ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОИНСЕКТИЦИДА ДЛЯ БОРЬБЫ С БОЛЬШОЙ ВОСКОВОЙ МОЛЬЮ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/07 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для получения биоинсектицида для борьбы с личинками большой восковой моли.

Большая восковая моль распространена повсеместно. Личинки большой восковой моли разрушают соты и восковое сырье, повреждают пчелиный расплод, портят мед, пергу, рамки, стенки улья, утеплительный материал и могут распространять гнильцовые болезни. Интенсивное размножение моли вызывает слет пчел из улья.

Применение для борьбы с большой восковой молью химических инсектицидов довольно часто оказывает отрицательное влияние на качество продукции и экологическое благополучие. Отдельные химические вещества, содержащиеся в инсектицидах, могут накапливаться в сельскохозяйственной продукции и оказывать отрицательное воздействие на здоровье человека.

Альтернативным методом борьбы с большой восковой молью является использование биоинсектицидов, содержащих микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности. Биоинсектициды избирательно токсичны для личинок чешуекрылых, безвредны для людей и животных, экологически безопасны, не ухудшают качество продуктов пчеловодства.

Известен штамм Bacillus thuringiensis P-2, являющийся основой биопрепарата «энтобактерин» для борьбы с большой восковой молью (БВМ), обладающий выраженной энтомопатогенной активностью в отношении личинок БВМ 2-го возраста (100%-ная гибель).

Однако для личинок БВМ 4-6 возрастов энтомопатогенная активность данного штамма значительно менее выражена, в первые сутки после заражения погибает 30% личинок, на вторые сутки - 16,1% и на третьи сутки - 0,5% (Дзю Е.А. Механизм развития инфекции, вызываемой бациллой турингиензис и влияние бактериальных метаболитов на организм личинок большой восковой моли: автореф. дис. … канд. биол. наук… / Новосиб. ГАУ. - Новосибирск, 2007 - С.7. Прототип).

Задачей изобретения является получение штамма, обладающего более высокой энтомопатогенной активностью в отношении личинок большой восковой моли 4-6 возрастов, чем известный штамм.

Технический результат заключается в том, что штамм Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045 обладает более высокой энтомопатогенной активностью против личинок большой восковой моли, в том числе и личинок более поздних стадий развития (4-6 возрастов).

Технический результат достигается новым штаммом Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045, который выделен из природных источников.

Штамм Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045, продуцирующий δ-эндотоксин, высокоактивен против личинок большой восковой моли как ранних, так и более старших возрастов (4-6). Штамм может быть использован для производства биоинсектицида, эффективного против личинок большой восковой моли. Энтомопатогенное действие бактерий Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045, продуцирующих белковый кристалл, содержащий δ-эндотоксин, обусловлено именно δ-эндотоксином, который при попадании в кишечник насекомого растворяется под действием протеолитических ферментов, вызывая их гибель.

Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии ГНУ ВНИИСХМ РАСХН (г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером RCAM 00045 (авторский №846-Bt в коллекции ДальЗНИВИ).

Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045 выделен из природных источников. Штамм характеризуется повышенной энтомопатогенной активностью в отношении личинок большой восковой моли всех возрастов.

Заявляемый штамм имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Вегетативные клетки - крупные, грамположительные палочки (1,8-2,6 мкм), располагаются одиночно, попарно или короткими цепочками, споры в спорангии располагаются субтерминально, на противоположном конце спорангия находятся белковые включения эндотоксина. После лизиса спорангия от спор отделяются белковые включения в виде кристаллов лимоновидной формы (δ-эндотоксин). На плотной питательной среде культура образует округлые колонии белого цвета, с возрастом культуры появляется сероватый оттенок, поверхность зернистая, край ворсинчатый. На МПБ растет без помутнения среды, образует тонкую пленку и пристеночное кольцо.

Физиолого-биохимические свойства штамма.

Аэроб. Оптимальные условия культивирования - в аэробных условиях при температуре 28-30°С. Оптимальный состав питательной среды для культивирования - 1,5% питательный агар.

Образует лецитиназу, слабо гидролизует крахмал, не обладает протеолитической активностью. Из углеводов усваивает сахарозу, глюкозу, лактозу, мальтозу, галактозу, ксилозу, образует мочевину и ацетилметилкарбинол (слабо).

Биотипирование штамма проведено с использованием схемы идентификации Bacillus thuringiensis Barjac и Bonnefoi (1968), Определителя зоопатогенных микроорганизмов (М.А.Сидоров, Д.И.Скородумов, В.Б.Федотов, М.: Колос, 1995).

Хранение культуры.

Культура хорошо хранится в холодильнике при температуре 4-6°С, в лиофилизированном состоянии - в стеклянных ампулах.

Энтомопатогенные свойства.

Энтомопатогенные свойства штамма оценивали в отношении тест-насекомых (личинки большой восковой моли): 100%-ная гибель личинок лабораторной популяции большой восковой моли 2-6 возрастов in vitro наступает на 3-4 сутки после заражения.

Пример.

Для определения энтомопатогенной активности штамма Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045 культуру выращивали на скошенном МПА в аэробных условиях при температуре 30°С в течение 5 суток. Бактериальную массу смывали с поверхности агара стерильным физиологическим раствором (0,85% NaCl), плотность суспензии доводили до 1·10⁸ спор/мл, 1 мл полученной суспензии вносили в корм (3,5 г), полученную массу скармливали личинкам большой восковой моли 2-6 возрастов. Личинок выращивали в термостате в стеклянных емкостях, в качестве корма использовали кусочки сотов. Для проведения опыта личинок рассаживали в чашки Петри по 10 штук, в чашку помещали корм с добавлением суспензии Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045, опыт проводили в 5 повторностях. В контрольную чашку Петри помещали личинок и корм с добавлением 1 мл стерильного физиологического раствора. Ежедневно учитывали гибель личинок в процентах от общего количества, бывших в эксперименте.

В таблице представлены результаты определения энтомопатогенной активности штамма Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045 в отношении личинок лабораторной популяции большой восковой моли в сравнении со штаммом Bacillus thuringiensis P-2.

Таблица Энтомопатогенная активность штаммов Bacillus thuringiensis в отношении личинок большой восковой моли 4-6 возрастов Добавка в корм Концентрация Гибель личинок по суткам, % Суммарная гибель личинок за 3 суток, % 1 2 3 ВНИИСХМ RCAM 00045 1·10⁸ спор/мл 25,0 62,5 12,5 100 Р-2 1·10⁸ спор/мл 30,0 16,1 0,5 46,6 Физиологический раствор 0,85% 0 0 0 0

Таким образом, представленные данные убедительно доказывают, что энтомопатогенная активность штамма Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045 существенно выше, чем у прототипа (штамм Bacillus thuringiensis Р-2), обеспечивает гибель 100% личинок большой восковой моли 4-6 возрастов.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для получения биоинсектицида для борьбы с большой восковой молью. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis 846-Bt выделен из природного источника и депонирован в коллекции ВНИИСХМ под номером RCAM 00045. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis RCAM 00045 обеспечивает гибель 100% личинок большой восковой моли 4-6 возрастов. 1 табл., 1 пр.

Штамм Bacillus thuringiensis ВНИИСХМ RCAM 00045 для получения биоинсектицида для борьбы с большой восковой молью.