СПОСОБ СПОРУЛЯЦИИ КОКЦИДИАЛЬНЫХ ООЦИСТ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЭКСКРЕМЕНТОВ ЖИВОТНЫХ, СПОРУЛИРОВАННЫЕ ООЦИСТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ЭТИМ СПОСОБОМ, И ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ ЭТИ СПОРУЛИРОВАННЫЕ ООЦИСТЫ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/10 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способу споруляции кокцидиальных ооцист, выделенных из экскрементов животных. Изобретение также относится к спорулированным ооцистам, полученным этим способом, и вакцине, содержащей такие спорулированные ооцисты.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Кокцидиоз является заболеванием различных животных, при котором слизистая оболочка кишечника подвергается инвазии и повреждается простейшими подкласса Coccidia. Экономические эффекты кокцидиоза могут являться особенно тяжелыми в птицеводстве, где интенсивное содержание птиц способствует распространению заболевания. Инфекция кокцидиальными простейшими, преимущественно, является видоспецифической. Однако многочисленные виды могут инфицировать одного хозяина. Например, существует семь видов кокцидиальных простейших, инфицирующих кур, шесть из которых считают имеющими патогенность от умеренной до тяжелой.

Жизненный цикл кокцидиального паразита является сложным. Например, простейшим родов Eimeria, Isospora, Cystoisospora или Cryptosporidium, как правило, необходим лишь один хозяин для завершения их жизненного цикла, хотя Cystoisospora могут использовать промежуточного хозяина. В природных условиях жизненный цикл начинается с поглощения спорулированных ооцист из окружающей среды. Ооцисты, как правило, имеют форму от яйцевидной до эллипсоидной, находятся в диапазоне 10-48 мкм в длину и 10-30 мкм в ширину и могут содержать специализированные структуры, такие как полярные шапочки, микропили, остаточные и кристаллические тельца. Когда восприимчивое животное поглощает спорулированные ооцисты, стенка спорулированной ооцисты разрушается для высвобождения спороцист. У домашней птицы высвобождение спороцисты является результатом механического разрушения спорулированной ооцисты в мускульном желудке. Внутри спороцист находятся спорозоиты, являющиеся инфекционной стадией организма. У домашней птицы разрушение оболочки спороцисты и высвобождение спорозоитов биохимически осуществляется под действием химотрипсина и солей желчных кислот в тонком кишечнике. После высвобождения спорозоиты осуществляют инвазию в слизистую оболочку кишечника или эпителиальные клетки в других местах. Участок инфекции является характерным для участвующих видов. Например, в роде Eimeria E. tenella локализована в слепой кишке; E. necatrix обнаруживают в передних и средних отделах тонкого кишечника; E. acervulina и E. praecox находятся в верхней половине тонкого кишечника; E. brunetti встречается в нижнем отделе тонкого кишечника, прямой кишке, слепой кишке и клоаке; E. mitis обнаруживают в нижних отделах тонкого кишечника, в то время как E. maxima можно найти в любом из этих физиологических мест.

После проникновения внутрь клеток животных-хозяев спорозоиты развиваются в многоядерные меронты, также называемые шизонтами. Каждое ядро меронта развивается в инфекционное тельце, называемое мерозоитом, проникающее в новые клетки и повторяющее процесс. После различного количества бесполых поколений мерозоиты развиваются в микрогаметоциты или макрогаметы. Микрогаметоциты развиваются во множество микрогамет, в свою очередь, оплодотворяющих макрогаметы. Затем вокруг образовавшихся зигот образуется устойчивая оболочка. Инцистированные зиготы называют ооцистами, и они неспорулированными попадают в экскременты. Инфицированные птицы могут распространять ооцисты в экскрементах в течение дней или недель. В подходящих условиях температуры и влажности ооцисты становятся инфективными посредством процесса споруляции. Затем восприимчивые птицы поглощают спорулированные ооцисты при обычном клевании или собирании грунта/подстилки, и цикл повторяется. Поглощение жизнеспособных, спорулированных ооцист является единственным природным средством инфицирования. Инфицирование кокцидиальными простейшими приводит к иммунитету таким образом, что частота заболевания снижается с течением времени, т.к. члены стада становятся иммунными. Эта самоограничивающая природа кокцидиальных инфекций широко известна у кур и другой домашней птицы. Однако придаваемый иммунитет является видоспецифическим таким образом, что поступление других видов кокцидиальных простейших будет приводить к вспышке нового заболевания.

Стенка ооцисты кокцидиальных простейших представляет собой высокоэффективный барьер для выживания ооцисты. Ооцисты могут выживать в течение многих недель вне хозяина. В лабораторных условиях интактные ооцисты устойчивы к экстремальному pH, детергентам, протеолитическим, гликолитическим и липолитическим ферментам, механическому разрушению и химическим веществам, таким как гипохлорит и дихромат натрия.

В настоящее время используют два способа контроля кокцидиоза у домашней птицы. Первый из них включает контроль посредством химиотерапии. Доступно множество лекарственных средств для контроля кокцидиоза у домашней птицы. Из-за количества видов, вызывающих заболевание, очень малое количество лекарственных средств является эффективным против всех видов, хотя одно лекарственное средство может является эффективным против нескольких видов. В современном производстве бройлерных кур, например, общепринятым является введение лекарственных средств для контроля кокцидиоза. Стоимость профилактических лекарственных средств против кокцидиоза представляет собой значительные издержки производства.

Вакцинация птиц от кокцидиоза является альтернативой химиотерапии. Преимущество вакцинации состоит в том, что она может значительно снижать или устранять необходимость введения противококцидиальных лекарственных средств, таким образом, снижая затраты на лекарственные средства для птицеводов, предотвращая развитие устойчивых к лекарственным средствам штаммов и снижая беспокойство потребителей в отношении остатков лекарственных средств. Разработано множество способов иммунизации домашней птицы против кокцидиальных простейших. Все успешные способы основаны на введении живых простейших, как полностью вирулентных штаммов, так и аттенуированных штаммов. Наиболее распространенным путем введения является пероральный путь, хотя используют и другие пути. Как правило, кур вакцинируют посредством перорального введения непосредственно через рот или с помощью корма или воды с жизнеспособными спорулированными ооцистами.

Независимо от пути введения, способы получения вакцин против кокцидиоза являются достаточно схожими. В кратком изложении, кокцидиальных простейших получают посредством инфицирования животных-хозяев одним видом кокцидиальных простейших. Этот "семенной фонд" часто является клональным по своей природе, т.е. его получают из одного организма для обеспечения наличия только интересующего вида. Семенной фонд может представлять собой дикий тип, т.е. его выделяют из окружающей среды, или он может являться ранним или аттенуированным штаммом. Затем простейшим позволяют подвергаться размножению в хозяине, после чего простейших собирают из животных, как правило, из экскрементов. Использование аттенуированных штаммов, как правило, приводит к меньшему выделению ооцист из животных-хозяев. На первом этапе способа очистки, при необходимости, крупную фракцию, содержащую макроскопические твердые частицы отделяют от разбавленных экскрементов. Затем простейших отделяют от разбавленных экскрементов хорошо известными способами, такими как флотация солей и центрифугирование (для обеспечения того, что с ооцистами не выделят твердые частицы, имеющие плотность, отличающуюся более чем на 10% от плотности ооцист). На момент сбора простейшие находятся на стадии жизненного цикла неинфективной ооцисты. Чтобы они стали инфективными и, таким образом, применимыми для вакцин, ооцисты необходимо индуцировать для осуществления споруляции. У членов рода Eimeria споруляция, как правило, включает инкубацию ооцисты в 1-4% водном растворе дихромата калия при 19-37°C, предпочтительно, приблизительно 28°C (т.е. от 27,5 до 28,5°C) с постоянной аэрацией. Споруляция, как правило, завершается в течение от 12 до 48 часов в зависимости от используемой температуры, и типичный выход составляет 40-60% (означая, что 40-60% исходно присутствующих жизнеспособных ооцист являются спорулированными). Мониторинг процесса споруляции осуществляют посредством микроскопического исследования простейших. Композиции для хранения, обнаруживаемые на современном уровне техники, как правило, включают водный раствор дихромата калия. Спорулированные ооцисты, как правило, хранят в 1-4% водном растворе дихромата калия для предотвращения роста бактерий, однако, используют другие среды для хранения.

Существующие в настоящее время вакцины, доступные для предотвращения кокцидиоза, как правило, содержат 2,5% масс./об. раствора и приблизительно 1600 ооцист на дозу (400 спорулированных ооцист, представляющих четыре разные вида). Существующие в настоящее время коммерчески доступные вакцины содержат приблизительно от 0,016 мкг дихромата калия на ооцисту до приблизительно 0,16 мкг дихромата калия на ооцисту. Хотя дихромат калия широко используют для споруляции и хранения, он имеет несколько свойств, делающих его элиминацию из биологических препаратов крайне желательной. Дихромат калия является сильным окислителем и, как сообщают, влияет на дыхательную систему, печень, почки, глаза, кожу и кровь. Он является известным канцерогеном, и при утилизации его рассматривают как опасные отходы. Из-за его высокой токсичности, соединения, содержащие дихромат калия, являются особенно неподходящими для парентерального введения. Таким образом, особенно предпочтительным может являться устранение дихромата калия из получения и хранения материалов, подлежащих введению животным, особенно, животным, употребляемым в пищу.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью изобретения является разработка способа споруляции кокцидиальных ооцист, по меньшей мере, уменьшающего недостатки способов, известных на современном уровне техники, в частности, для получения способа, не зависящего от наличия дихромата калия, но посредством которого можно достигать высокого выхода споруляции, предпочтительно - выше 60%, более предпочтительно - даже выше 80%. Кроме того, целью изобретения является получение вакцины, содержащей спорулированные ооцисты, но не дихромат калия.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для удовлетворения цели изобретения разрабатывали способ, соответствующий разделу ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ, где способ дополнительно включает предоставление очищенных ооцист в виде слоя на поверхности подложки, посредством поддержания слоя, по меньшей мере периодически в кислородосодержащей газовой среде, имеющей относительную влажность по меньшей мере 15%, и поддержания температуры ооцист от 19°C до 37°C.

В способах, известных из уровня техники, споруляция включает инкубацию ооцист в водном растворе дихромата калия с постоянной аэрацией. Таким образом, обеспечивают необходимое содержание воды, кислорода и достаточную температуру, необходимую для осуществления споруляции. Однако авторы настоящего изобретения обнаруживали, что лучше держать ооцисты, по меньшей мере периодически, в газовой среде, а не в водной среде, как рекомендуют на современном уровне техники. Обнаруживали, что в этом случае не нужен дихромат калия, при условии, что ооцисты поддерживают достаточно влажными (выше 15%, как известно из Waldenstedt et al, 2001 Poultry science 80:1412-1415) и температуру поддерживают на соответствующем уровне. Кроме того, выход споруляции можно значительно повышать до уровней 80-100%. Причина этого не совсем ясна, но может быть частично связана с тем, что в водной среде во флаконе, даже при непрерывной аэрации, все равно существует значительное количество "мертвого" пространства, где аэрация является недостаточной. Кроме того, непрерывная аэрация приводит к непрерывному значительному вращению ооцист во флаконе, что приводит к непрерывной механической нагрузке на ооцисты. Это может объяснять утрату части жизнеспособных ооцист. Кроме того, возможно, в аэрированном водном растворе уровень доступного кислорода все равно является слишком низким, чтобы способствовать споруляции значительной части ооцист.

В любом случае, авторы настоящего изобретения обнаруживали, что, подвергая ооцисты воздействию газовой среды, когда они находятся в форме слоя на поверхности подложки, можно достигать очень хорошего споруляции без потребности в каком-либо дихромате калия, при условии, что ооцисты являются достаточно влажными, и поддерживают температуру ооцист от 19°C до 37°C. Температура может иметь любое значение от 19 до 37°C, т.е. 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36°C или любое значение между этими температурами. Что касается влажности, хотя уровень относительной влажности 15% может являться достаточным для поддержания споруляции, более высокий уровень является предпочтительным, посредством чего снижают риск высушивания ооцист в слое. Таким образом, уровень относительной влажности газовой среды может иметь любое из следующих значений (% относительной влажности) до и включая 100%: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99. При относительной влажности 100% на слое ооцист будет образовываться тонка водяная пленка. Авторы настоящего изобретения обнаруживали, что такой тонкий слой не обладает неблагоприятным эффектом в отношении процесса споруляции при условии, что можно поддерживать транспорт газов (например, кислорода, потребляемого ооцистами, и образующихся газов, продуцируемых ооцистами) посредством диффузии посредством использования и/или продукции газа ооцистами. Таким образом, такой тонкий слой воды все равно означает, что, по существу, слой ооцист можно считать находящимся в газовой среде в значении настоящего изобретения.

По изобретению можно получать спорулированные ооцисты с достаточным выходом, где спорулированные ооцисты не содержат остатки дихромата калия, и, таким образом, вакцина на основе таких ооцист также не содержит эту соль.

Изобретение также относится к композиции, содержащей спорулированные кокцидиальные ооцисты, получаемые с использованием способа двойной фильтрации, как описано выше, кокцидиальным ооцистам, имеющим размеры от Dmin до Dmax, где композиция содержит частицы, имеющие размеры от Dmin до Dmax, имеющие плотность, отличающуюся от плотности ооцист.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Композиция ооцист, выделенных из экскрементов, означает, что из экскрементов удаляют по меньшей мере 90%, в частности, 91, 92, 93, 94, 95% или более неооцистного материала, где ооцисты экскретировались.

Макроскопический объект является объектом, который можно увидеть невооруженным взглядом. Как правило, это означает, что объект имеет размер по меньшей мере приблизительно 0,1 мм.

Частица является микроскопическим или макроскопическим объектом, которому можно приписывать физические свойства, такие как объем и масса. Типичными частицами, присутствующими в экскрементах животных, являются зерна песка, алевритовые частицы, глинистые частицы, остатки растений (переваренные и непереваренные), капли масла, бактерии, вирусы, зерна, галька и т.д.

Размер отверстия ситового яруса равен диаметру воображаемой окружности, соответствующей фактическому отверстию ситового яруса. Размер отверстия, по существу, является "приблизительным" заранее определенным размером, т.к. нельзя получать поверхность с многочисленными размерами отверстий с точно одинаковым размером для всех отверстий, и также подвержен колебаниям при механических нагрузках (массе на ситовом ярусе, вибрации и т.д.). Размер отверстия, как правило, является фактическим средним приблизительным заранее определенным размером. В связи с этим, "приблизительное значение X" для размера отверстия означает, что на практике точный размер отверстия может варьироваться от 0,9 до 1,1 X, в частности, от 0,95 до 1,05 X, и предпочтительно - от 0,98 до 1,02 X.

Случай, если объект расширяется в направлении, означает, что объект, по меньшей мере частично, расширяется в том направлении, предпочтительно, по существу, расширяется в том направлении, т.е. объект расширяется в том направлении больше, чем в любом другом направлении.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В первом варианте осуществления способа по изобретению толщина слоя составляет менее 10 мм. Авторы настоящего изобретения обнаруживали, что если толщина слоя, главным образом, равна регулярному максимальному поперечному размеру обычных экскрементов курицы, составляющему приблизительно 10 мм, значительная часть ооцист, если не почти все, может спорулировать. Авторы настоящего изобретения обнаруживали, что размер обычных экскрементов курицы является таким, что даже ооцисты на дне экскрементов могут спорулировать в газовой среде, в которой они находятся (т.е. в обычных условиях содержания кур). Другими словами, слой толщиной приблизительно 10 мм может делать возможной диффузию кислорода таким образом, что значительная часть ооцист может спорулировать. Толщина может составлять даже менее 9 мм, 8 мм, 7 мм, 6 мм, 5 мм, 4 мм, 3 мм, 2 мм или 1 мм. Как правило, толщина слоя составляет от 0,5 до 5 мм.

В другом варианте осуществления поверхность подложки является перфорированным ярусом, способным пропускать воду. В этом варианте осуществления слой ооцист можно поддерживать влажным, снабжая слой водой (например, в форме водяной пыли, душа, спрея, струи и т.д.) но все равно, т.к. вода может проходить через слой через перфорированный ярус, слой, по существу, можно оставлять в газовой среде по изобретению. В дополнительном варианте осуществления поверхность подложки имеет размеры отверстий, приблизительно равные минимальному размеру (Dmin) ооцист. Обнаруживали, что, если размеры отверстий приблизительно равны Dmin, любые ооцисты, имеющие наименьший размер Dmin, застревают при прохождении перфорированного яруса, в то время как бактерии, вирусы, белковые хлопья и другие частицы, имеющие типичный размер, меньший, чем Dmin, могут проходить через ярус вместе с водой. Это обеспечивает дополнительный этап очистки ооцист при одновременной споруляции. В способах, существующих на современном уровне техники, любые бактерии и вирусы остаются во флаконе с ооцистами. Однако, по существу, может возникать критическая ситуация, если водная фракция, подлежащая фильтрации, будет содержать слишком много неооцистных частицы, имеющих размер немного меньше Dmin, т.к. такие частицы, как правило, также будут до некоторой степени застревать и, таким образом, могут оставаться в виде загрязнений в слое ооцист. Однако, такие критические частицы, по-видимому, (умеренно заметно) не присутствуют в экскрементах животных, и таким образом, использование размера отверстия приблизительно Dmin, по-видимому, идеально подходит для поддержания ооцист на поверхности подложки, в то время как частицы загрязнений меньшего размера будут проходить чрез эту перфорированную поверхность. В дополнительном варианте осуществления изобретения поверхность подложки имеет размеры отверстий приблизительно 10 мкм. Отверстия этого размера, по-видимому, идеально подходят для поддержания слоя ооцист любого размера, даже если, например, диапазон ооцист, подлежащих очистке, составляет 20-35 мкм в длину и 20-30 мкм в ширину. Размер отверстий, т.е. 10 мкм, по-видимому, подходит для поддержания ооцист различного размера на поверхности подложки, и все равно любые "мелкие материалы" (как правило, бактерии, вирусы или другие микроорганизмы) меньше 10 мкм можно вымывать с использованием воды для промывания слоя.

В варианте осуществления поверхность подложки находится в форме непрерывного перфорированного яруса. В этом варианте осуществления слой можно располагать внутри или вне яруса. Это позволяет относительно большой поверхности быть доступной для поддержания слоя, в то же время площадь основания остается относительно низкой. В дополнительном варианте осуществления перфорированный ярус имеет форму цилиндра. Таким образом, легко можно обеспечивать равномерное распределение ооцист в слое для обеспечения сравнимых условий на всем протяжении слоя. В дополнительном варианте осуществления изобретения непрерывный ярус размещают частично в объеме воды и частично в газовой среде таким образом, что его продольная ось установлена параллельно поверхности этого объема воды, и где ярус вращают для поддержания слоя, по меньшей мере, периодически в кислородосодержащей газовой среде. Таким образом, ооцисты в слое можно поддерживать при высоком уровне влажности до 100%, даже если газовая среда является относительно сухой, просто из-за того, что ооцисты периодически проходят через объем воды. Это кажется очень простым, но походящим способом обеспечения двух основных требований для настоящего изобретения: поддержания ооцист, по меньшей мере, периодически в газовой среде и предотвращения их высушивания. При вращении цилиндра ооцисты в слое вращают частично в верхней части цилиндра, находящейся в газовой среде, и частично в нижней части цилиндра, находящейся в водной среде. Расположение непрерывного яруса в объеме воды, как правило, является таким, что, по большей мере, половину внутреннего пространства непрерывного яруса погружают в воду, или даже лишь 5-30% или 5-20%. Предпочтительно, цилиндр вращают при таких об./мин., что слой движется со скоростью от 10 метров/минуту (м/мин) до 40 м/мин, что представляет собой скорость вращения цилиндра. При более низкой скорости ооцисты в слое при низкой относительной влажности газовой среды могут становиться слишком сухими, в то время как при скорости выше 40 м/мин на ооцисты может действовать слишком высокие механические силы, и они могут повреждаться. В случае цилиндра, имеющего диаметр 80 см, соответствующий уровень об./мин. составляет 5-20 об./мин. Соответствующая скорость вращения, по-видимому, идеально подходит, в частности, при комбинировании с уровнем погружения 5-30% (как указано выше) для обеспечения подходящей длительности пребывания слоя в газовой среде и одновременного предотвращения того, чтобы слой становился слишком сухим, на всем протяжении диапазона предусмотренной относительной влажности для газовой среды.

В варианте осуществления слой ооцист располагается на внутренней поверхности непрерывного яруса. Этот вариант осуществления упрощает поддержание ооцист на поверхности подложки. Хотя в результате вращения слоя через объем воды, по меньшей мере, часть ооцист в слое может покидать слой и в течение периода времени оставаться в объеме воды, в конечном итоге их снова подбирает вращающийся ярус.

В другом варианте осуществления объем воды поддерживают при температуре от 19°C до 37°C. В этом варианте осуществления воду используют для поддержания температуры ооцист на подходящем уровне для поддержания споруляции. Предпочтительно, объем воды поддерживают при температуре приблизительно 28°C, являющейся идеальной температурой для поддержания споруляции.

В другом варианте осуществления после споруляции ооцист к слою добавляют дополнительную водную среду, содержащую противоинфекционное средство, после чего слой промывают для удаления противоинфекционного средства. В этом варианте осуществления можно удалять оставшиеся загрязнения, в то время как слой остается интактным. На современном уровне техники также описывают промывание спорулированных ооцист противоинфекционным средством, но в этом случае ооцисты необходимо вынимать из флакона для споруляции и обрабатывать посредством отдельного промывания.

В еще одном варианте осуществления, где поверхность подложки является ситовым ярусом, имеющим эффективный размер отверстия, приблизительно равный минимальному размеру ооцист (Dmin), тонкий слой получают посредством сбора экскрементов животных, содержащих кокцидиальные ооцисты, разбавляя экскременты в водной среде и отделяя крупную фракцию, содержащую макроскопические твердые частицы от разбавленных экскрементов, и собирая водную фракцию, содержащую ооцисты, просеивая водную фракцию через первый ситовой ярус, иной, чем указанная поверхность подложки, где первый ситовой ярус имеет размеры отверстий, пропускающие ооцисты, для получения водного фильтрата, содержащего ооцисты и остаток на первом ситовом ярусе, содержащем частицы, более крупные, чем ооцисты, а затем просеивая водный фильтрат через указанную поверхность подложки. Авторы настоящего изобретения обнаруживали, что, используя простой двухэтапный способ просеивания, можно очищать ооцисты до подходящего уровня из водной фракции экскрементов. На первом этапе просеивания можно удалять частицы, более крупные, чем ооцисты (как правило, зерна песка, зерна и остатки растений), в то время как на втором этапе просеивания можно удалять частицы, меньшие, чем ооцисты (как правило, бактерии, вирусы, переваренные остатки растений, белковые хлопья, капли масла и т.д.). Просеивание можно осуществлять (полу-) непрерывно, и количество воды, присутствующей в водной фракции относительно количества ооцист, не связано с каким-либо экономическим максимумом: вода, в конечном итоге, проходит через второй ситовой ярус, в то время как очищенные ооцисты остаются в виде остатка тонкого слоя на этом ярусе. Таким образом, воду можно эффективно использовать для достижения соответствующего просеивания и очистки.

В этой области просеивание никогда не использовали или даже не предлагали в качестве способа очистки кокцидиальных ооцист из экскрементов. Хотя просеивание используют для удаления крупной фракции из экскрементов, его никогда не использовали для получения очищенных ооцисты. Не будучи связанными какой-либо теорией, полагают, что, по-видимому, существует несколько причин этого. Во-первых, все общепринятые способы, используемые для очистки ооцист, основаны на использовании конкретной плотности ооцист, т.к. следует понимать, что в экскрементах нет других значительных фракций, имеющих ту же плотность, что и ооцисты (т.е. имеющих плотность в диапазоне плотности, отличающейся по большей мере на 10%, или даже по большей мере 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или даже всего на 1% от плотности ооцист). Таким образом, с помощью таких способов можно получать достаточно чистую композицию ооцист. С помощью просеивания нельзя отделять частицы, имеющие различные плотности, а только частицы, имеющие различные размеры. По существу, это приводит к тому, что при использовании просеивания в качестве дополнительного загрязнения во фракции ооцист включают другие частицы в том же диапазоне размеров, что и ооцисты, но имеющие другую плотность. Таким образом, обычно предполагают, что, используя просеивание, ооцисты нельзя очищать до подходящего уровня. Кроме того, ооцисты не являются полностью сферическими, а, как правило, имеют форму от яйцевидной до эллипсоидной. Просеивание несферических частиц имеет характерную проблему, состоящую в том, что просеивание зависит от ориентации частицы, учитываемой в отношении ситового яруса. Т.к. эту ориентацию нельзя контролировать, просеивание часто не рассматривают в качестве целесообразного решения для точного фракционирования несферических частиц. В заключение, просеивание часто приводит к высокой механической нагрузке на частицы, подвергаемые просеиванию, в частности, если размер отверстия находится в том же диапазоне размера частиц. В случае биологических веществ, такая высокая механическая нагрузка часто является неблагоприятной для их жизнеспособности (ср., общеупотребительный способ с использованием френч-пресса для уничтожения бактерий). Неожиданно для авторов настоящего изобретения, ничего из этого не мешает просеиванию быть хорошим способом очистки кокцидиальных ооцист из экскрементов и достижения чистоты, подходящей для использования ооцист в эффективной вакцине.

Далее изобретение описывают с учетом следующих фигур и примеров.

ПРИМЕРЫ

На фигуре 1 схематически показана система для сбора ооцист для споруляции.

На фигуре 2 схематически показан вариант осуществления системы по изобретению.

На фигуре 3 схематически показан вариант осуществления ситового яруса для применения в способе или системе по изобретению.

На фигуре 4 схематически показан другой вариант осуществления системы по изобретению.

На фигуре 5 схематически показан ситовой ярус для применения в качестве подложки, чтобы позволить очищенным ооцистам спорулировать.

В примере 1 описывают данные о способе, касающиеся способа по изобретению.

Фигура 1

На фигуре 1 схематически показана система для сбора экскрементов животных, содержащих кокцидиальные ооцисты, от животных-хозяев, и разделения крупной фракции, содержащей макроскопические твердые частицы из экскрементов, и сбора фракции, содержащей ооцисты, для дальнейшей очистки. В целом, в этой области известен ряд различных способов получения ооцист для дальнейшей очистки. Перед дальнейшей очисткой можно использовать любой или комбинацию таких способов. Предпочтительный способ описан ниже.

Сначала, после того как животные-хозяева (как правило, куры) начинают выделять организм, можно собирать ооцисты. Чаще всего кур держат в клетках (1) и кормят твердой пищей (2) и водой (3). Экскременты (5) собирают из клеток и выбрасывают поток отходов, содержащих другой материал (перья, солому и т.д.). После сбора экскременты переливают в отстойник (6) и смешивают с добавленной водой (7). Полученные разбавленные экскременты помещают на сито (9) для удаления крупного материала в экскрементах, такого как камни, остатки опилок, сетка, остатки корма для животных и т.д. В этом случае сито содержит две последовательные ситчатые пластинки, вышележащее сито имеет размеры отверстий 2 мм, и нижележащее сито имеет размеры отверстий 125 мкм. Полученные остатки (11) выбрасывают и собирают фильтрат в качестве водной фракции (10), содержащей ооцисты.

Фигура 2

На фигуре 2 схематически показан вариант осуществления системы (20) по изобретению. В этом варианте осуществления система содержит продольный бак трубчатой формы (23), имеющий два внутренних ситовых яруса, а именно вышележащий ситовой ярус (21) и нижележащий ситовой ярус (22). В этом варианте осуществления ситовые ярусы сделаны из плетеной проволоки из нержавеющей стали, соответствующей гладкому ткацкому переплетению. Водную фракцию (10) (см. фигуру 1) помещают сверху ситового яруса (21) для просеивания этой фракции. Этот ярус имеет такие размеры отверстий, что они пропускают ооцисты для получения водного фильтрата (32), содержащего ооцисты, и первого остатка (31), содержащего частицы, более крупные, чем ооцисты. Водный фильтрат (32) помещают сверху второго ситового яруса (22), имеющего размеры отверстий, задерживающие проходящие ооцисты через этот ситовой ярус. Таким образом, получают второй остаток (40), содержащий очищенные ооцисты, и фильтрат отходов (42), содержащий частицы, меньшие, чем ооцисты.

Размеры отверстий необходимо выбирать для эффективного сбора ооцист желаемой формы. Например, для сбора ооцист с диапазоном размеров от 15 до 25 мкм первый ситовой ярус может иметь размеры отверстий 25 мкм, и второй ситовой ярус может иметь размеры отверстий приблизительно 14 мкм. В этом случае, т.к. размеры отверстий практически точно соответствуют размеру ооцист, может потребоваться много дополнительной воды (поставляемой в виде отдельного подачи сверху ситового яруса (21)), чтобы ооцисты проходили первый ситовой ярус. В других условиях, например, для сбора ооцист с диапазоном размеров от 20 до 30 мкм, первый ситовой ярус может иметь размеры отверстий 40 мкм, и второй ситовой ярус может иметь размеры отверстий приблизительно 15 мкм. В других условиях, например, для сбора ооцист с диапазоном размеров от 10 до 40 мкм, первый ситовой ярус может иметь размеры отверстий 42 мкм, и второй ситовой ярус может иметь размеры отверстий приблизительно 10 мкм. В другом варианте осуществления, например, для сбора ооцист с диапазоном размеров от 12 до 48 мкм, первый ситовой ярус может иметь размеры отверстий 50 мкм, и второй ситовой ярус может иметь размеры отверстий приблизительно 10 мкм.

Фигура 3

На фигуре 3 схематически показан вариант осуществления ситового яруса (21) (размеры отверстий 50 мкм) для применения в способе или системе по изобретению. В этом варианте осуществления ситовой ярус является непрерывным ярусом в форме цилиндра. Цилиндр вращают на поддерживающей оси (25) и внутренне снабжают стационарным контейнером (26). При использовании водную фракцию нагружают внутрь этого цилиндра, ниже контейнера (26), и цилиндр вращают, одновременно просеивая водную фракцию. Кроме того, при этом просеивании дополнительную водную среду, имеющую температуру приблизительно 28°C, добавляют внутрь цилиндра (21). Водный фильтрат собирают в контейнер (27). Выше цилиндра располагают ряд распылителей (28). Эти распылители можно использовать для добавления воды в цилиндр в качестве смазочного средства во время просеивания или после завершения просеивания для высвобождения остатка из цилиндра и его сбора в контейнер (26). Этот контейнер можно удалять, сдвигая его по оси (25).

Фигура 4

На фигуре 4 схематически показан другой вариант осуществления системы (20) по изобретению, в котором можно осуществлять полунепрерывный способ для использования способа по изобретению. Эта система содержит вращающееся сито (91) (имеющее размеры отверстий 150 мкм), окруженное баком (9). Это сито и бак соответствуют пункту 9 на фигуре 1. К этому ситу (91) подводят водную фракцию (8), содержащую разбавленные экскременты кур (см. фигуру 1, несмотря на то, что эту фракцию, необязательно, предварительно просеивают через сито с размером отверстий 2 мм), для отделения крупной фракции, содержащей макроскопические твердые частицы, от разбавленных экскрементов. Водную фракцию 10, содержащую ооцисты, собирают и помещают на вращающееся сито в форме цилиндра (21ʹ) (также см. фигуру 3), как в баке (23ʹ). Как описано в отношении фигуры 3, этот ситовой ярус имеет размеры отверстий 50 мкм, и с помощью него разделяют водную фракцию в водном фильтрате (11), содержащем ооцисты, и первый остаток (не представлен), содержащий частицы, более крупные, чем ооцисты. Этот остаток можно удалять, как описано выше.

Водный фильтрат (11) помещают на вращающееся сито (22ʹ), находящееся в баке (23"). Это сито (22ʹ) имеет размеры отверстий 10 мкм для задержки проходящих ооцист через этот ситовой ярус, таким образом, что остаток, содержащий очищенные ооцисты, образуется на внутренней стороне этого ситового яруса в форме цилиндра (22ʹ). Фильтрат отходов (12) содержит частицы, меньшие, чем ооцисты, такие как любые бактерии.

Фигура 5

На фигуре 5 схематически показан ситовой ярус для применения в качестве подложки, чтобы позволить очищенным ооцистам спорулировать. В этом варианте осуществления остаток (40) образуется в виде слоя 2,5-3,5 мм на внутренней стороне ситового яруса (22) (имеющего размеры отверстий 10 мкм). Ситовой ярус в форме цилиндра (22) частично помещают в объем воды ((50); поддерживают при температуре 28°C) и частично в газовую среду (60) таким образом, что приблизительно 20% общей окружности цилиндра находится ниже уровня объема воды. Цилиндр установлен так, что его продольная ось (25) расположена параллельно поверхности этого объема воды. При споруляции цилиндр вращают для поддержания слоя (40) периодически в кислородосодержащей газовой среде 60. Цилиндр вращают при 10-12 об./мин. через воду (50ʹ). Относительная влажность газовой среды в цилиндре составляет 100%. Обнаруживали, что, таким образом, ооцисты могут спорулировать (почти все) в течение 48 часов.

Пример 1

В примере 1 описывают данные о способе, касающиеся способа по изобретению, с использованием системы, изображенной на фигуре 4. В этой системе используют небольшие ярусы в форме цилиндра, имеющие длину 40 см и диаметр цилиндра 80 см (цилиндры, имеющие длину до 2,80 метров и диаметр до 2,0 метров можно успешно использовать в условиях, изображенных на фигуре 4). Ярусы имеют сети из проволоки из нержавеющей стали, переплетенной в соответствии с гладким переплетением, с размерами отверстий, как описано в отношении фигуры 4. Цилиндры вращают со скоростью 10-12 оборотов в минуту.

Собирали экскременты 60 кур породы белый леггорн (инфицированных Eimeria) возрастом 26-31 дней (приблизительно 25 граммов экскрементов на курицу в сутки), смешивали с 200 литрами воды и отделяли крупную фракцию с использованием сита с размером отверстий 2 мм. Приблизительно 50 литров этой смеси (содержащей приблизительно 2,25 кг экскрементов) помещали в систему, где при просеивании на ситовые ярусы (21 и 22) добавляли приблизительно 5-10 литров воды в минуту. Таким образом, получали приблизительно 120 граммов очищенных ооцист (композицию, содержащую расчетное количество приблизительно 85 граммов неооцистных частиц экскрементов, как правило, зерен песка, алевритовых частиц и глинистых частиц, и приблизительно 35 граммов ооцист) на ситовом ярусе (22) после 35 минут просеивания при вычисленном выходе приблизительно 81% в случае Eimeria acervulina и приблизительно 100% в случае Eimeria maxima. При использовании общепринятого способа флотации и центрифугирования это занимает приблизительно 6 часов с типичными выходами приблизительно 50-60% в случае обоих видов.

Необязательно, в зависимости от количества все еще присутствующих загрязнений можно осуществлять дополнительный этап промывки, смешивая остаток в 6% растворе гипохлорита (противоинфекционного средства) и помещая его в цилиндр (22). Воду непрерывно добавляют со скоростью приблизительно 5-10 литров в минуту для удаления гипохлорита, и через 15 минут остаток готов для дальнейшей обработки.

После споруляции, как описано в отношении фигуры 5, типичные скорости споруляции составляют 85% в случае Eimeria acervulina и 90% в случае Eimeria maxima (ср. типичные значения 40% с максимумом 80% в случае общепринятого способа с использованием дихромата калия). Эти спорулированные ооцисты могут служить в качестве антигена в вакцине против кокцидиоза, как известно на современном уровне техники.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ споруляции кокцидиальных ооцист, выделенных из экскрементов животных (5), включающий получение очищенных ооцист в виде слоя (40) на поверхности подложки (22), поддержание слоя, по меньшей мере периодически, в кислородосодержащей газовой среде (60), имеющей относительную влажность по меньшей мере 15%, и поддержание температуры ооцист от 19°C до 37°C. Изобретение позволяет увеличить выход споруляции. 10 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ споруляции кокцидиальных ооцист, выделенных из экскрементов животных (5), включающий получение очищенных ооцист в виде слоя (40) на поверхности подложки (22), поддержание слоя, по меньшей мере периодически в кислородосодержащей газовой среде (60), имеющей относительную влажность по меньшей мере 15%, и поддержание температуры ооцист от 19°C до 37°C, и причем толщина слоя составляет менее 10 мм, и причем поверхность подложки является перфорированным ярусом, способным пропускать воду, и поверхность подложки имеет размеры отверстий, приблизительно равные минимальному размеру ооцист.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что поверхность подложки имеет размеры отверстий приблизительно 10 мкм.

3. Способ по любому из пп. 1 и 2, отличающийся тем, что поверхность подложки находится в форме непрерывного перфорированного яруса.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что перфорированный ярус имеет форму цилиндра.

5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что непрерывный ярус помещают частично в объем воды (50), частично в газовую среду, устанавливая его продольную ось (25) параллельно поверхности объема воды, и где ярус вращают для поддержания слоя, по меньшей мере периодически в кислородосодержащей газовой среде.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что цилиндр вращают при скорости вращения 10-40 м/мин.

7. Способ по любому из пп. 3-6, отличающийся тем, что слой ооцист располагается на внутренней поверхности непрерывного яруса.

8. Способ по любому из пп. 5-7, отличающийся тем, что объем воды поддерживают при температуре от 19°C до 37°C.

9. Способ по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что объем воды поддерживают при температуре приблизительно 28°C.

10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что после споруляции ооцист слой снабжают дополнительной водной средой, содержащей противоинфекционное средство, после чего слой промывают для удаления противоинфекционного средства.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где поверхность подложки является ситовым ярусом (22), имеющим эффективный размер отверстия, приблизительно равный минимальному размеру ооцист, отличающийся тем, что получают тонкий слой, собирая экскременты животных, содержащие кокцидиальные ооцисты, разбавляя экскременты водной средой (7), необязательно, отделяя крупную фракцию (11), содержащую макроскопические твердые частицы, от разбавленных экскрементов и собирая водную фракцию (10), содержащую ооцисты, просеивая водную фракцию через первый ситовой ярус (21), иной, чем указанная поверхность подложки, где первый ситовой ярус имеет такие размеры отверстий, что пропускает ооцисты, для получения водного фильтрата (11, 32), содержащего ооцисты, и остатка (31) на первом ситовом ярусе, содержащем частицы, более крупные, чем ооцисты, и затем просеивая водный фильтрат через указанную поверхность подложки.