СОСТАВ ФАКТОРА VIII Российский патент 2019 года по МПК A61K38/37 A61K9/19 A61K47/18 C07K14/755 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фактор VIII (FVIII) представляет собой белок, обнаруженный в плазме крови, который действует как кофактор в каскаде реакций, приводящих к свертыванию крови. Недостаточность уровня активности FVIII в крови приводит к нарушению свертывания, известному как гемофилия A, наследственное состояние, преимущественно поражающее мужчин. Гемофилию A в настоящее время лечат с помощью терапевтических препаратов FVIII, полученных из плазмы человека или изготовленных с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Такие препараты вводят либо в ответ на приступ кровотечения (лечение по требованию), либо с частыми, регулярными интервалами для предотвращения неконтролируемого кровотечения (профилактика).

Известно, что FVIII является относительно нестабильным в терапевтических препаратах. В плазме крови, FVIII, как правило, присутствует в комплексе с другим белком плазмы, фактором фон Виллебранда (vWF), который присутствует в плазме с большим молярным избытком субъединицы VWF по отношению к FVIII, и, как считают, защищает FVIII от преждевременной деградации. Другой циркулирующий белок плазмы, альбумин, может также играть роль в стабилизации FVIII in vivo. Присутствующие в настоящее время на рынке препараты FVIII, таким образом, часто основаны на использовании альбумина и/или vWF для стабилизации FVIII в ходе процесса изготовления и в ходе хранения.

Однако, альбумин и vWF, используемые в присутствующих в настоящее время на рынке препаратах FVIII, получены из плазмы крови человека, и использование такого материала обладает определенными недостатками. Большой молярный избыток альбумина по сравнению с FVIII, как правило, добавляют для увеличения стабильности FVIII в таких препаратах, и это делает более сложной характеризацию собственно белка FVIII в этих препаратах. Добавление альбумина человеческого происхождения к FVIII также рассматривают как недостаток в отношении полученных рекомбинантным способом препаратов FVIII. Это происходит из-за того, что в отсутствие такого добавленного альбумина, теоретический риск переноса вируса уменьшается в препаратах FVIII рекомбинантного происхождения.

Описано несколько попыток получения состава FVIII без альбумина или vWF (или с относительно низкими уровнями этих наполнителей). Например, в Патенте США No. 5565427 (EP 508 194) описаны препараты FVIII, содержащие конкретные комбинации детергента и аминокислот, конкретно, аргинина и глицина, в дополнение к наполнителям, таким как хлорид натрия и сахароза.

В Патенте США No. 5763401 (EP 818 204) описан также терапевтический состав FVIII без альбумина, содержащий 15-60 мМ сахарозу, вплоть до 50 мМ NaCl, вплоть до 5 мМ хлорида кальция, 65-400 мМ глицина и вплоть до 50 мМ гистидина.

В Патенте США No. 5733873 (EP 627 924) от Osterberg (принадлежащем Pharmacia & Upjohn) описаны составы, включающие 0,01-1 мг/мл поверхностно-активного вещества.

Описаны также другие попытки использования низких или высоких концентраций хлорида натрия. В Патенте США No. 4877608 (EP 315 968) описаны составы с относительно низкими концентрациями хлорида натрия, а именно 0,5 мМ - 15 мМ NaCl.

С другой стороны, в Патенте США No. 5605884 (EP 0 314 095) описано использование составов с относительно высокими концентрациями хлорида натрия.

Дополнительные составы FVIII описаны в WO 2010/054238, EP 1 712 223, WO 2000/48635, WO 96/30041, WO 96/22107, WO 2011/027152, EP 2 361 613, EP 0 410 207, EP 0 511 234, US 5565427, EP 0 638 091, EP 0 871 476, EP 0 819 010, US 5874408, US 2005/0256038, US 2008/0064856, WO 2005/058283, WO 2012/037530 и WO 2014/026954. В EP 1 712 223 A1 описаны композиции FVIII, содержащие гистидин и CaCl₂, однако объединенные концентрации гистидина и Ca²⁺ в композициях EP 1 712 223 A1 являются слишком низкими для обеспечения желательной стабильности FVIII в водном растворе.

Другие терапевтические составы FVIII известного уровня техники, как правило, включают альбумин и/или vWF с целью стабилизации FVIII и таким образом не относятся к настоящему описанию.

Одной из проблем в получении композиций FVIII является предоставление раствора, который является подходящим для лиофилизации и применения после последующего разведения. Важным критерием в отношении этого является то, что раствор FVIII должен обладать стабильной активностью FVIII и не должен обладать мутностью до лиофилизации. Если водный раствор FVIII является мутным до лиофилизации, это является явным признаком того, что одно или несколько веществ в растворе, включая собственно FVIII, подверглись агрегации. Это является очень нежелательным, поскольку это, как правило, является показателем денатурированного белка, что приводит к уменьшенной активности. Второй основной проблемой с составами FVIII является их стабильность после лиофилизации. Признаки плохой стабильности включают в себя уменьшенную остаточную активность FVIII после лиофилизации, хранения и разведения, и присутствие высокомолекулярных комплексов FVIII.

Таким образом, существует большая необходимость в композициях, содержащих FVIII, не обладающих какой-либо мутностью или другим относящимся к делу нарушением качества, подобным, например, значительной потере активности до лиофилизации, и одновременно обладающих долгосрочной стабильностью после лиофилизации. Поскольку требования стабильного раствора до лиофилизации и стабильного лиофилизата в отношении состава могут значительно отличаться, оба условия следует принимать во внимание при разработке такого стабильного состава.

В настоящее время неожиданно обнаружено, что этого можно достигать посредством композиций в соответствии с этим изобретением, содержащих гистидин и кальций в конкретных минимальных концентрациях. Авторы изобретения, в частности, обнаружили, что, в отношении стабильности FVIII, более низкую концентрацию гистидина можно уравновешивать посредством более высоких концентраций кальция, и наоборот. Это, например, не описано в EP 1 712 223 A1, и, следовательно, композиции, описанные в нем, не порочат объект изобретения, заявленный по настоящему изобретению. Конкретно, концентрации гистидина композиций из EP 1 712 223 A1 является более низкими, чем необходимо по пункту формулы 1 настоящей заявки. Композиции по настоящему изобретению обладают дополнительным преимуществом в том, что они ближе к физиологическим условиям в отношении осмолярности. Это исключает раздражения или другие местные эффекты, которые могут быть вызваны композициями со значительной гиперосмолярностью, присутствующими во многих составах фактора VIII известного уровня техники.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к водной композиции FVIII, где композицию можно использовать для лечения субъекта с гемофилией A.

В следующих пунктах (1) - (93) описаны различные аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения:

(1) Водная композиция фактора свертывания VIII, содержащая:

a. молекулу FVIII;

b. 40-195 мМ соль натрия;

c. гистидин;

d. по меньшей мере 1 мМ соль кальция; и

e. поверхностно-активное вещество;

где [His] ≥ 180 мМ - 20*[Ca²⁺], где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в водной композиции в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в водной композиции в миллимоль на литр; и где осмолярность композиции составляет 600 мосмоль/л или менее.

(2) Водная композиция фактора свертывания VIII, содержащая

a. молекулу FVIII;

b. 40-95 мМ соль натрия;

c. гистидин;

d. по меньшей мере 1 мМ соль кальция; и

e. поверхностно-активное вещество;

где [His] ≥ 180 мМ - 20*[Ca²⁺], где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в водной композиции в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в водной композиции в миллимоль на литр, и где осмолярность композиции составляет предпочтительно 600 мосмоль/л или менее.

(3) Водная композиция фактора свертывания VIII, содержащая:

a. молекулу FVIII;

b. по меньшей мере 40 мМ соль натрия;

c. гистидин;

d. сахарозу

e. по меньшей мере 1 мМ соль кальция; и

f. поверхностно-активное вещество;

где [His] ≥ 180 мМ - 20*[Ca²⁺], где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в водной композиции в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в водной композиции в миллимоль на литр, и где осмолярность композиции составляет предпочтительно 600 мосмоль/л или менее.

(4) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где формулы подчиняются условию, что [His] > 0.

(5) Водная композиция по пункту (1) или (3), где концентрация соли натрия составляет 50-150 мМ.

(6) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация соли натрия составляет 50-95 мМ.

(7) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация соли натрия составляет 50-75 мМ.

(8) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация соли натрия составляет 60-70 мМ.

(9) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация соли натрия составляет приблизительно 65 мМ.

(10) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация гистидина составляет по меньшей мере 5 мМ.

(11) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация гистидина составляет по меньшей мере 10 мМ.

(12) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация гистидина составляет по меньшей мере 20 мМ.

(13) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация гистидина составляет по меньшей мере 30 мМ.

(14) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация гистидина составляет по меньшей мере 40 мМ.

(15) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация гистидина составляет по меньшей мере 50 мМ.

(16) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация гистидина составляет 50-150 мМ.

(17) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация гистидина составляет приблизительно 100 мМ.

(18) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция обладает pH от 5 до 9.

(19) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция обладает pH от 6 до 8.

(20) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция обладает pH от 6,5 до 7,5.

(21) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция обладает pH от 6,8 до 7,2.

(22) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция обладает pH приблизительно 7.

(23) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где для композиции после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +25°C и относительной влажности 40% в течение периода 6 месяцев, и (iii) последующего восстановления лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, показано восстановление активности FVIII:C по меньшей мере на 80%, относительно такой же композиции после (i) лиофилизации и, без хранения лиофилизированной композиции, (ii) последующего немедленного восстановления в дистиллированной воде.

(24) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где для композиции, после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +25°C и относительной влажности 40% в течение периода 12 месяцев, и (iii) последующего восстановления лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, показано восстановление активности FVIII:C по меньшей мере на 80%, относительно такой же композиции после (i) лиофилизации и, без хранения лиофилизированной композиции, (ii) последующего немедленного восстановления в дистиллированной воде.

(25) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где для композиции после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +25°C и относительной влажности 40 в течение периода 18 месяцев, и (iii) последующего восстановление лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, показано восстановление активности FVIII:C по меньшей мере на 80%, относительно такой же композиции после (i) лиофилизации и, без хранения лиофилизированной композиции, (ii) последующего немедленного восстановления в дистиллированной воде.

(26) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где для композиции после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +25°C и относительной влажности 40% в течение периода 24 месяцев, и (iii) последующего восстановления лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, показано восстановление активности FVIII:C по меньшей мере на 80%, относительно такой же композиции после (i) лиофилизации и, без хранения лиофилизированной композиции, (ii) последующего немедленного восстановления в дистиллированной воде.

(27) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где для композиции после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +25°C и относительной влажности 40% в течение периода 36 месяцев, и (iii) последующего восстановления лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, показано восстановление активности FVIII:C по меньшей мере на 80%, относительно такой же композиции после (i) лиофилизации и, без хранения лиофилизированной композиции, (ii) последующего немедленного восстановления в дистиллированной воде.

(28) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где для композиции после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +40°C и относительной влажности 60% в течение периода 6 месяцев, и (iii) последующего восстановления лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, показано восстановление активности FVIII:C по меньшей мере на 80%, относительно такой же композиции после (i) лиофилизации и, без хранения лиофилизированной композиции, (ii) последующего немедленного восстановления в дистиллированной воде.

(29) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где для композиции после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +40°C и относительной влажности 60% в течение периода 12 месяцев, и (iii) последующего восстановления лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, показано восстановление активности FVIII:C по меньшей мере на 80%, относительно такой же композиции после (i) лиофилизации и, без хранения лиофилизированной композиции, (ii) последующего немедленного восстановления в дистиллированной воде.

(30) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где для композиции после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +40°C и относительной влажности 60% в течение периода 18 месяцев, и (iii) последующего восстановления лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, показано восстановление активности FVIII:C по меньшей мере на 80%, относительно такой же композиции после (i) лиофилизации и, без хранения лиофилизированной композиции, (ii) последующего немедленного восстановления в дистиллированной воде.

(31) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где для композиции после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +40°C и относительной влажности 60% в течение периода 24 месяцев, и (iii) последующего восстановления лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, показано восстановление активности FVIII:C по меньшей мере на 80%, относительно такой же композиции после (i) лиофилизации и, без хранения лиофилизированной композиции, (ii) последующего немедленного восстановления в дистиллированной воде.

(32) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция после (i) лиофилизации, (ii) хранения лиофилизированной композиции при температуре +25°C и относительной влажности 40% в течение периода 12 месяцев, и (iii) последующего восстановления лиофилизированной композиции в дистиллированной воде, обладает мутностью 18 НЕФ или менее.

(33) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где соль кальция представляет собой хлорид кальция.

(34) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где соль натрия представляет собой хлорид натрия.

(35) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция дополнительно содержит углевод.

(36) Водная композиция по (35) выше, где углевод выбран из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы и рафинозы.

(37) Водная композиция по (35) или (36) выше, где углевод представляет собой сахарозу.

(38) Водная композиция по любому из (35) - (37) выше, где концентрация углевода составляет 1-20% масс./масс.

(39) Водная композиция по любому из (35) - (37) выше, где концентрация углевода составляет 2-10% масс./масс.

(40) Водная композиция по любому из (35) - (37) выше, где концентрация углевода составляет 3-8% масс./масс.

(41) Водная композиция по любому из (35) - (37) выше, где концентрация углевода составляет 4-6% масс./масс.

(42) Водная композиция по любому из (35) - (37) выше, где концентрация углевода составляет приблизительно 5% масс./масс.

(43) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация поверхностно-активного вещества составляет по меньшей мере 0,001% об./об.

(44) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,001-0,1% об./об.

(45) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,002-0,2% об./об.

(46) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,005% об./об.

(47) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где поверхностно-активное вещество представляет собой неприродное поверхностно-активное вещество.

(48) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.

(49) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20.

(50) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере одну аминокислоту, отличную от гистидина.

(51) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, выбрана из группы, состоящей из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина, метионина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и их сочетаний.

(52) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, представляет собой аргинин.

(53) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, представляет собой аспарагин.

(54) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, представляет собой аспарагиновую кислоту.

(55) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, представляет собой глутаминовую кислоту.

(56) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, представляет собой глутамин.

(57) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, представляет собой лизин.

(58) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, представляет собой метионин.

(59) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, представляет собой фенилаланин.

(60) Водная композиция по (50) выше, где по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, представляет собой изолейцин.

(61) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов (50) - (60), где концентрация по меньшей мере одной аминокислоты, отличной от гистидина, составляет по меньшей мере 0,1 мМ.

(62) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов (50) - (60), где концентрация по меньшей мере одной аминокислоты, отличной от гистидина, составляет по меньшей мере 1 мМ.

(63) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов (50) - (60), где концентрация по меньшей мере одной аминокислоты, отличной от гистидина, составляет 5-300 мМ.

(64) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов (50) - (60), где концентрация по меньшей мере одной аминокислоты, отличной от гистидина, составляет 10-200 мМ.

(65) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один антиоксидант.

(66) Водная композиция по (65) выше, где по меньшей мере один антиоксидант выбран из группы, состоящей из восстановленного глутатиона, метионина, цистеина, сульфита натрия, витамина A, витамина E, аскорбиновой кислоты, аскорбата натрия и их сочетаний.

(67) Водная композиция по (65) выше, где по меньшей мере один антиоксидант представляет собой восстановленный глутатион.

(68) Водная композиция по (65) выше, где по меньшей мере один антиоксидант представляет собой метионин.

(69) Водная композиция по (65) выше, где по меньшей мере один антиоксидант представляет собой цистеин.

(70) Водная композиция по (65) выше, где по меньшей мере один антиоксидант представляет собой сульфит натрия.

(71) Водная композиция по (65) выше, где по меньшей мере один антиоксидант представляет собой витамин A.

(72) Водная композиция по (65) выше, где по меньшей мере один антиоксидант представляет собой витамин E.

(73) Водная композиция по (65) выше, где по меньшей мере один антиоксидант представляет собой аскорбиновую кислоту.

(74) Водная композиция по (65) выше, где по меньшей мере один антиоксидант представляет собой аскорбат натрия.

(75) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов (65) - (74), где концентрация по меньшей мере одного антиоксиданта составляет по меньшей мере 0,05 мМ.

(76) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов (65) - (74), где концентрация по меньшей мере одного антиоксиданта составляет 0,05-100 мМ.

(77) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов (65)-(74), где концентрация по меньшей мере одного антиоксиданта составляет 0,1-20 мМ.

(78) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов (65)-(74), где концентрация по меньшей мере одного антиоксиданта составляет 0,25-5 мМ.

(79) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где молекула фактора VIII представляет собой неприродную молекулу FVIII.

(80) Водная композиция по (79), где молекула фактора VIII получена рекомбинантным способом.

(81) Водная композиция по (79) или (80), где молекула фактора VIII обладает характером гликозилирования, отличным от гликозилирования происходящего из плазмы человека FVIII.

(82) Водная композиция по одному из (79) - (81) выше, где молекула FVIII обладает аминокислотной последовательностью, отличной от SEQ ID NO:1.

(83) Водная композиция по одному из (79) - (82) выше, где молекула FVIII выбрана из группы, состоящей из (i) молекул FVIII с делетированным или усеченным B-доменом, (ii) одноцепочечных молекул FvIII, (iii) молекул FVIII, обладающих защитными группами или увеличивающими время полужизни группами, (iv) слитых белков, содержащих аминокислотную последовательность FVIII, слитую с гетерологичной аминокислотной последовательностью, и (v) их сочетаний.

(84) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где молекула фактора VIII обладает аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO:2.

(85) Водная композиция по любому из вышеуказанных пунктов, где композиция обладает мутностью 18 НЕФ или менее, предпочтительно, 6 НЕФ или менее, более предпочтительно, 3 НЕФ или менее.

(86) Водная композиция по (85) выше, где композиция перед лиофилизацией обладает мутностью 18 НЕФ или менее, предпочтительно, 6 НЕФ или менее, более предпочтительно, 3 НЕФ или менее.

(87) Водная композиция по (85) выше, где композиция после лиофилизации и разведения в дистиллированной воде обладает мутностью 18 НЕФ или менее, предпочтительно, 6 НЕФ или менее, более предпочтительно, 3 НЕФ или менее.

(88) Композиция, получаемая посредством лиофилизации водной композиции по любому из пунктов выше.

(89) Водная композиция, получаемая посредством восстановления лиофилизированной водной композиции по (88) выше водным раствором.

(90) Водная композиция по (89), где водный раствор выбран из дистиллированной воды, раствора соли и раствора, содержащего гистидин.

(91) Способ стабилизации молекулы FVIII, включающий смешивание компонентов, определенных по любому из (1)-(3) выше, для получения водной композиции, и лиофилизацию водной композиции.

(92) Способ по (91), где полученная водная композиция представляет собой композицию по любому из (1) - (87) выше.

(93) Способ лечения нарушения свертывания крови, включающий введение субъекту фармацевтически эффективного количества композиций (89) или (90) выше.

На фиг. 1 изображено взаимодействие между концентрациями гистидина и ионов кальция в композиции по настоящему изобретению. На фигуре суммированы исследования липидного состава (Пример 7) с различными концентрациями гистидина и хлорида кальция, где другие наполнители сохраняли постоянными (65 ммоль/л хлорида натрия, 5% сахароза, 0,005% Tween^® 80). Точками представлена мутность выше порогового уровня 18 НЕФ, ромбами представлен прозрачный раствор (мутность менее или равная 18 НЕФ). На графике проиллюстрировано, что если применяют определенные концентрации гистидина и ионов кальция, в результате получают прозрачный раствор. Требования для прозрачного раствора представлены формулой, приведенной ниже.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Молекулы фактора VIII

Как применяют в настоящем документе, термин «фактор VIII» или «FVIII» относится к молекулам, обладающим по меньшей мере частью активности свертывания природного фактора VIII человека. FVIII человека состоит из 2351 аминокислот (включая сигнальный пептид) и 2332 аминокислот (без сигнального пептида). «Природный FVIII человека» представляет собой происходящую из плазмы человека молекулу FVIII, обладающую полноразмерной последовательностью, как показано на SEQ ID NO: 1 (аминокислоты 1-2332). Подробная доменная структура, A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, обладает соответствующими аминокислотными остатками (обозначенными SEQ ID NO 1): A1 (1-336), a1 (337-372), A2 (373-710), a2 (711-740), B (741-1648), a3 (1649-1689), A3 (1690-2020), C1 (2021-2173) и C2 (2174-2332).

Активность свертывания молекулы FVIII можно определять с использованием одностадийного анализа свертывания (например, как описано в Lee et al., Thrombosis Research 30, 511 519 (1983)) или анализа хромогенного субстрата (например, набор coamatic для тестирования FVIII от Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338-20128 Milano, Italy). Дополнительные детали этих анализов активности описаны ниже.

Предпочтительно, молекулы FVIII, используемые в соответствии с этим изобретением, обладают по меньшей мере 10% специфической молярной активности природного FVIII человека. Термин «специфическая молярная активность» относится к активности свертывания на моль FVIII и указана в «МЕ/моль FVIII.

В предпочтительном варианте осуществления молекула FVIII представляет собой неприродную молекулу FVIII. Предпочтительно, неприродная молекула FVIII получена рекомбинантным способом. В другом варианте осуществления молекула FVIII получена в культуре клеток. В другом предпочтительном варианте осуществления, неприродная молекула FVIII обладает характером гликозилирования, отличным от гликозилирования происходящего из плазмы FVIII. В другом варианте осуществления молекула FVIII выбрана из группы, состоящей из (i) молекул FVIII с делетированным или усеченным B-доменом, (ii) одноцепочечных молекул FvIII, (iii) полученных рекомбинантным способом двухцепочечных молекул FVIII, (iv) молекул FVIII, обладающих защитными группами или увеличивающими время полужизни группами, (v) слитых белков, содержащих аминокислотную последовательность FVIII, слитую с гетерологичной аминокислотной последовательностью, и (vi) их сочетаний.

Термины «фактор VIII» и «FVIII» используют как синонимы в настоящем документе. «Композиции фактора VIII» в смысле по настоящему изобретению включают в себя композиции, содержащие FVIII и FVIIIa. FVIIIa может, как правило, присутствовать в небольших количествах, например, приблизительно от 1 до 2% FVIIIa, по отношению к общему количеству белка FVIII в композиции. «FVIII» включает в себя природные аллельные варианты FVIII, которые могут существовать и передаваться от одного индивидуума к другому. FVIII можно получать из плазмы или получать рекомбинантным способом, с использованием хорошо известных способов получения и очистки. Степень и локализация гликозилирования, сульфатирования тирозина и других посттрансляционных модификаций может меняться, в зависимости от выбранной клетки-хозяина и условий ее роста.

Термин FVIII включает в себя аналоги FVIII. Термин «аналог FVIII», как применяют в настоящем документе, относится к молекуле FVIII (полноразмерной или с усеченным/делетированным B-доменом), где одна или несколько аминокислот заменены или делетированы по сравнению с SEQ ID NO 1 или, для молекул FVIII с усеченным/делетированным B-доменом, с соответствующей частью SEQ ID NO 1. Аналоги FVIII не встречаются в природе, но получены в результате манипуляции человека.

Молекулы фактора VIII, включенные в композиции по настоящему изобретению, также могут представлять собой молекулы FVIII с усеченным/делетированным B-доменом, где оставшиеся домены соответствуют последовательностям, как указано посредством аминокислот номер 1-740 и 1649-2332 из SEQ ID NO: 1. Другие формы молекул FVIII с делетированным B-доменом обладают, кроме того, частичной делецией в домене a3, что приводит к одноцепочечным молекулам FvIII.

Из указанного следует, что эти молекулы FVIII представляют собой рекомбинантные молекулы, продуцированные в трансформированных клетках-хозяевах, предпочтительно, происходящих из млекопитающих. Однако, оставшиеся домены в FVIII с делетированным B-доменом, (т.е. три A-домена, два C-домена и области a1, a2 и a3) могут немного отличаться, например, приблизительно на 1%, 2%, 3%, 4% или 5%, от соответствующей аминокислотной последовательности, как указано в SEQ ID NO 1 (аминокислоты 1-740 и 1649-2332).

Молекулы FVIII, включенные в композицию по настоящему изобретению, могут представлять собой двухцепочечные молекулы FVIII или одноцепочечные молекулы FvIII. Молекулы FVIII, включенные в композицию по настоящему изобретению, также могут представлять собой биологически активные фрагменты FVIII, т.е., FVIII, где домен(ы), отличные от B-домена, делетирован/делетированы или усечен/усечены, но где молекула FVIII в делетированной/усеченной форме сохраняет свою способность поддерживать формирование тромба. Активность FVIII можно оценивать in vitro с использованием способов, хорошо известных в данной области. Предпочтительным тестом для определения активности FVIII по этому изобретению является анализ хромогенного субстрата или одностадийный анализ (см. ниже). Аминокислотные модификации (замены, делеции и т.д.) можно вводить в остальные домены, например, чтобы модифицировать способность связывания фактора VIII с различными другими компонентами, например, такими как фактор фон Виллебранда (vWF), родственный рецептору липопротеинов низкой плотности белок (LPR), различные рецепторы, другие факторы свертывания, клеточные поверхности и т.д., или чтобы ввести и/или удалить участки гликозилирования и т.д. Другие мутации, не прекращающие активности FVIII, также можно размещать в молекуле/аналоге FVIII для применения в композиции по настоящему изобретению.

Аналоги FVIII включают в себя также молекулы FVIII, в которых один или несколько из аминокислотных остатков исходного полипептида делетированы или заменены другими аминокислотными остатками, и/или в которых дополнительные аминокислотные остатки добавлены в исходный полипептид FVIII.

Более того, молекулы/аналоги Фактора VIII могут содержать другие модификации например, в усеченном B-домене и/или в одном или нескольких из других доменов молекул («производные FVIII»). Эти другие модификации могут находиться в форме различных молекул, конъюгированных с молекулой фактора VIII, например, таких как полимерные соединения, пептидные соединения, полученные из жирных кислот соединения и т.д.

Термин FVIII включает в себя гликопэгилированный FVIII. В контексте настоящего изобретения, термин «гликопэгилированный FVIII» предназначен для обозначения молекулы фактора VIII (включая полноразмерный FVIII и FVIII с усеченным/делетированным B-доменом), где одна или несколько группа(групп) ПЭГ присоединена/присоединены к полипептиду FVIII посредством полисахаридных боковой цепи(цепей) (гликана(гликанов)) полипептида.

Термин FVIII включает в себя молекулы FVIII, обладающие защитными группами или увеличивающими время полужизни группами. Термины «защитные группы»/«увеличивающие время полужизни группы» в настоящем документе понимают как относящиеся к одной или нескольким химическим группам, которые присоединены к одной или нескольким функциональным группам боковых цепей аминокислот, таким как -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2, или одна или несколько структур N- и/или O-гликанов, и которые могут увеличивать время полужизни в кровотоке in vivo ряда терапевтических белков/пептидов при конъюгации с этими белками/пептидам. Примеры защитных групп/увеличивающих время полужизни групп включают в себя: биосовместимые жирные кислоты и их производные, гидроксиалкилкрахмал (HAS), например, гидроксиэтилкрахмал (HES), поли(Gly_x-Ser_y)_n (гомоаминокислотный полимер (HAP)), гиалуроновую кислоту (HA), гепарозановые полимеры (HEP), полимеры не основе фосфорилхолина (полимер PC), полимеры Fleximer^® (Mersana Therapeutics, MA, USA), декстран, полисиаловые кислоты (PSA), полиэтиленгликоль (ПЭГ), домен Fc, трансферрин, альбумин, подобные эластину пептиды, полимеры XTEN^® (Amunix, CA, USA), связывающие альбумин пептиды, фрагмент фактора фон Виллебранда (фрагмент vWF), карбокси-концевой пептид (пептид CTP, Prolor Biotech, IL) и любое их сочетание (см., например, McCormick, C.L., A.B. Lowe, and N. Ayres, Water-Soluble Polymers, in Encyclopedia of Polymer Science and Technology. 2002, John Wiley & Sons, Inc.). Способ дериватизации не является критическим и может быть установлен из вышеуказанного.

Молекулы FVIII, которые можно использовать по этому изобретению, включают в себя слитые белки, содержащие аминокислотную последовательность FVIII, слитую с гетерологичной аминокислотной последовательностью, предпочтительно, с увеличивающей время полужизни аминокислотной последовательностью. Предпочтительными слитыми белками являются слитые с Fc белки и слитые с альбумином белки. Термин «слитый с Fc белок» в настоящем документе понимают как включающий в себя FVIII, слитый с доменом Fc, который может происходить из любого изотипа антитела. Домен Fc IgG часто является предпочтительным из-за относительно длительного времени полужизни в кровотоке антител IgG. Более того, домен Fc можно модифицировать для модуляции конкретных эффекторных функций, например, таких как связывание комплемента и/или связывание с конкретными рецепторами Fc. Слияние FVIII с доменом Fc, обладающим способностью связывания с рецепторами FcRn, как правило, приводит к продленному времени полужизни в кровотоке слитого белка по сравнению с временем полужизни wt FVIII. Из указанного следует, что молекула FVIII для применения по настоящему изобретению также может представлять собой производное аналога FVIII, например, такое как слитый с аналогом FVIII белок, пэгилированный или гликопэгилированный аналог FVIII, или аналог FVIII, конъюгированный с гепарозановым полимером. Термин «слитый с альбумином белок» в настоящем документе понимают как включающий в себя FVIII, слитый с аминокислотной последовательностью альбумина или его фрагментом или производным. Гетерологичная аминокислотную последовательность может являться слитой с N- или C-концом FVIII, или может являться вставленной во внутреннюю часть аминокислотной последовательности FVIII. Гетерологичная аминокислотная последовательность может представлять собой любой «увеличивающий время полужизни полипептид», описанный в WO 2008/077616 A1, описание содержания которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Примеры молекул FVIII для применения в композиции по настоящему изобретению включают в себя, например, молекулы FVIII, описанные в WO 2010/045568, WO 2009/062100, WO 2010/014708, WO 2008/082669, WO 2007/126808, US 2010/0173831, US 2010/0173830, US 2010/0168391, US 2010/0113365, US 2010/0113364, WO 2003/031464, WO 2009/108806, WO 2010/102886, WO 2010/115866, WO 2011/101242, WO 2011/101284, WO 2011/101277, WO 2011/131510, WO 2012/007324, WO 2011/101267, WO 2013/083858 и WO 2004/067566.

Примеры молекул FVIII, которые можно использовать в композиции по настоящему изобретению, включают в себя активный ингредиент Advate®, Helixate®, Kogenate®, Xyntha® а также молекулу FVIII, описанную в WO 2008/135501, WO 2009/007451 и конструкцию, обозначенную «dBN(64-53)», из WO 2004/067566. Эта конструкция обладает аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO 2.

Концентрация фактора VIII в композиции по настоящему изобретению составляет, как правило, в диапазоне 10-10000 МЕ/мл. В различных вариантах осуществления, концентрация молекул FVIII в композициях по изобретению лежит в диапазоне 10-8000 МЕ/мл, или 10-5000 МЕ/мл, или 20-3000 МЕ/мл, или 50-1500 МЕ/мл, или 3000 МЕ/мл, или 2500 МЕ/мл, или 2000 МЕ/мл, или 1500 МЕ/мл, или 1200 МЕ/мл, 1000 МЕ/мл, или 800 МЕ/мл, или 600 МЕ/мл, или 500 МЕ/мл, или 400 МЕ/мл, или 300 МЕ/мл, или 250 МЕ/мл, или 200 МЕ/мл, или 150 МЕ/мл, или 100 МЕ/мл.

«Международная единица», или «МЕ», представляет собой единицу измерения активности (удельной активности) свертывания крови FVIII, как измерено посредством анализа активности FVIII, такого как одностадийный анализ свертывания или анализ активности FVIII с хромогенным субстратом с использованием стандарта, калиброванного по препарату международного стандарта, калиброванного в «МЕ». В данной области известны одностадийные анализы свертывания, такие как описанные в N Lee, Martin L, et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983). Принцип одностадийного анализа: Тест выполняют как модифицированный вариант анализа активированного частичного тромбопластинового времени (aPTT): Инкубация плазмы с фосфолипидами и контактным активатором приводит к активации факторов внутренней системы свертывания. Добавление ионов кальция запускает каскад свертывания. Определяют время до формирования поддающегося измерению фибринового сгустка. Анализ выполняют в присутствии плазмы с дефицитом фактора VIII. Способность к свертыванию плазмы с дефицитом восстанавливают посредством фактора свертывания VIII, включенного в образец, подлежащий тестированию. Сокращение времени свертывания является пропорциональным количеству фактора VIII, присутствующего в образце. Активность фактора свертывания VIII количественно определяют посредством прямого сравнения со стандартным препаратом с известной активностью фактора VIII в международных единицах.

Другим стандартным анализом является анализ с хромогенным субстратом. Наборы для анализа с хромогенным субстратом можно приобретать из коммерческих источников, такие как набор coamatic для тестирования FVIII (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338-20128 Milano, Italy). Принцип хромогенного анализа: В присутствии кальция и фосфолипида, фактор X активируется фактором IXa до фактора Xa. Эта реакция стимулируется посредством фактора VIIIa в качестве кофактора. FVIIIa формируется посредством низких количеств тромбина в реакционной смеси из FVIII в образце, подлежащем измерению. При использовании оптимальных концентраций Ca²⁺, фосфолипида и фактора IXa, и избыточного количества фактора X, активация фактора X является пропорциональной активности фактора VIII. Активированный фактор X высвобождает хромофор pNA из хромогенного субстрата S-2765. Высвобождение pNA, измеренное при 405 нм, таким образом, является пропорциональным сформированному количеству FXa, и, таким образом, также активности фактора VIII в образце.

Сублимационную сушку или лиофилизацию, если не указано иначе по контексту, в котором она появляется, следует использовать для обозначения процесса сушки, в котором раствор материалов (т.е. активного фармацевтического ингредиента и различных добавок для получения составов или «наполнителей») переводят в твердое вещество. Типичный процесс лиофилизации состоит из трех стадий, «замораживания», «первичной сушки» и «вторичной сушки». На стадии замораживания почти всю содержащуюся воду переводят в лед, и растворенные вещества - в твердые (кристаллические или аморфные). На стадии первичной сушки лед удаляют из продукта посредством прямой сублимации, которой достигают посредством поддержания отрицательного градиента давления между молекулами воды (льда) и окружающей атмосферой. На стадии вторичной сушки остаточную влажность удаляют из продукта посредством десорбции.

Если концентрации (масс./об.) приведены для лиофилизированных композиций, они относятся к объему непосредственно перед лиофилизацией.

Если не указано иначе, термины процентного содержания выражают массу/массовые доли, и температуры приведены по шкале Цельсия.

Осмолярность

Композиция фактора VIII по настоящему изобретению как правило, обладает осмолярностью менее 0,6 Осм/л. Это ближе к физиологическим условиям, чем осмолярность во многих составах известного уровня техники, содержащих высокие концентрации хлорида натрия. В различных вариантах осуществления изобретения, состав обладает осмолярностью ниже 0,55 Осм/л, ниже 0,5 Осм/л, ниже 0,45 Осм/л или ниже 0,4 Осм/л. Термины «осмолярность» и «осмотическая концентрация» используют взаимозаменяемо в настоящем документе. Осмолярность, или осмотическая концентрация, представляет собой меру концентрации растворенного вещества, определенную как количество осмоль (Осм) растворенного вещества на литр (л) раствора (осмоль/л или Осм/л). В то время как молярность измеряет количество моль растворенного вещества на единицу объема раствора, осмолярность измеряет количество осмоль частиц растворенного вещества на единицу объема раствора.

Теоретический расчет осмолярности хорошо известен специалисту в данной области. Кратко, для каждого компонента раствора рассчитывают произведение осмотического коэффициента f, количество n частиц, на которые молекула диссоциирует в воде, и молярной концентрации, и суммируют результат для всех компонентов. Осмолярность раствора можно рассчитывать по следующему уравнению: Осм/л=∑_i f_i n_i C_i, где индекс i представляет собой идентичность конкретного компонента; f представляет собой осмотический коэффициент конкретного компонента; n представляет собой количество частиц, на которые молекула диссоциирует в воде; C представляет собой молярную концентрацию компонента. Молярная концентрация обладает некоторой температурной зависимостью; для целей настоящего изобретения она относится к концентрациям при 25 °C.

Альтернативным способом оценки осмотического давления, которое раствор может проявлять после инъекции, является оценка осмоляльности, при которой содержание компонентов оценивают относительно массы растворителя. Осмоляльность и осмолярность можно легко подвергать взаимному переводу, если известны плотность раствора и масса растворенных компонентов в сухом состоянии. Осмоляльность можно измерять посредством ряда способов, где наиболее распространенным является понижение точки замерзания.

Например, для воды, 1 осмоль растворенного вещества, добавленный к 1 кг воды, понижает точку замерзания на 1,86°C. Способы измерения осмоляльности раствора посредством понижения точки замерзания описаны, например, в Европейской фармакопее 2.2.35 и в Фармакопее США, часть 785.

В таблице ниже перечислены осмотические коэффициенты и количество частиц n для некоторых важных наполнителей. Для других компонентов, значение f=1 обеспечивает достаточно хорошую аппроксимацию для практических целей, и значение n хорошо известно по существу для всех соединений, имеющих значение для фармацевтических препаратов для парентерального применения.

Наполнитель f n NaCI 0,93 2 CaCI₂ 0,86 3 Сахароза 1,02 1 Гистидин 1,0 1 L-метионин 1,0 1 Полоксамер-188 1,0 1 Полисорбат 20 1,0 1 Полисорбат 80 1,0 1

Соли

Композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит соль натрия.

В одном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере 40 мМ соль натрия (например, NaCl). В серии вариантов осуществления, композиция содержит 40-195 мМ соль натрия (например, NaCl) или 45-180 мМ, или 45-150 мМ, или 50-125 мМ, или 50-100 мМ, или 60-95 мМ, или 60-75 мМ, например, приблизительно 65 мМ. В другом варианте осуществления концентрация соли натрия (например, NaCl) составляет 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95 мМ.

Предпочтительно, соль натрия представляет собой хлорид натрия; в другом варианте осуществления соль представляет собой ацетат натрия. В третьем варианте осуществления, композиция по изобретению содержит смесь хлорида натрия и ацетата натрия.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит соль кальция. Соль кальция, используемая в соответствии с настоящим изобретением, является, как правило, растворимой в воде, так что она диссоциирует на один или несколько ионов кальция и противоанионов при растворении в водном растворе. Термин «Ca²⁺» является синонимом термина «ион кальция».

В одном варианте осуществления концентрацию кальция определяют по следующей формуле, где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в миллимоль на литр:

[Ca²⁺] ≥ 9 мМ - 0,05*[His]

В другом варианте осуществления концентрацию кальция определяют по следующей формуле, где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в миллимоль на литр:

[Ca²⁺] ≥ 9,5 мМ - 0,05*[His]

В другом варианте осуществления концентрацию кальция определяют по следующей формуле, где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в миллимоль на литр:

[Ca²⁺] ≥ 10 мМ - 0,05*[His]

В другом варианте осуществления концентрацию кальция определяют по следующей формуле, где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в миллимоль на литр:

[Ca²⁺] ≥ 10,5 мМ - 0,05*[His]

Вышеуказанные формулы подчиняются условию, что [Ca²⁺] > 0. Как правило, композиция содержит по меньшей мере 1 мМ, предпочтительно по меньшей мере 2 мМ, более предпочтительно, по меньшей мере 4 мМ, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 5 мМ соль кальция. В другом варианте осуществления композиция содержит вплоть до 100 мМ соль кальция. В другом варианте осуществления композиция содержит 1-50 мМ соль кальция, или 2-40 мМ, или 3-30 мМ, или 4-20 мМ. В одном конкретном варианте осуществления композиция содержит приблизительно 10 мМ соль кальция.

Соль кальция может, например, являться выбранной из группы из хлорида кальция, ацетата кальция, глюконата кальция, лактата кальция, бензоата кальция и их смесей, и других растворимых солей кальция, хорошо известных специалисту в данной области. В предпочтительном варианте осуществления соль кальция представляет собой хлорид кальция.

Гистидин

Композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит гистидин, предпочтительно L-гистидин.

В одном варианте осуществления концентрацию гистидина определяют по следующей формуле, где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в миллимоль на литр:

[His] ≥ 180 мМ - 20*[Ca²⁺]

В другом варианте осуществления концентрацию гистидина определяют по следующей формуле, где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в миллимоль на литр:

[His] ≥ 190 мМ - 20*[Ca²⁺]

В другом варианте осуществления концентрацию гистидина определяют по следующей формуле, где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в миллимоль на литр:

[His] ≥ 200 мМ - 20*[Ca²⁺]

В другом варианте осуществления концентрацию гистидина определяют по следующей формуле, где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в миллимоль на литр:

[His] ≥ 210 мМ - 20*[Ca²⁺]

Вышеуказанные формулы подчиняются условию, что [His] > 0. Как правило, концентрация гистидина составляет по меньшей мере 5 мМ, предпочтительно по меньшей мере 10 мМ, предпочтительно по меньшей мере 20 мМ, предпочтительно 20-400 мМ, предпочтительно по меньшей мере 25 мМ, предпочтительно 25-200 мМ, предпочтительно по меньшей мере 50 мМ, предпочтительно 50-300 мМ, предпочтительно 55-170 мМ, предпочтительно 60-150 мМ, предпочтительно 65-120 мМ, более предпочтительно 50-100 мМ, например, приблизительно 100 мМ. В другом варианте осуществления концентрация гистидина составляет 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300 или 400 мМ.

Поверхностно-активное вещество

Композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит поверхностно-активное вещество. Как применяют в настоящем документе, «поверхностно-активные вещества» относятся к средствам, защищающим активное вещество от индуцированных границей раздела воздух-раствор или индуцированных границей раздела раствор-поверхность стресса или повреждения. Предпочтительно, поверхностно-активное вещество представляет собой неприродное поверхностно-активное вещество.

Типичными неприродными поверхностно-активными веществами (с примерами торговых наименований, приведенными в скобках []) являются сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, такие как монолаурат полиоксиэтиленсорбитана (20) [Tween^® 20], монопальмитат полиоксиэтиленсорбитана (20) [Tween^® 40] или моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (20) [Tween^® 80], полоксамеры, такие как блок-сополимер полиоксипропилен-полиоксиэтилен [Плюроник^® F68/полоксамер 188], простой октилфениловый эфир полиэтиленгликоля [Triton^® X-100] или простой додециловый эфир полиоксиэтиленгликоля [Brij^® 35]. Применение поверхностно-активного вещества в водных композициях хорошо известно специалистам в данной области. Для удобства приведена ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995. В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит моноолеат сорбитана [Tween^® 80]. В конкретных вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению содержит поверхностно-активное вещество, которое является нечувствительным к окислению, например, алкилсахариды. В другом варианте осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой происходящее из овощей поверхностно-активное вещество и/или не содержит нефтепродуктов, и/или получено без использования нефтепродуктов.

В одном варианте осуществления концентрация поверхностно-активного вещества составляет по меньшей мере 0,001% об./об., предпочтительно 0,001-0,1% об./об., предпочтительно 0,002-0,3% об./об., более предпочтительно 0,003 до 0,1% об./об., и наиболее предпочтительно приблизительно 0,005% об./об. В другом варианте осуществления концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0% об./об. В одном варианте осуществления концентрация моноолеата полиоксиэтиленсорбитана (20) [Tween^® 80] составляет по меньшей мере 0,001% об./об., предпочтительно, 0,001-0,1% об./об., предпочтительно 0,002-0,3% об./об., более предпочтительно, 0,003-0,1% об./об., и наиболее предпочтительно, приблизительно 0,005% об./об.

Буфер

Композиция по изобретению может содержать забуферивающее средство. Как применяют в настоящем документе, «забуферивающие средства» или «буферы» относится к средствам, которые поддерживают pH препарата в диапазоне, где введение препарата (например, внутривенное или подкожное) в норме является хорошо переносимым (например, pH 5-9) и, более того, исключают сдвиги pH и защищают активное вещество от индуцированного pH стресса или разрушения в ходе лиофилизации. Типичными примерами веществ, используемых в качестве буферных веществ, являются например, карбонат, фосфат, цитрат, борат, 2-амино-2-гидроксиметил-1,-3-пропандиол [=TRIS], гистидин, глицин.

Буфер (или забуферивающие средства) можно выбирать из группы, состоящей из ацетата, бензоата, карбоната, цитрата, глицилглицина, Hepes, гистидина, глицина и TRIS, бицина, трицина, сукцината, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или их смесей. В одном варианте осуществления изобретения концентрация забуферивающего вещества составляет 1-200 мМ, например, такая как 1-150 мМ или 1-50 мМ, или 1-25 мМ, или 5-20 мМ, или 5-15 мМ.

Композиция по изобретению как правило, обладает pH от 4 до 10. В другом варианте осуществления композиция обладает pH 5,0-9,0 или 6,0-8,0, или 6,5-7,5 или 6,8-7,2 или приблизительно 7. В других вариантах осуществления pH композиции составляет 5,5±0,2, 5,6±0,2, 5,7±0,2, 5,8±0,2, 5,9±0,2, 6,0±0,2, 6,1±0,2, 6,2±0,2, 6,3±0,2, 6,4±0,2, 6,5±0,2, 6,6±0,2, 6,7±0,2, 6,8±0,2, 6,9±0,2, 7,0±0,2, 7,1±0,2, 7,2±0,2, 7,3±0,2, 7,4±0,2 или 7,5±0,2. В других вариантах осуществления pH композиции составляет 5,5±0,1, 5,6±0,1, 5,7±0,1, 5,8±0,1, 5,9±0,1, 6,0±0,1, 6,1±0,1, 6,2±0,1, 6,3±0,1, 6,4±0,1, 6,5±0,1, 6,6±0,1, 6,7±0,1, 6,8±0,1, 6,9±0,1, 7,0±0,1, 7,1±0,1, 7,2±0,1, 7,3±0,1, 7,4±0,1 или 7,5±0,1. В других вариантах осуществления pH стабилизирующего состава составляет 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 06,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 или 8,0.

Углеводы

Композиция по изобретению может дополнительно содержать углевод. Как применяют в настоящем документе, «углеводы» относится к сахарам, таким как моно-, ди- или полисахариды, или водорастворимые глюканы, включая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, маннит, сорбозу, сорбит, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, галактозу, декстран, трегалозу, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и карбоксиметилцеллюлозу, которые можно использовать.

Углевод можно, например, выбирать из группы из моно-, ди- или полисахаридов (включая, например, моносахариды фруктозу, глюкозу, маннозу, галактозу, дисахариды лактозу, сахарозу, трегалозуу, мальтозу и полисахариды декстран, рафинозу, стахиозу).

В одном варианте осуществления изобретения композиция FVIII содержит один или несколько углеводов из группы из: сахарозы, рафинозы, трегалозы или их смесей. В одном варианте осуществления композиция FVIII содержит углевод в концентрации 2-10% масс./масс., предпочтительно 3-8% масс./масс., предпочтительно 4-6% масс./масс. и наиболее предпочтительно, 5% масс./масс. В другом варианте осуществления концентрация углевода составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% масс./масс.

В конкретных вариантах осуществления углевод представляет собой сахарозу. В одном варианте осуществления композиция FVIII содержит сахарозу в концентрации 2-10% масс./масс., предпочтительно, 3-8% масс./масс., предпочтительно, 4-6% масс./масс. и наиболее предпочтительно, 5% масс./масс. В другом варианте осуществления концентрация сахарозы составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% масс./масс.

В конкретных вариантах осуществления углевод представляет собой трегалозу. В одном варианте осуществления композиция FVIII содержит трегалозу в концентрации 2-10% масс./масс., предпочтительно, 3-8% масс./масс., предпочтительно, 4-6% масс./масс. и наиболее предпочтительно, 5% масс./масс. В другом варианте осуществления концентрация трегалозы составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% масс./масс.

В конкретных вариантах осуществления углевод представляет собой рафинозу. В одном варианте осуществления композиция FVIII содержит рафинозу в концентрации 2-10% масс./масс., предпочтительно, 3-8% масс./масс., предпочтительно, 4-6% масс./масс. и наиболее предпочтительно 5% масс./масс. В другом варианте осуществления концентрация рафинозы составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% масс./масс.

Аминокислоты

В одном варианте осуществления композиция по изобретению дополнительно содержит одну или несколько аминокислот, отличным от гистидина. Как применяют в настоящем документе, «аминокислоты» относится к любой природной или неприродной фармацевтически приемлемой аминокислоте. Неограничивающие примеры аминокислот включают в себя изолейцин, аланин, лейцин, аспарагин, лизин, аспарагиновую кислоту, метионин, цистеин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, треонин, глутамин, триптофан, глицин, валин, пролин, селеноцистеин, серин, тирозин, аргинин, гистидин, орнитин, таурин и т.п. Аминокислоту, отличную от гистидина, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина, метионина, фенилаланина, изолейцина, лейцина и их сочетаний.

В одном варианте осуществления водная композиция содержит аргинин и изолейцин.

В одном варианте осуществления водная композиция содержит аргинин, глутаминовую кислоту и фенилаланин.

В одном варианте осуществления водная композиция содержит аргинин, глутаминовую кислоту, фенилаланин и метионин.

В одном варианте осуществления водная композиция содержит аргинин, изолейцин и метионин.

В одном варианте осуществления водная композиция содержит глутамин, глутаминовую кислоту, изолейцин и метионин.

В одном варианте осуществления концентрация аминокислоты, отличной от гистидина, составляет по меньшей мере 0,2 мМ, предпочтительно, 1-300 мМ, предпочтительно, 5-300 мМ, предпочтительно, 10-200 мМ, предпочтительно, 55-150 мМ, предпочтительно, 25-100 мМ, предпочтительно, 40-180 мМ, предпочтительно, 50-90 мМ. В другом варианте осуществления концентрация аминокислоты, отличной от гистидина, составляет 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 мМ.

В одном варианте осуществления концентрация аргинина составляет по меньшей мере 1 мМ, предпочтительно, 5-300 мМ, предпочтительно, 10-200 мМ, предпочтительно, 55-150 мМ, предпочтительно, 25-100 мМ, предпочтительно, 40-180 мМ, предпочтительно, 50-90 мМ. В другом варианте осуществления концентрация аргинина составляет 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 мМ.

В одном варианте осуществления концентрация изолейцина составляет по меньшей мере 1 мМ, предпочтительно, 5-300 мМ, предпочтительно, 10-200 мМ, предпочтительно, 55-150 мМ, предпочтительно, 25-100 мМ, предпочтительно, 40-180 мМ, предпочтительно, 50-90 мМ. В другом варианте осуществления концентрация изолейцина составляет 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 мМ.

В одном варианте осуществления концентрация глутаминовой кислоты составляет по меньшей мере 1 мМ, предпочтительно, 5-300 мМ, предпочтительно, 10-200 мМ, предпочтительно, 55-150 мМ, предпочтительно, 25-100 мМ, предпочтительно, 40-180 мМ, предпочтительно, 50-90 мМ. В другом варианте осуществления концентрация глутаминовой кислоты составляет 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 мМ.

В одном варианте осуществления концентрация фенилаланина составляет по меньшей мере 1 мМ, предпочтительно 5 до 200 мМ, предпочтительно 10 до 160 мМ, предпочтительно 55 до 150 мМ, предпочтительно 25 до 100 мМ, предпочтительно 40 до 180 мМ, предпочтительно 50 до 90 мМ. В другом варианте осуществления концентрация фенилаланина составляет 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 мМ.

Антиоксиданты

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать один или несколько антиоксидант(антиоксидантов). «Антиоксидант» в значении, предусмотренном по настоящему изобретению, представляет собой фармацевтически совместимое соединение или композицию, которые замедляют, ингибируют, прерывают и/или останавливают процессы окисления. Антиоксиданты включают в себя, в частности, следующие вещества: токоферолы и их сложные эфиры, восстановленный глутатион, метионин, монотиоглицерин, цистеин, гомоцистеин, цистатионин, витамин A, сезамол из кунжутного масла, кониферилбензоат из бензойной смолы, нордигидрогуайаретовую смолу и нордигидрогуайаретовую кислоту (NDGA), галлаты (наряду с другими, метил-, этил-, пропил-, амил-, бутил-, лаурилгаллаты), бутилированный гидроксианизол (BHAIBHT, также бутил-п-крезол); аскорбиновую кислоту и ее соли и сложные эфиры (например, аскорбилпальмитат), эриторбиновую кислоту (изоаскорбиновая кислота) и ее соли и сложные эфиры, монотиоглицерин, формальдегид-сульфоксилат натрия, метабисульфит натрия, бисульфит натрия, сульфит натрия, метабисульфит калия, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол (BHT), пропионовую кислоту. Типичными антиоксидантами являются токоферол, например, такой как, a-токоферол и его сложные эфиры, бутилированный гидрокситолуол и бутилированный гидроксианизол. Термин «токоферол» включает в себя также сложные эфиры токоферола. Известный токоферол представляет собой a-токоферол. Термин «a-токоферол» включает в себя сложные эфиры a-токоферола (например, ацетат a-токоферола). В одном варианте осуществления изобретения антиоксидант представляет собой метионин, например, L-метионин.

В одном варианте осуществления концентрация антиоксиданта составляет по меньшей мере 0,05 мМ, предпочтительно, 0,05-100 мМ, предпочтительно, 0,1-80 мМ, предпочтительно, 0,2-50 мМ, предпочтительно, 0,5-70 мМ, предпочтительно, 1-25 мМ, предпочтительно, 0,1-20 мМ, предпочтительно, 0,25-1 мМ. В другом варианте осуществления концентрация антиоксиданта составляет 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 или 100,0 мМ.

В одном варианте осуществления концентрация метионина составляет по меньшей мере 0,05 мМ, предпочтительно, 0,05-100 мМ, предпочтительно, 0,1-80 мМ, предпочтительно, 0,2-50 мМ, предпочтительно, 0,5-70 мМ, предпочтительно, 1-25 мМ, предпочтительно, 0,1-20 мМ, предпочтительно, 0,25-5 мМ. В другом варианте осуществления концентрация метионина составляет 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 или 100,0 мМ.

В одном варианте осуществления концентрация глутатиона составляет по меньшей мере 0,05 мМ, предпочтительно, 0,05-100 мМ, предпочтительно, 0,1-80 мМ, предпочтительно, 0,2-50 мМ, предпочтительно, 0,5-70 мМ, предпочтительно, 1-25 мМ, предпочтительно, 0,1-20 мМ, предпочтительно, 0,25-1 мМ. В другом варианте осуществления концентрация глутатиона составляет 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 или 100,0 мМ.

Стабилизаторы

Композиция по настоящему изобретению может содержать стабилизатор. Как применяют в настоящем документе, «стабилизатор» относится к химическому веществу (другими синонимами являются, например, «сорастворитель», «coрастворенное вещество», «химическая добавка»; «наполнитель»), которое способствует стабилизации лабильного лекарственного средства в водном составе либо в растворенном состоянии, либо во время замораживания-размораживания, а также лиофилизации и последующего хранения дегидратированного лиофилизата. Примеры подходящих стабилизаторов для составов и способов, представленных в настоящем документе, включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, забуферивающие средства (например, TRIS, HEPES, аминокислоты и т.д.), осмолиты (например, сахара, сахарные спирты и т.д.), криопротекторы/лиопротекторы (например, спирты, такие как глицерин, метанол, изопропанол; сахара, так как сахароза, ксилит, декстроза, трегалоза; карбоновые кислоты и карбоксилаты, такие как молочная кислота и лактаты, яблочная кислота и малеаты; ПЭГ, такие как этиленгликоль, ПЭГ 200, ПЭГ 2000, ПЭГ 20000; полимеры, такие как поливинилпирролидоны, PVP 12, PVP 17, PVP 30; наполнители (например, аминокислоты, полиолы, такие как маннит и т.д.), соли, полимеры, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты и т.п.

Концентрация стабилизатора зависит от химической природы средства и может быть выбрана в соответствии с описанием в настоящем документе выше.

Стабильность

В конкретном варианте осуществления композиций, представленных выше, композиция является стабильной. Термин «стабильный», как применяют в настоящем документе, означает, что активность композиции, как измерено посредством анализа активности FVIII, после хранения в течение какого-то периода времени, составляет по меньшей мере 80% от активности до хранения. Если не указано иначе в настоящем документе, тестирование стабильности проводят, как описано в документе CPMP/ICH/2736/99 из European Medicines Agency, озаглавленном «NOTE FOR GUIDANCE ON STABILITY TESTING: STABILITY TESTING OF NEW DRUG SUBSTANCES AND PRODUCTS» от августа 2003.

В серии вариантов осуществления, композиция, представленная в настоящем документе, после лиофилизации является стабильной в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или более месяцев (25°C; 40% относительная влажность [RH]). В предпочтительном варианте осуществления лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев (25°C; 40% RH). В более предпочтительном варианте осуществления, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 12 месяцев (25°C; 40% RH). В другом предпочтительном варианте осуществления, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 18 месяцев (25°C; 40% RH). В другом предпочтительном варианте осуществления, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 24 месяцев (25°C; 40% RH). В другом предпочтительном варианте осуществления, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 36 месяцев (25°C; 40% RH).

В конкретном варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 25°C/40% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 30°C/40% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев при хранении при 40°C/40% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 25°C/60% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 30°C/60% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев при хранении при 40°C/60% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 25°C/65% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 30°C/65% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев при хранении при 40°C/65% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 25°C/75% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 30°C/75% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев при хранении при 40°C/75% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 25°C/25% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев, даже более предпочтительно, в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 30°C/25% RH.

В другом варианте осуществления композиций, представленных выше, лиофилизированная композиция является стабильной в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 месяцев, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 24 месяцев при хранении при 40°C/25% RH.

Предпочтительно, количество высокомолекулярных компонентов, как определено по SE-ВЭЖХ, после хранения лиофилизированной композиции в условиях, определенных выше, составляет 3% или менее. Количество высокомолекулярных компонентов определяют посредством SE-ВЭЖХ, как описано в примерах этой заявки.

В одном варианте осуществления композиция является стабильной в течение по меньшей мере 48 часов, предпочтительно, в течение по меньшей мере 72 часов, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 96 часов, наиболее предпочтительно, в течение по меньшей мере одной недели, при хранении в жидком состоянии при 4°C. Водная композиция, как правило, сохраняет по меньшей мере 80% от активности фактора VIII в течение по меньшей мере 48 часов, предпочтительно, в течение по меньшей мере 72 часов, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 96 часов, наиболее предпочтительно, в течение по меньшей мере одной недели, при хранении в жидком состоянии при 2-8°C. Это относится к водной композиции до лиофилизации и/или к водной композиции после лиофилизации и восстановления в водном растворе, например, в дистиллированной воде.

В конкретном варианте осуществления композиций, представленных выше, композиция сохраняет по меньшей мере 85% от активности фактора VIII в течение по меньшей мере 48 часов, предпочтительно, в течение по меньшей мере 72 часов, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 96 часов, наиболее предпочтительно, в течение по меньшей мере одной недели, при хранении в жидком состоянии при 4°C. Это относится к водной композиции до лиофилизации и/или к водной композиции после лиофилизации и восстановления в водном растворе, например, в дистиллированной воде.

В конкретном варианте осуществления композиций, представленных выше, композиция сохраняет по меньшей мере 90% от активности фактора VIII в течение по меньшей мере 48 часов, предпочтительно, в течение по меньшей мере 72 часов, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 96 часов, наиболее предпочтительно, в течение по меньшей мере одной недели, при хранении в жидком состоянии при 4°C. Это относится к водной композиции до лиофилизации и/или к водной композиции после лиофилизации и восстановления в водном растворе, например, в дистиллированной воде.

В конкретном варианте осуществления изобретения для композиции показана небольшая мутность или отсутствие мутности, например, до лиофилизации или после лиофилизации и восстановления в воде. Как применяют в настоящем документе, термин «мутность» относится к опалесценции раствора. Мутность можно определять визуально или инструментально, как описано в Pharm. Eur. 8.0, section 2.2.1. «Clarity and degree of opalescence of liquids». Любая ссылка на мутность в настоящей заявке относится к способам, описанным в Pharm. Eur. 8.0, section 2.2.1. «Clarity and degree of opalescence of liquids».

В одном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению обладает мутностью 18 НЕФ или менее. В другом варианте осуществления композиция по настоящему изобретению обладает мутностью 6 НЕФ или менее. В другом варианте осуществления композиция по настоящему изобретению обладает мутностью 3 НЕФ или менее. Эти значения мутности получают до лиофилизации и после лиофилизации и восстановления в дистиллированной воде.

В другом варианте осуществления композиция по настоящему изобретению является прозрачной. По настоящей заявке, композицию или раствор считают «прозрачными», когда их опалесценция выражена не более, чем у «эталонной суспензии III», описанной в Pharm. Eur. 8,0, section 2.2.1. «Clarity and degree of opalescence of liquids». При ссылке в настоящем документе на то, что композиция «не обладает мутностью» или является «свободной от мутности», следует понимать, что композиция является «прозрачной» в соответствии с этим определением.

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 1), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween® 80 [%масс./масс] Сахароза [%масс./масс.] композиция 1 100 52 100 10 0,004 5 композиция 2 100 40 100 10 0,005 5 композиция 3 100 50 100 10 0,005 5 композиция 4 100 60 100 10 0,005 5 композиция 5 100 70 100 10 0,005 5 композиция 6 100 80 100 10 0,005 5 композиция 7 100 95 100 10 0,005 5 композиция 8 100 50 100 7 0,005 5 композиция 9 100 50 100 10 0,005 5 композиция 10 100 50 100 15 0,005 5 композиция 11 100 50 100 20 0,005 5 композиция 12 100 65 100 10 0,005 5 композиция 13 100 65 100 5,5 0,005 5 композиция 14 100 65 55 10 0,005 5 композиция 15 100 65 30 10 0,005 5 композиция 16 100 65 10 10 0,005 5

Кроме того, предпочтительными являются следующие композиции (таблица 2), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween® 80 [%масс./масс.] Сахароза [%масс./масс.] композиция 17 200 52 100 10 0,004 5 композиция 18 200 40 100 10 0,005 5 композиция 19 200 50 100 10 0,005 5 Композиция 20 200 60 100 10 0,005 5 композиция 21 200 70 100 10 0,005 5 композиция 22 200 80 100 10 0,005 5 композиция 23 200 95 100 10 0,005 5 композиция 24 200 50 100 7 0,005 5 композиция 25 200 50 100 10 0,005 5 композиция 27 200 50 100 15 0,005 5 композиция 28 200 50 100 20 0,005 5 композиция 29 200 65 100 10 0,005 5 композиция 30 200 65 100 5,5 0,005 5 композиция 31 200 65 55 10 0,005 5 композиция 32 200 65 30 10 0,005 5 композиция 33 200 65 10 10 0,005 5

Кроме того, предпочтительными являются следующие композиции (таблица 3), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween®80
[%масс./масс.] Сахароза
[%масс./масс.] композиция 34 400 52 100 10 0,004 5 композиция 35 400 40 100 10 0,005 5 композиция 36 400 50 100 10 0,005 5 композиция 37 400 60 100 10 0,005 5 композиция 38 400 70 100 10 0,005 5 композиция 39 400 80 100 10 0,005 5 композиция 40 400 95 100 10 0,005 5 композиция 41 400 50 100 7 0,005 5 композиция 42 400 50 100 10 0,005 5 композиция 43 400 50 100 15 0,005 5 композиция 44 400 50 100 20 0,005 5 композиция 45 400 65 100 10 0,005 5 композиция 46 400 65 100 5,5 0,005 5 композиция 47 400 65 55 10 0,005 5 композиция 48 400 65 30 10 0,005 5 композиция 49 400 65 10 10 0,005 5

Кроме того, предпочтительными являются следующие композиции (таблица 4), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween® 80
[%масс./масс.] Сахароза
[%масс./масс.] композиция 50 800 52 100 10 0,004 5 композиция 51 800 40 100 10 0,005 5 композиция 52 800 50 100 10 0,005 5 композиция 53 800 60 100 10 0,005 5 композиция 54 800 70 100 10 0,005 5 композиция 55 800 80 100 10 0,005 5 композиция 56 800 95 100 10 0,005 5 композиция 57 800 50 100 7 0,005 5 композиция 58 800 50 100 10 0,005 5 композиция 59 800 50 100 15 0,005 5 композиция 60 800 50 100 20 0,005 5 композиция 61 800 65 100 10 0,005 5 композиция 62 800 65 100 5,5 0,005 5 композиция 63 800 65 55 10 0,005 5 композиция 64 800 65 30 10 0,005 5 композиция 65 800 65 10 10 0,005 5

Кроме того, предпочтительными являются следующие композиции (таблица 5), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween®80 [%масс./масс.] Сахароза [%масс./масс.] композиция 66 1200 52 100 10 0,004 5 композиция 67 1200 40 100 10 0,005 5 композиция 68 1200 50 100 10 0,005 5 композиция 69 1200 60 100 10 0,005 5 композиция 70 1200 70 100 10 0,005 5 композиция 71 1200 80 100 10 0,005 5 композиция 72 1200 95 100 10 0,005 5 композиция 73 1200 50 100 7 0,005 5 композиция 74 1200 50 100 10 0,005 5 композиция 75 1200 50 100 15 0,005 5 композиция 76 1200 50 100 20 0,005 5 композиция 77 1200 65 100 10 0,005 5 композиция 78 1200 65 100 5,5 0,005 5 композиция 79 1200 65 55 10 0,005 5 композиция 80 1200 65 30 10 0,005 5 композиция 81 1200 65 10 10 0,005 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 6), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween® 80
[%масс./масс.] Сахароза
[%масс./масс.] композиция 82 1500 52 100 10 0,004 5 композиция 83 1500 40 100 10 0,005 5 композиция 84 1500 50 100 10 0,005 5 композиция 85 1500 60 100 10 0,005 5 композиция 86 1500 70 100 10 0,005 5 композиция 87 1500 80 100 10 0,005 5 композиция 88 1500 95 100 10 0,005 5 композиция 89 1500 50 100 7 0,005 5 композиция 90 1500 50 100 10 0,005 5 композиция 91 1500 50 100 15 0,005 5 композиция 92 1500 50 100 20 0,005 5 композиция 93 1500 65 100 10 0,005 5 композиция 94 1500 65 100 5,5 0,005 5 композиция 95 1500 65 55 10 0,005 5 композиция 96 1500 65 30 10 0,005 5 композиция 97 1500 65 10 10 0,005 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 7), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween®80
[%масс./масс.] Сахароза
[%масс./масс.] композиция 98 2500 52 100 10 0,004 5 композиция 99 2500 40 100 10 0,005 5 композиция 100 2500 50 100 10 0,005 5 композиция 101 2500 60 100 10 0,005 5 композиция 102 2500 70 100 10 0,005 5 композиция 103 2500 80 100 10 0,005 5 композиция 104 2500 95 100 10 0,005 5 композиция 105 2500 50 100 7 0,005 5 композиция 106 2500 50 100 10 0,005 5 композиция 107 2500 50 100 15 0,005 5 композиция 108 2500 50 100 20 0,005 5 композиция 109 2500 65 100 10 0,005 5 композиция 110 2500 65 100 5,5 0,005 5 композиция 111 2500 65 55 10 0,005 5 композиция 112 2500 65 30 10 0,005 5 композиция 113 2500 65 10 10 0,005 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 8), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween® 80 [%масс./масс.] Сахароза [%масс./масс.] Аргинин [мМ] Изолейцин [мМ] Глутамат [мМ] Фенилаланин [мМ] Метионин [мМ] Глутатион [мМ] композиция 114 100 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- -- композиция 115 100 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- 50 -- композиция 116 100 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 -- -- композиция 117 100 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 -- композиция 118 100 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- 5 композиция 119 100 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 5 композиция 120 100 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 -- композиция 121 100 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 9), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween®80 [%масс./масс.] Сахароза [%масс./масс.] Аргинин [мМ] Изолейцин [мМ] Глутамат [мМ] Фенилаланин [мМ] Метионин [мМ] Глутатион [мМ] композиция 122 200 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- -- композиция 123 200 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- 50 -- композиция 124 200 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 -- -- композиция 125 200 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 -- композиция 126 200 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- 5 композиция 127 200 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 5 композиция 128 200 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 -- композиция 129 200 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 10), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween®80 [%масс./масс.] Сахароза [%масс./масс.] Аргинин [мМ] Изолейцин [мМ] Глутамат [мМ] Фенилаланин [мМ] Метионин [мМ] Глутатион [мМ] композиция 130 400 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- -- композиция 131 400 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- 50 -- композиция 132 400 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 -- -- композиция 133 400 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 -- композиция 134 400 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- 5 композиция 135 400 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 5 композиция 136 400 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 -- композиция 137 400 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 11), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween®80 [%масс./масс.] Сахароза [%масс./масс.] Аргинин [мМ] Изолейцин [мМ] Глутамат [мМ] Фенилаланин [мМ] Метионин [мМ] Глутатион [мМ] композиция 138 800 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- -- композиция 139 800 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- 50 -- композиция 140 800 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 -- -- композиция 141 800 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 -- композиция 142 800 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- 5 композиция 143 800 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 5 композиция 144 800 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 -- композиция 145 800 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 12), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween®80 [%масс./масс.] Сахароза [%масс./масс.] Аргинин [мМ] Изолейцин [мМ] Глутамат [мМ] Фенилаланин [мМ] Метионин [мМ] Глутатион [мМ] композиция 146 1200 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- -- композиция 147 1200 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- 50 -- композиция 148 1200 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 -- -- композиция 149 1200 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 -- композиция 150 1200 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- 5 композиция 151 1200 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 5 композиция 152 1200 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 -- композиция 153 1200 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 13), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween®80 [%масс./масс.] Сахароза [%масс./масс.] Аргинин [мМ] Изолейцин [мМ] Глутамат [мМ] Фенилаланин [мМ] Метионин [мМ] Глутатион [мМ] композиция 154 1500 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- -- композиция 155 1500 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- 50 -- композиция 156 1500 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 -- -- композиция 157 1500 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 -- композиция 158 1500 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- 5 композиция 159 1500 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 5 композиция 160 1500 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 -- композиция 161 1500 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 14), содержащие:

FVIII [МЕ/мл] NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween®80 [%масс./масс.] Сахароза [%масс./масс.] Аргинин [мМ] Изолейцин [мМ] Глутамат [мМ] Фенилаланин [мМ] Метионин [мМ] Глутатион [мМ] композиция 162 2500 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- -- композиция 163 2500 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- 50 -- композиция 164 2500 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 -- -- композиция 165 2500 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 -- композиция 166 2500 80 100 10 0,005 5 25 25 -- -- -- 5 композиция 167 2500 80 100 10 0,005 5 25 -- 25 25 50 5 композиция 168 2500 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 -- композиция 169 2500 80 100 10 0,005 5 100 -- 100 50 50 5

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 15), содержащие:

NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Сахароза [%масс./масс.] композиция 170 40-195 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 2-10 композиция 171 40-195 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 3-8 композиция 172 40-195 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 4-6 композиция 173 40-195 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 5 композиция 174 40-195 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 2-10 композиция 175 40-195 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 3-8 композиция 176 40-195 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 4-6 композиция 177 40-195 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 5 композиция 178 40-195 по меньшей мере 20 8-20 2-10 композиция 179 40-195 по меньшей мере 20 8-20 3-8 композиция 180 40-195 по меньшей мере 20 8-20 4-6 композиция 181 40-195 по меньшей мере 20 8-20 5 композиция 182 40-195 по меньшей мере 20 8-50 2-10 композиция 183 40-195 по меньшей мере 20 8-50 3-8 композиция 184 40-195 по меньшей мере 20 8-50 4-6 композиция 185 40-195 по меньшей мере 20 8-50 5 композиция 186 40-195 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 2-10 композиция 187 40-195 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 3-8 композиция 188 40-195 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 4-6 композиция 189 40-195 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 5 композиция 190 40-195 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 2-10 композиция 191 40-195 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 3-8 композиция 192 40-195 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 4-6 композиция 193 40-195 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 5 композиция 194 40-195 по меньшей мере 50 6,5-20 2-10 композиция 195 40-195 по меньшей мере 50 6,5-20 3-8 композиция 196 40-195 по меньшей мере 50 6,5-20 4-6 композиция 197 40-195 по меньшей мере 50 6,5-20 5 композиция 198 40-195 по меньшей мере 50 6,5-50 2-10 композиция 199 40-195 по меньшей мере 50 6,5-50 3-8 композиция 200 40-195 по меньшей мере 50 6,5-50 4-6 композиция 201 40-195 по меньшей мере 50 6,5-50 5 композиция 202 40-195 50-100 по меньшей мере 6,5 2-10 композиция 203 40-195 50-100 по меньшей мере 6,5 3-8 композиция 204 40-195 50-100 по меньшей мере 6,5 4-6 композиция 205 40-195 50-100 по меньшей мере 6,5 5 композиция 206 40-195 50-100 по меньшей мере 10 2-10 композиция 207 40-195 50-100 по меньшей мере 10 3-8 композиция 208 40-195 50-100 по меньшей мере 10 4-6 композиция 209 40-195 50-100 по меньшей мере 10 5 NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Сахароза [% масс./масс.] композиция 210 40-195 50-100 6,5-20 2-10 композиция 211 40-195 50-100 6,5-20 3-8 композиция 212 40-195 50-100 6,5-20 4-6 композиция 213 40-195 50-100 6,5-20 5 композиция 214 40-195 50-100 6,5-50 2-10 композиция 215 40-195 50-100 6,5-50 3-8 композиция 216 40-195 50-100 6,5-50 4-6 композиция 217 40-195 50-100 6,5-50 5 композиция 218 40-195 100 по меньшей мере 4 2-10 композиция 219 40-195 100 по меньшей мере 4 3-8 композиция 220 40-195 100 по меньшей мере 4 4-6 композиция 221 40-195 100 по меньшей мере 4 5 композиция 222 40-195 100 по меньшей мере 10 2-10 композиция 223 40-195 100 по меньшей мере 10 3-8 композиция 224 40-195 100 по меньшей мере 10 4-6 композиция 225 40-195 100 по меньшей мере 10 5 композиция 226 40-195 100 4-20 2-10 композиция 227 40-195 100 4-20 3-8 композиция 228 40-195 100 4-20 4-6 композиция 229 40-195 100 4-20 5 композиция 230 40-195 100 4-50 2-10 композиция 231 40-195 100 4-50 3-8 композиция 232 40-195 100 4-50 4-6 композиция 233 40-195 100 4-50 5

В другом варианте осуществления композиции 170-233 дополнительно содержат поверхностно-активное вещество, например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (20) [например, Tween® 80], предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,001% масс./масс.

В другом варианте осуществления композиции 170-233 дополнительно содержат одну или несколько аминокислот, отличных от гистидина. Другая аминокислота выбрана из списка, состоящего из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина, метионина, фенилаланина, изолейцина или их смесей, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 1 мМ.

В другом варианте осуществления композиции 170-233 дополнительно содержат антиоксидант, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,05 мМ. Примеры антиоксидантов включают в себя, но без ограничения, восстановленный глутатион, метионин, цистеин, сульфит натрия, витамин A, витамин E, аскорбиновая кислота, аскорбат натрия и их смеси. В одном варианте осуществления изобретения антиоксидант представляет собой метионин, например, L- метионин.

В другом варианте осуществления композиции 170-233 обладают pH 6,0-8,0 или 6,5-7,5, или 6,8-7,2, или 7.

В другом варианте осуществления композиции 170-233 дополнительно содержат

a. моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (20) [например, Tween^® 80] в качестве поверхностно-активного вещества, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,001% масс./масс.,

b. одну или несколько аминокислот, отличных от гистидина, выбранных из списка, состоящего из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина, метионина, фенилаланина, изолейцина или их смесей, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 1 мМ,

c. антиоксидант, выбранный из списка, состоящего из восстановленного глутатиона, метионина, цистеина, сульфита натрия, витамина A, витамина E, аскорбиновой кислоты, аскорбата натрия и их смесей, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,05 мМ и

d. композиции обладают pH 6,0-8,0 или 6,5-7,5, или 6,8-7,2, или 7.

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 16), содержащие:

NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Сахароза [%масс./масс.] композиция 234 50-95 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 2-10 композиция 235 50-95 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 3-8 композиция 236 50-95 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 4-6 композиция 237 50-95 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 5 композиция 238 50-95 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 2-10 композиция 239 50-95 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 3-8 композиция 240 50-95 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 4-6 композиция 241 50-95 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 5 композиция 242 50-95 по меньшей мере 20 8-20 2-10 композиция 243 50-95 по меньшей мере 20 8-20 3-8 композиция 244 50-95 по меньшей мере 20 8-20 4-6 композиция 245 50-95 по меньшей мере 20 8-20 5 NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Сахароза [%масс./масс.] композиция 246 50-95 по меньшей мере 20 8-50 2-10 композиция 247 50-95 по меньшей мере 20 8-50 3-8 композиция 248 50-95 по меньшей мере 20 8-50 4-6 композиция 249 50-95 по меньшей мере 20 8-50 5 композиция 250 50-95 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 2-10 композиция 251 50-95 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 3-8 композиция 252 50-95 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 4-6 композиция 253 50-95 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 5 композиция 254 50-95 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 2-10 композиция 255 50-95 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 3-8 композиция 256 50-95 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 4-6 композиция 257 50-95 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 5 композиция 258 50-95 по меньшей мере 50 6,5-20 2-10 композиция 259 50-95 по меньшей мере 50 6,5-20 3-8 композиция 260 50-95 по меньшей мере 50 6,5-20 4-6 композиция 261 50-95 по меньшей мере 50 6,5-20 5 композиция 262 50-95 по меньшей мере 50 6,5-50 2-10 композиция 263 50-95 по меньшей мере 50 6,5-50 3-8 композиция 264 50-95 по меньшей мере 50 6,5-50 4-6 композиция 265 50-95 по меньшей мере 50 6,5-50 5 композиция 266 50-95 50-100 по меньшей мере 6,5 2-10 композиция 267 50-95 50-100 по меньшей мере 6,5 3-8 композиция 268 50-95 50-100 по меньшей мере 6,5 4-6 композиция 269 50-95 50-100 по меньшей мере 6,5 5 композиция 270 50-95 50-100 по меньшей мере 10 2-10 композиция 271 50-95 50-100 по меньшей мере 10 3-8 композиция 272 50-95 50-100 по меньшей мере 10 4-6 композиция 273 50-95 50-100 по меньшей мере 10 5 композиция 274 50-95 50-100 6,5-20 2-10 композиция 275 50-95 50-100 6,5-20 3-8 композиция 276 50-95 50-100 6,5-20 4-6 композиция 277 50-95 50-100 6,5-20 5 композиция 278 50-95 50-100 6,5-50 2-10 композиция 279 50-95 50-100 6,5-50 3-8 композиция 280 50-95 50-100 6,5-50 4-6 композиция 281 50-95 50-100 6,5-50 5 композиция 282 50-95 100 по меньшей мере 4 2-10 композиция 283 50-95 100 по меньшей мере 4 3-8 композиция 284 50-95 100 по меньшей мере 4 4-6 композиция 285 50-95 100 по меньшей мере 4 5 NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Сахароза [% масс./масс.] композиция 286 50-95 100 по меньшей мере 10 2-10 композиция 287 50-95 100 по меньшей мере 10 3-8 композиция 288 50-95 100 по меньшей мере 10 4-6 композиция 289 50-95 100 по меньшей мере 10 5 композиция 290 50-95 100 4-20 2-10 композиция 291 50-95 100 4-20 3-8 композиция 292 50-95 100 4-20 4-6 композиция 293 50-95 100 4-20 5 композиция 294 50-95 100 4-50 2-10 композиция 295 50-95 100 4-50 3-8 композиция 296 50-95 100 4-50 4-6 композиция 297 50-95 100 4-50 5

В другом варианте осуществления композиции 234-297 дополнительно содержат поверхностно-активное вещество, например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (20) [например, Tween® 80], предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,001% масс./масс.

В другом варианте осуществления композиции 234-297 дополнительно содержат одну или несколько аминокислот, отличных от гистидина. Другая аминокислота выбрана из списка, состоящего из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина, метионина, фенилаланина, изолейцина или их смесей, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 1 мМ.

В другом варианте осуществления композиции 234-297 дополнительно содержат антиоксидант, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,05 мМ. Примеры антиоксидантов включают в себя, но без ограничения, восстановленный глутатион, метионин, цистеин, сульфит натрия, витамин A, витамин E, аскорбиновую кислоту, аскорбат натрия и их смеси. В одном варианте осуществления изобретения антиоксидант представляет собой метионин, например, L-метионин.

В другом варианте осуществления композиции 234-297 обладают pH 6,0-8,0 или 6,5-7,5, или 6,8-7,2, или 7.

В другом варианте осуществления композиции 234-297 дополнительно содержат

e. моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (20) [например, Tween® 80] в качестве поверхностно-активного вещества, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,001% масс./масс.,

f. одну или несколько аминокислот, отличных от гистидина, выбранных из списка, состоящего из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина, метионина, фенилаланина, изолейцина или их смесей, предпочтительно в концентрации по меньшей мере 1 мМ,

g. антиоксидант, выбранный из списка, состоящего из восстановленного глутатиона, метионина, цистеина, сульфита натрия, витамина A, витамина E, аскорбиновой кислоты, аскорбата натрия и их смесей, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,05 мМ и

h. композиции обладают pH 6,0-8,0 или 6,5-7,5, или 6,8-7,2, или 7.

Предпочтительными являются следующие композиции (таблица 17), содержащие:

NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Сахароза [%масс./масс.] композиция 298 60-75, например65 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 2-10 композиция 299 60-75, например65 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 3-8 композиция 300 60-75, например65 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 4-6 композиция 301 60-75, например65 по меньшей мере 20 по меньшей мере 8 5 композиция 302 60-75, например65 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 2-10 композиция 303 60-75, например65 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 3-8 композиция 304 60-75, например65 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 4-6 композиция 305 60-75, например65 по меньшей мере 20 по меньшей мере 10 5 композиция 306 60-75, например65 по меньшей мере 20 8-20 2-10 композиция 307 60-75, например65 по меньшей мере 20 8-20 3-8 композиция 308 60-75, например65 по меньшей мере 20 8-20 4-6 композиция 309 60-75, например65 по меньшей мере 20 8-20 5 композиция 310 60-75, например65 по меньшей мере 20 8-50 2-10 композиция 311 60-75, например65 по меньшей мере 20 8-50 3-8 композиция 312 60-75, например65 по меньшей мере 20 8-50 4-6 композиция 313 60-75, например65 по меньшей мере 20 8-50 5 композиция 314 60-75, например65 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 2-10 композиция 315 60-75, например65 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 3-8 композиция 316 60-75, например65 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 4-6 композиция 317 60-75, например65 по меньшей мере 50 по меньшей мере 6,5 5 композиция 318 60-75, например65 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 2-10 композиция 319 60-75, например65 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 3-8 композиция 320 60-75, например65 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 4-6 композиция 321 60-75, например65 по меньшей мере 50 по меньшей мере 10 5 NaCl [мМ] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Сахароза [%масс./масс.] композиция 322 60-75, например65 по меньшей мере 50 6,5-20 2-10 композиция 323 60-75, например65 по меньшей мере 50 6,5-20 3-8 композиция 324 60-75, например65 по меньшей мере 50 6,5-20 4-6 композиция 325 60-75, например65 по меньшей мере 50 6,5-20 5 композиция 326 60-75, например65 по меньшей мере 50 6,5-50 2-10 композиция 327 60-75, например65 по меньшей мере 50 6,5-50 3-8 композиция 328 60-75, например65 по меньшей мере 50 6,5-50 4-6 композиция 329 60-75, например65 по меньшей мере 50 6,5-50 5 композиция 330 60-75, например65 50-100 по меньшей мере 6,5 2-10 композиция 331 60-75, например65 50-100 по меньшей мере 6,5 3-8 композиция 332 60-75, например65 50-100 по меньшей мере 6,5 4-6 композиция 333 60-75, например65 50-100 по меньшей мере 6,5 5 композиция 334 60-75, например65 50-100 по меньшей мере 10 2-10 композиция 335 60-75, например65 50-100 по меньшей мере 10 3-8 композиция 336 60-75, например65 50-100 по меньшей мере 10 4-6 композиция 337 60-75, например65 50-100 по меньшей мере 10 5 композиция 338 60-75, например65 50-100 6,5-20 2-10 композиция 339 60-75, например65 50-100 6,5-20 3-8 композиция 340 60-75, например65 50-100 6,5-20 4-6 композиция 341 60-75, например65 50-100 6,5-20 5 композиция 342 60-75, например65 50-100 6,5-50 2-10 композиция 343 60-75, например65 50-100 6,5-50 3-8 композиция 344 60-75, например65 50-100 6,5-50 4-6 композиция 345 60-75, например65 50-100 6,5-50 5 композиция 346 60-75, например65 100 по меньшей мере 6,5 2-10 композиция 347 60-75, например65 100 по меньшей мере 6,5 3-8 композиция 348 60-75, например65 100 по меньшей мере 6,5 4-6 композиция 349 60-75, например65 100 по меньшей мере 6,5 5 композиция 350 60-75, например65 100 по меньшей мере 10 2-10 композиция 351 60-75, например65 100 по меньшей мере 10 3-8 композиция 352 60-75, например65 100 по меньшей мере 10 4-6 композиция 353 60-75, например65 100 по меньшей мере 10 5 композиция 354 60-75, например65 100 6,5-20 2-10 композиция 355 60-75, например65 100 6,5-20 3-8 композиция 356 60-75, например65 100 6,5-20 4-6 композиция 357 60-75, например65 100 6,5-20 5 композиция 358 60-75, например65 100 6,5-50 2-10 композиция 359 60-75, например65 100 6,5-50 3-8 композиция 360 60-75, например65 100 6,5-50 4-6 композиция 361 60-75, например65 100 6,5-50 5

В другом варианте осуществления композиции 298-361 дополнительно содержат поверхностно-активное вещество, например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (20) [например, Tween® 80], предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,001% масс./масс.

В другом варианте осуществления композиции 298-361 дополнительно содержат одну или несколько аминокислот, отличных от гистидина. Другая аминокислота выбрана из списка, состоящего из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина, метионина, фенилаланина, изолейцина или их смесей, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 1 мМ.

В другом варианте осуществления композиции 298-361 дополнительно содержат антиоксидант, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,05 мМ. Примеры антиоксидантов включают в себя, но без ограничения, восстановленный глутатион, метионин, цистеин, сульфит натрия, витамин A, витамин E, аскорбиновую кислоту, аскорбат натрия и их смеси. В одном варианте осуществления изобретения антиоксидант представляет собой метионин, например, L- метионин.

В другом варианте осуществления композиции 298-361 обладают pH 6,0-8,0 или 6,5-7,5 или 6,8-7,2 или 7.

В другом варианте осуществления композиции 298-361 дополнительно содержат

i. моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (20) [например, Tween® 80] в качестве поверхностно-активного вещества, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,001% масс./масс.,

j. одну или несколько аминокислот, отличных от гистидина, выбранных из списка, состоящего из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина, метионина, фенилаланина, изолейцина или их смесей, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 1 мМ,

k. антиоксидант, выбранный из списка, состоящего из восстановленного глутатиона, метионина, цистеина, сульфита натрия, витамина A, витамина E, аскорбиновой кислоты, аскорбата натрия и их смесей, предпочтительно, в концентрации по меньшей мере 0,05 мМ и

l. композиции обладают pH 6,0-8,0 или 6,5-7,5, или 6,8-7,2, или 7.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к композициям, которые можно получать посредством лиофилизации водной композиции, описанной выше. В другом варианте осуществления изобретение относится к композициям, полученным посредством лиофилизации водной композиции, описанной выше.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к композициям, получаемым посредством восстановления лиофилизированной водной композиции, как описано выше, с помощью подходящего растворителя.

В конкретном варианте осуществления композицию получают посредством восстановления лиофилизированной водной композиции, как описано выше, с помощью подходящего растворителя, где подходящий растворитель представляет собой водный раствор.

В конкретном варианте осуществления композицию получают посредством восстановления лиофилизированной водной композиции, как описано выше, с помощью водного раствора, где водный раствор выбран из группы, содержащей раствор Рингера, раствор лактата Рингера и любой другой подходящий раствор для парентерального применения.

В конкретном варианте осуществления композицию получают посредством восстановления лиофилизированной водной композиции, как описано выше, с помощью водного раствора, где водный раствор представляет собой воду, предпочтительно, «воду для инъекций».

В конкретном варианте осуществления композицию получают посредством восстановления лиофилизированной водной композиции, как описано выше, с помощью водного раствора, где водный раствор представляет собой раствор хлорида натрия.

В конкретном варианте осуществления композицию получают посредством восстановления лиофилизированной водной композиции, как описано выше, с помощью водного раствора, где водный раствор представляет собой раствор гистидина.

Другим аспектом изобретения является применение композиций, описанных в настоящем документе, в лечении нарушения свертывания крови, например, гемофилии A.

В конкретном варианте осуществления композиций, представленных выше, композицию составляют для подкожного и/или внутримышечного введения.

Композиции вводят перорально, местно, чрескожно, парентерально, посредством спрея для ингаляции, вагинально, ректально или посредством интракраниальной инъекции, предпочтительно, парентерально. Термин парентерально, как применяют в настоящем документе, включает в себя подкожные инъекции, внутривенную, внутримышечную, интрацистернальную инъекцию или способы инфузии. Предусматривают также введение посредством внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургической имплантации в конкретном участке инъекции. Как правило, композиции являются в основном свободными от пирогенов (см., например, Ph. Eur. 7.0/2.06.08.00), а также других примесей, которые могут являться вредными для реципиента.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры осуществляли с использованием молекулы FVIII (SEQ ID NO:2; конструкция dBN(64-53), описанная в WO 2004/067566). Эта молекула FVIII обозначена как «CSL627» ниже.

Хромогенный анализ FVIII:C

Хромогенный анализ FVIII:C проводили с использованием набора Coamatic для тестирования FVIII (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA V. le Monza 338-20128 Milano, Italy).

Принцип анализа: В присутствии кальция и фосфолипида, фактор X активируется фактором IXa до фактора Xa. Эта реакция стимулируется посредством фактора VIIIa в качестве кофактора. FVIIIa формируется посредством низких количеств тромбина в реакционной смеси из FVIII в образце, подлежащем измерению. При использовании оптимальных концентраций Ca²⁺, фосфолипида и фактора IXa, и избыточного количества фактора X, активация фактора X является пропорциональной активности фактора VIII. Активированный фактор X высвобождает хромофор pNA из хромогенного субстрата S-2765. Высвобождение pNA, измеренное при 405 нм, таким образом, является пропорциональным сформированному количеству FXa и, таким образом, также активности фактора VIII в образце. Анализ адаптировали для проведения на автоматических анализаторах свертывания, либо на Behring Coagulation Timer (BCT), либо на Behring Coagulation System (BCS), оба из Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Ludwig-Erhard-Straße 12, 65760 Eschborn, Germany.

Одностадийный анализ свертывания

Одностадийный анализ свертывания FVIII:C проводили с использованием реагента Pathromtin SL и плазмы с дефицитом FVIII, оба от Siemens Healthcare Diagnostics products GmbH, Emil-von-Behring -Str. 76, 35041 Marburg, Germany.

Принцип анализа: Тест выполняют как модифицированный вариант анализа активированного частичного тромбопластинового времени (aPTT): Инкубация плазмы с фосфолипидами и контактным активатором приводит к активации факторов внутренней системы свертывания. Добавление ионов кальция запускает каскад свертывания. Определяют время до формирования поддающегося измерению фибринового сгустка. Анализ выполняют в присутствии плазмы с дефицитом фактора VIII. Способность к свертыванию плазмы с дефицитом восстанавливают посредством фактора свертывания VIII, включенного в образец, подлежащий тестированию. Сокращение времени свертывания является пропорциональным количеству фактора VIII, присутствующего в образце. Активность фактора свертывания VIII количественно определяют посредством прямого сравнения со стандартным препаратом с известной активностью фактора VIII в международных единицах.

Анализ адаптировали для проведения на автоматических анализаторах свертывания, либо на Behring Coagulation Timer (BCT), либо на Behring Coagulation System (BCS), оба из Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Ludwig-Erhard-Straße 12, 65760 Eschborn, Germany.

Высокомолекулярные Компоненты (HMWC) по эксклюзионной ВЭЖХ

Эксклюзионную ВЭЖХ проводили с использованием колонки CОСМOSIL Diol-300-II 7,5×600 мм (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) и детекции флуоресценции при длине волны возбуждения 280 нм и длине волны излучения 340 нм. Состав подвижной фазы представлял собой 300 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, 10 мМ CaCl₂ * 2H₂O, 0,005% Tween® 80, 10% изопропанол, pH 7,0. Элюция являлась изократической при скорости потока 0,5 мл/мин при комнатной температуре окружающей среды в течение 75 минут.

Пример 1:

Получение составов FVIII и оценка свойств раствора после замены буфера посредством обессоливающих колонок

Очищенный CSL627 с активностью FVIII:C (по способу с хромогенным субстратом) 9500 МЕ/мл составляли в желательные композиции посредством замены буфера с помощью обессоливающих колонок NAP-25 (GE Healthcare Sephadex™ G 25; каталожный номер 17-0852-01) в соответствии с инструкциями производителя. Эта замена буфера приводила к коэффициенту разбавления 1,4.

Затем различные композиции исследовали по их внешнему виду (мутности) и уровню активности FVIII:C.

Уровень FVIII:C рассчитывали как процентное содержание количества FVIII:C в полученной композиции после замены буфера, деленное на количество FVIII:C в растворе до замены буфера с соответствующей коррекцией на разведение посредством замены буфера (коэффициент разбавления 1,4).

Таблица 18.

Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] мутность да/нет Уровень FVIII:C * [%] 01-001 80 5 100 10 0,005 нет 112 01-002 (сравнительный) 10 5 100 10 0,005 да 48 01-003 (сравнительный) 30 5 100 10 0,005 да 98

* Уровень активности FVIII:C, определенный посредством анализа активности с хромогенным субстратом после замены буфера посредством обессоливающих колонок

Пример 2:

Получение составов FVIII и оценка свойств раствора после замены буфера посредством обессоливающих колонок

Различные композиции получали посредством замены буфера, как описано в примере 1 (активность FVIII:C в исходном веществе составляла 9733 МЕ/мл). Композиции оценивали по их внешнему виду после замены буфера. Кроме того, композиции затем стерилизовали фильтрацией (0,22 мкм) и анализировали по их активности FVIII:C непосредственно после фильтрации (время 0) и после хранения при +2 - +8°C в течение 1, 2, 3, 15, 30 и 60 суток, и хранения при +25°C и +40°C в течение 1, 2 и 3 суток.

Восстановление (стабильность) рассчитывали как процентное содержание FVIII:C (анализ активности FVIII с хромогенным субстратом) после хранения, деленное на активность FVIII:C на время 0. Активность FVIII:C на время 0 (после фильтрации через 0,22 мкм) определяли как 100%.

Таблица 19

Стабильность: восстановление FVIII:C по Coamatic * [%] +2 - +8°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] мутность да/нет Время 0 1 сутки 2 суток 3 суток 15 суток 30 суток 60 суток 02-001 40 5 100 10 0,005 нет 100 103 107 100 97 97 93 02-002 50 5 100 10 0,005 нет 100 96 104 97 92 90 81 02-003 60 5 100 10 0,005 нет 100 102 111 114 105 98 85 02-004 70 5 100 10 0,005 нет 100 110 98 104 93 94 87 02-005 80 5 100 10 0,005 нет 100 100 106 102 100 93 91 02-006 100 5 100 10 0,005 нет 100 100 111 106 101 96 87 02-007 150 5 100 10 0,005 нет 100 98 109 110 92 88 85

* восстановление FVIII:C на основании измерений активности FVIII:C (анализ активности с хромогенным субстратом) после хранения в условиях различной температуры (тест стабильности в жидком состоянии)

Таблица 20

Стабильность: восстановление по FVIII:C Coamatic * [%] +25°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] мутность да/нет Время 0 1 сутки 2 суток 3 суток 02-001 40 5 100 10 0,005 нет 100 104 105 103 02-002 50 5 100 10 0,005 нет 100 95 95 102 02-003 60 5 100 10 0,005 нет 100 105 104 116 02-004 70 5 100 10 0,005 нет 100 104 96 100 02-005 80 5 100 10 0,005 нет 100 99 103 96 02-006 100 5 100 10 0,005 нет 100 107 102 105 02-007 150 5 100 10 0,005 нет 100 106 103 103

* восстановление FVIII:C на основании измерений активности FVIII:C (анализ активности с хромогенным субстратом) после хранения в условиях различной температуры (тест стабильности в жидком состоянии)

Таблица 21

Стабильность: восстановление по FVIII:C Coamatic * [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] мутность да/нет Время 0 1 сутки 2 суток 3 суток 02-001 40 5 100 10 0,005 нет 100 103 93 101 02-002 50 5 100 10 0,005 нет 100 91 89 93 02-003 60 5 100 10 0,005 нет 100 102 105 104 02-004 70 5 100 10 0,005 нет 100 96 97 97 02-005 80 5 100 10 0,005 нет 100 107 91 89 02-006 100 5 100 10 0,005 нет 100 105 95 93 02-007 150 5 100 10 0,005 нет 100 105 104 103

* восстановление FVIII:C на основании измерений активности FVIII:C (анализ активности с хромогенным субстратом) после хранения в условиях различной температуры (тест стабильности в жидком состоянии)

Пример 3:

Внешний вид раствора после замены буфера посредством обессоливающих колонок

Различные композиции получали посредством замены буфера, как описано в примере 1 (активность FVIII:C по анализу активности FVIII с хромогенным субстратом в исходном веществе составляла 8317 МЕ/мл). Композиции оценивали по их внешнему виду после замены буфера.

Таблица 22

Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] мутность да/нет 03-001 (сравнительный) 0 5 100 10 0,005 да 03-002 (сравнительный) 10 5 100 10 0,005 да 03-003 (сравнительный) 20 5 100 10 0,005 да 03-004 (сравнительный) 30 5 100 10 0,005 да 03-005 40 5 100 10 0,005 нет 03-006 50 5 100 10 0,005 нет 03-007 80 5 100 10 0,005 нет 03-008 80 0,5 100 10 0,005 нет 03-009 80 5 20 10 0,005 нет 03-010 (сравнительный) 80 5 100 3 0,005 да 03-011 (сравнительный) 80 0,5 20 3 0,005 да 03-012 80 0,5 20 10 0,005 нет 03-013 (сравнительный) 80 0,5 100 3 0,005 да 03-014 (сравнительный) 80 5 20 3 0,005 да

Пример 4:

Уровень активности FVIII:C и внешний вид раствора после замены буфера посредством обессоливающих колонок и восстановление активности FVIII:C при хранении.

Различные композиции получали посредством замены буфера, как описано в примере 1 (активность FVIII:C в исходном веществе составляла 4780 МЕ/мл).

Композиции оценивали по их внешнему виду после замены буфера. Кроме того композиции стерилизовали фильтрацией (0,22 мкм) и анализировали по активности FVIII:C (анализ с хромогенным субстратом) непосредственно после фильтрации (время 0) и после хранения при 2-8°C в течение 1,2 и 3 суток и хранения при 25°C и 40°C в течение 3 суток.

Выход способа составления по активности FVIII:C рассчитывали как процентное содержание FVIII:C в полученной композиции после замены буфера, деленное на количество FVIII:C в растворе до замены буфера с соответствующей коррекцией на разведение. Восстановление (стабильность) при хранении рассчитывали как процентное содержание FVIII:C после хранения, деленное на активность FVIII:C на время 0. Активность FVIII:C на время 0 (после фильтрации через 0,22 мкм) определяли как 100%.

Таблица 23

Стабильность: восстановление FVIII:C по Coamatic ** [%] +2 - +8°C +25°C +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] мутность да/нет Уровень FVIII:C по Coamatic * [%] Время 0 1 сутки 2 суток 3 суток 3 суток 3 суток 04-001 80 5 100 10 0,005 нет 99 100 n/a n/a 88 88 81 04-002 (сравнительный) 50 5 100 1 0,005 да 76 100 n/a n/a 88 72 74 04-003 50 5 100 7 0,005 нет 95 100 n/a n/a 90 95 81 04-004 50 5 100 10 0,005 нет 98 100 n/a n/a 93 93 80 04-005 50 5 100 15 0,005 нет 93 100 n/a n/a 92 94 83 04-006 50 5 100 20 0,005 нет 94 100 n/a n/a 92 96 81

* уровень FVIII:C (на основании измерений активности FVIII с помощью анализа активности FVIII с хромогенным субстратом) после замены буфера посредством обессоливающих колонок

** восстановление FVIII:C (на основании измерений активности FVIII с помощью анализа активности FVIII с хромогенным субстратом) после хранения в условиях различной температуры (тест стабильности в жидком состоянии)

Пример 5:

Формирование HMWC (SE-ВЭЖХ) в лиофилизированных препаратах при хранении при повышенной температуре.

Активность FVIII:C и концентрацию наполнителей составов из этого примера доводили посредством разведения концентрата FVIII подходящими буферными растворами. Для полученных составов показаны концентрации FVIII:C 430-480 МЕ/мл. Затем растворы распределяли (по 2,5 мл) и лиофилизировали. Полученные лиофилизаты хранили при +40°C, и образцы отбирали через 1, 3, 6 и 12 месяцев. Образцы отбирали из разведенных растворов до и после хранения лиофилизатов и замораживали при -70°C. HMWC определяли по SE-ВЭЖХ в образцах после размораживания в водяной бане (+37 °C).

Таблица 24

Стабильность лиофилизатов при хранении: HMWC по SE-ВЭЖХ [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] После лиофилизации (время 0) 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 12 месяцев 05-001 52 5 100 10 0,004 0,76 1,39 0,41 0,25 0,73 05-002 (сравнительный) 280 0,6 20 3,4 0,02 0,56 2,89 3,16 6,13 5,75 05-003 (сравнительный) 340 2,55 52,5 5,5 0,05 0,30 2,07 2,18 2,79 4,17 05-004 (сравнительный) 340 2,55 52,5 0,64 0,05 0,34 2,24 2,15 2,97 4,48 05-005 (сравнительный) 340 2,55 3,61 5,5 0,05 0,31 1,84 2,19 3,50 5,69 05-006 (сравнительный) 600 5 3,61 0,64 0,1 0,38 3,38 3,86 7,21 11,43 05-007 (сравнительный) 600 5 3,61 10 0,004 1,44 1,81 1,81 5,48 7,73 05-008 (сравнительный) 600 5 100 0,64 0,004 1,03 1,64 2,18 4,90 6,71

Пример 6:

Анализ активности FVIII:C с хромогенным субстратом и формирование HMWC (SE-ВЭЖХ) в лиофилизированных препаратах при хранении при повышенной температуре

Активность FVIII:C и концентрацию наполнителей доводили посредством разведения концентрата FVIII подходящими буферными растворами. Затем растворы распределяли (по 2,5 мл) и лиофилизировали. Полученные лиофилизаты хранили при +40°C, и образцы отбирали через 1, 3, 6, 12, 18 и 24 месяцев. Образцы отбирали из разведенных растворов до и после хранения лиофилизатов и замораживали при -70°C. HMWC определяли в образцах, сохраняемых замороженными, после размораживания в водяной бане (+37 °C).

Активность FVIII:C (анализ активности FVIII с хромогенным субстратом) определяли в свежих растворах до лиофилизации и в свежих разведенных лиофилизатах непосредственно после лиофилизации или после хранения. Восстановление (стабильность) рассчитывали как процентное содержание FVIII:C после хранения, деленное на активность FVIII:C на время 0. Активность FVIII:C на время 0 (после лиофилизации) определяли как 100%.

Таблица 25

Стабильность лиофилизатов при хранении: восстановление FVIII:C по Coamatic [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] Лекарственная форма [МЕ] Активность FVIII:C до лиофилизации [МЕ/мл] После лиофилизации (время 0) 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 12 месяцев 18 месяцев 24 месяца 06-001 (сравнительный) 280 0,6 20 3,4 0,02 500 219 100 94 84 86 64 58 50 46 06-002 80 5 100 10 0,005 500 218 100 96 96 98 91 81 89 100 06-003 (сравнительный) 280 0,6 20 3,4 0,02 1000 437 100 106 87 88 78 65 59 55 06-004 80 5 100 10 0,005 1000 428 100 103 102 110 96 86 87 93 06-005 (сравнительный) 280 0,6 20 3,4 0,02 3000 1440 100 91 83 74 69 55 57 42 06-006 80 5 100 10 0,005 3000 1368 100 84 89 94 86 n.a. 82 89

Таблица 26

Стабильность лиофилизатов при хранении: HMWC по SE-ВЭЖХ [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] Лекарственная форма [МЕ] Активность FVIII:C до лиофилизации [МЕ/мл] После лиофилизации (время 0) 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 12 месяцев 18 месяцев 24 месяца 06-001 (сравнительный) 280 0,6 20 3,4 0,02 500 219 0,28 2,99 2,24 2,99 3,91 3,65 12,14 7,19 06-002 80 5 100 10 0,005 500 218 0,13 0,13 0,30 0,56 0,66 0,74 1,42 0,79 06-003 (сравнительный) 280 0,6 20 3,4 0,02 1000 437 0,59 1,94 5,00 4,26 3,29 3,91 6,88 7,13 06-004 80 5 100 10 0,005 1000 428 0,23 0,50 0,96 1,25 0,58 0,73 1,46 1,72 06-005 (сравнительный) 280 0,6 20 3,4 0,02 3000 1440 0,53 2,50 4,86 9,56 4,51 9,12 6,95 15,95 06-006 80 5 100 10 0,005 3000 1368 0,13 0,33 0,38 0,31 1,04 n.a. 1,02 2,03

Пример 7:

Получение составов FVIII и оценка свойств раствора после замены буфера посредством обессоливающих колонок.

Очищенный CSL627 составляли в желательные композиции посредством замены буфера с помощью обессоливающих колонок NAP-25 (GE Healthcare Sephadex™ G 25; каталожный номер 17-0852-01) в соответствии с инструкциями производителя и как описано в примере 1. Затем различные композиции разбавляли на основании хромогенного анализа активности до получения активности (удельной активности) FVIII:C с использованием анализа активности FVIII с хромогенным субстратом приблизительно 7000 МЕ/мл. Затем различные композиции исследовали по их внешнему виду (мутности).

Таблица 27

Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [% масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] GSH
[мМ] Tween^® 80
(%) мутность да/нет 07-001 65 5,0 100 10 0,25 0,005 нет 07-002 65 5,0 100 10 0,25 0,005 нет 07-003 65 5,0 100 5,5 0,25 0,005 нет 07-004 (сравнительный) 65 5,0 100 3,0 0,25 0,005 да 07-005 (сравнительный) 65 5,0 100 1,0 0,25 0,005 да 07-006 65 5,0 55 10 0,25 0,005 нет 07-007 (сравнительный) 65 5,0 55 5,5 0,25 0,005 да 07-008 (сравнительный) 65 5,0 55 5,5 0,25 0,005 да 07-009 (сравнительный) 65 5,0 55 5,5 0,25 0,005 да 07-010 (сравнительный) 65 5,0 55 3,0 0,25 0,005 да 07-011 (сравнительный) 65 5,0 55 1,0 0,25 0,005 да 07-012 65 5,0 30 10 0,25 0,005 нет 07-013 (сравнительный) 65 5,0 30 5,5 0,25 0,005 да 07-014 (сравнительный) 65 5,0 30 1,0 0,25 0,005 да 07-015 65 5,0 10 10 0,25 0,005 нет 07-016 (сравнительный) 65 5,0 10 5,5 0,25 0,005 да 07-017 (сравнительный) 65 5,0 10 3,0 0,25 0,005 да 07-018 (сравнительный) 65 5,0 10 1,0 0,25 0,005 да

Результаты показаны графически на фигуре 1. Точками представлена мутность выше порогового уровня 18 НЕФ, ромбами представлен прозрачный раствор (мутность менее или равная 18 НЕФ).

Пример 8

Формирование HMWC (SE-ВЭЖХ) в лиофилизированных препаратах при хранении при повышенной температуре

Активность FVIII:C и концентрацию наполнителей составов из этого примера доводили посредством разведения концентрата FVIII (CSL627) подходящими буферными растворами. Для полученных составов показаны концентрации FVIII:C приблизительно 390-435 МЕ/мл. Затем растворы распределяли (по 2,5 мл) и лиофилизировали. Полученные лиофилизаты хранили при +40°C, и образцы отбирали через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев. Образцы отбирали из разведенных растворов до и после хранения лиофилизатов, и замораживали при -70°C. HMWC определяли посредством SE-ВЭЖХ в образцах после размораживания в водяной бане (+37°C).

Таблица 28

Стабильность лиофилизатов при хранении: HMWC по SE-ВЭЖХ [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] GSH [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] После лиофилизации (время 0) 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 12 месяцев 08-001
(сравнительный) 500 5,0 100 10 0,25 0,005 1,27 1,27 2,22 3,11 2,92 4,77 08-002
(сравнительный) 300 5,0 100 10 0,25 0,005 0,29 0,58 1,06 1,86 2,04 1,92 08-003 150 5,0 100 10 0,25 0,005 0,47 0,42 0,68 0,74 0,81 0,56 08-004 100 5,0 100 10 0,25 0,005 0,32 0,40 0,74 0,65 0,72 0,62 08-005 65 5,0 100 15 0,25 0,005 0,34 0,34 0,84 0,77 0,96 0,75 08-006 65 5,0 100 10 0,25 0,005 0,34 0,42 0,77 0,67 0,87 0,72 08-007 65 5,0 100 7 0,25 0,005 0,53 0,51 0,78 0,79 1,10 0,87 08-008 65 5,0 100 5 0,25 0,005 0,49 0,53 0,93 0,83 1,17 0,84

Пример 9

Анализ активности FVIII:C с хромогенным субстратом и формирование HMWC (SE-ВЭЖХ) в лиофилизированных препаратах при хранении при повышенной температуре

Активность FVIII:C и концентрацию наполнителей доводили посредством разведения концентрата FVIII (CSL627) подходящими буферными растворами. Затем растворы распределяли (по 2,5 мл) и лиофилизировали. Полученные лиофилизаты хранили при +40°C, и образцы отбирали через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев. Образцы отбирали из разведенных растворов до и после хранения лиофилизатов, и замораживали при -70 °C. HMWC определяли в образцах, сохраняемых замороженными, после размораживания в водяной бане (+37 °C).

Активность FVIII:C (анализ активности FVIII с хромогенным субстратом) определяли в свежих растворах до лиофилизации и в свежих разведенных лиофилизатах непосредственно после лиофилизации или после хранения. Восстановление (стабильность) рассчитывали как процентное содержание FVIII:C после хранения, деленное на активность FVIII:C на время 0. Активность FVIII:C на время 0 (после лиофилизации) определяли как 100%.

Таблица 29

Стабильность лиофилизатов при хранении FVIII:C: восстановление по Coamatic [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] GSH [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] Лекарственная форма [МЕ] Активность FVIII:C до лиофилизации [МЕ/мл] После лиофилизации (время 0) 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 12 месяцев 09-001 65 5,0 100 10 0,25 0,005 1000 417 100 102 100 96 100 106 09-002 65 5,0 100 10 0,25 0,005 1000 447 100 107 103 93 93 95 09-003 65 5,0 100 5,5 0,25 0,005 1000 411 100 98 104 90 93 91 09-004 65 5,0 55 10 0,25 0,005 1000 389 100 103 105 95 105 107 09-005 65 5,0 30 10 0,25 0,005 1000 383 100 108 100 97 98 102 09-006 65 5,0 10 10 0,25 0,005 1000 384 100 110 101 95 94 90

Таблица 30

Стабильность лиофилизатов при хранении: HMWC по SE-ВЭЖХ [%] (n.t.=не тестировали) +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] GSH [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] Лекарственная форма [МЕ] Активность FVIII:C до лиофилизации [МЕ/мл] После лиофилизации (время 0) 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 12 месяцев 09-001 65 5,0 100 10 0,25 0,005 1000 417 0,19 n.t. 0,64 0,39 0,87 n.t. 09-002 65 5,0 100 10 0,25 0,005 1000 447 0,39 n.t. 0,57 0,46 0,64 n.t. 09-003 65 5,0 100 5,5 0,25 0,005 1000 411 1,10 n.t. 0,74 0,35 0,64 n.t. 09-004 65 5,0 55 10 0,25 0,005 1000 389 0,30 n.t. 1,00 0,76 1,10 n.t. 09-005 65 5,0 30 10 0,25 0,005 1000 383 0,26 n.t. 0,88 0,69 1,13 n.t. 09-006 65 5,0 10 10 0,25 0,005 1000 384 0,25 n.t. 0,98 1,03 1,26 n.t.

Пример 10

Анализ активности хромогенного субстрата FVIII:C и формирование HMWC (SE-ВЭЖХ) в лиофилизированных препаратах при хранении при повышенной температуре.

Активность FVIII:C и концентрацию наполнителей доводили посредством разведения концентрата FVIII (CSL627) подходящими буферными растворами. Затем растворы распределяли (по 2,5 мл) и лиофилизировали. Полученные лиофилизаты хранили при +40°C, и образцы отбирали через 3, 6 и 9 месяцев. Образцы отбирали из разведенных растворов до и после хранения лиофилизатов и замораживали при -70°C. HMWC определяли в образцах, сохраняемых замороженными, после размораживания в водяной бане (+37 °C).

Активность FVIII:C (анализ активности FVIII с хромогенным субстратом) определяли в свежих растворах до лиофилизации и в свежих разведенных лиофилизатах непосредственно после лиофилизации или после хранения. Восстановление (стабильность) рассчитывали как процентное содержание FVIII:C после хранения, деленное на активность FVIII:C на время 0. Активность FVIII:C на время 0 (после лиофилизации) определяли как 100%.

Таблица 31

Стабильность лиофилизатов при хранении: восстановление FVIII:C по Coamatic [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] GSH [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] лекарственная форма [МЕ] Активность FVIII:C до лиофилизации [МЕ/мл] После лиофилизации (время 0) 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 10-001 65 5,0 100 10 0,25 0,005 250 91 100 96 92 95 10-002 65 5,0 100 10 0,25 0,005 1000 402 100 99 88 96 10-003 65 5,0 100 10 0,25 0,005 3000 1340 100 90 85 87

Таблица 32

Стабильность лиофилизатов при хранении: восстановление FVIII:C по Coamatic [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] L-метионин [мМ] Tween^® 80 [% об./об.] Лекарственная форма [МЕ] Активность FVIII:C до лиофилизации [МЕ/мл] После лиофилизации (время 0) 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 10-004 65 5,0 100 10 5,0 0,005 250 96 100 90 90 92 10-005 65 5,0 100 10 5,0 0,005 1000 416 100 96 97 90 10-006 65 5,0 100 10 5,0 0,005 3000 1324 100 97 93 94

Таблица 33

Стабильность лиофилизатов при хранении: HMWC по SE-ВЭЖХ [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] GSH [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] Лекарственная форма [МЕ] Активность FVIII:C до лиофилизации [МЕ/мл] После лиофилизации (время 0) 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 10-001 65 5,0 100 10 0,25 0,005 250 91 0,28 0,43 0,60 0,86 10-002 65 5,0 100 10 0,25 0,005 1000 402 0,36 0,39 1,01 1,05 10-003 65 5,0 100 10 0,25 0,005 3000 1340 0,55 0,55 1,00 1,08

Таблица 34

Стабильность лиофилизатов при хранении: HMWC по SE-ВЭЖХ [%] +40°C Состав no # NaCl [мМ] Сахароза [%масс./об.] Гистидин [мМ] CaCl₂ [мМ] L-метионин [мМ] Tween^® 80 [%об./об.] Лекарственная форма [МЕ] Активность FVIII:C до лиофилизации [МЕ/мл] После лиофилизации (время 0) 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 10-004 65 5,0 100 10 5,0 0,005 250 96 0,33 0,23 0,59 0,56 10-005 65 5,0 100 10 5,0 0,005 1000 416 0,41 0,45 1,09 0,97 10-006 65 5,0 100 10 5,0 0,005 3000 1324 0,62 0,84 1,12 1,25

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, представляет собой водные композиции фактора свертываемости VIII. Водная композиция фактора свертывания VIII содержит: фактор свертывания VIII (FVIII), соль натрия, гистидин, соль кальция, поверхностно-активное вещество в необходимых количествах, и где осмолярность композиции составляет 600 мосмоль/л или менее. Изобретения также включают композицию фактора свертывания VIII, получаемую посредством лиофилизации водной композиции, и способ стабилизации FVIII, включающий смешивание компонентов. Предложенные композиции отличаются стабильной активностью и не обладают мутностью. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 ил., 34 табл.

1. Водная композиция фактора свертывания VIII, содержащая:

a. фактор свертывания VIII (FVIII);

b. 40-195 мМ соль натрия;

c. гистидин;

d. по меньшей мере 1 мМ соль кальция; и

e. поверхностно-активное вещество;

где [His] + 20*[Ca²⁺] ≥ 180 мM, где [Ca²⁺] представляет собой концентрацию ионов кальция в водной композиции в миллимоль на литр, и [His] представляет собой концентрацию гистидина в водной композиции в миллимоль на литр, при условии, что [His] > 0; и где осмолярность композиции составляет 600 мосмоль/л или менее.

2. Водная композиция по п. 1, где концентрация соли натрия в водной композиции составляет 45-95 мМ.

3. Водная композиция по п. 1, где [His] составляет 5-200 мМ.

4. Водная композиция по п. 1, где [Ca²⁺] составляет 5-100 мМ.

5. Водная композиция по п. 1, где pH водной композиции составляет от 5 до 9.

6. Водная композиция по п. 1, где соль кальция представляет собой хлорид кальция.

7. Водная композиция по п. 1, где соль натрия представляет собой хлорид натрия.

8. Водная композиция по п. 1, где композиция дополнительно содержит углевод.

9. Водная композиция по п. 8, где углевод представляет собой сахарозу.

10. Водная композиция по п. 8, где концентрация углевода составляет 1-20% (масс./масс.).

11. Водная композиция по п. 1, где концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,001-0,2% (об./об.).

12. Водная композиция по п. 1, где поверхностно-активное вещество представляет собой неприродное поверхностно-активное вещество.

13. Водная композиция по п. 1, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере одну аминокислоту, отличную от гистидина.

14. Водная композиция по п. 13, где указанная по меньшей мере одна аминокислота, отличная от гистидина, выбрана из группы, состоящей из аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина, метионина, фенилаланина, лейцина, изолейцина и их сочетаний.

15. Водная композиция по п. 1, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один антиоксидант.

16. Водная композиция по п. 15, где указанный по меньшей мере один антиоксидант выбран из группы, состоящей из восстановленного глутатиона, метионина, цистеина, сульфита натрия, витамина A, витамина E, аскорбиновой кислоты, аскорбата натрия и их сочетаний.

17. Водная композиция по п. 15, где концентрация указанного по меньшей мере одного антиоксиданта составляет 0,05-100 мМ.

18. Водная композиция по п. 1, где молекула FVIII представляет собой неприродную молекулу FVIII, предпочтительно, полученную рекомбинантным способом молекулу FVIII, например, (i) молекулу FVIII B с делетированным или усеченным B-доменом, (ii) полученную рекомбинантным способом двухцепочечную молекулу FVIII или (iii) одноцепочечную молекулу FVIII.

19. Композиция фактора свертывания VIII, получаемая посредством лиофилизации водной композиции по любому из пп. 1-17.

20. Водная композиция фактора свертывания VIII, получаемая посредством восстановления лиофилизированной композиции по п. 19 водным раствором.

21. Способ стабилизации FVIII, включающий смешивание компонентов, определенных в п. 1, для получения водной композиции и лиофилизацию водной композиции.