СПОСОБЫ И НАБОРЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО СУБТИПИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/6886 C12Q1/686 C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретения

Настоящее изобретение относится к in vitro способу идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного и к способу стратификации онкологических больных для лечения опухоли. Настоящее изобретение, кроме того, относится к наборам, которые применяют для идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного.

Уровень техники

Прогноз развития опухоли и предсказание реакции на терапевтическое вмешательство тесно связаны с молекулярным подтипом опухоли. Современная, применяемая во всем мире, стандартная методика для выявления рецепторного статуса раковых заболеваний, например, раков молочной железы, представляет собой иммуногистохимический анализ (ИГХ) зафиксированной в формалине и помещенной в парафин (FFPE) биопсии или ткани после резекции. В настоящее время, назначение гормонального или направленного системного лечения (т.е. трастузумаба) основано, главным образом, на ИГХ.

Получение образца FFPE и последующее иммуногистохимическое окрашивание специфическими антителами представляет собой технологию, выполняемую в настоящее время только в лабораториях, проводящих патологические исследования. На основании микроскопического исследования FFPE-тканей опухоли, кроме интерпретации результатов окрашивания, патологоанатомы извлекают дополнительную клинически важную информацию о биологии опухоли и метастазировании. Кроме того, интерпретация патологоанатомом результатов исследования ткани с помощью FFPE может рассматриваться в качестве существенной основы для принятия клинических решений. Во многих странах заключение патологоанатомов представляет собой неотъемлемую часть так называемого разбора клинического случая при принятии решения в отношении рака молочной железы. Хотя ИГХ может быть легко выполнена в централизованных лечебных учреждениях, личное мнение и опыт патологоанатома в проведении исследования высоко ценится при принятии решения в каждом отдельном случае.

Однако в нескольких исследованиях была продемонстрирована значительная вариабельность субъективной экспертной оценки и техническая вариабельность вплоть до 40% от результатов иммуногистохимии. Кроме того, иммуногистохимия позволяет провести только качественное или, в отдельных случаях, полуколичественное определение в отношении соответствующего статуса рецептора.

Следовательно, существует необходимость в надежной, объективной, количественной и воспроизводимой тест-системе молекулярного субтипирования опухолей, например, опухолей молочной железы, которая облегчает выбор подходящих схем лечения опухолей (стратификации пациентов), и обеспечивает возможность прогноза и предсказания успеха терапии и оценки уровня риска пациента в отношении отдаленных метастазов. Кроме того, такая тест-система должна обеспечить децентрализованное тестирование, то есть подходить для значительной части онкологических больных.

Раскрытие изобретения

В одном из аспектов, изобретение относится к in vitro способу идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного, указанный способ, включающий стадии:

(a) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) в образце опухоли;

(b) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора эстрогена (ESR1) в образце опухоли;

(c) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора прогестерона (PGR) в образце опухоли; и

(d) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта антигена пролиферации Ki-67 (Ki67) в образце опухоли; и/или

(e) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта активирующего GTPазу Rac белка 1 (RACGAP1) в образце опухоли.

В одном из воплощений, определение уровня экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1, включает определение того, ниже или выше уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1 по сравнению с определенным порогом экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1.

В одном из воплощений, стадию (а) выполняют перед стадиями (b), (с) и (d) и/или (е).

В одном из воплощений, стадию (d) и/или стадию (е) выполняются после стадий (а), (b) и (с).

В одном из воплощений, стадию (а) выполняют перед стадией (b), стадию (b) выполняют перед стадией (с), и стадию (с) выполняют перед стадией (d) и/или стадией (е).

В одном из воплощений, молекулярный подтип выбирают из группы, включающей HER2-позитивный, трижды негативный, люминальный А и люминальный В.

В одном из воплощений, уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта HER2, выявлял молекулярный подтип опухоли как HER2-позитивный.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже или выше определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как трижды негативный.

В одном из воплощений, молекулярный подтип представляет собой люминальный А или люминальный В.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный В.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный А.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже или выше определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный В.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный В.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный А.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный В.

В одном из воплощений, молекулярный подтип люминальный А связан с вероятностью отдаленной пятилетней безрецидивной выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 11%, предпочтительно, по меньшей мере, на 13% выше, чем вероятность отдаленной пятилетней безрецидивной выживаемости после лечения, связанного с молекулярным подтипом люминальным В и/или с вероятностью пятилетней выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 7%, предпочтительно, по меньшей мере, на 9% выше, чем вероятность пятилетней выживаемости после лечения, связанного с молекулярным подтипом люминальный В.

В одном из воплощений, способ включает стадию (d), и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1 и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67

указывает на повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного, в особенности, на повышенный риск отдаленных метастазов.

В одном из воплощений, способ включает стадию (е), и уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, указывает на повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного.

В одном из воплощений, способ включает стадии (d) и (е), и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67 и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1

указывает на повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного.

В одном из воплощений, способ включает стадии (d) и (е), и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67 и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1

указывает на дополнительно повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного.

В одном из воплощений, неблагоприятный клинический исход включает относительное или более выраженное снижение в выживаемости, безрецидивной выживаемости и отдаленной безрецидивной выживаемости.

В одном из воплощений, опухоль представляет собой солидную опухоль.

В одном из воплощений, опухоль представляет собой опухоль молочной железы или происходит от опухоли молочной железы.

В одном из воплощений, рак представляет собой рак молочной железы.

В одном из воплощений, образец представляет собой РНК, экстрагированную из опухоли.

В одном из воплощений, уровень экспрессии РНК-транскрипта определяют с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ).

В одном из воплощений, количественная ПЦР представляет собой количественную ПЦР в реальном времени с флуоресцентной меткой.

В одном из воплощений, способ включает применение ESR1-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2, и/или HER2-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 4 и 5, и/или Ki67-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, и/или PGR-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 10 и 11, и/или RACGAP1-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 13 и 14.

В одном из воплощений, способ включает применение ESR1-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 3, и/или HER2-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 6, и/или Ki67-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 9, и/или PGR-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 12, и/или RACGAP1-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 15.

В одном из воплощений, уровень экспрессии нормализовали по отношению к (среднему) уровню экспрессии одного или нескольких референсных генов в образце опухоли.

В одном из воплощений, один или несколько референсных генов выбирают из группы, включающей CALM2, В2М, RPL37A, GUSB, HPRT1 и GAPDH.

В дополнительном аспекте, изобретение относится к способу стратификации онкологических больных для лечения опухоли, указанный способ, включающий, в качестве первой стадии, идентификацию молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного с помощью in vitro способа, как определен выше, и, в качестве второй стадии, выбор схемы лечения опухоли на основании молекулярного подтипа, идентифицированного способом in vitro.

В одном из воплощений, молекулярный подтип выбирают из группы, включающей HER2-позитивный, трижды негативный, люминальный А и люминальный В.

В одном из воплощений,

- молекулярный подтип представляет собой HER2-позитивный подтип, и схема лечения опухоли включает введение анти-HER2 антител и химиотерапевтических средств;

- молекулярный подтип представляет собой трижды негативный подтип, и схема лечения опухоли включает введение химиотерапевтических средств;

- молекулярный подтип представляет собой люминальный А, и схема лечения опухоли включает эндокринную терапию; или

- молекулярный подтип представляет собой люминальный В, и схема лечения опухоли включает эндокринную терапию и, необязательно, введение химиотерапевтических средств.

В одном из воплощений, молекулярный подтип представляет собой люминальный В, и схема лечения опухоли включает введение химиотерапевтических средств.

В одном из воплощений, молекулярный подтип представляет собой люминальный В, и схема лечения опухоли включает введение таксана, предпочтительно, доцетаксела.

В одном из воплощений, таксан вводят в комбинации с фторурацилом, эпирубицином и циклофосфамидом (FEC).

В одном из воплощений, опухоль представляет собой солидную опухоль.

В одном из воплощений, опухоль представляет собой опухоль молочной железы или происходит от опухоли молочной железы.

В одном из воплощений, рак представляет собой рак молочной железы.

В дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения рака, указанный способ, включающий, в качестве первой стадии, стратификацию онкологических больных для лечения опухоли с помощью in vitro способа, как определен выше, и, в качестве второй стадии, обеспечение выбранной схемы лечения опухоли онкологическому больному.

В дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к набору, применяемому для идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ), указанный набор, включающий:

- по меньшей мере, одну пару HER2-специфических праймеров и, по меньшей мере, один HER2-специфический зонд;

- по меньшей мере, одну пару ESR1-специфических праймеров и, по меньшей мере, один ESR1-специфический зонд;

- по меньшей мере, одну пару PGR-специфических праймеров и, по меньшей мере, один PGR-специфический зонд; и

- по меньшей мере, одну пару Ki67-специфических праймеров и, по меньшей мере, один Ki67-специфический зонд; и/или

- по меньшей мере, одну пару RACGAP1-специфических праймеров и, по меньшей мере, один RACGAP1-специфический зонд.

В одном из воплощений, количественная ПЦР представляет собой количественную ПЦР в реальном времени с флуоресцентной меткой.

В одном из воплощений, обнаружение зонда основано на опосредованном амплификацией вытеснении зонда.

В одном из воплощений, зонд представляет собой зонд с двойной меткой, включающей фрагмент репортера флуоресценции и фрагмент гасителя флуоресценции.

В одном из воплощений, набор дополнительно включает обратную транскриптазу и ДНК-полимеразу.

В одном из воплощений, обратную транскриптазу и полимеразу обеспечивают в виде смеси ферментов, что позволяет проводить количественную ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ) в одну стадию.

В одном из воплощений, набор дополнительно включает, по меньшей мере, одну пару праймеров, специфических для референсных генов и, по меньшей мере, один зонд, специфический для референсных генов.

В одном из воплощений, референсный ген представляет собой один или несколько генов, которые выбирают из группы, включающей CALM2, В2М, RPL37A, GUSB, HPRT1 и GAPDH.

В одном из воплощений, набор дополнительно включает, по меньшей мере, один контрольный образец РНК.

В одном из воплощений, праймеры обеспечивают ампликон, размером менее чем 120 п.о.

В одном из воплощений, ESR1-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2, и/или HER2-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 4 и 5, и/или Ki67-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, и/или PGR-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 10 и 11, и/или RACGAP1-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 13 и 14.

В одном из воплощений, ESR1-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 3, и/или HER2-специфические зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 6, и/или Ki67-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 9, и/или PGR-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 12, и/или RACGAP1-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 15.

В одном из воплощений, опухоль представляет собой солидную опухоль.

В одном из воплощений, опухоль представляет собой опухоль молочной железы или происходит от опухоли молочной железы.

В одном из воплощений, рак представляет собой рак молочной железы.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к применению набора, как определен выше, для идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к применению набора, как определен выше, для оценки риска отдаленных метастазов у онкологического больного.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет в общих чертах возможные применения способов настоящего изобретения в качестве вспомогательных по отношению к традиционным способам классификации подтипов (например, ИГХ) и в качестве дополнительных по отношению к традиционным способам стратификации пациентов.

Фигура 2 иллюстрирует распределительный тест для оценки прогностической и предсказательной значимости уровня экспрессии мРНК HER2, ESR1, PGR, Ki67 и RACGAP1 для пятилетней выживаемости пациентов с раком молочной железы. Имеющиеся данные по 855 опухолям были сначала стратифицированы по уровню экспрессии мРНК HER2 для выявления HER-позитивных опухолей (≥ предельному значению 38). HER2-негвтивные опухоли были дополнительно стратифицированы по уровню экспрессии мРНК ESR1. A: ESR1-позитивные опухоли (≥ предельному значению 34) были дополнительно стратифицированы по уровню экспрессии мРНК Ki67 (предельное значение 31,7), а затем по уровню экспрессии мРНК PGR (предельное значение 30,2). В: Альтернативно, ESR1-позитивные опухоли (≥ предельному значению 34) были дополнительно стратифицированы по уровню экспрессии мРНК PGR (предельное значение 30,2), а затем по уровню экспрессии мРНК Ki67 (предельное значение 31,7). Анализ Каплана-Мейера данных результатов показан на фигурах 3 и 4. С: Ki67-позитивные и Ki67-негативные опухоли были стратифицированы по уровню экспрессии мРНК RACGAP1 (предельное значение 34,2). Для повышения количества пациентов для дальнейшего анализа RACGAP1, на рисунке не приведены данные для PGR. Дальнейшее рассмотрение PGR не изменяет общий результат в отношении RACGAP1. Данные (смотри таблицу 3) показывают, что уровни экспрессии мРНК RACGAP1, которые были ниже или выше определенного порога, связаны с особенно значительными различиями в пятилетней выживаемости.

Фигура 3 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера выживаемости пациентов с раком молочной железы с HER2-положительными (HER2), люминальными A (LumA), люминальными В (LumB) или трижды негативными (TNT) опухолями, в котором молекулярный подтип опухоли идентифицируют в соответствии с настоящим исследованием, на основании уровней экспрессии мРНК HER2, ESR1, PGR и Ki67. Подтип люминальный А, как было определено авторами настоящего изобретения, связан с показателем общей пятилетней выживаемости, равным 97% (по сравнению с 87% для люминальных В и HER2-положительных опухолей и 84% для трижды негативных опухолей).

Фигура 4 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера выживаемости без отдаленных метастазов («DMFS»; отдаленные метастазы через X лет после операции) пациентов с раком молочной железы с HER2-положительными (HER2), люминальными A (LumA), люминальными В (LumB) или трижды негативными (TNT) опухолями, в котором молекулярный подтип опухоли идентифицируют в соответствии с настоящим исследованием, на основании уровней экспрессии мРНК HER2, ESR1, PGR и Ki67. Подтип люминальный А, как было определено авторами настоящего изобретения, связан с пятилетней уровнем DMFS, равным 92% (по сравнению с 78% для люминальных В, HER2-положительных и трижды негативных опухолей).

Фигура 5 иллюстрирует многомерный регрессионный анализ Кокса для DMFS при сравнении молекулярного субтипирования с иммуногистохимическим способом (Sotiriou et al. (2009), N Engl J Med, 360(8): 790-800), при этом молекулярное субтипирование выполняли способом в соответствии с настоящим исследованием, на основании уровней экспрессии мРНК HER2, ESR1, PGR и Ki67. Анализ ясно показал превосходство способа настоящего изобретения, поскольку иммуногистохимическое субтипирование теряет свою значимость, когда результаты, полученные с помощью способа настоящего изобретения, включают в модели пропорциональных рисков Кокса.

Фигуры 6-9 показывают значения 40-ΔΔСТ маркеров HER2, ESR1, PGR и Ki67, определенных с помощью количественной ОТ-ПЦР для образцов пациентов 1-6 и серий 1-3.

Фигура 10 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера общей выживаемости пациентов с люминальными В опухолями. А: При определении с помощью количественной ОТ-ПЦР, выживаемость пациентов с люминальным В раком, получавших доцетаксел-FEC, была значительно более продолжительной по сравнению с пациентами, получавшими винорелбин-FEC (97% по сравнению с 89%, соответственно, отношение пределов функций риска [HR] 0,241; CI: 0,090-0,642). В: Если подтип опухоли определяли с помощью ИГХ, то преимущество доцетаксела для люминальных В пациентов не может быть показано (95% по сравнению с 92%, HR 0,617; CI 0,235-1,623).

Фигура 11 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера общей выживаемости пациентов с люминальными В опухолями, с поправкой на гистологический тип опухоли по регрессии Кокса как указано в SAP. А: Предсказание преимущества доцетаксела с помощью набора количественная ОТ-ПЦР остается значительным (97% по сравнению с 88%, HR 0,232; CI 0,087-0,624). В: субтипирование с помощью ИГХ не является предсказательным для преимущества доцетаксела (96% по сравнению с 92%, HR 0,510; CI 0,184-1,414).

Фигура 12 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера выживаемости без отдаленных метастазов (DMFS) пациентов с люминальной В опухолью. А: При определении с помощью количественной ОТ-ПЦР, люминальные В пациенты имеют более высокую вероятность остаться без отдаленных метастазов, если получают доцетаксел-FEC по сравнению с пациентами получавшими винорелбин-FEC (89% по сравнению с 78%, соответственно, HR 0,471; CI 0,263-0,843). В: Если люминальные В опухоли определяли с помощью ИГХ, то не наблюдали различий в выживаемости между различными схемами лечения (87% по сравнению с 86%, HR 0,938 CI 0,474-1,856).

Фигура 13 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера выживаемости без отдаленных метастазов пациентов с люминальными В опухолями, с поправкой на количество метастазирующих лимфатических узлов, размер опухоли и гистологический тип с помощью регрессии Кокса, как указано в SAP. А: При применении анализа по субтипированию настоящего изобретения остается значительный эффект (90 по сравнению с 78%, HR 0,409; CI 0,219-0,764). В: Напротив, эффект отсутствовал, если субтипирование опухоли осуществляли с помощью ИГХ (89% по сравнению с 85%, HR 0,674; CI 0,307-1,481).

Фигура 14 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера общей выживаемости пациентов с HER2-позитивные опухолью. А: При определении с помощью количественной ОТ-ПЦР, HER2-позитивные пациенты не имели улучшенной общей выживаемости, если получали доцетаксел по сравнению с пациентами получавшими винорелбин (87 по сравнению с 91%, HR 1,320; CI 0,556-3,132). В: Аналогичные результаты были показаны для опухолей, субтипированных с помощью ИГХ (86% по сравнению с 89%, HR 1,175; CI 0,518-2,663).

Фигура 15 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера выживаемости без отдаленных метастазов пациентов с HER2-позитивными опухолями. А: При определении с помощью способа настоящего изобретения, HER2-позитивные пациенты не отличались по выживаемости без отдаленных метастазов, если получали доцетаксел, по сравнению с пациентами, получавшими винорелбин (80 по сравнению с 81%, HR 1,070; CI 0,551-2,076). В: Аналогичным образом, при определении с помощью ИГХ, получавшие разное лечение HER2-позитивные пациенты не показывали различий в выживаемости (78% по сравнению с 77%, HR 0,975; CI 0,516-1,843).

Фигура 16 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера общей выживаемости пациентов с люминальными А опухолями. А: При определении с помощью количественной ОТ-ПЦР, люминальные А пациенты имели тенденцию к сниженной общей выживаемости, если получали доцетаксел, по сравнению с пациентами, получавшими винорелбин (95% по сравнению с 98%, HR 2,471; CI 0,477-12,809). В: Напротив, при определении с помощью ИГХ, люминальные А пациенты показали слабую, еще не значимую, тенденцию в отношении более продолжительной общей выживаемости (97 по сравнению с 93% HR 0,443; CI 0,114-1,716), если получали доцетаксел, по сравнению с пациентами, получавшими винорелбин.

Фигура 17 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера выживаемости без отдаленных метастазов пациентов с люминальной А опухолью. А: При определении с помощью количественной ОТ-ПЦР, люминальные А пациенты не отличались по выживаемости без отдаленных метастазов при лечении доцетакселом или винорелбином (92% по сравнению с 90%, HR 0,826; CI 0,336-2,033) В: Пациенты, субтипированные по ИГХ и получавшие доцетаксел, по сравнению с пациентами, получавшими винорелбин, показали слабую, еще не значимую, тенденцию в отношении более продолжительной выживаемости без отдаленных метастазов (93% по сравнению с 88%, HR 0,553; CI 0,221-1,386).

Фигура 18 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера общей выживаемости пациентов с TNBC-опухолью. А: При определении с помощью количественной ОТ-ПЦР, несущие TNBC пациенты не показали различий в общей выживаемости при лечении доцетакселом или винорелбином (84% по сравнению с 83%, HR 0,949; CI 0,338-2,665). В: При определении с помощью ИГХ, TNBC пациенты показали слабую, еще не значимую, тенденцию в отношении более продолжительной общей выживаемости (88% по сравнению с 80%, HR 0,552; CI 0,207-1,472).

Фигура 19 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера выживаемости без отдаленных метастазов пациенты с TNBC-опухолью. А: Получавшие разное лечение пациенты с TNBC, установленной по количественной ОТ-ПЦР, существенно не отличались по выживаемости без отдаленных метастазов (74% по сравнению с 78%, HR 1,211; CI 0,523-2,802). В: Пациенты с TNBC, установленной по ИГХ, показали слабую, еще не значимую, тенденцию в отношении более продолжительной выживаемости без отдаленных метастазов (82% по сравнению с 72%, HR 0,615; CI 0,284-1,333), если получали доцетаксел по сравнению с пациентами, получавшими винорелбин.

Фигура 20 А показывает диаграмму рассеяния непрерывных оценок Ki67 с помощью ИГХ (показано, как % положительных клеток на оси ординат) и количественной ОТ-ПЦР (показано, как 40-ΔΔСТ на оси абсцисс). Линии иллюстрируют предварительно заданные предельные значения плана статистического анализа (горизонтальные: ИГХ 20%; вертикальные: количественная ОТ-ПЦР 34,8 40-ΔΔСТ). В суммирует конкордантность и дискордантность между распределением по категориям, основанным на количественной ОТ-ПЦР и ИГХ (позитивные [поз] по сравнению с негативными [нег]). С показывает каппа-статистику, выявляющую высоко значимую корреляцию (р<0,0001), но умеренное соответствие между способами. D показывает позитивный и негативный процент совпадения (РРА и NPA, соответственно), при тестировании Ki67 с помощью количественной ОТ-ПЦР по сравнению с ИГХ.

Фигура 21 иллюстрирует анализ Каплана-Мейера выживаемости без отдаленных метастазов пациентов с опухолями, позитивными по рецептору эстрогена, и дискордантные результаты по Ki67 между количественная ОТ-ПЦР и ИГХ.

Другие цели, преимущества и отличительные признаки настоящего изобретения будут понятны из нижеследующего подробного описания, в особенности, при рассмотрении совместно с прилагаемыми фигурами.

Осуществление изобретения

Хотя настоящее изобретение будет подробно описано ниже, следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретными методиками, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, примененная в настоящем документе, предназначена только для целей описания конкретных воплощений, и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, которое ограничивается только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, примененные в настоящем документе, имеют те же значения, которые обычно понятны специалисту в данной области техники.

Далее будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены с конкретными воплощениями, однако, следует понимать, что они могут быть объединены любым способом и в любом количестве для создания дополнительных воплощений. Описанные различным образом примеры и предпочтительные воплощения не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение, а только как необходимые для подробного описания воплощений. Это описание следует понимать, как предназначенное для поддержания и охвата воплощений, которые сочетают в себе в явном виде описанные воплощения с любым числом раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в данной заявке следует рассматривать, как раскрытые описанием настоящей заявки, если только контекст не указывает на иное.

Предпочтительно, термины, примененные в настоящем документе, определяют, как описано в «А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. , Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).

При осуществлении настоящего изобретения используются, если не указано иное, способы, общепринятые в области химии, биохимии, клеточной биологии, иммунологии и методики рекомбинантной ДНК, которые описаны в литературе в этой области (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

На протяжении этого описания и последующей формулы изобретения, если контекст не подразумевает иное, слово «включали» и такие вариации как «включает» и «включающий» следует понимать, как подразумевающие включение указанного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, хотя в некоторых воплощениях, такой другой элемент, целое число или стадия или группы элементов, целые числа или стадий, могут быть исключены, т.е. предмет заключается во включении указанного элемента, целого числа или стадии или указанного элемента. Термины, приведенные в единственном числе, должны толковаться как охватывающие в настоящем документе как единственное, так и множественное число, если другое не указано или ясно не противоречит контексту. Указание диапазонов значений в настоящем документе предназначено лишь для сокращения способа отсылки, индивидуально для каждого отдельного значения, попадающего в интервал. Если в настоящем документе не указано другое, то каждую отдельную величину включают в описание, как если бы она была индивидуально перечислена в настоящем документе. Все способы, описанными в настоящем документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или, в противном случае, явно противоречат контексту. Применение любого и всех примеров, или иллюстративного оборота (например, «такой как»), обеспеченного в настоящем документе, предназначено только для лучшей иллюстрации изобретения и не накладывает ограничений на объем изобретения, заявленного иначе. Никакое из выражений в описании не должно быть истолковано, как указывающее на какой-либо незаявленный элемент, необходимый для осуществления изобретения на практике.

По всему тексту настоящего описания процитировано несколько документов. Каждый из документов, процитированных в настоящем документе (включая патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителей, инструкции т.п.), будь то supra или infra, включены в настоящий документ путем отсылки во всей своей полноте. Ничего из приведенного в настоящем документе не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не имеет право датироваться более ранним числом чем некое раскрытие на основании более ранней даты создания настоящего изобретения.

В одном из аспектов, изобретение относится к in vitro способу идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного, указанный способ, включает стадии:

(a) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) в образце опухоли;

(b) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора эстрогена (ESR1) в образце опухоли;

(c) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора прогестерона (PGR) в образце опухоли; и

(d) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта антигена пролиферации Ki-67 (Ki67) в образце опухоли; и/или

(e) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта активирующего GTPазу Rac белка 1, (RACGAP1) в образце опухоли.

В одном из воплощений, указанный способ не включает определение уровня экспрессии, в особенности, уровня экспрессии РНК-транскрипта, одного или нескольких дополнительных нереференсных генов. Другими словами, не определяют уровень экспрессии, в особенности, уровень экспрессии РНК-транскрипта гена, отличного от HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1 и одного или нескольких референсных генов.

В одном из воплощений, указанный способ не включает никаких других диагностических стадий, таких как гистологическая классификация или определение состояние лимфатических узлов.

Термин «опухоль», как применен в настоящем документе, относится к росту и пролиферации всех неопластических клеток, как злокачественных, так и доброкачественных, и всех предраковых и раковых клеток и тканей. В одном из воплощений настоящего изобретения, опухоль представляет собой солидную опухоль. В одном из воплощений, опухоль представляет собой опухоль молочной железы или происходит от опухоли молочной железы (например, путем метастазирования).

Как применен в настоящем документе, термин «рак» включает заболевание, характеризующееся аберрантно регулируемыми ростом, пролиферацией, дифференциация, адгезией и/или миграцией клеток. Термин «рак» в соответствии с изобретением включает лейкемии, семиномы, меланомы, тератомы, лимфомы, нейробластомы, глиомы, рак прямой кишки, рак эндометрия, рак почки, рак надпочечников, рак щитовидной железы, рак крови, рак кожи, рак мозга, рак шейки матки, рак кишечника, рак печени, рак толстой кишки, рак желудка, рак кишечника, рак головы и шеи, рак желудочно-кишечного тракта, рак лимфатических узлов, рак пищевода, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак уха-горла-носа (ENT), рак молочной железы, рак предстательной железы, рак матки, рак яичника и рак легких и их метастазы. Примеры данных заболеваний - это карциномы легких, карциномы молочной железы, карциномы простаты, карциномы толстой кишки, почечно-клеточные карциномы, карциномы шейки матки или их метастазы описанных выше типов рака или опухолей. Термин рак в соответствии с изобретением также включает раковые метастазы. В одном из воплощений, рак представляет собой рак молочной железы.

Термин «рак молочной железы» относится к такому типу рака, который происходит из ткани молочной железы, наиболее часто из внутренней выстилки молочных протоков или долек железы, которые поставляют молоко в протоки. Раки, происходящие из протоков, известны как протоковые карциномы, а происходящие от долек, известны как лобулярные карциномы. Иногда, рак молочной железы представляет собой метастатическое заболевание. Обычные места метастазирования включают кости, печень, легкие и мозг. Рак молочной железы возникает у людей и других млекопитающих. Хотя подавляющее большинство случаев заболевания людей возникает у женщин, мужской рак молочной железы также встречается. Лечение рака молочной железы может включать хирургическое вмешательство, медикаментозное лечение (гормональную терапию и химиотерапию), радиационную терапию и/или иммунотерапию/направленную терапию.

Термин «пациент», как применен в настоящем документе, относится к любому организму, такому как позвоночное, в особенности, любое млекопитающее, включая как человека, так и другое млекопитающее, например, животное, такое как грызун, кролик, или обезьяна. Грызун может представлять собой мышь, крысу, хомяка, морскую свинку или шиншиллу. Предпочтительно, пациент представляет собой человека.

В соответствии с настоящим изобретением, термин «РНК-транскрипт» включает и предпочтительно относится к «мРНК», что означает «матричная РНК», и относится к «транскрипту», который кодирует пептид или белок. мРНК, как правило, включает 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), область, кодирующую белок или пептид, и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR). мРНК имеет ограниченный период полураспада в клетках и in vitro.

Ген HER2 (также называемый ERBB2; локализация: 17q12, аннотация: хромосома: 17; NC_000017.10) кодирует члена семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGF) из рецепторных тирозинкиназ. Об амплификации и/или сверхэкспрессии данного гена сообщали для многих раков, включая опухоли молочной железы и яичников. В базе данных NCBI, приведены два варианта мРНК для HER2, которые кодируют две версии белка. Белок и последовательности мРНК можно найти под номерами доступа NM_001005862.1 (изоформа b тирозиновой протеинкиназы рецептора erbB-2) и NM_004448.2 (предшественник изоформы а тирозиновой протеинкиназы рецептора erbB-2). Амплификация гена HER2 встречается приблизительно у 10-20% первичных карцином молочной железы.

Ген ESR1 (локализация: 6q25, аннотация: хромосома 6, NC_000006.11) кодирует рецептор эстрогена (ER), лиганд-активированный фактор транскрипции, состоящий из нескольких доменов, важных для связывания гормона, связывания ДНК и активации транскрипции. Известно, что рецепторы эстрогена вовлечены в патологические процессы, включая рак молочной железы, рак эндометрия и остеопороз. Известны четыре варианта мРНК ESR1, в которых варианты транскрипта отличаются в 5'-UTR и/или в использовании различных промоторов, но каждый вариант кодирует один и тот же белок. 70-80% всех раков молочной железы представляют собой ER-позитивные раки.

Ген PGR (также называемый PR; локализация: 11q22-q23, аннотация: хромосома: 11; NC_000011.9) кодирует рецептор прогестерона. Стероидные гормоны, такие как прогестерон и их рецепторы вовлечены в регуляцию экспрессии эукариотических генов и влияют на клеточную пролиферацию и дифференциацию в тканях-мишенях. Данный ген применяет два различных промотора и сайты старта трансляции в первом экзоне для производства двух изоформ мРНК, А и В. Эти две изоформы идентичны, за исключением дополнительных 165 аминокислот, обнаруженных на N-конце изоформы В. 40% опухолей молочной железы позитивны по PGR.

Ген Ki-67 (Ki67; локализация: 10q26,2, аннотация: хромосома: 10; NC_000010.10) кодирует ядерный белок, который связан с клеточной пролиферацией и может быть для нее необходим. Были описаны два варианта мРНК. Родственный псевдоген существует на хромосоме 10. Приблизительно 25% опухолей молочной железы позитивны по Ki67.

Ген RACGAP1 (локализация: 12q13.12, аннотация: хромосома: 12; NC_000012.11) кодирует RacGTPаза-активирующий белок 1. Были описаны три варианта сплайсинга, все кодирующие один и тот же белок. RACGAP1 представляет собой компонент центрального комплекса spindlin и играет ключевую роль в управлении процессами, связанными с ростом и дифференциацией.

Термин «уровень экспрессии», как применен в настоящем документе, относится к экспрессии определенного гена (т.е. HER2, ESR1, PGR, Ki67 или RACGAP1), то есть гена, который продуцирует транскрипт и/или белок. В соответствии с настоящим изобретением, уровень экспрессии определяют по уровню РНК-транскрипта, в особенности, уровню мРНК (транскрипционному уровню), например, путем измерения транскрибированной мРНК (например, с помощью Нозерн-блота), с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) или путем непосредственного окрашивания мРНК (например, с помощью in situ гибридизации).

В одном из воплощений, термин «образец опухоли» относится к образцу опухолевой ткани, изолированной из онкологического больного (например, к биопсии или ткани опухоли после резекции). В предпочтительном воплощении, образец опухолевой ткани представляет собой криосрез образца опухолевой ткани или представляет собой химически фиксированный образец опухолевой ткани. В более предпочтительном воплощении, образец опухолевой ткани представляет собой зафиксированный в формалине и залитый в парафин (FFPE) образец опухолевой ткани. В одном из воплощений, образец опухоли представлял собой (суммарную) РНК, экстрагированную из образца опухолевой ткани. В особенно предпочтительном воплощении, образец опухоли представлял собой (суммарную) РНК, экстрагированную из образца FFPE опухолевой ткани. Специалисты в данной области техники способны выполнить процедуры экстракции РНК. Например, тотальная РНК из от 5 до 10 мкм среза опухолевой ткани FFPE может быть экстрагирована с помощью набора High Pure RNA Paraffin Kit («Roche», Базель, Швейцария) или, предпочтительно, с помощью набора XTRAKT RNA Extraction Kit XL («Stratifyer Molecular Pathology», Кельн, Германия). Также возможно хранить материал образца, который предстоит применять/тестировать, в морозильной камере и осуществлять способ настоящего изобретения в соответствующий момент времени после оттаивания соответствующего материала образца. Образец может быть получен от онкологического больного до начала терапевтического лечения, в процессе терапевтического лечения и/или после терапевтического лечения, т.е. до, во время или после проведения противораковой терапии.

Термин «молекулярный подтип опухоли», как применен в настоящем документе, относится к подтипам опухоли, которые характеризуются четкими молекулярными профилями, например, профилями экспрессии генов. В одном из воплощений, молекулярный подтип выбирают из группы, включающей HER2-позитивные, трижды негативные (также называемый «базально-подобные»), люминальный А и люминальный В. Термин «базально-подобные» относится к тому факту, что такие опухоли имеют некоторое сходство в экспрессии генов с базальными эпителиальными клетками. Термин «люминальный» происходит от сходства в экспрессии генов между опухолями и люминальным эпителием.

Молекулярные подтипы заметно отличаются по клиническому исходу и ответу на терапию. В одном из воплощений, молекулярный подтип люминальный А, как определен в настоящем документе, связан с вероятностью отдаленной пятилетней безрецидивной выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 11%, предпочтительно, по меньшей мере, на 13% выше, чем вероятность отдаленной пятилетней безрецидивной выживаемости после лечения, связанного с молекулярным подтипом люминальный В, и/или с вероятностью пятилетней выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 7%, предпочтительно, по меньшей мере, на 9% выше, чем вероятность пятилетней выживаемости после лечения, связанного с молекулярным подтипом люминальный В.

Термин «(терапевтическое) лечение», в особенности, в связи с лечением рака, как применен в настоящем документе, относится к любому лечению, которое улучшает состояние здоровья и/или продлевает (увеличивает) продолжительность жизни пациента. Указанное лечение может устранить рак, уменьшить размер или число опухолей у пациента, остановить или замедлить развитие рака у пациента, подавить или замедлить развитие нового рака у пациента, уменьшить частоту или тяжесть симптомов у пациента, и/или уменьшить рецидивы у пациента, который в настоящее время имеет или который ранее имел рак. В одном из воплощений, термины «лечение» и «терапевтическое лечение» предназначены для обозначения одного или нескольких хирургических удалений первичной опухоли, химиотерапии, гормональной терапии, радиационной терапии и иммунотерапии/направленной терапии.

Адъювантная терапия представляет собой лечение, которое назначают в дополнение к первичному, основному или исходному лечению. Хирургическое лечение и комплексные схемы лечения, применяемые в терапии рака, привели к тому, что термин, в основном, применяют для описания адъювантного лечения рака. Пример адъювантной терапии представляет собой дополнительное лечение (например, химиотерапия), обычно назначаемое после хирургического вмешательства (послеоперационное), когда все обнаруженные заболевания были удалены, но остается статистический риск рецидива из-за невыявленного заболевания. Неоадъювантная терапия представляет собой лечение, проведенное перед первичным, основным или исходным лечением (например, предоперационная химиотерапия).

В соответствии с настоящим изобретением, стадии «определения уровня экспрессии РНК-транскрипта» могут включать (i) измерение уровня экспрессии РНК-транскрипта и (ii) анализ измеренного уровня экспрессии РНК-транскрипта (например, по сравнению с референсным уровнем экспрессии, таким как определенный порог экспрессии), в котором порядок измерения уровня экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1 не зависит от порядка анализа измеренного уровня экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1.

В одном из воплощений, определение уровня экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1 включает определение такого уровня экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1, который был ниже или выше определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1. В случаях, когда уровень экспрессии равен определенному порогу экспрессии, считают, что уровень экспрессии принадлежит к уровням экспрессии, превышающим определенный порог экспрессии. Таким образом, формулировка «превышавший определенный порог экспрессии», как применена в настоящем документе, включает уровни экспрессии, которые выше чем или равны определенному порогу экспрессии. Уровни экспрессии, «превышающие определенный порог экспрессии», также могут называться «позитивные по экспрессии», тогда как уровни экспрессии, которые «ниже определенного порога экспрессии», также могут быть названы «негативные по экспрессии»

Термин «определенный порог экспрессии РНК-транскрипта», как применен в настоящем документе, может относиться к среднему предельному значению (коротко: пороговое значение), рассчитанному из некоторого количества образцов, указанное количество образцов получали от некоторого количества субъектов, в особенности, субъектов, имевших рак. Для получения порога, количество субъектов может включать субъектов, имеющих опухоли различных молекулярных подтипов, например, субъектов, имеющих HER2-позитивные опухоли, и/или субъектов, имеющих трижды негативные опухоли, и/или субъектов, имеющих люминальный А опухоли, и/или субъектов, имеющих люминальные В опухоли. Порог может представлять собой количество или концентрацию РНК-транскрипта. В одном из воплощений, порог задается как величина СТ (пороговый цикл) (смотри ниже). В одном из воплощений, (относительный) уровень экспрессии и порог экспрессии выражают в виде значений 40-ΔСТ или 40-ΔΔСТ (смотри ниже).

Термин «субъект», как применен в настоящем документе, относится к любому организму, такому как позвоночные, в особенности к любому млекопитающему, включая как человека, так и другое млекопитающее, например, животных, таких как грызуны, кролики или обезьяны. Грызун может представлять собой мышь, крысу, хомяка, морскую свинку или шиншиллу. Предпочтительно, субъект представляет собой человека. В одном из воплощений, субъект, который представляет собой субъекта с заболеванием или с подозреваем на наличие заболевания, в особенности, рака, также обозначается как «пациент» в настоящем документе. Для определения среднего предельного значения тестируют, по меньшей мере, двух субъектов, предпочтительно, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 40, по меньшей мере, 50, по меньшей мере, 60, по меньшей мере, 70, по меньшей мере, 80, по меньшей мере, 90, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 200, по меньшей мере, 300, по меньшей мере, 400, по меньшей мере, 500, по меньшей мере, 600, по меньшей мере, 700, по меньшей мере, 800, по меньшей мере, 900, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 1500, или, по меньшей мере, 2000 субъектов.

Поскольку разнообразные клинические исследования ранее проводились с генными маркерами, примененными в соответствии с настоящим изобретением, исследования по согласованности в тренировочно-тестирующих условиях будет достаточно для определения и подтверждения клинического порогового значения/порога для дихотомизации количественных результатов на «позитивные по экспрессии» или «негативные по экспрессии». Таким образом, в одном из воплощений, пороговое значение/порог определяют на основании одного или нескольких предыдущих клинических исследований. Кроме того, дополнительные клинические исследования могут быть проведены для установления и подтверждения порогового значения/порога. Пороговое значение/порог могут быть установлены/определены с помощью методик, известных в данной области техники.

В одном из воплощений, пороговое значение/порог устанавливают/определяют на основании клинико-патологических параметров, таких как ИГХ-ISH, и/или данных по общей выживаемости (OS), выживаемости без признаков заболевания (DFS) и выживаемости без отдаленных метастазов (DMFS) и выживаемости, зависящей от заболевания (DSS), в исследуемых когортах (например, НЕ10-97, Pentheroudakis et al. (2009), Breast Cancer Res Treat, 116: 131-143) с помощью пропорциональных тестов (например, SAS Software JMP® 9.0.0) и подтверждают в клинических исследованиях на независимых когортах, например, образцы тканей FFPE из исследования FinHER (Joensuu et al. (2006), N Engl J Med, 354: 809-820).

В одном из воплощений, величину 40-ΔСТ рассчитывали следующим образом: 40-[СТ соответствующего биомаркера (т.е. HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1) образца пациента - СТ референсного гена (например, CALM2) образца пациента] (= способ расчета 1). Если применяют более чем один референсный ген, то величину 40-ΔСТ рассчитывают следующим образом: 40 - (СТ соответствующего биомаркера образца пациента - средний СТ выбранных референсных генов образца пациента) (= способ расчета 2). Альтернативно, может быть применена величина 40-ΔΔСТ, в которой 40-ΔΔСТ может быть рассчитано следующим образом: ΔΔСТ=40 - [(СТ биомаркера образца пациента - СТ биомаркера референсного образца) - (СТ референсных генов образца пациента - СТ референсных генов референсного образца)] (= способ расчета 3); например, 40-ΔΔСТ=40 - [(СТ Ki67 образца пациента - СТ Ki67 референсного образца) - (СТ CALM2 образца пациента - СТ CALM2 референсного образца)]. В одном из воплощений, CALM2 применяют в качестве референсных генов.

В типичном воплощении, среднее предельное значение задается как величина 40-ΔСТ в соответствии со способом расчета 2, в котором среднее предельное значение для HER2 представляет собой величину 40-ΔСТ, равную 38, среднее предельное значение для ESR1 представляет собой величину 40-ΔСТ, равную 34, среднее предельное значение для PGR представляет собой величину 40-ΔСТ, равную 30,2, среднее предельное значение для Ki67 представляет собой величину 40-ΔСТ, равную 31,7, и среднее предельное значение для RACGAP1 представляет собой величину 40-ΔСТ, равную 34,2.

В другом воплощении, относительный уровень экспрессии биомаркеров задается как величина 40-ΔΔСТ, которую рассчитывали следующим образом: 40 - [(СТ биомаркера образца пациента - СТ референсных генов образца пациента) - (СТ биомаркера контрольного образца - СТ референсных генов контрольного образца)] (= способ расчета 4); например, 40-ΔΔСТ=40 - [(СТ Ki67 образца пациента - СТ среднее CombRef образца пациента) - (СТ Ki67 контрольного образца - СТ среднее CombRef контрольного образца)]. В одном из воплощений, СТ представляет собой медианный СТ. СТ референсных генов сможет представлять собой СТ единственного референсного гена или среднее СТ из двух или более референсных генов (называемых среднее CombRef). Предпочтительно, такой же контрольный образец (также называемый калибратор) применяют во всех анализах, что приводит к одинаковым результатам в количественной ОТ-ПЦР или qPCR. В одном из воплощений, контрольный образец представляет собой РНК клеточной линии, in vitro транскрибированную искусственную РНК или эквимолярную смесь олигонуклеотидов ДНК, представляющих мРНК или кДНК биомаркера или ампликон биомаркера или часть ампликона биомаркер с постоянным соотношением. В одном из воплощений, CALM2 и В2М применяют в качестве референсных генов, а позитивный контроль (например, in vitro транскрибированную искусственную РНК) применяют в качестве контрольного образца (калибратора).

В типичном воплощении, среднее предельное значение задают как величину 40-ΔΔСТ в соответствии со способом расчета 4, в котором среднее предельное значение для HER2 представляет собой величину 40-ΔΔСТ, равную 40,90, среднее предельное значение для ESR1 представляет собой величину 40-ΔΔСТ, равную 38,20, среднее предельное значение для PGR представляет собой величину 40-ΔΔСТ, равную 34,90 и среднее предельное значение для Ki67 представляет собой величину 40-ΔΔСТ, равную 34,80, данные получают на модуле AD прибора Versant kPCR («Siemens»).

В другом типичном воплощении, среднее предельное значение задают как величину 40-ΔΔСТ в соответствии со способом расчета 4, в котором среднее предельное значение для HER2 представляет собой величину 40-ΔΔСТ, равную 41,1, предельное значение для ESR1 представляет собой величину 40-ΔΔСТ, равную 38,00, предельное значение для PGR представляет собой величину 40-ΔΔСТ, равную 35,50, и предельное значение для Ki67 представляет собой величину 40-ΔΔСТ, равную 35,50 данные получают на приборе LightCycler^® 480 instrument II («Roche»).

В одном из воплощений, стадии (а), (b), (с) и (d) и/или (е) выполняют в случайном порядке. В одном из воплощений, стадию (а) выполняют перед стадиями (b), (с) и (d) и/или (е). В одном из воплощений, стадию (d) и/или стадию (е) выполняют после стадий (а), (b) и (с). В одном из воплощений, стадию (а) выполняют перед стадией (b), стадию (b) выполняют перед стадией (с), и стадию (с) выполняют перед стадией (d) и/или стадию (е).

В одном из воплощений, уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта HER2, выявлял молекулярный подтип опухоли как HER2-позитивный.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже или выше определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как трижды негативный.

В одном из воплощений, молекулярный подтип представляет собой люминальный А или люминальный В.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный В.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный А.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже или выше определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный В.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный В.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный А.

В одном из воплощений,

- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;

- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта PGR; и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67

выявлял молекулярный подтип опухоли как люминальный В.

В одном из воплощений, способ включает стадию (d), и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1 и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67

указывает на повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного, в особенности, повышенный риск отдаленных метастазов.

В одном из воплощений, способ включает стадию (е), и уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, указывает на повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного (по сравнению с риском онкологического больного с опухолью, имеющего уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1).

Определение уровня экспрессии РНК-транскрипта как для Ki67, так и для RACGAP1, обеспечивает более точную информацию о клиническом исходе для онкологического больного, при этом, в общем, повышенный уровень экспрессии РНК-транскрипта или Ki67, или RACGAP1 указывает на повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного (по сравнению с риском онкологического больного с опухолью, имеющего уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67 или RACGAP1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67 или RACGAP1).

В одном из воплощений, способ включает стадии (d) и (е), и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67 и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1

указывает на повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного.

В одном из воплощений, способ включает стадии (d) и (е), и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67 и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышавший определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1

указывает на дополнительно повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного (по сравнению с повышенным риском для онкологического больного с опухолью, имевшей уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67, и уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышающего определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, при этом, предпочтительно, дополнительное увеличение относится к увеличению, по меньшей мере, на 5%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 10%).

Термин «клинический исход» определяют как клинический результат заболевания, в особенности, после проведения лечения, например, снижение или облегчение симптомов. В одном из воплощений, неблагоприятный клинический исход включает относительное снижение в одном или нескольких из выживаемости, безрецидивной выживаемости и отдаленной безрецидивной выживаемости. Термин «рецидив» в отношении рака включает повторное возникновение опухолевых клеток в том же месте и органе происхождения заболевания, метастазирование, которое может появиться даже через много лет после первоначального диагноза и терапии рака, или к местным событиям, таким как инфильтрация опухолевых клеток в регионарные лимфатические узлы. Термин «отдаленные метастазы» относится к сценарию, когда раковые клетки распространяются (метастазируют) в отдаленную часть (т.е., в другой орган) организма за пределами регионарных лимфатических узлов. Безрецидивную выживаемость, как правило, определяют как время от рандомизации до первого рецидива, обострения, повторного рака или смерти.

Термин «метастазирование» применяют для обозначения распространения раковых клеток от места их происхождения к другой части организма. Образование метастазов представляет собой очень сложный процесс и зависит от отрыва злокачественных клеток от первичной опухоли, инвазии внеклеточного матрикса, проникновение эндотелиальных базальных мембран для входа в полость тела и сосудов, и затем, после транспортировки кровью, инфильтрации органов-мишеней. Наконец, рост новой опухоли в сайте-мишени зависит от ангиогенеза. Метастазирование опухоли часто происходит даже после удаления первичной опухоли, поскольку опухолевые клетки или компоненты могут сохранять и развивать метастатический потенциал.

В одном из воплощений, «повышенный риск неблагоприятного клинического исхода» относится к вероятности пятилетней выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 20% ниже, предпочтительно, по меньшей мере, на 25% ниже, чем вероятность пятилетней выживаемости после лечения онкологического больного с опухолью, имеющей

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67 и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1.

В одном из воплощений, термин «дополнительно повышенный риск неблагоприятного клинического исхода» относится к вероятности пятилетней выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 30% ниже, предпочтительно, по меньшей мере, на 35% ниже, чем вероятность пятилетней выживаемости после лечения онкологического больного с опухолью, имеющей

- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67 и

- уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, который был ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1.

В одном из воплощений, уровень экспрессии РНК-транскрипта определяют с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) (количественная ОТ-ПЦР). Поскольку РНК не может быть непосредственно амплифицирована в ПЦР, она должна быть обратно транскрибирована в кДНК с помощью фермента обратная транскриптаза. Для этой цели, можно применять одностадийную количественную ОТ-ПЦР, которая сочетает в себе реакции обратной транскрипции с амплификацией ДНК в ПЦР в одной и той же реакции. В одностадийной количественной ОТ-ПЦР, матрицу РНК смешивают в реакционной смеси, содержащей обратную транскриптазу, ДНК-полимеразу, праймеры и зонды, разные dNTP, соли и детергенты. На первой стадии ПЦР, целевую РНК обратно транскрибируют с помощью обратной транскриптазы, применяя направленные обратные праймеры. Впоследствии, кДНК амплифицируют с применением праймеров/зондов и ДНК-полимеразу.

В одном из воплощений, количественная ПЦР представляет собой количественную ПЦР в реальном времени с флуоресцентной меткой. Количественная ПЦР в реальном времени с флуоресцентной меткой включает применение флуоресцентно меченого зонда. Предпочтительно, флуоресцентно меченый зонд состоит из олигонуклеотида, меченного и красителем флуоресцентного репортера и красителем гасителя флуоресценции (= зонд с двойной меткой). Подходящие красителем/функциональные группы флуоресцентного репортера и гасителя флуоресценции известны специалисту в данной области техники и включают, без ограничений красители/функциональные группы репортеров 6-FAM™, JOE™, Cy5^®, Cy3^® и красители/функциональные группы гасителей флуоресценции Dabcyl, TAMRA™, BHQ™-1, -2 или -3. Амплификация зонд-специфического продукта приводит к расщеплению зонда (= опосредованное амплификацией вытеснение зонда), тем самым генерируя рост флуоресценции репортера. Увеличение флуоресценции в реакции прямо пропорционально увеличению целевых амплификатов. При применении системы LightCycler 480 II («Roche») или системы Versant kPCR («Siemens») или системы Мх3005Р («Agilent Technologies») или равнозначных инструментов измерения в режиме реального времени для детекции происходящей от зонда флуоресценции, можно измерить рост флуоресценции в режиме реального времени. Результат анализа на выходе представляет собой величину СТ для каждой мишени. Величину СТ (пороговый цикл) определяют по количеству циклов ПЦР-амплификации, после которого сигнал флуоресценции зонда превысит определенный фоновый сигнал, в котором величина СТ представляет собой меру для количества целевых молекул в образце перед ПЦР-амплификацией. Предпочтительно, СТ-значения дополнительно анализируют с помощью соответствующего программного обеспечения (например, Microsoft Excel™) или пакетов статистических программ (например, SAS JMP^® 9.0.0, GraphPad Prism4, Genedata Expressionist™). Величина СТ также может быть преобразована в абсолютное количество целевых молекул (например, нг/мкл или молекул/мкл) на основании результатов по стандартной кривой СТ с известными целевыми концентрациями. Альтернативно, целевое количество может учитываться как х-кратное сниженное или увеличенное количество на основании референсного значения (=ΔCT). Низкие значения ΔСТ (небольшая разница) указывают на более высокие количества мишени относительно референсного значения по сравнению с высокими ΔСТ (большая разница). Целесообразно повторно вычислять ΔСТ путем вычитания ее из фиксированной величины (такой как количество ПЦР-циклов, например, 40). Результат представляет собой величину с прямой корреляцией целевому количеству (высокая величина = большое количество) и его выражают как значение 40-ΔСТ, в котором одно целое число относится к удвоению количества мишени (например, величина 34 указывает на количество, которое вдвое больше, чем количество с величиной 33). В зависимости от желаемой воспроизводимости и точности системы, можно создать панель множественных референсных анализов или повторно вычислить/нормализовать ΔСТ образца с ΔСТ калибратора (калибровка по одной точке; Pfaffl (2001), Nucleic Acid Res., 29(9): e45). При применении различных флуорофоров для конкретных зондов также существует возможность мультиплексирования различных целевых анализов в той же реакции. В процессе ПЦР, каждую мишень в мультиплексе амплифицируют параллельно, но детектируют отдельно, применяя различную эмиссию флуоресценции.

Предпочтительно, праймеры для применения в соответствии с настоящим изобретением имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, в особенности, дезоксирибонуклеотидов. В одном из воплощений, праймеры были сконструированы таким образом, чтобы (1) быть специфическими для последовательности мРНК-мишени (т.е. HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1), (2) обеспечивать ампликон, размером менее чем 120 п.о. (предпочтительно, менее чем 100 п.о.), (3) обнаруживать все известные кодирующие белок варианты сплайсинга, (4) не включать известные полиморфизмы (например, однонуклеотидные полиморфизмы, SNP), (5) быть мРНК-специфичными (рассмотрение экзонов/интронов; предпочтительно, без амплификации ДНК), (6) не иметь тенденции к димеризации и/или (7) иметь температуру плавления T_m в диапазоне от 58°С до 62°С (предпочтительно, T_m приблизительно равна 60°С).

Как применен в настоящем документе, термин «нуклеотид» включает нативные (природные) нуклеотиды, которые включают азотистое основание, выбираемое из группы, состоящей из аденина (А), тимидина (Т), цитозина (С), гуанина (G) и урацила (U), сахара, выбираемого из группы рибозы, арабинозы, ксилозы и пиранозы и дезоксирибозы (комбинация основания и сахара, в общем, называется «нуклеозид»), и от одной до трех фосфатных групп, и которые могут образовывать фосфодиэфирные межнуклеотидные связи. Кроме того, как применен в настоящем документе, термин «нуклеотид» относится к аналогам нуклеотидов. Как применен в настоящем документе, термин «аналог нуклеотида» означает аналог A, G, С, Т или U (то есть, аналог нуклеотида, включающий основание A, G, С, Т или U), которое распознается ДНК или РНК-полимеразой (той, что будет применена) и включены в цепь ДНК или РНК (ту, что будет применена). Примеры таких аналогов нуклеотидов включают, без ограничений, 5-пропинил-пиримидины (т.е., 5-пропинил-dTTP и 5-пропинил-dCTP), 7-деаза-пурины (т.е., 7-деаза-dATP и 7-деаза-dGTP), аминоаллил-dNTP, биотин-AA-dNTP, 2-амино-dATP, 5-метил-dCTP, 5-иодо-dUTP, 5-бромо-dUTP, 5-фторо-dUTP, N4-метил-dCTP, 2-тио-dTTP, 4-тио-dTTP и альфа-тио-dNTP. Также включают меченые аналоги, например, флуоресцентные аналоги, такие как DEAC-пропилендиамин (PDA,)-ATP, аналоги на основе морфолиновых аналогов нуклеозидов, а также запертые нуклеиновые кислоты (LNA).

Формулировка «специфичный для последовательности мРНК-мишени», как применена в связи с праймерами для применения в соответствии с настоящим изобретением, предназначена для отсылки к способности праймера к гибридизации (т.е. к отжигу) с кДНК последовательности мРНК-мишени в соответствующих условиях температуры и ионной силы раствора, в особенности, в условиях ПЦР. Условия температуры и ионной силы раствора определяют жесткость гибридизации. Гибридизация требует, чтобы две нуклеиновые кислоты (т.е. праймер и кДНК) содержали комплементарные последовательности, хотя в зависимости от жесткости гибридизации, возможны несоответствия между основаниями. В одном из воплощений, «соответствующие условия температуры и ионной силы раствора» относятся к температуре в диапазоне от 58°С до 62°С (предпочтительно, температура равна приблизительно 60°С) и к ионной силе раствора, как правило, применяемой в реакционных смесях для ПЦР. В одном из воплощений, последовательность праймера на 80%, предпочтительно, на 85%, более предпочтительно, на 90%, еще более предпочтительно, на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарна соответствующей последовательности кДНК последовательности мРНК-мишени, определенной с помощью алгоритмов сравнения последовательностей, известных в данной области техники.

В одном из воплощений, праймер гибридизуется с последовательностью кДНК мРНК-мишени в жестких или умеренно жестких условиях гибридизации. Термин «жесткие условия гибридизации», как определен в настоящем документе, включает гибридизацию при 68°С в 5х SSC/5x растворе Денхардта/1,0% SDS, и отмывку в 0,2х SSC/0,1% SDS при комнатной температуре, или включает его эквивалент, признанный в данной области техники (например, условия в которых гибридизацию осуществляют при 60°С в 2,5 х SSC-буфере, с последующим несколькими стадиями отмывки при 37°С в буфере с низкой концентрацией, и остается стабильным). Термин «умеренно жесткие условия гибридизации», как определен в настоящем документе, включает отмывку в 3х SSC при 42°С, или ее эквивалент, признанный в данной области техники. Параметры концентрации солей и температуры можно варьировать для достижения оптимального уровня идентичности между праймером и нуклеиновой кислотой мишенью. Руководство относительно таких условий доступно в данной области техники, например, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; и Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, N.Y.).

В одном из воплощений, способ настоящего изобретения включает применение ESR1-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2, и/или HER2-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 4 и 5, и/или Ki67-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, и/или PGR-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 10 и 11, и/или RACGAP1-специфических праймеров, длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 13 и 14. В одном из воплощений, специфические праймеры включали, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из указанных выше последовательностей.

В одном из воплощений, способ включает применение ESR1-специфических праймеров, имеющих последовательность SEQ ID NO: 1 и 2, и/или HER2-специфических праймеров, имеющих последовательность SEQ ID NO: 4 и 5, и/или Ki67-специфических праймеров, имеющих последовательность SEQ ID NO: 7 и 8, и/или PGR-специфических праймеров, имеющих последовательность SEQ ID NO: 10 и 11, и/или RACGAP1-специфических праймеров, имеющих последовательность SEQ ID NO: 13 и 14.

Предпочтительно, зонды для применения в соответствии с настоящим изобретением имеют длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов, в особенности, дезоксирибонуклеотидов. В одном из воплощений, зонды сконструированы таким образом, чтобы (1) быть специфичными для последовательности мРНК-мишени (т.е. HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1), (2) не включать известные полиморфизмы (например, однонуклеотидные полиморфизмы, SNP) и/или (3) иметь температуру плавления T_m, которая приблизительно от 5°С до 8°С выше, чем температура плавления T_m соответствующего праймера (соответствующих праймеров).

Формулировка «специфичный для последовательности мРНК-мишени», как применена в связи с зондами для применения в соответствии с настоящим изобретением, предназначена для отсылки к способности зонда к гибридизации (т.е. к отжигу) с (амплифицированной) кДНК последовательностью мРНК-мишени в соответствующих условиях температуры и ионной силы раствора, в особенности, в условиях ПЦР. Условия температуры и ионной силы раствора определяют жесткость гибридизации. Гибридизация требует, чтобы две нуклеиновые кислоты (т.е. зонд и кДНК) содержали комплементарные последовательности, хотя в зависимости от жесткости гибридизации, возможны несоответствия между основаниями. В одном из воплощений, «соответствующие условия температуры и ионной силы раствора» относятся к температуре в диапазоне от 63°С до 70°С и к ионной силе раствора, как правило, применяемым в реакционных смесях для ПЦР. В одном из воплощений, последовательность зонда на 80%, предпочтительно, на 85%, более предпочтительно, на 90%, еще более предпочтительно, на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарна соответствующей последовательности (амплифицированной) кДНК последовательности мРНК-мишени, определенной с помощью алгоритмов сравнения последовательностей, известных в данной области техники.

В одном из воплощений, зонд гибридизуется с (амплифицированной) последовательностью кДНК мРНК-мишени в жестких или умеренно жестких условиях гибридизации, как определены выше.

В одном из воплощений, способ включает применение ESR1-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 3, и/или HER2-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 6, и/или Ki67-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 9, и/или PGR-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 12, и/или RACGAP1-специфического зонда, длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 15. В одном из воплощений, специфические зонды включали, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов указанных выше последовательностей.

В одном из воплощений, способ включает применение ESR1-специфического зонда, имеющего последовательность SEQ ID NO: 3, и/или HER2-специфический зонда, имеющего последовательность SEQ ID NO: 6, и/или Ki67-специфический зонда, имеющего последовательность SEQ ID NO: 9, и/или PGR-специфический зонда, имеющего последовательность SEQ ID NO: 12, и/или RACGAP1-специфический зонда, имеющего последовательность SEQ ID NO: 15.

Предпочтительно, зонды, как определены выше, представляют собой зонды с двойной меткой, включающей фрагмент репортера флуоресценции и фрагмент гасителя флуоресценции.

В одном из воплощений, уровень экспрессии нормализовали по отношению к (среднему) уровню экспрессии одного или нескольких референсных генов в образце опухоли. Термин «референсный ген», как применен в настоящем документе, предназначен для отсылки к гену, который имеет относительно неизменный уровень экспрессии на уровне РНК-транскрипт/мРНК в системе, которую предстоит исследовать, т.е. при раке. Такой ген может быть назван ген домашнего хозяйства. В одном из воплощений, один или несколько референсных генов выбирают из группы, включающей CALM2, В2М, RPL37A, GUSB, HPRT1 и GAPDH, предпочтительно, CALM2 и/или В2М.

Как применен в настоящем документе, CALM2 относится к калмодулину-2, киназе фосфорилазы, дельта (Ref. Seq. (мРНК): NM_001743), В2М относится к бета-2 микроглобулину (Ref. Seq. (мРНК): NM_004048), RPL37A относится к 60S рибосомальному белку L37a (Ref. Seq. (мРНК): NM_000998), GUSB относится к бета-глюкуронидазе (Ref. Seq. (мРНК): NM_000181), HPRT1 относится к гипоксантин-фосфорибозилтрансферазе 1 (Ref. Seq. (мРНК): NM_000194) и GAPDH относится к лицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназе (Ref. Seq. (мРНК): NM_002046).

В дополнительном аспекте, изобретение относится к способу стратификации онкологических больных для лечения опухоли, указанный способ, включающий, в качестве первой стадии, идентификацию молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного с помощью in vitro способа, как определен выше, и, в качестве второй стадии, выбор схемы лечения опухоли на основании молекулярного подтипа, идентифицированного in vitro способом.

«Стратификацию онкологических больных для лечения опухоли» в соответствии с настоящим изобретением включает отнесение онкологического больного к группе пациентов, имеющих конкретный молекулярный подтип опухоли, что затем позволит практикующему врачу выбрать наиболее подходящую схему лечения опухоли.

В одном из воплощений, указанный способ стратификации онкологических больных для лечения опухоли не включает каких-либо других стадии, таких как гистологическая классификация или определение статуса лимфатических узлов, помимо стадии идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного с применением in vitro способа, как определен выше.

В одном из воплощений, молекулярный подтип выбирают из группы, включающей HER2-позитивный, трижды негативный, люминальный А и люминальный В подтип.

В одном из воплощений,

- молекулярный подтип представляет собой HER2-позитивный подтип, и схема лечения опухоли включает введение анти-HER2 антител и химиотерапевтических средств;

- молекулярный подтип представляет собой трижды негативный подтип, и схема лечения опухоли включает введение химиотерапевтических средств;

- молекулярный подтип представляет собой люминальный А подтип, и схема лечения опухоли включает эндокринную терапию; или

- молекулярный подтип представляет собой люминальный В подтип, и схема лечения опухоли включает эндокринную терапию и, необязательно, введение химиотерапевтических средств.

Моноклональные анти-HER2 антитела включают трастузумаб (Herceptin^®) и пертузумаб (Perjeta^®), которые могут быть введены отдельно или в комбинации. Трастузумаб эффективен только в раках, где происходит гиперэкспрессия HER2. Другие моноклональные антитела, такие как эртумаксомаб (Rexomun^®), в данный момент проходит клинические испытания. Анти-HER2 антитела могут быть дополнительно модифицированы для включения терапевтической группировки/средств, таких как цитотоксическое средство, лекарственное средство (например, иммунодепрессант), химиотерапевтическое средство или радионуклид, или радиоактивный изотоп. Цитотоксин или цитотоксическое средством включает любое средство, которое вредно для клеток и, в особенности, убивает клетки. Примеры включают мертанзин (DM1), таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацен, дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, аманитин, 1-дигидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаина, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги и гомологи. Другие подходящие терапевтические средства для образования конъюгатов антител включают, без ограничений, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-фторурацилдекарбазин), алкилирование средства (например, мехлорэтамин, тиоэпахлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, митомицин С и цис- дихлордиамин платины (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (бывший дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (бывший актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)), и антимитотические средства (например, винкристин и винбластин). В предпочтительном воплощении, терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое средство или радиотоксичное средство. В другом воплощении, терапевтическое средство представляет собой иммунодепрессант. Еще в одном воплощении, терапевтическое средство представляет собой GM-CSF. В предпочтительном воплощении, терапевтическое средство представляет собой доксорубицин, цисплатин, блеомицин, сульфат, кармустин, хлорамбуцил, циклофосфамид или рицин А. Дополнительные терапевтические группировки включают терапевтические группировки, действующие на синтез мРНК и/или белка. Известны несколько ингибиторов транскрипции. Например, актиномицин D, который представляет собой как ингибитора транскрипции, так и средство, повреждающее ДНК, которое встраивается внутри ДНК и таким образом ингибирует этап инициирования транскрипции. Флавопиридол нацелен на стадию элонгации транскрипции. αАрнанитин связывается непосредственно с РНК-полимеразой II, что приводит к торможению как стадий инициации, так и стадии элонгации. Анти-HER2 антитела также могут быть конъюгированы с радиоизотопом, например, с йодом-131, иттрием-90 или индием-III, с образованием цитотоксических радиофармацевтических средств. Введение небольших соединений, нацеленных на HER2, таких как лапатиниб (Tykerb^® или Tyverb^®) представляет собой альтернативу введению анти-HER2 антител.

Химиотерапевтические средства в соответствии с изобретением включают цитостатические соединения и цитотоксические соединения. Традиционные химиотерапевтические средства действуют, убивая клетки, которые быстро делятся, одно основных свойств большинства раковых клеток. В соответствии с изобретением, термин «химиотерапевтическое средство» включает таксаны, соединения платины, аналоги нуклеозидов, аналоги камптотецина, антрациклины и аналоги антрациклин, этопозид, блеомицин, винорелбин, циклофосфамид, антиметаболиты, антимитотические средства и алкилирующие средства, включая средства, раскрытые выше в связи с конъюгатами антител и их комбинациями. В соответствии с изобретением референсное, по отношению к химиотерапевтическому, средство должно включать любое пролекарство, такое как эфир, соль или производное, такое как конъюгат, указанного средства. Примеры представляют собой конъюгаты указанного средства с веществом-носителем, например, связанный с белком паклитаксел, такой как паклитаксел связанный с альбумином. Предпочтительно, соли указанного средства представляют собой фармацевтически приемлемые соли. Химиотерапевтические средства часто назначают в комбинации, обычно, в течение 3-6 месяцев. Один из наиболее распространенных видов лечения представляет собой назначение циклофосфамида плюс доксорубицин (адриамицин; принадлежащий к группе аналогов антрациклинов и антрациклин), известные как АС. Иногда, добавляют таксановое лекарственное средство, такое как доцетаксел, и тогда схема лечения известна как CAT; таксан атакует микротрубочки в раковых клетках. Другое распространенное лечение, который производит эквивалентные результаты, заключается в приеме циклофосфамида, метотрексата, который представляет собой антиметаболит, и фторурацила, который представляет собой аналог нуклеозида (CMF). Другое стандартное химиотерапевтическое лечение включает фторурацил, эпирубицин и циклофосфамид (FEC), которые могут быть дополнены доцетакселом или винорелбином.

Эндокринная терапия (противогормональное лечение) нацелена на раки, требующие эстрогена для продолжения роста, путем введения лекарственных препаратов, которые блокируют/негативно регулируют рецепторы эстрогена и/или прогестерона, например, тамоксифена (Nolvadex^®) или фулвестранта (Faslodex^®), или альтернативно блокируют выработку эстрогена ингибитором ароматазы, например, анастрозолом (Arimidex^®) или летрозолом (Femara^®). Однако ингибиторы ароматазы, подходят только пациентам в постменопаузе. Это происходит потому, что активная ароматаза у женщин в постменопаузе отличается от преобладающей формы фермента у женщин в пременопаузе, и поэтому эти средства неэффективны в ингибировании преобладающей ароматазы у женщин в пременопаузе.

В одном из воплощений, молекулярный подтип представляет собой люминальный В, и схема лечения опухоли включает введение химиотерапевтических средств.

В одном из воплощений, молекулярный подтип представляет собой люминальный В, и схема лечения опухоли включает введение таксана, предпочтительно, доцетаксела.

В одном из воплощений, таксан вводят в комбинации с фторурацилом, эпирубицином и циклофосфамидом (FEC).

В дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения рака, указанный способ, включающий, в качестве первой стадии, стратификацию онкологических больных для лечения опухоли с помощью in vitro способа, как определен выше, и, в качестве второй стадии, обеспечение выбранной схемы лечения опухоли у онкологического больного. Схему лечения опухоли выбирают на основании молекулярного подтипа, идентифицированного in vitro способом, как определен выше.

В одном из воплощений, указанный способ включает применение количественных результатов, полученных с помощью in vitro способа, как определен выше, для непосредственного принятия решений в пользу или против адъювантной/неоадъювантной химиотерапии.

В еще одном дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к набору, применяемому для идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ), указанный набор, включающий:

- по меньшей мере, одну пару HER2-специфических праймеров и, по меньшей мере, один HER2-специфический зонд;

- по меньшей мере, одну пару ESR1-специфических праймеров и, по меньшей мере, один ESR1-специфический зонд;

- по меньшей мере, одну пару PGR-специфических праймеров и, по меньшей мере, один PGR-специфический зонд; и

- по меньшей мере, одну пару Ki67-специфических праймеров и, по меньшей мере, один Ki67-специфический зонд; и/или

- по меньшей мере, одну пару RACGAP1-специфических праймеров и, по меньшей мере, один RACGAP1-специфический зонд.

В одном из воплощений, количественная ПЦР представляет собой количественную ПЦР в реальном времени с флуоресцентной меткой.

В одном из воплощений, обнаружение зонда основано на опосредованном амплификацией вытеснении зонда.

В одном из воплощений, зонд представляет собой зонд с двойной меткой, включающей фрагмент репортера флуоресценции и фрагмент гасителя флуоресценции.

В одном из воплощений, набор дополнительно включает обратную транскриптазу и ДНК-полимеразу.

В одном из воплощений, обратную транскриптазу и полимеразу обеспечивают в виде смеси ферментов, что позволяет проводить количественную ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ) в одну стадию.

В одном из воплощений, набор дополнительно включает, по меньшей мере, одну пару праймеров, специфических для референсных генов, и, по меньшей мере, один зонд, специфический для референсных генов. В одном из воплощений, референсные гены представляют собой один или несколько генов, которые выбирают из группы, включающей CALM2, В2М, RPL37A, GUSB, HPRT1 и GAPDH, предпочтительно, CALM2 и/или В2М.

В одном из воплощений, набор дополнительно включает, по меньшей мере, один контрольный образец РНК. В одном из воплощений, по меньшей мере, один контрольный образец РНК применяют в качестве позитивного контроля и/или контрольного образца (калибратора), в котором, предпочтительно, по меньшей мере, один контрольный образец РНК включает синтетическую мРНК, кодирующую один или несколько генных продуктов (или их частей) одного или нескольких генов, которые выбирают из группы, включающей HER2, ESR1, PGR, Ki67, RACGAP1 и один или несколько референсных генов. В одном из воплощений, один или несколько референсных генов выбирают из группы, включающей CALM2, В2М, RPL37A, GUSB, HPRT1 и GAPDH, предпочтительно, CALM2 и/или В2М.

В одном из воплощений, набор может дополнительно включать ДНКазу и реакционный буфер для ДНКазы.

Предпочтительно, праймеры и зонды были такими, как определены дополнительно выше в связи с in vitro способом настоящего изобретения.

В одном из воплощений, праймеры обеспечивают ампликон, размером менее чем 120 п.о., предпочтительно, менее чем 100 п.о.

В одном из воплощений, ESR1-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2, и/или HER2-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 4 и 5, и/или Ki67-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, и/или PGR-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 10 и 11, и/или RACGAP1-специфические праймеры имели длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов и включали, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 13 и 14. В одном из воплощений, специфические праймеры включали, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов указанных выше последовательностей.

В одном из воплощений, ESR1-специфические праймеры имели последовательности SEQ ID NO: 1 и 2, и/или HER2-специфические праймеры имели последовательности SEQ ID NO: 4 и 5, и/или Ki67-специфические праймеры имели последовательности SEQ ID NO: 7 и 8, и/или PGR-специфические праймеры имели последовательности SEQ ID NO: 10 и 11, и/или RACGAP1-специфические праймеры имели последовательности SEQ ID NO: 13 и 14.

В одном из воплощений, ESR1-специфический зонд имел длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 3, и/или HER2-специфический зонд имел длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 6, и/или Ki67-специфический зонд имел длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 9, и/или PGR-специфический зонд имел длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 12, и/или RACGAP1-специфический зонд имел длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 15. В одном из воплощений, специфические зонды включали, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов из указанных выше последовательностей.

В одном из воплощений, ESR1-специфический зонд имел последовательность SEQ ID NO: 3, и/или HER2-специфический зонд имел последовательность SEQ ID NO: 6, и/или Ki67-специфический зонд имел последовательность SEQ ID NO: 9, и/или PGR-специфический зонд имел последовательность SEQ ID NO: 12, и/или RACGAP1-специфический зонд имел последовательность SEQ ID NO: 15.

Предпочтительно, зонды, как определены выше, представляют собой зонды с двойной меткой, включающие фрагмент репортера флуоресценции и фрагмент гасителя флуоресценции.

В одном из воплощений, опухоль представляет собой солидную опухоль. В одном из воплощений, опухоль представляет собой опухоль молочной железы или происходит от опухоли молочной железы (например, в результате метастазирования). В одном из воплощений, рак представляет собой рак молочной железы.

Как применен в настоящем документе, термин «набор частей (коротко: набор)» относится к изделию промышленного производства, включающему один или несколько контейнеров и, необязательно, носитель данных. Указанные один или несколько контейнеров могут быть заполнены одним или несколькими из вышеперечисленных средств или реагентов. В набор могут быть включены дополнительные контейнеры, которые содержат, например, разбавители, буферы и дополнительные реагенты, такие как различные dNTP. Указанный носитель данных может представлять собой неэлектронный носитель данных, например, графический носитель данных, такой как информационная брошюра, информационный листок, штрих-код или код доступа, или электронный носитель данных, такой как дискета, компакт-диск (CD), цифровой универсальный диск (DVD), микрочип или другой полупроводниковый электронный носитель данных. Код доступа может предоставить доступ к базе данных, например, к базе данных в интернете, к централизованной или децентрализованной базе данных. Указанный носитель данных может включать инструкции по применению набора в способах изобретения. Данный носитель может включать пороговую величину или референсный уровень РНК-транскрипта, например, мРНК. В случае если данный носитель включает код доступа, который дает доступ к базе данных, указанная пороговая величина или референсный уровень хранятся в этой базе данных. Кроме того, данный носитель может включать информацию или инструкции по осуществлению способов настоящего изобретения.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к применению набора, как определен выше, для идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к применению набора, как определен выше, для оценки риска отдаленных метастазов у онкологического больного.

Настоящее изобретение преодолевает основные недостатки диагностического способа иммуногистохимия и более современных способов настоящего стандартного и известного уровня техники.

Настоящее изобретение позволяет осуществлять надежное молекулярное субтипирование опухолей, в особенности, опухолей молочной железы, которое затем позволяет практикующему врачу осуществить выбор наиболее подходящей схемы лечения опухоли.

Благодаря применению предпочтительного порядка оценки четырех или пяти маркеров (предпочтительно, уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2 определяют первым), отсутствует неверная классификация HER2-позитивного подтипа в люминальных А и В подтипах, проблема, которая часто возникает, если субтипирование базируется на иерархическом групповом анализе или корреляционном анализе (Perou et al. (2000), Nature, 406: 747-752; TCGA (Cancer Genome Atlas Network) (2012), Nature, 490: 61-70). Кроме того, отсутствует неверная классификация ложнопозитивных и клинически HER2-негативных опухолей, которые, по мнению Perou et al., могут возникать в до 30% этих случаев.

Настоящее изобретение обеспечивает способы и наборы для подтверждения/переоценки неопределенных или противоречивых результатов иммунохимического анализа, в особенности, в следующих группах пациентов с раком молочной железы, как это было определено с помощью ИГХ: ESR1/PGR негативных (приблизительно 30% всех больных раком молочной железы), ESR1/PGR слабо позитивных (приблизительно 15% всех больных раком молочной железы), HER2 3+ (ИГХ биопсии опухоли, не подтвержденная ИГХ диссекции опухоли; приблизительно 15% всех больных раком молочной железы) и HER 2+ (приблизительно 20% всех больных раком молочной железы).

Способы и наборы настоящего изобретения содействуют прямому принятию решений в пользу или против адъювантной/неоадъювантной химиотерапии при люминальном раке молочной железы из-за различий в люминальном А и люминальном В подтипах путем надежного детектирования РНК-транскрипта Ki67- и/или RACGAP1. В особенности, это полезно для пациентов, имеющих ESR1/PGR-позитивные и вплоть до степени 2 опухоли (приблизительно 50% всех больных раком молочной железы).

Настоящее изобретение позволяет различать люминальную А и люминальную В опухоли с явно отличающимися показателями общей выживаемости и выживаемости без отдаленных метастазов. В то время как пациенты с люминальным В подтипом имеют постоянно высокий риск метастазирования, в особенности, в течение первых пяти лет после лечения (например, хирургического вмешательства), то риск пациентов люминальным А подтипов постоянно и очевидно ниже. Таким образом, способы и наборы также позволяют оценивать риск пациента в отношении отдаленных метастазов.

При применении способов настоящего изобретения, приблизительно 77% люминальных опухолей в исследовании FinHER (Joensuu et al. (2006), N Engl J Med, 354: 809-820) относят к группе люминальной А с низким риском, и не существует групп с промежуточным риском. Кроме того, классификация на люминальный А и люминальный В подтипы снижает значимость гистологической классификации и нодального статуса, двух параметров, которые обычно очень важны для прогноза опухоли. Следовательно, неопределенности в отношении терапии опухоли степени 2 разрешаются клинически значимым образом.

Способы и наборы настоящего изобретения также дают возможность предсказывать ответ на системную терапию, благодаря количественному определению уровня экспрессии РНК-транскрипта ESR1, HER2, Ki67 и, необязательно, RACGAP1. В особенности, это полезно пациентам, имеющих инвазивный рак молочной железы >1 см с неопределенной ИГХ (приблизительно, 40% всех больных раком молочной железы).

Новизна настоящего изобретения включает не только основанную на мРНК оценку биомаркеров рака молочной железы, но также алгоритмическое определение подтипов. Включение обязательной позитивности для PGR при определении подтипа люминального А в дополнение к низкому Ki67 представляет собой оригинальный критерий, не включенный на момент изобретения в клинические рекомендации Санкт-Галлен 2011. Кроме того, опухоли, демонстрирующие экспрессию мРНК HER2, превышающую предварительно определенное пороговое значение, классифицируют как HER2-позитивные независимо от статуса ESR1/PGR, что также отклоняется от Международных стандартов 2011, которые до сих пор в силе. Все эти новые аспекты вносят вклад в предсказательную значимость подхода на основе количественной ОТ-ПЦР и набора настоящего изобретения. В действительности, эти нововведения, технические с точки зрения определения биомаркеров на основе количественной ОТ-ПЦР и теоретические в терминах алгоритма классификации, обеспечивают более точное и значимое субтипирование пациентов в клиническом испытании FinHer, что в конечном итоге обеспечивает прогностический инструмент для пользы применения доцетаксела в адъювантной терапии.

Вместе взятое, настоящее изобретение служит клиническим потребностям, в значительной степени неудовлетворенным в настоящее время, для надежной, воспроизводимой и количественной оценки прогноза и предсказания успеха терапии, по меньшей мере, у 50% от всех пациентов с раком молочной железы (смотри также фигуру 1).

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Определение уровней экспрессии мРНК с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) (количественная ОТ-ПЦР)

РНК изолировали из залитой в парафин, зафиксированной в формалине ткани (= FFPE ткани). Конкретно, тотальную РНК из от 5 до 10 мкм среза ткани опухоли FFPE экстрагировали с помощью набора High Pure RNA Paraffin Kit («Roche», Базель, Швейцария) или набора XTRAKT RNA Extraction Kit XL («Stratifyer Molecular Pathology», Кельн, Германия), количественно определяли РНК с помощью количественного анализа Ribogreen RNA Quantitation Assay («Molecular Probes», Eugene, OR) и квалифицировали с помощью флуоресценцентной ОТ-ПЦР в режиме реального времени фрагмента референсного гена RPL37A. Было признано, что между различными методиками экстракции существуют различия при сравнении количественных данных генов-мишеней последовательных срезов различными методиками. Для целей настоящего изобретения применение набора XTRAKT RNA Extraction Kit XL было предпочтительным. В общем 2,5 мкл РНК каждой квалифицированной экстракции (приблизительно 50-100 нг) было проанализировано с помощью количественной ОТ-ПЦР, как описано ниже.

Для более детального анализа экспрессии генов способами количественной ОТ-ПЦР, применяли праймеры, фланкирующие интересующую область, и зонд с флуоресцентной меткой, гибридизующийся между ними. Специфичные к мишени праймеры и зонды выбирали с помощью инструмента для конструирования праймеров NCBI (www.ncbi.nlm.nih.go). РНК-специфичные последовательности праймера/зонда применяли для включения РНК-специфичных измерений по локализации последовательностей праймера/зонда по границам экзон/экзон. Кроме того, праймеры/зонды выбирали так, чтобы они не связывались с областями последовательности с известными полиморфизмами (SNP). В случае, когда существуют множественные изоформы того же самого гена, праймеры выбирали дл амплификации всех соответствующих вариантов сплайсинга. Все пары праймеров были проверены на специфичность с помощью общепринятых ПЦР-реакций. После последующей оптимизации праймеров/зондов, праймеры и зонды, приведенные в таблице 1, давали наилучшие результаты. Данные праймеры/зонды превосходили праймеры/зонды, известные из предшествующего уровня техники, например, с точки зрения специфичности и эффективности амплификации. Для стандартизации количества образца РНК, в качестве референсных генов выбирали гены CALM2 и В2М, так как они не регулируются дифференцированно в анализируемых образцах.

Эксперименты по подтверждению TaqMan^® выполняли, для того чтобы показать, что эффективности мишени и контрольных амплификации приблизительно равны, что представляет собой необходимое условие для относительной количественной оценки экспрессии генов способом сравнения ΔCT. Для проведения анализа экспрессии представляющих интерес генов в биологическом образце, 4 × двойных реакционных смеси готовили смешиванием соответствующих праймеров/зондов двух специфичных анализов. Для отдельной детекции значений СТ аналитические зонды модифицировали разными флуоресцентными зондами. Каждая 4 × реакционная смесь содержала по 2 мкм немодифицированного прямого и обратного праймера и по 1,2 мкМ зонда. Для каждой реакция по 2,5. мкл суммарной РНК, экстрагированной из FFPE-срезов (смотри выше), смешивали с 2,5 мкл реакционной смеси, 2,5 мкл смеси ферментов и 2,5 мкл воды в одной лунке 96-луночного оптического реакционного планшета. Измерения ПЦР-реакций выполняли в соответствии с инструкции производителя с помощью Versant kPCR Cycler («Siemens») или Light Cycler 480 («Roche») в соответствующих условиях (5 мин 50°С, 20 сек 95°С, 15 сек 95°С, 1 мин 60°С; 40 циклов). Перед измерением настолько неклассифицированных биологических образцов, для стандартизации экспериментальных условий могут быть применены контрольные эксперименты, например, с клеточными линиями, контрольными образцами здоровых людей, образцами определенных молекулярных подтипов опухолей.

Пример 2: Молекулярное субтипирование опухолей на основании уровней экспрессии мРНК HER2, ESR1, PGR, Ki67 и, необязательно, RACGAP1

Для оценки опухолей молочной железы, в исследовании FinHER могли быть применены 855 из 1010 пациентов с раком молочной железы (Joensuu et al. (2006), N Engl J Med, 354: 809-820). Средние предельные значения (заданные как значения 40-ΔСТ) были следующими: HER2: 38; ESR1: 34; PGR: 30,2; Ki67: 31,7; и RACGAP1: 34,2. Предельные значения для HER2 и ESR1 определяли на основе оценки, полученной в предыдущих исследованиях (Koutras et al. (2008), Brit. J. of Canc., 99: 1775-1785; Pentheroudakis et al. (2009), Breast Cancer Res Treat 2009, 116: 131-143) с 268 образцами, и применяли к исследованию FinHER (подтверждение модели пропорциональных рисков). CALM2 служил в качестве референсного гена.

На основании уровня экспрессии мРНК HER2, ESR1, PGR и Ki67 (нег/низкий указывает на уровень экспрессии, который был ниже определенного порога экспрессии; поз/повышенный указывает на уровень экспрессии, превышавший определенный порог экспрессии) опухоли относят к молекулярным подтипам HER2-позитивный (HER2), люминальный A (LumA), люминальный В (LumB) и трижды негативный (TNT). Как показано в таблице 2, молекулярное субтипирование опухолей в соответствии с настоящим изобретением отличается от тех способов, которые основаны на предшествующем уровне техники, например, на иммуногистохимии Goldhirsch et al. (2011), Annals of Oncology, 22: 1736-1747, St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011) и анализе только трех генных маркеров (Sotiriou et al. (2009), N Engl J Med, 360(8): 790-800).

Фигура 2 показывает распределяющий тест для оценки прогностической и предсказательной значимости уровня экспрессии мРНК HER2, ESR1, PGR, Ki67 и RACGAP1 для пятилетней выживаемости пациентов с раком молочной железы. Эти данные показывают, что уровень экспрессии мРНК RACGAP1, который был ниже или выше определенного порога, связан с особенно значительными различиями в пятилетней выживаемости. Конкретно, повышенный уровень экспрессии мРНК RACGAP1 значительно снижает вероятность выживаемости. Вероятность выживаемости дополнительно снижается, если экспрессия мРНК RACGAP1 повышена, а экспрессия мРНК Ki67 низка (смотри таблицу 3). С существующими аналитическими процедурами, остаются необнаруженными данные пациенты с риском заболевания (которым необходим различного рода последующий уход, например, обследование с определенными способами визуализации).

Применяя анализ Каплана-Мейера, авторы изобретения проанализировали выживаемость пациентов с HER2-позитивными, люминальными А, люминальными В и трижды негативными опухолями, соответственно, при которой молекулярный подтип опухоли идентифицировали в соответствии с настоящим исследованием, т.е. на основании уровней экспрессии мРНК HER2, ESR1, PGR и Ki67. Как показано на фигуре 3, люминальный А подтип, как было определено авторами настоящего изобретения, связан с пятилетней общей выживаемостью, равной 97% (по сравнению с 87% для люминальных В и HER2-позитивных опухолей и 84% для трижды негативных опухолей).

Авторы изобретения дополнительно проанализировали выживаемость без отдаленных метастазов («DMFS»; отдаленный рецидив через X лет после операции) пациентов с HER2-позитивныи, люминальными А, люминальными В и трижды негативными опухолями, соответственно, при которой молекулярный подтип опухоли идентифицировали в соответствии с настоящим исследованием. Как показано на фигуре 4, люминальный А подтип, как было определено авторами настоящего изобретения, связан с показателем пятилетней выживаемости без отдаленных метастазов, равным 92% (по сравнению с 78% для люминальных В, HER2-позитивных и трижды негативных опухолей).

В многофакторном анализе общей выживаемости с наиболее важными гистопатологическими стандартными параметрами (размер опухоли, нодальный статус и гистологическая классификация) молекулярное субтипирование в соответствии с настоящим изобретением оказалось весьма значительным, тогда как гистологическая классификация и нодальный статус утратили свое значение.

Наконец, проводили многомерный регрессионный анализ Кокса для DMFS для сравнения молекулярного субтипирования способом иммуногистохимия (Sotiriou et al. (2009), N Engl J Med, 360(8): 790-800) с молекулярным субтипированием способом в соответствии с настоящим изобретением, на основании уровней экспрессии мРНК HER2, ESR1, PGR и Ki67 (фигура 5). Анализ ясно показал превосходство способа настоящего изобретения, поскольку иммуногистохимическое субтипирование теряет свою значимость, если результаты, полученные с помощью способа настоящего изобретения, включают в модели пропорциональных рисков Кокса.

Пример 3: Измерение уровня экспрессии мРНК биомаркеров HER2, ESR1, PGR, Ki67 с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) (количественная ОТ-ПЦР) и определения молекулярного подтипа

РНК изолировали из FFPE ткани. Конкретно, тотальную РНК из 10 мкм срезов опухоли FFPE ткани молочной железы экстрагировали с помощью набора XTRAKT RNA Extraction Kit («Stratifyer Molecular Pathology», Кельн, Германия). Элюаты РНК применяли непосредственно без определения концентрации. 2,5 мкл РНК из каждой экстракции анализировали с помощью количественной ОТ-ПЦР, как описано ниже.

Для количественной ОТ-ПЦР, праймеры, фланкирующие представляющую интерес область, и 5'-флуоресцентно меченный гидролизуемый зонд с 3'-TAMRA или Dabcyl Quencher применяли для каждой мишени. Примененные праймеры и зонды приведены в таблице 1. Для коррекции различных количеств образца РНК, гены CALM2 и В2М применяли в качестве референсных генов для нормализации результатов экспрессии. Количественную ОТ-ПЦР проводили в двойных повторах в следующих комбинациях, HER2/ESR1, Ki67/В2М и PGR/CALM2. Каждая из трех 4х реакционных смесей содержала 2 мкМ немодифицированного прямого и обратного праймера и 1,2 мкМ зонда. Для каждого анализа, готовили мастер-микс с 2,5 мкл реакционной смеси, 2,5 мкл 4х смеси ферментов (TaqManFast Virus 1-Step MasterMix, «Life Technologies») и 2,5 мкл воды на реакцию, и 7,5 мкл каждой из мастер-микс распределяли в 96-луночный реакционный планшет kPCR в тройных повторах. 2,5 мкл суммарной РНК, экстрагированной из срезов FFPE (смотри выше), или, альтернативно, к каждой лунке добавляли позитивный (IVT RNA) или негативный (вода) контроль. Анализ элюатов РНК, полученных от трех образцов пациентов, выполняли с тремя сериями реакционных смесей и ферментных смесей. Измерение реакций 1-стадийной количественной ОТ-ПЦР выполняли в соответствии с инструкциями производителя с помощью Versant kPCR Cycler («Siemens») со следующим температурным профилем: 5 мин 50°С, 20 сек 95°С, каждый один цикл и 15 сек 95°С, 1 мин 60°С, для 40 циклов.

6 образцов пациентов вместе с позитивными и негативными контролями анализировали с тремя сериями реакционных смесей. Значения 40-ΔΔСТ рассчитывали в соответствии с приведенным выше описанием (способ расчета 4). Фигуры 6-9 показывают значения 40-ΔΔСТ для каждого маркера, для каждого образца и серии. Предельные значения (заданные как значения 40-ΔΔСТ) для классификации биомаркеров на позитивные или негативные были следующими: HER2: 40,90; ESR1: 38,20; PGR: 34,90; Ki67: 34,80. Молекулярный подтип определяли, как показано в таблице 4.

Только небольшие различия можно наблюдать в результатах между различными сериями реагентов. Качество проведения анализа было очень надежным и воспроизводимым для всех маркеры. Таблицы 5-7 показывают значения 40-ΔΔСТ и позитивные или негативные результаты для каждого маркера и перевод в соответствующий подтип, как определен в таблице 4 (смотри также таблицу 2). Результаты по маркерам (поз/нег) и подтипами были согласованными для всех 6-ти образцов, измеренных с тремя различными сериями реагентов.

Пример 4: Сравнение субтипирования рака молочной железы с помощью количественной ОТ-ПЦР и ИГХ с точки зрения клинического исхода

Фигуры 10-19 изображают кривые выживаемости Каплана-Мейера для различных подтипов опухоли (люминального В, HER2-позитивного, люминального А и тройного негативного рака молочной железы [TNBC]), получавших различные химиотерапевтические средства (доцетаксел или винорелбин). Подтипы, определенные с помощью количественной ОТ-ПЦР в соответствии с настоящим изобретением, показаны на панели А, а подтипы, определенные с помощью ИГХ, показаны на панели В. Пунктирной линией отмечена 5-летняя временная точка для вычисления результатов.

Данные, представленные на фигурах 10-19, в совокупности выделяют превосходство новой классификации рака молочной железы на основе определения РНК с помощью количественной ОТ-ПЦР по сравнению с общепринятой ИГХ на основе определения белка. Данные указывают на значительное преимущество лечения доцетакселом для люминальной В опухоли. Напротив, основанное на ИГХ субтипирование не в состоянии показать достоверное преимущество в каком-либо подтипе с некоторыми тенденциями у больных с люминальным А, люминальным В и трижды негативным раком молочной железы. Однако поскольку данные 3 подтипа включают ~80% всех пациентов, то основанное на ИГХ субтипирование не обеспечивает никакой клинически полезной предсказательной информации.

Важно отметить, пациенты с люминальными В опухолями, определенными количественной ОТ-ПЦР, извлекали статистически значимое и исключительное преимущество от получения доцетаксела по сравнению с пациентами, получавшими винорелбин при комбинированном лечении фторурацилом, эпирубицином и циклофосфамидом (FEC). Такие пациенты оставались свободными от метастазирования и жили значительно дольше, если получали доцетаксел, в то время как при получении винорелбина их результаты были очевидно хуже. Эту разницу в результатах между двумя химиотерапевтическими схемами лечения не наблюдали ни в одном другом подтипе за исключением люминального В. Интересно отметить, что доцетаксел, по-видимому, даже уступает винорелбину в случае люминальной А опухоли. Хотя данные эффект не достигает статистической достоверности, он явно исключает возможность полезного эффекта лечение доцетакселом люминальных А пациентов, как это видно у люминальных В пациентов, идентифицированных с помощью количественной ОТ-ПЦР.

Напротив, если пациентов субтипировали с помощью ИГХ, эффект, оказываемый на клинический исход типом схемы лечения, был неоднозначен из-за неточной классификации. Это, в свою очередь, генерирует множество безрезультатных направлений, на которые нельзя полагаться при принятии клинических решений. В заключении, настоящее изобретение бесспорно выявляет специфическую группу пациентов с раком молочной железы, которая положительно откликается на доцетаксел, но не на винорелбин, тем самым показывая предсказательную силу для люминальной В опухоли в данных конкретных условиях лечения. Это очень важное свойство для диагностического анализа, при условии, что как было показано в клиническом испытании FinHER, доцетаксел, как правило, в большей степени связан с неблагоприятными эффектами, чем винорелбин, факт, который требует снижения запланированной начальной дозы.

Следовательно, настоящее изобретение может быть применено для оказания помощи в надлежащем назначении лечения при раке молочной железы. В особенности, как показано в контексте рандомизированного клинического испытания, субтипирование рака молочной железы с помощью количественной ОТ-ПЦР позволяет ограничивать доцетаксел-содержащие схемы лечения для пациентов с люминальными В опухолями, которые более чувствительны к лечению доцетакселем, и рассматривать альтернативные химиотерапевтические средства для пациентов с опухолями других подтипов.

Пример 5: Сравнение количественной ОТ-ПЦР и общепринятого ИГХ-окрашивания с точки зрения их чувствительности к Ki67

Значительное количество случаев (16,58%) были Ki67-негативными по ИГХ, но Ki67-позитивными по количественной ОТ-ПЦР. Это демонстрирует более высокую чувствительность и надежность определения мРНК в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с основанной на определении белка оценкой предшествующего уровня техники. В частности, это может быть обусловлено многочисленными техническими ограничениями основанного на ИГХ способа (например, отсутствие сохранности белка из-за проблем с фиксацией и/или с извлечением антигенов, времени проведения анализа после вырезания ткани и т.п.) или проблемы с интерпретацией окрашивания (например, интерпретация слабых ядерных пятен).

Благодаря более высокой чувствительности основанной на определении РНК оценки Ki67 с помощью количественной ОТ-ПЦР, согласование с оценкой Ki67 по ИГХ было только умеренным (смотри фигура 20А, С). Кроме того, это приводит к низкому NPA для настоящего изобретения (53,82%), если в качестве референсного способа применяют локальную оценку по ИГХ (фигура 20D). Напротив, РРА был высоким, поскольку количественная ОТ-ПЦР выявляла большую часть позитивных случаев ИГХ (94,2%). В заключение, оба способа достоверно коррелировали (р<0,0001), но были только умеренно согласными.

Таблица 8 представляет собой таблицу сопряженности признаков, отображающую взаимоотношения подтипов, основанных на количественной ОТ-ПЦР и основанных на ИГХ, в популяции исследования FinHer, в котором N представляет собой количество наблюдений, % (ячейка) представляет собой общую частоту 16 комбинаций потенциальный подтипов, % (кол.) представляет распределение подтипов количественной ОТ-ПЦР внутри ИГХ-подтипов, и % (ряд) представляет собой распределение ИГХ-подтипов внутри подтипов, определенных с помощью настоящей заявки. При установлении ИГХ подтипов в качестве «референсных стандартных», согласование будет самым высоким для TNBC (85,71%) и HER2-позитивных (79,43%) и самым низким для люминальных А (65,38%) и люминальных В (61,22%) опухолей.

Пример 6: Основанное на количественной ОТ-ПЦР и на ИГХ субтипирование в основном отличается в оценке люминального В подтипа

Более высокая чувствительность основанной на количественной ОТ-ПЦР оценки Ki67 приводит к существенной разнице при определении люминальных А и люминальных В пациентов, при сравнении с оценкой, основанной на ИГХ, при применении того же алгоритма для объединения ESR1, PGR, HER2 и Ki67 для субтипирования.

Из 189 пациентов с раком молочной железы, которые были классифицированы как представляющие собой люминальных А с помощью способами, основанными на ИГХ, только 53,97% также были классифицированы как представляющие собой люминальных А способом количественной ОТ-ПЦР, в то время как оказалось, что 39,68% представляли собой люминальных В пациентов. Напротив, только 6,35% были переклассифицированы как HER2-позитивные, и оказалось, что 0% были трижды негативными. Кроме того, из 251 пациентов, которые были классифицированы как люминальные В с помощью способов ИГХ, 71,71% также были классифицированы как люминальные В с помощью количественной ОТ-ПЦР, тогда как оказалось, 19,12% были люминальными А пациентами. Напротив, 6,77% были переклассифицированы как HER2-позитивные, и оказалось, что 2,39% были трижды негативными. И наоборот, только 61,22% опухолей, которые классифицировали как люминальные В с помощью количественной ОТ-ПЦР, также были классифицированы с помощью общепринятой ИГХ как люминальные В.

Эти данные иллюстрируют недостаточно высокое согласование, наблюдаемое между двумя анализами, для определения доцетаксел-чувствительной люминальной В опухоли, которое в основном определяется ограниченной чувствительностью и/или надежностью полуколичественной оценки Ki67 с помощью ИГХ.

Пример 7: Высокий Ki67, определенный с помощью количественной ОТ-ПЦР, но низкий Ki67, определенный с помощью ИГХ, связан с повышенным риском отдаленных метастазов

Доказано, что подход настоящего изобретения обладает дополнительной дискриминационной способностью, если рассматривать популяцию, включающую только ER-позитивные случаи, определенные с помощью ИГХ. В этом случае, было обнаружено несоответствие между анализами по Ki67, основанными на ИГХ и на количественной ОТ-ПЦР. Поскольку определение Ki67 с помощью количественной ОТ-ПЦР и ИГХ было согласованным в 514 из 686 доступных наборов данных (74,92%), то количество образцов для доказательства превосходства оценки основанной на определении мРНК было ограничено (n=172).

Однако, несмотря на небольшое количество образцов, позитивность по Ki67, полученная с помощью количественной ОТ-ПЦР, указывает на повышенный риск для развития отдаленных метастазов в несогласованных случаях. Как показано на фигуре 21А, в течение последующих 5-ти лет у 5% ER-позитивных пациенты с низкой экспрессией мРНК Ki67, развились отдаленные метастазы, тогда как 15% пациентов, продемонстрировавших высокую экспрессию мРНК Ki67, страдали от отдаленных метастазов (HR 3,315). Многомерный анализ не влиял на эту тенденцию (фигура 21В).

Это показывает, что более высокая чувствительность в оценке Ki67 при применении подхода настоящего изобретения обеспечивает дополнительную прогностическую информацию по сравнению с общепринятым ИГХ-окрашиванием.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу стратификации онкологических больных для лечения опухоли, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет по уровню экспрессии транскриптов РНК HER2, ESR1, PGR и Ki67 стратифицировать пациента с раком молочной железы для адъювантной химиотерапии. Изобретение обеспечивает возможность прогноза и предсказания успеха противоопухолевой терапии и оценки уровня риска пациента с раком молочной железы в отношении отдельных метастазов. 2 н. и 23 з.п. ф-лы, 21 ил., 8 табл., 7 пр.

1. Способ стратификации пациента с раком молочной железы для адъювантной химиотерапии, причем указанный способ включает в качестве первого этапа идентификацию молекулярного подтипа опухоли молочной железы у больного раком молочной железы и в качестве второго этапа - решение в пользу или против адъювантной химиотерапии на основе молекулярного подтипа, где молекулярный подтип идентифицируют, используя способ, осуществляемый in vitro и включающий стадии:

- определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) в образце опухоли;

- определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора эстрогена (ESR1) в образце опухоли;

- определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора прогестерона (PGR) в образце опухоли; и

- определение уровня экспрессии РНК-транскрипта антигена пролиферации Ki-67 (Ki67) в образце опухоли,

где образец представляет собой РНК, выделенную из опухоли,

где уровень экспрессии транскрипта РНК определяют с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ),

где не определяют уровень экспрессии РНК-транскрипта гена, отличного от HER2, ESR1, PGR и Ki67, и одного или нескольких референсных генов,

где молекулярный подтип выбирают из группы, включающей люминальный A и люминальный B подтипы, и

где, если молекулярный подтип является люминальным В, принимается решение в пользу адъювантной химиотерапии, и, если молекулярный подтип является люминальным А, решение принимается против адъювантной химиотерапии.

2. Способ по п. 1, в котором определение уровня экспрессии транскрипта РНК HER2, ESR1, PGR и Ki67 включает определение того, является ли уровень экспрессии транскрипта РНК HER2, ESR1, PGR и Ki67 более низким или более высоким, чем определенный порог экспрессии транскрипта РНК HER2, ESR1, PGR и Ki67.

3. Способ по п. 1, в котором стадию (а) выполняют перед стадиями (b), (c) и (d).

4. Способ по п. 1, в котором стадию (d) выполняют после стадий (a), (b) и (c).

5. Способ по п. 1, в котором стадию (a) выполняют перед стадией (b), стадию (b) выполняют перед стадией (c) и стадию (c) выполняют перед стадией (d).

6. Способ по п. 1, в котором молекулярный подтип люминальный A связан с вероятностью отдаленной пятилетней безрецидивной выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 11%, предпочтительно, по меньшей мере, на 13% выше, чем вероятность отдаленной пятилетней безрецидивной выживаемости после лечения, связанного с молекулярным подтипом люминальный В, и/или с вероятностью пятилетней выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 7%, предпочтительно, по меньшей мере, на 9% выше, чем вероятность пятилетней выживаемости после лечения, связанного с молекулярным подтипом люминальный В.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором опухоль представляет собой солидную опухоль.

8. Способ по любому одному из пп. 1-6, в котором количественная ПЦР представляет собой количественную ПЦР в реальном времени с флуоресцентной меткой.

9. Способ по любому одному из пп. 1-6, включающий применение ESR1-специфических праймеров длиной от 15 до 30 нуклеотидов, включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2, и/или HER2-специфических праймеров длиной от 15 до 30 нуклеотидов, включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 4 и 5, и/или Ki67-специфических праймеров длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, и/или PGR-специфических праймеров длиной от 15 до 30 нуклеотидов и включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 10 и 11.

10. Способ по любому одному из пп. 1-6, включающий применение ESR1-специфического зонда длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 3, и/или HER2- специфического зонда длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 6, и/или Ki67- специфического зонда длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 9, и/или PGR- специфического зонда длиной от 20 до 35 нуклеотидов и включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 12.

11. Способ по любому из пп. 1-6, в котором уровень экспрессии нормализуют по отношению к (среднему) уровню экспрессии одного или нескольких референсных генов в образце опухоли.

12. Способ по п. 11, в котором один или несколько референсных генов выбирают из группы, включающей CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 и GAPDH.

13. Способ по любому из пп. 1-6, в котором адъювантная химиотерапия включает введение доцетаксела.

14. Применение набора для стратификации пациента с раком молочной железы для адъювантной химиотерапии способом по любому из пп.1-6, причем указанный набор включает:

- по меньшей мере, одну пару HER2-специфических праймеров и, по меньшей мере, один HER2-специфический зонд;

- по меньшей мере, одну пару ESR1-специфических праймеров и, по меньшей мере, один ESR1-специфический зонд;

- по меньшей мере, одну пару PGR-специфических праймеров и, по меньшей мере, один PGR-специфический зонд и

- по меньшей мере, одну пару Ki67-специфических праймеров и, по меньшей мере, один Ki67-специфический зонд.

15. Применение по п. 14, в котором количественная ПЦР представляет собой количественную ПЦР в реальном времени с флуоресцентной меткой.

16. Применение по п. 14, в котором количественная ПЦР включает обнаружение зонда, основанное на опосредованном амплификацией вытеснении зонда.

17. Применение по п. 16, в котором зонд представляет собой зонд с двойной меткой, включающей фрагмент репортера флуоресценции и фрагмент гасителя флуоресценции.

18. Применение по п. 14, в котором набор дополнительно включает обратную транскриптазу и ДНК-полимеразу.

19. Применение по п. 18, в котором обратную транскриптазу и полимеразу обеспечивают в виде смеси ферментов, что позволяет проводить количественную ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) в одну стадию.

20. Применение по п. 14, в котором набор дополнительно включает, по меньшей мере, одну пару специфических для референсных генов праймеров и, по меньшей мере, один специфический для референсных генов зонд.

21. Применение по п. 20, в котором референсный ген представляет собой один или несколько референсных генов, которые выбирают из группы, включающей CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 и GAPDH.

22. Применение по п. 14, в котором набор дополнительно включает, по меньшей мере, один контрольный образец РНК.

23. Применение по п. 14, в котором праймеры обеспечивают ампликон, размером менее чем 120 п.о.

24. Применение по п. 14, в котором ESR1-специфические праймеры имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, и включают, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2, и/или в котором HER2-специфические праймеры имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, и включают, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 4 и 5, и/или в котором Ki67-специфические праймеры имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, и включают, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, и/или в котором PGR-специфические праймеры имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, и включают, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 10 и 11.

25. Применение по п. 14, в котором ESR1-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов, и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 3, и/или в котором HER2-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов, и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 6, и/или в котором Ki67-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 9, и/или в котором PGR-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов, и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 12.