUUGGCAAGUUAUCUUGA 1335 1336 896-914 CAAGAUAACUUGCCAAAAU AUUUUGGCAAGUUAUCUUG 1337 1338 897-915 AAGAUAACUUGCCAAAAUC GAUUUUGGCAAGUUAUCUU 1339 1340 898-916 AGAUAACUUGCCAAAAUCU AGAUUUUGGCAAGUUAUCU 1341 1342 899-917 GAUAACUUGCCAAAAUCUG CAGAUUUUGGCAAGUUAUC 1343 1344 900-918 AUAACUUGCCAAAAUCUGU ACAGAUUUUGGCAAGUUAU 1345 1346 901-919 UAACUUGCCAAAAUCUGUU AACAGAUUUUGGCAAGUUA 1347 1348 902-920 AACUUGCCAAAAUCUGUUU AAACAGAUUUUGGCAAGUU 1349 1350 903-921 ACUUGCCAAAAUCUGUUUC GAAACAGAUUUUGGCAAGU 1351 1352 904-922 CUUGCCAAAAUCUGUUUCC GGAAACAGAUUUUGGCAAG 1353 1354 905-923 UUGCCAAAAUCUGUUUCCA UGGAAACAGAUUUUGGCAA 1355 1356 906-924 UGCCAAAAUCUGUUUCCAC GUGGAAACAGAUUUUGGCA 1357 1358 907-925 GCCAAAAUCUGUUUCCACU AGUGGAAACAGAUUUUGGC 1359 1360 908-926 CCAAAAUCUGUUUCCACUU AAGUGGAAACAGAUUUUGG 1361 1362 909-927 CAAAAUCUGUUUCCACUUU AAAGUGGAAACAGAUUUUG 1363 1364 910-928 AAAAUCUGUUUCCACUUUU AAAAGUGGAAACAGAUUUU 1365 1366 911-929 AAAUCUGUUUCCACUUUUC GAAAAGUGGAAACAGAUUU 1367 1368 912-930 AAUCUGUUUCCACUUUUCA UGAAAAGUGGAAACAGAUU 1369 1370 913-931 AUCUGUUUCCACUUUUCAG CUGAAAAGUGGAAACAGAU 1371 1372 916-934 UGUUUCCACUUUUCAGUAU AUACUGAAAAGUGGAAACA 1373 1374 917-935 GUUUCCACUUUUCAGUAUG CAUACUGAAAAGUGGAAAC 1375 1376 918-936 UUUCCACUUUUCAGUAUGA UCAUACUGAAAAGUGGAAA 1377 1378 919-937 UUCCACUUUUCAGUAUGAU AUCAUACUGAAAAGUGGAA 1379 1380 920-938 UCCACUUUUCAGUAUGAUC GAUCAUACUGAAAAGUGGA 1381 1382 921-939 CCACUUUUCAGUAUGAUCG CGAUCAUACUGAAAAGUGG 1383 1384 925-943 UUUUCAGUAUGAUCGUUUC GAAACGAUCAUACUGAAAA 1385 1386 929-947 CAGUAUGAUCGUUUCUUUG CAAAGAAACGAUCAUACUG 1387 1388 930-948 AGUAUGAUCGUUUCUUUGA UCAAAGAAACGAUCAUACU 1389 1390 931-949 GUAUGAUCGUUUCUUUGAG CUCAAAGAAACGAUCAUAC 1391 1392 933-951 AUGAUCGUUUCUUUGAGAA UUCUCAAAGAAACGAUCAU 1393 1394 934-952 UGAUCGUUUCUUUGAGAAA UUUCUCAAAGAAACGAUCA 1395 1396 936-954 AUCGUUUCUUUGAGAAAAA UUUUUCUCAAAGAAACGAU 1397 1398 937-955 UCGUUUCUUUGAGAAAAAA UUUUUUCUCAAAGAAACGA 1399 1400 938-956 CGUUUCUUUGAGAAAAAAA UUUUUUUCUCAAAGAAACG 1401 1402 939-957 GUUUCUUUGAGAAAAAAAU AUUUUUUUCUCAAAGAAAC 1403 1404 940-958 UUUCUUUGAGAAAAAAAUU AAUUUUUUUCUCAAAGAAA 1405 1406 941-959 UUCUUUGAGAAAAAAAUUG CAAUUUUUUUCUCAAAGAA 1407 1408 942-960 UCUUUGAGAAAAAAAUUGA UCAAUUUUUUUCUCAAAGA

1409 1410 943-961 CUUUGAGAAAAAAAUUGAU AUCAAUUUUUUUCUCAAAG 1411 1412 944-962 UUUGAGAAAAAAAUUGAUG CAUCAAUUUUUUUCUCAAA 1413 1414 945-963 UUGAGAAAAAAAUUGAUGA UCAUCAAUUUUUUUCUCAA 1415 1416 946-964 UGAGAAAAAAAUUGAUGAG CUCAUCAAUUUUUUUCUCA 1417 1418 947-965 GAGAAAAAAAUUGAUGAGA UCUCAUCAAUUUUUUUCUC 1419 1420 948-966 AGAAAAAAAUUGAUGAGAA UUCUCAUCAAUUUUUUUCU 1421 1422 949-967 GAAAAAAAUUGAUGAGAAA UUUCUCAUCAAUUUUUUUC 1423 1424 950-968 AAAAAAAUUGAUGAGAAAA UUUUCUCAUCAAUUUUUUU 1425 1426 951-969 AAAAAAUUGAUGAGAAAAA UUUUUCUCAUCAAUUUUUU 1427 1428 952-970 AAAAAUUGAUGAGAAAAAG CUUUUUCUCAUCAAUUUUU 1429 1430 953-971 AAAAUUGAUGAGAAAAAGA UCUUUUUCUCAUCAAUUUU 1431 1432 954-972 AAAUUGAUGAGAAAAAGAA UUCUUUUUCUCAUCAAUUU 1433 1434 955-973 AAUUGAUGAGAAAAAGAAU AUUCUUUUUCUCAUCAAUU 1435 1436 956-974 AUUGAUGAGAAAAAGAAUG CAUUCUUUUUCUCAUCAAU 1437 1438 957-975 UUGAUGAGAAAAAGAAUGA UCAUUCUUUUUCUCAUCAA 1439 1440 958-976 UGAUGAGAAAAAGAAUGAC GUCAUUCUUUUUCUCAUCA 1441 1442 959-977 GAUGAGAAAAAGAAUGACC GGUCAUUCUUUUUCUCAUC 1443 1444 960-978 AUGAGAAAAAGAAUGACCA UGGUCAUUCUUUUUCUCAU 1445 1446 961-979 UGAGAAAAAGAAUGACCAC GUGGUCAUUCUUUUUCUCA 1447 1448 962-980 GAGAAAAAGAAUGACCACA UGUGGUCAUUCUUUUUCUC 1449 1450 963-981 AGAAAAAGAAUGACCACAC GUGUGGUCAUUCUUUUUCU 1451 1452 964-982 GAAAAAGAAUGACCACACC GGUGUGGUCAUUCUUUUUC 1453 1454 965-983 AAAAAGAAUGACCACACCU AGGUGUGGUCAUUCUUUUU 1455 1456 966-984 AAAAGAAUGACCACACCUA UAGGUGUGGUCAUUCUUUU 1457 1458 967-985 AAAGAAUGACCACACCUAU AUAGGUGUGGUCAUUCUUU 1459 1460 968-986 AAGAAUGACCACACCUAUC GAUAGGUGUGGUCAUUCUU 1461 1462 969-987 AGAAUGACCACACCUAUCG CGAUAGGUGUGGUCAUUCU 1463 1464 970-988 GAAUGACCACACCUAUCGA UCGAUAGGUGUGGUCAUUC 1465 1466 971-989 AAUGACCACACCUAUCGAG CUCGAUAGGUGUGGUCAUU 1467 1468 972-990 AUGACCACACCUAUCGAGU ACUCGAUAGGUGUGGUCAU 1469 1470 976-994 CCACACCUAUCGAGUUUUU AAAAACUCGAUAGGUGUGG 1471 1472 977-995 CACACCUAUCGAGUUUUUA UAAAAACUCGAUAGGUGUG 1473 1474 978-996 ACACCUAUCGAGUUUUUAA UUAAAAACUCGAUAGGUGU 1475 1476 979-997 CACCUAUCGAGUUUUUAAA UUUAAAAACUCGAUAGGUG 1477 1478 980-998 ACCUAUCGAGUUUUUAAAA UUUUAAAAACUCGAUAGGU 1479 1480 981-999 CCUAUCGAGUUUUUAAAAC GUUUUAAAAACUCGAUAGG 1481 1482 982-1000 CUAUCGAGUUUUUAAAACU AGUUUUAAAAACUCGAUAG 1483 1484 983-1001 UAUCGAGUUUUUAAAACUG CAGUUUUAAAAACUCGAUA 1485 1486 984-1002 AUCGAGUUUUUAAAACUGU ACAGUUUUAAAAACUCGAU 1487 1488 985-1003 UCGAGUUUUUAAAACUGUG CACAGUUUUAAAAACUCGA 1489 1490 986-1004 CGAGUUUUUAAAACUGUGA UCACAGUUUUAAAAACUCG 1491 1492 987-1005 GAGUUUUUAAAACUGUGAA UUCACAGUUUUAAAAACUC 1493 1494 988-1006 AGUUUUUAAAACUGUGAAC GUUCACAGUUUUAAAAACU 1495 1496 989-1007 GUUUUUAAAACUGUGAACC GGUUCACAGUUUUAAAAAC 1497 1498 990-1008 UUUUUAAAACUGUGAACCG CGGUUCACAGUUUUAAAAA 1499 1500 991-1009 UUUUAAAACUGUGAACCGG CCGGUUCACAGUUUUAAAA 1501 1502 992-1010 UUUAAAACUGUGAACCGGC GCCGGUUCACAGUUUUAAA 1503 1504 993-1011 UUAAAACUGUGAACCGGCG CGCCGGUUCACAGUUUUAA 1505 1506 994-1012 UAAAACUGUGAACCGGCGA UCGCCGGUUCACAGUUUUA 1507 1508 995-1013 AAAACUGUGAACCGGCGAG CUCGCCGGUUCACAGUUUU

1509 1510 996-1014 AAACUGUGAACCGGCGAGC GCUCGCCGGUUCACAGUUU 1511 1512 997-1015 AACUGUGAACCGGCGAGCA UGCUCGCCGGUUCACAGUU 1513 1514 998-1016 ACUGUGAACCGGCGAGCAC GUGCUCGCCGGUUCACAGU 1515 1516 999-1017 CUGUGAACCGGCGAGCACA UGUGCUCGCCGGUUCACAG 1517 1518 1000-1018 UGUGAACCGGCGAGCACAC GUGUGCUCGCCGGUUCACA 1519 1520 1001-1019 GUGAACCGGCGAGCACACA UGUGUGCUCGCCGGUUCAC 1521 1522 1002-1020 UGAACCGGCGAGCACACAU AUGUGUGCUCGCCGGUUCA 1523 1524 1003-1021 GAACCGGCGAGCACACAUC GAUGUGUGCUCGCCGGUUC 1525 1526 1004-1022 AACCGGCGAGCACACAUCU AGAUGUGUGCUCGCCGGUU 1527 1528 1005-1023 ACCGGCGAGCACACAUCUU AAGAUGUGUGCUCGCCGGU 1529 1530 1006-1024 CCGGCGAGCACACAUCUUC GAAGAUGUGUGCUCGCCGG 1531 1532 1007-1025 CGGCGAGCACACAUCUUCC GGAAGAUGUGUGCUCGCCG 1533 1534 1008-1026 GGCGAGCACACAUCUUCCC GGGAAGAUGUGUGCUCGCC 1535 1536 1028-1046 AUGGCAGAUGACUAUUCAG CUGAAUAGUCAUCUGCCAU 1537 1538 1030-1048 GGCAGAUGACUAUUCAGAC GUCUGAAUAGUCAUCUGCC 1539 1540 1031-1049 GCAGAUGACUAUUCAGACU AGUCUGAAUAGUCAUCUGC 1541 1542 1032-1050 CAGAUGACUAUUCAGACUC GAGUCUGAAUAGUCAUCUG 1543 1544 1033-1051 AGAUGACUAUUCAGACUCC GGAGUCUGAAUAGUCAUCU 1545 1546 1034-1052 GAUGACUAUUCAGACUCCC GGGAGUCUGAAUAGUCAUC 1547 1548 1035-1053 AUGACUAUUCAGACUCCCU AGGGAGUCUGAAUAGUCAU 1549 1550 1036-1054 UGACUAUUCAGACUCCCUC GAGGGAGUCUGAAUAGUCA 1551 1552 1037-1055 GACUAUUCAGACUCCCUCA UGAGGGAGUCUGAAUAGUC 1553 1554 1038-1056 ACUAUUCAGACUCCCUCAU AUGAGGGAGUCUGAAUAGU 1555 1556 1039-1057 CUAUUCAGACUCCCUCAUC GAUGAGGGAGUCUGAAUAG 1557 1558 1040-1058 UAUUCAGACUCCCUCAUCA UGAUGAGGGAGUCUGAAUA 1559 1560 1041-1059 AUUCAGACUCCCUCAUCAC GUGAUGAGGGAGUCUGAAU 1561 1562 1042-1060 UUCAGACUCCCUCAUCACC GGUGAUGAGGGAGUCUGAA 1563 1564 1043-1061 UCAGACUCCCUCAUCACCA UGGUGAUGAGGGAGUCUGA 1565 1566 1044-1062 CAGACUCCCUCAUCACCAA UUGGUGAUGAGGGAGUCUG 1567 1568 1045-1063 AGACUCCCUCAUCACCAAA UUUGGUGAUGAGGGAGUCU 1569 1570 1046-1064 GACUCCCUCAUCACCAAAA UUUUGGUGAUGAGGGAGUC 1571 1572 1047-1065 ACUCCCUCAUCACCAAAAA UUUUUGGUGAUGAGGGAGU 1573 1574 1048-1066 CUCCCUCAUCACCAAAAAG CUUUUUGGUGAUGAGGGAG 1575 1576 1049-1067 UCCCUCAUCACCAAAAAGC GCUUUUUGGUGAUGAGGGA 1577 1578 1050-1068 CCCUCAUCACCAAAAAGCA UGCUUUUUGGUGAUGAGGG 1579 1580 1070-1088 GUGUCAGUCUGGUGCAGUA UACUGCACCAGACUGACAC 1581 1582 1071-1089 UGUCAGUCUGGUGCAGUAA UUACUGCACCAGACUGACA 1583 1584 1072-1090 GUCAGUCUGGUGCAGUAAU AUUACUGCACCAGACUGAC 1585 1586 1073-1091 UCAGUCUGGUGCAGUAAUG CAUUACUGCACCAGACUGA 1587 1588 1074-1092 CAGUCUGGUGCAGUAAUGA UCAUUACUGCACCAGACUG 1589 1590 1075-1093 AGUCUGGUGCAGUAAUGAC GUCAUUACUGCACCAGACU 1591 1592 1078-1096 CUGGUGCAGUAAUGACUAC GUAGUCAUUACUGCACCAG 1593 1594 1079-1097 UGGUGCAGUAAUGACUACC GGUAGUCAUUACUGCACCA 1595 1596 1081-1099 GUGCAGUAAUGACUACCUA UAGGUAGUCAUUACUGCAC 1597 1598 1082-1100 UGCAGUAAUGACUACCUAG CUAGGUAGUCAUUACUGCA 1599 1600 1083-1101 GCAGUAAUGACUACCUAGG CCUAGGUAGUCAUUACUGC 1601 1602 1084-1102 CAGUAAUGACUACCUAGGA UCCUAGGUAGUCAUUACUG 1603 1604 1085-1103 AGUAAUGACUACCUAGGAA UUCCUAGGUAGUCAUUACU 1605 1606 1086-1104 GUAAUGACUACCUAGGAAU AUUCCUAGGUAGUCAUUAC 1607 1608 1087-1105 UAAUGACUACCUAGGAAUG CAUUCCUAGGUAGUCAUUA

1609 1610 1088-1106 AAUGACUACCUAGGAAUGA UCAUUCCUAGGUAGUCAUU 1611 1612 1089-1107 AUGACUACCUAGGAAUGAG CUCAUUCCUAGGUAGUCAU 1613 1614 1090-1108 UGACUACCUAGGAAUGAGU ACUCAUUCCUAGGUAGUCA 1615 1616 1091-1109 GACUACCUAGGAAUGAGUC GACUCAUUCCUAGGUAGUC 1617 1618 1092-1110 ACUACCUAGGAAUGAGUCG CGACUCAUUCCUAGGUAGU 1619 1620 1093-1111 CUACCUAGGAAUGAGUCGC GCGACUCAUUCCUAGGUAG 1621 1622 1094-1112 UACCUAGGAAUGAGUCGCC GGCGACUCAUUCCUAGGUA 1623 1624 1095-1113 ACCUAGGAAUGAGUCGCCA UGGCGACUCAUUCCUAGGU 1625 1626 1096-1114 CCUAGGAAUGAGUCGCCAC GUGGCGACUCAUUCCUAGG 1627 1628 1097-1115 CUAGGAAUGAGUCGCCACC GGUGGCGACUCAUUCCUAG 1629 1630 1098-1116 UAGGAAUGAGUCGCCACCC GGGUGGCGACUCAUUCCUA 1631 1632 1099-1117 AGGAAUGAGUCGCCACCCA UGGGUGGCGACUCAUUCCU 1633 1634 1100-1118 GGAAUGAGUCGCCACCCAC GUGGGUGGCGACUCAUUCC 1635 1636 1101-1119 GAAUGAGUCGCCACCCACG CGUGGGUGGCGACUCAUUC 1637 1638 1102-1120 AAUGAGUCGCCACCCACGG CCGUGGGUGGCGACUCAUU 1639 1640 1103-1121 AUGAGUCGCCACCCACGGG CCCGUGGGUGGCGACUCAU 1641 1642 1104-1122 UGAGUCGCCACCCACGGGU ACCCGUGGGUGGCGACUCA 1643 1644 1105-1123 GAGUCGCCACCCACGGGUG CACCCGUGGGUGGCGACUC 1645 1646 1106-1124 AGUCGCCACCCACGGGUGU ACACCCGUGGGUGGCGACU 1647 1648 1107-1125 GUCGCCACCCACGGGUGUG CACACCCGUGGGUGGCGAC 1649 1650 1108-1126 UCGCCACCCACGGGUGUGU ACACACCCGUGGGUGGCGA 1651 1652 1109-1127 CGCCACCCACGGGUGUGUG CACACACCCGUGGGUGGCG 1653 1654 1110-1128 GCCACCCACGGGUGUGUGG CCACACACCCGUGGGUGGC 1655 1656 1111-1129 CCACCCACGGGUGUGUGGG CCCACACACCCGUGGGUGG 1657 1658 1112-1130 CACCCACGGGUGUGUGGGG CCCCACACACCCGUGGGUG 1659 1660 1113-1131 ACCCACGGGUGUGUGGGGC GCCCCACACACCCGUGGGU 1661 1662 1114-1132 CCCACGGGUGUGUGGGGCA UGCCCCACACACCCGUGGG 1663 1664 1115-1133 CCACGGGUGUGUGGGGCAG CUGCCCCACACACCCGUGG 1665 1666 1116-1134 CACGGGUGUGUGGGGCAGU ACUGCCCCACACACCCGUG 1667 1668 1117-1135 ACGGGUGUGUGGGGCAGUU AACUGCCCCACACACCCGU 1669 1670 1118-1136 CGGGUGUGUGGGGCAGUUA UAACUGCCCCACACACCCG 1671 1672 1119-1137 GGGUGUGUGGGGCAGUUAU AUAACUGCCCCACACACCC 1673 1674 1120-1138 GGUGUGUGGGGCAGUUAUG CAUAACUGCCCCACACACC 1675 1676 1121-1139 GUGUGUGGGGCAGUUAUGG CCAUAACUGCCCCACACAC 1677 1678 1122-1140 UGUGUGGGGCAGUUAUGGA UCCAUAACUGCCCCACACA 1679 1680 1123-1141 GUGUGGGGCAGUUAUGGAC GUCCAUAACUGCCCCACAC 1681 1682 1125-1143 GUGGGGCAGUUAUGGACAC GUGUCCAUAACUGCCCCAC 1683 1684 1126-1144 UGGGGCAGUUAUGGACACU AGUGUCCAUAACUGCCCCA 1685 1686 1128-1146 GGGCAGUUAUGGACACUUU AAAGUGUCCAUAACUGCCC 1687 1688 1129-1147 GGCAGUUAUGGACACUUUG CAAAGUGUCCAUAACUGCC 1689 1690 1130-1148 GCAGUUAUGGACACUUUGA UCAAAGUGUCCAUAACUGC 1691 1692 1131-1149 CAGUUAUGGACACUUUGAA UUCAAAGUGUCCAUAACUG 1693 1694 1132-1150 AGUUAUGGACACUUUGAAA UUUCAAAGUGUCCAUAACU 1695 1696 1133-1151 GUUAUGGACACUUUGAAAC GUUUCAAAGUGUCCAUAAC 1697 1698 1134-1152 UUAUGGACACUUUGAAACA UGUUUCAAAGUGUCCAUAA 1699 1700 1135-1153 UAUGGACACUUUGAAACAA UUGUUUCAAAGUGUCCAUA 1701 1702 1136-1154 AUGGACACUUUGAAACAAC GUUGUUUCAAAGUGUCCAU 1703 1704 1139-1157 GACACUUUGAAACAACAUG CAUGUUGUUUCAAAGUGUC 1705 1706 1140-1158 ACACUUUGAAACAACAUGG CCAUGUUGUUUCAAAGUGU 1707 1708 1141-1159 CACUUUGAAACAACAUGGU ACCAUGUUGUUUCAAAGUG

1709 1710 1142-1160 ACUUUGAAACAACAUGGUG CACCAUGUUGUUUCAAAGU 1711 1712 1143-1161 CUUUGAAACAACAUGGUGC GCACCAUGUUGUUUCAAAG 1713 1714 1144-1162 UUUGAAACAACAUGGUGCU AGCACCAUGUUGUUUCAAA 1715 1716 1145-1163 UUGAAACAACAUGGUGCUG CAGCACCAUGUUGUUUCAA 1717 1718 1146-1164 UGAAACAACAUGGUGCUGG CCAGCACCAUGUUGUUUCA 1719 1720 1147-1165 GAAACAACAUGGUGCUGGG CCCAGCACCAUGUUGUUUC 1721 1722 1148-1166 AAACAACAUGGUGCUGGGG CCCCAGCACCAUGUUGUUU 1723 1724 1149-1167 AACAACAUGGUGCUGGGGC GCCCCAGCACCAUGUUGUU 1725 1726 1150-1168 ACAACAUGGUGCUGGGGCA UGCCCCAGCACCAUGUUGU 1727 1728 1151-1169 CAACAUGGUGCUGGGGCAG CUGCCCCAGCACCAUGUUG 1729 1730 1152-1170 AACAUGGUGCUGGGGCAGG CCUGCCCCAGCACCAUGUU 1731 1732 1153-1171 ACAUGGUGCUGGGGCAGGU ACCUGCCCCAGCACCAUGU 1733 1734 1154-1172 CAUGGUGCUGGGGCAGGUG CACCUGCCCCAGCACCAUG 1735 1736 1155-1173 AUGGUGCUGGGGCAGGUGG CCACCUGCCCCAGCACCAU 1737 1738 1156-1174 UGGUGCUGGGGCAGGUGGU ACCACCUGCCCCAGCACCA 1739 1740 1157-1175 GGUGCUGGGGCAGGUGGUA UACCACCUGCCCCAGCACC 1741 1742 1158-1176 GUGCUGGGGCAGGUGGUAC GUACCACCUGCCCCAGCAC 1743 1744 1159-1177 UGCUGGGGCAGGUGGUACU AGUACCACCUGCCCCAGCA 1745 1746 1160-1178 GCUGGGGCAGGUGGUACUA UAGUACCACCUGCCCCAGC 1747 1748 1161-1179 CUGGGGCAGGUGGUACUAG CUAGUACCACCUGCCCCAG 1749 1750 1162-1180 UGGGGCAGGUGGUACUAGA UCUAGUACCACCUGCCCCA 1751 1752 1166-1184 GCAGGUGGUACUAGAAAUA UAUUUCUAGUACCACCUGC 1753 1754 1167-1185 CAGGUGGUACUAGAAAUAU AUAUUUCUAGUACCACCUG 1755 1756 1168-1186 AGGUGGUACUAGAAAUAUU AAUAUUUCUAGUACCACCU 1757 1758 1169-1187 GGUGGUACUAGAAAUAUUU AAAUAUUUCUAGUACCACC 1759 1760 1170-1188 GUGGUACUAGAAAUAUUUC GAAAUAUUUCUAGUACCAC 1761 1762 1171-1189 UGGUACUAGAAAUAUUUCU AGAAAUAUUUCUAGUACCA 1763 1764 1172-1190 GGUACUAGAAAUAUUUCUG CAGAAAUAUUUCUAGUACC 1765 1766 1173-1191 GUACUAGAAAUAUUUCUGG CCAGAAAUAUUUCUAGUAC 1767 1768 1174-1192 UACUAGAAAUAUUUCUGGA UCCAGAAAUAUUUCUAGUA 1769 1770 1175-1193 ACUAGAAAUAUUUCUGGAA UUCCAGAAAUAUUUCUAGU 1771 1772 1176-1194 CUAGAAAUAUUUCUGGAAC GUUCCAGAAAUAUUUCUAG 1773 1774 1177-1195 UAGAAAUAUUUCUGGAACU AGUUCCAGAAAUAUUUCUA 1775 1776 1178-1196 AGAAAUAUUUCUGGAACUA UAGUUCCAGAAAUAUUUCU 1777 1778 1179-1197 GAAAUAUUUCUGGAACUAG CUAGUUCCAGAAAUAUUUC 1779 1780 1180-1198 AAAUAUUUCUGGAACUAGU ACUAGUUCCAGAAAUAUUU 1781 1782 1181-1199 AAUAUUUCUGGAACUAGUA UACUAGUUCCAGAAAUAUU 1783 1784 1183-1201 UAUUUCUGGAACUAGUAAA UUUACUAGUUCCAGAAAUA 1785 1786 1186-1204 UUCUGGAACUAGUAAAUUC GAAUUUACUAGUUCCAGAA 1787 1788 1187-1205 UCUGGAACUAGUAAAUUCC GGAAUUUACUAGUUCCAGA 1789 1790 1189-1207 UGGAACUAGUAAAUUCCAU AUGGAAUUUACUAGUUCCA 1791 1792 1190-1208 GGAACUAGUAAAUUCCAUG CAUGGAAUUUACUAGUUCC 1793 1794 1192-1210 AACUAGUAAAUUCCAUGUG CACAUGGAAUUUACUAGUU 1795 1796 1193-1211 ACUAGUAAAUUCCAUGUGG CCACAUGGAAUUUACUAGU 1797 1798 1194-1212 CUAGUAAAUUCCAUGUGGA UCCACAUGGAAUUUACUAG 1799 1800 1195-1213 UAGUAAAUUCCAUGUGGAC GUCCACAUGGAAUUUACUA 1801 1802 1196-1214 AGUAAAUUCCAUGUGGACU AGUCCACAUGGAAUUUACU 1803 1804 1197-1215 GUAAAUUCCAUGUGGACUU AAGUCCACAUGGAAUUUAC 1805 1806 1198-1216 UAAAUUCCAUGUGGACUUA UAAGUCCACAUGGAAUUUA 1807 1808 1199-1217 AAAUUCCAUGUGGACUUAG CUAAGUCCACAUGGAAUUU

1809 1810 1200-1218 AAUUCCAUGUGGACUUAGA UCUAAGUCCACAUGGAAUU 1811 1812 1201-1219 AUUCCAUGUGGACUUAGAG CUCUAAGUCCACAUGGAAU 1813 1814 1202-1220 UUCCAUGUGGACUUAGAGC GCUCUAAGUCCACAUGGAA 1815 1816 1222-1240 GGAGCUGGCAGACCUCCAU AUGGAGGUCUGCCAGCUCC 1817 1818 1223-1241 GAGCUGGCAGACCUCCAUG CAUGGAGGUCUGCCAGCUC 1819 1820 1224-1242 AGCUGGCAGACCUCCAUGG CCAUGGAGGUCUGCCAGCU 1821 1822 1225-1243 GCUGGCAGACCUCCAUGGG CCCAUGGAGGUCUGCCAGC 1823 1824 1226-1244 CUGGCAGACCUCCAUGGGA UCCCAUGGAGGUCUGCCAG 1825 1826 1227-1245 UGGCAGACCUCCAUGGGAA UUCCCAUGGAGGUCUGCCA 1827 1828 1228-1246 GGCAGACCUCCAUGGGAAA UUUCCCAUGGAGGUCUGCC 1829 1830 1229-1247 GCAGACCUCCAUGGGAAAG CUUUCCCAUGGAGGUCUGC 1831 1832 1230-1248 CAGACCUCCAUGGGAAAGA UCUUUCCCAUGGAGGUCUG 1833 1834 1231-1249 AGACCUCCAUGGGAAAGAU AUCUUUCCCAUGGAGGUCU 1835 1836 1232-1250 GACCUCCAUGGGAAAGAUG CAUCUUUCCCAUGGAGGUC 1837 1838 1233-1251 ACCUCCAUGGGAAAGAUGC GCAUCUUUCCCAUGGAGGU 1839 1840 1254-1272 CACUCUUGUUUUCCUCGUG CACGAGGAAAACAAGAGUG 1841 1842 1255-1273 ACUCUUGUUUUCCUCGUGC GCACGAGGAAAACAAGAGU 1843 1844 1256-1274 CUCUUGUUUUCCUCGUGCU AGCACGAGGAAAACAAGAG 1845 1846 1257-1275 UCUUGUUUUCCUCGUGCUU AAGCACGAGGAAAACAAGA 1847 1848 1259-1277 UUGUUUUCCUCGUGCUUUG CAAAGCACGAGGAAAACAA 1849 1850 1260-1278 UGUUUUCCUCGUGCUUUGU ACAAAGCACGAGGAAAACA 1851 1852 1261-1279 GUUUUCCUCGUGCUUUGUG CACAAAGCACGAGGAAAAC 1853 1854 1262-1280 UUUUCCUCGUGCUUUGUGG CCACAAAGCACGAGGAAAA 1855 1856 1263-1281 UUUCCUCGUGCUUUGUGGC GCCACAAAGCACGAGGAAA 1857 1858 1264-1282 UUCCUCGUGCUUUGUGGCC GGCCACAAAGCACGAGGAA 1859 1860 1265-1283 UCCUCGUGCUUUGUGGCCA UGGCCACAAAGCACGAGGA 1861 1862 1266-1284 CCUCGUGCUUUGUGGCCAA UUGGCCACAAAGCACGAGG 1863 1864 1267-1285 CUCGUGCUUUGUGGCCAAU AUUGGCCACAAAGCACGAG 1865 1866 1268-1286 UCGUGCUUUGUGGCCAAUG CAUUGGCCACAAAGCACGA 1867 1868 1269-1287 CGUGCUUUGUGGCCAAUGA UCAUUGGCCACAAAGCACG 1869 1870 1270-1288 GUGCUUUGUGGCCAAUGAC GUCAUUGGCCACAAAGCAC 1871 1872 1271-1289 UGCUUUGUGGCCAAUGACU AGUCAUUGGCCACAAAGCA 1873 1874 1272-1290 GCUUUGUGGCCAAUGACUC GAGUCAUUGGCCACAAAGC 1875 1876 1273-1291 CUUUGUGGCCAAUGACUCA UGAGUCAUUGGCCACAAAG 1877 1878 1274-1292 UUUGUGGCCAAUGACUCAA UUGAGUCAUUGGCCACAAA 1879 1880 1275-1293 UUGUGGCCAAUGACUCAAC GUUGAGUCAUUGGCCACAA 1881 1882 1276-1294 UGUGGCCAAUGACUCAACC GGUUGAGUCAUUGGCCACA 1883 1884 1277-1295 GUGGCCAAUGACUCAACCC GGGUUGAGUCAUUGGCCAC 1885 1886 1278-1296 UGGCCAAUGACUCAACCCU AGGGUUGAGUCAUUGGCCA 1887 1888 1279-1297 GGCCAAUGACUCAACCCUC GAGGGUUGAGUCAUUGGCC 1889 1890 1280-1298 GCCAAUGACUCAACCCUCU AGAGGGUUGAGUCAUUGGC 1891 1892 1281-1299 CCAAUGACUCAACCCUCUU AAGAGGGUUGAGUCAUUGG 1893 1894 1282-1300 CAAUGACUCAACCCUCUUC GAAGAGGGUUGAGUCAUUG 1895 1896 1283-1301 AAUGACUCAACCCUCUUCA UGAAGAGGGUUGAGUCAUU 1897 1898 1284-1302 AUGACUCAACCCUCUUCAC GUGAAGAGGGUUGAGUCAU 1899 1900 1285-1303 UGACUCAACCCUCUUCACC GGUGAAGAGGGUUGAGUCA 1901 1902 1286-1304 GACUCAACCCUCUUCACCC GGGUGAAGAGGGUUGAGUC 1903 1904 1287-1305 ACUCAACCCUCUUCACCCU AGGGUGAAGAGGGUUGAGU 1905 1906 1288-1306 CUCAACCCUCUUCACCCUG CAGGGUGAAGAGGGUUGAG 1907 1908 1289-1307 UCAACCCUCUUCACCCUGG CCAGGGUGAAGAGGGUUGA

1909 1910 1290-1308 CAACCCUCUUCACCCUGGC GCCAGGGUGAAGAGGGUUG 1911 1912 1291-1309 AACCCUCUUCACCCUGGCU AGCCAGGGUGAAGAGGGUU 1913 1914 1292-1310 ACCCUCUUCACCCUGGCUA UAGCCAGGGUGAAGAGGGU 1915 1916 1293-1311 CCCUCUUCACCCUGGCUAA UUAGCCAGGGUGAAGAGGG 1917 1918 1294-1312 CCUCUUCACCCUGGCUAAG CUUAGCCAGGGUGAAGAGG 1919 1920 1297-1315 CUUCACCCUGGCUAAGAUG CAUCUUAGCCAGGGUGAAG 1921 1922 1298-1316 UUCACCCUGGCUAAGAUGA UCAUCUUAGCCAGGGUGAA 1923 1924 1300-1318 CACCCUGGCUAAGAUGAUG CAUCAUCUUAGCCAGGGUG 1925 1926 1301-1319 ACCCUGGCUAAGAUGAUGC GCAUCAUCUUAGCCAGGGU 1927 1928 1302-1320 CCCUGGCUAAGAUGAUGCC GGCAUCAUCUUAGCCAGGG 1929 1930 1303-1321 CCUGGCUAAGAUGAUGCCA UGGCAUCAUCUUAGCCAGG 1931 1932 1304-1322 CUGGCUAAGAUGAUGCCAG CUGGCAUCAUCUUAGCCAG 1933 1934 1305-1323 UGGCUAAGAUGAUGCCAGG CCUGGCAUCAUCUUAGCCA 1935 1936 1306-1324 GGCUAAGAUGAUGCCAGGC GCCUGGCAUCAUCUUAGCC 1937 1938 1307-1325 GCUAAGAUGAUGCCAGGCU AGCCUGGCAUCAUCUUAGC 1939 1940 1308-1326 CUAAGAUGAUGCCAGGCUG CAGCCUGGCAUCAUCUUAG 1941 1942 1309-1327 UAAGAUGAUGCCAGGCUGU ACAGCCUGGCAUCAUCUUA 1943 1944 1310-1328 AAGAUGAUGCCAGGCUGUG CACAGCCUGGCAUCAUCUU 1945 1946 1311-1329 AGAUGAUGCCAGGCUGUGA UCACAGCCUGGCAUCAUCU 1947 1948 1312-1330 GAUGAUGCCAGGCUGUGAG CUCACAGCCUGGCAUCAUC 1949 1950 1313-1331 AUGAUGCCAGGCUGUGAGA UCUCACAGCCUGGCAUCAU 1951 1952 1314-1332 UGAUGCCAGGCUGUGAGAU AUCUCACAGCCUGGCAUCA 1953 1954 1316-1334 AUGCCAGGCUGUGAGAUUU AAAUCUCACAGCCUGGCAU 1955 1956 1317-1335 UGCCAGGCUGUGAGAUUUA UAAAUCUCACAGCCUGGCA 1957 1958 1318-1336 GCCAGGCUGUGAGAUUUAC GUAAAUCUCACAGCCUGGC 1959 1960 1319-1337 CCAGGCUGUGAGAUUUACU AGUAAAUCUCACAGCCUGG 1961 1962 1320-1338 CAGGCUGUGAGAUUUACUC GAGUAAAUCUCACAGCCUG 1963 1964 1321-1339 AGGCUGUGAGAUUUACUCU AGAGUAAAUCUCACAGCCU 1965 1966 1322-1340 GGCUGUGAGAUUUACUCUG CAGAGUAAAUCUCACAGCC 1967 1968 1323-1341 GCUGUGAGAUUUACUCUGA UCAGAGUAAAUCUCACAGC 1969 1970 1326-1344 GUGAGAUUUACUCUGAUUC GAAUCAGAGUAAAUCUCAC 1971 1972 1327-1345 UGAGAUUUACUCUGAUUCU AGAAUCAGAGUAAAUCUCA 1973 1974 1328-1346 GAGAUUUACUCUGAUUCUG CAGAAUCAGAGUAAAUCUC 1975 1976 1329-1347 AGAUUUACUCUGAUUCUGG CCAGAAUCAGAGUAAAUCU 1977 1978 1330-1348 GAUUUACUCUGAUUCUGGG CCCAGAAUCAGAGUAAAUC 1979 1980 1331-1349 AUUUACUCUGAUUCUGGGA UCCCAGAAUCAGAGUAAAU 1981 1982 1332-1350 UUUACUCUGAUUCUGGGAA UUCCCAGAAUCAGAGUAAA 1983 1984 1333-1351 UUACUCUGAUUCUGGGAAC GUUCCCAGAAUCAGAGUAA 1985 1986 1334-1352 UACUCUGAUUCUGGGAACC GGUUCCCAGAAUCAGAGUA 1987 1988 1335-1353 ACUCUGAUUCUGGGAACCA UGGUUCCCAGAAUCAGAGU 1989 1990 1336-1354 CUCUGAUUCUGGGAACCAU AUGGUUCCCAGAAUCAGAG 1991 1992 1337-1355 UCUGAUUCUGGGAACCAUG CAUGGUUCCCAGAAUCAGA 1993 1994 1338-1356 CUGAUUCUGGGAACCAUGC GCAUGGUUCCCAGAAUCAG 1995 1996 1339-1357 UGAUUCUGGGAACCAUGCC GGCAUGGUUCCCAGAAUCA 1997 1998 1340-1358 GAUUCUGGGAACCAUGCCU AGGCAUGGUUCCCAGAAUC 1999 2000 1341-1359 AUUCUGGGAACCAUGCCUC GAGGCAUGGUUCCCAGAAU 2001 2002 1342-1360 UUCUGGGAACCAUGCCUCC GGAGGCAUGGUUCCCAGAA 2003 2004 1343-1361 UCUGGGAACCAUGCCUCCA UGGAGGCAUGGUUCCCAGA 2005 2006 1344-1362 CUGGGAACCAUGCCUCCAU AUGGAGGCAUGGUUCCCAG 2007 2008 1345-1363 UGGGAACCAUGCCUCCAUG CAUGGAGGCAUGGUUCCCA

2009 2010 1346-1364 GGGAACCAUGCCUCCAUGA UCAUGGAGGCAUGGUUCCC 2011 2012 1348-1366 GAACCAUGCCUCCAUGAUC GAUCAUGGAGGCAUGGUUC 2013 2014 1349-1367 AACCAUGCCUCCAUGAUCC GGAUCAUGGAGGCAUGGUU 2015 2016 1350-1368 ACCAUGCCUCCAUGAUCCA UGGAUCAUGGAGGCAUGGU 2017 2018 1351-1369 CCAUGCCUCCAUGAUCCAA UUGGAUCAUGGAGGCAUGG 2019 2020 1352-1370 CAUGCCUCCAUGAUCCAAG CUUGGAUCAUGGAGGCAUG 2021 2022 1353-1371 AUGCCUCCAUGAUCCAAGG CCUUGGAUCAUGGAGGCAU 2023 2024 1354-1372 UGCCUCCAUGAUCCAAGGG CCCUUGGAUCAUGGAGGCA 2025 2026 1358-1376 UCCAUGAUCCAAGGGAUUC GAAUCCCUUGGAUCAUGGA 2027 2028 1359-1377 CCAUGAUCCAAGGGAUUCG CGAAUCCCUUGGAUCAUGG 2029 2030 1360-1378 CAUGAUCCAAGGGAUUCGA UCGAAUCCCUUGGAUCAUG 2031 2032 1361-1379 AUGAUCCAAGGGAUUCGAA UUCGAAUCCCUUGGAUCAU 2033 2034 1362-1380 UGAUCCAAGGGAUUCGAAA UUUCGAAUCCCUUGGAUCA 2035 2036 1363-1381 GAUCCAAGGGAUUCGAAAC GUUUCGAAUCCCUUGGAUC 2037 2038 1365-1383 UCCAAGGGAUUCGAAACAG CUGUUUCGAAUCCCUUGGA 2039 2040 1366-1384 CCAAGGGAUUCGAAACAGC GCUGUUUCGAAUCCCUUGG 2041 2042 1367-1385 CAAGGGAUUCGAAACAGCC GGCUGUUUCGAAUCCCUUG 2043 2044 1368-1386 AAGGGAUUCGAAACAGCCG CGGCUGUUUCGAAUCCCUU 2045 2046 1369-1387 AGGGAUUCGAAACAGCCGA UCGGCUGUUUCGAAUCCCU 2047 2048 1370-1388 GGGAUUCGAAACAGCCGAG CUCGGCUGUUUCGAAUCCC 2049 2050 1371-1389 GGAUUCGAAACAGCCGAGU ACUCGGCUGUUUCGAAUCC 2051 2052 1372-1390 GAUUCGAAACAGCCGAGUG CACUCGGCUGUUUCGAAUC 2053 2054 1373-1391 AUUCGAAACAGCCGAGUGC GCACUCGGCUGUUUCGAAU 2055 2056 1374-1392 UUCGAAACAGCCGAGUGCC GGCACUCGGCUGUUUCGAA 2057 2058 1375-1393 UCGAAACAGCCGAGUGCCA UGGCACUCGGCUGUUUCGA 2059 2060 1376-1394 CGAAACAGCCGAGUGCCAA UUGGCACUCGGCUGUUUCG 2061 2062 1377-1395 GAAACAGCCGAGUGCCAAA UUUGGCACUCGGCUGUUUC 2063 2064 1378-1396 AAACAGCCGAGUGCCAAAG CUUUGGCACUCGGCUGUUU 2065 2066 1379-1397 AACAGCCGAGUGCCAAAGU ACUUUGGCACUCGGCUGUU 2067 2068 1380-1398 ACAGCCGAGUGCCAAAGUA UACUUUGGCACUCGGCUGU 2069 2070 1381-1399 CAGCCGAGUGCCAAAGUAC GUACUUUGGCACUCGGCUG 2071 2072 1383-1401 GCCGAGUGCCAAAGUACAU AUGUACUUUGGCACUCGGC 2073 2074 1384-1402 CCGAGUGCCAAAGUACAUC GAUGUACUUUGGCACUCGG 2075 2076 1385-1403 CGAGUGCCAAAGUACAUCU AGAUGUACUUUGGCACUCG 2077 2078 1386-1404 GAGUGCCAAAGUACAUCUU AAGAUGUACUUUGGCACUC 2079 2080 1387-1405 AGUGCCAAAGUACAUCUUC GAAGAUGUACUUUGGCACU 2081 2082 1388-1406 GUGCCAAAGUACAUCUUCC GGAAGAUGUACUUUGGCAC 2083 2084 1389-1407 UGCCAAAGUACAUCUUCCG CGGAAGAUGUACUUUGGCA 2085 2086 1390-1408 GCCAAAGUACAUCUUCCGC GCGGAAGAUGUACUUUGGC 2087 2088 1391-1409 CCAAAGUACAUCUUCCGCC GGCGGAAGAUGUACUUUGG 2089 2090 1392-1410 CAAAGUACAUCUUCCGCCA UGGCGGAAGAUGUACUUUG 2091 2092 1393-1411 AAAGUACAUCUUCCGCCAC GUGGCGGAAGAUGUACUUU 2093 2094 1394-1412 AAGUACAUCUUCCGCCACA UGUGGCGGAAGAUGUACUU 2095 2096 1395-1413 AGUACAUCUUCCGCCACAA UUGUGGCGGAAGAUGUACU 2097 2098 1396-1414 GUACAUCUUCCGCCACAAU AUUGUGGCGGAAGAUGUAC 2099 2100 1397-1415 UACAUCUUCCGCCACAAUG CAUUGUGGCGGAAGAUGUA 2101 2102 1398-1416 ACAUCUUCCGCCACAAUGA UCAUUGUGGCGGAAGAUGU 2103 2104 1399-1417 CAUCUUCCGCCACAAUGAU AUCAUUGUGGCGGAAGAUG 2105 2106 1400-1418 AUCUUCCGCCACAAUGAUG CAUCAUUGUGGCGGAAGAU 2107 2108 1401-1419 UCUUCCGCCACAAUGAUGU ACAUCAUUGUGGCGGAAGA

2109 2110 1402-1420 CUUCCGCCACAAUGAUGUC GACAUCAUUGUGGCGGAAG 2111 2112 1403-1421 UUCCGCCACAAUGAUGUCA UGACAUCAUUGUGGCGGAA 2113 2114 1404-1422 UCCGCCACAAUGAUGUCAG CUGACAUCAUUGUGGCGGA 2115 2116 1405-1423 CCGCCACAAUGAUGUCAGC GCUGACAUCAUUGUGGCGG 2117 2118 1406-1424 CGCCACAAUGAUGUCAGCC GGCUGACAUCAUUGUGGCG 2119 2120 1407-1425 GCCACAAUGAUGUCAGCCA UGGCUGACAUCAUUGUGGC 2121 2122 1427-1445 CUCAGAGAACUGCUGCAAA UUUGCAGCAGUUCUCUGAG 2123 2124 1428-1446 UCAGAGAACUGCUGCAAAG CUUUGCAGCAGUUCUCUGA 2125 2126 1429-1447 CAGAGAACUGCUGCAAAGA UCUUUGCAGCAGUUCUCUG 2127 2128 1430-1448 AGAGAACUGCUGCAAAGAU AUCUUUGCAGCAGUUCUCU 2129 2130 1431-1449 GAGAACUGCUGCAAAGAUC GAUCUUUGCAGCAGUUCUC 2131 2132 1432-1450 AGAACUGCUGCAAAGAUCU AGAUCUUUGCAGCAGUUCU 2133 2134 1433-1451 GAACUGCUGCAAAGAUCUG CAGAUCUUUGCAGCAGUUC 2135 2136 1434-1452 AACUGCUGCAAAGAUCUGA UCAGAUCUUUGCAGCAGUU 2137 2138 1435-1453 ACUGCUGCAAAGAUCUGAC GUCAGAUCUUUGCAGCAGU 2139 2140 1436-1454 CUGCUGCAAAGAUCUGACC GGUCAGAUCUUUGCAGCAG 2141 2142 1437-1455 UGCUGCAAAGAUCUGACCC GGGUCAGAUCUUUGCAGCA 2143 2144 1457-1475 UCAGUCCCCAAGAUUGUGG CCACAAUCUUGGGGACUGA 2145 2146 1458-1476 CAGUCCCCAAGAUUGUGGC GCCACAAUCUUGGGGACUG 2147 2148 1459-1477 AGUCCCCAAGAUUGUGGCA UGCCACAAUCUUGGGGACU 2149 2150 1461-1479 UCCCCAAGAUUGUGGCAUU AAUGCCACAAUCUUGGGGA 2151 2152 1462-1480 CCCCAAGAUUGUGGCAUUU AAAUGCCACAAUCUUGGGG 2153 2154 1463-1481 CCCAAGAUUGUGGCAUUUG CAAAUGCCACAAUCUUGGG 2155 2156 1464-1482 CCAAGAUUGUGGCAUUUGA UCAAAUGCCACAAUCUUGG 2157 2158 1465-1483 CAAGAUUGUGGCAUUUGAA UUCAAAUGCCACAAUCUUG 2159 2160 1466-1484 AAGAUUGUGGCAUUUGAAA UUUCAAAUGCCACAAUCUU 2161 2162 1467-1485 AGAUUGUGGCAUUUGAAAC GUUUCAAAUGCCACAAUCU 2163 2164 1468-1486 GAUUGUGGCAUUUGAAACU AGUUUCAAAUGCCACAAUC 2165 2166 1469-1487 AUUGUGGCAUUUGAAACUG CAGUUUCAAAUGCCACAAU 2167 2168 1470-1488 UUGUGGCAUUUGAAACUGU ACAGUUUCAAAUGCCACAA 2169 2170 1471-1489 UGUGGCAUUUGAAACUGUC GACAGUUUCAAAUGCCACA 2171 2172 1472-1490 GUGGCAUUUGAAACUGUCC GGACAGUUUCAAAUGCCAC 2173 2174 1473-1491 UGGCAUUUGAAACUGUCCA UGGACAGUUUCAAAUGCCA 2175 2176 1474-1492 GGCAUUUGAAACUGUCCAU AUGGACAGUUUCAAAUGCC 2177 2178 1475-1493 GCAUUUGAAACUGUCCAUU AAUGGACAGUUUCAAAUGC 2179 2180 1476-1494 CAUUUGAAACUGUCCAUUC GAAUGGACAGUUUCAAAUG 2181 2182 1477-1495 AUUUGAAACUGUCCAUUCA UGAAUGGACAGUUUCAAAU 2183 2184 1479-1497 UUGAAACUGUCCAUUCAAU AUUGAAUGGACAGUUUCAA 2185 2186 1480-1498 UGAAACUGUCCAUUCAAUG CAUUGAAUGGACAGUUUCA 2187 2188 1481-1499 GAAACUGUCCAUUCAAUGG CCAUUGAAUGGACAGUUUC 2189 2190 1482-1500 AAACUGUCCAUUCAAUGGA UCCAUUGAAUGGACAGUUU 2191 2192 1483-1501 AACUGUCCAUUCAAUGGAU AUCCAUUGAAUGGACAGUU 2193 2194 1484-1502 ACUGUCCAUUCAAUGGAUG CAUCCAUUGAAUGGACAGU 2195 2196 1485-1503 CUGUCCAUUCAAUGGAUGG CCAUCCAUUGAAUGGACAG 2197 2198 1486-1504 UGUCCAUUCAAUGGAUGGG CCCAUCCAUUGAAUGGACA 2199 2200 1487-1505 GUCCAUUCAAUGGAUGGGG CCCCAUCCAUUGAAUGGAC 2201 2202 1488-1506 UCCAUUCAAUGGAUGGGGC GCCCCAUCCAUUGAAUGGA 2203 2204 1508-1526 GUGUGCCCACUGGAAGAGC GCUCUUCCAGUGGGCACAC 2205 2206 1509-1527 UGUGCCCACUGGAAGAGCU AGCUCUUCCAGUGGGCACA 2207 2208 1510-1528 GUGCCCACUGGAAGAGCUG CAGCUCUUCCAGUGGGCAC

2209 2210 1511-1529 UGCCCACUGGAAGAGCUGU ACAGCUCUUCCAGUGGGCA 2211 2212 1512-1530 GCCCACUGGAAGAGCUGUG CACAGCUCUUCCAGUGGGC 2213 2214 1513-1531 CCCACUGGAAGAGCUGUGU ACACAGCUCUUCCAGUGGG 2215 2216 1514-1532 CCACUGGAAGAGCUGUGUG CACACAGCUCUUCCAGUGG 2217 2218 1515-1533 CACUGGAAGAGCUGUGUGA UCACACAGCUCUUCCAGUG 2219 2220 1516-1534 ACUGGAAGAGCUGUGUGAU AUCACACAGCUCUUCCAGU 2221 2222 1517-1535 CUGGAAGAGCUGUGUGAUG CAUCACACAGCUCUUCCAG 2223 2224 1518-1536 UGGAAGAGCUGUGUGAUGU ACAUCACACAGCUCUUCCA 2225 2226 1519-1537 GGAAGAGCUGUGUGAUGUG CACAUCACACAGCUCUUCC 2227 2228 1520-1538 GAAGAGCUGUGUGAUGUGG CCACAUCACACAGCUCUUC 2229 2230 1521-1539 AAGAGCUGUGUGAUGUGGC GCCACAUCACACAGCUCUU 2231 2232 1522-1540 AGAGCUGUGUGAUGUGGCC GGCCACAUCACACAGCUCU 2233 2234 1523-1541 GAGCUGUGUGAUGUGGCCC GGGCCACAUCACACAGCUC 2235 2236 1524-1542 AGCUGUGUGAUGUGGCCCA UGGGCCACAUCACACAGCU 2237 2238 1525-1543 GCUGUGUGAUGUGGCCCAU AUGGGCCACAUCACACAGC 2239 2240 1526-1544 CUGUGUGAUGUGGCCCAUG CAUGGGCCACAUCACACAG 2241 2242 1527-1545 UGUGUGAUGUGGCCCAUGA UCAUGGGCCACAUCACACA 2243 2244 1528-1546 GUGUGAUGUGGCCCAUGAG CUCAUGGGCCACAUCACAC 2245 2246 1529-1547 UGUGAUGUGGCCCAUGAGU ACUCAUGGGCCACAUCACA 2247 2248 1532-1550 GAUGUGGCCCAUGAGUUUG CAAACUCAUGGGCCACAUC 2249 2250 1533-1551 AUGUGGCCCAUGAGUUUGG CCAAACUCAUGGGCCACAU 2251 2252 1534-1552 UGUGGCCCAUGAGUUUGGA UCCAAACUCAUGGGCCACA 2253 2254 1535-1553 GUGGCCCAUGAGUUUGGAG CUCCAAACUCAUGGGCCAC 2255 2256 1536-1554 UGGCCCAUGAGUUUGGAGC GCUCCAAACUCAUGGGCCA 2257 2258 1537-1555 GGCCCAUGAGUUUGGAGCA UGCUCCAAACUCAUGGGCC 2259 2260 1538-1556 GCCCAUGAGUUUGGAGCAA UUGCUCCAAACUCAUGGGC 2261 2262 1539-1557 CCCAUGAGUUUGGAGCAAU AUUGCUCCAAACUCAUGGG 2263 2264 1540-1558 CCAUGAGUUUGGAGCAAUC GAUUGCUCCAAACUCAUGG 2265 2266 1542-1560 AUGAGUUUGGAGCAAUCAC GUGAUUGCUCCAAACUCAU 2267 2268 1543-1561 UGAGUUUGGAGCAAUCACC GGUGAUUGCUCCAAACUCA 2269 2270 1545-1563 AGUUUGGAGCAAUCACCUU AAGGUGAUUGCUCCAAACU 2271 2272 1546-1564 GUUUGGAGCAAUCACCUUC GAAGGUGAUUGCUCCAAAC 2273 2274 1547-1565 UUUGGAGCAAUCACCUUCG CGAAGGUGAUUGCUCCAAA 2275 2276 1548-1566 UUGGAGCAAUCACCUUCGU ACGAAGGUGAUUGCUCCAA 2277 2278 1549-1567 UGGAGCAAUCACCUUCGUG CACGAAGGUGAUUGCUCCA 2279 2280 1550-1568 GGAGCAAUCACCUUCGUGG CCACGAAGGUGAUUGCUCC 2281 2282 1551-1569 GAGCAAUCACCUUCGUGGA UCCACGAAGGUGAUUGCUC 2283 2284 1552-1570 AGCAAUCACCUUCGUGGAU AUCCACGAAGGUGAUUGCU 2285 2286 1553-1571 GCAAUCACCUUCGUGGAUG CAUCCACGAAGGUGAUUGC 2287 2288 1554-1572 CAAUCACCUUCGUGGAUGA UCAUCCACGAAGGUGAUUG 2289 2290 1555-1573 AAUCACCUUCGUGGAUGAG CUCAUCCACGAAGGUGAUU 2291 2292 1556-1574 AUCACCUUCGUGGAUGAGG CCUCAUCCACGAAGGUGAU 2293 2294 1557-1575 UCACCUUCGUGGAUGAGGU ACCUCAUCCACGAAGGUGA 2295 2296 1558-1576 CACCUUCGUGGAUGAGGUC GACCUCAUCCACGAAGGUG 2297 2298 1559-1577 ACCUUCGUGGAUGAGGUCC GGACCUCAUCCACGAAGGU 2299 2300 1560-1578 CCUUCGUGGAUGAGGUCCA UGGACCUCAUCCACGAAGG 2301 2302 1561-1579 CUUCGUGGAUGAGGUCCAC GUGGACCUCAUCCACGAAG 2303 2304 1562-1580 UUCGUGGAUGAGGUCCACG CGUGGACCUCAUCCACGAA 2305 2306 1563-1581 UCGUGGAUGAGGUCCACGC GCGUGGACCUCAUCCACGA 2307 2308 1564-1582 CGUGGAUGAGGUCCACGCA UGCGUGGACCUCAUCCACG

2309 2310 1565-1583 GUGGAUGAGGUCCACGCAG CUGCGUGGACCUCAUCCAC 2311 2312 1566-1584 UGGAUGAGGUCCACGCAGU ACUGCGUGGACCUCAUCCA 2313 2314 1567-1585 GGAUGAGGUCCACGCAGUG CACUGCGUGGACCUCAUCC 2315 2316 1568-1586 GAUGAGGUCCACGCAGUGG CCACUGCGUGGACCUCAUC 2317 2318 1569-1587 AUGAGGUCCACGCAGUGGG CCCACUGCGUGGACCUCAU 2319 2320 1570-1588 UGAGGUCCACGCAGUGGGG CCCCACUGCGUGGACCUCA 2321 2322 1571-1589 GAGGUCCACGCAGUGGGGC GCCCCACUGCGUGGACCUC 2323 2324 1572-1590 AGGUCCACGCAGUGGGGCU AGCCCCACUGCGUGGACCU 2325 2326 1595-1613 GGGGCUCGAGGCGGAGGGA UCCCUCCGCCUCGAGCCCC 2327 2328 1596-1614 GGGCUCGAGGCGGAGGGAU AUCCCUCCGCCUCGAGCCC 2329 2330 1597-1615 GGCUCGAGGCGGAGGGAUU AAUCCCUCCGCCUCGAGCC 2331 2332 1598-1616 GCUCGAGGCGGAGGGAUUG CAAUCCCUCCGCCUCGAGC 2333 2334 1599-1617 CUCGAGGCGGAGGGAUUGG CCAAUCCCUCCGCCUCGAG 2335 2336 1600-1618 UCGAGGCGGAGGGAUUGGG CCCAAUCCCUCCGCCUCGA 2337 2338 1601-1619 CGAGGCGGAGGGAUUGGGG CCCCAAUCCCUCCGCCUCG 2339 2340 1602-1620 GAGGCGGAGGGAUUGGGGA UCCCCAAUCCCUCCGCCUC 2341 2342 1603-1621 AGGCGGAGGGAUUGGGGAU AUCCCCAAUCCCUCCGCCU 2343 2344 1604-1622 GGCGGAGGGAUUGGGGAUC GAUCCCCAAUCCCUCCGCC 2345 2346 1605-1623 GCGGAGGGAUUGGGGAUCG CGAUCCCCAAUCCCUCCGC 2347 2348 1606-1624 CGGAGGGAUUGGGGAUCGG CCGAUCCCCAAUCCCUCCG 2349 2350 1607-1625 GGAGGGAUUGGGGAUCGGG CCCGAUCCCCAAUCCCUCC 2351 2352 1608-1626 GAGGGAUUGGGGAUCGGGA UCCCGAUCCCCAAUCCCUC 2353 2354 1609-1627 AGGGAUUGGGGAUCGGGAU AUCCCGAUCCCCAAUCCCU 2355 2356 1610-1628 GGGAUUGGGGAUCGGGAUG CAUCCCGAUCCCCAAUCCC 2357 2358 1611-1629 GGAUUGGGGAUCGGGAUGG CCAUCCCGAUCCCCAAUCC 2359 2360 1612-1630 GAUUGGGGAUCGGGAUGGA UCCAUCCCGAUCCCCAAUC 2361 2362 1613-1631 AUUGGGGAUCGGGAUGGAG CUCCAUCCCGAUCCCCAAU 2363 2364 1614-1632 UUGGGGAUCGGGAUGGAGU ACUCCAUCCCGAUCCCCAA 2365 2366 1615-1633 UGGGGAUCGGGAUGGAGUC GACUCCAUCCCGAUCCCCA 2367 2368 1617-1635 GGGAUCGGGAUGGAGUCAU AUGACUCCAUCCCGAUCCC 2369 2370 1618-1636 GGAUCGGGAUGGAGUCAUG CAUGACUCCAUCCCGAUCC 2371 2372 1619-1637 GAUCGGGAUGGAGUCAUGC GCAUGACUCCAUCCCGAUC 2373 2374 1620-1638 AUCGGGAUGGAGUCAUGCC GGCAUGACUCCAUCCCGAU 2375 2376 1621-1639 UCGGGAUGGAGUCAUGCCA UGGCAUGACUCCAUCCCGA 2377 2378 1622-1640 CGGGAUGGAGUCAUGCCAA UUGGCAUGACUCCAUCCCG 2379 2380 1623-1641 GGGAUGGAGUCAUGCCAAA UUUGGCAUGACUCCAUCCC 2381 2382 1624-1642 GGAUGGAGUCAUGCCAAAA UUUUGGCAUGACUCCAUCC 2383 2384 1625-1643 GAUGGAGUCAUGCCAAAAA UUUUUGGCAUGACUCCAUC 2385 2386 1626-1644 AUGGAGUCAUGCCAAAAAU AUUUUUGGCAUGACUCCAU 2387 2388 1627-1645 UGGAGUCAUGCCAAAAAUG CAUUUUUGGCAUGACUCCA 2389 2390 1628-1646 GGAGUCAUGCCAAAAAUGG CCAUUUUUGGCAUGACUCC 2391 2392 1629-1647 GAGUCAUGCCAAAAAUGGA UCCAUUUUUGGCAUGACUC 2393 2394 1630-1648 AGUCAUGCCAAAAAUGGAC GUCCAUUUUUGGCAUGACU 2395 2396 1632-1650 UCAUGCCAAAAAUGGACAU AUGUCCAUUUUUGGCAUGA 2397 2398 1633-1651 CAUGCCAAAAAUGGACAUC GAUGUCCAUUUUUGGCAUG 2399 2400 1636-1654 GCCAAAAAUGGACAUCAUU AAUGAUGUCCAUUUUUGGC 2401 2402 1638-1656 CAAAAAUGGACAUCAUUUC GAAAUGAUGUCCAUUUUUG 2403 2404 1639-1657 AAAAAUGGACAUCAUUUCU AGAAAUGAUGUCCAUUUUU 2405 2406 1640-1658 AAAAUGGACAUCAUUUCUG CAGAAAUGAUGUCCAUUUU 2407 2408 1641-1659 AAAUGGACAUCAUUUCUGG CCAGAAAUGAUGUCCAUUU

2409 2410 1642-1660 AAUGGACAUCAUUUCUGGA UCCAGAAAUGAUGUCCAUU 2411 2412 1643-1661 AUGGACAUCAUUUCUGGAA UUCCAGAAAUGAUGUCCAU 2413 2414 1644-1662 UGGACAUCAUUUCUGGAAC GUUCCAGAAAUGAUGUCCA 2415 2416 1645-1663 GGACAUCAUUUCUGGAACA UGUUCCAGAAAUGAUGUCC 2417 2418 1646-1664 GACAUCAUUUCUGGAACAC GUGUUCCAGAAAUGAUGUC 2419 2420 1647-1665 ACAUCAUUUCUGGAACACU AGUGUUCCAGAAAUGAUGU 2421 2422 1648-1666 CAUCAUUUCUGGAACACUU AAGUGUUCCAGAAAUGAUG 2423 2424 1649-1667 AUCAUUUCUGGAACACUUG CAAGUGUUCCAGAAAUGAU 2425 2426 1650-1668 UCAUUUCUGGAACACUUGG CCAAGUGUUCCAGAAAUGA 2427 2428 1651-1669 CAUUUCUGGAACACUUGGC GCCAAGUGUUCCAGAAAUG 2429 2430 1652-1670 AUUUCUGGAACACUUGGCA UGCCAAGUGUUCCAGAAAU 2431 2432 1653-1671 UUUCUGGAACACUUGGCAA UUGCCAAGUGUUCCAGAAA 2433 2434 1654-1672 UUCUGGAACACUUGGCAAA UUUGCCAAGUGUUCCAGAA 2435 2436 1655-1673 UCUGGAACACUUGGCAAAG CUUUGCCAAGUGUUCCAGA 2437 2438 1656-1674 CUGGAACACUUGGCAAAGC GCUUUGCCAAGUGUUCCAG 2439 2440 1657-1675 UGGAACACUUGGCAAAGCC GGCUUUGCCAAGUGUUCCA 2441 2442 1658-1676 GGAACACUUGGCAAAGCCU AGGCUUUGCCAAGUGUUCC 2443 2444 1659-1677 GAACACUUGGCAAAGCCUU AAGGCUUUGCCAAGUGUUC 2445 2446 1660-1678 AACACUUGGCAAAGCCUUU AAAGGCUUUGCCAAGUGUU 2447 2448 1661-1679 ACACUUGGCAAAGCCUUUG CAAAGGCUUUGCCAAGUGU 2449 2450 1662-1680 CACUUGGCAAAGCCUUUGG CCAAAGGCUUUGCCAAGUG 2451 2452 1682-1700 UGUGUUGGAGGGUACAUCG CGAUGUACCCUCCAACACA 2453 2454 1683-1701 GUGUUGGAGGGUACAUCGC GCGAUGUACCCUCCAACAC 2455 2456 1684-1702 UGUUGGAGGGUACAUCGCC GGCGAUGUACCCUCCAACA 2457 2458 1685-1703 GUUGGAGGGUACAUCGCCA UGGCGAUGUACCCUCCAAC 2459 2460 1686-1704 UUGGAGGGUACAUCGCCAG CUGGCGAUGUACCCUCCAA 2461 2462 1687-1705 UGGAGGGUACAUCGCCAGC GCUGGCGAUGUACCCUCCA 2463 2464 1688-1706 GGAGGGUACAUCGCCAGCA UGCUGGCGAUGUACCCUCC 2465 2466 1689-1707 GAGGGUACAUCGCCAGCAC GUGCUGGCGAUGUACCCUC 2467 2468 1690-1708 AGGGUACAUCGCCAGCACG CGUGCUGGCGAUGUACCCU 2469 2470 1691-1709 GGGUACAUCGCCAGCACGA UCGUGCUGGCGAUGUACCC 2471 2472 1692-1710 GGUACAUCGCCAGCACGAG CUCGUGCUGGCGAUGUACC 2473 2474 1693-1711 GUACAUCGCCAGCACGAGU ACUCGUGCUGGCGAUGUAC 2475 2476 1694-1712 UACAUCGCCAGCACGAGUU AACUCGUGCUGGCGAUGUA 2477 2478 1695-1713 ACAUCGCCAGCACGAGUUC GAACUCGUGCUGGCGAUGU 2479 2480 1696-1714 CAUCGCCAGCACGAGUUCU AGAACUCGUGCUGGCGAUG 2481 2482 1697-1715 AUCGCCAGCACGAGUUCUC GAGAACUCGUGCUGGCGAU 2483 2484 1698-1716 UCGCCAGCACGAGUUCUCU AGAGAACUCGUGCUGGCGA 2485 2486 1699-1717 CGCCAGCACGAGUUCUCUG CAGAGAACUCGUGCUGGCG 2487 2488 1700-1718 GCCAGCACGAGUUCUCUGA UCAGAGAACUCGUGCUGGC 2489 2490 1701-1719 CCAGCACGAGUUCUCUGAU AUCAGAGAACUCGUGCUGG 2491 2492 1702-1720 CAGCACGAGUUCUCUGAUU AAUCAGAGAACUCGUGCUG 2493 2494 1703-1721 AGCACGAGUUCUCUGAUUG CAAUCAGAGAACUCGUGCU 2495 2496 1704-1722 GCACGAGUUCUCUGAUUGA UCAAUCAGAGAACUCGUGC 2497 2498 1705-1723 CACGAGUUCUCUGAUUGAC GUCAAUCAGAGAACUCGUG 2499 2500 1707-1725 CGAGUUCUCUGAUUGACAC GUGUCAAUCAGAGAACUCG 2501 2502 1727-1745 GUACGGUCCUAUGCUGCUG CAGCAGCAUAGGACCGUAC 2503 2504 1728-1746 UACGGUCCUAUGCUGCUGG CCAGCAGCAUAGGACCGUA 2505 2506 1729-1747 ACGGUCCUAUGCUGCUGGC GCCAGCAGCAUAGGACCGU 2507 2508 1730-1748 CGGUCCUAUGCUGCUGGCU AGCCAGCAGCAUAGGACCG

2509 2510 1731-1749 GGUCCUAUGCUGCUGGCUU AAGCCAGCAGCAUAGGACC 2511 2512 1732-1750 GUCCUAUGCUGCUGGCUUC GAAGCCAGCAGCAUAGGAC 2513 2514 1733-1751 UCCUAUGCUGCUGGCUUCA UGAAGCCAGCAGCAUAGGA 2515 2516 1734-1752 CCUAUGCUGCUGGCUUCAU AUGAAGCCAGCAGCAUAGG 2517 2518 1735-1753 CUAUGCUGCUGGCUUCAUC GAUGAAGCCAGCAGCAUAG 2519 2520 1736-1754 UAUGCUGCUGGCUUCAUCU AGAUGAAGCCAGCAGCAUA 2521 2522 1737-1755 AUGCUGCUGGCUUCAUCUU AAGAUGAAGCCAGCAGCAU 2523 2524 1738-1756 UGCUGCUGGCUUCAUCUUC GAAGAUGAAGCCAGCAGCA 2525 2526 1739-1757 GCUGCUGGCUUCAUCUUCA UGAAGAUGAAGCCAGCAGC 2527 2528 1740-1758 CUGCUGGCUUCAUCUUCAC GUGAAGAUGAAGCCAGCAG 2529 2530 1741-1759 UGCUGGCUUCAUCUUCACC GGUGAAGAUGAAGCCAGCA 2531 2532 1742-1760 GCUGGCUUCAUCUUCACCA UGGUGAAGAUGAAGCCAGC 2533 2534 1743-1761 CUGGCUUCAUCUUCACCAC GUGGUGAAGAUGAAGCCAG 2535 2536 1744-1762 UGGCUUCAUCUUCACCACC GGUGGUGAAGAUGAAGCCA 2537 2538 1745-1763 GGCUUCAUCUUCACCACCU AGGUGGUGAAGAUGAAGCC 2539 2540 1746-1764 GCUUCAUCUUCACCACCUC GAGGUGGUGAAGAUGAAGC 2541 2542 1747-1765 CUUCAUCUUCACCACCUCU AGAGGUGGUGAAGAUGAAG 2543 2544 1748-1766 UUCAUCUUCACCACCUCUC GAGAGGUGGUGAAGAUGAA 2545 2546 1749-1767 UCAUCUUCACCACCUCUCU AGAGAGGUGGUGAAGAUGA 2547 2548 1750-1768 CAUCUUCACCACCUCUCUG CAGAGAGGUGGUGAAGAUG 2549 2550 1751-1769 AUCUUCACCACCUCUCUGC GCAGAGAGGUGGUGAAGAU 2551 2552 1752-1770 UCUUCACCACCUCUCUGCC GGCAGAGAGGUGGUGAAGA 2553 2554 1753-1771 CUUCACCACCUCUCUGCCA UGGCAGAGAGGUGGUGAAG 2555 2556 1754-1772 UUCACCACCUCUCUGCCAC GUGGCAGAGAGGUGGUGAA 2557 2558 1755-1773 UCACCACCUCUCUGCCACC GGUGGCAGAGAGGUGGUGA 2559 2560 1756-1774 CACCACCUCUCUGCCACCC GGGUGGCAGAGAGGUGGUG 2561 2562 1757-1775 ACCACCUCUCUGCCACCCA UGGGUGGCAGAGAGGUGGU 2563 2564 1758-1776 CCACCUCUCUGCCACCCAU AUGGGUGGCAGAGAGGUGG 2565 2566 1759-1777 CACCUCUCUGCCACCCAUG CAUGGGUGGCAGAGAGGUG 2567 2568 1760-1778 ACCUCUCUGCCACCCAUGC GCAUGGGUGGCAGAGAGGU 2569 2570 1761-1779 CCUCUCUGCCACCCAUGCU AGCAUGGGUGGCAGAGAGG 2571 2572 1762-1780 CUCUCUGCCACCCAUGCUG CAGCAUGGGUGGCAGAGAG 2573 2574 1763-1781 UCUCUGCCACCCAUGCUGC GCAGCAUGGGUGGCAGAGA 2575 2576 1764-1782 CUCUGCCACCCAUGCUGCU AGCAGCAUGGGUGGCAGAG 2577 2578 1765-1783 UCUGCCACCCAUGCUGCUG CAGCAGCAUGGGUGGCAGA 2579 2580 1766-1784 CUGCCACCCAUGCUGCUGG CCAGCAGCAUGGGUGGCAG 2581 2582 1767-1785 UGCCACCCAUGCUGCUGGC GCCAGCAGCAUGGGUGGCA 2583 2584 1768-1786 GCCACCCAUGCUGCUGGCU AGCCAGCAGCAUGGGUGGC 2585 2586 1769-1787 CCACCCAUGCUGCUGGCUG CAGCCAGCAGCAUGGGUGG 2587 2588 1770-1788 CACCCAUGCUGCUGGCUGG CCAGCCAGCAGCAUGGGUG 2589 2590 1771-1789 ACCCAUGCUGCUGGCUGGA UCCAGCCAGCAGCAUGGGU 2591 2592 1772-1790 CCCAUGCUGCUGGCUGGAG CUCCAGCCAGCAGCAUGGG 2593 2594 1773-1791 CCAUGCUGCUGGCUGGAGC GCUCCAGCCAGCAGCAUGG 2595 2596 1774-1792 CAUGCUGCUGGCUGGAGCC GGCUCCAGCCAGCAGCAUG 2597 2598 1775-1793 AUGCUGCUGGCUGGAGCCC GGGCUCCAGCCAGCAGCAU 2599 2600 1776-1794 UGCUGCUGGCUGGAGCCCU AGGGCUCCAGCCAGCAGCA 2601 2602 1777-1795 GCUGCUGGCUGGAGCCCUG CAGGGCUCCAGCCAGCAGC 2603 2604 1778-1796 CUGCUGGCUGGAGCCCUGG CCAGGGCUCCAGCCAGCAG 2605 2606 1779-1797 UGCUGGCUGGAGCCCUGGA UCCAGGGCUCCAGCCAGCA 2607 2608 1780-1798 GCUGGCUGGAGCCCUGGAG CUCCAGGGCUCCAGCCAGC

2609 2610 1781-1799 CUGGCUGGAGCCCUGGAGU ACUCCAGGGCUCCAGCCAG 2611 2612 1782-1800 UGGCUGGAGCCCUGGAGUC GACUCCAGGGCUCCAGCCA 2613 2614 1783-1801 GGCUGGAGCCCUGGAGUCU AGACUCCAGGGCUCCAGCC 2615 2616 1784-1802 GCUGGAGCCCUGGAGUCUG CAGACUCCAGGGCUCCAGC 2617 2618 1785-1803 CUGGAGCCCUGGAGUCUGU ACAGACUCCAGGGCUCCAG 2619 2620 1786-1804 UGGAGCCCUGGAGUCUGUG CACAGACUCCAGGGCUCCA 2621 2622 1787-1805 GGAGCCCUGGAGUCUGUGC GCACAGACUCCAGGGCUCC 2623 2624 1788-1806 GAGCCCUGGAGUCUGUGCG CGCACAGACUCCAGGGCUC 2625 2626 1789-1807 AGCCCUGGAGUCUGUGCGG CCGCACAGACUCCAGGGCU 2627 2628 1790-1808 GCCCUGGAGUCUGUGCGGA UCCGCACAGACUCCAGGGC 2629 2630 1792-1810 CCUGGAGUCUGUGCGGAUC GAUCCGCACAGACUCCAGG 2631 2632 1793-1811 CUGGAGUCUGUGCGGAUCC GGAUCCGCACAGACUCCAG 2633 2634 1795-1813 GGAGUCUGUGCGGAUCCUG CAGGAUCCGCACAGACUCC 2635 2636 1796-1814 GAGUCUGUGCGGAUCCUGA UCAGGAUCCGCACAGACUC 2637 2638 1797-1815 AGUCUGUGCGGAUCCUGAA UUCAGGAUCCGCACAGACU 2639 2640 1798-1816 GUCUGUGCGGAUCCUGAAG CUUCAGGAUCCGCACAGAC 2641 2642 1799-1817 UCUGUGCGGAUCCUGAAGA UCUUCAGGAUCCGCACAGA 2643 2644 1800-1818 CUGUGCGGAUCCUGAAGAG CUCUUCAGGAUCCGCACAG 2645 2646 1801-1819 UGUGCGGAUCCUGAAGAGC GCUCUUCAGGAUCCGCACA 2647 2648 1802-1820 GUGCGGAUCCUGAAGAGCG CGCUCUUCAGGAUCCGCAC 2649 2650 1803-1821 UGCGGAUCCUGAAGAGCGC GCGCUCUUCAGGAUCCGCA 2651 2652 1804-1822 GCGGAUCCUGAAGAGCGCU AGCGCUCUUCAGGAUCCGC 2653 2654 1805-1823 CGGAUCCUGAAGAGCGCUG CAGCGCUCUUCAGGAUCCG 2655 2656 1806-1824 GGAUCCUGAAGAGCGCUGA UCAGCGCUCUUCAGGAUCC 2657 2658 1807-1825 GAUCCUGAAGAGCGCUGAG CUCAGCGCUCUUCAGGAUC 2659 2660 1808-1826 AUCCUGAAGAGCGCUGAGG CCUCAGCGCUCUUCAGGAU 2661 2662 1809-1827 UCCUGAAGAGCGCUGAGGG CCCUCAGCGCUCUUCAGGA 2663 2664 1810-1828 CCUGAAGAGCGCUGAGGGA UCCCUCAGCGCUCUUCAGG 2665 2666 1811-1829 CUGAAGAGCGCUGAGGGAC GUCCCUCAGCGCUCUUCAG 2667 2668 1812-1830 UGAAGAGCGCUGAGGGACG CGUCCCUCAGCGCUCUUCA 2669 2670 1813-1831 GAAGAGCGCUGAGGGACGG CCGUCCCUCAGCGCUCUUC 2671 2672 1814-1832 AAGAGCGCUGAGGGACGGG CCCGUCCCUCAGCGCUCUU 2673 2674 1815-1833 AGAGCGCUGAGGGACGGGU ACCCGUCCCUCAGCGCUCU 2675 2676 1816-1834 GAGCGCUGAGGGACGGGUG CACCCGUCCCUCAGCGCUC 2677 2678 1817-1835 AGCGCUGAGGGACGGGUGC GCACCCGUCCCUCAGCGCU 2679 2680 1818-1836 GCGCUGAGGGACGGGUGCU AGCACCCGUCCCUCAGCGC 2681 2682 1819-1837 CGCUGAGGGACGGGUGCUU AAGCACCCGUCCCUCAGCG 2683 2684 1820-1838 GCUGAGGGACGGGUGCUUC GAAGCACCCGUCCCUCAGC 2685 2686 1821-1839 CUGAGGGACGGGUGCUUCG CGAAGCACCCGUCCCUCAG 2687 2688 1822-1840 UGAGGGACGGGUGCUUCGC GCGAAGCACCCGUCCCUCA 2689 2690 1823-1841 GAGGGACGGGUGCUUCGCC GGCGAAGCACCCGUCCCUC 2691 2692 1824-1842 AGGGACGGGUGCUUCGCCG CGGCGAAGCACCCGUCCCU 2693 2694 1825-1843 GGGACGGGUGCUUCGCCGC GCGGCGAAGCACCCGUCCC 2695 2696 1826-1844 GGACGGGUGCUUCGCCGCC GGCGGCGAAGCACCCGUCC 2697 2698 1827-1845 GACGGGUGCUUCGCCGCCA UGGCGGCGAAGCACCCGUC 2699 2700 1828-1846 ACGGGUGCUUCGCCGCCAG CUGGCGGCGAAGCACCCGU 2701 2702 1829-1847 CGGGUGCUUCGCCGCCAGC GCUGGCGGCGAAGCACCCG 2703 2704 1830-1848 GGGUGCUUCGCCGCCAGCA UGCUGGCGGCGAAGCACCC 2705 2706 1831-1849 GGUGCUUCGCCGCCAGCAC GUGCUGGCGGCGAAGCACC 2707 2708 1832-1850 GUGCUUCGCCGCCAGCACC GGUGCUGGCGGCGAAGCAC

2709 2710 1833-1851 UGCUUCGCCGCCAGCACCA UGGUGCUGGCGGCGAAGCA 2711 2712 1834-1852 GCUUCGCCGCCAGCACCAG CUGGUGCUGGCGGCGAAGC 2713 2714 1835-1853 CUUCGCCGCCAGCACCAGC GCUGGUGCUGGCGGCGAAG 2715 2716 1836-1854 UUCGCCGCCAGCACCAGCG CGCUGGUGCUGGCGGCGAA 2717 2718 1837-1855 UCGCCGCCAGCACCAGCGC GCGCUGGUGCUGGCGGCGA 2719 2720 1838-1856 CGCCGCCAGCACCAGCGCA UGCGCUGGUGCUGGCGGCG 2721 2722 1839-1857 GCCGCCAGCACCAGCGCAA UUGCGCUGGUGCUGGCGGC 2723 2724 1840-1858 CCGCCAGCACCAGCGCAAC GUUGCGCUGGUGCUGGCGG 2725 2726 1841-1859 CGCCAGCACCAGCGCAACG CGUUGCGCUGGUGCUGGCG 2727 2728 1842-1860 GCCAGCACCAGCGCAACGU ACGUUGCGCUGGUGCUGGC 2729 2730 1865-1883 CUCAUGAGACAGAUGCUAA UUAGCAUCUGUCUCAUGAG 2731 2732 1866-1884 UCAUGAGACAGAUGCUAAU AUUAGCAUCUGUCUCAUGA 2733 2734 1867-1885 CAUGAGACAGAUGCUAAUG CAUUAGCAUCUGUCUCAUG 2735 2736 1868-1886 AUGAGACAGAUGCUAAUGG CCAUUAGCAUCUGUCUCAU 2737 2738 1869-1887 UGAGACAGAUGCUAAUGGA UCCAUUAGCAUCUGUCUCA 2739 2740 1871-1889 AGACAGAUGCUAAUGGAUG CAUCCAUUAGCAUCUGUCU 2741 2742 1872-1890 GACAGAUGCUAAUGGAUGC GCAUCCAUUAGCAUCUGUC 2743 2744 1873-1891 ACAGAUGCUAAUGGAUGCC GGCAUCCAUUAGCAUCUGU 2745 2746 1874-1892 CAGAUGCUAAUGGAUGCCG CGGCAUCCAUUAGCAUCUG 2747 2748 1875-1893 AGAUGCUAAUGGAUGCCGG CCGGCAUCCAUUAGCAUCU 2749 2750 1876-1894 GAUGCUAAUGGAUGCCGGC GCCGGCAUCCAUUAGCAUC 2751 2752 1877-1895 AUGCUAAUGGAUGCCGGCC GGCCGGCAUCCAUUAGCAU 2753 2754 1878-1896 UGCUAAUGGAUGCCGGCCU AGGCCGGCAUCCAUUAGCA 2755 2756 1879-1897 GCUAAUGGAUGCCGGCCUC GAGGCCGGCAUCCAUUAGC 2757 2758 1880-1898 CUAAUGGAUGCCGGCCUCC GGAGGCCGGCAUCCAUUAG 2759 2760 1881-1899 UAAUGGAUGCCGGCCUCCC GGGAGGCCGGCAUCCAUUA 2761 2762 1882-1900 AAUGGAUGCCGGCCUCCCU AGGGAGGCCGGCAUCCAUU 2763 2764 1883-1901 AUGGAUGCCGGCCUCCCUG CAGGGAGGCCGGCAUCCAU 2765 2766 1884-1902 UGGAUGCCGGCCUCCCUGU ACAGGGAGGCCGGCAUCCA 2767 2768 1885-1903 GGAUGCCGGCCUCCCUGUU AACAGGGAGGCCGGCAUCC 2769 2770 1886-1904 GAUGCCGGCCUCCCUGUUG CAACAGGGAGGCCGGCAUC 2771 2772 1887-1905 AUGCCGGCCUCCCUGUUGU ACAACAGGGAGGCCGGCAU 2773 2774 1888-1906 UGCCGGCCUCCCUGUUGUC GACAACAGGGAGGCCGGCA 2775 2776 1889-1907 GCCGGCCUCCCUGUUGUCC GGACAACAGGGAGGCCGGC 2777 2778 1890-1908 CCGGCCUCCCUGUUGUCCA UGGACAACAGGGAGGCCGG 2779 2780 1891-1909 CGGCCUCCCUGUUGUCCAC GUGGACAACAGGGAGGCCG 2781 2782 1892-1910 GGCCUCCCUGUUGUCCACU AGUGGACAACAGGGAGGCC 2783 2784 1893-1911 GCCUCCCUGUUGUCCACUG CAGUGGACAACAGGGAGGC 2785 2786 1894-1912 CCUCCCUGUUGUCCACUGC GCAGUGGACAACAGGGAGG 2787 2788 1895-1913 CUCCCUGUUGUCCACUGCC GGCAGUGGACAACAGGGAG 2789 2790 1896-1914 UCCCUGUUGUCCACUGCCC GGGCAGUGGACAACAGGGA 2791 2792 1897-1915 CCCUGUUGUCCACUGCCCC GGGGCAGUGGACAACAGGG 2793 2794 1898-1916 CCUGUUGUCCACUGCCCCA UGGGGCAGUGGACAACAGG 2795 2796 1899-1917 CUGUUGUCCACUGCCCCAG CUGGGGCAGUGGACAACAG 2797 2798 1900-1918 UGUUGUCCACUGCCCCAGC GCUGGGGCAGUGGACAACA 2799 2800 1901-1919 GUUGUCCACUGCCCCAGCC GGCUGGGGCAGUGGACAAC 2801 2802 1902-1920 UUGUCCACUGCCCCAGCCA UGGCUGGGGCAGUGGACAA 2803 2804 1903-1921 UGUCCACUGCCCCAGCCAC GUGGCUGGGGCAGUGGACA 2805 2806 1904-1922 GUCCACUGCCCCAGCCACA UGUGGCUGGGGCAGUGGAC 2807 2808 1905-1923 UCCACUGCCCCAGCCACAU AUGUGGCUGGGGCAGUGGA

2809 2810 1906-1924 CCACUGCCCCAGCCACAUC GAUGUGGCUGGGGCAGUGG 2811 2812 1907-1925 CACUGCCCCAGCCACAUCA UGAUGUGGCUGGGGCAGUG 2813 2814 1908-1926 ACUGCCCCAGCCACAUCAU AUGAUGUGGCUGGGGCAGU 2815 2816 1909-1927 CUGCCCCAGCCACAUCAUC GAUGAUGUGGCUGGGGCAG 2817 2818 1910-1928 UGCCCCAGCCACAUCAUCC GGAUGAUGUGGCUGGGGCA 2819 2820 1911-1929 GCCCCAGCCACAUCAUCCC GGGAUGAUGUGGCUGGGGC 2821 2822 1912-1930 CCCCAGCCACAUCAUCCCU AGGGAUGAUGUGGCUGGGG 2823 2824 1913-1931 CCCAGCCACAUCAUCCCUG CAGGGAUGAUGUGGCUGGG 2825 2826 1914-1932 CCAGCCACAUCAUCCCUGU ACAGGGAUGAUGUGGCUGG 2827 2828 1915-1933 CAGCCACAUCAUCCCUGUG CACAGGGAUGAUGUGGCUG 2829 2830 1916-1934 AGCCACAUCAUCCCUGUGC GCACAGGGAUGAUGUGGCU 2831 2832 1917-1935 GCCACAUCAUCCCUGUGCG CGCACAGGGAUGAUGUGGC 2833 2834 1918-1936 CCACAUCAUCCCUGUGCGG CCGCACAGGGAUGAUGUGG 2835 2836 1919-1937 CACAUCAUCCCUGUGCGGG CCCGCACAGGGAUGAUGUG 2837 2838 1920-1938 ACAUCAUCCCUGUGCGGGU ACCCGCACAGGGAUGAUGU 2839 2840 1922-1940 AUCAUCCCUGUGCGGGUUG CAACCCGCACAGGGAUGAU 2841 2842 1923-1941 UCAUCCCUGUGCGGGUUGC GCAACCCGCACAGGGAUGA 2843 2844 1924-1942 CAUCCCUGUGCGGGUUGCA UGCAACCCGCACAGGGAUG 2845 2846 1925-1943 AUCCCUGUGCGGGUUGCAG CUGCAACCCGCACAGGGAU 2847 2848 1926-1944 UCCCUGUGCGGGUUGCAGA UCUGCAACCCGCACAGGGA 2849 2850 1928-1946 CCUGUGCGGGUUGCAGAUG CAUCUGCAACCCGCACAGG 2851 2852 1929-1947 CUGUGCGGGUUGCAGAUGC GCAUCUGCAACCCGCACAG 2853 2854 1930-1948 UGUGCGGGUUGCAGAUGCU AGCAUCUGCAACCCGCACA 2855 2856 1931-1949 GUGCGGGUUGCAGAUGCUG CAGCAUCUGCAACCCGCAC 2857 2858 1932-1950 UGCGGGUUGCAGAUGCUGC GCAGCAUCUGCAACCCGCA 2859 2860 1933-1951 GCGGGUUGCAGAUGCUGCU AGCAGCAUCUGCAACCCGC 2861 2862 1934-1952 CGGGUUGCAGAUGCUGCUA UAGCAGCAUCUGCAACCCG 2863 2864 1935-1953 GGGUUGCAGAUGCUGCUAA UUAGCAGCAUCUGCAACCC 2865 2866 1936-1954 GGUUGCAGAUGCUGCUAAA UUUAGCAGCAUCUGCAACC 2867 2868 1937-1955 GUUGCAGAUGCUGCUAAAA UUUUAGCAGCAUCUGCAAC 2869 2870 1938-1956 UUGCAGAUGCUGCUAAAAA UUUUUAGCAGCAUCUGCAA 2871 2872 1939-1957 UGCAGAUGCUGCUAAAAAC GUUUUUAGCAGCAUCUGCA 2873 2874 1940-1958 GCAGAUGCUGCUAAAAACA UGUUUUUAGCAGCAUCUGC 2875 2876 1941-1959 CAGAUGCUGCUAAAAACAC GUGUUUUUAGCAGCAUCUG 2877 2878 1961-1979 GAAGUCUGUGAUGAACUAA UUAGUUCAUCACAGACUUC 2879 2880 1963-1981 AGUCUGUGAUGAACUAAUG CAUUAGUUCAUCACAGACU 2881 2882 1965-1983 UCUGUGAUGAACUAAUGAG CUCAUUAGUUCAUCACAGA 2883 2884 1966-1984 CUGUGAUGAACUAAUGAGC GCUCAUUAGUUCAUCACAG 2885 2886 1968-1986 GUGAUGAACUAAUGAGCAG CUGCUCAUUAGUUCAUCAC 2887 2888 1969-1987 UGAUGAACUAAUGAGCAGA UCUGCUCAUUAGUUCAUCA 2889 2890 1970-1988 GAUGAACUAAUGAGCAGAC GUCUGCUCAUUAGUUCAUC 2891 2892 1971-1989 AUGAACUAAUGAGCAGACA UGUCUGCUCAUUAGUUCAU 2893 2894 1972-1990 UGAACUAAUGAGCAGACAU AUGUCUGCUCAUUAGUUCA 2895 2896 1973-1991 GAACUAAUGAGCAGACAUA UAUGUCUGCUCAUUAGUUC 2897 2898 1974-1992 AACUAAUGAGCAGACAUAA UUAUGUCUGCUCAUUAGUU 2899 2900 1975-1993 ACUAAUGAGCAGACAUAAC GUUAUGUCUGCUCAUUAGU 2901 2902 1978-1996 AAUGAGCAGACAUAACAUC GAUGUUAUGUCUGCUCAUU 2903 2904 1979-1997 AUGAGCAGACAUAACAUCU AGAUGUUAUGUCUGCUCAU 2905 2906 1980-1998 UGAGCAGACAUAACAUCUA UAGAUGUUAUGUCUGCUCA 2907 2908 2000-2018 GUGCAAGCAAUCAAUUACC GGUAAUUGAUUGCUUGCAC

2909 2910 2001-2019 UGCAAGCAAUCAAUUACCC GGGUAAUUGAUUGCUUGCA 2911 2912 2002-2020 GCAAGCAAUCAAUUACCCU AGGGUAAUUGAUUGCUUGC 2913 2914 2004-2022 AAGCAAUCAAUUACCCUAC GUAGGGUAAUUGAUUGCUU 2915 2916 2024-2042 GUGCCCCGGGGAGAAGAGC GCUCUUCUCCCCGGGGCAC 2917 2918 2025-2043 UGCCCCGGGGAGAAGAGCU AGCUCUUCUCCCCGGGGCA 2919 2920 2026-2044 GCCCCGGGGAGAAGAGCUC GAGCUCUUCUCCCCGGGGC 2921 2922 2027-2045 CCCCGGGGAGAAGAGCUCC GGAGCUCUUCUCCCCGGGG 2923 2924 2028-2046 CCCGGGGAGAAGAGCUCCU AGGAGCUCUUCUCCCCGGG 2925 2926 2029-2047 CCGGGGAGAAGAGCUCCUA UAGGAGCUCUUCUCCCCGG 2927 2928 2030-2048 CGGGGAGAAGAGCUCCUAC GUAGGAGCUCUUCUCCCCG 2929 2930 2031-2049 GGGGAGAAGAGCUCCUACG CGUAGGAGCUCUUCUCCCC 2931 2932 2032-2050 GGGAGAAGAGCUCCUACGG CCGUAGGAGCUCUUCUCCC 2933 2934 2033-2051 GGAGAAGAGCUCCUACGGA UCCGUAGGAGCUCUUCUCC 2935 2936 2034-2052 GAGAAGAGCUCCUACGGAU AUCCGUAGGAGCUCUUCUC 2937 2938 2060-2078 ACCCCUCACCACACACCCC GGGGUGUGUGGUGAGGGGU 2939 2940 2061-2079 CCCCUCACCACACACCCCA UGGGGUGUGUGGUGAGGGG 2941 2942 2062-2080 CCCUCACCACACACCCCAG CUGGGGUGUGUGGUGAGGG 2943 2944 2063-2081 CCUCACCACACACCCCAGA UCUGGGGUGUGUGGUGAGG 2945 2946 2064-2082 CUCACCACACACCCCAGAU AUCUGGGGUGUGUGGUGAG 2947 2948 2065-2083 UCACCACACACCCCAGAUG CAUCUGGGGUGUGUGGUGA 2949 2950 2066-2084 CACCACACACCCCAGAUGA UCAUCUGGGGUGUGUGGUG 2951 2952 2067-2085 ACCACACACCCCAGAUGAU AUCAUCUGGGGUGUGUGGU 2953 2954 2068-2086 CCACACACCCCAGAUGAUG CAUCAUCUGGGGUGUGUGG 2955 2956 2069-2087 CACACACCCCAGAUGAUGA UCAUCAUCUGGGGUGUGUG 2957 2958 2070-2088 ACACACCCCAGAUGAUGAA UUCAUCAUCUGGGGUGUGU 2959 2960 2071-2089 CACACCCCAGAUGAUGAAC GUUCAUCAUCUGGGGUGUG 2961 2962 2072-2090 ACACCCCAGAUGAUGAACU AGUUCAUCAUCUGGGGUGU 2963 2964 2073-2091 CACCCCAGAUGAUGAACUA UAGUUCAUCAUCUGGGGUG 2965 2966 2074-2092 ACCCCAGAUGAUGAACUAC GUAGUUCAUCAUCUGGGGU 2967 2968 2076-2094 CCCAGAUGAUGAACUACUU AAGUAGUUCAUCAUCUGGG 2969 2970 2077-2095 CCAGAUGAUGAACUACUUC GAAGUAGUUCAUCAUCUGG 2971 2972 2078-2096 CAGAUGAUGAACUACUUCC GGAAGUAGUUCAUCAUCUG 2973 2974 2079-2097 AGAUGAUGAACUACUUCCU AGGAAGUAGUUCAUCAUCU 2975 2976 2080-2098 GAUGAUGAACUACUUCCUU AAGGAAGUAGUUCAUCAUC 2977 2978 2081-2099 AUGAUGAACUACUUCCUUG CAAGGAAGUAGUUCAUCAU 2979 2980 2082-2100 UGAUGAACUACUUCCUUGA UCAAGGAAGUAGUUCAUCA 2981 2982 2083-2101 GAUGAACUACUUCCUUGAG CUCAAGGAAGUAGUUCAUC 2983 2984 2084-2102 AUGAACUACUUCCUUGAGA UCUCAAGGAAGUAGUUCAU 2985 2986 2085-2103 UGAACUACUUCCUUGAGAA UUCUCAAGGAAGUAGUUCA 2987 2988 2086-2104 GAACUACUUCCUUGAGAAU AUUCUCAAGGAAGUAGUUC 2989 2990 2087-2105 AACUACUUCCUUGAGAAUC GAUUCUCAAGGAAGUAGUU 2991 2992 2088-2106 ACUACUUCCUUGAGAAUCU AGAUUCUCAAGGAAGUAGU 2993 2994 2089-2107 CUACUUCCUUGAGAAUCUG CAGAUUCUCAAGGAAGUAG 2995 2996 2090-2108 UACUUCCUUGAGAAUCUGC GCAGAUUCUCAAGGAAGUA 2997 2998 2091-2109 ACUUCCUUGAGAAUCUGCU AGCAGAUUCUCAAGGAAGU 2999 3000 2117-2135 UGGAAGCAAGUGGGGCUGG CCAGCCCCACUUGCUUCCA 3001 3002 2118-2136 GGAAGCAAGUGGGGCUGGA UCCAGCCCCACUUGCUUCC 3003 3004 2119-2137 GAAGCAAGUGGGGCUGGAA UUCCAGCCCCACUUGCUUC 3005 3006 2120-2138 AAGCAAGUGGGGCUGGAAC GUUCCAGCCCCACUUGCUU 3007 3008 2121-2139 AGCAAGUGGGGCUGGAACU AGUUCCAGCCCCACUUGCU

3009 3010 2122-2140 GCAAGUGGGGCUGGAACUG CAGUUCCAGCCCCACUUGC 3011 3012 2123-2141 CAAGUGGGGCUGGAACUGA UCAGUUCCAGCCCCACUUG 3013 3014 2124-2142 AAGUGGGGCUGGAACUGAA UUCAGUUCCAGCCCCACUU 3015 3016 2125-2143 AGUGGGGCUGGAACUGAAG CUUCAGUUCCAGCCCCACU 3017 3018 2126-2144 GUGGGGCUGGAACUGAAGC GCUUCAGUUCCAGCCCCAC 3019 3020 2127-2145 UGGGGCUGGAACUGAAGCC GGCUUCAGUUCCAGCCCCA 3021 3022 2147-2165 CAUUCCUCAGCUGAGUGCA UGCACUCAGCUGAGGAAUG 3023 3024 2148-2166 AUUCCUCAGCUGAGUGCAA UUGCACUCAGCUGAGGAAU 3025 3026 2149-2167 UUCCUCAGCUGAGUGCAAC GUUGCACUCAGCUGAGGAA 3027 3028 2150-2168 UCCUCAGCUGAGUGCAACU AGUUGCACUCAGCUGAGGA 3029 3030 2151-2169 CCUCAGCUGAGUGCAACUU AAGUUGCACUCAGCUGAGG 3031 3032 2152-2170 CUCAGCUGAGUGCAACUUC GAAGUUGCACUCAGCUGAG 3033 3034 2153-2171 UCAGCUGAGUGCAACUUCU AGAAGUUGCACUCAGCUGA 3035 3036 2154-2172 CAGCUGAGUGCAACUUCUG CAGAAGUUGCACUCAGCUG 3037 3038 2155-2173 AGCUGAGUGCAACUUCUGC GCAGAAGUUGCACUCAGCU 3039 3040 2156-2174 GCUGAGUGCAACUUCUGCA UGCAGAAGUUGCACUCAGC 3041 3042 2157-2175 CUGAGUGCAACUUCUGCAG CUGCAGAAGUUGCACUCAG 3043 3044 2158-2176 UGAGUGCAACUUCUGCAGG CCUGCAGAAGUUGCACUCA 3045 3046 2159-2177 GAGUGCAACUUCUGCAGGA UCCUGCAGAAGUUGCACUC 3047 3048 2160-2178 AGUGCAACUUCUGCAGGAG CUCCUGCAGAAGUUGCACU 3049 3050 2161-2179 GUGCAACUUCUGCAGGAGG CCUCCUGCAGAAGUUGCAC 3051 3052 2162-2180 UGCAACUUCUGCAGGAGGC GCCUCCUGCAGAAGUUGCA 3053 3054 2163-2181 GCAACUUCUGCAGGAGGCC GGCCUCCUGCAGAAGUUGC 3055 3056 2164-2182 CAACUUCUGCAGGAGGCCA UGGCCUCCUGCAGAAGUUG 3057 3058 2165-2183 AACUUCUGCAGGAGGCCAC GUGGCCUCCUGCAGAAGUU 3059 3060 2166-2184 ACUUCUGCAGGAGGCCACU AGUGGCCUCCUGCAGAAGU 3061 3062 2167-2185 CUUCUGCAGGAGGCCACUG CAGUGGCCUCCUGCAGAAG 3063 3064 2168-2186 UUCUGCAGGAGGCCACUGC GCAGUGGCCUCCUGCAGAA 3065 3066 2169-2187 UCUGCAGGAGGCCACUGCA UGCAGUGGCCUCCUGCAGA 3067 3068 2170-2188 CUGCAGGAGGCCACUGCAU AUGCAGUGGCCUCCUGCAG 3069 3070 2171-2189 UGCAGGAGGCCACUGCAUU AAUGCAGUGGCCUCCUGCA 3071 3072 2172-2190 GCAGGAGGCCACUGCAUUU AAAUGCAGUGGCCUCCUGC 3073 3074 2173-2191 CAGGAGGCCACUGCAUUUU AAAAUGCAGUGGCCUCCUG 3075 3076 2174-2192 AGGAGGCCACUGCAUUUUG CAAAAUGCAGUGGCCUCCU 3077 3078 2175-2193 GGAGGCCACUGCAUUUUGA UCAAAAUGCAGUGGCCUCC 3079 3080 2176-2194 GAGGCCACUGCAUUUUGAA UUCAAAAUGCAGUGGCCUC 3081 3082 2177-2195 AGGCCACUGCAUUUUGAAG CUUCAAAAUGCAGUGGCCU 3083 3084 2178-2196 GGCCACUGCAUUUUGAAGU ACUUCAAAAUGCAGUGGCC 3085 3086 2179-2197 GCCACUGCAUUUUGAAGUG CACUUCAAAAUGCAGUGGC 3087 3088 2180-2198 CCACUGCAUUUUGAAGUGA UCACUUCAAAAUGCAGUGG 3089 3090 2181-2199 CACUGCAUUUUGAAGUGAU AUCACUUCAAAAUGCAGUG 3091 3092 2182-2200 ACUGCAUUUUGAAGUGAUG CAUCACUUCAAAAUGCAGU 3093 3094 2183-2201 CUGCAUUUUGAAGUGAUGA UCAUCACUUCAAAAUGCAG 3095 3096 2184-2202 UGCAUUUUGAAGUGAUGAG CUCAUCACUUCAAAAUGCA 3097 3098 2185-2203 GCAUUUUGAAGUGAUGAGU ACUCAUCACUUCAAAAUGC 3099 3100 2186-2204 CAUUUUGAAGUGAUGAGUG CACUCAUCACUUCAAAAUG 3101 3102 2187-2205 AUUUUGAAGUGAUGAGUGA UCACUCAUCACUUCAAAAU 3103 3104 2188-2206 UUUUGAAGUGAUGAGUGAA UUCACUCAUCACUUCAAAA 3105 3106 2190-2208 UUGAAGUGAUGAGUGAAAG CUUUCACUCAUCACUUCAA 3107 3108 2191-2209 UGAAGUGAUGAGUGAAAGA UCUUUCACUCAUCACUUCA

3109 3110 2192-2210 GAAGUGAUGAGUGAAAGAG CUCUUUCACUCAUCACUUC 3111 3112 2193-2211 AAGUGAUGAGUGAAAGAGA UCUCUUUCACUCAUCACUU 3113 3114 2194-2212 AGUGAUGAGUGAAAGAGAG CUCUCUUUCACUCAUCACU 3115 3116 2195-2213 GUGAUGAGUGAAAGAGAGA UCUCUCUUUCACUCAUCAC 3117 3118 2196-2214 UGAUGAGUGAAAGAGAGAA UUCUCUCUUUCACUCAUCA 3119 3120 2197-2215 GAUGAGUGAAAGAGAGAAG CUUCUCUCUUUCACUCAUC 3121 3122 2198-2216 AUGAGUGAAAGAGAGAAGU ACUUCUCUCUUUCACUCAU 3123 3124 2199-2217 UGAGUGAAAGAGAGAAGUC GACUUCUCUCUUUCACUCA 3125 3126 2200-2218 GAGUGAAAGAGAGAAGUCC GGACUUCUCUCUUUCACUC 3127 3128 2201-2219 AGUGAAAGAGAGAAGUCCU AGGACUUCUCUCUUUCACU 3129 3130 2202-2220 GUGAAAGAGAGAAGUCCUA UAGGACUUCUCUCUUUCAC 3131 3132 2203-2221 UGAAAGAGAGAAGUCCUAU AUAGGACUUCUCUCUUUCA 3133 3134 2204-2222 GAAAGAGAGAAGUCCUAUU AAUAGGACUUCUCUCUUUC 3135 3136 2205-2223 AAAGAGAGAAGUCCUAUUU AAAUAGGACUUCUCUCUUU 3137 3138 2206-2224 AAGAGAGAAGUCCUAUUUC GAAAUAGGACUUCUCUCUU 3139 3140 2207-2225 AGAGAGAAGUCCUAUUUCU AGAAAUAGGACUUCUCUCU 3141 3142 2208-2226 GAGAGAAGUCCUAUUUCUC GAGAAAUAGGACUUCUCUC 3143 3144 2209-2227 AGAGAAGUCCUAUUUCUCA UGAGAAAUAGGACUUCUCU 3145 3146 2210-2228 GAGAAGUCCUAUUUCUCAG CUGAGAAAUAGGACUUCUC 3147 3148 2211-2229 AGAAGUCCUAUUUCUCAGG CCUGAGAAAUAGGACUUCU 3149 3150 2212-2230 GAAGUCCUAUUUCUCAGGC GCCUGAGAAAUAGGACUUC 3151 3152 2213-2231 AAGUCCUAUUUCUCAGGCU AGCCUGAGAAAUAGGACUU 3153 3154 2214-2232 AGUCCUAUUUCUCAGGCUU AAGCCUGAGAAAUAGGACU 3155 3156 2215-2233 GUCCUAUUUCUCAGGCUUG CAAGCCUGAGAAAUAGGAC 3157 3158 2216-2234 UCCUAUUUCUCAGGCUUGA UCAAGCCUGAGAAAUAGGA 3159 3160 2217-2235 CCUAUUUCUCAGGCUUGAG CUCAAGCCUGAGAAAUAGG 3161 3162 2218-2236 CUAUUUCUCAGGCUUGAGC GCUCAAGCCUGAGAAAUAG 3163 3164 2219-2237 UAUUUCUCAGGCUUGAGCA UGCUCAAGCCUGAGAAAUA 3165 3166 2220-2238 AUUUCUCAGGCUUGAGCAA UUGCUCAAGCCUGAGAAAU 3167 3168 2221-2239 UUUCUCAGGCUUGAGCAAG CUUGCUCAAGCCUGAGAAA 3169 3170 2222-2240 UUCUCAGGCUUGAGCAAGU ACUUGCUCAAGCCUGAGAA 3171 3172 2223-2241 UCUCAGGCUUGAGCAAGUU AACUUGCUCAAGCCUGAGA 3173 3174 2224-2242 CUCAGGCUUGAGCAAGUUG CAACUUGCUCAAGCCUGAG 3175 3176 2225-2243 UCAGGCUUGAGCAAGUUGG CCAACUUGCUCAAGCCUGA 3177 3178 2226-2244 CAGGCUUGAGCAAGUUGGU ACCAACUUGCUCAAGCCUG 3179 3180 2229-2247 GCUUGAGCAAGUUGGUAUC GAUACCAACUUGCUCAAGC 3181 3182 2231-2249 UUGAGCAAGUUGGUAUCUG CAGAUACCAACUUGCUCAA 3183 3184 2232-2250 UGAGCAAGUUGGUAUCUGC GCAGAUACCAACUUGCUCA 3185 3186 2233-2251 GAGCAAGUUGGUAUCUGCU AGCAGAUACCAACUUGCUC 3187 3188 2234-2252 AGCAAGUUGGUAUCUGCUC GAGCAGAUACCAACUUGCU 3189 3190 2235-2253 GCAAGUUGGUAUCUGCUCA UGAGCAGAUACCAACUUGC 3191 3192 2236-2254 CAAGUUGGUAUCUGCUCAG CUGAGCAGAUACCAACUUG 3193 3194 2237-2255 AAGUUGGUAUCUGCUCAGG CCUGAGCAGAUACCAACUU 3195 3196 2238-2256 AGUUGGUAUCUGCUCAGGC GCCUGAGCAGAUACCAACU 3197 3198 2239-2257 GUUGGUAUCUGCUCAGGCC GGCCUGAGCAGAUACCAAC 3199 3200 2240-2258 UUGGUAUCUGCUCAGGCCU AGGCCUGAGCAGAUACCAA 3201 3202 2241-2259 UGGUAUCUGCUCAGGCCUG CAGGCCUGAGCAGAUACCA 3203 3204 2242-2260 GGUAUCUGCUCAGGCCUGA UCAGGCCUGAGCAGAUACC 3205 3206 2243-2261 GUAUCUGCUCAGGCCUGAG CUCAGGCCUGAGCAGAUAC 3207 3208 2244-2262 UAUCUGCUCAGGCCUGAGC GCUCAGGCCUGAGCAGAUA

3209 3210 2245-2263 AUCUGCUCAGGCCUGAGCA UGCUCAGGCCUGAGCAGAU 3211 3212 2246-2264 UCUGCUCAGGCCUGAGCAU AUGCUCAGGCCUGAGCAGA 3213 3214 2247-2265 CUGCUCAGGCCUGAGCAUG CAUGCUCAGGCCUGAGCAG 3215 3216 2248-2266 UGCUCAGGCCUGAGCAUGA UCAUGCUCAGGCCUGAGCA 3217 3218 2249-2267 GCUCAGGCCUGAGCAUGAC GUCAUGCUCAGGCCUGAGC 3219 3220 2250-2268 CUCAGGCCUGAGCAUGACC GGUCAUGCUCAGGCCUGAG 3221 3222 2251-2269 UCAGGCCUGAGCAUGACCU AGGUCAUGCUCAGGCCUGA 3223 3224 2252-2270 CAGGCCUGAGCAUGACCUC GAGGUCAUGCUCAGGCCUG 3225 3226 2253-2271 AGGCCUGAGCAUGACCUCA UGAGGUCAUGCUCAGGCCU 3227 3228 2279-2297 CACUUAACCCCAGGCCAUU AAUGGCCUGGGGUUAAGUG 3229 3230 2280-2298 ACUUAACCCCAGGCCAUUA UAAUGGCCUGGGGUUAAGU 3231 3232 2281-2299 CUUAACCCCAGGCCAUUAU AUAAUGGCCUGGGGUUAAG 3233 3234 2282-2300 UUAACCCCAGGCCAUUAUC GAUAAUGGCCUGGGGUUAA 3235 3236 2283-2301 UAACCCCAGGCCAUUAUCA UGAUAAUGGCCUGGGGUUA 3237 3238 2284-2302 AACCCCAGGCCAUUAUCAU AUGAUAAUGGCCUGGGGUU 3239 3240 2285-2303 ACCCCAGGCCAUUAUCAUA UAUGAUAAUGGCCUGGGGU 3241 3242 2287-2305 CCCAGGCCAUUAUCAUAUC GAUAUGAUAAUGGCCUGGG 3243 3244 2288-2306 CCAGGCCAUUAUCAUAUCC GGAUAUGAUAAUGGCCUGG 3245 3246 2289-2307 CAGGCCAUUAUCAUAUCCA UGGAUAUGAUAAUGGCCUG 3247 3248 2290-2308 AGGCCAUUAUCAUAUCCAG CUGGAUAUGAUAAUGGCCU 3249 3250 2291-2309 GGCCAUUAUCAUAUCCAGA UCUGGAUAUGAUAAUGGCC 3251 3252 2292-2310 GCCAUUAUCAUAUCCAGAU AUCUGGAUAUGAUAAUGGC 3253 3254 2314-2332 CUUCAGAGUUGUCUUUAUA UAUAAAGACAACUCUGAAG 3255 3256 2315-2333 UUCAGAGUUGUCUUUAUAU AUAUAAAGACAACUCUGAA 3257 3258 2316-2334 UCAGAGUUGUCUUUAUAUG CAUAUAAAGACAACUCUGA 3259 3260 2318-2336 AGAGUUGUCUUUAUAUGUG CACAUAUAAAGACAACUCU 3261 3262 2322-2340 UUGUCUUUAUAUGUGAAUU AAUUCACAUAUAAAGACAA 3263 3264 2323-2341 UGUCUUUAUAUGUGAAUUA UAAUUCACAUAUAAAGACA 3265 3266 2324-2342 GUCUUUAUAUGUGAAUUAA UUAAUUCACAUAUAAAGAC 3267 3268 2325-2343 UCUUUAUAUGUGAAUUAAG CUUAAUUCACAUAUAAAGA 3269 3270 2326-2344 CUUUAUAUGUGAAUUAAGU ACUUAAUUCACAUAUAAAG 3271 3272 2327-2345 UUUAUAUGUGAAUUAAGUU AACUUAAUUCACAUAUAAA 3273 3274 2328-2346 UUAUAUGUGAAUUAAGUUA UAACUUAAUUCACAUAUAA 3275 3276 2329-2347 UAUAUGUGAAUUAAGUUAU AUAACUUAAUUCACAUAUA 3277 3278 2330-2348 AUAUGUGAAUUAAGUUAUA UAUAACUUAAUUCACAUAU 3279 3280 2331-2349 UAUGUGAAUUAAGUUAUAU AUAUAACUUAAUUCACAUA 3281 3282 2332-2350 AUGUGAAUUAAGUUAUAUU AAUAUAACUUAAUUCACAU 3283 3284 2333-2351 UGUGAAUUAAGUUAUAUUA UAAUAUAACUUAAUUCACA 3285 3286 2334-2352 GUGAAUUAAGUUAUAUUAA UUAAUAUAACUUAAUUCAC 3287 3288 2335-2353 UGAAUUAAGUUAUAUUAAA UUUAAUAUAACUUAAUUCA 3289 3290 2336-2354 GAAUUAAGUUAUAUUAAAU AUUUAAUAUAACUUAAUUC 3291 3292 2337-2355 AAUUAAGUUAUAUUAAAUU AAUUUAAUAUAACUUAAUU 3293 3294 2338-2356 AUUAAGUUAUAUUAAAUUU AAAUUUAAUAUAACUUAAU 3295 3296 2339-2357 UUAAGUUAUAUUAAAUUUU AAAAUUUAAUAUAACUUAA 3297 3298 2340-2358 UAAGUUAUAUUAAAUUUUA UAAAAUUUAAUAUAACUUA 3299 3300 2341-2359 AAGUUAUAUUAAAUUUUAA UUAAAAUUUAAUAUAACUU 3301 3302 2342-2360 AGUUAUAUUAAAUUUUAAU AUUAAAAUUUAAUAUAACU 3303 3304 2343-2361 GUUAUAUUAAAUUUUAAUC GAUUAAAAUUUAAUAUAAC 3305 3306 2345-2363 UAUAUUAAAUUUUAAUCUA UAGAUUAAAAUUUAAUAUA 3307 3308 2346-2364 AUAUUAAAUUUUAAUCUAU AUAGAUUAAAAUUUAAUAU

3309 3310 2347-2365 UAUUAAAUUUUAAUCUAUA UAUAGAUUAAAAUUUAAUA 3311 3312 2348-2366 AUUAAAUUUUAAUCUAUAG CUAUAGAUUAAAAUUUAAU 3313 3314 2349-2367 UUAAAUUUUAAUCUAUAGU ACUAUAGAUUAAAAUUUAA 3315 3316 2350-2368 UAAAUUUUAAUCUAUAGUA UACUAUAGAUUAAAAUUUA 3317 3318 2351-2369 AAAUUUUAAUCUAUAGUAA UUACUAUAGAUUAAAAUUU 3319 3320 2354-2372 UUUUAAUCUAUAGUAAAAA UUUUUACUAUAGAUUAAAA 3321 3322 2355-2373 UUUAAUCUAUAGUAAAAAC GUUUUUACUAUAGAUUAAA 3323 3324 2356-2374 UUAAUCUAUAGUAAAAACA UGUUUUUACUAUAGAUUAA 3325 3326 2357-2375 UAAUCUAUAGUAAAAACAU AUGUUUUUACUAUAGAUUA 3327 3328 2358-2376 AAUCUAUAGUAAAAACAUA UAUGUUUUUACUAUAGAUU 3329 3330 2359-2377 AUCUAUAGUAAAAACAUAG CUAUGUUUUUACUAUAGAU 3331 3332 2360-2378 UCUAUAGUAAAAACAUAGU ACUAUGUUUUUACUAUAGA 3333 3334 2361-2379 CUAUAGUAAAAACAUAGUC GACUAUGUUUUUACUAUAG 3335 3336 2362-2380 UAUAGUAAAAACAUAGUCC GGACUAUGUUUUUACUAUA 3337 3338 2363-2381 AUAGUAAAAACAUAGUCCU AGGACUAUGUUUUUACUAU 3339 3340 2364-2382 UAGUAAAAACAUAGUCCUG CAGGACUAUGUUUUUACUA 3341 3342 2365-2383 AGUAAAAACAUAGUCCUGG CCAGGACUAUGUUUUUACU 3343 3344 2366-2384 GUAAAAACAUAGUCCUGGA UCCAGGACUAUGUUUUUAC 3345 3346 2367-2385 UAAAAACAUAGUCCUGGAA UUCCAGGACUAUGUUUUUA 3347 3348 2368-2386 AAAAACAUAGUCCUGGAAA UUUCCAGGACUAUGUUUUU 3349 3350 2369-2387 AAAACAUAGUCCUGGAAAU AUUUCCAGGACUAUGUUUU 3351 3352 2370-2388 AAACAUAGUCCUGGAAAUA UAUUUCCAGGACUAUGUUU 3353 3354 2371-2389 AACAUAGUCCUGGAAAUAA UUAUUUCCAGGACUAUGUU 3355 3356 2372-2390 ACAUAGUCCUGGAAAUAAA UUUAUUUCCAGGACUAUGU 3357 3358 2373-2391 CAUAGUCCUGGAAAUAAAU AUUUAUUUCCAGGACUAUG 3359 3360 2374-2392 AUAGUCCUGGAAAUAAAUU AAUUUAUUUCCAGGACUAU 3361 3362 2375-2393 UAGUCCUGGAAAUAAAUUC GAAUUUAUUUCCAGGACUA 3363 3364 2377-2395 GUCCUGGAAAUAAAUUCUU AAGAAUUUAUUUCCAGGAC 3365 3366 2378-2396 UCCUGGAAAUAAAUUCUUG CAAGAAUUUAUUUCCAGGA

Пример 9. Подавление предшественников порфиринов с использованием ми-РНК ALAS1 в случае применения подхода острого лечения

Мышиную модель AIP (См. пример 5) использовали для исследования того, может ли ми-РНК ALAS1 работать в случае применения подхода острого лечения, снижая уже повышенные уровни ALA и PBG, что может иметь место, например, когда пациент с порфирией страдает от острого приступа. Введение LND11-препарат ми-РНК AD-53558 в дозе 1 мг/кг через 12 часов после последней дозы фенобарбитала быстро снижало уровни ALA и PBG в плазме мышей, тогда как у контрольных обработанных Luc животных уровни продолжали возрастать (фиг. 14). Полученные результаты показывают, что ми-РНК ALAS является эффективной при лечении острого приступа. ми-РНК ALAS1 эффективно снижала и предотвращала дальнейшее повышение уровней ALA и PBG.

Пример 10. ми-РНК, мишенью которых является ALAS1

Дополнительные немодифицированные и модифицированные последовательности ми-РНК, мишенью которых является ALAS1, конструировали и получали, как описано в примере 2. Активность in vitro модифицированных дуплексов тестировали, как описано ниже.

Способы

Опосредованная липидами трансфекция

В случае Hep3B, PMH и первичных гепатоцитов макак-крабоедов трансфекцию осуществляли, добавляя по 14,8 мкл Opti-MEM плюс 0,2 мкл липофектамина RNAiMax на лунку (Invitrogen, Carlsbad CA, номер в каталоге 13778-150) к 5 мкл каждого дуплекса ми-РНК в отдельной лунке в 96-луночном планшете. Затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем к смеси ми-РНК добавляли восемнадцать микролитров полной ростовой среды без антибиотика, содержащей соответствующее количество клеток. Клетки инкубировали в течение 24 часов перед очисткой РНК.

Эксперименты с введением однократной дозы осуществляли, используя конечную концентрацию дуплекса 1 мкМ, 500 нМ, 20 нМ, 10 нМ и 0,2 нМ в случае GalNAc-модифицированных последовательностей.

Трансфекция в результате свободного захвата

Криозамороженные первичные гепатоциты макака-крабоеда (Celsis In Vitro Technologies, M003055-P) размораживали на водяной бане при 37°C непосредственно перед использованием и ресуспендировали в концентрации 0,26×106 клеток/мл в среде InVitroGRO CP (посев) (Celsis In Vitro Technologies, номер в каталоге Z99029). Во время трансфекции клетки высевали на 96-луночный планшет с коллагеном BD BioCoat (BD, 356407) по 25000 клеток на лунку и инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO2. Эксперименты по свободному захвату осуществляли, добавляя по 10 мкл дуплексов ми-РНК в PBS на лунку в 96-луночный (96л) планшет. Затем к ми-РНК добавляли девяносто микролитров полной ростовой среды, содержащей соответствующее количество клеток для данного типа клеток. Клетки инкубировали в течение 24 часов перед очисткой РНК. Эксперименты с введением однократных доз осуществляли, используя конечную концентрацию дуплекса 1 мкМ, 500 нМ, 20 нМ и 10 нМ.

Выделение суммарной РНК с использованием набора для выделения мРНК DYNABEADS (Invitrogen, серия №: 610-12)

Клетки собирали и лизировали в 150 мкл буфера для лизиса/связывания, затем перемешивали в течение 5 минут при 850 об./мин, используя термомиксер Eppendorf (скорость перемешивания была одинаковой на протяжении всего процесса). Добавляли десять микролитров магнитных шариков и 80 мкл буфера для лизиса/связывания в лунки планшета с круглым дном и перемешивали в течение 1 минуты. Магнитные шарики улавливали, используя магнитную подставку, и надосадок удаляли, не нарушая шарики. После удаления надосадка к оставшимся шарикам добавляли лизированные клетки и перемешивали в течение 5 минут. После удаления надосадка магнитные шарики промывали 2 раза, используя 150 мкл буфера для промывки A, и перемешивали в течение 1 минуты. Шарики улавливали и надосадок удаляли. Затем шарики промывали, используя 150 мкл буфера для промывки B, улавливали и надосадок удаляли. Шарики снова промывали 150 мкл буфера для элюирования, улавливали и надосадок удаляли. Шарикам давали возможность высохнуть в течение 2 минут. После сушки добавляли 50 мкл буфера для элюирования и перемешивали в течение 5 минут при 70°C. Шарики улавливали на магните в течение 5 минут. Сорок пять мкл надосадка извлекали и добавляли в другой 96-луночный планшет.

Синтез кДНК с использованием набора для высокопроизводительной обратной транскрипции кДНК ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, № в каталоге 4368813)

Готовили маточную смесь, состоящую из 2 мкл 10X буфера, 0,8 мкл 25X dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКаз и 3,2 мкл H2O на реакцию. Смешивали равные объемы маточной смеси и РНК до конечного объема 12 мкл в случае образцов, которые были подвергнуты скринингу in vitro, или 20 мкл в случае образцов, которые были подвергнуты скринингу in vivo. кДНК получали, используя термоциклер Bio-Rad C-1000 или S-1000 (Hercules, CA), выполняя следующие стадии: 25°C 10 минут, 37°C 120 минут, 85°C 5 секунд, 4°C - хранение.

ПЦР в реальном времени

Два мкл кДНК добавляли к маточной смеси, содержащей 2 мкл H2O, 0,5 мкл зонда GAPDH TaqMan (Life Technologies, № в каталоге 4326317E в случае клеток Hep3B cells, номер в каталоге 352339E в случае первичных гепатоцитов мыши или специально приготовленного зонда в случае первичных гепатоцитов макака-крабоеда), 0,5 мкл зонда C5 TaqMan probe (Life Technologies, номер в каталоге Hs00167441_m1 в случае клеток Hep3B или Mm00457879_m1 в случае первичных гепатоцитов мыши или специально приготовленного зонда в случае первичных гепатоцитов макака-крабоеда) и 5 мкл маточной смеси зонда Lightcycler 480 (Roche, номер в каталоге 04887301001) на лунку в 384-луночные (384 w) планшеты (Roche, номер в каталоге 04887301001). ПЦР в реальном времени осуществляли в системе для ПЦР в реальном времени Roche LC480 (Roche), используя анализ ΔΔCt(RQ). В случае скрининга in vitro каждый дуплекс тестировали с двумя биологическими повторами, если не указано иное, и каждую ПЦР в реальном времени осуществляли в двух технических повторах. В случае скрининга in vivo каждый дуплекс тестировали в одном или нескольких экспериментах (3 мыши на группу), и каждую ПЦР в реальном времени осуществляли в двух технических повторах.

Чтобы вычислить относительное кратное изменение уровней мРНК ALAS1, данные, полученные в реальном времени, анализировали, используя способ ΔΔCt, и нормализовали по отношению к данным анализов, осуществляемых с использованием клеток, трансфицированных 10 нм AD-1955, или ложно трансфицированных клеток. IC50 вычисляли с помощью модели подгонки по 4 параметрам, используя XLFit, и нормализовали по отношению к клеткам, трансфицированным AD-1955, в том же диапазоне доз или по отношению к собственной наименьшей дозе.

Смысловые и антисмысловые последовательности AD-1955:

Смысловая: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 3682)

Антисмысловая: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 3683).

Последовательности одиночных нитей и дуплексов модифицированных и немодифицированных ми-РНК представлены в таблице 14 и таблице 15, соответственно.

Таблица 14
Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') Сайты-мишени антисмысловой последовательности на NM_ 000688.4 3371 3372 AD-58848 CfsasUfgCfcAfaAfAfAfuGfgAfcAfuCfaUfL96 asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgCfaUfgsAfsc 1635-1657 3373 3374 AD-58849 AfsusUfuUfgAfaGfUfGfaUfgAfgUfgAfaAfL96 usUfsuCfaCfuCfaUfcacUfuCfaAfaAfusGfsc 2189-2211 3375 3376 AD-58850 AfsgsUfuAfuAfuUfAfAfaUfuUfuAfaUfcUfL96 asGfsaUfuAfaAfaUfuuaAfuAfuAfaCfusUfsa 2344-2366 3377 3378 AD-58851 GfscsAfuUfuUfgAfAfGfuGfaUfgAfgUfgAfL96 usCfsaCfuCfaUfcAfcuuCfaAfaAfuGfcsAfsg 2187-2209 3379 3380 AD-58852 GfsasAfcUfaAfuGfAfGfcAfgAfcAfuAfaCfL96 gsUfsuAfuGfuCfuGfcucAfuUfaGfuUfcsAfsu 1975-1997 3381 3382 AD-58853 AfsasUfgAfcCfaCfAfCfcUfaUfcGfaGfuUfL96 asAfscUfcGfaUfaGfgugUfgGfuCfaUfusCfsu 973-995 3383 3384 AD-58854 UfsasAfaUfuUfuAfAfUfcUfaUfaGfuAfaAfL96 usUfsuAfcUfaUfaGfauuAfaAfaUfuUfasAfsu 2352-2374 3385 3386 AD-58855 UfsusCfaGfuAfuGfAfUfcGfuUfuCfuUfuGfL96 csAfsaAfgAfaAfcGfaucAfuAfcUfgAfasAfsa 929-951 3387 3388 AD-58856 CfsasCfuUfuUfcAfGfUfaUfgAfuCfgUfuUfL96 asAfsaCfgAfuCfaUfacuGfaAfaAfgUfgsGfsa 924-946 3389 3390 AD-58857 AfsasAfuCfuGfuUfUfCfcAfcUfuUfuCfaGfL96 csUfsgAfaAfaGfuGfgaaAfcAfgAfuUfusUfsg 913-935 3391 3392 AD-58858 CfsasUfuUfgAfaAfCfUfgUfcCfaUfuCfaAfL96 usUfsgAfaUfgGfaCfaguUfuCfaAfaUfgsCfsc 1478-1500 3393 3394 AD-58859 CfscsUfaUfcGfaGfUfUfuUfuAfaAfaCfuGfL96 csAfsgUfuUfuAfaAfaacUfcGfaUfaGfgsUfsg 983-1005 3395 3396 AD-58861 GfsasCfcAfgAfaAfGfAfgUfgUfcUfcAfuCfL96 gsAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfuGfgUfcsUfsu 872-894 3397 3398 AD-58862 AfscsCfaGfaAfaGfAfGfuGfuCfuCfaUfcUfL96 asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcUfgGfusCfsu 873-895 3399 3400 AD-58863 AfscsUfaAfuGfaGfCfAfgAfcAfuAfaCfaUfL96 asUfsgUfuAfuGfuCfugcUfcAfuUfaGfusUfsc 1977-1999 3401 3402 AD-58864 UfsasGfuAfaAfaAfCfAfuAfgUfcCfuGfgAfL96 usCfscAfgGfaCfuAfuguUfuUfuAfcUfasUfsa 2366-2388 3403 3404 AD-58865 UfsasUfuUfcUfgGfAfAfcUfaGfuAfaAfuUfL96 asAfsuUfuAfcUfaGfuucCfaGfaAfaUfasUfsu 1185-1207 3405 3406 AD-58867 UfsusCfuGfcAfaAfGfCfcAfgUfcUfuGfaGfL96 csUfscAfaGfaCfuGfgcuUfuGfcAfgAfasGfsa 706-728 3407 3408 AD-58868 GfsasGfgAfaAfgAfGfGfuUfgCfuGfaAfaCfL96 gsUfsuUfcAfgCfaAfccuCfuUfuCfcUfcsAfsc 759-781

3409 3410 AD-58869 GfsgsUfaCfuAfgAfAfAfuAfuUfuCfuGfgAfL96 usCfscAfgAfaAfuAfuuuCfuAfgUfaCfcsAfsc 1174-1196 3411 3412 AD-58870 GfsasCfaUfcAfuGfCfAfaAfaGfcAfaAfgAfL96 usCfsuUfuGfcUfuUfugcAfuGfaUfgUfcsCfsu 853-875 3413 3414 AD-58871 AfsasAfuUfuUfaAfUfCfuAfuAfgUfaAfaAfL96 usUfsuUfaCfuAfuAfgauUfaAfaAfuUfusAfsa 2353-2375 3415 3416 AD-58873 CfsasUfgAfuCfcAfAfGfgGfaUfuCfgAfaAfL96 usUfsuCfgAfaUfcCfcuuGfgAfuCfaUfgsGfsa 1362-1384 3417 3418 AD-58874 AfsgsAfcCfaGfaAfAfGfaGfuGfuCfuCfaUfL96 asUfsgAfgAfcAfcUfcuuUfcUfgGfuCfusUfsu 871-893 3419 3420 AD-58875 AfsusCfcUfgAfaGfAfGfcGfcUfgAfgGfgAfL96 usCfscCfuCfaGfcGfcucUfuCfaGfgAfusCfsc 1810-1832 3421 3422 AD-58876 GfsusCfuGfuGfaUfGfAfaCfuAfaUfgAfgCfL96 gsCfsuCfaUfuAfgUfucaUfcAfcAfgAfcsUfsu 1966-1988 3423 3424 AD-58877 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuCfL96 gsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsGfsu 875-897 3425 3426 AD-58878 AfscsUfuUfuCfaGfUfAfuGfaUfcGfuUfuCfL96 gsAfsaAfcGfaUfcAfuacUfgAfaAfaGfusGfsg 925-947 3427 3428 AD-58879 UfscsAfuGfcCfaAfAfAfaUfgGfaCfaUfcAfL96 usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcAfuGfasCfsu 1634-1656 3429 3430 AD-58880 AfsasUfaUfuUfcUfGfGfaAfcUfaGfuAfaAfL96 usUfsuAfcUfaGfuUfccaGfaAfaUfaUfusUfsc 1183-1205 3431 3432 AD-58881 CfsusUfcUfuCfaAfGfAfuAfaCfuUfgCfcAfL96 usGfsgCfaAfgUfuAfucuUfgAfaGfaAfgsAfsu 892-914 3433 3434 AD-58882 UfsusUfcAfgUfaUfGfAfuCfgUfuUfcUfuUfL96 asAfsaGfaAfaCfgAfucaUfaCfuGfaAfasAfsg 928-950 3435 3436 AD-58883 CfscsCfaGfuGfuGfGfUfuAfgUfgUfgAfaAfL96 usUfsuCfaCfaCfuAfaccAfcAfcUfgGfgsGfsc 790-812 3437 3438 AD-58884 GfscsUfgUfgAfgAfUfUfuAfcUfcUfgAfuUfL96 asAfsuCfaGfaGfuAfaauCfuCfaCfaGfcsCfsu 1325-1347 3439 3440 AD-58885 AfsgsGfcUfuGfaGfCfAfaGfuUfgGfuAfuCfL96 gsAfsuAfcCfaAfcUfugcUfcAfaGfcCfusGfsa 2229-2251 3441 3442 AD-58886 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsUfsg 877-899 3443 3444 AD-58887 AfsusUfuCfuGfgAfAfCfuAfgUfaAfaUfuCfL96 gsAfsaUfuUfaCfuAfguuCfcAfgAfaAfusAfsu 1186-1208 3445 3446 AD-58888 UfsgsUfgAfuGfuGfGfCfcCfaUfgAfgUfuUfL96 asAfsaCfuCfaUfgGfgccAfcAfuCfaCfasCfsa 1531-1553 3447 3448 AD-58889 AfsasGfaGfaGfaAfGfUfcCfuAfuUfuCfuCfL96 gsAfsgAfaAfuAfgGfacuUfcUfcUfcUfusUfsc 2208-2230 3449 3450 AD-58890 UfsgsGfcAfgCfaCfAfGfaUfgAfaUfcAfgAfL96 usCfsuGfaUfuCfaUfcugUfgCfuGfcCfasGfsg 671-693 3451 3452 AD-58891 AfsusGfaUfcGfuUfUfCfuUfuGfaGfaAfaAfL96 usUfsuUfcUfcAfaAfgaaAfcGfaUfcAfusAfsc 935-957 3453 3454 AD-58892 UfscsUfgGfaAfcUfAfGfuAfaAfuUfcCfaUfL96 asUfsgGfaAfuUfuAfcuaGfuUfcCfaGfasAfsa 1189-1211 3455 3456 AD-59095 GfscsCfcAfuUfcUfUfAfuCfcCfgAfgUfL96 asCfsuCfgGfgAfuAfagaAfuGfgsgsc 360-382 3457 3458 AD-59096 GfsgsAfaCfcAfuGfCfCfuCfcAfuGfaUfL96 asUfscAfuGfgAfgGfcauGfgUfuscsc 1347-1369 3459 3460 AD-59097 UfsgsGfaGfuCfuGfUfGfcGfgAfuCf asGfsgAfuCfcGfcAfcagAfcUfc 1794-1816

cUfL96 scsa 3461 3462 AD-59098 CfsasCfcCfaCfgGfGfUfgUfgUfgGfgAfL96 usCfscCfaCfaCfaCfccgUfgGfgsusg 1112-1134 3463 3464 AD-59099 GfsgsAfgUfcUfgUfGfCfgGfaUfcCfuAfL96 usAfsgGfaUfcCfgCfacaGfaCfuscsc 1795-1817 3465 3466 AD-59100 CfsasAfaAfcUfgCfCfCfcAfaGfaUfgAfL96 usCfsaUfcUfuGfgGfgcaGfuUfususg 428-450 3467 3468 AD-59101 GfscsCfuCfcAfuGfAfUfcCfaAfgGfgAfL96 usCfscCfuUfgGfaUfcauGfgAfgsgsc 1355-1377 3469 3470 AD-59102 CfsasUfcAfuCfcCfUfGfuGfcGfgGfuUfL96 asAfscCfcGfcAfcAfgggAfuGfasusg 1921-1943 3471 3472 AD-59103 AfscsCfcAfcGfgGfUfGfuGfuGfgGfgAfL96 usCfscCfcAfcAfcAfcccGfuGfgsgsu 1113-1135 3473 3474 AD-59104 CfsasCfaUfcAfuCfCfCfuGfuGfcGfgAfL96 usCfscGfcAfcAfgGfgauGfaUfgsusg 1919-1941 3475 3476 AD-59105 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfL96 asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcsusg 873-895 3477 3478 AD-59106 CfscsUfcCfaUfgAfUfCfcAfaGfgGfaUfL96 asUfscCfcUfuGfgAfucaUfgGfasgsg 1356-1378 3479 3480 AD-59107 UfsgsCfcCfaUfuCfUfUfaUfcCfcGfaAfL96 usUfscGfgGfaUfaAfgaaUfgGfgscsa 359-381 3481 3482 AD-59108 CfsusUfcAfcCfcUfGfGfcUfaAfgAfuAfL96 usAfsuCfuUfaGfcCfaggGfuGfasasg 1297-1319 3483 3484 AD-59109 AfsusCfaUfcCfcUfGfUfgCfgGfgUfuAfL96 usAfsaCfcCfgCfaCfaggGfaUfgsasu 1922-1944 3485 3486 AD-59110 AfsgsAfaAfgAfgUfGfUfcUfcAfuCfuUfL96 asAfsgAfuGfaGfaCfacuCfuUfuscsu 874-896 3487 3488 AD-59111 CfsusCfcAfuGfaUfCfCfaAfgGfgAfuUfL96 asAfsuCfcCfuUfgGfaucAfuGfgsasg 1357-1379 3489 3490 AD-59112 CfscsAfuUfcUfuAfUfCfcCfgAfgUfcAfL96 usGfsaCfuCfgGfgAfuaaGfaAfusgsg 362-384 3491 3492 AD-59113 CfsasCfcCfuGfgCfUfAfaGfaUfgAfuAfL96 usAfsuCfaUfcUfuAfgccAfgGfgsusg 1300-1322 3493 3494 AD-59114 UfscsAfuCfcCfuGfUfGfcGfgGfuUfgAfL96 usCfsaAfcCfcGfcAfcagGfgAfusgsa 1923-1945 3495 3496 AD-59115 AfsasGfaGfuGfuCfUfCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcsusu 877-899 3497 3498 AD-59116 GfsusCfaUfgCfcAfAfAfaAfuGfgAfcAfL96 usGfsuCfcAfuUfuUfuggCfaUfgsasc 1631-1653 3499 3500 AD-59117 CfsasUfuCfuUfaUfCfCfcGfaGfuCfcAfL96 usGfsgAfcUfcGfgGfauaAfgAfasusg 363-385 3501 3502 AD-59118 AfscsCfcUfgGfcUfAfAfgAfuGfaUfgAfL96 usCfsaUfcAfuCfuUfagcCfaGfgsgsu 1301-1323 3503 3504 AD-59119 CfsusCfuUfcAfcCfCfUfgGfcUfaAfgAfL96 usCfsuUfaGfcCfaGfgguGfaAfgsasg 1295-1317 3505 3506 AD-59120 AfsusGfcCfaAfaAfAfUfgGfaCfaUfcAfL96 usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcsasu 1634-1656 3507 3508 AD-59121 UfsgsCfcCfcAfaGfAfUfgAfuGfgAfaUfL96 asUfsuCfcAfuCfaUfcuuGfgGfgscsa 434-456 3509 3510 AD-59122 GfsasAfcCfaUfgCfCfUfcCfaUfgAfuAfL96 usAfsuCfaUfgGfaGfgcaUfgGfususc 1348-1370

3511 3512 AD-59123 UfscsUfuCfaCfcCfUfGfgCfuAfaGfaUfL96 asUfscUfuAfgCfcAfgggUfgAfasgsa 1296-1318 3513 3514 AD-59124 UfsgsCfcAfaAfaAfUfGfgAfcAfuCfaUfL96 asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgscsa 1635-1657 3515 3516 AD-59125 CfscsAfgAfaAfgAfGfUfgUfcUfcAfuAfL96 usAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfusgsg 872-894 3517 3518 AD-59126 GfsasAfaCfuGfuCfCfAfuUfcAfaUfgAfL96 usCfsaUfuGfaAfuGfgacAfgUfususc 1481-1503 3519 3520 AD-59127 UfscsAfcCfcUfgGfCfUfaAfgAfuGfaUfL96 asUfscAfuCfuUfaGfccaGfgGfusgsa 1299-1321 3521 3522 AD-59128 CfscsCfuGfgAfgUfCfUfgUfgCfgGfaUfL96 asUfscCfgCfaCfaGfacuCfcAfgsgsg 1791-1813 3523 3524 AD-59129 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfususc 875-897 3525 3526 AD-59130 UfsgsGfaGfcCfcUfGfGfaGfuCfuGfuAfL96 usAfscAfgAfcUfcCfaggGfcUfcscsa 1786-1808

Таблица 15
Немодифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Название дуплекса Смысловая последовательность
(5'-3')
Антисмысловая последовательность (5'-3') Сайты-мишени антисмысловой последовательности на NM_ 000688.4
3684 3527 AD-58848 CAUGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCAUGAC 1635-1657 3528 3529 AD-58849 AUUUUGAAGUGAUGAGUGAAA UUUCACUCAUCACUUCAAAAUGC 2189-2211 3530 3531 AD-58850 AGUUAUAUUAAAUUUUAAUCU AGAUUAAAAUUUAAUAUAACUUA 2344-2366 3532 3533 AD-58851 GCAUUUUGAAGUGAUGAGUGA UCACUCAUCACUUCAAAAUGCAG 2187-2209 3534 3535 AD-58852 GAACUAAUGAGCAGACAUAAC GUUAUGUCUGCUCAUUAGUUCAU 1975-1997 3536 3537 AD-58853 AAUGACCACACCUAUCGAGUU AACUCGAUAGGUGUGGUCAUUCU 973-995 3538 3539 AD-58854 UAAAUUUUAAUCUAUAGUAAA UUUACUAUAGAUUAAAAUUUAAU 2352-2374 3540 3541 AD-58855 UUCAGUAUGAUCGUUUCUUUG CAAAGAAACGAUCAUACUGAAAA 929-951 3542 3543 AD-58856 CACUUUUCAGUAUGAUCGUUU AAACGAUCAUACUGAAAAGUGGA 924-946 3544 3545 AD-58857 AAAUCUGUUUCCACUUUUCAG CUGAAAAGUGGAAACAGAUUUUG 913-935 3546 3547 AD-58858 CAUUUGAAACUGUCCAUUCAA UUGAAUGGACAGUUUCAAAUGCC 1478-1500 3548 3549 AD-58859 CCUAUCGAGUUUUUAAAACUG CAGUUUUAAAAACUCGAUAGGUG 983-1005 3550 3551 AD-58861 GACCAGAAAGAGUGUCUCAUC GAUGAGACACUCUUUCUGGUCUU 872-894 3552 3553 AD-58862 ACCAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUGGUCU 873-895

3554 3555 AD-58863 ACUAAUGAGCAGACAUAACAU AUGUUAUGUCUGCUCAUUAGUUC 1977-1999 3556 3557 AD-58864 UAGUAAAAACAUAGUCCUGGA UCCAGGACUAUGUUUUUACUAUA 2366-2388 3558 3559 AD-58865 UAUUUCUGGAACUAGUAAAUU AAUUUACUAGUUCCAGAAAUAUU 1185-1207 3560 3561 AD-58867 UUCUGCAAAGCCAGUCUUGAG CUCAAGACUGGCUUUGCAGAAGA 706-728 3562 3563 AD-58868 GAGGAAAGAGGUUGCUGAAAC GUUUCAGCAACCUCUUUCCUCAC 759-781 3564 3565 AD-58869 GGUACUAGAAAUAUUUCUGGA UCCAGAAAUAUUUCUAGUACCAC 1174-1196 3566 3567 AD-58870 GACAUCAUGCAAAAGCAAAGA UCUUUGCUUUUGCAUGAUGUCCU 853-875 3568 3569 AD-58871 AAAUUUUAAUCUAUAGUAAAA UUUUACUAUAGAUUAAAAUUUAA 2353-2375 3570 3571 AD-58873 CAUGAUCCAAGGGAUUCGAAA UUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGGA 1362-1384 3572 3573 AD-58874 AGACCAGAAAGAGUGUCUCAU AUGAGACACUCUUUCUGGUCUUU 871-893 3574 3575 AD-58875 AUCCUGAAGAGCGCUGAGGGA UCCCUCAGCGCUCUUCAGGAUCC 1810-1832 3576 3577 AD-58876 GUCUGUGAUGAACUAAUGAGC GCUCAUUAGUUCAUCACAGACUU 1966-1988 3578 3579 AD-58877 CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUC GAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU 875-897 3580 3581 AD-58878 ACUUUUCAGUAUGAUCGUUUC GAAACGAUCAUACUGAAAAGUGG 925-947 3582 3583 AD-58879 UCAUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAUGACU 1634-1656 3584 3585 AD-58880 AAUAUUUCUGGAACUAGUAAA UUUACUAGUUCCAGAAAUAUUUC 1183-1205 3586 3587 AD-58881 CUUCUUCAAGAUAACUUGCCA UGGCAAGUUAUCUUGAAGAAGAU 892-914 3588 3589 AD-58882 UUUCAGUAUGAUCGUUUCUUU AAAGAAACGAUCAUACUGAAAAG 928-950 3590 3591 AD-58883 CCCAGUGUGGUUAGUGUGAAA UUUCACACUAACCACACUGGGGC 790-812 3592 3593 AD-58884 GCUGUGAGAUUUACUCUGAUU AAUCAGAGUAAAUCUCACAGCCU 1325-1347 3594 3595 AD-58885 AGGCUUGAGCAAGUUGGUAUC GAUACCAACUUGCUCAAGCCUGA 2229-2251 3596 3597 AD-58886 GAAAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUUUCUG 877-899 3598 3599 AD-58887 AUUUCUGGAACUAGUAAAUUC GAAUUUACUAGUUCCAGAAAUAU 1186-1208 3600 3601 AD-58888 UGUGAUGUGGCCCAUGAGUUU AAACUCAUGGGCCACAUCACACA 1531-1553 3602 3603 AD-58889 AAGAGAGAAGUCCUAUUUCUC GAGAAAUAGGACUUCUCUCUUUC 2208-2230 3604 3605 AD-58890 UGGCAGCACAGAUGAAUCAGA UCUGAUUCAUCUGUGCUGC 671-693

CAGG 3606 3607 AD-58891 AUGAUCGUUUCUUUGAGAAAA UUUUCUCAAAGAAACGAUCAUAC 935-957 3608 3609 AD-58892 UCUGGAACUAGUAAAUUCCAU AUGGAAUUUACUAGUUCCAGAAA 1189-1211 3610 3611 AD-59095 GCCCAUUCUUAUCCCGAGU ACUCGGGAUAAGAAUGGGC 360-382 3612 3613 AD-59096 GGAACCAUGCCUCCAUGAU AUCAUGGAGGCAUGGUUCC 1347-1369 3614 3615 AD-59097 UGGAGUCUGUGCGGAUCCU AGGAUCCGCACAGACUCCA 1794-1816 3616 3617 AD-59098 CACCCACGGGUGUGUGGGA UCCCACACACCCGUGGGUG 1112-1134 3618 3619 AD-59099 GGAGUCUGUGCGGAUCCUA UAGGAUCCGCACAGACUCC 1795-1817 3620 3621 AD-59100 CAAAACUGCCCCAAGAUGA UCAUCUUGGGGCAGUUUUG 428-450 3622 3623 AD-59101 GCCUCCAUGAUCCAAGGGA UCCCUUGGAUCAUGGAGGC 1355-1377 3624 3625 AD-59102 CAUCAUCCCUGUGCGGGUU AACCCGCACAGGGAUGAUG 1921-1943 3626 3627 AD-59103 ACCCACGGGUGUGUGGGGA UCCCCACACACCCGUGGGU 1113-1135 3628 3629 AD-59104 CACAUCAUCCCUGUGCGGA UCCGCACAGGGAUGAUGUG 1919-1941 3630 3631 AD-59105 CAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUG 873-895 3632 3633 AD-59106 CCUCCAUGAUCCAAGGGAU AUCCCUUGGAUCAUGGAGG 1356-1378 3634 3635 AD-59107 UGCCCAUUCUUAUCCCGAA UUCGGGAUAAGAAUGGGCA 359-381 3636 3637 AD-59108 CUUCACCCUGGCUAAGAUA UAUCUUAGCCAGGGUGAAG 1297-1319 3638 3639 AD-59109 AUCAUCCCUGUGCGGGUUA UAACCCGCACAGGGAUGAU 1922-1944 3640 3641 AD-59110 AGAAAGAGUGUCUCAUCUU AAGAUGAGACACUCUUUCU 874-896 3642 3643 AD-59111 CUCCAUGAUCCAAGGGAUU AAUCCCUUGGAUCAUGGAG 1357-1379 3644 3645 AD-59112 CCAUUCUUAUCCCGAGUCA UGACUCGGGAUAAGAAUGG 362-384 3646 3647 AD-59113 CACCCUGGCUAAGAUGAUA UAUCAUCUUAGCCAGGGUG 1300-1322 3648 3649 AD-59114 UCAUCCCUGUGCGGGUUGA UCAACCCGCACAGGGAUGA 1923-1945 3650 3651 AD-59115 AAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUU 877-899 3652 3653 AD-59116 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC 1631-1653 3654 3655 AD-59117 CAUUCUUAUCCCGAGUCCA UGGACUCGGGAUAAGAAUG 363-385 3656 3657 AD-59118 ACCCUGGCUAAGAUGAUGA UCAUCAUCUUAGCCAGGGU 1301-1323 3658 3659 AD-59119 CUCUUCACCCUGGCUAAGA UCUUAGCCAGGGUGAAGAG 1295-1317 3660 3661 AD-59120 AUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAU 1634-1656 3662 3663 AD-59121 UGCCCCAAGAUGAUGGAAU AUUCCAUCAUCUUGGGGCA 434-456 3664 3665 AD-59122 GAACCAUGCCUCCAUGAUA UAUCAUGGAGGCAUGGUUC 1348-1370 3666 3667 AD-59123 UCUUCACCCUGGCUAAGAU AUCUUAGCCAGGGUGAAGA 1296-1318 3668 3669 AD-59124 UGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCA 1635-1657 3670 3671 AD-59125 CCAGAAAGAGUGUCUCAUA UAUGAGACACUCUUUCUGG 872-894 3672 3673 AD-59126 GAAACUGUCCAUUCAAUGA UCAUUGAAUGGACAGUUUC 1481-1503 3674 3675 AD-59127 UCACCCUGGCUAAGAUGAU AUCAUCUUAGCCAGGGUGA 1299-1321 3676 3677 AD-59128 CCCUGGAGUCUGUGCGGAU AUCCGCACAGACUCCAGGG 1791-1813 3678 3679 AD-59129 GAAAGAGUGUCUCAUCUUA UAAGAUGAGACACUCUUUC 875-897 3680 3681 AD-59130 UGGAGCCCUGGAGUCUGUA UACAGACUCCAGGGCUCCA 1786-1808

Результаты анализов in vitro представлены в таблице 16. В таблице 16 также указаны виды-мишени для каждой ми-РНК.

Таблица 16
Результаты функциональных анализов
Свободный захват Cyno Трансфекция Cyno Трансфекция Hep3b Номер дуплекса Виды-мишени Тип 1 мкМ среднее 500 нМ 20 нМ среднее 10 нМ 20 нМ среднее 0,2 нМ среднее 10 нМ среднее 0,1нМ среднее AD-58848 M/R/Rh/H 21/23 131,6 176,0 104,4 128,0 43,5 44,8 25,3 76,8 AD-58849 H/Rh 21/23 91,9 88,1 92,2 105,0 29,4 35,4 11,5 47,1 AD-58850 H/Rh 21/23 79,4 103,4 80,0 111,2 Нет данных 62,2 31,3 72,0 AD-58851 H/Rh 21/23 99,7 74,7 94,8 104,7 Нет данных 40,7 8,6 81,3 AD-58852 H/Rh 21/23 108,1 91,8 103,3 111,9 101,1 128,8 43,4 129,0 AD-58853 H/Rh 21/23 74,8 67,7 84,2 93,5 24,7 52,9 14,1 61,2 AD-58854 H/Rh 21/23 145,9 124,1 106,6 115,3 119,0 83,9 85,0 84,0 AD-58855 H/Rh 21/23 81,5 97,9 92,7 101,8 39,5 40,3 15,3 67,6 AD-58856 H/Rh 21/23 74,1 90,6 84,6 82,6 22,4 30,7 8,7 33,3 AD-58857 H/Rh 21/23 64,7 91,4 62,3 87,1 22,0 31,6 9,8 106,3 AD-58858 H/Rh 21/23 67,4 91,7 68,6 98,3 27,9 40,3 17,4 44,8 AD-58859 H/Rh 21/23 71,2 77,2 92,4 90,1 19,1 34,3 13,1 39,7 AD-58861 H/Rh 21/23 104,6 107,2 102,0 100,6 25,9 35,1 18,0 69,8 AD-58862 H/Rh 21/23 66,8 77,0 68,7 88,5 20,3 31,1 24,2 49,9 AD-58863 H/Rh 21/23 70,8 66,8 76,8 98,5 21,5 29,7 8,7 54,9 AD-58864 H/Rh 21/23 76,2 85,6 83,7 100,8 60,4 61,0 56,4 87,3 AD-58865 H/Rh 21/23 67,9 77,9 95,9 98,4 21,3 38,6 15,5 81,4 AD-58867 H/Rh 21/23 95,9 93,3 107,0 97,5 32,3 42,7 16,6 79,8 AD-58868 H/Rh 21/23 95,2 92,1 116,2 94,7 54,6 69,2 61,5 105,9 AD-58869 H/Rh 21/23 65,0 78,2 75,8 88,2 17,4 25,0 13,0 63,9 AD-58870 H/Rh 21/23 69,4 92,3 81,0 88,1 29,2 43,8 33,7 79,1 AD-58871 H/Rh 21/23 61,2 77,3 88,2 77,0 71,2 73,2 36,7 110,3 AD-58873 H/Rh 21/23 95,2 100,9 83,3 94,6 54,2 52,8 36,6 73,3

AD-58874 H/Rh 21/23 75,8 76,8 63,8 85,3 22,3 31,2 15,0 38,2 AD-58875 H/Rh 21/23 80,7 88,7 78,6 97,9 48,6 73,6 61,2 90,6 AD-58876 H/Rh 21/23 90,8 93,1 82,5 100,2 41,1 56,9 21,2 58,7 AD-58877 H/Rh 21/23 68,3 85,1 51,2 78,7 18,5 46,6 11,9 27,4 AD-58878 H/Rh 21/23 78,3 68,3 81,2 91,2 24,1 23,4 6,2 37,1 AD-58879 H/Rh 21/23 87,9 94,1 79,7 95,4 32,0 47,8 15,7 82,5 AD-58880 H/Rh 21/23 74,9 72,2 88,9 88,1 20,1 27,5 14,0 60,7 AD-58881 H/Rh 21/23 85,9 76,8 78,8 118,0 22,2 36,7 27,6 71,6 AD-58882 H/Rh 21/23 54,1 53,4 60,3 85,8 14,6 27,2 8,2 23,8 AD-58883 H/Rh 21/23 80,4 69,9 75,7 80,3 31,8 25,8 12,3 63,0 AD-58884 H/Rh 21/23 57,7 55,3 64,8 78,2 20,0 30,0 11,8 68,9 AD-58885 H/Rh 21/23 101,8 91,8 104,1 101,5 85,9 71,9 61,8 71,2 AD-58886 M/R/Rh/H 21/23 47,1 58,0 36,3 93,3 16,0 26,6 9,2 32,0 AD-58887 H/Rh 21/23 73,6 98,7 82,6 95,2 28,5 33,5 12,8 65,2 AD-58888 H/Rh 21/23 90,2 69,9 69,4 85,6 46,9 45,0 16,6 72,0 AD-58889 H/Rh 21/23 83,6 98,6 82,4 92,2 36,5 40,3 31,6 99,4 AD-58890 H/Rh 21/23 69,5 95,4 84,2 88,2 50,8 45,6 21,7 92,9 AD-58891 H/Rh 21/23 62,8 75,7 75,4 109,2 23,6 34,3 15,6 55,8 AD-58892 H/Rh 21/23 60,2 92,9 89,8 92,9 22,8 43,3 20,2 75,6 AD-59095 M/R/Rh/H 19мер. 88,9 Нет данных 132,8 Нет данных 48,3 97,4 54,3 99,0 AD-59096 M/R/Rh/H 19мер. 95,5 Нет данных 90,5 Нет данных 105,7 138,6 131,4 120,7 AD-59097 M/R/Rh/H 19мер. 92,5 Нет данных 84,2 Нет данных 75,0 NA 94,7 108,5 AD-59098 M/R/Rh/H 19мер. 84,0 Нет данных 87,7 Нет данных 109,3 NA 130,0 87,3 AD-59099 M/R/Rh/H 19мер. 89,7 Нет данных 90,0 Нет данных 77,8 85,4 46,8 74,9 AD-59100 M/R/Rh/H 19мер. 84,8 Нет данных 144,3 Нет данных 70,6 108,1 91,5 117,6 AD- M/R/Rh/H 19мер. 79,0 Нет 103,8 Нет 89,8 102,9 124,2 107,0

59101 данных данных AD-59102 M/R/Rh/H 19мер. 85,9 Нет данных 100,6 Нет данных 72,2 68,5 87,9 95,1 AD-59103 M/R/Rh/H 19мер. 86,0 Нет данных 91,1 Нет данных 93,0 81,3 130,0 96,0 AD-59104 M/R/Rh/H 19мер. 92,6 Нет данных 96,9 Нет данных 94,9 91,4 124,4 83,1 AD-59105 M/R/Rh/H 19мер. 48,9 Нет данных 101,7 Нет данных 18,4 48,9 17,0 34,7 AD-59106 M/R/Rh/H 19мер. 63,2 Нет данных 76,7 Нет данных 28,5 40,7 28,6 46,4 AD-59107 M/R/Rh/H 19мер. 71,4 Нет данных 68,7 Нет данных 37,1 45,3 26,8 63,6 AD-59108 M/R/Rh/H 19мер. 70,7 Нет данных 85,1 Нет данных 89,9 84,8 139,2 101,7 AD-59109 M/R/Rh/H 19мер. 86,1 Нет данных 83,4 Нет данных 84,9 96,2 131,7 86,7 AD-59110 M/R/Rh/H 19мер. 70,8 Нет данных 119,7 Нет данных 38,5 60,4 67,4 80,3 AD-59111 M/R/Rh/H 19мер. 66,1 Нет данных 76,5 Нет данных 52,2 61,0 69,7 87,6 AD-59112 M/R/Rh/H 19мер. 71,2 Нет данных 80,2 Нет данных 91,2 83,4 127,4 89,0 AD-59113 M/R/Rh/H 19мер. 67,0 Нет данных 77,8 Нет данных 49,1 59,0 66,8 91,4 AD-59114 M/R/Rh/H 19мер. 81,7 Нет данных 79,3 Нет данных 96,3 88,0 129,6 72,4 AD-59115 M/R/Rh/H 19мер. 40,4 Нет данных 69,6 Нет данных 19,6 35,7 9,3 16,9 AD-59116 M/R/Rh/H 19мер. 72,2 Нет данных 78,3 Нет данных 53,5 77,8 70,1 107,8 AD-59117 M/R/Rh/H 19мер. 70,7 Нет данных 75,6 Нет данных 75,8 74,9 129,0 103,5 AD-59118 M/R/Rh/H 19мер. 68,8 Нет данных 75,9 Нет данных 81,4 82,1 114,1 89,7 AD-59119 M/R/Rh/H 19мер. 64,9 Нет данных 86,5 Нет данных 85,1 125,1 122,8 124,8 AD-59120 M/R/Rh/H 19мер. 63,5 Нет данных 75,1 Нет данных 29,9 52,0 16,1 54,1 AD-59121 M/R/Rh/H 19мер. 67,6 Нет данных 72,0 Нет данных 88,8 77,4 108,0 103,1 AD-59122 M/R/Rh/H 19мер. 60,2 Нет данных 62,3 Нет данных 25,1 45,3 16,2 54,8 AD-59123 M/R/Rh/H 19мер. 68,6 Нет данных 108,2 Нет данных 59,2 84,6 80,0 97,7 AD-59124 M/R/Rh/H 19мер. 47,5 Нет данных 56,5 Нет данных 23,9 40,0 9,8 18,9 AD-59125 M/R/Rh/H 19мер. 45,4 Нет данных 47,2 Нет данных 15,2 40,7 14,7 15,1 AD-59126 M/R/Rh/H 19мер. 64,3 Нет данных 74,6 Нет данных 51,6 57,1 35,5 54,4

AD-59127 M/R/Rh/H 19мер. 103,4 Нет данных 105,8 Нет данных 94,0 156,4 135,9 113,7 AD-59128 M/R/Rh/H 19мер. 102,4 Нет данных 81,4 Нет данных 66,3 89,3 60,2 74,9 AD-59129 M/R/Rh/H 19мер. 41,3 Нет данных 38,8 Нет данных 17,9 41,4 8,6 12,6 AD-59130 M/R/Rh/H 19мер. 58,3 Нет данных 80,8 Нет данных 94,9 78,3 106,7 88,0

Таблица 17 иллюстрирует IC50 выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1. IC50 определяли на основании нокдауна эндогенно экспрессируемого ALAS1 в линии клеток Hep3B через 24 часа после трансфекции каждого модифицированного дуплекса ми-РНК ALAS1 (См. таблицу 14). По меньшей мере, семь дуплексов, включая AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 и AD-59129, соответственно имели IC50 меньше 0,1 нМ, что свидетельствует о том, что такие дуплексы особенно эффективны в подавлении экспрессии ALAS1.

Таблица 17
IC50 выбранных дуплексов ми-РНК ALAS1
IC50 (нМ) Номер дуплекса 384w IC50 (нМ) 96w IC50 (нМ) AD-58882 0,008 0,014 AD-58878 0,040 0,031 AD-58886 0,037 0,033 AD-58877 0,031 0,034 AD-59115 0,093 0,052 AD-58856 0,061 0,066 AD-59129 0,085 0,071 AD-59124 0,572 0,078 AD-58874 0,140 0,102 AD-59125 0,118 0,115 AD-59105 0,511 0,144 AD-59120 180,592 0,498 AD-59122 36,646 0,646 AD-59106 7,906 0,847 AD-59126 нет данных 1,014 AD-59107 нет данных 1,971

Пример 11. Активность ALAS1-GalNAc в мышиной модели индуцированной фенобарбиталом AIP

Мышиную модель AIP использовали для исследования эффекта ми-РНК, которая представляла собой конъюгат ALAS1-GalNAc. ми-РНК имела последовательность дуплекса AD-58632 (См. таблицу 20).

Таблица 20
Последовательности дуплекса ми-РНК ALAS1 AD-58632
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Сайты-мишени антисмысловой последовательности Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') 4149 4150 877-899 AD-58632 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg

Мышей AIP не обрабатывали (исходный уровень) или им подкожно инъецировали в 1 день физиологический раствор или конъюгат ALAS1-GalNAc в дозе 20 мг/кг. На 2, 3 и 4 день их оставляли необработанными (исходный уровень), или их обрабатывали с использованием внутрибрюшинных инъекций фенобарбитала. На 5 день собирали плазму и измеряли уровни ALA и PBG, используя анализ ЖХ-МС. Как показано на фиг. 15, конъюгат ALAS1-GalNAc ослаблял продукцию ALA и PBG в плазме примерно на 84 и 80%, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют, что лечение конъюгатом ALAS1-GalNAc эффективно предотвращает повышение уровней ALA и PBG в плазме, ассоциированные с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами, в такой животной модели AIP.

Пример 12. Дополнительные ми-РНК, которые нацелены на ALAS1 в качестве мишени и ингибируют экспрессию ALAS1

Модифицированные последовательности ми-РНК, мишенью которых является мРНК ALAS1, конструировали и получали, как описано в примере 2. Последовательности представлены в таблице 18. Активность in vitro модифицированных дуплексов тестировали, как описано ниже.

Таблица 18
Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') Сайты-мишени антисмысловой последовательности на NM_ 000688.4 3685 3686 AD-59453 CAGGCAAAUCUCUGUUGUUdTdT AACAACAGAGAUUUGCCUGdTdT 402-420

3687 3688 AD-59395 GAAAAAAAUUGAUGAGAAAdTdT UUUCUCAUCAAUUUUUUUCdTdT 949-967 3689 3690 AD-59477 GGAAAGAUGCCGCACUCUUdTdT AAGAGUGCGGCAUCUUUCCdTdT 1242-1260 3691 3692 AD-59492 UGUCUCAUCUUCUUCAAGAdTdT UCUUGAAGAAGAUGAGACAdTdT 882-900 3693 3694 AD-59361 ACAUCUACGUGCAAGCAAUdTdT AUUGCUUGCACGUAGAUGUdTdT 1992-2010 3695 3696 AD-59462 UUCUCUGAUUGACACCGUAdTdT UACGGUGUCAAUCAGAGAAdTdT 1711-1729 3697 3698 AD-59433 GCUGCUGGCUUCAUCUUCAdTdT UGAAGAUGAAGCCAGCAGCdTdT 1739-1757 3699 3700 AD-59424 AGCGCAACGUCAAACUCAUdTdT AUGAGUUUGACGUUGCGCUdTdT 1851-1869 3701 3702 AD-59414 UAUUUCUGGAACUAGUAAAdTdT UUUACUAGUUCCAGAAAUAdTdT 1183-1201 3703 3704 AD-59539 GGUUGUGUUGGAGGGUACAdTdT UGUACCCUCCAACACAACCdTdT 1679-1697 3705 3706 AD-59400 GUGUCAGUCUGGUGCAGUAdTdT UACUGCACCAGACUGACACdTdT 1070-1088 3707 3708 AD-59551 CUUUGUGGCCAAUGACUCAdTdT UGAGUCAUUGGCCACAAAGdTdT 1273-1291 3709 3710 AD-59482 AGAUGCUGCUAAAAACACAdTdT UGUGUUUUUAGCAGCAUCUdTdT 1942-1960 3711 3712 AD-59448 GAGUCAUGCCAAAAAUGGAdTdT UCCAUUUUUGGCAUGACUCdTdT 1629-1647 3713 3714 AD-59392 CUGUGCGGAUCCUGAAGAGdTdT CUCUUCAGGAUCCGCACAGdTdT 1800-1818 3715 3716 AD-59469 CACUUUGAAACAACAUGGUdTdT ACCAUGUUGUUUCAAAGUGdTdT 1141-1159 3717 3718 AD-59431 AAGUGAUGAGUGAAAGAGAdTdT UCUCUUUCACUCAUCACUUdTdT 2193-2211 3719 3720 AD-59423 AUCUGCUAGUCACAUGGAAdTdT UUCCAUGUGACUAGCAGAUdTdT 2103-2121 3721 3722 AD-59517 UGGGGCAGGUGGUACUAGAdTdT UCUAGUACCACCUGCCCCAdTdT 1162-1180 3723 3724 AD-59578 GCAGAUGACUAUUCAGACUdTdT AGUCUGAAUAGUCAUCUGCdTdT 1031-1049 3725 3726 AD-59495 GCCUCAUUCCUCAGCUGAGdTdT CUCAGCUGAGGAAUGAGGCdTdT 2143-2161 3727 3728 AD-59432 GUAUGAUCGUUUCUUUGAGdTdT CUCAAAGAAACGAUCAUACdTdT 931-949 3729 3730 AD-59382 UAUCCAGAUGGUCUUCAGAdTdT UCUGAAGACCAUCUGGAUAdTdT 2302-2320 3731 3732 AD-59472 UAGUGUGAAAACCGAUGGAdTdT UCCAUCGGUUUUCACACUAdTdT 799-817 3733 3734 AD-59459 UCCCCAUGGCAGAUGACUAdTdT UAGUCAUCUGCCAUGGGGAdTdT 1023-1041 3735 3736 AD-59413 CCACUGCAGCAGUACACUAdTdT UAGUGUACUGCUGCAGUGGdTdT 483-501 3737 3738 AD- CUGUGAACCGGCGAGCACAdTdT UGUGCUCGCCGGUUCACAG 999-1017

59478 dTdT 3739 3740 AD-59376 GGUCCUAUGCUGCUGGCUUdTdT AAGCCAGCAGCAUAGGACCdTdT 1731-1749 3741 3742 AD-59556 AGCCUUUGGUUGUGUUGGAdTdT UCCAACACAACCAAAGGCUdTdT 1672-1690 3743 3744 AD-59399 AAUUCCAUGUGGACUUAGAdTdT UCUAAGUCCACAUGGAAUUdTdT 1200-1218 3745 3746 AD-59474 CCAGGGCACUGCAAGCAAAdTdT UUUGCUUGCAGUGCCCUGGdTdT 640-658 3747 3748 AD-53542 cuuuucAGuAuGAucGuuudTsdT AAACGAUcAuACUGAAAAGdTsdT 924-942 3749 3750 AD-59480 GAAUCAGAGAGGCAGCAGUdTdT ACUGCUGCCUCUCUGAUUCdTdT 682-700 3751 3752 AD-59549 GCAAAGAUCUGACCCCUCAdTdT UGAGGGGUCAGAUCUUUGCdTdT 1441-1459 3753 3754 AD-59515 GGAGAAGAGCUCCUACGGAdTdT UCCGUAGGAGCUCUUCUCCdTdT 2033-2051 3755 3756 AD-59427 CCAUGAGUUUGGAGCAAUCdTdT GAUUGCUCCAAACUCAUGGdTdT 1540-1558 3757 3758 AD-59390 CUUUGAGAAAAAAAUUGAUdTdT AUCAAUUUUUUUCUCAAAGdTdT 943-961 3759 3760 AD-59511 UGAGCAGACAUAACAUCUAdTdT UAGAUGUUAUGUCUGCUCAdTdT 1980-1998 3761 3762 AD-59532 CGUGCAAGCAAUCAAUUACdTdT GUAAUUGAUUGCUUGCACGdTdT 1999-2017 3763 3764 AD-59562 AAAGCAAAGACCAGAAAGAdTdT UCUUUCUGGUCUUUGCUUUdTdT 862-880 3765 3766 AD-59513 GGAUGUGCAGGAAAUGAAUdTdT AUUCAUUUCCUGCACAUCCdTdT 733-751 3767 3768 AD-59362 CAGCAUACUUCCUGAACAUdTdT AUGUUCAGGAAGUAUGCUGdTdT 321-339 3769 3770 AD-53541 GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsdT UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdTsdT 671-689 3771 3772 AD-59490 UCUGUUGUUCUAUGCCCAAdTdT UUGGGCAUAGAACAACAGAdTdT 412-430 3773 3774 AD-59422 UGAGACAGAUGCUAAUGGAdTdT UCCAUUAGCAUCUGUCUCAdTdT 1869-1887 3775 3776 AD-59467 GCCAAUGACUCAACCCUCUdTdT AGAGGGUUGAGUCAUUGGCdTdT 1280-1298 3777 3778 AD-59579 GAGUGCAACUUCUGCAGGAdTdT UCCUGCAGAAGUUGCACUCdTdT 2159-2177 3779 3780 AD-59426 GUGAAAGAGAGAAGUCCUAdTdT UAGGACUUCUCUCUUUCACdTdT 2202-2220 3781 3782 AD-59363 UAACUUGCCAAAAUCUGUUdTdT AACAGAUUUUGGCAAGUUAdTdT 901-919 3783 3784 AD-59436 AAGCCAGUCUUGAGCUUCAdTdT UGAAGCUCAAGACUGGCUUdTdT 711-729 3785 3786 AD-53536 cAcuuuucAGuAuGAucGudTsdT ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTsdT 922-940 3787 3788 AD-59491 GCAGCAGUGUCUUCUGCAAdTdT UUGCAGAAGACACUGCUGCdTdT 693-711

3789 3790 AD-59500 UCCUGAACAUGGAGAGUGUdTdT ACACUCUCCAUGUUCAGGAdTdT 330-348 3791 3792 AD-59394 AUUUCUGGAACACUUGGCAdTdT UGCCAAGUGUUCCAGAAAUdTdT 1652-1670 3793 3794 AD-59441 CAGUACACUACCAACAGAUdTdT AUCUGUUGGUAGUGUACUGdTdT 492-510 3795 3796 AD-59365 GCAUGACCUCAAUUAUUUCdTdT GAAAUAAUUGAGGUCAUGCdTdT 2261-2279 3797 3798 AD-59411 AGAACUGCUGCAAAGAUCUdTdT AGAUCUUUGCAGCAGUUCUdTdT 1432-1450 3799 3800 AD-59544 CACCCCAGAUGAUGAACUAdTdT UAGUUCAUCAUCUGGGGUGdTdT 2073-2091 3801 3802 AD-59428 GAUCCAAGGGAUUCGAAACdTdT GUUUCGAAUCCCUUGGAUCdTdT 1363-1381 3803 3804 AD-59471 CUCAUCACCAAAAAGCAAGdTdT CUUGCUUUUUGGUGAUGAGdTdT 1052-1070 3805 3806 AD-59518 ACAACAUGGUGCUGGGGCAdTdT UGCCCCAGCACCAUGUUGUdTdT 1150-1168 3807 3808 AD-53547 GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsdT UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTsdT 935-953 3809 3810 AD-59573 CAGCACGAGUUCUCUGAUUdTdT AAUCAGAGAACUCGUGCUGdTdT 1702-1720 3811 3812 AD-59473 AAUGAUGUCAGCCACCUCAdTdT UGAGGUGGCUGACAUCAUUdTdT 1412-1430 3813 3814 AD-59412 AGUUAUGGACACUUUGAAAdTdT UUUCAAAGUGUCCAUAACUdTdT 1132-1150 3815 3816 AD-59522 GAUGAUGAACUACUUCCUUdTdT AAGGAAGUAGUUCAUCAUCdTdT 2080-2098 3817 3818 AD-59502 GCAGGAAAUGAAUGCCGUGdTdT CACGGCAUUCAUUUCCUGCdTdT 739-757 3819 3820 AD-59499 UCUUCAAGAUAACUUGCCAdTdT UGGCAAGUUAUCUUGAAGAdTdT 892-910 3821 3822 AD-59520 CGAUGGAGGGGAUCCCAGUdTdT ACUGGGAUCCCCUCCAUCGdTdT 811-829 3823 3824 AD-59581 CCAAAAAGCAAGUGUCAGUdTdT ACUGACACUUGCUUUUUGGdTdT 1059-1077 3825 3826 AD-59461 GAUUGGGGAUCGGGAUGGAdTdT UCCAUCCCGAUCCCCAAUCdTdT 1612-1630 3827 3828 AD-59370 CCCUGGAGUCUGUGCGGAUdTdT AUCCGCACAGACUCCAGGGdTdT 1791-1809 3829 3830 AD-53540 GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsdT AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsdT 2321-2339 3831 3832 AD-59574 CGGGCAUUGUCCACUGCAGdTdT CUGCAGUGGACAAUGCCCGdTdT 473-491 3833 3834 AD-59375 UAUUCAGACUCCCUCAUCAdTdT UGAUGAGGGAGUCUGAAUAdTdT 1040-1058 3835 3836 AD-59387 CACUGCAUUUUGAAGUGAUdTdT AUCACUUCAAAAUGCAGUGdTdT 2181-2199 3837 3838 AD-59397 CCAGAAAGAGUGUCUCAUCdTdT GAUGAGACACUCUUUCUGGdTdT 872-890 3839 3840 AD- AGGCGGAGGGAUUGGGGAUdTdT AUCCCCAAUCCCUCCGCCU 1603-1621

59396 dTdT 3841 3842 AD-59393 AGACCUCCAUGGGAAAGAUdTdT AUCUUUCCCAUGGAGGUCUdTdT 1231-1249 3843 3844 AD-59483 GCAGGAGGCCACUGCAUUUdTdT AAAUGCAGUGGCCUCCUGCdTdT 2172-2190 3845 3846 AD-59430 AUCUGUUUCCACUUUUCAGdTdT CUGAAAAGUGGAAACAGAUdTdT 913-931 3847 3848 AD-59463 AGAGAAGUCCUAUUUCUCAdTdT UGAGAAAUAGGACUUCUCUdTdT 2209-2227 3849 3850 AD-53534 GucuucAGAGuuGucuuuAdTsdT uAAAGAcAACUCUGAAGACdTsdT 2312-2330 3851 3852 AD-59514 GGCUGGAACUGAAGCCUCAdTdT UGAGGCUUCAGUUCCAGCCdTdT 2130-2148 3853 3854 AD-59575 GCCAUUAUCAUAUCCAGAUdTdT AUCUGGAUAUGAUAAUGGCdTdT 2292-2310 3855 3856 AD-59364 AGCAGGCCCCAGUGUGGUUdTdT AACCACACUGGGGCCUGCUdTdT 781-799 3857 3858 AD-59402 UCAGCUGAGUGCAACUUCUdTdT AGAAGUUGCACUCAGCUGAdTdT 2153-2171 3859 3860 AD-59479 GAGCACACAUCUUCCCCAUdTdT AUGGGGAAGAUGUGUGCUCdTdT 1011-1029 3861 3862 AD-59481 ACUUCCAGGACAUCAUGCAdTdT UGCAUGAUGUCCUGGAAGUdTdT 843-861 3863 3864 AD-59530 CCUAUCGAGUUUUUAAAACdTdT GUUUUAAAAACUCGAUAGGdTdT 981-999 3865 3866 AD-59582 CUUCCUUGAGAAUCUGCUAdTdT UAGCAGAUUCUCAAGGAAGdTdT 2092-2110 3867 3868 AD-59506 ACCAACAGAUCAAAGAAACdTdT GUUUCUUUGAUCUGUUGGUdTdT 501-519 3869 3870 AD-59567 UAACCCCAGGCCAUUAUCAdTdT UGAUAAUGGCCUGGGGUUAdTdT 2283-2301 3871 3872 AD-59485 CCAUGCCUCCAUGAUCCAAdTdT UUGGAUCAUGGAGGCAUGGdTdT 1351-1369 3873 3874 AD-59525 UGAUGAACUAAUGAGCAGAdTdT UCUGCUCAUUAGUUCAUCAdTdT 1969-1987 3875 3876 AD-59566 CCUGAAGAGCGCUGAGGGAdTdT UCCCUCAGCGCUCUUCAGGdTdT 1810-1828 3877 3878 AD-59580 AACACUUGGCAAAGCCUUUdTdT AAAGGCUUUGCCAAGUGUUdTdT 1660-1678 3879 3880 AD-59512 UCUGCAGAAAGCAGGCAAAdTdT UUUGCCUGCUUUCUGCAGAdTdT 391-409 3881 3882 AD-59475 CCGGCCUCCCUGUUGUCCAdTdT UGGACAACAGGGAGGCCGGdTdT 1890-1908 3883 3884 AD-59438 CAUCAUCCCUGUGCGGGUUdTdT AACCCGCACAGGGAUGAUGdTdT 1921-1939 3885 3886 AD-59442 UGUGCGGGUUGCAGAUGCUdTdT AGCAUCUGCAACCCGCACAdTdT 1930-1948 3887 3888 AD-59516 GGAAAGAGGUUGCUGAAACdTdT GUUUCAGCAACCUCUUUCCdTdT 759-777 3889 3890 AD-59429 AGGUCCACGCAGUGGGGCUdTdT AGCCCCACUGCGUGGACCUdTdT 1572-1590

3891 3892 AD-59510 UGCCGUGAGGAAAGAGGUUdTdT AACCUCUUUCCUCACGGCAdTdT 751-769 3893 3894 AD-59457 GCUAAUGGAUGCCGGCCUCdTdT GAGGCCGGCAUCCAUUAGCdTdT 1879-1897 3895 3896 AD-59434 GAAGCAAGUGGGGCUGGAAdTdT UUCCAGCCCCACUUGCUUCdTdT 2119-2137 3897 3898 AD-59454 CAUCUUCCGCCACAAUGAUdTdT AUCAUUGUGGCGGAAGAUGdTdT 1399-1417 3899 3900 AD-59468 AUUUCUCAGGCUUGAGCAAdTdT UUGCUCAAGCCUGAGAAAUdTdT 2220-2238 3901 3902 AD-59565 CCCGAGUCCCCCAGGCCUUdTdT AAGGCCUGGGGGACUCGGGdTdT 372-390 3903 3904 AD-59416 CAAGCAAAUGCCCUUUCCUdTdT AGGAAAGGGCAUUUGCUUGdTdT 651-669 3905 3906 AD-59420 CCCCUCAGUCCCCAAGAUUdTdT AAUCUUGGGGACUGAGGGGdTdT 1453-1471 3907 3908 AD-59552 CUACGGUGCCCCGGGGAGAdTdT UCUCCCCGGGGCACCGUAGdTdT 2019-2037 3909 3910 AD-59558 AAAACUGCCCCAAGAUGAUdTdT AUCAUCUUGGGGCAGUUUUdTdT 429-447 3911 3912 AD-59404 ACAAAACUGCUAAGGCCAAdTdT UUGGCCUUAGCAGUUUUGUdTdT 540-558 3913 3914 AD-59455 GAUUCUGGGAACCAUGCCUdTdT AGGCAUGGUUCCCAGAAUCdTdT 1340-1358 3915 3916 AD-59496 CCAGAUGGCACACAGCUUCdTdT GAAGCUGUGUGCCAUCUGGdTdT 593-611 3917 3918 AD-59446 AGGGAUUCGAAACAGCCGAdTdT UCGGCUGUUUCGAAUCCCUdTdT 1369-1387 3919 3920 AD-59435 CUCUGCAGUCCUCAGCGCAdTdT UGCGCUGAGGACUGCAGAGdTdT 109-127 3921 3922 AD-59419 CCGCCGCCUCUGCAGUCCUdTdT AGGACUGCAGAGGCGGCGGdTdT 102-120 3923 3924 AD-59533 CUGGCUGGAGCCCUGGAGUdTdT ACUCCAGGGCUCCAGCCAGdTdT 1781-1799 3925 3926 AD-59366 GACAUCAUGCAAAAGCAAAdTdT UUUGCUUUUGCAUGAUGUCdTdT 851-869 3927 3928 AD-59521 GCUUGAGCAAGUUGGUAUCdTdT GAUACCAACUUGCUCAAGCdTdT 2229-2247 3929 3930 AD-59563 CAGGCUGUGAGAUUUACUCdTdT GAGUAAAUCUCACAGCCUGdTdT 1320-1338 3931 3932 AD-59534 AGAGCUGUGUGAUGUGGCCdTdT GGCCACAUCACACAGCUCUdTdT 1522-1540 3933 3934 AD-59407 GGAGCUGGCAGACCUCCAUdTdT AUGGAGGUCUGCCAGCUCCdTdT 1222-1240 3935 3936 AD-59445 AUCCCAGUGGACUGCUGAAdTdT UUCAGCAGUCCACUGGGAUdTdT 822-840 3937 3938 AD-59546 GUCAAACUCAUGAGACAGAdTdT UCUGUCUCAUGAGUUUGACdTdT 1859-1877 3939 3940 AD-59456 CUUUCCUGGCAGCACAGAUdTdT AUCUGUGCUGCCAGGAAAGdTdT 663-681 3941 3942 AD- CCCUCCGGCCAGUGAGAAAdTdT UUUCUCACUGGCCGGAGGG 520-538

59503 dTdT 3943 3944 AD-59536 CUACCUAGGAAUGAGUCGCdTdT GCGACUCAUUCCUAGGUAGdTdT 1093-1111 3945 3946 AD-59385 CCCAAGAUUGUGGCAUUUGdTdT CAAAUGCCACAAUCUUGGGdTdT 1463-1481 3947 3948 AD-59367 GAGCAAUCACCUUCGUGGAdTdT UCCACGAAGGUGAUUGCUCdTdT 1551-1569 3949 3950 AD-59458 UGCCCAUUCUUAUCCCGAGdTdT CUCGGGAUAAGAAUGGGCAdTdT 359-377 3951 3952 AD-59381 AAGGCCAAGGUCCAACAGAdTdT UCUGUUGGACCUUGGCCUUdTdT 551-569 3953 3954 AD-59538 CACACAGCUUCCGUCUGGAdTdT UCCAGACGGAAGCUGUGUGdTdT 601-619 3955 3956 AD-59421 UUAUGGGGCUCGAGGCGGAdTdT UCCGCCUCGAGCCCCAUAAdTdT 1591-1609 3957 3958 AD-59388 UGUCUUCUGCAAAGCCAGUdTdT ACUGGCUUUGCAGAAGACAdTdT 700-718 3959 3960 AD-59444 AGGCCUGAGCAUGACCUCAdTdT UGAGGUCAUGCUCAGGCCUdTdT 2253-2271 3961 3962 AD-59528 AUGUGAAUUAAGUUAUAUUdTdT AAUAUAACUUAAUUCACAUdTdT 2332-2350 3963 3964 AD-59498 ACUGCUGAAGAACUUCCAGdTdT CUGGAAGUUCUUCAGCAGUdTdT 832-850 3965 3966 AD-59497 UGAGAAAGACAAAACUGCUdTdT AGCAGUUUUGUCUUUCUCAdTdT 532-550 3967 3968 AD-59384 UCAGCCACCUCAGAGAACUdTdT AGUUCUCUGAGGUGGCUGAdTdT 1419-1437 3969 3970 AD-59452 GGCAACGAGCGUUUCGUUUdTdT AAACGAAACGCUCGUUGCCdTdT 51-69 3971 3972 AD-59379 CCUGAUGGAUCCCAGCAGAdTdT UCUGCUGGGAUCCAUCAGGdTdT 572-590 3973 3974 AD-59529 UGUGCCCACUGGAAGAGCUdTdT AGCUCUUCCAGUGGGCACAdTdT 1509-1527 3975 3976 AD-59389 CCACAGGAGCCAGCAUACUdTdT AGUAUGCUGGCUCCUGUGGdTdT 311-329 3977 3978 AD-59585 GUGGUACUAGAAAUAUUUCdTdT GAAAUAUUUCUAGUACCACdTdT 1170-1188 3979 3980 AD-59570 UUCGCCGCUGCCCAUUCUUdTdT AAGAAUGGGCAGCGGCGAAdTdT 351-369 3981 3982 AD-59415 CCGCCAGCACCAGCGCAACdTdT GUUGCGCUGGUGCUGGCGGdTdT 1840-1858 3983 3984 AD-59505 CGCUGAGGGACGGGUGCUUdTdT AAGCACCCGUCCCUCAGCGdTdT 1819-1837 3985 3986 AD-59557 UGGACUUCUCGACUUGAGUdTdT ACUCAAGUCGAGAAGUCCAdTdT 69-87 3987 3988 AD-59548 AAAGAAACCCCUCCGGCCAdTdT UGGCCGGAGGGGUUUCUUUdTdT 512-530 3989 3990 AD-59487 UUGACACCGUACGGUCCUAdTdT UAGGACCGUACGGUGUCAAdTdT 1719-1737 3991 3992 AD-59550 CCCUCUUCACCCUGGCUAAdTdT UUAGCCAGGGUGAAGAGGGdTdT 1293-1311

3993 3994 AD-59572 CCCCCAGGCCUUUCUGCAGdTdT CUGCAGAAAGGCCUGGGGGdTdT 379-397 3995 3996 AD-59554 AUGCCCAAAACUGCCCCAAdTdT UUGGGGCAGUUUUGGGCAUdTdT 423-441 3997 3998 AD-59437 CUUGAGUGCCCGCCUCCUUdTdT AAGGAGGCGGGCACUCAAGdTdT 81-99 3999 4000 AD-59584 GGGUACAUCGCCAGCACGAdTdT UCGUGCUGGCGAUGUACCCdTdT 1691-1709 4001 4002 AD-59373 GUGUGGGGCAGUUAUGGACdTdT GUCCAUAACUGCCCCACACdTdT 1123-1141 4003 4004 AD-59545 ACAUAGUCCUGGAAAUAAAdTdT UUUAUUUCCAGGACUAUGUdTdT 2372-2390 4005 4006 AD-59547 AUCCCAGCAGAGUCCAGAUdTdT AUCUGGACUCUGCUGGGAUdTdT 580-598 4007 4008 AD-59470 CUAGAUUCUUUCCACAGGAdTdT UCCUGUGGAAAGAAUCUAGdTdT 300-318 4009 4010 AD-59417 UUGUUUUCCUCGUGCUUUGdTdT CAAAGCACGAGGAAAACAAdTdT 1259-1277 4011 4012 AD-59535 CCUCCUUCGCCGCCGCCUCdTdT GAGGCGGCGGCGAAGGAGGdTdT 93-111 4013 4014 AD-59507 UGAGGCUGCUCCCGGACAAdTdT UUGUCCGGGAGCAGCCUCAdTdT 31-49 4015 4016 AD-59519 CCAACAGACUCCUGAUGGAdTdT UCCAUCAGGAGUCUGUUGGdTdT 562-580 4017 4018 AD-59391 UCACAUGGAAGCAAGUGGGdTdT CCCACUUGCUUCCAUGUGAdTdT 2112-2130 4019 4020 AD-59537 CAUUCAAUGGAUGGGGCGGdTdT CCGCCCCAUCCAUUGAAUGdTdT 1490-1508 4021 4022 AD-59450 AGGAAUGAGUCGCCACCCAdTdT UGGGUGGCGACUCAUUCCUdTdT 1099-1117 4023 4024 AD-59449 UGGACUUAGAGCGGGAGCUdTdT AGCUCCCGCUCUAAGUCCAdTdT 1209-1227 4025 4026 AD-59418 CUAAAAACACAGAAGUCUGdTdT CAGACUUCUGUGUUUUUAGdTdT 1950-1968 4027 4028 AD-59561 CCCUCACCACACACCCCAGdTdT CUGGGGUGUGUGGUGAGGGdTdT 2062-2080 4029 4030 AD-59460 AAUCCUUGCUUCAGGGACUdTdT AGUCCCUGAAGCAAGGAUUdTdT 171-189 4031 4032 AD-59409 UUGUGGCAUUUGAAACUGUdTdT ACAGUUUCAAAUGCCACAAdTdT 1470-1488 4033 4034 AD-59476 UCAAUUACCCUACGGUGCCdTdT GGCACCGUAGGGUAAUUGAdTdT 2010-2028 4035 4036 AD-59406 CAAGCCAGCCCCUCGGGCAdTdT UGCCCGAGGGGCUGGCUUGdTdT 460-478 4037 4038 AD-59569 GAGUCUUCCCUGCCUGGAUdTdT AUCCAGGCAGGGAAGACUCdTdT 259-277 4039 4040 AD-59451 UGGAGAGUGUUGUUCGCCGdTdT CGGCGAACAACACUCUCCAdTdT 339-357 4041 4042 AD-59553 ACCCCUUGCCUGCCACAAGdTdT CUUGUGGCAGGCAAGGGGUdTdT 621-639 4043 4044 AD- CUGGAUGGAUGAGUGGCUUdTdT AAGCCACUCAUCCAUCCAG 272-290

59372 dTdT 4045 4046 AD-59377 CAAGAUGAUGGAAGUUGGGdTdT CCCAACUUCCAUCAUCUUGdTdT 439-457 4047 4048 AD-59531 UUUCGUUUGGACUUCUCGAdTdT UCGAGAAGUCCAAACGAAAdTdT 62-80 4049 4050 AD-59560 UCAUCUUCACCACCUCUCUdTdT AGAGAGGUGGUGAAGAUGAdTdT 1749-1767 4051 4052 AD-59489 UGCCCAGUUCUUCCCGCUGdTdT CAGCGGGAAGAACUGGGCAdTdT 132-150 4053 4054 AD-59540 AAAAAUGGACAUCAUUUCUdTdT AGAAAUGAUGUCCAUUUUUdTdT 1639-1657 4055 4056 AD-59378 CUUGAGCUUCAGGAGGAUGdTdT CAUCCUCCUGAAGCUCAAGdTdT 719-737 4057 4058 AD-59403 CCUCUCUGCCACCCAUGCUdTdT AGCAUGGGUGGCAGAGAGGdTdT 1761-1779 4059 4060 AD-59493 AAAGUCAGGAUCCCUAAGAdTdT UCUUAGGGAUCCUGACUUUdTdT 242-260 4061 4062 AD-59374 CGACCACGGAGGAAUCCUUdTdT AAGGAUUCCUCCGUGGUCGdTdT 159-177 4063 4064 AD-59380 UUCCGUCUGGACACCCCUUdTdT AAGGGGUGUCCAGACGGAAdTdT 609-627 4065 4066 AD-59576 CCACCCAUGCUGCUGGCUGdTdT CAGCCAGCAGCAUGGGUGGdTdT 1769-1787 4067 4068 AD-59425 UGAGAAAAAGAAUGACCACdTdT GUGGUCAUUCUUUUUCUCAdTdT 961-979 4069 4070 AD-59509 UAAGAUGAUGCCAGGCUGUdTdT ACAGCCUGGCAUCAUCUUAdTdT 1309-1327 4071 4072 AD-59488 AGUUAUAUUAAAUUUUAAUdTdT AUUAAAAUUUAAUAUAACUdTdT 2342-2360 4073 4074 AD-59486 UCUUCCCGCUGUGGGGACAdTdT UGUCCCCACAGCGGGAAGAdTdT 140-158 4075 4076 AD-59465 UGCCACAAGCCAGGGCACUdTdT AGUGCCCUGGCUUGUGGCAdTdT 631-649 4077 4078 AD-59484 AGCGCAGUUAUGCCCAGUUdTdT AACUGGGCAUAACUGCGCUdTdT 122-140 4079 4080 AD-59368 GGACCAGGAGAAAGUCAGGdTdT CCUGACUUUCUCCUGGUCCdTdT 232-250 4081 4082 AD-59464 UGUCCACUGCCCCAGCCACdTdT GUGGCUGGGGCAGUGGACAdTdT 1903-1921 4083 4084 AD-59386 AUCGCGGCCUGAGGCUGCUdTdT AGCAGCCUCAGGCCGCGAUdTdT 22-40 4085 4086 AD-59439 GGGGAUGUGGGGACCAGGAdTdT UCCUGGUCCCCACAUCCCCdTdT 222-240 4087 4088 AD-59440 CUGGAAAUAAAUUCUUGCUdTdT AGCAAGAAUUUAUUUCCAGdTdT 2380-2398 4089 4090 AD-59542 UUGAAACUGUCCAUUCAAUdTdT AUUGAAUGGACAGUUUCAAdTdT 1479-1497 4091 4092 AD-59559 GUGGGGACACGACCACGGAdTdT UCCGUGGUCGUGUCCCCACdTdT 150-168 4093 4094 AD-59586 CGCAGUGGGGCUUUAUGGGdTdT CCCAUAAAGCCCCACUGCGdTdT 1579-1597

4095 4096 AD-59408 UUGUCUUUAUAUGUGAAUUdTdT AAUUCACAUAUAAAGACAAdTdT 2322-2340 4097 4098 AD-59568 UCACCCUGGCUAAGAUGAUdTdT AUCAUCUUAGCCAGGGUGAdTdT 1299-1317 4099 4100 AD-59398 GUAUCUGCUCAGGCCUGAGdTdT CUCAGGCCUGAGCAGAUACdTdT 2243-2261 4101 4102 AD-59508 AUGAGUGGCUUCUUCUCCAdTdT UGGAGAAGAAGCCACUCAUdTdT 280-298 4103 4104 AD-59523 GAAGUUGGGGCCAAGCCAGdTdT CUGGCUUGGCCCCAACUUCdTdT 449-467 4105 4106 AD-59410 UCAGGGACUCGGGACCCUGdTdT CAGGGUCCCGAGUCCCUGAdTdT 181-199 4107 4108 AD-59541 UCCUACGGAUUGCCCCCACdTdT GUGGGGGCAAUCCGUAGGAdTdT 2043-2061 4109 4110 AD-59524 UUACUCUGAUUCUGGGAACdTdT GUUCCCAGAAUCAGAGUAAdTdT 1333-1351 4111 4112 AD-59501 AUCCCUAAGAGUCUUCCCUdTdT AGGGAAGACUCUUAGGGAUdTdT 251-269 4113 4114 AD-59383 UGCCAAAGUACAUCUUCCGdTdT CGGAAGAUGUACUUUGGCAdTdT 1389-1407 4115 4116 AD-59577 UCCUCGGGUUUAGGGGAUGdTdT CAUCCCCUAAACCCGAGGAdTdT 210-228 4117 4118 AD-59447 UGCUGAAACCUCAGCAGGCdTdT GCCUGCUGAGGUUUCAGCAdTdT 769-787 4119 4120 AD-59555 CCACCCACGGGUGUGUGGGdTdT CCCACACACCCGUGGGUGGdTdT 1111-1129 4121 4122 AD-59405 UGGUGCAGUAAUGACUACCdTdT GGUAGUCAUUACUGCACCAdTdT 1079-1097 4123 4124 AD-59371 UUCUCCACCUAGAUUCUUUdTdT AAAGAAUCUAGGUGGAGAAdTdT 292-310 4125 4126 AD-59443 UAAGGCGCCGGCGAUCGCGdTdT CGCGAUCGCCGGCGCCUUAdTdT 9-27 4127 4128 AD-59401 UGGAACUAGUAAAUUCCAUdTdT AUGGAAUUUACUAGUUCCAdTdT 1189-1207 4129 4130 AD-59494 GGACCCUGCUGGACCCCUUdTdT AAGGGGUCCAGCAGGGUCCdTdT 192-210 4131 4132 AD-59504 UCAAUUAUUUCACUUAACCdTdT GGUUAAGUGAAAUAAUUGAdTdT 2269-2287 4133 4134 AD-59369 CCCGGACAAGGGCAACGAGdTdT CUCGUUGCCCUUGUCCGGGdTdT 41-59 4135 4136 AD-59571 UUUUAAAACUGUGAACCGGdTdT CCGGUUCACAGUUUUAAAAdTdT 991-1009 4137 4138 AD-59527 GUGCUUCGCCGCCAGCACCdTdT GGUGCUGGCGGCGAAGCACdTdT 1832-1850 4139 4140 AD-59466 UGGACCCCUUCCUCGGGUUdTdT AACCCGAGGAAGGGGUCCAdTdT 201-219 4141 4142 AD-59526 CUGUAUAUUAAGGCGCCGGdTdT CCGGCGCCUUAAUAUACAGdTdT 1-19 4143 4144 AD-59543 UUGCCCCCACCCCUCACCAdTdT UGGUGAGGGGUGGGGGCAAdTdT 2052-2070 4145 4146 AD- AUGGGGCGGUGUGCCCACUdTdT AGUGGGCACACCGCCCCAU 1500-1518

59564 dTdT 4147 4148 AD-59583 CUAUAGUAAAAACAUAGUCdTdT GACUAUGUUUUUACUAUAGdTdT 2361-2379

Активность in vitro ми-РНК в подавлении мРНК ALAS1 тестировали в ходе скрининга по одной дозе на клетках Hep3B, которые были трансфицированы с использованием липофектамина 2000 в качестве реагента для трансфекции. Эксперименты с использованием одной дозы осуществляли при концентрации дуплекса 10 нМ и анализировали в анализе разветвленной ДНК (р-ДНК). Результаты показаны в таблице 19 и выражены в виде процента сохраняемой мРНК.

Таблица 19
Подавление мРНК ALAS1, которое оценивали в анализе р-ДНК
Дуплекс % сохраняемой мРНК SD AD-59453 11,2 1,5 AD-59395 12,7 1,1 AD-59477 14,5 2,0 AD-59492 14,8 2,1 AD-59361 15,1 4,9 AD-59462 15,4 2,6 AD-59433 15,8 2,7 AD-59424 16,0 1,7 AD-59414 16,1 1,3 AD-59539 16,2 2,6 AD-59400 16,2 1,8 AD-59551 16,3 2,3 AD-59482 16,6 2,1 AD-59448 16,6 3,7 AD-59392 16,9 3,5 AD-59469 16,9 2,2 AD-59431 17,0 2,0 AD-59423 17,1 3,8 AD-59517 17,2 1,5 AD-59578 17,3 3,1 AD-59495 17,7 3,7

AD-59432 17,7 2,8 AD-59382 17,9 3,2 AD-59472 18,6 3,5 AD-59459 18,7 3,8 AD-59413 18,8 2,4 AD-59478 18,9 3,0 AD-59376 18,9 3,2 AD-59556 18,9 2,4 AD-59399 19,0 4,1 AD-59474 19,4 1,6 AD-53542 19,4 1,7 AD-59480 19,6 1,6 AD-59549 19,7 2,1 AD-59515 19,8 4,4 AD-59427 19,9 3,2 AD-59390 19,9 3,4 AD-59511 19,9 2,2 AD-59532 20,0 2,4 AD-59562 20,2 2,6 AD-59513 20,3 3,9 AD-59362 20,6 2,5 AD-53541 20,6 2,2 AD-59490 20,7 2,3 AD-59422 20,8 4,5 AD-59467 21,2 2,3 AD-59579 21,2 3,3 AD-59426 21,7 2,3 AD-59363 21,7 2,7 AD-59436 21,7 2,7 AD-53536 21,9 1,5 AD-59491 21,9 2,6 AD-59500 22,2 2,8 AD-59394 22,3 10,1 AD-59441 22,3 2,6

AD-59365 22,4 4,2 AD-59411 22,5 2,9 AD-59544 22,5 2,1 AD-59428 22,7 4,7 AD-59471 22,9 5,0 AD-59518 22,9 2,3 AD-53547 22,9 1,5 AD-59573 23,0 4,2 AD-59473 23,2 1,8 AD-59412 23,4 2,5 AD-59522 23,4 3,3 AD-59502 23,6 2,7 AD-59499 23,6 1,6 AD-59520 23,8 3,8 AD-59581 23,9 6,0 AD-59461 24,3 4,2 AD-59370 24,3 5,6 AD-53540 24,4 2,1 AD-59574 24,5 2,0 AD-59375 24,6 2,3 AD-59387 24,8 7,2 AD-59397 24,9 9,6 AD-59396 25,0 10,2 AD-59393 25,3 11,6 AD-59483 25,4 3,8 AD-59430 25,5 1,8 AD-59463 25,6 4,8 AD-53534 25,9 3,1 AD-59514 26,2 5,7 AD-59575 26,2 3,2 AD-59364 26,2 4,5 AD-59402 26,3 3,1 AD-59479 26,3 2,5 AD-59481 26,4 2,2

AD-59530 26,4 4,4 AD-59582 26,6 3,9 AD-59506 27,0 4,1 AD-59567 27,3 1,1 AD-59485 27,7 4,7 AD-59525 28,3 3,1 AD-59566 28,5 0,6 AD-59580 28,7 7,1 AD-59512 29,5 2,5 AD-59475 29,6 4,2 AD-59438 29,6 3,3 AD-59442 29,9 2,8 AD-59516 30,4 3,8 AD-59429 30,8 4,3 AD-59510 31,3 1,9 AD-59457 31,4 1,2 AD-59434 31,6 3,5 AD-59454 32,0 1,9 AD-59468 32,2 3,2 AD-59565 32,4 1,5 AD-59416 32,7 1,7 AD-59420 33,2 3,1 AD-59552 33,2 2,2 AD-59558 33,8 3,8 AD-59404 34,0 5,4 AD-59455 34,8 1,3 AD-59496 34,9 5,2 AD-59446 35,5 1,7 AD-59435 35,9 1,2 AD-59419 36,0 1,4 AD-59533 36,7 3,7 AD-59366 36,7 6,0 AD-59521 36,9 4,3 AD-59563 36,9 4,1

AD-59534 36,9 3,3 AD-59407 37,1 4,7 AD-59445 37,2 3,2 AD-59546 37,9 4,9 AD-59456 38,3 4,0 AD-59503 38,8 5,0 AD-59536 39,8 4,2 AD-59385 39,9 13,7 AD-59367 40,0 3,6 AD-59458 40,0 3,4 AD-59381 40,3 9,9 AD-59538 40,8 4,9 AD-59421 40,9 6,4 AD-59388 41,0 9,1 AD-59444 41,1 2,7 AD-59528 41,9 3,3 AD-59498 42,2 3,3 AD-59497 42,4 4,9 AD-59384 42,7 17,6 AD-59452 42,7 3,1 AD-59379 43,6 2,6 AD-59529 43,8 4,8 AD-59389 44,1 6,4 AD-59585 44,3 3,2 AD-59570 45,1 4,0 AD-59415 46,6 2,3 AD-59505 47,5 6,2 AD-59557 48,1 4,4 AD-59548 49,9 4,0 AD-59487 50,7 3,2 AD-59550 50,8 5,8 AD-59572 51,1 4,0 AD-59554 51,3 6,0 AD-59437 52,2 4,8

AD-59584 54,9 2,7 AD-59373 55,3 20,1 AD-59545 55,4 3,4 AD-59547 55,9 4,7 AD-59470 56,0 2,7 AD-59417 56,4 7,7 AD-59535 57,6 5,1 AD-59507 58,8 4,7 AD-59519 59,1 5,6 AD-59391 60,1 12,5 AD-59537 60,6 9,1 AD-59450 60,7 7,2 AD-59449 61,6 6,8 AD-59418 61,8 8,4 AD-59561 62,2 7,2 AD-59460 62,8 4,7 AD-59409 64,4 9,0 AD-59476 65,2 5,6 AD-59406 65,6 3,5 AD-59569 66,7 7,6 AD-59451 66,9 2,9 AD-59553 67,2 8,8 AD-59372 67,3 25,6 AD-59377 68,7 5,1 AD-59531 68,7 9,0 AD-59560 68,7 12,7 AD-59489 69,6 8,9 AD-59540 70,1 10,1 AD-59378 70,6 14,1 AD-59403 71,4 3,3 AD-59493 72,3 3,5 AD-59374 75,9 5,1 AD-59380 76,4 11,1 AD-59576 77,5 16,2

AD-59425 77,9 10,6 AD-59509 78,0 3,2 AD-59488 78,6 7,1 AD-59486 79,4 5,0 AD-59465 79,5 5,1 AD-59484 79,8 3,2 AD-59368 80,0 11,9 AD-59464 80,2 9,3 AD-59386 80,6 33,2 AD-59439 80,9 4,0 AD-59440 82,2 1,9 AD-59542 83,3 10,6 AD-59559 83,7 9,1 AD-59586 83,8 11,5 AD-59408 86,3 2,8 AD-59568 86,8 4,2 AD-59398 87,4 24,9 AD-59508 87,5 2,5 AD-59523 87,6 11,8 AD-59410 88,8 8,3 AD-59541 88,9 10,8 AD-59524 89,5 12,1 AD-59501 89,9 5,1 AD-59383 90,8 27,4 AD-59577 91,1 2,3 AD-59447 91,3 12,9 AD-59555 91,7 3,4 AD-59405 92,5 5,7 AD-59371 93,5 31,7 AD-59443 93,8 9,0 AD-59401 94,5 7,1 AD-59494 95,1 9,1 AD-59504 96,8 11,7 AD-59369 96,8 4,8

AD-59571 97,4 7,0 AD-59527 98,6 7,8 AD-59466 99,7 14,0 AD-59526 102,9 4,6 AD-59543 103,7 3,0 AD-59564 103,7 12,1 AD-59583 112,4 13,2

Двести тридцать два дуплекса, которые были тестированы, в различной степени подавляли мРНК ALAS1 в таком анализе по одной дозе. Согласно проведенному анализу, по меньшей мере, четыре дуплекса (AD-59453, AD-59395, AD-59477,и AD-59492) подавляли мРНК ALAS1 на 85% или больше, 39 дуплексов подавляли мРНК ALAS1 на 80% или больше, 101 дуплекс подавлял мРНК ALAS1 на 70% или больше, и 152 дуплекса подавляли мРНК ALAS1 на 50% или больше. Напротив, некоторые дуплексы не оказывали заметного подавления в данном анализе.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Специалистам в данной области будет понятно, или они смогут установить, используя ничего более, кроме обычных экспериментов, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящей публикации. Подразумевается, что такие эквиваленты входят в объем следующей формулы изобретения.

Похожие патенты RU2687223C2

название год авторы номер документа
СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОГО С SERPINC1 РАССТРОЙСТВА 2016
  • Акинк Акин
  • Соренсен Бенни
  • Гарг Пушкал
  • Робби Габриэль
RU2754188C2
КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ iRNA SERPINA1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ 2017
  • Шлегель, Марк, К.
  • Джанас, Майя
  • Джадхав, Васант, Р.
  • Фостер, Дональд
  • Манохаран, Мутхиах
  • Раджив, Каллантхоттатхил, Г.
  • Кел'Ин, Александер, В.
  • Хариссе, Клаус
  • Наир, Джаяпракаш, К.
  • Майер, Мартин, А.
  • Мацуда, Шигео
  • Джаяраман, Мутхусами
  • Сехгал, Алфика
  • Браун, Кристофер
  • Фицджеральд, Кевин
  • Милстейн, Стюарт
RU2761667C2
ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ФАКТОРОМ РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ (VEGF), ПОСРЕДСТВОМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К VEGF 2009
  • Коллард Джозеф
  • Хорькова Шерман Ольга
RU2569182C2
ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С НЕЙТРОФИЧЕСКИМ ФАКТОРОМ ГОЛОВНОГО МОЗГА (BDNF), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА BDNF 2013
  • Фагихи Мохаммад Али
  • Които Карлос
RU2661104C2
ЛЕЧЕНИЕ НАРУШЕНИЙ ЦНС 2007
  • Хименес Антон Ана Изабель
  • Сесто Яге Анхела
  • Хименес Гомес Мария Консепсьон
  • Гомес-Асебо Гульон Эдуардо
RU2426544C2
СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЯВЛЕНИЯ КРОВОТЕЧЕНИЯ У БОЛЬНОГО ГЕМОФИЛИЕЙ 2018
  • Акинк, Акин
RU2801263C2
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ГЕПАТИТА В 2018
  • Коузер, Мартин
  • Абрамс, Марк
RU2780021C2
СРЕДСТВА ДЛЯ РНКи, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ТРАНСТИРЕТИНОМ (TTR) 2012
  • Раджив Каллантхоттатхил Г.
  • Циммерманн Трэйси
  • Манохаран Мутхиах
  • Майер Мартин
  • Кучиманчи Сатиянараяна
  • Хариссе Клаус
RU2678807C2
МОЛЕКУЛЫ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОЙ КОРОТКОЙ ИНТЕРФЕРИРУЮЩЕЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, КОТОРЫЕ ОПОСРЕДУЮТ ИНТЕРФЕРЕНЦИЮ РНК 2006
  • Морриси Дэвид
  • Максвиджен Джеймс
  • Бейджелман Леонид
RU2418068C2
ЛИПОСОМЫ С РЕТИНОИДОМ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ МОДУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ HSP47 2012
  • Ниитсу Йоширо
  • Пэйн Джозеф И.
  • Кнопов Виктор
  • Акопян Виолетта
  • Уитт Ричард П.
  • Ахмадиан Мухаммед
  • Перельман Лорен А.
  • Танака Ясунобу
  • Файнштайн Елена
  • Авкин-Нахум Шарон
  • Калинский Хагар
  • Метт Игор
  • Миноми Кенжиро
  • Инг Венбин
  • Лиу Юн
RU2628694C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 687 223 C2

Реферат патента 2019 года КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ALAS1

Изобретение относится к биотехнологии. Описана двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1. Указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить. Антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1 и включает SEQ ID NO: 1296. Смысловая нить содержит по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295. Каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов. днРНК включает один или более нуклеотидов с модификацией, выбранной из 2’-O-метил-модифицированного нуклеотида, 2’-фтор-модифицированного нуклеотида или обоих. Также представлена фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, содержащая терапевтически эффективное количество днРНК. Представлены способы ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, лечения расстройства и снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке, связанного с экспрессией ALAS1, включающие введение днРНК. Изобретение позволяет ингибировать экспрессию гена ALAS1. 8 н. и 37 з.п. ф-лы, 15 ил., 20 табл., 12 пр.

Формула изобретения RU 2 687 223 C2

1. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, при этом указанная днРНК содержит смысловую нить и антисмысловую нить, причем:

(i) антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1 и включает SEQ ID NO: 1296,

(ii) смысловая нить содержит по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295,

(iii) каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов,

(iv) лиганд и линкер со структурой, показанной ниже, присоединен к 3’-концу смысловой нити днРНК

и

(v) днРНК включает один или более нуклеотидов с модификацией, выбранной из 2’-O-метил-модифицированного нуклеотида, 2’-фтор-модифицированного нуклеотида или обоих.

2. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, содержащая:

(i) антисмысловую нить, комплементарную по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1;

(ii) смысловую нить, содержащую по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295;

(iii) каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов;

(iv) одно или более производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc) и

(v) один или более нуклеотидов с модификацией, выбранной из 2’-O-метил-модифицированного нуклеотида, 2’-фтор-модифицированного нуклеотида или обоих.

3. ДнРНК по п. 2, в которой антисмысловая нить содержит последовательность SEQ ID NO: 1296.

4. ДнРНК по п. 3, содержащая по меньшей мере пять 2’-O-метил-модифицированных нуклеотидов и по меньшей мере пять 2’-фтор-модифицированных нуклеотидов.

5. ДнРНК по п. 4, содержащая одну или более фосфоротиоатных связей.

6. ДнРНК по п. 2, содержащая по меньшей мере 20 2’-O-метил-модифицированных нуклеотидов и/или 2’-фтор-модифицированных нуклеотидов.

7. ДнРНК по п. 5, содержащая 2’-O-метил-модифицированные нуклеотиды и/или 2’-фтор-модифицированные нуклеотиды по всей длине смысловой и антисмысловой нитей.

8. ДнРНК по п. 3, включающая по меньшей мере один тупой конец.

9. ДнРНК по п. 3, в которой оба конца днРНК являются тупыми концами.

10. ДнРНК по п. 3, в которой по меньшей мере одна нить включает 3’-липкий конец, состоящий из по меньшей мере 1 нуклеотида.

11. ДнРНК по п. 10, в которой 3’-липкий конец имеет длину 2 нуклеотида.

12. ДнРНК по п. 10, в которой 3’-липкий конец присутствует на 3’-конце либо антисмысловой нити, либо смысловой нити, либо на обоих 3’-концах антисмысловой нити и смысловой нити днРНК.

13. ДнРНК по п. 10, в которой 3’-липкий конец находится на антисмысловой нити.

14. ДнРНК по п. 13, в которой один или более нуклеотидов липкого конца представляют собой нуклеозид трифосфат.

15. ДнРНК по п. 1 или 2, в которой лиганд или производное GalNAc конъюгирован(о) с 3’-концом смысловой нити днРНК.

16. ДнРНК по п. 2, в которой одно или более производных GalNAc является двухантенным или трехантенным лигандом GalNAc.

17. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc представляет собой

18. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc присоединен к 3’-концу смысловой нити.

19. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc присоединен к 3’-концу смысловой нити посредством линкера.

20. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc и линкер имеют структуру

21. ДнРНК по п. 1 или 2, в которой антисмысловая нить полностью комплементарна по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1.

22. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, содержащая:

(i) антисмысловую нить, которая включает последовательность SEQ ID NO: 1296;

(ii) смысловую нить, содержащую по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295;

(iii) область дуплекса длиной от 19 до 30 пар оснований;

(iv) двухантенный или трехантенный лиганд GalNAc;

(v) 20 или более модифицированных нуклеотидов, выбранных из 2’-O-метил-модифицированных нуклеотидов и 2’-фтор-модифицированных нуклеотидов, и

(vi) по меньшей мере одну нить, содержащую 3’-липкий конец, состоящий из по меньшей мере 1 нуклеотида.

23. ДнРНК по п. 22, в которой каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов.

24. ДнРНК по п. 23, в которой антисмысловая нить включает 3’-липкий конец.

25. ДнРНК по п. 24, в которой 3’-липкий конец имеет длину 2 нуклеотида.

26. ДнРНК по п. 25, содержащая смысловую нить с тупым концом.

27. ДнРНК по п. 26, содержащая одну или более фосфоротиоатных связей.

28. ДнРНК по п. 27, содержащая 2’-O-метил-модифицированные нуклеотиды и/или 2’-фтор-модифицированные нуклеотиды по всей длине смысловой и антисмысловой нитей.

29. ДнРНК по п. 22, в которой лиганд GalNAc представляет собой

30. ДнРНК по п. 29, в которой лиганд GalNAc присоединен к 3’-концу смысловой нити.

31. ДнРНК по п. 30, в которой лиганд GalNAc присоединен к 3’-концу смысловой нити посредством линкера.

32. ДнРНК по п. 16, в которой лиганд GalNAc и линкер имеют структуру

33. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (днРНК) для ингибирования экспрессии ALAS1, содержащая:

(i) антисмысловую нить, которая полностью комплементарна по меньшей мере нуклеотидам 871-889 последовательности SEQ ID NO: 1;

(ii) смысловую нить, содержащую по меньшей мере 15 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 1295, причем каждая из смысловой и антисмысловой нитей имеет длину от 19 до 24 нуклеотидов;

(iii) лиганд, присоединенный к 3’-концу смысловой нити и имеющий структуру

(iv) модифицированные нуклеотиды по всей длине смысловой нити и антисмысловой нити, состоящие из 2’-O-метил-модифицированных нуклеотидов, 2’-фтор-модифицированных нуклеотидов, и фосфоротиоатные связи;

(v) антисмысловую нить, включающую 3’-липкий конец длиной 2 нуклеотида, и

(vi) смысловую нить с тупым концом.

34. Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, содержащая терапевтически эффективное количество днРНК по любому из пп. 1-33.

35. Фармацевтическая композиция по п. 34, причем указанную композицию вводят внутривенно или подкожно.

36. Способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, включающий:

(a) введение в клетку днРНК по любому из пп. 1-33 или фармацевтической композиции по п. 34 и

(b) поддержание клетки со стадии (a) в течение периода времени, достаточного для получения распада транскрипта мРНК гена ALAS1 с ингибированием тем самым экспрессии гена ALAS1 в клетке.

37. Способ лечения расстройства, связанного с экспрессией ALAS1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества днРНК по любому из пп. 1-33 или фармацевтической композиции по п. 34.

38. Способ по п. 37, в котором субъект подвергается риску развития порфирии или у него диагностирована порфирия.

39. Способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке, включающий осуществление контакта клетки с днРНК по п. 1 в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке.

40. Способ по п. 38, в котором порфирия представляет собой печеночную порфирию.

41. Способ по п. 40, в котором печеночная порфирия выбрана из острой интермиттирующей порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (HCP), смешанной порфирии (VP), порфирии вследствие недостаточности ALA-дегидратазы (ADP) и гепатоэритропоэтической порфирии.

42. Способ по п. 38, в котором днРНК или композицию, содержащую днРНК, вводят до, во время или после острого приступа порфирии.

43. Способ по п. 38, в котором днРНК или композицию, содержащую днРНК, вводят в продромальный период.

44. Способ по п. 43, в котором продромальный период характеризуется болью, тошнотой, психологическими симптомами, беспокойством или бессонницей.

45. Способ по п. 38, в котором пациент имеет повышенный уровень ALA и/или PBG.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2687223C2

С. М. РЫБКИН, Н. Б. Строкан и А. X. Хусаинов Физико-технический институт им. А. Ф. Иоффе 0
SU260745A1
US 20050080032 А1, 14.04.2005
US 20100112687 А1, 06.05.2010
RICHARD T
PON, Tandem oligonucleotide synthesis using linker phosphoramidites, Nucleic Acids Res, 2005; 33(6), 1940-1948
RICHARD J
ROBERTS, REBASE - enzymes and genes for DNA restriction and modification, Nucleic Acids Res, 2007; 35(Database issue):D269-70.

RU 2 687 223 C2

Авторы

Беттенкорт Брайан

Фитцжеральд Кевин

Куэрбс Уилльям

Ясуда Макико

Десник Роберт Дж.

Даты

2019-05-07Публикация

2013-04-10Подача