ОЧИСТКА ОЛИГОСАХАРИДОВ ОТ ФЕРМЕНТАЦИОННОГО БУЛЬОНА ПОСРЕДСТВОМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ФИЛЬТРАЦИИ Российский патент 2023 года по МПК C07H1/08 C07H3/06 A61K31/702 C12P19/14 A23L5/00 A23L29/30 A23L33/21 A23L33/00 

Настоящее изобретение относится к получению олигосахаридов посредством микробной ферментации в промышленном масштабе. Более конкретно, настоящее изобретение относится к очистке целевого олигосахарида от ферментационного бульона посредством использования способов фильтрации.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Человеческое грудное молоко представляет собой сложную смесь углеводов, жиров, белков, витаминов, минеральных веществ и микроэлементов. Фракция углеводов представляет собой наиболее преобладающую фракцию твердой фазы и может быть дополнительно подразделена на лактозу и более сложные олигосахариды, так называемые олигосахариды грудного молока (ОГМ).

В то время как лактоза используется в качестве источника энергии, сложные олигосахариды не метаболизируются грудными детьми и взрослыми. На долю фракции сложных олигосахаридов приходится вплоть до 10% суммарной фракции углеводов, и она, вероятно, состоит из более чем 150 разных олигосахаридов. Распространенность и концентрация данных сложных олигосахаридов являются специфичными для человека, и, таким образом, они не обнаружены в больших количествах в молоке других млекопитающих, таких как одомашненные молочные животные. Несмотря на то, что ОГМ представляют только минорную фракцию всего человеческого грудного молока, их высоко полезное действие на развитие грудных детей стало очевидным за последние десятилетия.

Наиболее распространенным ОГМ является 2'-фукозиллактоза. Дополнительные распространенные ОГМ представляют собой 3-фукозиллактозу, дифукозиллактозу, лакто-N-тетраозу, лакто-N-неотетраозу и лакто-N-фукопентаозы. Помимо данных нейтральных олигосахаридов, также в человеческом грудном молоке могут быть обнаружены кислые ОГМ, включая 3'-сиалиллактозу, 6'-сиалиллактозу и сиалиллакто-N-тетраозы, такие как LST-a, LST-b и LST-c (Таблица 1). Вплоть до 20% от общего содержания ОГМ человеческого грудного молока являются кислыми за счет наличия по меньшей мере одной группировки сиаловой кислоты. Данные структуры тесно связаны с эпитопами гликоконъюгатов поверхности эпителиальных клеток (групповые антигены крови Льюиса), и структурная гомология между ОГМ и эпитопами эпителия объясняет способность ОГМ защищать от бактериальных патогенов (Weichert et al. 2013, Nutr. Res. 33:831; Weichert et al. 2016, J. Virol. 90:4843).

О наличии сложных олигосахаридов в человеческом грудном молоке известно на протяжении длительного периода, и физиологические функции ОГМ стали предметом медицинского исследования на протяжении многих десятилетий (Gura 2014, Science 345:747; Kunz & Egge 2017, In McGuire, McGuire & Bode (eds) Prebiotics and Probiotics in Human Milk, Elsevier, London, pp. 3-16). Для некоторых более распространенных ОМГ конкретные функции уже идентифицированы (Bode 2012, Glycobiology 22:147; Bode & Jantscher-Krenn 2012, Adv. Nutr. 3S:383; Morrow et al. 2004, J. Pediatr. 145:297). За счет их физиологической способности ингибировать инфекционные агенты (бактерии, вирусы и бактериальные токсины), их положительного действия, оказываемого на развитие головного мозга, и их пребиотических функций, существует большая потребность во включении ОГМ в продукты питания, в частности, продукты для детского питания. В Таблице 1 предложен обзор ОГМ, которые могут быть очищены от ферментационного бульона способами, раскрытыми в данном документе.

Ограниченная поставка отдельных ОГМ и неспособность поставить достаточные количества данных молекул привела к разработке способов на основе химического синтеза для их получения. Однако, химический синтез ОГМ оказался крайне сложным, особенно крупномасштабная масштабное получение ОГМ с достаточным качеством для применений в пищевой промышленности. В частности, для химического синтеза ОГМ, таких как 2'-FL (WO 2010/115935 А), требуется несколько вредных химических веществ, которые могут загрязнять конечный продукт.

Недостатки химического синтеза привели к разработке нескольких ферментативных способов и способов на основе ферментации (Miyazaki et al. 2010, Methods Enzymol. 480:511; Murata et al. 1999, Glycoconj. J. 16:189; Baumgartner et al. 2013, Microb. Cell Fact. M AO; Lee et al. 2012, Microb. Cell Fact. 1:48; Albermann et al. 2001, Carbohydr. Res. 334:97; US 7,521,212 B1; Fierfort & Samain 2008, J. Biotechnol. 134:216). Однако, данные способы приводят к получению сложных смесей олигосахаридов, и желательный продукт, таким образом, загрязняется исходным сырьем, таким как лактоза, а также промежуточными веществами, нежелательными побочными продуктами (например, побочными продуктами, происходящими в результате побочных активностей определенных гликозилтрансфераз) и субстратами из процесса ферментации, такими как белки, полипептиды, органические кислоты и соли.

Многие современные способы очистки отдельных олигосахаридов от смесей являются технически сложными, трудными для расширения масштабов и нерентабельными для применений в пищевой промышленности. Способы промышленного масштаба разработаны для очистки дисахаридов - лактозы и сахарозы от молочной сыворотки и кормовой патоки, соответственно, но данные способы включают множественные стадии кристаллизации, которые детально разработаны и достигают только низких выходов. Однако, молочная сыворотка и кормовые патоки являются прежде всего «пищевыми» продуктами и отнюдь не такими сложными и требовательными (сточки зрения нормативных требований), как ферментационные бульоны, содержащие рекомбинантные бактерии или дрожжи. Гель-хроматография представляет собой наилучший способ очистки сложных олигосахаридов, таких как ОГМ, полученные в результате микробной ферментации, но недостатки данного способа включают его недостаточную масштабируемость и его несовместимость с непрерывной обработкой. Гель-хроматография, таким образом, является нерентабельной и не может использоваться для получения ОГМ в промышленном масштабе.

Теоретически, гель-хроматография является наилучшим способом очистки сложных олигосахаридов, таких как ОГМ, продуцируемых в результате микробной ферментации, но недостатки гель-хроматографии включают ее недостаточную масштабируемость и ее несовместимость с непрерывной обработкой. Гель-хроматография, таким образом, является нерентабельной и не может быть использована для получения ОГМ в промышленном масштабе.

После разработки эффективных способов и процессов получения ОГМ посредством микробной ферментации следующей логической стадией являлась разработка эффективных последующих способов выделения ОГМ из культурального бульона.

В WO 2015/049331 А раскрыт способ очистки нейтральных ОГМ. В способе используют ионный обмен, электродиализ и хроматографию с псевдодвижущимся слоем (SMB - от англ. simulated moving bed) для достижения непрерывной и эффективной очистки больших количеств ОГМ. В отличие от путей химического синтеза для получения нейтральных ОГМ и их последующей очистки, описанный способ ферментации и очистки делает возможным предоставление ОГМ, не содержащих вредных химических веществ, таких как тяжелые металлы - микроэлементы и органические растворители. Способ очистки дает высоко очищенный продукт на основе ОГМ в твердой форме (посредством сушки распылением) или в виде концентрированного сиропа, который может быть использован в применениях в пищевой промышленности.

В WO 2015/106943 А описан простой способ очистки нейтральных ОГМ, полученных посредством микробной ферментации. В способе используется комбинация катионного обмена, анионного обмена и нанофильтрации и/или электродиализа, которая делает возможной эффективную очистку больших количеств нейтральных ОГМ. В отличие от более ранних способов очистки для нейтральных ОГМ, полученных посредством микробной ферментации, способ не включает стадий хроматографического разделения. Способ приводит к получению ОГМ в твердой форме в виде вещества, высушенного распылением, в виде кристаллического вещества или в виде концентрата, стерилизованного на фильтре. Полученные ОГМ не содержат белков и веществ, происходящих из рекомбинантных микробных штаммов, используемых для продукции, и, таким образом, являются идеальными для применений в получении пищевых продуктов, продуктов лечебного питания и корма (например, корма для домашних животных).

В WO 2016/095924 А описан способ очистки 2'-FL посредством кристаллизации. ОГМ получали посредством микробной ферментации, и после удаления биомассы ее концентрировали посредством нанофильтрации и электродиализа. Наконец, 2'-FL селективно кристаллизовали из водного раствора, также содержащего 2', 3-ди-О-фукозиллактозу (DFL - от англ. 2', 3-ди-О-fucosyllactose), с использованием уксусной кислоты.

LNT и LNnT могут быть отделены от углеводных побочных продуктов посредством селективного связывания с активным углем с последующим элюированием органическими растворителями и разделением посредством гель-хроматографии (Priem et al. 2002, Glycobiology 12:235; Gebus et al. 2012, Carbohydr. Res. 361:83; Baumgartner et al. 2014, ChemBioChem 15:1896). Как указано выше, гель-хроматография является удобным лабораторным способом, но она не может быть эффективно расширена в масштабе для промышленного производства.

BWO 2015/049331 А раскрыта следующая последовательность операций для очистки LNT, получаемой в результате бактериальной ферментации, с предоставлением прозрачного раствора, не содержащего частиц: электродиализ, нанофильтрация, хроматография с псевдодвижущимся слоем (SMB) с использованием сильной катионообменной смолы, электродиализ, ультрафильтрация и вторая стадия хроматографии с SMB.

Разные способы также описаны для выделения кислотных ОГМ, особенно сиалированных лактоз или сиалированных олигосахаридов.

В US 2007/0020736 А раскрыто получение 3'-SL с дисиалированными и трисиалированными лактозами в качестве побочных продуктов генетически модифицированного штамма бактерии Escherichia coli. 3'-SL накапливался в культуральном бульоне до концентрации ~0,8 мМ. 3'-SL очищали, используя следующие стадии: центрифугирование, адсорбция посредством пропускания супернатанта через уголь и вымывания водорастворимых солей дистиллированной водой, градиентное элюирование в водном этаноле и в конечном итоге разделение на колонке Biogel и обессоливание. Выход из 1 л бульона составлял 49 мг 3'-SL.

Еще один раскрытый способ включает получение 3'-SL с использованием генетически модифицированного штамма Е. coli и последующее выделение посредством тепловой пермеабилизации клеток с последующим центрифугированием (Priem et al. 2002, Glycobiology 12:235). Вещество в супернатанте адсорбировали на угле, и водорастворимые соли вымывали дистиллированной водой. После градиентного элюирования в водном этаноле 3'-SL адсорбировали на сильном анионообменнике в своей HCO₃^- (бикарбонат-ион) форме и элюировали с помощью линейного градиента бикарбоната натрия (NaHCO₃). Последний удаляли посредством катионного обмена (с использованием смолы в своей кислотной форме), что приводило к получению коэффициента извлечения 3'-SL 49%.

Альтернативный способ, начиная с ферментационного бульона, включал стадии тепловой пермеабилизации, центрифугирования, подведения рН до 3,0 посредством добавления сильной катионообменной смолы в своей кислотной форме и удаления осажденных белков посредством центрифугирования (Fierfort et al. 2008, J, Biotechnol, 134:261). Затем рН супернатанта доводили до 6,0 посредством добавления слабого анионообменника в своей основной форме, и 3'-SL связывали с анионообменником в форме HCO₃^-. После промывания дистиллированной водой с последующим элюированием в непрерывном градиенте NaHCO₃, NaHCO₃ удаляли посредством катионного обмена (с использованием смолы в своей кислотной форме) до тех пор, пока рН не падал до 3,0. Наконец, рН доводили до 6,0 посредством NaOH. При данной стратегии очистки достигали коэффициента извлечения 3'-SL 59%.

Ферментативно полученную 3'-SL также отделяли от лактозы посредством нанофильтрации (Nordvang et al. 2014, Separ. Purif. Technol. 138:77). Авторы изобретения показали, что две разные нанофильтрационные мембраны, одна с порогом отсечения по молекулярной массе (MWCO - от англ. Molecular-weight cutoff) 600-800 Да (мембрана на основе сульфированного полиэфирсульфона (SPES - от англ. sulfonated polyethersulfone)) и другая с MWCO 1000-1400 Да (мембрана SPES), могли разделять большую часть 3'-SL от лактозы после диафильтрации. Однако, происходила значимая потеря 3'-SL во время данного процесса, и чистота была низкой, что требовало дополнительной стадии очистки на основе ионного обмена.

В WO 2010/106320 А2 описан способ обогащения 3'-SL из молочной сыворотки. Сначала, белки удаляют посредством ультрафильтрации, и затем осветленный фильтрат молочной сыворотки инкубируют с ионообменной смолой с захватом 3'-SL. После элюирования с ионообменного вещества, обогащенную фракцию 3'-SL концентрируют посредством нанофильтрации для деминерализации концентрата. После деминерализации 3'-SL концентрируют и сушат, что приводит к получению конечного сухого продукта с содержанием 3'-SL 20 масс. %.

В WO 2018/020473 А описан дополнительный способ обогащения 3'-SL и 6'-SL из жидкого источника. Оба ОГМ выделяли из маточного раствора кристаллизации лактозы посредством стадий нагревания раствора, ферментативной обработки и дополнительной ультрафильтрации и нанофильтрации. После обогащения содержание 3'-SL и 6'-SL составляло 10-30 масс. % сухой массы.

Исходя из данного предшествующего уровня техники, цель заключалась в предложении способа очистки целевых олигосахаридов, в частности, нейтральных ОГМ или сиалированных ОГМ, которые получены посредством микробной ферментации, где указанный способ легко расширить в масштабе и он подходит для изготовления указанных целевых олигосахаридов в промышленном и производственном масштабе, и который может приводить к получению продукта, имеющего чистоту, которая делает продукт подходящим для потребления человеком.

Нужно подчеркнуть, что бульон микробной ферментации, в частности, который содержит рекомбинантные микроорганизмы (бактерии или эукариотические микроорганизмы, такие как хлебопекарные дрожжи) является гораздо более сложным, чем потоки молочных продуктов. Состав молочной сыворотки, например, является следующим: примерно 94% воды, 4-5% лактозы, 0,5-1% белков и лишь немного определенных минералов, подобно кальцию, калию и фосфору, наряду с некоторыми витаминами, простой матрикс, который только что сконцентрирован и деминерализован в потоках молочных продуктов. Напротив, матрикс раствора Сахаров, полученного из процесса ферментации на основе рекомбинантных микробов, является очень сложным, во-первых, прежде всего исходя из требования законодательно отделять рекомбинантную биомассу и инактивировать ее в соответствии с государственным регулированием. Полученный осветленный бульон представляет собой неопределенный матрикс разных солей и ионов, также содержащий тяжелые металлы и микроэлементы. Проблема такой жидкости, кроме того, заключается в удалении обломков клеток, фрагментов мембраны, таких как липиды, белки, молекул, происходящих из метаболизма микробных клеток, и главным образом ДНК. Выделение олигосахарида, полученного с помощью рекомбинантного технологического вспомогательного средства, такого как генетически модифицированные бактерии, таким образом, является даже большей проблемой, по сравнению с потоками молочной сыворотки и молочного продукта, поскольку многообразие загрязняющих веществ внутри бульона очень высоко в отношении молекулярной массы, заряженных молекул (однозарядных и многозарядных) и окрашивающих молекул.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложен способ очистки целевого олигосахарида, полученного посредством ферментации периодическим или непрерывным образом из культурального бульона или ферментационного бульона, полученного посредством микробной ферментации, используя рекомбинантные штаммы для ферментации. В ранее описанных стратегиях очистки часто использовали дорогие стадии ионного обмена (требующие как катионо-, так и анионообменники). Ионообменники не могу работать непрерывно, поскольку они требуют регенерации. Культуральный бульон содержит целевой олигосахарид, биомассу, компоненты среды, соли и загрязняющие вещества, такие как другие кислоты и пигменты.

Во время процесса очистки культуральный бульон может быть подвергнут следующим стадиям очистки для получения целевого олигосахарида:

1) Отделение микробных клеток от культурального бульона посредством микрофильтрации;

2) Отделение белков от осветленного культурального бульона (представляет собой технологический поток) посредством ультрафильтрации;

3) Первая стадия нанофильтрации для удаления пептидов и высокомолекулярных (HMW - от англ. high-molecular-weight) примесей;

4) Вторая стадия нанофильтрации для удаления воды и солей;

5) Обработка активированным углем для удаления пигментов и других примесей;

6) Электродиализ или диафильтрация с использованием нанофильтрационной мембраны для полного удаления загрязняющих солей;

7) Удаление воды посредством обратного осмоса.

Дополнительно, еще одна стадия электродиализа могла бы быть введена перед обработкой активированным углем для уменьшения количества загрязняющих ионов. Для получения целевых олигосахаридов в твердой форме после очистки в водном растворе вещество может быть или высушено распылением или гранулировано.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показана схема процесса иллюстративного воплощения способа по изобретению.

На Фиг. 2 показана схема процесса еще одного иллюстративного воплощения способа по изобретению.

На Фиг. 3 показана схема процесса еще одного иллюстративного воплощения способа по изобретению.

На Фиг. 4 показана схема процесса еще одного иллюстративного воплощения способа по изобретению.

На Фиг. 5 показана схема процесса еще одного иллюстративного воплощения способа по изобретению.

На Фиг. 6 показана ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография)-хроматограмма осветленного ферментационного бульона, содержащего 3-фукозиллактозу.

На Фиг. 7 показана ВЭЖХ-хроматограмма 3-фукозиллактозы после очистки от ферментационного бульона посредством иллюстративного воплощения способа по изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Согласно изобретению термин «чистота» относится к химической чистоте и определяет степень, до которой вещество, такое как 2'-FL, 3-FL, DFL, LNT, 3'-SL, 6'-SL или другой целевой олигосахарид (Таблица 1), не разводится или не смешивается с посторонним веществом. Следовательно, химическая чистота является показателем взаимосвязи между односоставным веществом и любыми побочными продуктами/примесями. Химическая чистота выражается в процентах (%) и рассчитывается с использованием следующей формулы:

В композиции, содержащей целевой олигосахарид, чистота данного соединения может быть определена любым подходящим способом, известным специалисту в данной области, таким как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Соответствующий детектор может быть выбран из группы, состоящей из электрохимического детектора, рефрактометрического (RI - от англ. refractive-index) детектора, масс-спектрометра (МС), детектора с диодной матрицей (DAD - от англ. diode-array detector) и детектора ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В ВЭЖХ, например, чистота может быть определена посредством расчета отношения площади под целевым пиком (представляющей количество целевого олигосахарида) к сумме площадей под всеми пиками (представляющей и количество целевого олигосахарида и соединений, отличных от данного вещества, на одной и той же хроматограмме). Однако, из указанного следует, что все примеси можно анализировать посредством выбранного способа ВЭЖХ. Иначе, необходим подход на основе массового баланса, а именно, определение абсолютного количества желательного продукта. В указанном подходе чистые вещества используют в качестве референса для количественного определения чистоты, которую затем оценивают относительно сухого вещества, полученного из продукта (желательный продукт плюс все примеси). Указанный подход на основе массового баланса также может быть использован для определения чистоты согласно изобретению.

Согласно изобретению «культуральный бульон» или «ферментационный бульон» относится к любой жидкости после ферментации, содержащей 2'-FL, 3-FL, DFL, LNT, 3'-SL, 6'-SL или любой другой целевой олигосахарид (Таблица 1) для очистки. Термины «культуральный бульон», «ферментационный бульон» и «культуральная среда» используются в качестве симптомов в данном документе. Культуральный бульон содержит целевой олигосахарид, который должен быть очищен, а также биомассу (например, биологические клетки и обломки клеток), компоненты среды, соли и дополнительные загрязняющие вещества, такие как другие кислоты и пигменты. Биологические клетки, содержащиеся в культуральном бульоне, представляют собой биологические клетки, которые продуцируют целевой олигосахарид внутриклеточно и секретируют данное соединение в жидкую культуральную среду. Биологические клетки могут содержать или состоять из генетически модифицированных биологических клеток, например, генетически модифицированных клеток Е. coli. Генетическая модификация может включать или состоять из модификации с получением целевого олигосахарида, особенно во время фазы роста указанных биологических клеток.

Термин «биомасса», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к совокупности биологических клеток, находящихся в ферментационном бульоне в конце стадии ферментации. Биомасса включает микробные клетки, которые продуцировали целевой олигосахарид, клетки, происходящие из данного микроорганизма, которые могли утратить свою способность продуцировать целевой олигосахарид на протяжении стадии ферментации, а также любые другие клетки, которые случайно находятся в ферментационном бульоне в конце стадии ферментации. Следовательно, по существу все биологические клетки, которые находятся в ферментационном бульоне в конце стадии ферментации, отделяют от ферментационного бульона таким образом, что осветленный ферментационный бульон, известный как «технологический поток» (любой раствор, включающий или содержащий целевые олигосахариды, которые подлежат очистке) по существу или совсем не содержит клеток.

Биомасса предпочтительно содержит биологические клетки, которые продуцируют целевой олигосахарид, предпочтительно, бактериальные клетки, которые продуцируют целевой олигосахарид, и более предпочтительно рекомбинантные бактериальные клетки, которые продуцируют целевой олигосахарид, наиболее предпочтительно рекомбинантные клетки Е. coli, которые продуцируют целевой олигосахарид.

Биомасса и/или микробные клетки могут быть удалены из ферментационного бульона посредством центрифугирования и/или фильтрации.

В способах центрифугирования, подходящих для удаления биомассы из культурального бульона, биомассу получают в виде осадка и супернатант в виде осветленного технологического потока, который подвергают дополнительным обработкам. В подходящих способах фильтрации для удаления биомассы из культурального бульона, фильтрат становится осветленным технологическим потоком. Предпочтительный способ фильтрации для удаления биомассы представляет собой микрофильтрацию и/или ультрафильтрацию, последняя дает возможность удалять даже более маленькие частицы, чем микрофильтрация, и также большие молекулы. Микрофильтрация и ультрафильтрация могут быть проведены способом «тупиковой фильтрации» (технологический поток течет перпендикулярно фильтру) или способом фильтрации в перекрестном потоке (технологический поток течет параллельно фильтру).

Микрофильтрация представляет собой способ физического разделения, в котором жидкость, содержащую частицы, пропускают через среду, причем указанная среда содержит или пористое вещество, содержащее каналы для удержания частиц (глубинная фильтрация), и/или мембрану с конкретным размером пор, делающим возможным прохождение частиц/молекул, которые меньше, чем указанный размер пор (мембранная фильтрация). Термин «микрофильтрация», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к способу физического разделения, где биологические клетки (и клеточные обломки) удаляют из ферментационного бульона, оставляя (осветленный) технологический поток.

Подходящие мембраны для удаления биомассы посредством микрофильтрации могут иметь размер пор по меньшей мере 0,2 мкм и могли бы представлять собой половолоконные и спиральнонавитые мембраны. В качестве альтернативы, удаление биомассы могло быть достигнуто посредством микрофильтрации с использованием мембран с MWCO 100-1000 кДа, предпочтительно 150-500 кДа, для удаления биомассы, дополнительных клеточных обломков и больших белков. Например, мембраны, такие как TRISEP® DS MVP20 (размер пор 0,2 мкм) (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, Германия), которая смотана в спираль для обеспечения компактной конструкции и лучшей эффективности, можно использовать для отделения клеток от культурального бульона. Также спиральнонавитые мембраны с размером пор 0,05-0,1 мкм, подобно TRISEP® DS МР005, которая представляет собой модуль, содержащий мембрану PES (от англ. polyethersulphone - полиэфирсульфон), и номинальным размером пор 0,05 мкм, можно использовать для разделения биомассы и белков.

Кроме того, половолоконные модули, подобно FS10-FC FUS1582 (Microdyn-Nadir GmbH), половолоконный фильтрующий модуль с использованием мембраны PES (5 м²) с MWCO 150 кДа, можно использовать в качестве альтернативы.

В итоге, в настоящем изобретении можно применять следующие возможности для удаления биомассы из ферментационного бульона:

i) Сбор посредством центрифугирования. Нерастворимые компоненты удаляют из культурального бульона за одну стадию. Преимущество: быстрое удаление нерастворимых компонентов.

ii) Сбор посредством микрофильтрации. Нерастворимые компоненты и большие молекулы больше определенного размера удаляют из культурального бульона за одну стадию. Спиральнонавитые мембраны или половолоконные фильтры с перекрестным потоком можно использовать для микрофильтрации с MWCO 500 кДа или больше, Преимущество: быстрое удаление нерастворимых компонентов и больших растворимых молекул больше определенного размера.

iii) Сбор посредством центрифугирования в сочетании с микрофильтрацией: Нерастворимые компоненты и большие молекулы больше определенного размера удаляю из культурального бульона за две стадии. Спиральнонавитые мембраны или половолоконные фильтры с перекрестным потоком можно использовать для микрофильтрации с MWCO 500 кДа или больше, Преимущество: быстрое удаление нерастворимых компонентов и больших молекул больше определенного размера без забивания микрофильтрационных мембран.

Ультрафильтрация представляет собой форму мембранной фильтрации, которая фундаментально не отличается от микрофильтрации. При ультрафильтрации силы, генерируемые давлением и градиентами концентраций, приводят к удалению частиц и больших растворимых молекул посредством пропускания жидкости, содержащей такие частицы и большие растворимые молекулы, через полупроницаемую мембрану. Это обеспечивает удерживание частиц и больших растворимых молекул в так называемом ретентате, в то время как вода и низкомолекулярные (LMW - от англ. low-molecular-weight) растворенные вещества, такие как полученные нейтральные и кислотные олигосахариды, проходят через мембрану в пермеат (фильтрат). Мембраны для ультрафильтрации определяют по их MWCO, которая описывает максимальную молекулярную массу растворимой молекулы, которая может проходить через мембрану в пермеат. Любые частицы, а также молекулы больше, чем MWCO, неспособны проходить через мембрану и сохраняются в ретентате. Ультрафильтрацию можно применять в режиме перекрестного потока, где поток жидкости параллелен поверхности мембраны, или в режиме «тупиковой фильтрации», где поток жидкости перпендикулярен поверхности мембраны.

Осветленный технологический поток, содержащий продуцируемый целевой олигосахарид, обычно содержит существенное количество нежелательных примесей, включая (но не ограничиваясь) одновалентные ионы, двухвалентные ионы, аминокислоты, полипептиды, белки органические кислоты, нуклеиновые кислоты, моносахариды и/или олигосахариды.

Подходящие мембраны для удаления большинства белков посредством ультрафильтрации имеют MWCO по меньшей мере 50 кДа, предпочтительно по меньшей мере 30 кДа, более предпочтительно 10 кДа и могли бы представлять собой половолоконные или спиральнонавитые мембраны. Например, мембраны, такие как SPIRA-CEL® DS UP010 (MWCO составляет 10 кДа) или SPIRA-CEL DS UP005 (MWCO составляет 5 кДа), обе из которых поставляются на рынок Microdyn-Nadir GmbH, смотаны в спираль для обеспечения компактной конструкции и лучшей эффективности, и данные мембраны можно использовать для отделения остающегося белка от культурального бульона, не содержащего клеток.

Кроме того, половолоконные модули, такие как ROMICON® HF UF Cartridge РМ10 (Koch Membranes Systems, Wilmington, США), которые представляют собой мембраны PES с площадью вплоть до 12 м² и MWCO 10 кДа, могут быть использованы в качестве альтернативы.

Нанофильтрация представляет собой способ мембранной фильтрации, в котором мембрана содержит поры в нанометровом диапазоне (1-10 нм). Размер пор нанофильтрационных мембран меньше чем размер пор микрофильтрационных и ультрафильтрационных мембран, но больше чем размер пор мембран, используемых для обратного осмоса. Нанофильтрационные мембраны главным образом сделаны из тонких пленок полимеров, таких как полиэтилентерефталат, или металлов, таких как алюминий, с плотностями пор 1-10⁶ пор на см².

Нанофильтрацию используют в способе очистки для целевого олигосахарида для удаления LMW примесей, таких как пептиды и соли, и для увеличения концентрации олигосахаридов в осветленном технологическом потоке или элюате.

Молекулярная масса большинства ОГМ находится в диапазоне от 400 до 1200 Да. Для удаления HMW примесей (больше 1200 Да), таких как пептиды и пигменты, а также LMW примесей (меньше 400 Да), таких как соли из технологического потока, по меньшей мере требуется две стадии нанофильтрации.

После ультра фильтрации все молекулы больше 5 кДа или больше 10 кДа (в зависимости от используемой мембраны) должны быть удалены из технологического потока. Для удаления примесей, таких как пептиды и пигменты, которые ниже данного порога, но все еще больше, чем целевой олигосахарид, первая стадия нанофильтрации могла бы быть проведена с использованием MWCO, которая позволяет олигосахариду проходить в пермеат, в то время как HMW примеси остаются в ретентате.

Для отделения большей части требуемого олигосахарида от HMW примесей и для увеличения выхода желательного олигосахарида, способ должен длиться до тех пор, пока больше 70%, предпочтительно больше 80%, более предпочтительно больше 90% продукта проходит через мембрану. Дополнительно, стадия диафильтрации могла бы быть включена для увеличения выхода олигосахарида в осветленном технологическом потоке.

После данной первой стадии нанофильтрации единственные примеси в технологическом потоке, содержащем целевой олигосахарид, должны иметь такую же молекулярную массу или меньше, чем данный олигосахарид, и могли бы включать одновалентные ионы, двухвалентные ионы, аминокислоты, органические кислоты, моносахариды и/или олигосахариды.

Мембраны, подходящие для первой стадии нанофильтрации, включают материалы тонкопленочных композитных мембран - полиамид или полипиперазин, достигающие разделения по размеру в диапазоне 400-1200 Да. Примеры включают мембраны HYDRACoRe70 (MWCO составляет 720 Да) или HYDRACoReSO (MWCO составляет 1000 Да), обе из мембран Hydranautics (Oceanside, США), NADIR® NP010P (MWCO составляет 1000-1500 Да) или NADIR® NP030P (MWCO составляет 500-1000 Да) (Microdyn-Nadir GmbH). Такие мембраны делают возможным поток большой интенсивности. Дополнительные примеры подходящих мембран для нанофильтрации включают Trisep® SBNF (MWCO составляет 2000 Да), нанофильтрационную мембрану на основе ацетата целлюлозы (Microdyn-Nadir GmbH) и мембраны GE-Series (MWCO составляет 1000 Да) из Suez Water Technologies & Solutions (Ratingen, Германия).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении первая стадия нанофильтрации достигает следующих параметров:

i) выделение после фильтрации целевого олигосахарида должно составлять больше 70%, предпочтительно больше 80%, более предпочтительно больше 90%.

ii) концентрация целевого олигосахарида в технологическом потоке должна быть меньше 50% (масс/об.), предпочтительно меньше 40% (масс./об.), более предпочтительно меньше 30% (масс./об.), предпочтительно меньше 20% (масс./об.), более предпочтительно меньше 10% (масс/об.).

iii) стадия должна проводиться при температуре меньше 80°С, предпочтительно меньше 50°С, более предпочтительно 4-40°С (в частности, релевантно для нанофильтрации).

iv) стадия должна проводиться при давлении 500-5000 кПа, предпочтительно при давлении 1000-4000 кПа, более предпочтительно при давлении 1500-3000 кПа.

В предпочтительном воплощении способа технологический поток, содержащий целевой олигосахарид, концентрируют и обессоливают после первой стадии нанофильтрации посредством применения второй стадии нанофильтрации. Целевой олигосахарид может также быть сконцентрирован посредством выпаривания в вакууме (например, используя испаритель с падающей пленкой или пластинчатый испаритель) или обратного осмоса. Недостаток обеих данных методик заключается в том, что технологический поток концентрируют, но не обессоливают. Таким образом, нанофильтрация является предпочтительным способом, поскольку он может достигать одновременно концентрирования и обессоливания, например, посредством использования мембраны с пределом разделения по размеру меньше 2 нм.

Способ очистки целевого олигосахарида включает стадию, на которой осветленный технологический поток из первой стадии нанофильтрации подвергают по меньшей мере одной дополнительной стадии нанофильтрации для удаления солей, меньших молекул и воды. Предпочтительно, элюат из первой нанофильтрации (представляет собой фильтрат или пермеат) подвергают непосредственно второй стадии нанофильтрации для удаления солей и меньших молекул из осветленного технологического потока.

Мембраны, подходящие для первой стадии нанофильтрации, включают материалы тонкопленочных композитных мембран - полиамид или полипиперазин, достигающие разделения по размеру в диапазоне 150-300 Да, такие как мембраны Filmtec™ NF270 (Dow Chemical Company, Midland, США) и Trisep® XN45 или TS40 (Microdyn Nadir GmbH). Такие мембраны делают возможным поток большой интенсивности. Дополнительные примеры включают мембраны Trisep® 4040-XN45-TSF (Microdyn-Nadir GmbH) или GE4040F30 и GH4040F50 (Suez Water Technologies & Solutions).

Нанофильтрация эффективно удаляет значимые количества солей и LMW примесей из технологического потока, содержащего целевой олигосахарид, перед электродиализом. Нанофильтрация также эффективно удаляет LMW загрязняющие вещества после стадии ультрафильтрации, где удаление таких загрязняющих веществ полезно для концентрирования и деминерализации раствора целевого олигосахарида. Применение нанофильтрации для концентрирования целевого олигосахарида приводит к более низкой энергии и затратам на обработку и лучшему качеству продукта за счет более ограниченного теплового воздействия.

В способе концентрируется целевой олигосахарид из водного раствора, где концентрация целевого олигосахарида в водном растворе составляет 20% или меньше, 10% или меньше или 5% или меньше для концентрирования.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении концентрация посредством нанофильтрации должна достигать следующих параметров:

i) концентрация олигосахарида больше 100 г/л, предпочтительно больше 200 г/л, более предпочтительно больше 300 г/л, наиболее предпочтительно больше 400 г/л;

ii) количество соли в очищенном растворе должно быть меньше 10 масс. %, предпочтительно меньше 5%, более предпочтительно меньше 2%; и/или проводимость должна быть 0,5-10,0 мСм/см², предпочтительно 1-8 мСм /см², более предпочтительно 1,5-4,0 мСм/см².

iii) стадию нужно проводить при температуре меньше 80°С, предпочтительно меньше 50°С, более предпочтительно 4-40°С (в частности релевантно для нанофильтрации).

iv) стадию нужно проводить при давлении 500-5000 кПа, предпочтительно при давлении 1000-4000 кПа, более предпочтительно при давлении 1500-3000 кПа.

Пигменты в осветленном растворе и/или очищенном растворе можно удалять посредством обработки активированным углем. Преимущество удаления пигментов с использованием активированного угля заключается в том, что как электрически заряженные, так и электрически незаряженные (нейтральные) пигменты могут быть удалены.

Активированный уголь, также называемый активированным древесным углем, представляет собой форму углерода, которая обработана с образованием маленьких, низкообъемных пор, которые увеличивают площадь поверхности, доступную для адсорбции. Обычно, только 1 г активированного угля имеет площадь поверхности больше, чем 30,00 м², как определено посредством адсорбции газа, из-за его высокой степени микропорозности.

Придающие окраску примеси, такие как продукты Майяра, рибофлавин и другие LMW примеси, имеют тенденцию адсорбироваться на поверхности частиц активированного угля. В отличие от полученных олигосахаридов, количество веществ, придающих окраску, гораздо меньше и/или демонстрирует в большинстве случаев гидрофобное поведение. Являясь следствием данного факта, окрашенные пигментами загрязняющие вещества имеют высокую степень удаления из технологического потока. Водорастворимые вещества, такие как олигосахариды, связываются слабее и могут быть элюированы посредством промывки водой, оставляя пигменты, адсорбированные на поверхности.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении способ очистки целевого олигосахарида дополнительно включает по меньшей мере одну стадию, на которой осветленный технологический поток или элюат из предшествующей стадии очистки обрабатывают активированным углем для удаления пигментов.

В предпочтительном воплощении обработку активированным углем следует проводить следующим образом:

i) после удаления воды и соли на второй стадии нанофильтрации; и/или

ii) после удаления белков посредством ультрафильтрации или после удаления оставшихся солей посредством электродиализа (в качестве альтернативы, можно вводить стадию диафильтрации).

Подходящий активированный уголь для удаления нейтральных олигосахаридов, пигментов и других загрязняющих веществ представляет собой (но не ограничивается) гранулированный активированный уголь, такой как Norit GAC830EN (Cabot Corporation, Бостон, США) и Epibon Y 12 х 40 spezial (Donau Carbon, Франкфурт, Германия), или активированный уголь в порошке, такой как Norit DX1, Norit SA2 (Cabot Corporation) и Carbopal MB 4 (Donau Carbon).

Электродиализ объединяет диализ и электролиз и может быть использован для разделения и концентрирования ионов в растворах на основе их селективной электромиграции через полупроницаемую мембрану. Применения промышленного электродиализа относятся к началу 1960-х г.г., когда данный способ использовали для деминерализации подсырной сыворотки для включения в детскую питательную смесь. Дополнительные применения включают подведение рН напитков, таких как вина, виноградное сусло, яблочный сок и апельсиновый сок.

Обессоливание солоноватой воды для получения питьевой воды и деминерализация молочной сыворотки для получения детского питания являются наиболее широко распространенными применениями электродиализа на сегодняшний день. Основной принцип электродиализа включает электролитическую ячейку, содержащую пару электродов, погруженных в электролит для проведения ионов, соединенных с генератором постоянного тока. Электрод, соединенный с положительным полюсом генератора прямого тока, представляет собой анод, и электрод, соединенный с отрицательным полюсом, представляет собой катод. Раствор электролита затем поддерживает протекание электрического тока, который получен в результате движения отрицательных и положительных ионов в направлении анода и катода, соответственно. Мембраны, используемые для электродиализа, представляют собой по существу листы пористых ионообменных смол с отрицательно или положительно заряженными группами, и, таким образом, описаны как катионные или анионные мембраны, соответственно. Ионообменные мембраны обычно состоят из матрицы из полистирола, несущей подходящую функциональную группу (как например, сульфоновая кислота в случае катионных мембран или группа четвертичного аммония в случае анионных мембран), поперечно сшитую с дивинилбензолом.

Электролит может представлять собой водный раствор, содержащий, например, хлорид натрия, ацетат натрия, пропионат натрия и/или сульфаминовую кислоту. Электролит окружает катод и анод и позволяет току протекать в ячейке. Электродиализный пакет затем собирают таким образом, что анионные и катионные мембраны параллельны, как в фильтр-прессе между двумя блоками электродов, таким образом, что поток, подлежащий обеднению ионами, хорошо отделяется от потока, подлежащего обогащению ионами. Данные два раствора также называются разбавленным раствором (подлежащим обеднению ионами) и концентратом (подлежащим обогащению ионами).

Центральной частью процесса электродиализа является пакет мембран, который состоит из нескольких анионообменных и катионообменных мембран, разделенных спейсерами, установленных между двумя электродами. Посредством применения прямого тока, анионы и катионы будут мигрировать через мембраны в направлении электродов, образуя поток (обессоленного) разбавленного раствора и поток концентрата.

Размер пор ионообменных мембран, используемых для электродиализа, достаточно мал для предотвращения диффузии продукта из потока разбавленного раствора в поток концентрата под воздействием большого различия в концентрации у данных двух потоков.

Электролиз используется для удаления ионов из водных растворов, в то время как нейтральные и кислотные олигосахариды остаются в технологическом потоке. Важное преимущество электродиализа заключается в том, что рекомбинантные молекулы ДНК могут быть полностью удалены из раствора, содержащего целевой олигосахарид. Кроме того, количество соли в технологическом потоке может быть значимо уменьшено посредством электродиализа. Действительно, хлорид натрия может быть полностью удален из потока с продуктом. Это имеет преимущество, заключающееся в том, что может быть предоставлен раствор, содержащий целевой олигосахарид, который лишен солей, подобно хлориду натрия, что предотвращает какое-либо отрицательное влияние данной соли в конечном продукте, например, детском питании.

После нанофильтрации и обработки активированным углем большую часть соли и меньших по размеру органических примесей, подобно органическим кислотам, следует удалить из технологического потока. Для обеспечения эффективного удаления оставшихся солей и небольших, заряженных органических веществ проводят стадию электродиализа.

Электродиализ может проводиться до тех пор, пока технологический поток не достигнет стабильной проводимости 0,05-1,0 мСм/см², предпочтительно 0,1-0,5 мСм/см², более предпочтительно 0,2-0,4 мСм/см². Кроме того, электродиализ можно проводить до тех пор, пока концентрация солей не упадет до концентрации меньше 10,0 г/л, предпочтительно меньше 5,0 г/л, более предпочтительно меньше 1,0 г/л, наиболее предпочтительно меньше 0,2 г/л.

В случае нейтральных олигосахаридов стадию электродиализа следует запускать в условиях кислотного или нейтрального рН, предпочтительно рН 3-8, более предпочтительно рН 4-7. Для кислотных олигосахаридов стадию электродиализа следует запускать в условиях нейтрального рН, предпочтительно рН 6-8, более предпочтительно рН 6,5-7,5 из-за нестабильности кислотных олигосахаридов в кислотных условиях. рН раствора кислотных олигосахаридов нужно контролировать во время электролиза и подводить с помощью NaOH, при необходимости.

Стадию обратного осмоса можно использовать вместо нанофильтрации для концентрирования целевого олигосахарида. Обратный осмос представляет собой способ мембраной фильтрации, при котором концентрируются частицы, больше чем 0,1 нм, в ретентате технологического потока при удалении воды. Обратный осмос, таким образом, концентрирует технологический поток, но не достигает обессоливания.

Способ может концентрировать целевой олигосахарид в водном или органическом растворителе, где концентрация целевого олигосахарида составляет 20% (масс/об.) или меньше, 10% (масс./об.) или меньше или 5% (масс/об.) или меньше до концентрирования.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении стадия концентрирования должна достигать следующих параметров:

i) концентрация олигосахарида больше 300 г/л, предпочтительно больше 400 г/л, более предпочтительно больше 500 г/л, наиболее предпочтительно 600 г/л.

ii) стадию следует проводить при температуре меньше 80°С, предпочтительно меньше 50°С, более предпочтительно меньше 4-40°С (в частности, релевантно для обратного осмоса).

iii) стадию следует проводить при давлении 500-5000 кПа, предпочтительно при давлении 1000-4000 кПа, более предпочтительно при давлении 1500-3000 кПа.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении способа раствор, содержащий нейтральный или кислотный ОГМ, концентрируют при выпаривании в вакууме (например, используя роторный испаритель или пластинчатый испаритель), и он должен достигать следующих параметров:

i) концентрация олигосахарида больше 300 г/л, предпочтительно больше 400 г/л, более предпочтительно больше 500 г/л, наиболее предпочтительно больше 600 г/л.

ii) стадию нужно проводить при температуре меньше 80°С, предпочтительно меньше 50°С, более предпочтительно 20-50°С, даже более предпочтительно 30-45°С, наиболее предпочтительно 35-45°С (в частности, релевантно в случае выпаривания в вакууме).

Для удаления каких-либо возможных загрязняющих веществ и эндотоксинов, образованных микробами, концентрированный целевой олигосахарид стерилизуют посредством фильтрации посредством пропускания через ультрафильтрационную мембрану.

В предпочтительном воплощении изобретения раствор очищенного олигосахарида пропускают через модуль фильтров 10 кДа или меньше, как например, фильтр с MWCO 5 кДа или 3 кДа. Подходящие ультрафильтрационные мембраны для удаления эндотоксинов имеют MWCO по меньшей мере 10 кДа, предпочтительно по меньшей мере 5 кДа, и могли бы представлять собой спиральнонавитые или половолоконные ультрафильтрационные мембраны. Примеры спиральнонавитых мембран включают мембраны SPIRA-CEL® DS UP010 (MWCO составляет 10 кДа) или DS UP005 (MWCO составляет 5 кДа) (Microdyn-Nadir GmbH) и Dairy-Pro® НрНТ UF-5K (MWCO составляет 5 кДа) из Koch Membranes Systems. Примеры половолоконных модулей включают ROMICON® HF UF Cartridge РМ5 (MWCO составляет 5 кДа) из Koch Membranes Systems или серийные мембраны Microzoa™ (MWCO составляет 3 или 6) из Pall Cooperation (Port Washington, США).

В предпочтительном воплощении раствор очищенного олигосахарида подвергают сушке распылением после стерилизации посредством фильтра. Раствор может быть высушен распылением с использованием горячего воздуха для удаления предпочтительно по меньшей мере 85 масс. % или более предпочтительно по меньшей мере 90 масс. % воды. Раствор может быть высушен распылением с использованием любой традиционной системы сушки распылением, предпочтительно с присоединением сушилки с псевдоожиженным слоем.

Очищенный раствор может быть высушен распылением для достижения концентрации целевого олигосахарида 5-60 масс. %, предпочтительно 10-50 масс. %, более предпочтительно 15-45 масс. %. Температура на входе может быть установлена в диапазоне 110-150°С, предпочтительно 120-140°С, более предпочтительно 125-135°С. Температура на выходе может быть установлена в диапазоне 60-80°С, предпочтительно 65-70°С.

После сушки распылением очищенный целевой олигосахарид может иметь следующие свойства:

i) форма твердой гранулы; и/или

ii) температура стеклования 60-90°С, предпочтительно 62-88°С, более предпочтительно 64-86°С, как определено посредством дифференциальной сканирующей калориметрии; и/или

iii) размер частиц 5-500 мкм, предпочтительно 10-300 мкм, определенный посредством лазерной дифракции; и/или

iv) средний размер частиц 10-100 мкм, предпочтительно 20-90 мкм, более предпочтительно 30-80 мкм, наиболее предпочтительно 40-70 мкм, определенный посредством лазерной дифракции; и/или

v) аморфное состояние, предпочтительно аморфное состояние без характеристических пиков кристаллического вещества, наблюдаемых посредством рентгеновской порошковой дифракции; и/или

vi) содержание влаги 10 масс. % или меньше, предпочтительно 8 масс. % или меньше, более предпочтительно 5 масс. % или меньше.

Очищенный целевой олигосахарид можно использовать для применений в питании, предпочтительно лечебном или молочном питании (например, зерновые продукты), и более предпочтительно в детском питании или в медицине, предпочтительно в профилактике или для лечения расстройств желудочно-кишечного тракта.

В одном воплощении целевой олигосахарид представляет собой нейтральный олигосахарид или сиалированный олигосахарид, предпочтительно олигосахарид грудного молока. Целевой олигосахарид может представлять собой нейтральный ОГМ или сиалированный ОГМ. В дополнительном воплощении и/или альтернативном воплощении целевой олигосахарид выбран из группы олигосахаридов грудного молока, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-неофукопентаозы, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы V, лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукогексаозы II, 6'-галактозиллактозы, 3'-галактозиллактозы, лакто-N-гексаозы и лакто-N-неогексаозы 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы, сиалиллакто-N-тетраозы с, 3-фукозил-сиалиллактозы, дисиалил-лакто-N-тетраозы и фукозил-LST b.

Настоящее изобретение будет описано относительно конкретных воплощений и со ссылкой на графические материалы, но данное изобретение не ограничивается ими, а только формулой изобретения. Кроме того, термины первый, второй и тому подобное в описании и в формуле изобретения используются для проведения различия между похожими элементами и не обязательно для описания последовательности, во времени, в пространстве, по рангу или любым другим образом. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми в соответствующих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данном документе, способны работать в последовательностях, отличных от описанных или проиллюстрированных в данном документе.

Следует отметить, что термин «содержащий», используемый в формуле изобретения, не следует считать ограничивающимся средствами, перечисленными в дальнейшем; он не исключает других элементов или стадий. Таким образом, его следует считать определяющим наличие заявленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, на которые ссылаются, но он не исключает наличие или добавление одного или более других признаков, целых чисел, стадий или компонентов или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее средства А и В» не следует ограничивать устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Оно означает, что в отношении настоящего изобретения, единственными релевантными компонентами устройства являются А и В.

Ссылка на всем протяжении данного описания изобретения на «одно воплощение» или «воплощение» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с данным воплощением, включены в по меньшей мере одно воплощение настоящего изобретения. Таким образом, появления фраз «в одном воплощении» или «в воплощении» в разных местах по всему объему данного описания изобретения не обязательно все относятся к одному и тому же воплощению, но могут. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом, как будет очевидно среднему специалисту в данной области из данного раскрытия, в одном или более воплощениях.

Аналогично, следует понимать, что в описании иллюстративных воплощений изобретения разные признаки изобретения иногда сгруппированы вместе в одном единственном воплощении, фигуре или его описании в целях упрощения раскрытия и помощи в понимании одного или более из разных аспектов изобретения. Данный способ раскрытия, однако, не нужно считать отражающим мысль, что заявленное изобретение требует больше признаков, чем явным образом перечислены в каждом пункте. Скорее, как отражено в приведенной ниже формуле изобретения, аспекты изобретения заключаются меньше чем во всех признаках одного вышеизложенного раскрытого воплощения. Таким образом, формула изобретения после подробного описания явным образом включена тем самым в данное подробное описание, причем каждый пункт отдельно стоит в виде отдельного воплощения данного изобретения.

Кроме того, в то время как некоторые воплощения, описанные в данном документе, включают некоторые, но не все признаки, включенные в другие воплощения, подразумевается, что комбинации признаков разных воплощений находятся в объеме изобретения и образуют разные воплощения, как будет понятно специалистам в данной области. Например, в приведенной ниже формуле изобретения любое из заявленных воплощений можно использовать в любой комбинации.

Кроме того, некоторые из воплощений описаны в данном документе как способ или комбинация элементов способа, которые могут быть реализованы посредством процессора компьютерной системы или с помощью других средств выполнения функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для осуществления такого способа или элемента способа образует средство осуществления способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данном документе элемент воплощения аппарата представляет собой пример средства осуществления функции, выполняемой элементом, с целью осуществления изобретения.

В описании и графических материалах, предоставленных в данном документе, изложены многочисленные конкретные подробности. Однако, понятно, что воплощения изобретения можно осуществлять на практике без данных конкретных подробностей. В других примерах хорошо известные способы, структуры и методики не были показаны подробно для того, чтобы не затруднять понимание данного описания.

Теперь изобретение будет описано с помощью подробного описания нескольких воплощений изобретения. Ясно, что другие воплощения изобретения могут быть скомпонованы в соответствии со знаниями специалистов в данной области, не отклоняясь от истинной сущности или технической идеи изобретения, причем изобретение ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1: Очистка 3-фукозиллактозы, полученной в результате бактериальной ферментации

ОГМ - 3-фукозиллактозу получали посредством бактериальной ферментации, и бактерии удаляли из данного ферментационного бульона посредством фильтрации. Для удаления бактериальных клеток ферментационный бульон фильтровали посредством микрофильтрации с использованием мембраны из полиэфирсульфона, имеющей номинальный размер пор 0,05 мкм (NADIR® МР005; Microdyn-Nadir, Wiesbaden), и посредством последующей ультрафильтрации с использованием половолоконного модуля (ULTRADYN FS-10-FS FUS-1582, MWCO 150 кДа; Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Германия).

Бульон, не содержащий клеток, затем обрабатывали посредством диафильтрации со стадией нанофильтрации для удаления солей и меньших по размеру молекул, увеличивая чистоту 3-FL. Система обратного осмоса, типа RO40404 (Aqmos GmbH, Rodgau, Германия), была оснащена модулями нанофильтрации Filmtec™ NF270. Давление на входе было установлено на уровне 800 кПа, и раствор три раза обрабатывали равным объемом обратноосмотической воды для повышения концентрации в результате уменьшения вдвое исходного объема. Затем раствор 3-FL пропускали через половолоконный модуль нанофильтрации FS-10-FS FUS018110 кДа (Microdyn-Nadir) для удаления белков и пептидов.

Ионы, похожие по размеру на 3-FL, удаляли из технологического потока посредством электродиализа с использованием системы PCCell Р15 (PCCell GmbH, Heusweiler, Германия), оснащенной пакетом мембран PCCell ED 1000А, содержащим катионообменную мембрану CEM:PCSK и анионообменную мембрану CEM:PcAcid60 с пределом разделения по размеру 60 Да. Проводимость исходных растворов составляла от 8 до 11 мСм/см² и электродиализ продолжался до тех пор, пока проводимость не падала до 0,5 мСм/см².

Затем раствор 3-FL обрабатывали активированным углем в виде порошка для удаления пигментов. Раствор перемешивали в течение 2 ч посредством активированного угля Norit DX1, и последний затем удаляли посредством фильтрации.

Еще один раунд электродиализа выполняли, используя ту же установку, как описано выше. Проводимость исходного раствора составляла 1,0-1,5 сСм/см², и электродиализ продолжался до тех пор, пока проводимость не падала до 0,3 мСм/см².

После электродиализа раствор 3-FL концентрировали посредством обратного осмоса, используя систему обратного осмоса Emrich EMRO 1.8 (Emrich Edelstahlbau, Polch, Германия), оснащенную модулем обратного осмоса CSM RE8040BE. Раствор концентрировали до тех пор, пока скорость потока системы фильтрации не падала ниже 50 л/ч. Сухое вещество после концентрирования составляло 20-25 масс. %. Для сушки распылением (см. Пример 2), раствор 3-FL дополнительно концентрировали, используя промышленный испаритель Hei-VAP (Heidolph Instruments GmbH, Schwabach, Германия) до 45 масс. % сухого вещества. Высококонцентрированный раствор 3-FL стерилизовали посредством фильтра для удаления эндотоксинов посредством пропускания его через ультрафильтрационную мембрану 5 кДа Spira-Cell WY UP005 2440 С (Microdyn-Nadir).

ВЭЖХ-хроматограммы, иллюстрирующие очистку 3-фукозиллактозы от осветленного ферментационного бульона данным способом, изображены на Фиг. 6 и Фиг. 7. На Фиг. 6 показана ВЭЖХ-хроматограмма осветленного ферментационного бульона, тогда как на Фиг. 7 показана ВЭЖХ-хроматограмма стерильного отфильтрованного технологического потока, полученного из осветленного ферментационного бульона, что приводит к получению ВЭЖХ-хроматограммы, показанной на Фиг. 6. Сравнение данных хроматограмм обнаруживает, что большинство пиков на ВЭЖХ-хроматограмме (каждый пик представляет по меньшей мере одно соединение) осветленного ферментационного бульона отсутствует на ВЭЖХ-хроматограмме стерильного отфильтрованного технологического потока.

Пример 2: Получение 3-фукозиллактозы в твердой форме посредством сушки распылением

Раствор 3-FL, полученный посредством фильтрации и электродиализа, концентрировали до 45 масс. % и стерилизовали посредством фильтра для удаления какой-либо бионагрузки и эндотоксинов, как описано в Примере 1. Высококонцентрированный и стерильный раствор 3-FL затем подвергали сушке распылением, используя распылительную сушилку LTC-GMP (Nubilosa, Konstanz, Германия). Раствор 3-FL, 45 масс. %, пропускали через сопла распылительной сушилки при 130°С и 350 кПа, и поток регулировали для поддержания температуры выхлопа на уровне 66-67°С. Используя данные установки, получали порошок, высушенный распылением, содержащий меньше чем 5% влаги. Влагосодержание определяли посредством титрования по Карлу Фишеру.

Изобретение относится к области органической химии и пищевой промышленности и направлено на очистку целевого олигосахарида от ферментационного бульона посредством использования способов фильтрации. Раскрывается способ очистки целевого олигосахарида от ферментационного бульона, включающий: - предоставление ферментационного бульона, который содержит целевой олигосахарид, биомассу, микробные клетки и углеводы, отличные от целевого олигосахарида; - удаление микробных клеток из ферментационного бульона с получением, таким образом, технологического потока; - подвергание технологического потока первой стадии фильтрации с использованием нанофильтрационной мембраны с получением, таким образом, фильтрата, который содержит целевой олигосахарид; - подвергание фильтрата второй стадии фильтрации с использованием нанофильтрационной мембраны с получением, таким образом, ретентата, который содержит целевой олигосахарид; и - удаление солей из технологического потока с использованием электродиализа с получением, таким образом, очищенного препарата целевого олигосахарида, где целевой олигосахарид представляет собой нейтральный олигосахарид грудного молока (ОГМ) или сиалированный ОГМ, где указанный способ не включает стадию ионного обмена, и где раствор очищенного олигосахарида подвергают сушке распылением после стерилизации посредством фильтра. Изобретение обеспечивает простую, эффективную промышленную очистку целевого олигосахарида, что обеспечивает получение продукта, имеющего чистоту, которая делает продукт подходящим для потребления человеком. 16 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ очистки целевого олигосахарида от ферментационного бульона, включающий:

- предоставление ферментационного бульона, который содержит целевой олигосахарид, биомассу, микробные клетки и углеводы, отличные от целевого олигосахарида;

- удаление микробных клеток из ферментационного бульона с получением, таким образом, технологического потока;

- подвергание технологического потока первой стадии фильтрации с использованием нанофильтрационной мембраны с получением, таким образом, фильтрата, который содержит целевой олигосахарид;

- подвергание фильтрата второй стадии фильтрации с использованием нанофильтрационной мембраны с получением, таким образом, ретентата, который содержит целевой олигосахарид; и

- удаление солей из технологического потока с использованием электродиализа с получением, таким образом, очищенного препарата целевого олигосахарида,

где целевой олигосахарид представляет собой нейтральный олигосахарид грудного молока (ОГМ) или сиалированный ОГМ,

где указанный способ не включает стадию ионного обмена, и

где раствор очищенного олигосахарида подвергают сушке распылением после стерилизации посредством фильтра.

2. Способ по п. 1, в котором микробные клетки удаляют из ферментационного бульона посредством подвергания ферментационного бульона по меньшей мере одной стадии центрифугирования и/или по меньшей мере одной стадии фильтрации.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором по меньшей мере одна стадия фильтрации представляет собой микрофильтрацию, предпочтительно микрофильтрацию с использованием мембраны, которая имеет порог отсечения по молекулярной массе примерно 500 кДа, более предпочтительно порог отсечения по молекулярной массе примерно 150 кДа.

4. Способ по п. 3, в котором технологический поток подвергают по меньшей мере одной стадии ультрафильтрации с использованием мембраны, имеющей порог отсечения по молекулярной массе примерно 50 кДа, предпочтительно порог отсечения по молекулярной массе примерно 30 кДа, более предпочтительно порог отсечения по молекулярной массе 10 кДа.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором нанофильтрационная мембрана, используемая на первой стадии фильтрации, имеет порог отсечения по молекулярной массе от примерно 700 дальтон до примерно 3000 дальтон, предпочтительно порог отсечения по молекулярной массе от примерно 1000 до примерно 2000 дальтон.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором нанофильтрационная мембрана, используемая на второй стадии фильтрации, имеет порог отсечения по молекулярной массе от 100 дальтон до 1000 дальтон, предпочтительно порог отсечения по молекулярной массе от примерно 150 дальтон до примерно 500 дальтон, более предпочтительно порог отсечения по молекулярной массе от примерно 200 до примерно 300 дальтон.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором целевой олигосахарид представляет собой ОГМ, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-неофукопентаозы, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы V, лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукогексаозы II, 6'-галактозиллактозы, 3'-галактозиллактозы, лакто-N-гексаозы и лакто-N-неогексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы, дифукозил-лакто-N-неогексаозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, лакто-N-сиалилпентаозы а, лакто-N-сиалилпентаозы b, лакто-N-сиалилпентаозы c, фукозил-лакто-N-сиалилпентаозы a, фукозил-лакто-N-сиалилпентаозы b, фукозил-лакто-N-сиалилпентаозы c, дисиалил-лакто-N-тетраозы, дисиалил-лакто-N-фукопентаозы, сиалиллакто-N-тетраозы a, сиалиллакто-N-тетраозы, сиалиллакто-N-тетраозы c, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы, 3-фукозил-6'-сиалиллактозы, 3-фукозил-сиалиллактозы, дисиалил-лакто-N-тетраозы, фукозил-LST b и лакто-N-неодифукогексаозы I.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором технологический поток подвергают второй стадии фильтрации таким образом, что:

i) количество соли в ретентате составляет меньше 10 масс.%, предпочтительно меньше 5 масс.%, более предпочтительно 2 масс.% или меньше и/или

ii) проводимость составляет от 0,5 до 10,0 мСм/см², предпочтительно от 1 до 8 мСм/см², более предпочтительно от 1,5 до 4,0 мСм/см².

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором технологический поток подвергают стадии концентрирования, предпочтительно концентрированию посредством обратного осмоса и/или дополнительной стадии нанофильтрации, предпочтительно посредством стадии нанофильтрации с использованием нанофильтрационной мембраны, которая имеет порог отсечения по молекулярной массе в диапазоне от 200 до 300 Да.

10. Способ по п. 9, в котором стадию концентрирования проводят

- посредством нанофильтрации при температуре меньше 80°C, предпочтительно меньше 50°C, более предпочтительно от 4°C до 45°C, более предпочтительно от 10°C до 40°C, еще более предпочтительно от 15°C до 30°C, наиболее предпочтительно от 15°C до 20°C; и/или

- посредством обратного осмоса при температуре от 20°C до 50°C, более предпочтительно от 30°C до 45°C, наиболее предпочтительно от 35°C до 45°C; и/или

- при давлении от более 500 кПа до менее 5000 кПа, предпочтительно при давлении от более 1000 кПа до менее 4000 кПа, более предпочтительно при давлении от более 1500 до менее 3000 кПа.

11. Способ по п. 9 или 10, в котором технологический поток подвергают стадии концентрирования, таким образом, чтобы концентрация целевого олигосахарида составляла 100 г/л или больше, предпочтительно 150 г/л или больше, более предпочтительно 200 г/л или больше.

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором технологический поток подвергают стадии удаления красителей, предпочтительно посредством обработки технологического потока активированным углем.

13. Способ по п. 12, в котором стадию удаления красителей проводят

i) перед или после стадии диафильтрации;

ii) перед или после стадии концентрирования технологического потока; и/или

iii) перед или после стадии электродиализа.

14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором электродиализ представляет собой электродиализ в нейтральных условиях или электродиализ в кислотных условиях.

15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором технологический поток после удаления солей, содержащихся в нем,

i) содержит количество соли, которое составляет менее 1 масс.%, предпочтительно менее 0,5 масс.%, более предпочтительно менее 0,2 масс.%; и/или

ii) имеет проводимость от 0,05 до 1,0 мСм/см², предпочтительно от 0,1 до 0,5 мСм/см², более предпочтительно от 0,2 до 0,4 мСм/см².

16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором технологический поток сушат распылением, предпочтительно сушат распылением

i) при температуре на входе в диапазоне 110-150°C, предпочтительно 120-140°C, более предпочтительно 125-135°C; и температура на выходе может находиться в диапазоне 60-80°C, предпочтительно 65-70°C; и/или

ii) при концентрации целевого олигосахарида в технологическом потоке, составляющей 5-60 масс.%, предпочтительно 10-50 масс.%, более предпочтительно 15-45 масс.%.

17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором чистота целевого олигосахарида в очищенном препарате составляет 80 масс.% или больше, предпочтительно 85 масс.% или больше, более предпочтительно 90 масс.% или больше относительно сухого вещества очищенного препарата.