СПОСОБ ОЧИСТКИ КОКЦИДИАЛЬНЫХ ООЦИСТ ИЗ ЭКСКРЕМЕНТОВ ЖИВОТНЫХ, СИСТЕМА, ПРИГОДНАЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ДАННОГО СПОСОБА, И ПОЛУЧЕННЫЕ ПОСРЕДСТВОМ ИХ ООЦИСТЫ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/02 C12Q1/04 A61K39/12 

ОБЩАЯ ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу очистки кокцидиальных ооцист, имеющих размеры между Dmin и Dmax, из экскрементов, включающему этапы сбора экскрементов, содержащего кокцидиальные ооцисты, от животных-хозяев, разбавления экскрементов в водной среде, необязательно отделения крупной фракции, содержащей макроскопические твердые частицы из разбавленных экскрементов, и сбор водной фракции (которая может представлять собой экскременты, разведенные в водной среде), содержащей ооцисты, с целью извлечения из нее ооцист. Изобретение также относится к системе, пригодной для применения данного способа, и к полученным посредством нее ооцистам.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Кокцидиоз представляет собой заболевание различных животных, при котором в слизистую оболочку кишечника внедряются и поражают простейшие подкласса Coccidia. Экономические результаты кокцидиоза могут быть особенно тяжелыми в промышленном птицеводстве, где интенсивное содержание птиц способствует распространению заболевания. Инфицирование кокцидиальными простейшими является, большей частью, видоспецифическим. Ряд видов, однако, может инфицировать одного хозяина. Например, имеется семь видов кокцидиальных простейших, которые инфицируют кур, шесть из которых считаются от умеренно- до высокопатогенными.

Жизненный цикл паразитирующих кокцидий сложен. Например, простейшим родов Eimeria, Isospora, Cystoisospora или Cryptosporidium, как правило, требуется один хозяин для завершения их жизненного цикла, хотя Cystoisospora могут использовать промежуточного хозяина. В природных условиях жизненный цикл начинается с проглатывания спорулированных ооцист из окружающей среды. Как правило, ооцисты имеют форму от овальной до эллиптической, варьируют от 10 до 48 мкм в длину на 10-30 мкм в ширину и могут содержать специальные структуры, такие как полярные шапочки, микропили, остаточные и кристаллические тела. Когда спорулированные ооцисты поглощаются восприимчивым животным, стенка спорулированного ооциста разрывается с целью высвобождения спороцист внутрь. В птицеводстве высвобождение спороциста является результатом механического разрыва спорулированного ооциста в мышечном желудке. Внутри спороциста имеются спорозоиты, которые представляют собой заразную стадию организма. В птицеводстве разрушение оболочки спороциста и высвобождение спорозоитов биохимически осуществляется через действие хемотрипсина и желчных солей в тонкой кишке. Тотчас после высвобождения спорозоиты внедряются в слизистую оболочку кишечника или эпителиальные клетки других локализаций. Участок инфицирования является характерным для вовлеченного вида. Например, в роду Eimeria E. tenella локализуется в слепой кишке; E. necatrix обнаруживают в передней и средней частях тонкой кишки; E. acervulina и E. praecox встречается в верхней половине тонкой кишки; E. brunetti встречается в нижней части тонкой кишки, прямой кишке, слепой кишке и клоаке; E. mitis обнаруживают в нижней части тонкой кишки, тогда как E. maxima можно обнаружить в любой из данных физиологических локализаций.

Попав внутрь клеток животных-хозяев спорозоиты превращаются в многоядерные меронты, также называемые шизонтами. Каждое ядро меронта превращается в инфекционное тельце, называемое мерозоитом, которое входит в новые клетки и повторяет процесс. После варьирующего ряда бесполых поколений мерозоиты превращаются либо в микрогаметоциты, либо в макрогаметы. Микрогаметоциты превращаются во множество микрогамет, которые, в свою очередь, оплодотворяют макрогаметы. Затем вокруг получившихся в результате зигот формируется устойчивая оболочка. Инцистированные зиготы называются ооцисты и распространяются неспорулированными в экскрементах. Инфицированные птицы могут распространять ооцисты в экскрементах в течение дней или недель. При подходящих условиях температуры и влажности ооцисты становятся заразными через процесс споруляции. Затем восприимчивые птицы проглатывают спорулированные ооцисты за счет нормальной клевательной активности или поиска пищи в лесной подстилке, и сам цикл повторяется. Проглатывание жизнеспособных, спорулированных ооцист представляет собой единственный природный процесс инфицирования. Инфицирование кокцидиальными простейшими приводит к иммунитету, так что с течением времени заболеваемость снижается, поскольку члены стаи становятся иммунизированными. Такая самоограничивающая природа кокцидиальных инфекций широко известна у кур и в других видах птицеводства. Приобретенный иммунитет, однако, является видоспецифическим, так что внедрение других видов кокцидиальных простейших приведет к новой вспышке заболевания.

Стенка ооцист кокцидиальных простейших обеспечивает высокоэффективный барьер для выживания ооцист. Вне хозяина ооцисты могут сохранять жизнеспособность в течение многих недель. В лабораторных условиях интактные ооцисты резистентны к экстремальным значениям pH, детергентам, протеолитическим, гликолитическим и липолитическим ферментам, механическому разрушению и химическим веществам, таким как гипохлорит и дихромат натрия.

В настоящее время для контроля кокцидиоза в птицеводстве применяют два способа. Первый задействует контроль посредством химиотерапии. Для контроля кокцидиоза в птицеводстве является пригодным ряд лекарственных препаратов. По причине ряда видов, которые вызывают заболевание, весьма немногие лекарственные препараты являются эффективными против всех видов, несмотря на то, что один лекарственный препарат может быть эффективным против нескольких видов. В современном производстве бройлерных кур, например, введение лекарственных препаратов для контроля кокцидиоза является общепринятым. Расходы на превентивное лечение от кокцидиоза представляют значительную стоимость продукции.

Вакцинация птиц против кокцидиоза является альтернативой химиотерапии. Преимущество вакцинации состоит в том, что она может значительно снизить или исключить потребность в введении противококцидиальных лекарственных препаратов, уменьшая таким образом стоимость лекарственных препаратов для владельцев промышленного птицеводческого предприятия, предотвращая развитие штаммов, резистентных к лекарственным средствам, и уменьшая беспокойство потребителей об остатках лекарственных препаратов. Для иммунизации сельскохозяйственной птицы от кокцидиальных простейших был разработан ряд способов. Успешные способы основываются на введении живых простейших, либо полностью вирулентных штаммов, либо аттенуированных штаммов. Наиболее частым путем введения является пероральный, хотя применяют и другие пути. Как правило, кур вакцинируют посредством перорального введения жизнеспособных спорулированных ооцист либо непосредственно в ротовую полость, либо через пищу или воду.

Независимо от пути введения, методики производства вакцин от кокцидиоза являются весьма сходными. Кратко, кокцидиальных простейших производят посредством инфицирования животных-хозяев одним видом кокцидиальных простейших. Данный «семенной фонд» часто является клональным по природе, то есть произведен от одного организма с целью обеспечения присутствия только интересующего вида. Семенной фонд может быть дикого типа, то есть выделен в поле, или он может представлять собой зрелые или аттенуированные штаммы. Затем простейшим позволяют пройти репликацию в хозяине, после которой простейших собирают у животных, обычно из выделений. Применение аттенуированных штаммов, как правило, приводит к меньшему выделению ооцист из животного-хозяина. На первом этапе процесса очистки, при необходимости, крупную фракцию, содержащую макроскопические твердые частицы, отделяют от разбавленных выделений. Затем простейших отделяют от разбавленных выделений посредством хорошо известных методик, таких как солевая флотация и центрифугирование (для обеспечения, чтобы не было твердых частиц, имеющих плотность, которая более чем на 10% отличается от плотности ооцистов, очищают с ооцистами). Во время сбора простейшие представляют собой неинфекционную стадию ооциста жизненного цикла. Чтобы стать более заразными и таким образом более пригодными для вакцин, необходимо индуцировать ооцисты, чтобы подвергнуть их споруляции. У членов рода Eimeria споруляция, как правило, затрагивает культивируемые ооцисты в 1-4% водном растворе дихромата калия при 19-37°C, предпочтительно приблизительно 28°C с постоянной аэрацией. Споруляция обычно завершается в течение 12-48 часов в зависимости от применяемой температуры. Мониторное наблюдение за процессом споруляции дополняется микроскопическим исследованием простейших. Композиции для хранения, обнаруженные в предшествующем уровне техники, как правило, содержат водный раствор дихромата калия. Спорулированные ооцисты обычно хранят в 1-4% водном растворе дихромата калия для предотвращения бактериального роста, однако применяют и другие среды хранения.

Современные вакцины, приемлемые для предотвращения кокцидиоза, как правило, содержат 2,5% раствор по массе к объему и содержат приблизительно 1600 ооцитов на дозу (400 спорулированных ооцист, представляющих четыре различных вида). Важный недостаток современных способов получения спорулированных ооцист состоит в том, что они, как правило, зависят от солевой флотации и центрифугирования для очистки. Это не только требует очень много времени (в частности центрифугирование должно происходить партиями), но также приводит к контакту ооцист с концентрированным солевым раствором в течение многих часов. Количество воды по отношению к количеству ооцист должно оставаться малым, так как в противном случае стадия порционного центрифугирования может быть далека от экономичной. Суммарный эффект всего этого, в частности длительное время процесса и контакт ооцист с концентрированной солью, состоит в том, что во время данного известного процесса очистки пропадает 80% жизнеспособных ооцист. Также очищенные ооцисты содержат остатки солей, применяемых для методики флотации, причем данная соль является недостатком на дополнительных этапах процесса, или данная соль может быть включена в итоговую вакцину и мешать компонентам вакцины или животного-хозяина. Также ооцисты, загрязняются растворенными веществами, как правило, применяемыми в методике центрифугирования для создания градиента плотности. Это является другим недостатком способов предшествующего уровня изобретения.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цель настоящего изобретения состоит в изобретении способа, который уменьшает недостатки способов очистки ооцист предшествующего уровня изобретения, в частности в изобретении способа, в котором большая часть ооцист очищается, оставаясь при этом все еще жизнеспособными и способными к споруляции. Также цель изобретения состоит в изобретении системы для применения данного способа и очищенных посредством него ооцист, предпочтительно не имеющих недостатка в виде присутствующих остатков солей или других растворенных веществ.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

С целью достижения первой цели изобретения был разработан способ согласно разделу ОБЩЕЙ ОБЛАСТИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ, при этом с целью извлечения ооцист из водной фракции способ включает этапы просеивания водной фракции через первую ситовую деку, имеющую отверстия сетки, позволяющие проходить ооцистам, для получения водного фильтрата, содержащего ооцисты, и первого осадка, содержащего частицы, более крупные, чем ооцисты, и впоследствии просеивания водного фильтрата через вторую ситовую деку, имеющую отверстия сетки для задержки проходящих ооцист через данную ситовую деку, для получения второго осадка, содержащего очищенные ооцисты, и непригодного фильтрата, содержащего частицы, меньшие, чем ооцисты.

Заявитель обнаружил, что посредством использования простого двухэтапного процесса просеивания ооцисты можно очистить от водной фракции экскрементов до должного уровня. На этапе первого просеивания могут быть удалены частицы, более крупнодисперсные, чем ооцисты (как правило, зерна песка, гравий и остатки растений), тогда как на этапе второго просеивания могут быть удалены частицы, меньшие, чем ооцисты (как правило, бактерии, вирусы, переваренные остатки растений, белковые волокна, масляные капли и т.д.). Таким способом можно получить фракцию ооцист, которая имеет очень малую нагрузку (или даже практически никакой) загрязняющих микробов, тогда как с применением способов флотации предшествующего уровня изобретения фракция ооцист еще содержит значительную микробную нагрузку. Просеивание можно применять (полу-) непрерывно, а количество воды, присутствующей в водной фракции по отношению к количеству ооцист, не связано с каким-либо экономическим максимумом: вода в конечном счете проходит вторую ситовую деку, тогда как очищенные ооцисты остаются в виде тонкого слоя осадка на данной деке. Таким образом, воду можно экономично использовать для получения хорошего просеивания и очищающего действия.

В данной области техники просеивание никогда не используют или даже не рассматривают как способ очистки кокцидиальных ооцист из экскрементов. Хотя просеивание применяют для удаления крупной фракции из экскрементов, его никогда не используют для получения очищенных ооцист. Не связывая себя теорией, по-видимому, для этого имеется несколько причин. Во-первых, все общие способы, применяемые для очистки ооцист, основаны на применении конкретной плотности ооцист, поскольку понятно, что в экскрементах не присутствуют другие большие фракции, которые имеют такую же плотность (т.е. имеющие плотность в пределах диапазона плотности, отличающейся самое большее на 10%, или даже самое большее на 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или даже всего лишь на 1% от плотности ооцист), как ооцисты. Вследствие этого, данные способы могут привести к достаточно чистой содержащей ооцисты композиции. С помощью просеивания сложно различить частицы, имеющие различную плотность, но только частицы, имеющие различные размеры (различные просеивающие характеристики). Это безусловно приводит к факту, что с помощью просеивания другие частицы такого же диапазона размеров, как ооцисты, но имеющие другую плотность, включены во фракцию ооцист как дополнительное загрязнение. Вследствие этого обычно предполагается, что с помощью просеивания ооцисты сложно очистить до должного уровня. Также ооцисты имеют форму не совершенно сферическую, но, как правило, от овальной до эллиптической. Просеивание несферических частиц имеет неизбежную проблему, что просеивающее действие зависит от ориентации частиц по отношению к ситовой деке. Поскольку данную ориентацию трудно регулировать, просеивание часто не считают приемлемым выбором для точного фракционирования несферических частиц. В заключение, просеивание часто приводит к высокой механической нагрузке на просеиваемые частицы, в частности когда размер ячеек сита находится в одинаковом диапазоне с размером частиц. Для биологической материи такая высокая механическая нагрузка часто вредна для их жизнеспособности (см. часто применяемый способ French Press для уничтожения бактерий). Неожиданно для заявителя, ничто из всего этого не мешает просеиванию являться хорошим способом очистки кокцидиальных ооцист из экскрементов и получения чистоты, которая является достаточной для применения ооцист в эффективной вакцине.

Как известно любому квалифицированному специалисту в области просеивания, отмечено, что «наличие отверстий сетки, позволяющих проходить ооцистам» не приравнивается просто к «наличию отверстий сетки больше, чем наибольший размер ооцист», ни что «наличие отверстий сетки для задержки проходящих ооцист» приравнивается просто к «наличию отверстий сетки меньше, чем наименьший размер ооцист». Как общеизвестно, проходит ли частица, имеющая конкретные размеры, ситовую деку, или нет (таким образом, позволяют или не позволяют отверстия сетки пройти частице), зависит не только от размеров частицы по отношению к размеру отверстий, но также зависит от материала проволоки ситовой деки, толщины проволоки, типа сита (тканого, типа переплетения, полученного распылением, фрезерованного, полученного лазерным распылением, просверленного и т.д.), формы отверстий сита, вибрирует ситовая дека или нет, амплитуды вибрации, применяется дополнительная текучая среда, чтобы помочь частицам пройти ситовую деку, или нет, формы частиц и т.д. Например, ситовая дека, имеющая отверстия сетки 150 мкм, в условиях, когда дека не вибрирует, может быть способна позволить проходить лишь частицам, имеющим диаметр, составляющий менее 50 мкм (поскольку на отверстии сита, как правило, могут образовываться «мостики» из 2-3 частиц). Также могут играть роль и другие обстоятельства. Например, сито, имеющее отверстия сетки 100 мкм, может быть способно позволять проходить частицам с верхней границей размера, составляющей 30 мкм, или например 60 мкм, или даже, например, 99 мкм, в зависимости от применяемого количества смазочного вещества (как правило, воды) и величины вибрации деки. Соответственно, это верно для ситуации, в которой отверстия сетки являются такими, что они могут задерживать прохождение частиц. Используя общедоступные знания в области просеивания, квалифицированный специалист в данной области может изобрести просеивающее устройство, которое можно применять согласно представленному изобретению.

Другое преимущество настоящего изобретения состоит в том, что очищенным ооцистам больше не нужно содержать (по существу) все ооцисты, присутствующие в экскрементах. С помощью представленного способа можно выбрать диапазон размеров ооцист, требующихся для очистки. С помощью способов предшествующего уровня изобретения все ооцисты определенной плотности очищаются в виде одной фракции. С помощью настоящего способа возможно, например, пропустить самые мелкие ооцисты или, например, выбрать только фракцию, которая представляет определенный вид кокцидий (каждый вид имеет характерные для своих ооцист диапазоны размеров).

С целью достижения второй цели изобретения была разработана система, пригодная для очистки кокцидиальных ооцист, имеющих размеры между Dmin и Dmax, из экскрементов или их мелкой фракции, при этом система содержит первую имеющую кольцевую форму ситовую деку, имеющую отверстия сетки, пригодные, чтобы позволить проходить ооцистам ситовую деку в фильтрате и задерживать частицы, более крупные, чем ооцисты, средство для автоматической загрузки фильтрата внутрь второй имеющей кольцевую форму ситовой деки, при этом вторая ситовая дека имеет отверстия сетки, чтобы задерживать ооцисты, проходящие через данную ситовую деку, и позволять проходить частицам, более мелким, чем ооцисты.

С целью достижения третьей цели изобретения изобретение предоставляет композицию очищенных кокцидиальных ооцист, полученных с применением описанного выше способа или системы, при этом композиция содержит частицы, имеющие размеры между Dmin и Dmax и имеющие плотность, отличающуюся от плотности ооцист.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Композиция ооцист, очищенных от экскрементов, означает, что из экскрементов, с которыми были выделены ооцисты, удаляется по меньшей мере 90%, в частности 91, 92, 93, 94, 95% или более материала, не являющегося ооцистами.

Dmin частицы представляет собой минимальный размер (длину, ширину и высоту) данной частицы.

Dmax частицы представляет собой максимальный размер (длину, ширину и высоту) данной частицы.

Макроскопический объект: объект, который можно увидеть невооруженным человеческим глазом. Как правило, это означает, что объект имеет размер, составляющий по меньшей мере приблизительно 0,1 мм.

Частица представляет собой ограниченный микроскопический или макроскопический объект, которому можно приписать физические параметры, такие как объем и масса. Обычными частицами, присутствующими в экскрементах животных, являются зерна песка, алевритовые частицы, частицы глины, остатки растений (переваренные и непереваренные), масляные капельки, бактерии, вирусы, гравий, галька и т.д.

Отверстие сетки ситовой деки равно диаметру воображаемой окружности, который соответствует фактическому отверстию в деке. Отверстие сетки по сути представляет собой «приблизительный» предварительно заданный размер, поскольку поверхность с многочисленными отверстиями сетки не может быть сделана с точно одинаковым размером для всех отверстий, а также подвергается изменению при механической нагрузке (груз на ситовой деке, вибрация и т.д.). Отверстие сетки представляет собой, как правило, средний эффективный приблизительный предварительно заданный размер. В данном отношении «приблизительное значение X» для размера ячеек сита означает, что на практике фактический размер отверстия может варьировать между 0,9 и 1,1 X, в частности между 0,95 и 1,05 X, и предпочтительно между 0,98 и 1,02 X.

Автоматически обозначает без вмешательства оператора. Автоматически не исключает, что операцию начинает или завершает оператор.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В первом варианте осуществления первая ситовая дека имеет отверстия сетки, более крупные, чем Dmin, и вплоть до Dmax, а вторая ситовая дека имеет отверстия сетки, приблизительно Dmin. Что касается второй ситовой деки было обнаружено, что если отверстия сетки составляют приблизительно Dmin, то любые ооцисты, имеющие наименьший размер, равный Dmin, задерживаются при прохождении деки, тогда как бактерии, вирусы, пучки белковых волокон и другие частицы, имеющие обычный размер, меньший, чем Dmin, могут проходить через деку. Данным способом можно получить фракцию ооцист, которая будет практически стерильной. Критическая ситуация может наступить, если водная фракция, подлежащая фильтрации, может иметь слишком много частиц, не являющихся ооцистами, имеющих размер несколько меньше Dmin, поскольку данные частицы, как правило, также в некоторой степени задерживались бы декой и, таким образом, могут оставаться в качестве загрязнения в осадке ооцист. Однако, данные критичные частицы, по-видимому, не присутствуют (достаточно заметно) в экскрементах животных различных видов, и таким образом, применение размера ячеек сита приблизительно Dmin, по-видимому, превосходно подходит для сохранения ооцист в осадке, поскольку более мелкие загрязняющие частицы будут проходить ситовую деку. Что касается первой ситовой деки, является очевидным, что отверстия сетки имеют предпочтительно по меньшей мере размер Dmin. Однако предпочтительный максимальный размер сам по себе не является очевидным. Размер более Dmin, но по существу менее Dmax, может быть подходящим, если, например, применяют достаточное количество дополнительной воды, чтобы попытаться и позволить ооцистам проходить ситовую деку, при этом вода функционирует в качестве смазочного вещества, и перенастроить ориентацию (несферических) ооцист по отношению к деке. Любой больший размер отверстий мог бы сделать возможным более легкое прохождение ооцист. Заявитель обнаружил, что предпочтительный максимальный размер отверстий первой ситовой деки представляет собой приблизительно Dmax. Наличие еще более крупных отверстий может привести к слишком большому количеству загрязняющих частиц, проходящих через ситовую деку вместе с ооцистами.

В еще одном варианте осуществления первая ситовая дека имеет отверстия сетки приблизительно Dmax, а вторая ситовая дека имеет отверстия сетки приблизительно Dmin. Заявитель обнаружил, что данным способом можно получить достаточно очищенную фракцию ооцист на второй ситовой деке, несмотря на то, что любая загрязняющая частица, имеющая диапазон размеров между Dmin и Dmax, также вероятно могла бы быть захвачена в осадок на второй ситовой деке.

В еще одном варианте осуществления первая ситовая дека имеет отверстия сетки приблизительно 50 мкм, а вторая ситовая дека имеет отверстия сетки приблизительно 10 мкм. Отверстия сетки данных размеров, по-видимому, идеально подходят для получения осадка высокоочищенных ооцист любого размера, даже если, например, ооцисты, подлежащие очистке, варьируют по размеру между 20-35 мкм в длину и 20-30 мкм по ширине. Размер отверстий первой ситовой деки, 50 мкм, по-видимому, является подходящим для выведения любой загрязняющей частицы на «крупную» сторону, тогда как размер отверстий второй деки, 10 мкм, по-видимому, является подходящим для выведения любой загрязняющей частицы на «мелкую» сторону. Очевидно, количество загрязняющих частиц в диапазоне от 10 мкм до 50 мкм является настолько малым, что данные частицы не приводят к недостаточно очищенным ооцистам.

В варианте осуществления вторая ситовая дека имеет форму барабана, водный фильтрат загружают внутрь данного барабана, и барабан вращается во время просеивания водного фильтрата. В данном варианте осуществления осадок может накопиться в виде тонкого слоя на внутренней стороне данного барабана. Это является преимуществом при дополнительной обработке ооцист. Предпочтительно барабан вращается с таким числом оборотов в минуту, чтобы слой перемещался со скоростью от 10 метров/минуту (м/мин) до 40 м/мин, что является скоростью вращения поверхности барабана. При скорости, ниже данной, может быть, что ооцисты в слое, в частности, при низкой относительной влажности газовой среды в барабане, становятся слишком сухими, в то время как при скорости выше 40 м/мин ооцисты могут столкнуться со слишком большим количеством механических сил и получить повреждения.

В еще одном варианте осуществления первая ситовая дека имеет форму барабана, водную фракцию загружают внутрь данного барабана, и барабан вращается во время просеивания водной фракции. В данном варианте осуществления водную фракцию можно более или менее непрерывно добавлять на первую ситовую деку, поскольку она может иметь относительно тщательно подготовленную поверхность и вращается непрерывно, позволяя фильтрату (содержащему ооцисты) легко проходить ситовую деку.

В еще одном варианте осуществления во время просеивания на ситовые деки дополнительно добавляют водную среду. Данная дополнительная вода может преимущественно служить в качестве смазочного вещества и необязательно в качестве среды для перенастройки ориентации ооцист по отношению к ситовой деке для обеспечения возможности легкого просеивания, даже если размеры отверстий приближаются к Dmin. В дополнительном варианте осуществления дополнительная водная среда имеет температуру между 19°C и 37°C. Таким образом, ооцисты уже могут начинать процесс спорулирования во время очистки от экскрементов с применением настоящего процесса просеивания. Это может быть полезным для конечного результата способа. Предпочтительно, дополнительная водная среда имеет температуру приблизительно 28°C.

Система согласно изобретению может включать признаки, чтобы сделать возможным применение одного или более из данных вариантов осуществления способа согласно изобретению. Зависимая система требует изложения данных признаков.

Теперь изобретение будет объяснено более подробно с применением следующих фигур и примеров.

ПРИМЕРЫ

Фигура 1 графически показывает систему для сбора ооцист для очистки.

Фигура 2 схематически показывает вариант осуществления системы согласно изобретению.

Фигура 3 схематически показывает вариант осуществления ситовой деки для применения в способе или системе согласно изобретению.

Фигура 4 схематически показывает другой вариант осуществления системы согласно изобретению.

Фигура 5 схематически показывает ситовую деку для применения в качестве опоры, чтобы позволить очищенным ооцистам спорулировать.

Пример 1 описывает данные обработки в отношении способа согласно изобретению.

Фигура 1

Фигура 1 графически показывает систему для сбора экскрементов животных, содержащих кокцидиальные ооцисты, от животных-хозяев, и отделение крупной фракции, содержащей макроскопические твердые частицы, от экскрементов, и сбор фракции, содержащей ооцисты, для дополнительной очистки. В целом, в данной области техники известен ряд различных способов подготовки ооцист для дополнительной очистки. Перед дополнительной очисткой можно применять любой один или комбинацию из данных способов. Предпочтительный способ изложен ниже.

Для начала, ооцисты можно собирать после того, как животные-хозяева (как правило, куры) начинают выделение микроорганизма. Наиболее часто кур держат в клетках (1) и кормят твердой пищей (2) и водой (3). Экскременты 5 собирают из клеток, а поток отходов, содержащих иной материал (перья, солому и т.д.) выбрасывают. После сбора экскременты переносят в жижесборник 6 и смешивают с добавленной водой (7). Полученный в итоге разбавленный фекальный материал доставляют в сито 9 для удаления крупнозернистого материала в экскрементах, такого как камни, остатков опилок, гравия, остатков пищи животного и т.д. Для этого сито содержит два идущих друг за другом плоских сита, верхнее сито, имеющее 2 мм отверстия сетки, и нижнее сито, имеющее 125 мкм отверстия сетки. Полученный в итоге осадок (11) выбрасывают, и фильтрат собирают в виде водной фракции 10, содержащей ооцисты.

Фигура 2

Фигура 2 схематически показывает вариант осуществления системы 20 согласно изобретению. В данном варианте осуществления система содержит продольный трубкообразный корпус 23, имеющий две внутренних ситовых деки, а именно верхнюю ситовую деку 21 и нижнюю ситовую деку 22. В данном варианте осуществления ситовые деки сделаны из переплетенной проволоки из нержавеющей стали, в соответствии с плоским шаблоном плетения. Водную фракцию 10 (см. Фигуру 1) доставляют в верхнюю часть ситовой деки 21 с целью просеивания данной фракции. Эта дека имеет такие отверстия сетки, что ооцисты проходят с получением водного фильтрата 32, содержащего ооцисты, и первого осадка 31, содержащего частицы, более крупные, чем ооцисты. Водный фильтрат 32 доставляют в верхнюю часть второй ситовой деки 22, при этом ситовая дека имеет отверстия сетки, чтобы задерживать ооцисты, проходящие через данную ситовую деку. Таким образом, получают второй осадок 40, содержащий очищенные ооцисты, и непригодный фильтрат 42, содержащий частицы, более мелкие, чем ооцисты.

Размер отверстий сетки можно выбрать для эффективного сбора ооцист необходимой формы. Например, для сбора ооцист размера, варьирующего между 15 и 25 мкм, первая ситовая дека может иметь отверстия сетки 25 мкм, а вторая ситовая дека может иметь отверстия сетки приблизительно 14 мкм. В данном случае, поскольку отверстия сетки почти точно соответствуют размеру ооцист, может потребоваться много дополнительной воды (доставляемой в виде отдельной подачи в верхнюю часть ситовой деки 21), чтобы фактически иметь ооцисты, прошедшие первую ситовую деку. В еще одной установке, например, для сбора ооцист с размером в диапазоне между 20 и 30 мкм, первая ситовая дека может иметь отверстия сетки 40 мкм, а вторая ситовая дека может иметь отверстия сетки приблизительно 15 мкм. В еще одной установке, например для сбора ооцист с размером в диапазоне между 10 и 40 мкм, первая ситовая дека может иметь отверстия сетки 42 мкм, а вторая ситовая дека может иметь отверстия сетки приблизительно 10 мкм. В еще одном варианте осуществления, например, для сбора ооцист с размером в диапазоне между 12 и 48 мкм, первая ситовая дека может иметь отверстия сетки 50 мкм, а вторая ситовая дека может иметь отверстия сетки приблизительно 10 мкм.

Фигура 3

Фигура 3 схематически показывает вариант осуществления ситовой деки 21 (отверстия сетки 50 мкм) для применения в способе или системе согласно изобретению. В данном варианте осуществления ситовая дека представляет собой кольцевую деку в форме барабана. Барабан установлен с возможностью поворота на оси 25 и внутри снабжен неподвижным контейнером 26. При применении водную фракцию загружают внутрь данного барабана под контейнером 26, и во время просеивания водной фракции барабан вращают. Также во время данного просеивающего действия в барабан 21 добавляют дополнительную водную среду, имеющую температуру приблизительно 28°C. Водный фильтрат собирают в контейнер 27. Над барабаном размещен ряд распылительных головок 28. Данные головки можно использовать для добавления воды в барабан, либо чтобы служить в качестве смазочного вещества во время просеивания, либо, после завершения просеивания, для высвобождения осадка из барабана и сбора его в контейнер 26. Этот контейнер может быть извлечен посредством его сдвигания по оси 25.

Фигура 4

Фигура 4 схематически показывает другой вариант осуществления системы 20 согласно изобретению, в котором может быть задействован вариант осуществления полунепрерывного процесса для применения способа согласно изобретению. Данная система содержит вращающееся сито 91 (имеющее 150 мкм отверстия сетки), которое окружает корпус 9. Данное сито и корпус соответствуют позиции 9 на Фигуре 1. Для отделения крупной фракции, содержащей макроскопические твердые частицы, от разбавленных экскрементов в данное сито 91 подают водную фракцию 8, содержащую разбавленные куриные экскременты (см. Фигуру 1, хотя данная фракция необязательно предварительно просеяна через 2 мм сито. Водную фракцию 10, содержащую ооцисты, собирают и подают в барабанообразное вращающееся сито 21' (см. также Фигуру 3), которое находится в корпусе 23'. Как описано в связи с Фигурой 3, данная ситовая дека имеет отверстия сетки 50 мкм и отделяет водную фракцию в водном фильтрате 11, содержащую ооцисты, и первый осадок (не показано), содержащий частицы, более крупные, чем ооцисты. Данный осадок можно удалить, как описано в данной заявке выше.

Водный фильтрат 11 поступает во вращающееся сито 22', при этом данное сито помещено в корпусе 23ʺ. Данное сито 22' имеет отверстия сетки 10 мкм для задерживания ооцист, проходящих через данную ситовую деку, так что осадок, содержащий очищенные ооцисты, собирается на внутренней стороне данной барабанообразной ситовой деки 22'. Непригодный фильтрат 12 содержит частицы меньшие, чем ооцисты, например, любые бактерии.

Фигура 5

Фигура 5 схематически показывает ситовую деку для применения в качестве опоры, чтобы позволить очищенным ооцистам спорулировать. В данном варианте осуществления осадок 40 собирается в виде 2,5-3,5 мм слоя на внутренней стороне ситовой деки 22 (имеющей отверстия сетки 10 мкм). Барабанообразную ситовую деку 22 частично помещают в объеме воды (50; хранят при температуре 28°C) и частично в газообразной окружающей среде 60, так что приблизительно 20% общей окружности барабана находится ниже уровня объема воды. Барабан устанавливают его продольной осью 25, простирающейся параллельно поверхности данного объема воды. Во время споруляции барабан вращается для непрерывного удерживания слоя 40 в кислородсодержащей газообразной окружающей среде 60. Барабан вращается через воду 50' при 10-12 оборотов в минуту. Относительная влажность газообразной окружающей среды в барабане составляет 100%. Было обнаружено, что таким образом ооцисты могут спорулировать (почти все) в пределах 48 часов.

Пример 1

Пример 1 описывает данные обработки в отношении способа согласно изобретению с применением системы Фигуры 4. В данной системе применяют небольшие барабанообразные деки, имеющие длину 40 см и диаметр барабана 80 см (в установке Фигуры 4 могут преимущественно использоваться барабаны, имеющие длину вплоть до 2,80 метров и диаметр вплоть до 2,0 метров). Деки имеют сетки из проволоки из нержавеющей стали, переплетенной в соответствии с плоским шаблоном плетения, с отверстиями сетки, как описано в связи с Фигурой 4. Барабаны вращаются с 10-12 оборотов в минуту.

Экскременты 60 кур белых леггорнов (инфицированных Eimeria) в возрасте 26-31 дней собирали (приблизительно 25 грамм экскрементов на курицу в день), смешивали с 200 литрами воды и отделяли крупную фракцию с применением 2 мм сита. Приблизительно 50 литров данной смеси (содержащей приблизительно 2,25 кг экскрементов) загрузили в систему, в которой во время просеивания в ситовые деки 21 и 22 добавляли приблизительно 5-10 литров воды в минуту. В результате этого после 35 минут просеивания на ситовой деке 22 получили приблизительно 120 грамм очищенных ооцист (композиции, содержащей установленное количество, составившее приблизительно 85 грамм фекальных частиц, не являющихся ооцистами, как правило, мелкие зерна песка, частицы ила и глины, и приблизительно 35 грамм ооцист), при расчетном выходе, составившем приблизительно 81% для Eimeria acervulina и приблизительно 100% для Eimeria maxima. С применением традиционного способа флотации и центрифугирования это занимает приблизительно 6 часов с обычным выходом, составляющим приблизительно 50-60% для обоих видов.

Необязательно, в зависимости от все еще имеющейся степени загрязнения, можно провести этап дополнительной промывки посредством смешивания осадка с 6% раствором гипохлорита (противоинфекционным) и его загрузки в барабан 22. Для удаления гипохлорита непрерывно добавляют воду, приблизительно 5-10 литров в минуту, и после 15 минут осадок готов для дополнительной обработки.

После споруляции, как описано в связи с Фигурой 5, обычная скорость споруляции составляет 85% для Eimeria acervulina и 90% для Eimeria maxima (сравнить с обычными значениями, составляющими от 40% до максиммум 80% для традиционного процесса с применением дихромата калия). Данные спорулированные ооцисты могут служить в качестве антигена в кокцидиозной вакцине, как известно из предшествующего уровня изобретения.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ и система для очистки кокцидиальных ооцист, а также композиция очищенных кокцидиальных ооцист. Система включает первую ситовую деку с позволяющими ооцистам проходить в фильтрат и задерживать более крупные частицы отверстиями, средство для автоматической загрузки фильтрата внутрь второй ситовой деки, а также вторую ситовую деку с позволяющими задерживать ооцисты и проходить более мелким частицам отверстиями. Способ включает этапы сбора содержащих кокцидиальные ооцисты экскрементов, разбавление экскрементов в водной среде, просеивание водной фракции через первую деку для получения фильтрата, просеивание водного фильтрата через вторую деку для получения содержащего очищенные ооцисты осадка, где второй осадок подходит для применения в вакцине. Изобретения обеспечивают очищение большей части жизнеспособных и способных к споруляции ооцист, не имеющей остатков солей и других веществ. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 пр.

1. Способ очистки кокцидиальных ооцист, имеющих размеры между Dmin и Dmax, из экскрементов, включающий этапы сбора экскрементов (5), содержащих кокцидиальные ооцисты, от животных-хозяев, разбавление экскрементов в водной среде (7), необязательно отделение крупной фракции (11), содержащей макроскопические твердые частицы, от разбавленных экскрементов и сбор водной фракции (10), содержащей ооцисты, отличающийся тем, что способ дополнительно включает

- просеивание водной фракции через первую ситовую деку (21), имеющую отверстия сетки, позволяющие проходить ооцистам, для получения водного фильтрата (11, 32), содержащего ооцисты, и первого осадка (31), содержащего частицы более крупные, чем ооцисты,

- просеивание водного фильтрата через вторую ситовую деку (22), имеющую отверстия сетки, чтобы задерживать ооцисты, проходящие через данную ситовую деку, для получения второго осадка (40), содержащего очищенные ооцисты, и непригодный фильтрат (12, 42), содержащий частицы более мелкие, чем ооцисты,

где второй осадок подходит для применения в вакцине.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первая ситовая дека имеет отверстия сетки более крупные, чем Dmin и вплоть до Dmax, а вторая ситовая дека имеет отверстия сетки примерно Dmin.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что первая ситовая дека имеет отверстия сетки приблизительно Dmax и вторая ситовая дека имеет отверстия сетки примерно Dmin.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что первая ситовая дека имеет отверстия сетки приблизительно 50 мкм, а вторая ситовая дека имеет отверстия сетки примерно 10 мкм.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что вторая ситовая дека имеет форму барабана, водный фильтрат загружают внутрь данного барабана и барабан вращается во время просеивания водного фильтрата.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что первая ситовая дека имеет форму барабана, водную фракцию загружают внутрь данного барабана и барабан вращается во время просеивания водной фракции.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что во время просеивания в ситовые деки добавляют дополнительную водную среду.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что дополнительная водная среда имеет температуру между 19°C и 37°C.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что дополнительная водная среда имеет температуру примерно 28°C.

10. Система (20), пригодная для очистки кокцидиальных ооцист, имеющих размеры между Dmin и Dmax, из экскрементов, или их мелкой фракции, при этом система включает:

- первую имеющую кольцевую форму ситовую деку (21'), имеющую отверстия сетки, подходящие, чтобы позволить ооцистам проходить ситовую деку в фильтрате (11), и задерживать частицы более крупные, чем ооцисты,

- средство для автоматической загрузки фильтрата внутрь второй имеющей кольцевую форму ситовой деки (22'),

- вторую ситовую деку, имеющую отверстия сетки, чтобы задерживать ооцисты, проходящие через данную ситовую деку и позволять проходить частицам более мелким, чем ооцисты.

11. Система по п. 10, отличающаяся тем, что ситовые деки имеют форму барабана.

12. Система по любому из пп. 10 и 11, отличающаяся тем, что первая ситовая дека имеет отверстия сетки более крупные, чем Dmin и вплоть до Dmax, а вторая ситовая дека имеет отверстия сетки примерно Dmin.

13. Система по любому из пп. 10-12, отличающаяся тем, что первая ситовая дека имеет отверстия сетки примерно Dmax, а вторая ситовая дека имеет отверстия сетки примерно Dmin.

14. Система по любому из пп. 10-13, отличающаяся тем, что первая ситовая дека имеет отверстия сетки примерно 50 мкм, а вторая ситовая дека имеет отверстия сетки примерно 10 мкм.

15. Композиция очищенных кокцидиальных ооцист для применения в вакцине, где очищенные кокцидиальные ооцисты получают по любому из способов по пп. 1-9, в которой кокцидиальные ооцисты имеют размеры между Dmin и Dmax, отличающаяся тем, что композиция содержит органическую частицу, присутствующую в экскрементах животного, имеющую размер между Dmin и Dmax, и при этом плотность частицы отличается от плотности ооцист.

16. Композиция очищенных кокцидиальных ооцист по п. 15, отличающаяся тем, что частица имеет размер между 10 мкм и 50 мкм.