СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ АНАЛИЗА ПОВЕДЕНИЯ ВЕЩЕСТВ IN VITRO В СМОДЕЛИРОВАННОЙ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ СРЕДЕ Российский патент 2019 года по МПК G01N13/00 G01N33/15 G01N33/48 

Изобретение относится к способу и устройству для анализа поведения веществ in vitro, предпочтительно, макромолекул, таких как, например, белки, в смоделированных физиологических средах. В особенности, изобретение относится к способу и устройству для анализа поведения веществ in vitro в условиях, имитирующих глаз.

Для лечения дегенерации желтого пятна или заболеваний сетчатки, таких как, например, диабетическая ретинопатия, оказались успешными инъекции лекарственных средств в стекловидное тело. При инъекциях в стекловидное тело лекарственное средство в лекарственной форме вводят непосредственно в стекловидное тело (VH), то есть, в прозрачный гель, заполняющий пространство между хрусталиком глаза и сетчаткой глазного яблока, например, человеческого. Немаловажно, что из-за того, что при инъекциях в стекловидное тело значительная часть введенной дозы неизмененного лекарства достигает сетчатки, инъекции в стекловидное тело обычно обладают высокой биодоступностью.

Однако тесты in vitro для изучения, например, устойчивости лекарственной формы в стекловидном теле (VH) оказались малополезными при имитации реальных условий in vivo. VH вне природной среды быстро дегенерирует, и по причине накопления продуктов дегенерации, значение рН в VH может быстро увеличиваться. Поэтому тесты необязательно отражают реальную ситуацию в глазу живого человека, в особенности, по прошествии длительных периодов времени, таких как, например, несколько суток. В более поздних тестовых системах физиологическое значение pH VH может стабилизироваться за счет применения буферной системы. В этом случае продуктам деградации предоставляют возможность покидать VH в буферный раствор через полупроницаемую мембрану.

Однако такие системы не позволяют сымитировать разнообразные барьерные условия для лекарственного средства в лекарственной форме. В особенности, они не позволяют смоделировать разнообразные имитируемые барьерные условия, например, создаваемые задним сегментом ткани глаза.

Таким образом, существует потребность в улучшенном способе и устройстве для имитации физиологической среды с целью анализа поведения веществ, таких как, например, макромолекулы, in vitro. В частности, существует потребность в способе и устройстве для анализа долговременной устойчивости веществ in vitro в различных смоделированных физиологических средах.

Согласно одному аспекту изобретения предлагают способ для анализа поведения вещества in vitro в смоделированной физиологической естественной среде. Способ содержит этапы, на которых обеспечивают первую жидкость, матрикс геля и вторую жидкость. Способ дополнительно содержит этапы, на которых осуществляют разделение первой жидкости и матрикса геля с помощью по меньшей мере одной полупроницаемой мембраны и разделение матрикса геля и второй жидкости с помощью по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны. Еще дополнительными этапами являются введение вещества в первую жидкость, что дает возможность веществу мигрировать из первой жидкости через по меньшей мере одну первую полупроницаемую мембрану, затем через матрикс геля, затем через по меньшей мере одну вторую полупроницаемую мембрану и затем во вторую жидкость, и определение клиренса вещества из первой жидкости.

Размещение матрикса геля между по меньшей мере первой и по меньшей мере второй полупроницаемой мембраной позволяет реалистично имитировать диффузионные барьеры для веществ и диффузию вещества через упомянутые барьеры. Матрикс геля располагают между первой жидкостью, куда вводят вещество, например, молекулу, например, макромолекулу, такую как белок или лекарственное средство в лекарственной форме, и вторую жидкость, которая служит в качестве буферного раствора. Первая жидкость соответствует жидкости или имитирует жидкость, или ткань, куда вводят вещество. Первая жидкость может представлять собой жидкость, извлеченную из человека или животных, но также может представлять собой искусственную жидкость, имитирующую природную жидкость. Вторая жидкость служит в качестве буферного раствора, с тем чтобы, например, значение pH системы удерживалось на желаемых значениях, например, оставалось постоянным. Вторая жидкость может служить резервуаром для вмещения или адсорбции осадка или продуктов деградации.

Специальная установка позволяет имитировать разнообразные барьерные условия одних и тех же, а также разнообразных физиологических систем. Например, при инъекции лекарственного средства в лекарственной форме в стекловидное тело может имитироваться устойчивость и биодоступность лекарственной формы в глазу человека, а также животных. Например, может быть проведено тестирование различной диффузии и осаждения, например, различных белков в условиях глаза, (разного возраста или при болезни) и для передней ткани глаза, и для задней ткани глаза и в любой их комбинации. Эти ткани содержат молекулярные барьеры, имеющие разные свойства, которые могут имитироваться и тестироваться способом и устройством по изобретению путем изменения свойств матрикса геля, а также, дополнительно, свойств полупроницаемых мембран. Кроме того, могут быть достигнуты более реалистичные результаты, особенно в отношении устойчивости и биодоступности вещества, например, белка или лекарственного средства в лекарственной форме, за счет того, что учитывается расстояние между эффективным местоположением инъекции и местоположением диффузионного барьера, а также физическая и химическая среда, существующая в месте инъекции. Поэтому способ и устройство по изобретению позволяют более реалистично имитировать геометрию и природную среду, наиболее предпочтительно, среду глаза. Это достигается специальным размещением жидкостей и матрикса геля и компоновкой устройства, как будет подробно описано ниже.

Способ и устройство по изобретению могут применяться, но не ограничиваясь, для оценки устойчивости, например, зависящего от концентрации осаждения веществ, таких как, например, лекарственные средства в лекарственной форме, макромолекулы, белки и/или вспомогательные вещества или их комбинации; для оценки взаимодействий веществ, таких как, например макромолекулы и/или вспомогательное вещество в конкретной жидкой среде, например, белки в стекловидном теле; для оценки устойчивости вещества при разбавлении в конкретной жидкости, например, стекловидном теле и после потери стабилизирующих вспомогательных веществ, например, сурфактантов, сахаров, буферных средств и агентов, удерживающих изотоничность, и для оценки долговременной устойчивости в смоделированной физиологической среде, например, среде глаза.

Далее по тексту, способ и устройство, как правило, относится, к тестированию веществ, в особенности макромолекул, в среде, имитирующей глаз. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления способа первая жидкость представляет собой стекловидное тело, а вторая жидкость представляет собой буферный раствор, предпочтительно, физиологически совместимый буферный раствор. Однако способ и устройство не ограничиваются данными применениями. Например, существует возможность имитировать гематоэнцефалический барьер для испытания, например, устойчивости и биодоступности веществ в ткани мозга, если вещества вводят, например, в кровяной сосуд. В этом случае в качестве первой и второй жидкостей могут выступать кровь и спинномозговая жидкость или жидкости, имитирующие спинномозговую жидкость.

«Вещество», в аспекте применения термина в данной заявке может относиться к любому веществу, которое могло бы поступать в жидкость, и которое могло быть предназначенным для испытаний его устойчивости или биодоступности в способе или в устройстве по изобретению. Вещество может представлять собой молекулу, например, макромолекулу, такую как белки, антитела, фрагменты антител, химерные белки, биспецифические антитела, конъюгированные белки, натуральные или синтетические пептиды или олигонуклеотиды, натуральные или синтетические молекулы, такие как, лекарственные средства на основе малых молекул, сахара, сурфактанты, буферные смеси, полимеры, а также любые общеизвестные вспомогательные вещества. Предпочтительно, вещество является лекарственным средством в лекарственной форме такой как, например, раствор, суспензия или эмульсия, которое также может содержаться в твердом матриксе или в любой другой системе доставки как описано ниже в настоящем документе.

«Стекловидное тело» в том смысле как этот термин применяется в данной заявке, может происходить из любых натуральных или искусственных источников. Натуральное стекловидное тело может быть взято из любых животных организмов, например, свиней, быков и коров, собак, кошек, у кроликов и не человекообразных приматов или у человека. Натуральное стекловидное тело может быть получено, например, из ранее удаленного глаза. Искусственное стекловидное тело предпочтительно имитирует стекловидное тело человека. Искусственное стекловидное тело может быть получено из различных полимерных материалов, например, природных полимеров, таких как, не ограничиваясь перечисляемыми, гиалуроновая кислота, альгинат, агар, хитозан, желатин, ксантановая камедь, пектины, коллаген, или например, синтетических полимеров таких как, не оганичиваясь перечисляемыми, плюрониловый гель, поливиниловый спирт, полифосфазены, любые димерные, тримерные или мультимерные гельобразующие полимеры, состоящие из PEG (полиэтиленгликоля), PCL (поликапролактона), PLA (полилактида), PGA (птероилглютаминовой кислоты), PLGA (полилактидглюколидов), полиакриламида, полиакриловой кислоты, а также комбинаций этих полимеров в их различных концентрациях.

Стекловидное тело может также представлять собой смесь искусственного и натурального стекловидного тела или их компонентов в различных комбинациях.

«Матрикс геля» в том смысле как этот термин применяется в данной заявке, представляет собой жидкость или полужидкость (обладающая свойствами между твердым телом и жидкостью) с заранее заданной, но переменной вязкостью и заранее заданными, но варьируемыми концентрациями соединений материала матрикса геля. Предпочтительно, матрикс геля представляет собой вязкую жидкость. Матрикс геля представляет собой сердцевину смоделированного барьера и находится между по меньшей мере одной первой и по меньшей мере одной второй полупроницаемыми мембранами. Предпочтительно по меньшей мере одна первая и по меньшей мере одна вторая полупроницаемая мембрана представляют собой единичные полупроницаемые мембраны, предпочтительно мембраны для диализа. Однако они также могут представлять собой составные полупроницаемые мембраны, причем более чем одна, предпочтительно, две мембраны расположены одна над другой. Характеристики барьера могут изменяться и приспосабливаться для изменения условий испытаний путем изменения физических и/или химических характеристик матрикса геля. Для образования матрикса геля, индивидуально или в комбинациях в различных концентрациях, могут применяться разнообразные полимерные материалы натурального или искусственного происхождения. Для приготовления матрикса геля можно использовать химически модифицированные природные полимеры. Для приготовления матрикса геля могут применяться природные, полусинтетические и синтетические полимеры в различных комбинациях и концентрациях. Матрикс геля может быть приготовлен из различных полимерных материалов, например, природных полимеров, таких, не ограничиваясь перечисляемыми, как гиалуроновая кислота, альгинат, агар, хитозан, желатин, ксантановая камедь, пектины, коллаген, или например, синтетические полимеры, такие, не ограничиваясь перечисляемыми, как плюрониловый гель, поливиниловый спирт, полифосфазены, любой из димерных, тримерных или мультимерных гельобразующих полимеров, состоящих из PEG, PCL, PLA, PGA, PLGA, полиакриламида, полиакриловой кислоты, равно как из комбинаций этих полимеров в различных концентрациях.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления способа по изобретению изменяют отсечку по молекулярной массе (MWCO) по меньшей мере одной первой или по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны или обеих мембран. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления способа по изобретению изменяют композицию матрикса геля, предпочтительно, изменяя вязкость матрикса геля или изменяя концентрацию соединения материала матрикса геля. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления способа по изобретению меняют как MWCO по меньшей мере одной мембраны, так и композицию матрикса геля. Эти меры могут изменить коэффициент диффузии через мембраны и/или проницаемость вещества через матрикс геля. Может изучаться взаимодействие вещества внутри первой жидкости с материалом матрикса геля и его влияние на устойчивость, совместимость и пригодность вещества.

«Буферный раствор» представляет собой раствор предпочтительно, имеющий значение рН или обладающий способностью удерживать значение pH системы, например, между pH 5,5 и pH 8,5, предпочтительно, между около pH 7,0 и около pH 7,6, более предпочтительно, с pH 7,4. «Физиологически совместимый буферный раствор» представляет собой раствор, предпочтительно имеющий значение рН или обладающий способностью удерживать значение pH системы между около pH 7,0 и около pH 7,6, более предпочтительно, с pH 7,2-7,4. Предпочтительно, буферный раствор содержит соли. Буферный раствор может представлять собой, например, физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS), бикарбонатный буфер, бикарбонатный буфер по Рингеру, лактатный буфер по Рингеру, смоделированные жидкости организма, другие изотонические растворы, клеточные культуральные среды и любые другие физиологически репрезентативные буферные смеси. Жидкости, применяемые в качестве буферных смесей, могут также применяться для приготовления матрикса геля в комбинации с вышеупомянутыми материалами для матрикса геля.

В настоящей Заявке термин «клиренс вещества из жидкости», такой как первая жидкость, следует понимать как включающий в себя диффузию вещества из жидкости, в которую вещество было введено. Однако клиренс также включает в себя физические и химические изменения вещества, такие как, например, разложение или осаждение вещества в жидкости или в любой другой части системы, например, в матриксе геля или во второй жидкости. Так, клиренс вещества из первой жидкости включает информацию, например, об устойчивости и биодоступности вещества в соответствующих жидкостях и в целом в сымитированной физиологической среде.

Согласно способу по изобретению, можно не только анализировать поведение введенного вещества, такого как, например, белок или вспомогательное вещество. Согласно способу по изобретению, можно также отслеживать, например, разложение или физические и химические изменения из первой жидкости или любой другой жидкости, произошедшие после введения вещества в первую жидкость и диффузию из первой жидкости в другие жидкости.

Согласно аспекту способа по изобретению, на этапе определения клиренса вещества из первой жидкости выполняют измерение концентрации вещества в первой жидкости, во второй жидкости или как в первой, так и во второй жидкости. Это может быть выполнено, например, путем отбора образцов из соответствующих жидкостей с последующим анализом содержания вещества или продуктов разложения. Анализ может выполняться посредством спектроскопии, например, флуоресцентной спектрометрии, спектроскопии комбинационного рассеяния или спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой области. Анализ образцов жидкости также можно проводить посредством жидкостной или газовой хроматографии, например, эксклюзионной хроматографии высокого разрешения (SE-HPLC) или ионообменной жидкостной хроматографии высокого разрешения (IE-HPLC). Анализ также можно проводить по рассеянию света, например, способами статического рассеяния света, динамического рассеяния света и турбидиметрии. Предпочтительно, измерения концентрации или другие измерения при определении клиренса проводят повторно, предпочтительно, периодически. Предпочтительно, измерения проводят в течение нескольких часов, более предпочтительно, в течение нескольких суток, например, до одной или двух недель, или даже дольше. Продолжительность и интенсивность выполнения измерений может быть адаптирована к веществу, например, размеру молекулы и проницаемости системы. Измерения концентрации или другие измерения, такие как, например, измерения pH можно также проводить помещая датчик непосредственно в соответствующую жидкость, подлежащую измерениям.

Согласно другому аспекту способа по изобретению, вводимое вещество содержит молекулы, обладающие размером в диапазоне между около 100 Да и около 400 кДа, предпочтительно, в диапазоне между около 1 кДа и около 250 кДа, например, между 4 кДа и 150 кДа. Характеристики полупроницаемых мембран могут быть адаптированы под размеры и формы (например, линейная, глобулярная) молекул, применяемых в способе по изобретению. Например, MWCO мембраны можно отрегулировать в зависимости от желаемого времени удержания вещества, например, в первой жидкости или, например, в матриксе геля. Например, если вещество, подлежащее анализу, состоит из молекул меньшего размера или содержит молекулы меньшего размера, например, меньше чем около 10 кДа, тогда для увеличения времени удерживания (например, до нескольких суток) можно использовать, предпочтительно, мембраны, имеющие MWCO менее чем или равные 10 кДа. Если необходимо уменьшить время удерживания (например, до нескольких часов), можно применить мембраны с MWCO, превышающим 10 кДа. Предпочтительно, мембраны с MWCO в диапазоне между около 10 кДа до 100 кДа применяют для веществ, состоящих из макромолекул или содержащих макромолекулы с размерами между около 50 кДа до 150 кДа. Предпочтительно, мембраны с MWCO в диапазоне между около 1 кДа до 50 кДа применяют для веществ, состоящих из макромолекул или содержащих макромолекулы с размерами около 10 кДа.

Предпочтительно, в способе и устройстве по изобретению применяют первую полупроницаемую мембрану и одну вторую полупроницаемую мембрану. Однако вместо одной мембраны на опоре можно расположить также множество мембран. Предпочтительно, тогда мембраны располагают непосредственно одна за другой, предпочтительно, сверху каждой. Если применяют несколько, например, две мембраны, некоторые мембраны могут обладать одинаковыми MWCO или могут обладать различными MWCO. За счет применения множества мембран, дополнительно можно изменять характеристики барьера. Множество мембран способно изменить характеристики барьера не только благодаря дополнительному утолщению множества мембран, но также благодаря отличающимся диапазонам размеров пор множества мембран по сравнению с отдельной мембраной (даже с одинаковыми MWCO). Также переход от одной мембраны к следующей может повлиять на характеристики барьера ввиду различий в местоположениях пор и размеров мембраны.

Предпочтительно, характеристики мембраны адаптируют к проницаемости реальной ткани. Например, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления способа по изобретению, по меньшей мере одна первая полупроницаемая мембрана имеет MWCO по существу соответствующую эксклюзионному пределу сетчатки (REL). «В основном соответствующий» подразумевает включение значений REL, а также MWCO, отличающегося от REL, например, до около 50 процентов. Общеизвестно, что REL представляет собой максимальный размер молекулы, способной свободно диффундировать через сетчатку глаза. Для здорового глаза человека считается, что REL находится в диапазоне от около 50 кДа (10³ Дальтон) до 100 кДа, предпочтительно, 70 кДа. Однако у различных организмов этот диапазон может значительно варьироваться и зависит от состояния глаза (возрастные изменения, болезнь и так далее). Кроме того REL сильно зависит от структуры диффундирующей молекулы, например, от линейной или глобулярной структуры молекулы.

Полупроницаемые мембраны, применяемые в способе и устройстве по изобретению, дают возможность контролировать скорость диффузии через мембраны. Полупроницаемые мембраны представляют собой мембраны, контролирующие диффузию и их также можно рассматривать как мембраны, селективно регулирующие величину по молекулярной массе. Предпочтительно, полупроницаемые мембраны являются диалитическими мембранами. диалитическая мембрана представляет собой полупроницаемую пленку, например, лист регенерированной целлюлозы или сложных эфиров целлюлозы, содержащий поры различного размера. Как правило, молекулы, размеры которых превышают размеры пор, не могут проходить через мембрану, хотя маленькие молекулы могут проходить свободно. Характеристики разделения, определяемые диапазоном размера пор диалитической мембраны, соизмеримы с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) мембраны. Диффузия молекулы около MWCO является замедленной по сравнению с молекулами, имеющими значительно меньшие размеры, чем MWCO. MWCO мембраны не является строго определенной величиной. Диалитические мембраны, в зависимости от материала из которого они изготовлены, могут иметь большой диапазон размеров пор. Другими примерами мембран, контролирующих диффузию, являются мембранные фильтры с различными размерами пор. Как правило, мембраны с увеличенным MWCO применяют, когда в первую жидкость вводят молекулы больших размеров, а мембраны с меньшим MWCO применяют, когда в первую жидкость вводят молекулы с меньшими размерами. Однако, как вкратце упоминалось выше, MWCO мембраны также можно варьировать, чтобы повлиять на время удерживания вещества в первой жидкости. Например, MWCO можно уменьшить, если, например, вещество необходимо удерживать в первой жидкости в течение более длительного периода времени, например, для исследований взаимодействия молекулы с первой жидкостью.

Согласно дополнительному аспекту способа по изобретению этап введения вещества в первую жидкость содержит введение вещества через систему доставки вещества в первую жидкость. Благодаря этому вещество высвобождается в первую жидкость замедленно. Вещество можно вводить в первую жидкость с помощью системы доставки, такой как, например, наночастицы, микрочастицы, депо лекарственного средства (в твердой, жидкой или гелевой форме), имплантаты, депо лекарственного средства или внешние устройства, обеспечивающие повторную доставку вещества с повторным введением или без него. В таких системах доставки вещество может быть инкапсулировано, конъюгировано (присоединено к макромолекуле) или захвачено материалом или элементом, причем материал или элемент подвергается физическому или химическому изменению или тому и другому (например, увеличение в объеме, деградация) в течение времени для высвобождения вещества в жидкость при введении в нее системы доставки. Благодаря наличию системы доставки может быть достигнута задержка во времени для высвобождения вещества в первую жидкость. Когда в первой жидкости происходит миграция системы доставки, транспортер будет двигаться ближе к по меньшей мере одной первой полупроницаемой мембране до высвобождения вещества и входить в контакт с первой жидкостью. В реальной системе с применением систем доставки, биодоступность может увеличиваться за счет доставки вещества, например, лекарственного средства в лекарственной форме, ближе к целевому местоположению без изменения положения места введения.

В аспекте способа по изобретению способ может дополнительно содержать этап выращивания клеток в 2D или 3D клеточных культурах в слое матрикса геля, удерживаемом полупроницаемыми мембранами. Например, общепринятые клеточные линии сетчатки, такие как ARPE-19, D407, RF-6A. Клетки можно выращивать в культуре или сокультуре для имитации ткани задней стенки глаза человека. Систему можно применять для исследования токсичности на клеточном уровне и исследования клиренса введенного вещества или системы доставки или распада клеток.

Способ и устройство по изобретению может применяться не только в специфических тестовых сценариях посредством выбора жидкостей, матрикса геля и полупроницаемых мембран. Способ и устройство может также быть специально адаптировано для анализа различий в поведении веществ и их физиологической среды путем изменения геометрической структуры вышеупомянутых компонентов, например, в зависимости от ориентации полупроницаемых мембран. Например, можно наилучшим образом проанализировать долговременную устойчивость молекулы, например, белка или лекарственной формы лекарственного средства, или также, например, афинности к связыванию антигена, при условии, если время удерживания соответствующей молекулы в тестируемой жидкости достаточно велико. Испытания устойчивости и времени удерживания могут, например, предоставить информацию о том, какую частоту введения конкретного лекарственного средства необходимо выбрать. Так, в некоторых сферах применения было бы желательно увеличить время удерживания вещества в первой жидкости до нескольких суток, предпочтительно, до нескольких недель, более предпочтительно, до нескольких месяцев. Предпочтительно, чтобы при удерживании вещества в первой жидкости условия испытаний оставались настолько близкими к физиологическим, насколько это возможно. В некоторых нижеследующих вариантах осуществления изобретения описаны устройства для анализа поведения молекулы в смоделированной физиологической среде.

В соответствие с дополнительным аспектом изобретения предложено устройство для анализа поведения молекулы в смоделированной физиологической среде. Устройство содержит первую камеру, вмещающую первую жидкость, вторую камеру, вмещающую матрикс геля, и третью камеру, вмещающую вторую жидкость. Устройство дополнительно содержит первую опору, удерживающую по меньшей мере одну первую полупроницаемую мембрану, и вторую опору, удерживающую по меньшей мере одну вторую полупроницаемую мембрану. Вторую опору располагают на расстоянии от первой опоры. Первую опору располагают между первой камерой и второй камерой, и вторую опору располагают между второй камерой и третьей камерой.

В устройстве по изобретению первую жидкость в первой камере можно отделять от матрикса геля во второй камере при помощи по меньшей мере одной первой полупроницаемой мембраны, удерживаемой первой опорой. Предпочтительно, по меньшей мере одну первую полупроницаемую мембрану располагают на первой опоре. По меньшей мере одну первую полупроницаемую мембрану можно располагать на первой опоре только в краевых участках мембраны. Первую опору можно сконструировать таким образом, чтобы на ней помещалась по меньшей мере одна мембрана, удерживаемая по существу всей поверхностью первой опоры. Матрикс геля также отделяют от второй жидкости в третьей камере при помощи по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны, удерживаемой второй опорой. По меньшей мере одну вторую полупроницаемую мембрану предпочтительно располагать на второй опоре. По меньшей мере одну вторую полупроницаемую мембрану можно располагать на второй опоре только на краевых участках мембраны. Вторую опору можно сконструировать таким образом, чтобы на ней располагалась по меньшей мере одна мембрана, удерживаемая по существу всей поверхностью второй опоры.

Вторую камеру преимущественно образуют из по меньшей мере одной первой и по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны, а также возможно из боковых стенок устройства. В зависимости от варианта осуществления устройства и расположения опор, вторую камеру преимущественно образуют из первой опоры и второй опоры и возможно также из боковых стенок устройства. Три камеры предпочтительно располагать последовательно. Предпочтительно, чтобы единственным материальным обменом, происходящим между первой и третьей камерой, были молекулы, проникшие через по меньшей мере одну первую и по меньшей мере одну вторую полупроницаемые мембраны и диффундирующие через матрикс геля.

Предпочтительно снабжать первую, вторую и третью камеры по меньшей мере одним отверстием. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере одно отверстие камеры соответствовало по меньшей мере одному отверстию, предусмотренному в каждой из первой и второй опор. Первая и вторая опоры предпочтительно являются стенками камер, снабженных по меньшей мере одним отверстием. По меньшей мере одно отверстие покрывают, соответственно, по меньшей мере одной полупроницаемой мембраной. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения первая опора образует пористую стенку первой камеры и второй камеры, а вторая опора образует пористую стенку второй камеры и третьей камеры. В данных вариантах осуществления изобретения, первую и вторую опору предпочтительно снабжают множеством отверстий, предпочтительно, распределенных по всей площади опоры.

Некоторые аспекты и преимущества устройства обсуждались в отношении способа по изобретению и не будут повторяться.

Согласно одному аспекту устройства по изобретению по меньшей мере одна первая полупроницаемая мембрана обладает отсечкой по молекулярной массе (MWCO), меньшей или равной отсечке по молекулярной массе (MWCO) по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны. Превышающая или равная MWCO по меньшей мере одной второй мембраны теоретически гарантирует, что все молекулы, прошедшие через по меньшей мере одну первую мембрану могут пройти через по меньшей мере одну вторую мембрану и могут быть обнаружены во второй жидкости. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения способа и устройства по изобретению отсечку по молекулярной массе MWCO по меньшей мере одной первой полупроницаемой мембраны по существу соответствует эксклюзионному пределу сетчатки (REL). Предпочтительно, чтобы MWCO по меньшей мере одной первой мембраны находилась в диапазоне между и включая 10 кДа и 100 кДа, в особенности при имитации среды глаза.

В соответствии с дополнительным аспектом устройства по изобретению форма и размер первой опоры адаптируют к форме и размеру сетчатки, предпочтительно, сетчатки человека. Одну или по меньшей мере одну мембрану затем располагают на первой опоре так, чтобы она принимала форму первой опоры. Это позволяет сымитировать распределение и миграцию вещества, введенного в стекловидное тело глазного яблока. В особенности в реальных условиях можно имитировать расстояния между местоположением введения и сетчаткой или задней поверхностью глазного яблока. Так, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере первая опора имеет вогнутую форму. Благодаря этому по меньшей мере часть первой камеры может имитировать форму части глазного яблока, часть которого соответствует части первой камеры, образованной первой опорой. Эта часть является наиболее значимой с точки зрения проницаемости для макромолекул. Благодаря вогнутой (или выпуклой) опоре и соответствующей форме камеры, возможно, также обеспечивается возможность в реальных условиях имитировать формы других органов. Предпочтительно, вторая опора также имеет вогнутую форму, причем вторую опору вогнутой формы можно располагать соосно с первой опорой. Первую и вторую опоры также можно располагать параллельно друг другу и на расстоянии друг от друга. Тогда вторая камера может быть по существу полностью образована первой и второй опорами (и соответствующими мембранами, лежащими на соответствующей опоре).

При таком устройстве первой камеры и по меньшей мере одной первой мембраны имитируют геометрию, а также физическую и химическую среду внутри глазного яблока. В сочетании с матриксом геля и предпочтительно, вогнутой по меньшей мере одной второй мембраной, можно сымитировать барьер из цельной ткани, покрывающей глазное яблоко, такой как передний отдел и задний отдел глазной ткани.

Устройство, а именно, стенки камер и опоры могут изготавливаться из любого материала, совместимого с жидкостями и веществами, применяемыми в устройстве. Предпочтительно применять инертный материал, такой как стекло, нержавеющая сталь, сплавы инертных металлов, инертные синтетические пластики или полимерные материалы. Предпочтительно, в виду их прозрачности, применять стекло или инертные пластики. В качестве материала устройства предпочтительно применять стекло, так как этот материал обладает инертностью и хорошими свойствами для повторного применения. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления устройства по изобретению, устройство содержит стекло или изготовлено из стекла. Предпочтительно, по меньшей мере одна первая, вторая или третья камера, первая опора вторая опора содержат стекло или изготовлены из стекла. Все стенки устройства, включая первую и вторую опору, предпочтительно целиком изготавливать из стекла.

Согласно другому аспекту устройства по изобретению устройство дополнительно содержит крышку, закрывающую отверстие первой камеры. Через отверстие первую камеру можно заполнить первой жидкостью и затем ее вновь удалить. Предпочтительно, закрывание можно выполнить воздухонепроницаемым. Благодаря этому можно свести к минимуму влияния окружающей среды на первую жидкость, такие как, например, влажность или загрязнение, до введения вещества и после введения вещества. Крышку предпочтительно изготавливать из того же материала, что и устройство. Предпочтительно, крышку изготавливают из стекла.

Варианты осуществления устройства, содержащие опоры полупроницаемых мембран, являются наиболее предпочтительными для применений полупроницаемых мембран в горизонтальном или по существу горизонтальном положении. При горизонтальном расположении устройства по меньшей мере две камеры, предпочтительно, все камеры, располагают одна над другой или одна поверх другой. Здесь расположение полупроницаемых мембран может являться строго горизонтальным. Однако, горизонтальное расположение включает в себя, например, вогнутую или выпуклую форму мембран, имитирующих форму сетчатки или других тканей. Опоры могут удерживать мембраны целиком, а также оказывать сопротивление давлению массы жидкости или матрикса геля, действующему на полупроницаемые мембраны при их горизонтальном расположении. Введенное вещество стремится мигрировать вниз под действием силы тяготения. При по существу горизонтальном расположении полупроницаемых мембран, полупроницаемая мембрана по существу образует нижнюю часть соответствующей камеры. Так, вещество склонно накапливаться на полупроницаемой мембране и может непосредственно просачиваться из камеры. Было обнаружено, что если накопления вещества на мембране не произошло, это может повлиять на время удерживания вещества в камере. Это может объясняться следующим образом: Если низ камеры закрыт, вещество может повторно диффундировать в жидкость в камере до тех пор пока не переместится в местоположение полупроницаемой мембраны. Полупроницаемая мембрана может, например, образовывать боковую стенку камеры. Такие варианты осуществления устройства являются предпочтительными при вертикальном или по существу вертикальном расположении полупроницаемых мембран. При вертикальном расположении накопление вещества на мембране может не происходить, или по меньшей мере быть ограниченным и время удерживания вещества в первой жидкости или также в матриксе геля может быть увеличено.

Согласно другому аспекту изобретения предусмотрено другое устройство для анализа поведения молекулы в смоделированной физиологической среде. Устройство содержит первую камеру, принимающую первую жидкость, вторую камеру, принимающую матрикс геля и третью камеру, принимающую вторую жидкость. Устройство дополнительно содержит по меньшей мере одну первую полупроницаемую мембрану и по меньшей мере одну вторую полупроницаемую мембрану, причем по меньшей мере одну вторую полупроницаемую мембрану располагают на расстоянии от по меньшей мере одной первой полупроницаемой мембраны. По меньшей мере одну первую полупроницаемую мембрану располагают между первой камерой и второй камерой и по меньшей мере одну вторую полупроницаемую мембрану располагают между второй камерой и третей камерой.

В данных вариантах осуществления устройства по изобретению полупроницаемые мембраны располагают в устройстве без первой и втор опор. Устройство может содержать держатели для удерживания по меньшей мере одной первой полупроницаемой мембраны и по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны между соответствующими камерами. Такие держатели могут, например, представлять собой фиксаторы или фиксирующие средства, зажимающие или фиксирующие мембраны. Держатели предпочтительно располагать на внешней стороне устройства, и они не распространяются внутрь устройства, в особенности не распространяются внутрь какой-либо камеры. Это может упростить изготовление, установку и очистку устройства. Кроме того, полупроницаемые мембраны могут служить единственным барьером между жидкостями и матриксом геля в камерах и не содержать никакого механического элемента, например, первой и второй опор.

Согласно аспекту данного устройства по изобретению, первую камеру, вторую камеру и третью камеру располагают в ряд, в котором по меньшей мере одну первую полупроницаемую мембрану и по меньшей мере одну вторую полупроницаемую мембрану располагают по существу вертикально между соответствующими камерами. При таком вертикальном расположении полупроницаемых мембран сила тяготения действует на мембраны по существу вдоль самих мембран, так что опорами мембран можно пренебречь. Матрикс геля и, возможно также жидкости (в зависимости от их плотности) могут также оказывать удерживающий эффект на полупроницаемые мембраны, когда они расположены вплотную к мембранам. При, в сущности вертикальном расположении положение полупроницаемых мембран может быть строго вертикальным. Однако они также могут располагаться под углом относительно строго вертикального положения. Термин «По существу вертикальное» также включает в себя, например, вогнутую или выпуклую формы при имитации части глазного яблока или других форм тканей.

При по существу вертикальном расположении полупроницаемых мембран вещество не обязательно будет накапливаться на мембранах, в отличие от тех, например, вариантов осуществления устройства, в которых камеры располагают одна над другой. Так, при длительных исследованиях, как например, при исследовании устойчивости в первой жидкости, например, стекловидном теле, их предпочтительно проводят в таком варианте устройства, в котором сила тяготения не оказывает влияния или оказывает только ограниченное влияние на проницаемость вещества через полупроницаемую мембрану.

В вариантах осуществления устройства без опор, его предпочтительно изготавливают из стекла, однако, за исключением полупроницаемых мембран, а также, предпочтительно, держателей.

Дополнительные аспекты и преимущества этого дополнительного устройства по изобретению были уже описаны в отношении способа и устройства по изобретению, содержащего опоры полупроницаемых мембран, и не будут повторяться. В частности, в дополнительном устройстве также могут быть предусмотрены опоры, которые могут быть сформированы и сконструированы как было описано ранее. При наличии опоры в держателе нет необходимости. Кроме того еще и по меньшей мере первая опора может иметь вогнутую форму для имитации формы глазного яблока или сетчатки. При этом характеристики и варианты выполнения полупроницаемых мембран могут быть такими, как было описано ранее, например, с указанными MWCO, или возможно выполнение мембран, контролирующими диффузию, например, в виде отдельной полупроницаемой мембраны или в виде структуры из или комбинации двух или более полупроницаемой мембран.

Предпочтительно, устройство по изобретению, как описано здесь, применяют для испытания вещества in vitro, предпочтительно, испытания лекарственного средства в лекарственной форме, для получения данных об устойчивости или биодоступности вещества, предпочтительно, в лекарственной форме. Устройство по изобретению, как здесь описано, предпочтительно применяют для выполнения способа по изобретению.

Изобретение дополнительно описывают с помощью примеров и вариантов осуществления, иллюстрируемых нижеследующими чертежами, на которых

Фиг. 1 показывает схематичное изображение установки по изобретению для тестирования;

Фиг. 2 и 3 показывают скорости диффузии (Фиг.2) и проницаемость (Фиг. 3) декстрана в зависимости от концентрации гиалуроновой кислоты в матриксе геля;

Фиг. 4 показывает влияние различных мембран на диффузию макромолекул в зависимости от времени;

Фиг. 5 и 6 показывают диффузию (Фиг. 5) и проницаемость (Фиг. 6) различных макромолекул;

Фиг. 7 показывает результаты испытаний, проведенных с моноклональным антителом;

Фиг. 8a-8e показывают первый иллюстративный вариант осуществления устройства по изобретению;

Фиг. 9 показывает схематичное изображение второго варианта осуществления устройства по изобретению;

Фиг. 10a, 10b показывает вариант осуществления устройства по Фиг. 9.

На Фиг. 1 схематически показан вариант осуществления установки и схематически показан способ. Установка имитирует геометрию и состояние глаза и может предпочтительно применяться для исследований in vitro, имитируя условия глаза. Первую камеру 1, вмещающую стекловидное тело, образуют верхней стенкой 10 и первой полупроницаемой мембраной 4, покрывающей часть упомянутой верхней стенки 10. Верхняя стенка 10 снабжена отверстием 101 для заполнения первой камеры 1 через упомянутое отверстие 101. Отверстие 101 может быть закрыто, предпочтительно, воздухонепроницаемой крышкой 6. Крышка 6 может представлять собой, например, пробку конической формы, например, стеклянную пробку. Полупроницаемая мембрана 4 имеет форму части окружности, например, 2/3 окружности. Форма первой камеры 1 и первой мембраны имитирует геометрию глазного яблока и сетчатки. Первую камеру 1 присоединяют к третьей камере 3. При этом предпочтительно, чтобы первая мембрана 4 была полностью вставлена в верхнее отверстие 303 третьей камеры 3 и внутрь третьей камеры 3. Третья камера 3 предназначена принимать буферный раствор. Вогнутая вторая полупроницаемая мембрана 5 расположена в верхнем отверстии 303 и покрывает часть верхней стенки 30 третьей камеры 3. Вторая мембрана 5 также имеет форму части окружности, например от 1/2 до 2/3 окружности. Первая и вторая мембраны 4, 5 могут удерживаться, соответствующими первой и второй опорой, формирующей стенки камеры, как показано ниже на Фиг. 8a-8e. В собранном состоянии первая и третья камеры 1,3, две полупроницаемых мембраны 4,5 расположены на расстоянии друг от друга, образуя вторую камеру 2 в промежутке между первой и второй мембранами. Размеры промежутка могут варьироваться, например, адаптироваться под имитируемую физиологическую систему. Первую и вторую мембраны 4,5 располагают соосно и таким образом, чтобы между мембранами имелось заранее заданное расстояние, предпочтительно, превышающее общую длину мембран. Матрикс геля может заполнить вторую камеру 2 или затем вновь быть удален из нее через входное и выходное отверстие 102, предусмотренное в верхней стенке 10 первой камеры 1. Три камеры могут быть герметизированы, например, помещением уплотнительного кольца круглого сечения, расположенного на верхней стенке 30 третьей камеры и расположенного по окружности вокруг промежутка, образующего вторую камеру 2.

Третью камеру 3 снабжают входным и выходным отверстиями 32, 33. Через входное отверстие третья камера 3 может быть заполнена буферным раствором и через выходное отверстие третьей камеры 3 его можно удалить. Вход и выход предпочтительно выполняют так, чтобы обеспечивался поток через камеру таким образом, чтобы очистить и заменить содержимое третьей камеры 3. Непрерывный или прерывающийся поток через третью камеру 3 может также использоваться для отбора проб второй жидкости с последующим анализом образца.

С помощью первой камеры и первой мембраны 4, имитируют геометрию, а также физическую и химическую среду внутри глазного яблока. В комбинации с матриксом геля и второй мембраной 5, имитируют внешний барьер, охватывающий глазное яблоко, такой как ткань переднего и заднего сегмента. Вещество, например, макромолекулы, может вводиться в стекловидное тело в первой камере 1. Оно мигрирует к первой мембране, затем через первую мембрану 4 и матрикс геля во вторую камеру 2, через вторую мембрану и в буферный раствор в третью камеру 3. Съемная крышка 6 первой камеры 1, а также вход и выход 32,33 третьей камеры позволяют извлекать образцы в аналитических целях.

Далее описаны примеры, выполненные с помощью системы согласно Фиг. 1. Все эксперименты, упомянутые в примерах, проводили в асептических условиях при ламинарном потоке воздуха. Пробы собирали из первой и третьей камеры 1,3 (или VH-камеры 1 и FT-камеры 3, соответственно) в различные интервалы времени.

Пример 1:

Пример 1 приведен для того, чтобы оптимизировать концентрацию гиалуроновой кислоты в матриксе геля. С этой целью изучали влияние различных концентраций гиалуроновой кислоты (НА) (молекулярная масса 1,4x10⁶ Дальтон) в матриксе геля (GM) на скорость диффузии FITC-декстрана (FITC – флуоресцинизотиоцианат) (40 кДа) из стекловидного тела (VH)-камеры 1 при потоке через (FT)-камеру 3. VH-камеру и FT-камеру разделяли GM-камерой 2, действующей как барьер, контролирующий диффузию. Для разделения этих трех камер 1,2,3 применяли две диалитические мембраны 4,5. Первую диалитическую мембрану 4, отделяющую VH-камеру 1 от GM-камеры 2 обозначили как DM-1 (мембрана 4, контролирующая диализ), и вторую диалитическую мембрану, отделяющую GM-камеру от FT-камеры обозначили как DM-2 (мембрана 5, контролирующая диализ). MWCO для DM-1 и DM-2 составили 50 кДа и 100 кДа, соответственно. FT-камеру 3 наполняли стерильным фосфатным буфером в физиологическом растворе (PBS) (pH 7,4), а GM-камеру 2 наполняли различными концентрациями около 3 мл стерильной HA в геле, приготовленной в PBS (в диапазоне от 0-0,9% масс./объ.). В VH-камеру добавляли около 3,5 мл стерильного VH свиньи. Устройство укупоривали и VH оставляли на ночь при 37°C. В конце инкубации в VH-камеру 1 вводили 50 мкл 80 мг/мл FITC-декстрана (40 кДа). Устройство укупоривали и осуществляли инкубацию при 37°C в течение всего времени исследования. В образцах определяли концентрацию FITC-декстрана, применяя флуоресцентный спектрофотометр при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны эмиссии 520 нм. Фиг. 2 иллюстрирует зависимость скорости диффузии от концентрации HA, а Фиг. 3 иллюстрирует зависимость наблюдаемой проницаемости (P_app) от концентрации HA. Проницаемость является характеристикой барьера, контролирующего диффузию (единичный барьер), который позволяет перенос соединений с одной стороны барьера на другую. Если имеется более одного барьера, контролирующего диффузию, проницаемость рассчитывают как наблюдаемую проницаемость (P_app (наблюдаемая) или P_eff (эффективная)). В данных экспериментах для облегчения корреляции между данными по диффузии vitro/ex vivo и литературными данными, описывающими диффузию in vivo, применяли P_app (наблюдаемая проницаемость). Наблюдаемую проницаемость можно рассчитать, например, из соотношения P_app = Q/[A•t•(C_o-C_i)], где Q представляет собой количество вещества, прошедшего через мембрану площадью (A) за время t. C_o и C_i представляют собой концентрацию вещества перед мембраной (концентрация в камере VH) и вещества, прошедшего через мембрану, (концентрация в камере FT), соответственно. P_app можно выражать в см/с, см/мин или см/ч.

Результаты, показанные на Фиг. 2, позволяют предположить, что увеличение концентрации HA в матриксе геля значительно уменьшает скорость диффузии, а также наблюдаемую проницаемость макромолекулы. Правдоподобным объяснением могло быть то, что увеличение концентрации HA может привести к уменьшению пористости матрикса и/или может увеличить взаимодействие декстрана с компонентами матрикса, что приводит к замедлению диффузии FITC-декстрана. Эти результаты показывают, что меняя концентрацию GM можно регулировать скорость диффузии макромолекул через систему.

Пример 2:

Пример 2приведен с целью анализа влияния диалитических мембран на диффузию макромолекул.

Исследовали диффузию альбумина сыворотки быка (BSA) и иммуноглобулина G (IgG) в направлении потока из VH-камеры в FT-камеру, изменяя MWCO диалитической мембраны. Эксперимент проводили так же, как описано в примере 1, с незначительными модификациями. В качестве DM-1 использовали две разные диалитические мембраны с различными значениями MWCO, с MWCO 50 кДа и 100 кДа, в то время как MWCO DM-2 сохраняли постоянным при 100 кДа. VH-камеру заполняли 3,5 мл стерильного VH свиньи, а GM-камеру заполняли около 3 мл стерильного геля HA (0,6 % масс./объ.). FT-камеру заполняли стерильным PBS. Устройство укупоривали и VH оставляли на ночь при 37°C. В конце инкубации в VH-камеру вводили 50 мкл FITC-BSA (80 мг/мл) или 200 мкл FITC-IgG (20 мг/мл). В течение всего исследования устройство укупоривали и осуществляли инкубацию при 37°C. В образцах определяли концентрацию FITC-BSA и FITC-IgG при помощи флуоресцентного спектрофотометра при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны эмиссии 520 нм.

На Фиг. 4 показаны результаты измерений зависимости диффузии BSA в FT камере 3 (на рисунке обозначена как PBS камера) от времени при DM-1 и DM-2 MWCO 100 кДа 81, для IgG (около 144 кДа) DM-1 и DM-2, MWCO 100 кДа 82, для BSA DM-1 50 кДа и DM-2 MWCO 100 кДа 83 и для IgG при DM-1 50 кДа и DM-2 MWCO 100 кДа 84. Результаты, показанные на Фиг. 4, позволяют предположить, что DM-1 (83,84) при MWCO 50 кДа значительно ограничила диффузию, как IgG, так и BSA по сравнению с диффузией, наблюдаемой при DM-1 (81,82) при MWCO 100 кДа. Таким образом, меняя MWCO диалитической мембраны, появляется дополнительная возможность настраивать диффузию макромолекул.

Пример 3:

Пример 3 приведен с целью наблюдения диффузии различных макромолекул (линейных и глобулярных).

Данный эксперимент проводили так же как описано в примере 1 с незначительными модификациями. В качестве DM-1 использовали диалитическую мембрану (MWCO, 50 кДа), а в качестве DM-2 использовали диалитическую мембрану (MWCO, 100 кДа). VH-камеру заполняли 3,5 мл стерильного VH свиньи, а GM-камеру заполняли около 3 мл стерильного геля HA (0,6 % масс./объ.). FT-камеру заполняли около 35 мл стерильного PBS. Устройство укупоривали и VH оставляли на ночь при 37°C. В конце инкубации в VH-камеру вводили 50 мкл 80 мг/мл FITC-декстрана 4 кДа 91, FITC-декстрана 40 кДа 92, FITC-декстрана 70 кДа 94, FITC-BSA 93, или 200 мкл FITC-IgG (20 мг/мл) 95. Устройство укупоривали и осуществляли инкубацию при 37°C на протяжении всего исследования. С помощью флуоресцентного спектрофотометра при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны эмиссии 520 нм в образцах определяли концентрацию FITC-декстрана.

Как показано на Фиг. 5, где изображена зависимость количества различных продиффундировавших макромолекул от времени, макромолекулы продемонстрировали различную скорость диффузии. Как и ожидалось, молекулы меньшего размера диффундировали с более высокой скоростью, чем более крупные молекулы. Аналогичное явление наблюдали для макромолекул линейного и глобулярного видов. Аналогичным образом более мелкие молекулы демонстрировали более высокие значения P_app по сравнению с крупными молекулами, что изображено на Фиг. 6. Это может быть обусловлено тем, что крупные молекулы сталкиваются с более высоким сопротивлением GM ввиду их большего молекулярного радиуса по сравнению с молекулами меньшего размера, что приводит к низкой P_app. Интересно, что FITC-декстран 40 кДа и FITC-BSA (66 кДа) продемонстрировали близкие результаты P_app. Близость значений P_app можно объяснить близостью молекулярного радиуса (FITC-декстрана 40 кДа: 4,5 нм, а FITC BSA: 3,62 нм).

Пример 4:

В данном эксперименте исследовали диффузию моноклонального антитела (mAb1)при наличии или в отсутствие GM, из VH-камеры в FT-камеру. Данный эксперимент проводили так же как описано в примере 1 с незначительными модификациями. Вновь в качестве DM-1 использовали диалитическую мембрану MWCO 50 кДа, а в качестве DM-2 использовали диалитическую мембрану MWCO 100 кДа. VH-камеру заполняли 3,5 мл стерильного VH свиньи, а GM-камеру заполняли около 3 мл стерильного геля HA (0,6 % масс./объ.) или стерильным PBS (без матрикса). FT-камеру заполняли стерильным PBS. Устройство укупоривали и VH оставляли на ночь при 37°C. В конце инкубации в VH-камеру вводили 33 мкл mAb1 (120 мг/мл). Устройство укупоривали и осуществляли инкубацию при 37°C в течение всего исследования. Концентрацию mAb1 определяли с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC).

На Фиг. 7 показана зависимость количества mAB1 в VH камере от времени. Как показано, что диффузия mAb1 значительно уменьшалась в присутствии GM (около 51% mAb1 продиффундировало из VH-камеры за 120 ч), о чем свидетельствует кривая 85, по сравнению с диффузией, наблюдавшейся в отсутствие GM (около 87% mAb1 продиффундировало за 120 ч), о чем свидетельствует кривая 86. Уменьшение диффузии можно объяснить сопротивлением, оказываемым матриксом геля. Данный результат ясно свидетельствует о возможности искусственно менять время удерживания терапевтических препаратов на основе белка в VH камере 1, изменяя концентрацию матрикса геля.

Фиг. 8a - Фиг. 8e представляют собой иллюстративный вариант выполнения устройства по изобретению и его частей. Для одних и тех же или подобных элементов используют те же ссылочных позиции, что что и на Фиг. 1. Фиг. 8a показывает крышку 6, имеющую цилиндрическую форму с окружностью, соответствующей размеру отверстия 101 в верхней стенке 10 первой камеры 1. В собранном состоянии, как показано на Фиг. 8c, крышка предпочтительно обеспечивает герметичное уплотнение с верхней стенкой 101. Макромолекулы 7, представляющие собой вещество, в первой жидкости, такой как стекловидное тело 11, обозначены кружками. На Фиг. 8c макромолекулы уже мигрировали через первую жидкость 11, например стекловидное тело, в первой камере 1 в направлении первой мембраны 4. Первая мембрана расположена на первой опоре 14, образующей часть верхней стенки 101 первой камеры 1. на Фиг. 8d вторая мембрана 5 расположена на второй опоре 15. Вторая опора 15 образует часть верхней стенки 30 третьей камеры 3. Третья камера имеет цилиндрическую форму, но в принципе может иметь любую другую форму. Третья камера заполнена второй жидкостью, предпочтительно, физиологически совместимым буферным раствором 31. Вход и выход 33, 32 образованы трубчатыми секциями, присоединенными или, предпочтительно, объединенными с боковыми стенками 34 третьей камеры 3. Первую и вторую опору 14, 15 в собранном состоянии располагают на равном расстоянии от первой и третьей камер, как показано на Фиг. 8e. На этом рисунке показано, что некоторые макромолекулы уже мигрировали к первой мембране 4, а некоторые из них частично прошли матрикс геля 21 во второй камере 2, образованной первой и второй мембранами 4,5 (удерживаемыми первой и второй опорами 14,15), а некоторые уже почти продиффундировали через вторую мембрану 5.

Три камеры 1,2,3, располагают выше или одна поверх другой. Полупроницаемые мембраны 4,5 располагают по существу горизонтально между соответствующими камерами, образуя «горизонтальное расположение» устройства.

Все части устройства, граничащие с мембранами, можно изготавливать из стекла. Предпочтительно изготавливать устройство только из трех отдельных частей: крышки, первой камеры и третьей камеры, при этом отельные части могут быть соединены друг с другом, предпочтительно, герметично. Также предпочтительно, чтобы устройство, показанное на Фиг. 9, было изготовлено из стекла.

Устройство на Фиг. 9 содержит резервуар 100, например, кубической или трубчатой формы. Первая полупроницаемая мембрана 4 и вторая полупроницаемая мембрана 5 расположены в резервуаре таким образом, чтобы разделить внутреннее пространство резервуара 100 на первую камеру 1, вторую камеру 2 и третью камеру 3. Первая полупроницаемая мембрана 4 и вторая полупроницаемая мембрана 5 расположены в резервуаре 100 вертикально, перпендикулярно продольной оси 300 резервуара 100.

Для подачи первой жидкости, например, стекловидного тела первая камера 1 содержит первый вход 17, расположенный наверху резервуара 100. Одна боковая стенка первой камеры 1 образована первой полупроницаемой мембраной 4.

Две полупроницаемые мембраны 4,5 расположены на расстоянии друг от друга, образуя между двумя мембранами вторую камеру 2. Расстояние между мембранами 4,5 может варьироваться, например, адаптироваться под физиологическую систему, подлежащую имитации. Первая и вторая мембраны 4,5 предпочтительно имеют между собой заранее заданное расстояние, предпочтительно, превышающее общую длину мембраны. Вторая камера 2 содержит второй вход 18, расположенный в верхней части резервуара 100, для подачи матрикса геля во вторую камеру 2 и удаления его из второй камеры 2.

Третью камеру 3 образуют для подачи и удаления третьей жидкости, например, буферного раствора, ее образуют в виде проточной камеры, содержащей вход и выход 32,33, расположенные на Фиг. 9 в верхней части резервуара 100. Однако вход и выход можно также располагать предпочтительно, в разных (твердых) боковых стенках третьей камеры. Одна боковая стенка третьей камеры 3 (не образованная стенкой резервуара) образована второй полупроницаемой мембраной 5.

Три камеры 1,2,3, расположены одна за другой вплотную. В резервуаре полупроницаемые мембраны 4,5 расположен вертикально, образуя «вертикальное расположение» устройства.

Полупроницаемые мембраны 4,5 фиксируются держателями 24,25. Держатели 24,25 расположены сверху и снизу резервуара 100 снаружи резервуара 100. Держатели 24,25 можно также располагать вокруг резервуара 100 по окружности. Держатели могут представлять собой, например, зажимы.

Фиксация мембран 4,5 также может быть достигнуто с помощью самого резервуара 100. Например, резервуар 100 может быть изготовлен из нескольких, например, трех частей. Тогда полупроницаемые мембраны могут быть зажаты между двумя частями при установке и скреплении частей друг с другом. Тогда каждая часть по существу образует камеру. Такой вариант осуществления устройства иллюстрируется Фиг. 10a и Фиг. 10b. Фиг. 10a показывает три отдельные части 101,102,103 резервуара 100, которые могут быть собраны в устройство по изобретению, причем первая полупроницаемая мембрана 4 зажимается между первой и второй частями 101,102, а вторая полупроницаемая мембрана 5 зажимается между второй и третьей частями 102,103. Каждая из двух частей резервуара может быть снабжена зажимные средства (не показаны) для взаимного скрепления двух частей и для достижения соединения, непроницаемого для жидкостей, между двумя частями. Для обеспечения фиксации каждую часть 101,102,103 снабжают кольцеобразными подвижными ободками 1010,1020,1021,1030. В собранном состоянии резервуара, показано на Фиг. 10b, каждые два ободка 1010,1020; 1021,1030 вступают в соприкосновение друг с другом, фиксируя полупроницаемые мембраны вдоль кольцевой части. Для фиксации каждого из участков ободков, предпочтительно, предусмотрены зажимные средства.

Полупроницаемые мембраны 4,5 предпочтительно представляют собой плоские мембраны. Однако, если позволяет материал мембран, мембраны могут также иметь заранее заданную форму, например, вогнутую или выпуклую с целью имитации геометрии частей глазного яблока. Предпочтительно, чтобы формы полупроницаемых мембран 4,5 соответствовали друг другу. Хотя вертикально расположенные мембраны предпочтительно удерживаются в резервуаре зажимами или другими фиксаторами, первая и вторая мембраны 4, 5 могут также удерживаться соответственно первой и второй опорами, образующими стенки камер, как описано выше на Фиг. 8a-8e. Тогда в держателях 24,25 нет необходимости.

Вещество, например, макромолекулы, можно вводить через первое отверстие 17 в первую жидкость в первой камере 1. Вещество мигрирует во все стороны. За счет силы тяготения преобладает миграция к дну первой камеры. Однако дно образованное закрытой стенкой резервуара, не допускает диффузию вещества из первой жидкости через него. Только после миграции вещества в первую полупроницаемую мембрану происходит диффузия из первой камеры через первую мембрану 4 в и через матрикс геля во вторую камеру 2, через вторую мембрану, и в буферный раствор в третьей камере 3.. Вход 17, так же как вход и выход 32,33 третьей камеры также позволяет извлекать образцы в аналитических целях.

Изобретение было описано для конкретных вариантов осуществления. Однако дополнительные варианты осуществления возможны без отступления от объема изобретения. Например форма и размер устройства могут быть адаптированы под конкретное применение вещества, подлежащего исследованию. Главным образом может изменяться геометрия устройства. Например, камеры и мембраны можно располагать по существу в плоскости, таким образом, чтобы устройство было образовано комплектом камер, разделенных мембранами. Геометрия расположения может также оказывать влияние на материалы, применяемые в способе и устройстве по изобретению. Например, в плоскостной конфигурации вещество может предусматривать дополнительную опору для мембран, так, что, например, отпадает необходимость в первой опоре или она может быть ограничена небольшими краевыми участками. Кроме того жидкий или полужидкий материал матрикса геля можно заменить пористым твердым материалом, образующим барьер. Например, керамические материалы и пластические вещества с открытыми порами могут быть предпочтительными в сочетании с ростом клеток в материале барьера . Кроме того одну мембрану можно заменить на две или более мембраны с одинаковыми или различными MWCO.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ анализа поведения веществ in vitro, устройство для анализа поведения молекул, а также средство для испытания вещества in vitro. Способ включает обеспечение первой жидкости, матрикс геля и второй жидкости, разделение первой жидкости и матрикс геля первой полупроницаемой мембраной, разделение матрикс геля и второй жидкости второй полупроницаемой мембраной, введение вещества в первую жидкость для его мигрирования из первой жидкости через матрикс гель во вторую жидкость и определение клиренса вещества из первой жидкости. Устройство включает три камеры для первой жидкости, второй жидкости и матрикс геля, первую опору для удержания первой полупроницаемой мембраны, вторую опору для удержания второй полупроницаемой мембраны, где форма и размер первой опоры адаптированы к форме и размеру сетчатки. Средство для испытания вещества in vitro с целью получения данных об устойчивости или биодоступности вещества представляет собой вышеуказанное устройство. Изобретения обеспечивают реалистичное имитирование диффузионных барьеров для веществ и диффузии вещества через указанные барьеры. 3 н. и 13 з.п. ф-лы., 15 ил., 4 пр.

1. Способ анализа поведения веществ in vitro в смоделированной физиологической среде, причем способ содержит этапы, на которых:

- обеспечивают первую жидкость, представляющую собой жидкость, извлеченную из человека или животных, или искусственную жидкость, имитирующую природную жидкость, матрикс геля, обладающий свойствами между твердым телом и жидкостью с заранее заданной, но переменной вязкостью и заранее заданными, но варьируемыми концентрациями соединений, и вторую жидкость, представляющую собой буферный раствор;

- разделяют первую жидкость и матрикс геля с помощью по меньшей мере одной первой полупроницаемой мембраны, селективно регулирующей величину по молекулярной массе;

- разделяют матрикс геля и вторую жидкость с помощью по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны, селективно регулирующей величину по молекулярной массе;

- вводят вещество в первую жидкость;

- позволяют веществу мигрировать из первой жидкости через по меньшей мере одну первую полупроницаемую мембрану, через матрикс гель, через по меньшей мере одну вторую полупроницаемую мембрану и во вторую жидкость; и

- определяют клиренс вещества из первой жидкости.

2. Способ по п. 1, в котором первая жидкость представляет собой стекловидное тело, а вторая жидкость представляет собой буферный раствор, предпочтительно, физиологически совместимый буферный раствор.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором этап определения клиренса вещества из первой жидкости выполняют путем измерения концентрации вещества в первой жидкости, во второй жидкости или, и в первой, и во второй жидкости.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащий этап изменения отсечки по молекулярной массе (MWCO) по меньшей мере одной первой или по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны, или изменением композиции матрикс геля, предпочтительно, изменяя вязкость матрикс геля или изменяя концентрацию компонента матрикс геля.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вводимое вещество содержит молекулы с размерами в диапазоне между около 100 Да и около 400 кДа, предпочтительно, в диапазоне между около 1 кДа и около 250 кДа, например, между 4 кДа и 150 кДа.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором по меньшей мере одна первая мембрана имеет отсечку по молекулярной массе (MWCO), по существу соответствующую эксклюзионному пределу сетчатки (REL).

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором этап введения вещества в первую жидкость содержит введение вещества через систему доставки вещества в первую жидкость, замедляя тем самым высвобождение вещества в первую жидкость.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вещество представляет собой по меньшей мере одно из следующего: макромолекулу, лекарственное средство в лекарственной форме, вспомогательное вещество, белок или их комбинацию.

9. Устройство для анализа поведения молекул в смоделированной физиологической среде, причем устройство содержит

первую камеру для приема первой жидкости, представляющей собой жидкость, извлеченную из человека или животных, или искусственную жидкость, имитирующую природную жидкость, вторую камеру для приема матрикс геля, обладающего свойствами между твердым телом и жидкостью с заранее заданной, но переменной вязкостью и заранее заданными, но варьируемыми концентрациями соединений и

третью камеру для приема второй жидкости, представляющей собой буферный раствор; причем устройство дополнительно содержит

первую опору для удержания по меньшей мере одной первой полупроницаемой мембраны, селективно регулирующей величину по молекулярной массе, и

вторую опору, удаленную от первой опоры, для удержания по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны, селективно регулирующей величину по молекулярной массе, в котором первая опора расположена между первой камерой и второй камерой, а вторая опора расположена между второй камерой и третьей камерой, причем

первая опора образует пористую стенку первой камеры и второй камеры, а вторая опора образует пористые стенки второй камеры и третьей камеры, а форма и размер первой опоры адаптированы к форме и размеру сетчатки.

10. Устройство по п. 9, в котором по меньшей мере одна первая полупроницаемая мембрана расположена на первой опоре, а по меньшей мере одна вторая полупроницаемая мембрана расположена на второй опоре, причем по меньшей мере одна первая полупроницаемая мембрана имеет отсечку по молекулярной массе (MWCO), которая меньше или равна отсечке по молекулярной массе (MWCO) по меньшей мере одной второй полупроницаемой мембраны.

11. Устройство по любому из пп. 9-10, в котором отсечка по молекулярной массе (MWCO) по меньшей мере одной первой полупроницаемой мембраны по существу соответствует эксклюзионному пределу сетчатки (REL).

12. Устройство по любому из пп. 9-11, в котором по меньшей мере первая опора имеет вогнутую форму.

13. Устройство по любому из пп. 9-12, в котором по меньшей мере часть устройства выполнена из стекла.

14. Устройство по любому из пп. 9-13, дополнительно содержащее крышку для закрывания отверстия первой камеры.

15. Применение устройства по любому из пп. 9-14 для испытания вещества in vitro с целью получения данных об устойчивости или биодоступности вещества.

16. Применение устройства по п. 15, в котором вещество представляет собой лекарственное средство в лекарственной форме.