ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus thuringiensis var.thuringiensis N800/15 В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТОМОЦИДНОГО БИОПРЕПАРАТА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическим средствам защиты сельскохозяйственных, лекарственных и лесных культур от вредных насекомых, т.е. обладающих энтомоцидным действием.

Известно, что в качестве энтомопатогенов используют штаммы-продуценты битоксибацеллина, а именно Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis 202, 98 и 620, способные образовывать два энтомоцидных токсина: белковые кристаллы эндотоксина, освобождающегося из клеток в процессе лизиса их оболочек, и водорастворимый экзотоксин нуклеотидной природы, продуцируемый в процессе вегетативного роста культуры (Н.В.Кандыбин, Н.М.Барбашова, А.А.Стусь, Л.Н.Кузнецова. Сравнительная эффективность трех штаммов Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis /Бюл. ВНИИСХМ №53, Л., 1990, с.44-46). В результате сравнения биологической и энтомоцидной активности этих трех штаммов было выявлено, что штаммы 98 и 620 превосходят по энтомоцидной активности штамм 202.

Штамм Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis 98 (BtH₁ 98) выделен из погибшей куколки капустной совки, является продуцентом энтомоцидного эндотоксина, хранится в коллекции «ВНИИгенетика» под №ЦМПЛ В-2452.

Штамм BtH₁ 98 обладает достаточно высокой энтомоцидной активностью против колорадского жука и других вредных насекомых (прототип).

Битоксибациллин получают культивированием штамма BtH₁ 98 на питательной среде, содержащей фосфорнокислый аммоний, сернокислый магний, хлористый кальций, крахмал кукурузный и кормовые дрожжи, зеленую патоку, при аэрации в течение 48 ч, титр спор в культуральной жидкости 3,5-3,75 млрд/мл, содержание экзотоксина 0,5 мг/мл. В полученную культуральную жидкость вносят 1% натрия хлористого и высушивают. Получают Битоксибациллин, в котором содержится спор 65-72 млрд/г и 1% экзотоксина.

Недостатком штамма Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis 98 (BtH₁ 98) является то, что он быстро теряет энтомоцидную активность при хранении.

Битоксибациллин на основе штамма BtH₁ 98 получают в сухой форме, в связи с чем, его производство является энергоемким и затратным из-за проведения операции сушки. Кроме того, высокие температуры при сушке оказывают губительное влияние на кристаллы эндотоксина, разрушая их, что приводит к снижению энтомоцидной активности Битоксибациллина.

Задачей заявляемого изобретения является выявление штамма на основе экологически безопасной бактерии из группы Bacillus thuringiensis, пригодного для создания высокоэффективного энтомоцидного препарата в жидкой форме против массовых насекомых-фитофагов, вредителей сельскохозяйственных и лесных культур и сохраняющего свою энтомоцидную активность при длительном хранении.

Задача решается тем, что в качестве средства для получения энтомоцидного препарата используют штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15.

Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 (BtH₁ 800/15) выделен из трупов личинок колорадского жука в Ленинградской области и депонирован 20.03.2006 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВКСМ) ГНУ ВНИСХМ под регистрационным №611 в группе споровых микроорганизмов, что подтверждается справкой о депонировании от 02.07.2010 г. (Справка прилагается). Штамм характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства.

Грамположительные подвижные палочки, перитрихи, вегетативные клетки одиночные или в виде коротких цепочек по 2-4 клетки в цепочке. Величина клеток односуточной культуры на рыбном агаре (РА) составляет (2,5-3,0) × (0,8-0,9) мкм. На 3-4 сутки роста на РА в клетках образуются споры овальной формы, расположенные субтерминально, размером (1,1-1,3)×(0,8-0,9) мкм и параспоральные включения эндоксина (кристаллы) правильной бобовидной формы размером 1,1-1,3 мкм.

На РА через 48 ч при 26-28°С культура образует плоские колонии серовато-белого цвета округлой формы с неровным краем, поверхность мелкозернистая, диаметр колонии 22-24 мм. Штамм растет при температуре 20-34°С (opt 26-32°С) и при показателе кислотности среды рН 6,4-8,0 (opt 6,8-7,2). На рыбном бульоне (РБ) через 24 ч растет с образованием пленки (вуали).

Биохимические свойства.

Факультативный анаэроб. Желатину разживает на 5-е сутки, казеин расщепляет, молоко пептонизирует с подщелачиванием через 24-28 ч, затем подкисляет и обесцвечивает лакмус. На среде Кларка образует ацетилметилкарбонил (АМК).

Гидрализует крахмал, использует цитраты, пигмента и уреазы не образует. Индол и сероводород не использует, редуцирует нитраты в нитриты.

Расщепляет глюкозу, маннозу, левулезу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, глицерин и салицин с образованием кислоты. Не использует галактозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, лактозу, раффинозу, маннит, сорбит, дульцит, инозит, инулин.

Антигенные свойства.

Дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis var. thuringiensis H-1 в разведении 1:6400.

Штамм идентифицирован согласно этой реакции, а также по классификации Bacillus thuringiensis (1962, 1967, 1990) H.de Barjack.

Штамм устойчив к производственным фагам: К, М, Н, Э-5, И-77, Д₂-Д₅.

Штамм малотоксичен для теплокровных животных.

Штамм растет на питательных дрожжеполисахаридных средах; хранится в лиофилизированном состоянии или на косяках РА в пробирках при 4-5°С с периодическими пересевами один раз в 6 мес.

Штамм BtH₁ 800/15 обладает выраженными энтомоцидными свойствами и перспективен в качестве средства для производства биопрепарата для защиты сельскохозяйственных культур от массовых насекомых-фитофагов.

На основе этого штамма BtH₁ 800/15 разработана технология производства нового энтомоцидного биопрепарата, названного авторами Битоксин.

Пример получения Битоксина.

Сначала в колбах (1 л) готовили дрожжеполисахаридную питательную среду следующего состава, %:

Кукурузная мука 1,5-2,4 Кормовые дрожжи 3,0-3,5 (NH₄)₂HPO₄ 0,5-0,6 MgSO₄×7H₂O 0,02-0,04 CaCl₂×2H₂O 0,15-0,20 Вода водопроводная до 100.

С помощью щелочи (например, 10% NaOH) довели рН среды до 7,4-7,8. Потом эту питательную среду разлили по 30-50 мл в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл и стерилизовали в течение 40 мин при 120-122°С. После стерилизации рН среды составляло 6,8-7,2. Подготовленную питательную среду охлаждали и засевали культурой штамма BtH₁ 800/15.

Для засева среды в колбах служит споровая культура штамма BtH₁ 800/15, полученная смывом 5-10 мл физ. раствора на пробирку с культурой на скошенном агаре. Полученную взвесь с культурой штамма взбалтывали до получения гомогенной суспензии и вносили в колбы с подготовленной питательной средой из расчета 0,3-0,5 мл суспензии на 30-50 мл среды. Засеянные колбы помещали на качалку при 200-220 об/мин и 28-30°С на 56-72 ч до полного высыпания спор и кристаллов эндоксина (проверку осуществляли мироскопированием). Выращенную в колбах культуральную жидкость штамма BtH₁ 800/15 использовали для засева среды в ферментерах.

В качестве питательной среды для ферментеров может быть использована любая дрожжеполисахаридная среда, оптимально - того же состава, который был использован для получения культуральной жидкости в колбах, т.е. на основе кормовых дрожжей и кукурузной муки (состав указан выше).

При этом сначала в водопроводную воду, прогретую до 40°С, засыпали при постоянном перемешивании все остальные ингредиенты, полученную взвесь нагревали до 80°С и выдерживали в течение 30 мин, после чего рН доводили до 7,8-8,0 и среду стерилизовали в течение 1 ч при 140°С.

Простерелизованную питательную среду для ферментера охлаждали до 30-35°С и вносили в нее культуральную жидкость штамма BtH₁ 800/15, заранее выращенную в колбах, из расчета 0,7-1,0% культуральной жидкости от объема питательной среды в ферментере.

В ферментере процесс культивирования проводили при следующих условиях:

- температура культивирования 28-30°С;

- скорость вращения мешалки 200-220 об/мин;

- давление в аппарате 0,4-0,5 кгс/см²;

- режим подачи воздуха:

с 0 до 12 ч - 0,2 V_возд / V_среды/мин;

с 12 до 24 ч - 0,5 V_возд / V_среды/мин;

с 24 до 42 ч - 0,8-1,0 V_возд / V_среды/мин;

с 42 ч - до окончания ферментации - 0,5 V_возд / V_среды/мин.

То есть процесс ферментации проводили в условиях высокой аэрации и заканчивали при достижении содержания в полученном препарате 80-85% свободных спор и кристаллов эндотоксина при их соотношении 1:1. При этом титр штамма BtH₁ 800/15 в полученном жидком препарате составлял не менее 3,8-4,0 млрд.спор/мл при отсутствии посторонней микрофлоры и вирулентного фага.

Таким образом? был получен биопреперат на основе штамма BtH₁ 800/15 (Битоксин), представляющий собой жидкость, легко разбавляемую водой до необходимой рабочей концентрации, удобной для применения серийной опрыскивающей аппаратуры. Производство препарата на заводах, биофабриках в регионах потребителя не потребует затрат на его перевозку и доставку на большие расстояния. Так как Битоксин является жидким, технология производства препарата не требует также больших энергозатрат для проведения операции высушивания.

Были проведены лабораторные испытания эффективности препарата на основе штамма BtH₁ 800/15 - Битоксина по отношению к массовым насекомым-фитофагам сельскохозяйственных культур.

Так, например, лабораторные определения энтомоцидной активности препарата на основе штамма BtH₁ 800/15 (Битоксина) проводили на личинках колорадского жука 2-го возраста. При этом корм (листья картофеля) обрабатывали Битоксином в разведениях 1:20; 1:100; 1:500, что соответствует концентрациям 5,0; 1,0; 0,2%, обеспечивающим гибель тест-объекта от 30 до 95%. В каждый вариант опыта сажали по 25 личинок колорадского жука 2-го возраста (в трехкратной повторности). Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препарат на основе штамма-прототипа BtH₁ 98 (Битоксибациллин жидкий, без сушки), при тех же концентрациях. В контроле корм обрабатывали водой. Учет гибели личинок колорадского жука проводили на 7 день.

Были проведены также лабораторные испытания энтомоцидной активности Битоксина (препарата на основе штамма BtH₁ 800/15) на гусеницах 2-го возраста непарного шелкопряда. Опыты проводили в стеклянных банках объемом 0,8 л. При этом корм (ветки яблони с листьями) обрабатывали Битоксином в пяти концентрациях: 2,0; 1,0; 0,5; 0,25; 0,125%. В каждый вариант опыта сажали по 25 гусениц непарного шелкопряда 2-го возраста (в трехкратной повторности). Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препарат на основе штамма-прототипа BtH₁ 98 (Битоксибациллин жидкий, без сушки) в тех же концентрациях. В контроле корм обрабатывали водой. Учет гибели гусениц непарного шелкопряда проводили на 7 день.

Опыты по определению содержания экзотоксина в препарате Битоксин оценивали на личинках комнатной мухи по следующей методике.

Препарат на основе штамма BtH₁ 800/15 (Битоксин) в количестве 20 мл центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Полученный фугат автоклавировали при давлении 0,1 МПа и температуре 105°С в течение 20 мин. Затем готовили разведения препарата: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32, что соответствует концентрациям 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 мкл/г корма (каждую - трехкратно).

Для испытания в стеклянную банку вместимостью 200 мл вносили:

- 2 мл препарата Битоксин соответствующего разведения;

- 11 мл 2,5%-ной водной суспензии сухого молока;

- 7 г стерилизованных пшеничных отрубей.

В контроле вместо Битоксина использовали препарат на основе штамма - прототипа BtH₁ 98 (Битоксибациллин жидкий, без сушки) в тех же концентрациях. Корм с соответствующими разведениями препарата в каждой банке тщательно перемешивали и помещали туда по 25 личинок комнатной мухи. Активность экзотоксина оценивали по количеству погибших личинок комнатной мухи на 8 день опыта.

По результатам опытов для каждого из них был определен показатель ЛК₅₀-доза препарата (в %, в мкл/г корма, …), которая вызывает 50% гибели насекомых.

Значение ЛК₅₀ рассчитывали по формуле Кербера (см., например, монографию «ЭКОЛОГИЯ BACILLUS THURINGIENSIS» авторов В.Ф.Патыка, Т.И.Патыка, Киев, изд. ПГАА, 2007 г., 217 стр.):

lgЛК₅₀=lgC_м-σ(ΣL₁-0,5),

где С_м - максимальная апробируемая концентрация;

σ - логарифм отношения каждой предыдущей концентрации к последующей (логарифм кратности разведений);

ΣL₁ - сумма отношений числа насекомых, которые погибли от данной концентрации, к общему числу насекомых, которые подверглись действию этой концентрации.

Полученные в указанных опытах значения ЛК₅₀ для препарата на основе штамма BtH₁ 800/15 (Битоксина) и препарата на основе штамма - прототипа BtH₁ 98 (Битоксибациллина), характеризующие их энтомоцидную активность, представлены в таблице 1.

Таблица 1. Биологическая активность препаратов на основе BtH₁   ЛК₅₀, %, для L₂ ЛК₅₀, %, для L₂ Содержание экзотоксина: Препарат колорадского жука непарного шелкопряда ЛК₅₀, мкл/г корма для L₂       комнатной мухи Препарат на основе       штамма BtH₁ 98 0,51 0,42 6,82 (Битоксибациллин -       прототип)       Новый препарат       на основе 0,24 0,2 3,05 штамма BtH₁ 800/15       (Битоксин)      

Из приведенных в таблице 1 данных следует, что препарат на основе штамма BtH₁ 800/15 (Битоксин) по энтомоцидной активности для личинок колорадского жука и гусениц непарного шелкопряда в 2,1 раза активнее препарата на основе штамма - прототипа BtH₁ 98 (Битоксибациллина), а по содержанию экзотоксина он превосходит его в 2,24 раза.

Кроме того, были проведены лабораторные опыты по сохранению энтомоцидной активности штаммов BtH₁ 800/15 и BtH₁ 98 после их длительного хранения. Результаты опытов приведены в таблице 2.

Таблица 2. Биологические характеристики штаммов BtH₁ после их длительного хранения Показатели Исходные значения Через 1 год Через 2 года   Штамм   BtH₁ 98 BtH₁ 800/15 BtH₁ 98 BtH₁ 800/15 BtH₁ 98 BtH₁ 800/15 Титр спор, млрд/мл 2,11 4,0 2,05 3,92 1,98 3,8 Содержание экзотоксина: ЛК₅₀, мкл/г корма для L₂ комнатной мухи 5,04 2,9 5,4 3,0 6,4 3,05 Энтомоцидная активность: ЛК₅₀, %, для L₂ колорадского жука 0,54 0,28 0,58 0,29 0,62 0,3

Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что через 2 года хранения энтомоцидная активность штамма - прототипа BtH₁ 98 в отношении колорадского жука уменьшилась на 15%, а у штамма BtH₁ 800/15 - только на 7%, что подтверждает возможность его длительного хранения. При этом через 2 года хранения штамм BtH₁ 800/15 на 92% технологичнее штамма - прототипа BtH₁ 98, а по содержанию экзотоксина и энтомоцидной активности в отношении колорадского жука в 2,1 раза превосходит его.

Эффективность препарата на основе штамма BtH₁ 800/15 (Битоксина) была также проверена в полевых условиях в хозяйствах Ленинградской области: ГП ОПХ «Каложицы», ОПХ «Суйда» и ОПХ «Предпортовый», на картофеле против колорадского жука. Результаты полевых опытов в хозяйствах Ленинградской области приведены в таблице 3.

Таблица 3. Эффективность препарата на основе штамма BtH₁ 800/15 на картофеле против колорадского жука в хозяйствах Лен.обл. Вариант обработки Площадь обработки, га Норма расхода препарата, л/га Норма расхода рабочей жидкости Средняя численность вредителя (экз. на 1 растение) Эффективность обработки, % на день учета       л/га До обработки День учета 7 14           7 14     ГП ОПХ «Каложицы» Битоксин 3 15 300 26,7 1,0 1,6 96,4 95,9 Контроль (без обработки) 0,25 - - 19,3 30,4 25,1*   Увеличение числ. вредителя на 30% ОПХ «Суйда» Битоксин 2 12 400 28,4 1,5 0,9 94,7 96,8 Контроль (без обработки 0,25 - - 26,4 36,7 34,6*   Увеличение числ. вредителя на 31% ОПХ «Предпортовый» Битоксин 3 15 400 30,2 3,0 0,8 90,0 97,4 Контроль (без обработки) 0,25 - - 23,4 28,1 30,9   Увеличение числ. вредителя на 37% Примечание: * - часть личинок ушла в почву.

Приведенные в таблице 3 данные подтверждают высокую энтомоцидную активность Битоксина - препарата на основе штамма BtH₁ 800/15.

Препарат на основе штамма BtH₁ 800/15 (Битоксин) безопасен для теплокровных животных.

Вирулентность, диссеминация, токсичность и токсигенность штамма BtH₁ 800/15 были изучены в соответствии с Методическими указаниями Минздрава СССР №4263-87, №2620-82 и с учетом рекомендаций ВОЗ (Бюлл. ВОЗ, 1981, №6, стр.20-27) на беспородных белых крысах и беспородных белых мышах.

Вирулентность и диссеминацию штамма BtH₁ 800/15 изучали при однократном введении суточной агаровой культуры в физиологическом растворе в желудок белым мышам и белым крысам в дозах по 10⁶, 10⁷, 10⁸ и 10⁹ и внутрибрюшинно по 10⁶, 10⁷, 10⁸ и 10⁹ микробных клеток на животное. В опыте использовали по 12 животных на дозу (6 самцов и 6 самок). В период наблюдения клинических симптомов заболевания животных не наблюдалось, гибель отсутствовала. Через 30 суток после введения культуры микроорганизмов, животных умерщвляли ингаляцией CO₂ и методом отпечатков делали посев из крови и внутренних органов (легких, печени, почек и селезенки) на чашки Петри с агаризованной средой. Рост культуры в высевах из органов животных при обоих способах введения не был обнаружен.

Токсичность штамма BtH₁ 800/15 оценивали путем внутрибрюшинного введения мышам взвеси агаровой культуры микроорганизмов, приготовленной на стерильном физиологическом растворе и инактивированной нагреванием при 60°С в течение 30 минут в концентрациях 10⁷, 10⁸ и 10⁹ микробных клеток на животное (по 6 особей на дозу).

Токсигенность штамма BtH₁ 800/15 изучали на мышах путем внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения стерильного фильтрата культураль-ной жидкости (фильтрация через фильтр Millipor с размером пор 0,22 мкм) 3-х и 7 суточных культур в дозах 0,3 мл, 0,6 мл и 1,0 мл (по 6 особей на дозу). Животным контрольных групп вводили стерильную жидкую питательную среду в таких же объемах. Гибели мышей не было. ЛД₅₀ не была установлена. При обоих способах введения она превышает 1,0 мл на животное для 3-х и 7-ми суточных культуральных жидкостей.

То есть по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и ток-сигенности штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 (BtH₁ 800/15) не патогенен для теплокровных животных и, в соответствии с Методическими указаниями Минздрава №2620-82 и №4263-87, штамм BtH₁ 800/15 относится к 4 классу опасности (малоопасен) и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Результаты по безопасности данного биопрепарата согласуются с мировой практикой широкого использования биоинсектицидов на основе штаммов бактерий группы Bacillus thuringiensis.

Таким образом, на основании вышеизложенного можно утверждать, что препарат жидкой формы на основе штамма BtH₁ 800/15 (Битоксин) обладает высокой энтомоцидной активностью против опасных массовых вредителей - насекомых-фитофагов, характеризуется безопасностью для человека и теплокровных животных, а также что штамм BtH₁ 800/15 сохраняет свою энтомоцидную активность при длительном хранении.

А это, в свою очередь, характеризует штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 (BtH₁ 800/15) как перспективный в качестве средства для производства энтомоцидного биопрепарата.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к защите сельскохозяйственных, лекарственных и лесных культур. Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 (BtH₁ 800/15) обладает энтомоцидной активностью против вредителей - насекомых-фитофагов. Депонирован в ГНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером № 611. Может быть использован при получении высокоэффективного энтомоцидного биопрепарата. 3 табл., 1 пр.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis № 800/15, депонированный в ГНУ ВНИИСХМ (Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения - ВКСМ) под регистрационным номером 611 в группе споровых микроорганизмов, в качестве средства для получения энтомоцидного биопрепарата.