ОЧИСТКА иРНК ФИЛЬТРАЦИЕЙ В ТАНГЕНЦИАЛЬНОМ ПОТОКЕ Российский патент 2023 года по МПК C12N15/10 B01D61/14 A61K31/7088 A61K48/00 C12P19/34 

Настоящее изобретение относится к способу очистки молекул иРНК, включающему (Iа) очистку осажденных молекул иРНК, из суспензии, включающей осажденные молекулы иРНК, (Iб) промывку и растворение очищенных осажденных молекул иРНК, (IIа) очистку молекул иРНК с использованием раствора, включающего хелатирующий агент, с последующей (IIб) промывкой очищенных молекул иРНК, где стадии (Iа)-(IIб) проводят с использованием фильтрации в тангенциальном потоке.

Генетическая информация хранится в клетке в виде дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и при необходимости может транскрибироваться в рибонуклеиновую кислоту (РНК). Обе молекулы как ДНК, так и РНК, состоят из нуклеотидов, состоящих из азотистого основания, пятиуглеродного сахара и по крайней мере одной фосфатной группы. Существуют различные типы молекул РНК, включая молекулы иРНК, которые несут генетическую информацию для синтеза белка. У эукариот эти молекулы иРНК транскрибируются из ДНК как молекулы незрелой иРНК и впоследствии модифицируются при добавлении, например, 5' кэпа и 3' полиаденозинового (поли (А)) хвоста. Затем молекулы зрелой иРНК переносятся из клеточного ядра в цитоплазму, где они транслируются в белки. Таким образом, последовательность ДНК, а также количество, стабильность и трансляционная эффективность молекул зрелой иРНК в основном определяют синтез белков в клетке.

Для оптимизации синтеза требуемого белка в клетке, например, в терапевтических целях, подходы на основе иРНК представляют собой многообещающий инструмент. Преимущество использования молекул иРНК заключается в том, что молекулы должны быть введены только в цитоплазму клетки для трансляции белка (Tavernier и др., 2011, J Control Release, 150 (3): 238-247, Yamamoto и др., 2009, Eur J Pharm Biopharm, 71 (3): 484-489). Кроме того, использование молекул иРНК представляет собой представляет собой более простой и более эффективный метод по сравнению с применением соответствующей последовательности ДНК на соответствующем носителе, таком как плазмида, и позволяет исключить значительный риск изменения хромосомной ДНК в случае включения плазмиды или ее частей в геном. Молекулы иРНК в основном образуются при транскрипции in vitro, например, в терапевтических целях. Такие подходы основаны на матричных ДНК, которые создаются либо в ходе линеаризации самой плазмидной ДНК, либо в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) из плазмидной ДНК. Оба подхода хорошо известны и их можно масштабировать простыми методами. Однако в обоих случаях молекулы иРНК должны быть очищены, прежде чем их можно будет использовать на следующих этапах их применения.

Очистка синтезированных молекул иРНК имеет решающее значение, поскольку загрязняющие вещества отрицательно влияют на большинство следующих стадий их применения, прежде всего в терапевтических целях. Различные побочные продукты могут загрязнять требуемые молекулы иРНК, такие как компоненты, использованные и/или образующиеся на предшествующих стадиях, таких как синтез иРНК. В случае обоих подходов, in vivo и in vitro, короткие фрагменты молекулы иРНК могут образоваться, например, в результате гидролиза и прерванной транскрипции. Гидролиз молекулы иРНК может происходить в присутствии катализатора или фермента, а также самопроизвольно, что приводит к деградации соответствующей молекулы иРНК и, таким образом, к образованию фрагментов молекулы иРНК переменной длины. В случае прерванной транскрипции (см., например, Revyakin и др., 2006, Science, 314 (5802): 1139-1143), РНК-полимераза связывается с соответствующим промоторным элементом в молекуле ДНК для транскрипции, при этом раскручивается двойная цепь ДНК, окружающая сайт начала транскрипции и начинается синтез молекулы иРНК. Однако в некоторых случаях РНК-полимераза не отделяется от промоторной области ДНК, а остается неподвижной при транскрипции части молекулы ДНК. По мере того как размотанная ДНК накапливается внутри фермента, РНК-полимераза выталкивает часть ДНК, в которой хранится генетическая информация для транскрипции, и высвобождает синтезированную молекулу РНК длиной от одного до 15 нуклеотидов (см., например, Goldman и др., 2009, Science, 324 (5929): 927-928). Чтобы исключить, например, нежелательный иммунный ответ после введения фармацевтической композиции, включающей такие короткие фрагменты иРНК, существует настоятельная необходимость в получении очищенных нефрагментированных молекул иРНК для их дальнейшего применения, особенно в терапевтических целях.

Для очистки молекул иРНК существуют различные подходы, включающие осаждение и фильтрацию, а также их комбинации. Для удаления нежелательных солей, нуклеотидов и белков подходы на основе осаждения РНК представляют собой, например, простой и рентабельный способ получения очищенных молекул РНК в виде пеллеты, которую можно ресуспендировать в требуемом буферном растворе. Для осаждения можно использовать различные растворы, содержащие, например, тиоцианат гуанидина (GSCN), ацетат аммония (NH₄OAc), этанол, хлорид лития и ацетат натрия (см. обзор, например, Walker и Lorsch, 2013, Methods Enzymol, 530: 337-343). С другой стороны методы фильтрации основаны на механической концепции для очистки молекулы-мишени, такой как молекулы иРНК. В случае фильтрации, сырье, например, раствор или суспензию, включающую целевые молекулы, такие как иРНК, пропускают через фильтрационную мембрану или над ней, и последний метод называется фильтрацией в тангенциальном потоке (TFF).

В заявках WO 2014/152966 А1 и WO 2015/164773 А1, например, описаны способы очистки молекул иРНК с использованием TFF и различных объемов раствора и/или суспензии. Молекулы иРНК очищают при осаждении молекул иРНК с использованием, например, мочевины, GSCN и/или хлорида калия, и осадки промывают несколько раз. Однако в обоих случаях не было установлено, что при этом можно очищать целевые молекулы иРНК, принимая во внимание короткие фрагменты иРНК, такие как молекулы незрелой иРНК и/или продукты гидролиза.

В заявке WO 2016/193206 А1 описан способ продуцирования и очистки РНК, где очистка РНК включает по меньшей мере одну стадию TFF и предпочтительно не включает стадию, включающую экстракцию фенолом/хлороформом и/или осаждение ДНК и/или РНК. Более того молекулы РНК предпочтительно очищают с использованием дополнительной стадии очистки с применением, например, катионо- и/или анионообменной хроматографии, и/или обращенно-фазовой хроматографии. Как указано выше, в документе не раскрыта очистка целевых молекул РНК с учетом молекул незрелой иРНК, и/или продуктов гидролиза молекул иРНК.

В заявке WO 2018/157133 А1 описаны способы очистки молекул иРНК в препаративном масштабе. Изобретение относится прежде всего к применению перемешиваемой ячейки или встряхиваемого нутч-фильтра для получения прозрачных и гомогенных композиций иРНК. Как описано в разделе Примеры, молекулы иРНК осаждают с использованием GSCN и осадок промывают с использованием раствора, включающего GSCN и этанол. Следует отметить, что композиции молекул иРНК, полученные заявленным способом, сравнивают с композициями, включающими молекулы иРНК, очищенные с использованием TFF, и было установлено, что только очистка на основе TFF приводит к получению раствора, включающего кроме целевых молекул иРНК остаточные ферменты.

Следовательно, все еще существует необходимость иметь под рукой альтернативные решения, позволяющие эффективно очищать молекулы иРНК в препаративных масштабах, особенно с учетом молекул незрелой иРНК и продуктов гидролиза молекул иРНК, обеспечивая низкие уровни солей, которые могут создавать проблемы при дальнейшем применении, таких как GSCN, и с помощью системы, которую можно автоматизировать простым способом.

Настоящая заявка направлена на необходимость получения очищенных молекул иРНК с высокой производительностью при осуществлении вариантов, изложенных в формуле изобретения.

Прежде всего настоящее изобретение относится к способу очистки молекул иРНК, причем указанный способ включает (Iа) очистку осажденных молекул иРНК из суспензии, включающей осажденные молекулы иРНК, с использованием первого раствора, (Iб) промывку и растворение очищенных осажденных молекул иРНК, полученных на стадии (Iа), с использованием второго раствора, (IIа) очистку молекул иРНК из растворенных молекул иРНК, полученных на стадии (Iб), с использованием третьего раствора, включающего хелатирующий агент, с последующей (IIб) промывкой очищенных молекул иРНК, полученных на стадии (IIа) с использованием четвертого раствора, где стадии (Iа)-(IIб) проводят с использованием фильтрации в тангенциальном потоке.

Неожиданно было установлено, что способ по настоящему изобретению приводит не только к высокой степени очистки молекул иРНК и, таким образом, к получению раствора, содержащего очищенные молекулы иРНК, но и не содержащего или практически не содержащего продуктов гидролиза молекул иРНК и молекул незрелой иРНК. Прежде всего, было установлено, что при применении указанного способа эффективно удаляются продукты гидролиза молекул иРНК, молекулы незрелой иРНК, белки и соли, которые могут создавать проблемы на последующих стадиях применения. Таким образом, при использовании способа по настоящему изобретению можно получить раствор, включающий очищенные молекулы иРНК, пригодный для последующего применения в таких областях, как фармацевтика.

В контексте настоящего изобретения термин «способ очистки» относится к способу получения целевых молекул из смеси, например, раствора или суспензии, включающих указанные целевые молекулы, предназначенные для очистки, и другие компоненты, отличающиеся от целевых молекул, где концентрация целевых молекул повышается или увеличивается в растворе, полученном после осуществления указанного способа по сравнению с концентрацией целевых молекул в смеси до осуществления указанного способа. Очистку целевых молекул можно также отнести к обогащению указанных целевых молекул при удалении или по меньшей мере в значительной степени удалении компонентов, отличающихся от целевых молекул.

В контексте настоящего изобретения целевые молекулами являются молекулы иРНК. В данном контексте термин «иРНК» и термин «молекула иРНК», которые используются взаимозаменяемо, относятся к одноцепочечной молекуле РНК, построенной, например, из нуклеотидов А, С, G и/или U, то есть нуклеотидов, включающих аденин, гуанин, цитозин и урацил, в качестве соответствующего азотистого основания. Более того, молекула иРНК содержит одну или более кодирующих последовательностей, которые можно использовать в качестве матрицы в ходе синтеза аминокислотной последовательности при трансляции. Таким образом, предназначенная для очистки молекула иРНК предпочтительно включает кодирующую последовательность, то есть последовательность, которая может быть транслирована в аминокислотную последовательность, такую как белок, и включает стартовый кодон и стоп-кодон. Кодирующая последовательность может являться природной последовательностью, частично или полностью оптимизированной по кодонам последовательностью, полученной из природной последовательности, которая предназначена для использования, или искусственной последовательностью. Оптимизация кодонов относится к методике, которая применяется для максимального повышения экспрессии белка за счет увеличения эффективности трансляции соответствующей молекулы иРНК, поскольку в некоторых случаях существуют кодоны, которые предпочтительно используются некоторыми видами для данной аминокислоты. Более того указанная молекула иРНК может содержать 5' и/или 3' нетранслируемую область (UTR), один или несколько внутренних участков внутренней посадки рибосомы (IRES), одну или несколько дополнительных последовательностей для стимуляции трансляции и/или одну или несколько дополнительных модификаций для регуляции и/или увеличения продолжительности действия. Другие признаки молекул иРНК более подробно описаны ниже.

Таким образом следует понимать, что термин «иРНК» означает любую молекулу РНК, которая пригодна для экспрессии аминокислотной последовательности или которая транслируется в аминокислотную последовательность, такую как белок. Таким образом предполагается, что молекула иРНК проявляет свойство и/или активность, которыми она характеризуется, и, таким образом, может транслироваться в аминокислотную последовательность, такую как белок с указанной аминокислотной последовательностью, проявляющей активность и/или свойство, которыми он характеризуется.

В данном контексте термин «аминокислотная последовательность» охватывает любой тип аминокислотной последовательности, то есть цепи двух или более аминокислот, которые связаны друг с другом через пептидные связи, и относится к любой исследуемой аминокислотной последовательности. Предпочтительно длина кодируемой аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 5 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 10 аминокислот, даже более предпочтительно по меньшей мере 50, 100, 200 или 500 аминокислот. Таким образом термин «аминокислотная последовательность» охватывает короткие пептиды, олигопептиды, полипептиды, гибридные белки, белки, а также их фрагменты, такие как фрагменты известных белков, предпочтительно функциональные фрагменты. Например, такие фрагменты могут представлять собой биологически активные фрагменты белка или антигенные фрагменты, такие как эпитопы, которые могут быть эффективными в повышении уровня антител. Что касается функции аминокислотной последовательности, то в данном случае нет ограничении, и возможные аминокислотные последовательности подробно описаны ниже.

Напротив, компоненты, подлежащие удалению во время очистки указанных молекул иРНК, и, таким образом, компоненты, отличающиеся от целевых молекул, включают, например, молекулы иРНК, которые частично или полностью подвергаются деградации при гидролизе. Деградация при гидролизе является случайным процессом и образующиеся в результате продукты деградации, в данном контексте называемые «продуктами гидролиза» или также «продуктами гидролиза молекулы иРНК», являются укороченными по меньшей мере на 1 нуклеотид по сравнению с молекулой иРНК, которая подвергалась гидролизу. Таким образом, в зависимости от длины молекулы иРНК, которая подвергалась гидролизу, длина образующихся продуктов гидролиза может составлять, например, менее 10000 нуклеотидов, предпочтительно менее 5000 нуклеотидов, более предпочтительно менее 500 нуклеотидов, даже более предпочтительно менее 250 нуклеотидов, еще более предпочтительно менее 170 нуклеотидов и наиболее предпочтительно менее 120 нуклеотидов. Другой пример компонентов, которые подлежат удалению, представляет собой молекулы незрелой иРНК, длина которых составляет, например, менее 50 нуклеотидов, предпочтительно менее 25 нуклеотидов и более предпочтительно менее 15 нуклеотидов.

Более того, компоненты, предназначенные для удаления в ходе очистки молекул иРНК, включают, например, компоненты, которые использовали в ходе синтеза in vitro целевых молекул, такого как транскрипция in vitro молекул иРНК и/или компонентов, включенных в клетки, использованные для амплификации матриц для синтеза целевых молекул и/или для транскрипции молекул иРНК. В случае транскрипции молекул иРНК in vitro, такие компоненты включают, например, белки, такие как ферменты, использованные для транскрипции in vitro, соли, ионы, такие как ионы магния, нуклеозидтрифосфаты, моно-, ди- и/или трифосфаты, включающие 5' кэп и/или 5' кэп аналоги, незрелые транскрипты, продукты гидролиза, буферное вещество, такое как 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS) и/или хелатирующий агент, такой как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).

Способ по настоящему изобретению осуществляют методом фильтрации в тангенциальном потоке (TFF). Метод TFF характеризуется тем, что суспензия или раствор, включающие предназначенные для очистки молекулы иРНК, протекают в тангенциальном потоке над поверхностью фильтрационной мембраны, при этом молекулы иРНК предпочтительно удерживаются в концентрате. Следовательно, при проведении TFF для очистки молекул иРНК исключается образование фильтрационной «корки», которая может забить фильтрационную мембрану в течение времени, и таким образом можно увеличить срок использования фильтрационной мембраны.

Таким образом, система очистки целевых молекул по настоящему изобретению представляет собой систему TFF. Система TFF обычно включает фильтрационное устройство, такое как капсула, кассета и держатель или модуль из полых волокон, насос, шланг, вентиль или зажим и резервуар для жидкости, а также, необязательно, манометр (см. Фиг. 1). Систему TFF можно использовать в непрерывном режиме даже при высоких концентрациях молекул иРНК без забивания пор фильтрационной мембраны. Использование системы TFF представляет собой преимущество, поскольку она позволяет очищать молекулы иРНК с высокой пропускной способностью.

Следует отметить, что термин «раствор» обычно относится к гомогенной смеси двух или более веществ и, прежде всего, применяется к жидкому состоянию вещества, хотя также возможны растворы газов и твердых веществ. В данном контексте термин «раствор», прежде всего в случае «первого раствора», «второго раствора», «третьего раствора» и «четвертого раствора» в соответствии с настоящим изобретением включает жидкость, такую как вода, предпочтительно гомогенная смесь жидкостей, а также, например, смесь жидкости и предпочтительно растворенной соли.

В настоящем изобретении предлагается способ очистки молекул иРНК, где указанный способ включает стадию (Iа) очистки осажденных молекул иРНК из суспензии, которая включает указанные осажденные молекулы иРНК. Указанная очистка достигается с использованием первого раствора. Суспензию, включающую осажденные молекулы иРНК, можно получить, например, в условиях лизиса клеток или транскрипции in vitro. Таким образом осажденные молекулы иРНК следует очистить от компонентов клеток или от смесей транскрипции in vitro, таких как аминокислотные последовательности, включающие белки и ферменты, нуклеозидтрифосфаты, компоненты буферных растворов и необязательно 5' кэп и/или 5' кэп аналоги. 5' Кэп и/или 5' кэп аналоги могут содержаться в суспензии, использованной для проведения стадии (Iа), например, в случае когда молекулы иРНК были транскрибированы in vitro и ко-транскрипционно 5' кэпированы. Следовательно, преимущество заключается в стадии (Iа) для удаления клеточных компонентов или компонентов из смесей транскрипции in vitro из осажденных молекул мРНК.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый раствор содержит ацетат аммония (NH₄OAc). Таким образом осажденные молекулы иРНК очищают из суспензии с использованием первого раствора, включающего NH₄OAc. Более того, значение рН первого раствора предпочтительно находится в интервале от 1 до 12, более предпочтительно от 1 до 10, даже более предпочтительно в интервале от 3 до 9, и наиболее предпочтительно в интервале от 6 до 8. Таким образом, осажденные молекулы иРНК очищают из суспензии, включающей осажденные молекулы иРНК, с использованием первого раствора, включающего NH₄OAc и значение рН которого находится в интервале от 1 до 12, предпочтительно в интервале от 1 до 10, более предпочтительно в интервале от 3 до 9, и даже более предпочтительно в интервале от 6 до 8.

Способ очистки молекул иРНК по настоящему изобретению дополнительно включает стадию (Iб) промывки и растворения очищенных осажденных молекул иРНК, полученных на стадии (Iа), описанной выше, с использованием второго раствора. Указанный второй раствор может представлять собой любой раствор, в котором молекулы иРНК можно ресуспендировать и в котором молекулы иРНК остаются стабильными, то есть не подвергаются гидролизу, например, воду. Проведение стадии (Iб) является преимуществом для удаления определенных компонентов первого раствора и для получения растворенных молекул иРНК. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вторым раствором является вода.

Способ очистки молекул иРНК по настоящему изобретению дополнтельно включает стадию (IIа) очистки молекул иРНК из растворенных молекул иРНК, полученных на стадии (Iб), с использованием третьего раствора, включающего хелатирующий агент. Такая стадия является преимуществом для удаления молекул незрелой иРНК и продуктов гидролиза из раствора, включающего растворенные молекулы иРНК.

Термин «хелатирующий агент» означает молекулы, которые хелатируют катионы и прежде всего молекулы с донорными группами, которые могут связываться с центральным атомом в координационном комплексе в зависимости от нескольких факторов, таких как рН и/или температура, концентрация хелатирующего агента и/или тип хелатируемого катиона. Хелатирующие агенты можно охарактеризовать, например, числом «дентатов», то есть количеством донорных групп на молекулу и/или количеством координирующих положений на хелатируемом катионе. Например, хелатирующий агент ЭДТА содержит шесть «дентатов» и хелатирует двухвалентный катион в составе комплекса двухвалентного катиона с хелатирующий агентом 1:1.

Предпочтительно в контексте настоящего изобретения термин «хелатирующий агент» относится к хелатирующим агентам, которые способны образовывать комплекс двухвалентных и/или трехвалентных катионов, таких как, например, двухвалентные ионы магния или кальция и/или трехвалентные ионы железа. Обычно хелатирующие агенты, включающие менее четырех координационных положений у катиона, обладают более низкой хелатирующей активностью по сравнению с хелатирующими агентами, включающими четыре или более координационных положений у катиона, прежде всего с учетом эффективного комплексообразования двухвалентных и/или трехвалентных катионов.

Хелатирующие агенты согласно настоящему изобретению представляют собой хелатирующие агенты, включающие по меньшей мере четыре координационных положения у хелатируемого катиона, более предпочтительно хелатирующие агенты, включающие более четырех координационных положений у хелатируемого катиона, даже более предпочтительно по меньшей мере четыре дентата на молекулу, в данном контексте также называются «высокоэффективными хелатирующими агентами», более предпочтительно хелатирующие агенты, включающие более четырех координирующих положений у хелатируемого катиона, которые используются в фармацевтических композициях и/или составах, и даже более предпочтительно ЭДТА. Хелатирующие агенты, включающие более четырех координирующих положений у хелатируемого катиона, которые используются в фармацевтических композициях, например, используются в антидотах, содержащих раствор Na₂ЭДТА (например, 2 г/10 мл, см., например, GPUPharma GmbH) и/или динатрий-кальциевую соль ЭДТА (например, 50 мг/мл, ампула 10 мл, см., например, Laboratories SERB), или, например, используемые в качестве эксципиентов (см., Например, Phenhydan, Desitin Arzneimittel GmbH, или Soluvit N, Baxter, или Fluimucil, Zambon GmbH).

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения хелатирующим агентом является ЭДТА.

Типичные предпочтительные хелатирующие агенты перечислены в табл. 1, при этом ЭДТА является наиболее предпочтительным хелатирующим агентом.

Высокоэффективные хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, могут эффективно удалять прежде всего двухвалентные катионы, такие как катионы магния. Катионы магния, например, требуются для ферментов, которые принимают участие в транскрипции молекул иРНК и таким образом, присутствуют в больших количествах в клеточных смесях и в транскрипционных смесях in vitro. Авторами настоящего изобретения неожиданно было установлено, что эффективное удаление продуктов гидролиза и молекул незрелой иРНК достигается с использованием высокоэффективного хелатирующего агента, такого как ЭДТА, на стадии (IIа), при этом обеспечивается высокая степень очистки молекул иРНК. Не связываясь с какой-либо теорией, можно предположить, что указанные выше катионы могут способствовать формированию вторичных и третичных структур молекул иРНК, и что удаление прежде всего двухвалентных катионов, таких как катионы магния, может иметь особое значение для очистки молекул иРНК, так как молекулы иРНК в качестве молекул незрелой иРНК и продуктов гидролиза могут иметь тенденцию связываться с очищаемыми молекулами иРНК в присутствии указанных катионов. Таким образом, можно предположить, что при удалении двухвалентных катионов с использованием высокоэффективного хелатирующего агента, такого как ЭДТА, на стадии (IIа), снижается температура плавления и оказывается влияние на вторичную и/или третичную структуру молекул иРНК.

Таким образом, молекулы незрелой иРНК и продукты гидролиза можно удалить в виде фильтрата. Следовательно, стадия (IIа) прежде всего представляет собой преимущество для удаления молекул незрелой иРНК и продуктов гидролиза.

Согласно настоящему изобретению, третий раствор включает хелатирующий агент, предпочтительно высокоэффективный хелатирующий агент, как определено выше, наиболее предпочтительно ЭДТА. Как указано выше, на комплексообразующую способность хелатирующих агентов может оказывать влияние значение рН, так как на константу комплексообразования данного хелатирующего агента влияет значение рН. Например, ЭДТА проявляет наиболее высокую эффективность при более высоких значениях рН, таких как от 8 до 10, в отношении хелатирующих ионов магния. Однако желательно регулировать величину рН с учетом оптимального компромисса между комплексообразующей способностью данного хелатирующего агента и стабильностью очищаемых молекул иРНК. В данном контексте было установлено, что высокоэффективный хелатирующий агент, такой как ЭДТА, может эффективно удалять прежде всего двухвалентные катионы при рН от 1 до 10, предпочтительно от 6 до 8. Таким образом, не связываясь с какой-либо теорией, можно предположить, что такую температуру плавления, прежде всего молекул незрелой иРНК и продуктов гидролиза, которые связаны с молекулами иРНК, можно снизить с помощью высокоэффективных хелатирующих агентов, таких как ЭДТА, и таким образом, молекулы незрелой иРНК и продукты гидролиза можно удалить при одновременном доведении рН до значения, при котором сохраняется стабильность очищаемых молекул иРНК.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения значение рН третьего раствора, содержащего хелатирующий агент, доводят до значения рН, в котором соответствующий хелатирующий агент обладает оптимальной хелатирующей способностью.

Следовательно, использование, например, высокоэффективного хелатирующего агента, такого как ЭДТА, при рН в интервале от 1 до 10, предпочтительно от 6 до 8, является преимуществом для эффективного удаления двухвалентных катионов, и таким образом, в свою очередь, для эффективного удаления молекул незрелой иРНК и продуктов гидролиза. В случае использования одного из альтернативных хелатирующих агентов, упомянутых выше, может потребоваться доведение рН до такого значения, при котором указанный альтернативный вариант эффективен для удаления ионов, предпочтительно двухвалентных катионов магния. Соответствующие интервалы рН для предпочтительных хелатирующих агентов указаны в таблице выше.

В некоторых вариантах значение рН третьего раствора находится в интервале от 1 до 10, предпочтительно в интервале от 3 до 9 и более предпочтительно в интервале от 6 до 8.

Величину рН третьего раствора можно доводить с использованием буферного вещества. Предпочтительные буферные вещества (их соответствующие интервалы рН указаны в скобках) включают 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол (Bis-Tris, рН интервал 5,8-7,2), N-(2-ацетамидо)иминодиуксусная кислота (ADA, рН интервал 6,0-7,2), N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновая кислота (ACES, рН интервал 6,1-7,5), 1,4-пиперазиндиэтансульфоновая кислота (PIPES, рН интервал 6,1-7,5), 2-гидрокси-3-морфолин-4-илпропан-1-сульфоновая кислота (MOPSO, рН интервал 6,2-7,6), 1,3-бис(трис(гидроксиметил)метиламино)пропан (Bis-Tris пропан, рН интервал 6,3-9,5), N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота (BES, рН интервал 6,4-7,8), 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS, рН интервал 6,5-7,9), 2-[[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино]этансульфоновая кислота (TES, рН интервал 6,8-8,2), 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота (HEPES, рН интервал 6,8-8,2), 3-(N,N-бис[2-гидроксиэтил]амино)-2-гидроксипропансульфоновая кислота (DIPSO, рН интервал 7,0-8,2), 4-(N-морфолино)бутансульфоновая кислота (MOBS, рН интервал 6,9-8,3) и 3-[[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино]-2-гидроксипропан-1-сульфоновая кислота (TAPSO, рН интервал 7,0-8,2). Прежде всего предпочтительным буферным веществом является MOPS, характеризующаяся предпочтительным рН от 6 до 8, более предпочтительно от 6,5 до 7,5.

В некоторых вариантах величина рН третьего раствора находится в интервале от 1 до 10, предпочтительно от 3 до 9, более предпочтительно от 6 до 9, и указанный раствор включает буферное вещество, предпочтительно MOPS.

В некоторых вариантах третий раствор включает буферное вещество MOPS и его предпочтительно получают при доведении рН буферным веществом MOPS перед добавлением хелатирующего агента, предпочтительно ЭДТА.

Таким образом, в некоторых вариантах третий раствор, который включает предпочтительно ЭДТА в качестве хелатирующего агента для удаления прежде всего двухвалентных катионов, таких как катионы магния, дополнительно включает буферное вещество MOPS, а значение рН составляет от 6 до 8. В некоторых вариантах третий раствор можно получить при приготовлении буферного вещества MOPS, доведении рН указанного буферного раствора MOPS в интервале от 1 до 10, предпочтительно от 6 до 8, и затем при добавлении ЭДТА в качестве предпочтительного хелатирующего агента.

В некоторых вариантах третий раствор включает 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА, а значение рН составляет от 6 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5.

Способ очистки молекул иРНК по настоящему изобретению дополнительно включает стадию (IIб) промывки очищенных молекул иРНК, полученных на стадии (IIа), с использованием четвертого раствора. Четвертый раствор может представлять собой любой раствор, в котором молекулы иРНК сохраняют стабильность, то есть не подвергаются гидролизу. Стадия (IIб) является преимуществом для удаления компонентов третьего раствора, при этом указанный четвертый раствор включает, например, хлорид натрия или цитрат натрия или является водой.

Как указано выше, вторым и четвертым растворами может являться любой раствор, в котором молекулы иРНК остаются стабильными, то есть не подвергаются гидролизу. Такой жидкостью может являться, например, вода, предпочтительно не содержащая нуклеаз вода или не содержащая РНКазы вода, такая как вода для инъекций (вода WFI). В случае четвертого раствора, такая жидкость может, кроме того, представлять собой, например, буферный раствор на основе HEPES, содержащий глюкозу, хлорид и/или цитрат натрия.

Таким образом, в некоторых вариантах четвертый раствор представляет собой воду. В некоторых вариантах вторым и четвертым раствором является вода.

В некоторых вариантах четвертый раствор включает хлорид и/или цитрат натрия.

В некоторых вариантах второй раствор представляет собой воду и/или четвертый раствор представляет собой воду или включает хлорид и/или цитрат натрия. Преимущество такого состава заключается в получении раствора, включающего очищенные молекулы иРНК после стадии (IIб) без добавления компонентов, которые следовало бы удалять на дополнительных стадиях перед дальнейшей последующей обработкой или применением.

В некоторых вариантах второй раствор представляет собой воду и четвертый раствор представляет собой воду и включает хлорид и/или цитрат натрия, предпочтительно при рН в интервале от 4 до 5. Значительное преимущество такого состава прежде всего заключается в терапевтическом отношении, так как хлорид и/или цитрат натрия предпочтительно содержатся в фармацевтической композиции, включающей очищенные молекулы иРНК. Таким образом, это является преимуществом с точки зрения последующего включения полученных молекул мРНК в фармацевтические композиции, поскольку хлорид и/или цитрат натрия являются широко используемыми компонентами фармацевтических композиций. Таким образом, использование четвертого раствора, содержащего хлорид или цитрат натрия, который является предпочтительным компонентом фармацевтических композиций, обеспечивает времясберегающую и экономичную интеграцию стадий, необходимых для очистки указанных молекул иРНК и включения их в фармацевтическую композицию.

В случае четвертого раствора, включающего хлорид и/или цитрат натрия, величина рН четвертого раствора предпочтительно находится в интервале от 3 до 6, более предпочтительно в интервале от 3,5 до 5,5 и даже еще более предпочтительно в интервале от 4 до 5.

В предпочтительных вариантах способа по настоящему изобретению этанол не включен ни в один из используемых в указанном способе растворов: первый, второй, третий и/или четвертый раствор.

Как указано выше, неожиданно было установлено, что при применении способа по настоящему изобретению можно обеспечивать высокую степень очистки молекул иРНК. Предпочтительно, раствор, полученный указанным способом, включает очищенные молекулы иРНК, но не содержит или содержит только очень низкие уровни продуктов гидролиза и молекул незрелой иРНК. Более предпочтительно, процентное содержание в полученном растворе после стадии (IIб) молекул иРНК составляет по меньшей мере 80%, даже более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% от всех молекул иРНК (молекулы иРНК, продукт гидролиза и молекулы незрелой иРНК). Такое содержание можно измерять методами, широко известными специалистам в данной области техники, например, анализом методами гель-электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) или по данным исследования электрофореграмм капиллярного гель-электрофореза или капиллярного электрофореза, такого как анализ в анализаторе Fragment Analyzer. Последний подход описан более подробно в разделе Примеры ниже.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере стадию (IIа), предпочтительно стадии (Iа)-(IIб), проводят при температуре в интервале от 0°С до 25°С, предпочтительно от 2°С до 8°С. Таким образом способ по настоящему изобретению предпочтительно проводят в интервале от 0°С до 25°С по меньшей мере в случае стадии (IIа), то есть очистку молекул иРНК из растворенных молекул иРНК, полученных на стадии (Iб) с использованием третьего раствора, включающего высокоэффективный хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА. Таким образом молекулы незрелой иРНК и продукты гидролиза удивляют при проведении стадии (IIа) при температуре в интервале от 0°С до 25°С, предпочтительно в интервале от 2°С до 8°С. Преимущество применения особенно низких температур, таких как в интервале от 2°С до 8°С, заключается в том, что снижается степень деградации молекул иРНК в ходе гидролиза по сравнению со степенью деградации, которая наблюдается при проведении особенно стадии (IIа) при более высокой температуре, такой как выше 25°С.Таким образом для получения больших количеств очищенных молекул иРНК преимущество заключается в проведении по меньшей мере стадии (IIа), предпочтительно стадий (Iа)-(IIб) способа по настоящему изобретению при температуре в интервале от 0°С до 25°С, предпочтительно в интервале от 2°С до 8°С.

В некоторых вариантах осажденные молекулы иРНК, включенные в суспензию, получают методом транскрипции in vitro, предпочтительно с использованием матрицы ДНК. Таким образом, очищаемые способом по настоящему изобретению молекулы иРНК можно получить любым известным в данной области техники способом. Предпочтительно, молекулы иРНК транскрибируют in vitro с использованием матрицы ДНК.

Для транскрипции in vitro требуются очищенная линейная или линеализированная матрица ДНК, содержащая промотер, рибонуклеотид трифосфаты, буферная система и соответствующая РНК полимераза, такая как полимераза Т7 RNA. Например, такую очищенную линейную матрицу ДНК можно получить химическим синтезом in vitro, необязательно амплификацией матрицы с использованием, например, метода на основе ПЦР. В другом варианте матрицу для транскрипции ДНК можно получить из плазмиды ДНК, которую в основном получают в условиях клеточного лизиса, очищают и линеализируют, например, с использованием сайт-специфичного рестрикционного фермента. В обоих случаях полученную последовательность линейной матрицы ДНК можно использовать для транскрипции молекул иРНК in vitro в присутствии нуклеотидов А, С, G, Т и U с использованием стандартных лабораторных протоколов.

В некоторых вариантах очищаемые молекулы иРНК получают методом транскрипции in vitro в присутствии немодифицированных и/или модифицированных нуклеотидов. Таким образом очищаемые молекулы иРНК можно синтезировать методом транскрипции in vitro на основе линейной или линеализированной матрицы ДНК с использованием немодифицированных и/или модифицированных нуклеотидов. Термин «немодифицированный нуклеотид», использованный в данном контексте, относится к нуклеотидам А, С, G, Т и U, как описано выше. Прежде всего, в случае транскрипции in vitro молекул иРНК, указанный термин относится к нуклеотидам А, С, G, Т и U.

Термин «модифицированный нуклеотид», использованный в данном контексте, относится в любому природному, химически синтезированному изомеру нуклеотидов А, С, G, Т и U, а также к любым природному или химически синтезированным аналогам, их альтернативному или модифицированному нуклеотиду или изомеру, включающим, например, химические модификации или замещенные остатки. Модифицированные нуклеотиды могут включать модификацию основания и/или модификацию углеводного остатка. Модифицированные нуклеотиды могут также включать модификации фосфатной группы, например, в отношении 5' кэпа молекулы иРНК. Модифицированные нуклеотиды могут также включать нуклеотиды, которые синтезируют пост-транскрипционно с использованием ковалентной модификации нуклеотидов. Кроме того, можно использовать любую пригодную смесь немодифицированных и/или модифицированных нуклеотидов. Неограниченное число типичных модифицированных нуклеотидов можно найти в литературе (например, см. статьи Cantara и др., Nucleic Acids Res, 2011, 39(Issue suppl_1):D195-D201, Helm и Alfonzo, Chem Biol, 2014, 21(2): 174-185, Carell и др., Angew Chem Int Ed Engl, 2012, 51(29): 7110-31) и некоторые предпочтительные модифицированные нуклеотиды перечислены в следующем списке на основе их соответствующего нуклеозидного остатка:

1-метиладенозин, 2-метилтио-N6-гидроксинорвалил карбамоиладенозин, 2-метиладенозин, 2'-O-рибозилфосфат аденозин, N6-метил-N6-треонилкарбамоиладенозин, N6-ацетиладенозин, N6-глицинилкарбамоиладенозин, N6-изопентениладенозин, N6-метиладенозин, N6-треонилкарбамоиладенозин, N6,N6-диметиладенозин, N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин, N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин, 1,2'-О-диметиладенозин, N6,2'-O-диметиладенозин, 2'-O-метиладенозин, N6,N6,2'-О-триметиладенозин, 2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин, 2-метилтио-N6-метиладенозин, 2-метилтио-N6-изопентениладенозин, 2-метилтио-N6-треонил карбамоиладенозин, N6-2-метилтио-N6-треонил карбамоиладенозин, 2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин, 7-метиладенозин, 2-метилтио-аденозин, 2-метокси-аденозин, 2'-амино-2'-дезоксиаденозин, 2'-азидо-2'-дезоксиаденозин, 2'-фтор-2'-дезоксиаденозин, 2-аминопурин, 2,6-диаминопурин, 7-деаза-аденозин, 7-деаза-8-аза-аденозин, 7-деаза-2-аминопурин, 7-деаза-8-аза-2-аминопурин, 7-деаза-2,6-диаминопурин, 7-деаза-8-аза-2,6-диаминопурин; 2-тиоцитидин, 3-метилцитидин, N4-ацетилцитидин, 5-формилцитидин, N4-метилцитидин, 5-метилцитидин, 5-гидроксиметилцитидин, 5-гидроксицитидин, лизидин, N4-ацетил-2'-O-метилцитидин, 5-формил-2'-O-метилцитидин, 5,2'-O-диметилцитидин, 2-О-метилцитидин, N4,2'-O-диметилцитидин, N4,N4,2'-O-триметилцитидин, изоцитидин, псевдоцитидин, псевдоизоцитидин, 2-тио-цитидин, 2'-метил-2'-дезоксицитидин, 2'-амино-2'-дезоксицитидин, 2'-фтор-2'-дезоксицитидин, 5-иодцитидин, 5-бромцитидин, 2'-азидо-2'-дезоксицитидин, 2'-амино-2'-дезоксицитидин, 2'-фтор-2'-дезоксицитидин, 5-аза-цитидин, 3-метил-цитидин, 1-метил-псевдоизоцитидин, пирроло-цитидин, пирроло-псевдоизоцитидин, 2-тио-5-метил-цитидин, 4-тио-псевдоизоцитидин, 4-тио-1-метил-псевдоизоцитидин, 4-тио-1-метил- 1-деаза-псевдоизоцитидин, 1-метил-1-деаза-псевдоизоцитидин, 2-метокси-цитидин, 2-метокси-5-метил-цитидин, 4-метокси-псевдоизоцитидин, 4-метокси-1-метил-псевдоизоцитидин, зебуларин, 5-аза-зебуларин, 5-метил-зебуларин, 5-аза-2-тио-зебуларин, 2-тио-зебуларин, 1-метилгуанозин, N2,7-диметилгуанозин, N2-метилгуанозин, 2'-O-рибозилфосфат гуанозина, 7-метилгуанозин, гидроксивибутозин, 7-аминометил-7-деазагуанозин, 7-циано-7-деазагуанозин, N2,N2-диметилгуанозин, N2,7,2'-O-триметилгуанозин, N2,2'-O-диметилгуанозин, 1,2'-O-диметилгуанозин, 2'-O-метилгуанозин, N2,N2,2'-O-триметилгуанозин, N2,N2J-триметилгуанозин, изогуанозин, 4-деметилвиозин, эпоксикевозин, не полностью модифицированный гидроксивибутозин, метилированный не полностью модифицированный гидроксивибутозин, изовиозин, пероксивибутозин, галактозил-кевозин, маннозил-кевозин, кевозин, археозин, вибутозин, метилвиозин, виозин, 7-аминокарбоксипропилдеметилвиозин, 7-аминокарбоксипропилвиозин, метиловый эфир 7-аминокарбоксипропилвиозина, 7-деаза-гуанозин, 7-деаза-8-аза-гуанозин, 6-тио-гуанозин, 6-тио-7-деаза-гуанозин, 6-тио-7-деаза-8-аза-гуанозин, 7-метил-гуанозин, 6-тио-7-метил-гуанозин, 7-метилинозин, 6-метокси-гуанозин, 1-метилгуанозин, 8-оксо-гуанозин, 7-метил-8-оксо-гуанозин, 1-метил-6- тио-гуанозин, N2-метил-6-тио-гуанозин, N2,N2-диметил-6-тио-гуанозин, N1-метилгуанозин, 2'-амино-3'-дезоксигуанозин, 2'-азидо-2'-дезоксигуанозин, 2'-фтор-2'-дезоксигуанозин, 2-тиоуридин, 3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридин, 3-метилуридин, 4-тиоуридин, 5-метил-2-тиоуридин, 5-метиламинометилуридин, 5-карбоксиметилуридин, 5-карбоксиметиламинометилуридин, 5-гидроксиуридин, 5-метилуридин, 5-тауринометилуридин, 5-карбамоилметилуридин, метиловый эфир 5-(карбоксигидроксиметил)уридина, дигидроуридин, 5-метилдигидроуридин, 5-метиламинометил-2-тиоуридин, 5-(карбоксигидроксиметил)уридин, метиловый эфир 5-(карбоксигидроксиметил)-2'-O-метилуридина, 5-(изопентениламинометил)уридин, 5-(изопентениламинометил)-2-тиоуридин, 3,2'-O-диметилуридин, 5-карбоксиметиламинометил-2'-O-метилуридин, 5-карбамоилгидроксиметилуридин, 5-карбамоилметил-2'-O-метилуридин, 5-карбамоилметил-2-тиоуридин, 5-метоксикарбонилметил-2'-O-метилуридин, 5-(изопентениламинометил)-2'-O-метилуридин, 5,2'-O-диметилуридин, 2'-O-метилуридин, 2'-O-метил-2-тиоуридин, 2-тио-2'-O-метилуридин, уридин 5-оксиуксусная кислота, 5-метоксикарбонилметилуридин, метиловый эфир уридин 5-оксиуксусной кислоты, 5-метоксиуридин, 5-аминометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-метиламинометил-2-селеноуридин, 5-метоксикарбонилметил-2-тиоуридин, 5-тауринометил-2-тиоуридин, псевдоуридин, 1-метил-3-(3-амино-3-карбоксипропил)псевдоуридин, 1-метилпсевдоуридин, 3-метилпсевдоуридин, 2'-O-метилпсевдоуридин, 5-формилуридин, 5-аминометил-2-геранилуридин, 5-тауринометилуридин, 5-иодуридин, 5-бромуридин, 2'-метил-2'-дезоксиуридин, 2'-амино-2'-дезоксиуридин, 2'-азидо-2'-дезоксиуридин, 2'-фтор-2'-дезоксиуридин, инозин, 1-метилинозин, 1,2'-O-диметилинозин, 2'-O-метилинозин, 5-аза-уридин, 2-тио-5-аза-уридин, 4-тио-псевдоуридин, 2-тио-псевдоуридин, 5-карбоксиметил-уридин, 1-карбоксиметил-псевдоуридин, 5-пропинил-уридин, 1-пропинил-псевдоуридин, 1- тауринометил-псевдоуридин, 5-тауринометил-2-тио-уридин, 1-тауринометил-4-тио-уридин, 5-метил-уридин, 1-метил-псевдоуридин, 4-тио-1-метил-псевдоуридин, 2-тио-1-метил-псевдоуридин, 1-метил-1-деаза-псевдоуридин, 2-тио-1-метил-1-деаза-псевдоуридин, дигидропсевдоуридин, 2-тио-дигидроуридин, 2-тио-дигидропсевдоуридин, 2-метоксиуридин, 2-метокси-4-тио-уридин, 4-метокси-псевдоуридин, 4-метокси-2-тио-псевдоуридин, 1,2'-O-диметиладенозин, 1,2'-O-диметилгуанозин, 1,2'-O-диметилинозин, 2,8-диметиладенозин, 2-метилтиометилентио-N6-изопентенил-аденозин, 2-геранилтиоуридин, 2-лизидин, 2-метилтио циклический N6-треонилкарбамоиладенозин, 2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин, 2-метилтио-N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин, 2-метилтио-N6-треонилкарбамоиладенозин, 2-селеноуридин, 2-тио-2'-O-метилуридин, 2'-O-метиладенозин, 2'-O-метилцитидин, 2'-O-метилгуанозин, 2'-O-метилинозин, 2'-О-метилпсевдоуридин, 2'-O-метилуридин, метиловый эфир 2'-O-метилуридин 5-оксиуксусной кислоты, 2'-O-рибозиладенозинфосфат, 2'-O-рибозилгуанозинфосфат, 3,2'-O-диметилуридин, 3-(3-амино-3-карбоксипропил)-5,6-дигидроуридин, 3-(3-амино-3-карбоксипропил)псевдоуридин, 5,2'-O-диметилцитидин, 5,2'-O-диметилуридин, метиловый эфир 5-(карбоксигидроксиметил)-2'-O-метилуридина, 55-(изопентениламинометил)-2'-О-метилуридин, 5-аминометил-2-геранилтиоуридин, 5-аминометил-2-селеноуридин, 5-аминометилуридин, 5-карбамоилметил-2'-O-метилуридин, 5-карбоксигидроксиметилуридин, 5-карбоксиметил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометил-2-геранилтиоуридин, 5-карбоксиметиламинометил-2-селеноуридин, 5-карбоксиметиламинометил-2'-O-метилуридин, 5-цианометилуридин, 5-формил-2'-O-метилцитидин, 5-метоксикарбонилметил-2'-О-метилуридин, 5-метиламинометил-2-геранилтиоуридин, 7-аминокарбоксилпропил-деметилвиозин, 7-метилгуанозин, 8-метиладенозин, N2,2'-O-диметилгуанозин, N2,7,2'-O-триметилгуанозин, N2,7-диметилгуанозин, N2,N2,2'-O-триметилгуанозин, N2,N2,7-триметилгуанозин, N2,N2,7-триметилгуанозин, N4,2'-O-диметилцитидин, N4,N4,2'-O-триметилцитидин, N4,N4-диметилцитидин, N4-ацетил-2'-O-метилцитидин, N6,2'-O-диметиладенозин, N6,N6,2'-O-триметиладенозин, N6-формиладенозин, N6-гидроксиметиладенозин, агматидин, 2-метилтио циклический N6-треонилкарбамоиладенозин, глутамил-кевозин, гуанозин, добавленный к любому нуклеотиду, гуанилированный 5' конец, гидрокси-N6-треонилкарбамоиладенозин, наиболее предпочтительно псевдоуридин, N1-метил-псевдоуридин, 2'-фтор-2'-дезоксицитидин, 5-иодцитидин, 5-метилцитидин, 2-тиоуридин, 5-иодуридин и/или 5-метилуридин.

Более того, термин «модифицированный нуклеотид» включает нуклеотиды, содержащие изотопы, такие как дейтерий. Термин «изотоп» относится к элементу, содержащему равное количество протонов, но различное количество нейтронов, что приводит к различным массовым числам. Таким образом, изотопы водорода, например, не ограничиваются дейтерием, но включают также тритий. Более того, молекула иРНК может также содержать изотопы других элементов, включая, например, изотопы углерода, кислорода, азота и фосфора. Возможен также вариант, когда модифицированные нуклеотиды дейтерированы или содержат другой изотоп водорода или кислорода, углерода, азота или фосфора.

Следовательно, в случае, когда очищаемые молекулы иРНК получают методом транскрипции in vitro в присутствии четырех типов нуклеотидов, то есть нуклеотидов А, С, G и U, общее количество типов модифицированных нуклеотидов может составлять 0, 1, 2, 3 или 4. Таким образом, в некоторых вариантах модифицированным нуклеотидом может являться по меньшей мере один нуклеотид одного типа, например, по меньшей мере один нуклеотид U. В некоторых вариантах модифицированным нуклеотидом может являться по меньшей мере один нуклеотид всего двух типов, например, по меньшей мере один нуклеотид U и по меньшей мере один нуклеотид С. В некоторых вариантах модифицированным нуклеотидом может являться по меньшей мере один нуклеотид всего трех типов, например, по меньшей мере один нуклеотид G, по меньшей мере один нуклеотид U и по меньшей мере один нуклеотид С. В некоторых вариантах модифицированным нуклеотидом может являться по меньшей мере один нуклеотид всех четырех типов. Во всех этих вариантах один или более нуклеотидов одного типа может являться модифицированным, при этом содержание указанных модифицированных нуклеотидов в процентах составляет 0%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 100%.

В некоторых вариантах общее содержание модифицированных нуклеотидов в процентах, включенных в очищаемые молекулы иРНК, составляет 0%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 100%.

Очищаемые молекулы иРНК можно, например, характеризовать следующим образом: от 0,5 до 50%, предпочтительно от 5 до 50% нуклеотидов U, и от 5 до 50% нуклеотидов С являются модифицированными. Указанные модифицированные нуклеотиды U предпочтительно представляют собой 5-иодуридин, а указанные модифицированные нуклеотиды С предпочтительно представляют собой 5-иодцитидин.

В некоторых вариантах очищаемые молекулы иРНК можно, например, характеризовать следующим образом: от 15 до 25% нуклеотидов U и от 5 до 15% нуклеотидов С являются модифицированными, при этом указанные модифицированные нуклеотиды U предпочтительно представляют собой 5-метилуридин, а указанные модифицированные нуклеотиды С предпочтительно представляют собой 5-иодцитидин.

В некоторых вариантах очищаемые молекулы иРНК можно, например, характеризовать следующим образом: от 30 до 50% нуклеотидов U и от 10 до 20% нуклеотидов С являются модифицированными, при этом указанные модифицированные нуклеотиды U предпочтительно представляют собой 5-иодуридин, а указанные модифицированные нуклеотиды С предпочтительно представляют собой 5-иодцитидин.

В некоторых вариантах очищаемые молекулы иРНК можно, например, характеризовать следующим образом: от 30 до 50% нуклеотидов U и от 5 до 15% нуклеотидов С являются модифицированными, при этом указанные модифицированные нуклеотиды U предпочтительно представляют собой 5-иодуридин, а указанные модифицированные нуклеотиды С предпочтительно представляют собой 5-иодцитидин.

В некоторых вариантах очищаемые молекулы иРНК можно, например, характеризовать следующим образом: от 0,5 до 5% нуклеотидов U и от 25 до 35% нуклеотидов С являются модифицированными, при этом указанные модифицированные нуклеотиды U предпочтительно представляют собой 2-тиоуридин, а указанные модифицированные нуклеотиды С предпочтительно представляют собой 5-метилцитидин.

Очищаемые молекулы иРНК можно, например, характеризовать следующим образом: от 50 до 100%, предпочтительно 100% нуклеотидов U являются модифицированными, при этом указанные модифицированные нуклеотиды U предпочтительно представляют собой Nl-метилпсевдоуридин.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ перед стадией (Iа) включает стадию получения суспензии, включающей осажденные молекулы иРНК, с использованием ацетата аммония. Преимущество осаждения молекул иРНК заключается в удалении солей, нуклеотидов и белков, прежде всего в связи с тем, что осаждение иРНК является простым и рентабельным способом. Специалистам в данной области техники известны различные растворы для осаждения, включающие, например, GSCN, NH₄OAc, этанол, хлорид лития, ацетат натрия и хлорид натрия. Однако именно в отношении терапевтического применения, значительное преимущество заключается в удалении солей, таких как GSCN и LDS. Таким образом, в некоторых вариантах молекулы иРНК осаждают с использованием NH₄OAc. Таким образом, суспензию для осаждения молекул иРНК, используемую на стадии (Iа), предпочтительно получают с использованием NH₄OAc.

Как указано выше, в некоторых вариантах первый раствор содержит ацетат аммония. Предпочтительно, общее количество NH₄OAc в суспензии и первом растворе находится в интервале от 0,1 моля/л до 5 молей/л, предпочтительно в интервале от 1 моля/л до 4 молей/л, более предпочтительно от 2 молей/л до 3 молей/л, и таким образом менее 5 молей/л, предпочтительно менее 4 молей/л, более предпочтительно менее 3 молей/л. Низкое количество ацетата аммония является особым преимуществом с точки зрения продолжительности и рентабельности дальнейшей обработки. Первый раствор может, кроме того, характеризоваться значением рН в интервале от 1 до 12, предпочтительно от 6,5 до 7,5.

В некоторых вариантах первый раствор содержит ацетат аммония, где общее количество NH₄OAc в суспензии и в первом растворе находится в интервале от 1 моля/л до 4 молей/л, предпочтительно в интервале от 2 молей/л до 3 молей/л.

В некоторых вариантах значение рН первого раствора находится в интервале от 1 до 12, предпочтительно от 6,5 до 7,5, и указанный раствор содержит ацетат аммония, где общее количество NH₄OAc в суспензии и в первом растворе находится в интервале от 1 моля/л до 4 молей/л, предпочтительно в интервале от 2 молей/л до 3 молей/л.

В некоторых вариантах способ очистки молекул иРНК дополнительно включает добавление пятого раствора к растворенным молекулам иРНК, полученным на стадии (Iб), до очистки молекул иРНК с использованием третьего раствора, включающего хелатирующий агент согласно стадии (IIа). Пятый раствор включает предпочтительно тот же самый хелатирующий агент, что и в третьем растворе. Таким образом, пятый раствор предпочтительно включает ЭДТА в качестве хелатирующего агента для удаления прежде всего двухвалентных катионов, таких как катионы магния, и необязательно буферное вещество MOPS. Однако концентрация хелатирующего агента, включенного в пятый раствор, предпочтительно превышает концентрацию хелатирующего агента, включенного в третий раствор. При добавлении пятого раствора к растворенным молекулам иРНК, полученным на стадии (Iб), перед проведением стадии (IIа), состав раствора, в котором суспендированы молекулы иРНК, полученные на стадии (Iб), можно скорректировать до состава третьего раствора, используемого на стадии (IIа). Преимущество такой операции заключается в том, что можно снизить возможные эффекты разбавления, и, таким образом, повысить производительность и/или воспроизводимость очистки молекулы иРНК в соответствии способом, описанным в данном контексте.

В некоторых вариантах способ очистки молекул иРНК дополнительно включает дефосфорилирование и/или полиаденилирование и/или пост-кэппирование молекул иРНК. Таким образом, молекулы иРНК можно не только очистить способом по настоящему изобретению, но и дополнительно модифицировать для обеспечения их способности транслироваться в функциональные аминокислотные последовательности, такие как белки. Такие модификации включают дефосфорилирование молекул иРНК для удаления, например, 5'-моно-, ди- и/или трифосфатов, которые были добавлены в ходе синтеза in vitro и/или в ходе котранскрипционного 5'-кэппинга, полиаденилирование молекул иРНК, так как хвост поли(А) в большинстве случаев является основным фактором, определяющим время жизни молекулы иРНК, и пост-кэппирование молекул иРНК в случае, если не проводили ко-транскрипционное 5'-кэппирование. Поскольку прежде всего 5'-кэпы и 3'-поли(А) хвосты считаются основными факторами, определяющими эффективность иРНК, включение таких признаков в способ очистки молекулы иРНК является преимуществом с точки зрения максимального увеличения времени и рентабельности обработки молекулы иРНК и максимального увеличения продолжительности действия очищенных молекул иРНК.

Преимущество наличия 5'-кэпа заключается в повышении стабильности молекул иРНК и, таким образом, в увеличении продолжительности действия молекул иРНК. Таким образом в случае, если очищаемые осажденные молекулы иРНК не содержат 5'-кэп или аналог 5'-кэпа, молекулы иРНК предпочтительно подвергают пост-транскрипционному 5'-кэппированию, например, при ферментативном включении кэпа C1-m7G или кэпа m7GpppG. Однако более предпочтительно молекулы иРНК подвергают пост-транскрипционному 5'-кэпированию, например, с использованием аналога кэпа ARCA или с использованием технологии Trilink (CleanCap technology, см. US 2018/273576 А1). В этом случае преимущество применения способа TFF по настоящему изобретению заключается в удалении чистого кэп-аналога.

Более того в случае, если очищаемые осажденные молекулы иРНК не содержат хвост 3'-поли(А), молекулы иРНК предпочтительно подвергают ферментативному полиаденилированию с использованием хвоста поли(А), который содержит по меньшей мере 100 нуклеотидов А, предпочтительно по меньшей мере 120 нуклеотидов А, более предпочтительно по меньшей мере 240 нуклеотидов А. Необязательно, добавляемый хвост поли(А) включает не-А нуклеотиды, предпочтительно нуклеотиды G в последовательности хвоста поли(А) и/или в одном концевом фрагменте хвоста поли(А), при этом указанный концевой фрагмент не включен в 3'-концевой фрагмент очищаемых молекул иРНК. Было установлено, что преимущество добавления хвоста поли(А) к молекулам иРНК заключается в увеличении продолжительности действия указанной молекулы иРНК и таким образом в обеспечении требуемых уровней трансляции.

Следовательно, в некоторых вариантах способ очистки молекул тРНК по настоящему изобретению дополнительно включает дефосфолирирование молекул иРНК.

В других вариантах способ дополнительно включает полиаденилирование молекул иРНК.

В еще одних вариантах способ дополнительно включает пост-кэппирование молекул иРНК.

В некоторых вариантах способ очистки молекул иРНК включает по меньшей мере дефосфорилирование и полиаденилирование молекул иРНК.

В некоторых вариантах способ очистки молекул иРНК по настоящему изобретению включает по меньшей мере дефосфорилирование и пост-кэппирование молекул иРНК, где дефосфорилирование молекул иРНК проводят после пост-кэппирования молекул иРНК.

В некоторых вариантах способ очистки молекул иРНК включает дефосфорилирование молекул иРНК, полученных на стадии (Iб), с последующим проведением стадий (Iа)-(IIб), с последующим полиаденилированием полученных молекул иРНК и с последующим повторным проведением стадий (Iа)-(IIб), где последнюю стадию (Iа) проводят при температуре в интервале от 20°С до 30°С, предпочтительно в интервале от 23°С до 27°С, более предпочтительно при 25°С, необязательно с последующей фильтрацией полученного концентрата, включающего молекулы иРНК. Таким образом, для обеспечения максимальной рентабельности и снижения временных затрат на обработку молекул иРНК, способ очистки молекул иРНК дополнительно включает стадии дефосфорилирования и полиаденилирования молекул иРНК. Прежде всего авторами настоящего изобретения было установлено, что преимущество заключается в объединении последних двух стадий с дополнительными стадиями очистки молекул иРНК, чтобы удалить также компоненты, введенные в ходе дефосфорилирования и полиаденилирования.

Таким образом, прежде всего в случае, если очищаемые молекулы иРНК включают котранскрипционно включенные 5' кэп или аналог 5' кэпа, способ очистки молекул иРНК включает следующие стадии. Сначала осажденные молекулы иРНК очищают из суспензии, включающей указанные осажденные молекулы иРНК, с использованием первого раствора на стадии (Iа), причем указанный первый раствор предпочтительно включает ацетат аммония. Затем очищенные осажденные молекулы иРНК на стадии (Iб) промывают и растворяют с использованием второго раствора, предпочтительно воды, для удаления, например, белков, солей и трифосфатов нуклеозидов. Затем растворенные молекулы иРНК подергают дефосфорилированию способами, известными специалистам в данной области техники для удаления 5' моно-, ди- и трифосфатов от молекул иРНК, которые могли не подвергаться кэппированию. Дефосфорилированные молекулы иРНК очищают с использованием первого раствора, предпочтительно включающего ацетат аммония, на дополнительной стадии (Iа) и затем промывают с использованием второго раствора, который предпочтительно представляет собой воду, на дополнительной стадии (Iб). Полученные таким образом молекулы иРНК затем очищают на стадии (IIа) с использованием третьего раствора, включающего хелатирующий агент, предпочтительно ЭДТА, и предпочтительно MOPS при рН в интервале от 0 до 8, более предпочтительно при рН в интервале от 6,5 до 7,5, для удаления молекул незрелой иРНК и продуктов гидролиза. Затем третий раствор удаляют при проведении стадии промывки на стадии (IIб) с использованием четвертого раствора. Если стадия полиаденилирования не требуется, например, в связи с тем, что матрица ДНК, которая включает последовательность, кодирующую хвост поли(А), используемую для транскрипции in vitro, полученные очищенные молекулы иРНК промывают на стадии (IIб) с использованием четвертого раствора, предпочтительно включающего цитрат и/или хлорид натрия, и за указанной стадией (IIб) необязательно следует дополнительная стадия фильтрации с использованием, например, фильтрационной мембраны с размером пор менее 0,3 мкм. В случае, если стадия полиаденилирования является предпочтительной, например, поскольку для транскрипции in vitro использовали матрицу ДНК, которая не содержит последовательность, кодирующую хвост поли(А), полученные очищенные молекулы иРНК промывают на стадии (IIб) с использованием четвертого раствора, предпочтительно воды, и затем их можно удлинять в условиях ферментативного включения хвоста 3'-поли (А) с использованием стандартных лабораторных протоколов для повышения продолжительности действия молекул иРНК, например, при добавлении поли(А) полимеразы. Затем молекулы иРНК подвергают обработке на стадиях (Iа)-(IIб), как описано выше, за исключением того, что стадию (Iа) проводят при температуре в интервале от 20°С до 30°С, предпочтительно в интервале от 23°С до 37°С, более предпочтительно при 25°С, например, для удаления добавленной поли(А) полимеразы, и за исключением того, что четвертый раствор, использованный на стадии (IIб), предпочтительно включает цитрат или хлорид натрия, для получения очищенных молекул иРНК, включающих 5' кэпы или аналоги 5' кэпов или хвосты 3' поли(А). Необязательно полученные очищенные молекулы иРНК можно подвергать дополнительной стадии фильтрации, например, с использованием фильтрационной мембраны с размером пор менее 0,3 мкм.

В случае, если очищаемые молекулы иРНК не включают ко-транскрипционно включенные 5' кэп или аналог 5' кэпа, способ очистки молекул иРНК по настоящему изобретению, по сравнению с процедурой, описанной выше, включает дополнительную стадию, предпочтительно посттранскрипционное добавление 5' кэпа или аналога 5' кэпа в присутствии фермента. Таким образом, способ очистки молекул иРНК может включать следующие стадии. Сначала осажденные молекулы иРНК очищают от суспензии, которая включает указанные осажденные молекулы иРНК, с использованием первого раствора на стадии (Iа), причем указанный первый раствор предпочтительно включает ацетат аммония. Затем очищенные осажденные молекулы иРНК промывают на стадии (Iб) и растворяют с использованием второго раствора, предпочтительно воды, для удаления, например, белков, солей и трифосфатов нуклеозидов. Способ дополнительно включает кэппирование молекул иРНК, полученных на стадии (Iб), а затем проведение стадий (Iа) и (Iб), дефосфорилирование полученных молекул иРНК, с последующим проведением стадий (Iа)-(IIб). Если стадия полиаденилирования не требуется, например, в связи с тем, что матрица ДНК, которая включает последовательность, которая кодирует хвост поли(А), была использована для транскрипции in vitro, полученные очищенные молекулы иРНК промывают на стадии (IIб) с использованием четвертого раствора, предпочтительно включающего цитрат и/или хлорид натрия, и за указанной стадией (IIб) необязательно следует дополнительная стадия фильтрации с использованием, например, фильтрационной мембраны с размером пор менее 0,3 мкм. В случае, когда стадия полиаденилирования является целесообразной, например, в связи с тем, что для транскрипции in vitro была использована матрица ДНК, которая не включает последовательность, которая кодирует хвост поли(А), полученные очищенные молекулы иРНК промывают на стадии (IIб) с использованием четвертого раствора, предпочтительно воды, и затем их можно удлинять при добавлении хвоста 3' поли(А) в присутствии фермента с использованием стандартного лабораторного протокола для увеличения продолжительности действия молекул иРНК, например, при добавлении поли(А) полимеразы. Затем молекулы иРНК подвергают обработке на стадиях (Iа)-(IIб), где стадию (Iа) предпочтительно проводят при температуре в интервале от 20°С до 30°С, предпочтительно в интервале от 23°С до 37°С, более предпочтительно при 25°С, например, для удаления добавленной поли(А) полимеразы, а затем проводят стадию (IIб) с использованием четвертого раствора, включающего предпочтительнбо цитрат и/или хлорид натрия, при этом необязательно с последующим проведением фильтрации полученного концентрата, включающего молекулы иРНК.

Таким образом, стадии (Iа)-(IIб) предпочтительно осуществляют до проведения любого удлинения молекул иРНК, такого как 3' полиаденилирование и необязательно 5' кэппирование. Прежде всего стадии (Iа)-(IIб) предпочтительно проводят до 3' полиаденилирования молекул иРНК, и стадии (Iа)-(Iб) предпочтительно проводят до 5' кэппирования. Такой подход используется во всех четырех вариантах осуществления настоящего изобретения, то есть для очистки молекул иРНК, которые подвергали ко-транскрипционному и пост-транскрипционному 5' кэппированию, соответственно.

Кроме того, во всех четырех вариантах осуществления, описанных выше, после стадий дефосфорилирования молекул иРНК проведение стадий (Iа) и (Iб) является необязательным. Следовательно, некоторые варианты соответствуют четырем вариантам осуществления, как описано выше, за исключением того, что стадии дефосфорилирования молекул иРНК, за которыми следует выполнение стадий (Iа) и (Iб).

Фильтрацию TFF можно проводить с использованием в качестве устройства для фильтрации капсулы, кассеты и кассетного держателя или модуля из полых волокон. Прежде всего, модули из полых волокон представляют собой полностью предварительно собранные, предварительно стерилизованные, одноразовые проточные каналы, которые обеспечивают стерильную обработку и обеспечивают экономически эффективный метод упаковки фильтрационных мембран.

Фильтрационные мембраны, используемые для очистки молекул иРНК, могут представлять собой любой тип материала, пригодный для очистки молекул иРНК, и следовательно, не взаимодействующий с очищаемыми молекулами иРНК. Типичные материалы для фильтрационных мембран включают немодифицированный полиэфирсульфон (PES), модифицированный полисульфон (mPES), мембрану из полых волокон на основе mPES, поливинилиденфторид (PVDF), ацетат целлюлозы, нитроцеллюлозу, смешанный эфир целлюлозы (ME), сверхвысокомолекулярный полиэтилен высокой плотности (UPE), полифтортетраэтилен (PTFE), найлон, полисульфон (PS), полиакрилонитрил, полипропилен, поливинилхлорид, поливинилидендифторид (PVDF) и их комбинации.

Фильтрационные мембраны характеризуются величиной предела отсечения по молекулярной массе (MWCO), который означает самую низкую молекулярную массу частиц в дальтонах, 90% которых удерживаются над мембраной. Предпочтительно размер пор фильтрационной мембраны обеспечивает удерживание молекул иРНК, в то время как компоненты меньшего размера, то есть меньше MWCO, проходят через фильтрационную мембрану и называются фильтратом. Так как удаляются различные компоненты различного размера, преимуществ заключается в том, чтобы подбирать размер пор фильтрационной мембраны в соответствии с размером компонентов, которые необходимо удалить на соответствующей стадии способа по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в случае стадии (Iа), для фильтрации TFF используют фильтрационную мембрану с пределом отсечения MWCO в интервале от 300 кДа до 0,65 мкм, предпочтительно 500 кДа, и/или в случае стадий (Iб) и (IIб) используют фильтрационную мембрану с пределом отсечения MWCO в интервале от 1 кДа до 0,65 мкм, предпочтительно от 1 кДа до 300 кДа, более предпочтительно от 1 кДа до 50 кДа, даже более предпочтительно 50 кДа, 70 кДа и/или 100 кДа, и/или в случае стадии (IIа), используют фильтрационную мембрану с пределом отсечения по меньшей мере 50 кДа, предпочтительно по меньшей мере 70 кДа, более предпочтительно 70 кДа или 100 кДа. Фильтрационная мембрана имеет важное значение, так как размер пор фильтрационной мембраны определяет размер частиц, таких как молекулы иРНК и ее компонентов, которые могут проходить через фильтрационную мембрану и таким образом содержаться в фильтрате.

Таким образом, в случае стадии (Ia), MWCO фильтрационной мембраны предпочтительно составляет 300 кДа или 0,065 мкм. Предпочтительно, величину MWCO выбирают из группы, состоящей из 300 кДа, 500 кДа, 750 кДа, 0,05 кДа, 0,1 мкм, 0,2 мкм, 0,45 мкм, 0,5 мкм 0,65 мкм, и величина MWCO прежде всего предпочтительно составляет 500 кДа. Преимущество заключается в том, чтобы удерживать осажденные молекулы иРНК при удалении, например, ферментов и белков, содержащихся в клетках, которые подвергали лизису для получения очищаемых молекул иРНК или в случае транскрибированных in vitro молекул иРНК ферментов, модифицированных и немодифицированных нуклеозидтрифосфатов, 5' кэпов, аналогов 5' кэпов и компонентов буферного раствора, содержащихся в реакционных смесях транскрипции in vitro. Таким образом, соответствующую величину MWCO можно выбирать с учетом, например, размера ферментов, использованных на предшествующих стадиях обработки, таких как транскрипция in vitro очищаемых молекул иРНК, и которые необходимо удалить фильтрацией TFF на стадии (Iа). Полимераза T7RNA представляет собой хорошо известный в данной области техники фермент, который недостаточно эффективно удаляется в случае использования фильтрационной мембраны с величиной MWCO менее 100 кДа. При использовании на стадии (Iа) мембраны с величиной MWCO в интервале от 1 кДа до 750 кДа, фильтрация TFF называется ультрафильтрацией, в то время как фильтрация с использованием мембраны с величиной MWCO в интервале от 0,05 мкм до 0,65 мкм фильтрация TFF называется микрофильтрацией.

В случае стадий (Iб) и (IIб), величина MWCO предпочтительно составляет по меньшей мере 1 кДа, предпочтительно от 1 кДа до 50 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 50 кДа, и даже более предпочтительно по меньшей мере 70 кДа. Предпочтительно, величину MWCO выбирают из группы, состоящей из 1 кДа, 3 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 30 кДа, 50 кДа, 70 кДа, 100 кДа, 300 кДа, 0,05 мкм, 0,1 мкм, 0,2 мкм, 0,45 мкм, 0,5 мкм и 0,65 мкм, а величина MWCO прежде всего предпочтительно составляет 50 кДа, 70 кДа или 100 кДа. Такие признаки представляют преимущество для очистки молекул иРНК, в связи с эффективным удалением солей и других компонентов, содержащихся в соответствующем растворе, таких как ацетат аммония, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, буферное вещество, такое как MOPS, молекулы незрелой иРНК и/или продукты гидролиза. В случае сравнительно больших молекул иРНК можно также рассматривать величину MWCO более 300 кДа.

В случае стадии (IIа), величина MWCO предпочтительно составляет по меньшей мере 50 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 70 кДа, даже более предпочтительно 70 кДа или 100 кДа. При использовании, например, буферного раствора на основе MOPS-ЭДТА, как описано выше, прежде всего предпочтительной является величина MWCO 100 кДа. В случае применения других высокоэффективных хелатирующих агентов или других высокоэффективных комбинаций хелатирующего агента и буферного вещества, для очистки сравнительно больших молекул иРНК может рассматриваться даже величина MWCO 100 кДа и более.

Более того, способы с использованием фильтрации TFF можно характеризовать с учетом различных переменных, наиболее важными из которых являются трансмембранное давление и скорость потока.

Термин «трансмембранное давление» (ТМР) означает движущую силу, которая обеспечивает продвижение компонентов через фильтрационную мембрану. В некоторых вариантах трансмембранное давление в случае стадий (Iа) и (Iб), например, в лабораторном масштабе в типичном случае 500 мг иРНК, составляет от 100 мбар до 500 мбар, предпочтительно от 200 мбар до 400 мбар, и в случае стадий (IIа) и (IIб) от 2 мбар до 20 мбар, предпочтительно от 5 мбар до 15 мбар.

Термин «поток» относится к объему раствора, который протекает через систему TFF и прежде всего через площадь фильтрационной мембраны, а «скорость потока» означает объем раствора, протекающего через указанную систему в течение данного времени. Таким образом, скорость потока или поперечная скорость означает скорость потока раствора через фильтрационную мембрану. В некоторых вариантах скорость потока в случае стадий (Iа) и (Iб) составляет, например, 500 мг иRNA в типичном случае в лабораторном масштабе, составляет от 1,5 л/мин до 2,5 л/мин, предпочтительно от 1,6 л/мин до 1,9 л/мин, и в случае стадий (IIа) и (IIб) от 0,2 л/мин до 0,6 л/мин, предпочтительно от 0,35 л/мин до 0,45 л/мин.

В наиболее предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения способ очистки молекул иРНК проводят с использованием непрерывной фильтрации TFF. Термин непрерывная TFF относится к системе TFF, в которой концентрат используют в качестве питающего потока в другом цикле TFF. В данном контексте термин «питающий поток» означает раствор или суспензию, включающие очищаемые молекулы иРНК. Следовательно, исходный питающий поток, включающий молекулы иРНК, подвергают первому циклу фильтрации с использованием TFF, и полученный концентрат, включающий молекулы иРНК, снова используют в качестве питающего потока для другого цикла TFF при циркуляции по меньшей мере молекул иРНК. Такая комбинация представляет преимущество для повышения уровня очистки на повторных стадиях очистки в автоматическом режиме, а также в снижении риска потерь молекул иРНК при их перемещении через системы.

Таким образом в некоторых вариантах молекулы иРНК содержатся в концентрате после фильтрации в тангенциальном потоке, предпочтительно по меньшей мере в концентрате, полученном на стадиях (Ia)-(IIa). В случае стадии (IIб) молекулы иРНК могут содержаться в концентрате или в фильтрате.

В некоторых вариантах молекулы иРНК содержатся в концентрате, полученном на стадиях (Iа)-(IIб).

В некоторых вариантах концентрат, полученный на стадии (Iа), используют в качестве питающего потока раствора для фильтрации в тангенциальном потоке на стадии (Iб), концентрат, полученный на стадии (Iб), в качестве питающего потока раствора на стадии (IIа), а концентрат, полученный на стадии (IIа), в качестве питающего раствора на стадии (IIб). Таким образом настоящее изобретение предпочтительно осуществляют с использованием непрерывной фильтрации TFF для выполнения по меньшей мере стадий (Iа)-(IIб). Более подробно, для очистки по настоящему изобретению молекулы иРНК предпочтительно циркулируют в системе непрерывной TFF. Таким образом, в одном варианте по меньшей мере стадии (Ia)-(IIa), предпочтительно стадии (Iа)-(IIб), проводят с использованием непрерывной TFF.

Дополнительное преимущество системы TFF заключается в том, что ее можно простым способом использовать для диафильтрации и прежде всего для непрерывной диафильтрации. С помощью диафильтрации части раствора или суспензии могут быть заменены на другие. Например, при прерывистой диафильтрации раствор сначала разбавляют, а затем снова концентрируют до исходного объема. Однако этот процесс может оказывать отрицательный эффект на функциональность очищаемых молекул иРНК.

Следовательно, в предпочтительных вариантах очищаемые молекулы иРНК циркулируют по меньшей мере в ходе стадий (Iа)-(IIб), в непрерывной системе TFF для очистки способом, описанный выше, с использованием постоянного объема диафильтрации. Постоянный объем или непрерывная диафильтрация относится к способу фильтрации, при этом в системе фильтрации сохраняется постоянный объем. Таким образом, одно и то же количество раствора или суспензии добавляют в виде объема раствора или суспензии, который проходит через фильтрационную мембрану в виде фильтрата. Таким образом, объем концентрата равен объему, который исходно подавали в систему TFF, то есть питающий объем и объем для промывки, то есть объем диафильтрации, равен объему фильтрата. Комбинация непрерывной TFF и непрерывной диафильтрации является преимуществом в отношении удаления примесей в виде фильтрата, и при этом очищаемые молекулы иРНК удерживаются в циркулирующей части системы TFF в постоянном объеме для сохранения их функции.

Следовательно, в некоторых вариантах по меньшей мере стадии (Ia)-(IIa), предпочтительно стадии (Iа)-(IIб) проводят с использованием диафильтрации, предпочтительно непрерывной диафильтрации.

В некоторых вариантах объем диафильтрации любого первого, второго, третьего и/или четвертого раствора составляет по меньшей мере 1-кратный объем суспензии стадии (Iа), например, 1-кратный, 2-кратный, 3-кратный, 4-кратный, 5-кратный, предпочтительно по меньшей мере 10-кратный объем. Определение указанного объема диафильтрации представляет особый интерес с точки зрения оптимального компромисса между временными затратами, экономической эффективностью и уровнем очистки, который необходимо обеспечить. Было установлено, что объем диафильтрации любого из первого, второго, третьего и/или четвертого раствора составляет по меньшей мере 1-кратный объем суспензии стадии (Iа), предпочтительно, по меньшей мере, 10-кратный. Преимущество заключается в том, чтобы обеспечить значительно удаление компонентов и при этом обеспечить высокую производительность обработки, и таким образом, очистку молекул иРНК в препаративном масштабе.

В некоторых вариантах объем диафильтрации составляет 1-кратный объем суспензии стадии (Iа), и таким образом объем суспензии, включающей осажденные молекулы иРНК, первоначально введенные в систему TFF на стадии (Iа).

В некоторых вариантах объем диафильтрации является двухкратным объемом суспензии. В некоторых вариантах объем диафильтрации является 3-кратным объемом суспензии. В некоторых вариантах объем диафильтрации является 4-кратным объемом суспензии. В некоторых вариантах объем диафильтрации является 5-кратным объемом суспензии. В некоторых вариантах объем диафильтрации является по меньшей мере 5-кратным объемом суспензии на стадии (Iа).

В некоторых вариантах объем диафильтрации составляет по меньшей мере 10-кратный объем суспензии на стадии (Iа), и следовательно объем суспензии, включающий осажденные молекулы иРНК, первоначально введенный в систему TFF на стадии (Iа). Было установлено, что использование объема диафильтрации, по меньшей мере 10-кратного объема, первоначально введенного в систему TFF, является преимуществом для значительного удаления компонентов, использованных на соответствующей стадии, как описано выше.

Следовательно, предпочтительно, чтобы объем диафильтрации любого первого, второго, третьего и/или четвертого раствора составлял по меньшей мере 10-кратный объем суспензии стадии (Iа). Еще более предпочтительно, чтобы по меньшей мере объем диафильтрации третьего и четвертого раствора составлял по меньшей мере 10-кратный объем суспензии на стадии (Iа).

В некоторых вариантах объем диафильтрации первого, второго, третьего и четвертого раствора составляет 10-кратный объем суспензии на стадии (Iа).

Типичная полностью автоматизированная, замкнутая система для получения очищенных молекул иРНК согласно способу по настоящему изобретению представлена на Фиг. 2. Система включает непрерывную систему TFF, показанную на Фиг. 1, которая находится в жидкостном соединении с системой продуцирования иРНК, предпочтительно через первый вентиль. Следует отметить, что термин «вентиль», используемый в данном контексте, охватывает вентили (например, двух- и/или трехходовые) запорные вентили, зажимы и соединители с микропроцессорным управлением (МРС), предпочтительно вентили и/или соединители МРС. Кроме того, предпочтительно, чтобы соединитель МРС использовался в сочетании с зажимом. Таким образом, два элемента, например, два шланга, могут быть соединены таким образом, чтобы обеспечить одноразовое использование и/или обеспечить совместимость с различными системами, устойчивость к высокому давлению и/или изменениям давления, например, в одном из шлангов, и/или невысокую стоимость.

Система получения иРНК может включать реакционный сосуд и по меньшей мере еще один сосуд. Реакционный сосуд и, по меньшей мере, один дополнительный сосуд предпочтительно находятся в жидкостном соединении друг с другом и с системой TFF через соединительный шланг. Первый вентиль расположен между соединительным шлангом системы получения иРНК и шлангом системы TFF, предпочтительно шлангом, в котором питающий поток циркулирует из резервуара к фильтрационному устройству. В другом варианте, система для продуцирования иРНК может находиться в жидкостном соединении со шлангом, в котором концентрат циркулирует от фильтрационного устройства к резервуару. Следует отметить, что использованный в данном контексте термин «шланг» может относиться к шлангу, трубе, трубопроводу или их комбинации. Более того соединительный шланг системы продуцирования иРНК может включать вспомогательный насос.Преимущество вспомогательного насоса заключается в автоматической регулировке скоростей потоков, проходящих через соединительный шланг.

Очищаемые молекулы иРНК согласно способу по настоящему изобретению можно получить, например, при культивировании клеток для амплификации молекул иРНК в клетке, или предпочтительно в условиях транскрипции in vitro (IVT). В случае продуцирования молекул иРНК из клетках, клетки, такие как клетки Е. coli, можно культивировать в ферментере в условиях клеточно-специфического культивирования, пригодных для продуцирования молекул иРНК. Параметры указанных условий культивирования предпочтительно являются автоматически регулируемыми, например, при обеспечении соответствующих количеств среды для культивирования, газа и/или буферного вещества. Следовательно, система для продуцирования молекул иРНК может включать реакционную емкость и по меньшей мере одну дополнительную емкость, где реакционная емкость представляет собой ферментер и по меньшей мере одна дополнительная емкость включает, например, соответствующую среду для культивирования, газ и/или буферный раствор.

В другом варианте, если очищаемые молекулы иРНК получают методом IVT, то при этом требуются матрица IVT, например, соответствующая матрица ДНК для транскрипции IVT очищаемых целевых молекул иРНК и реагенты для IVT, например, полимераза Т7 RNA, и смесь трифосфатов нуклеотидов (NTP). Следовательно, система продуцирования иРНК может включать реакционную емкость и по меньшей мере одну дополнительную емкость, где по меньшей мере одна дополнительная емкость включает по меньшей мере один из указанных реагентов IVT.

Таким образом реакционная емкость предпочтительно находится в жидкостном соединении по меньшей мере с одной дополнительной емкостью, предпочтительно по меньшей мере с первой дополнительной емкостью и второй дополнительной емкостью.

Первая дополнительная емкость может включать по меньшей мере один из указанных реагентов IVT и предпочтительно находиться в жидкостном соединении с реакционной емкостью через соединительный шланг и второй и третий вентиль. Второй вентиль предпочтительно расположен между реакционной емкостью и соединительным шлангом, а третий вентиль расположен между соединительным шлангом и первой дополнительной емкостью. Когда закрывается первый вентиль и открываются второй и третий вентили, может происходить продуцирование молекул иРНК, например, методом IVT, предпочтительно в реакционной емкости. Когда закрывается третий вентиль и открываются первый и второй вентили, продуцированные молекулы иРНК можно переносить из системы продуцирования иРНК в систему TFF.

Вторая дополнительная емкость может включать раствор для осаждения молекул иРНК, где указанный раствор включает предпочтительно ацетат аммония (NH₄OAc), например, 5 М NH₄OAc. Предпочтительно вторая дополнительная емкость находится в жидкостном соединении с соединительным шлангом через четвертый вентиль. Когда открываются второй и четвертый вентили и закрываются первый и третий вентили, целевые молекулы можно осадить, предпочтительно в реакционной емкости, или в случае, если реакционной емкостью является ферментер, во второй дополнительной емкости. Затем при открытии первого вентиля осажденные молекулы иРНК в суспензии можно переносить из системы продуцирования иРНК в систему фильтрации TFF для очистки молекул иРНК способом по изобретению.

Следовательно, система, показанная на Фиг. 2, включает систему TFF, предпочтительно систему непрерывной диафильтрации с резервуаром. Предпочтительно резервуар находится в жидкостной соединении по крайней мере с тремя дополнительными емкостями, то есть по меньшей мере с третьей дополнительной емкостью, четвертой дополнительной емкостью и дополнительной пятой емкостью, по меньшей мере через пятый, шестой и седьмой вентили, соответственно. Третья дополнительная емкость может включать первый раствор, четвертая дополнительная емкость - второй раствор, а пятая дополнительная емкость - третий раствор по настоящему изобретению. Если второй и четвертый растворы отличаются друг от друга, резервуар предпочтительно находится в жидкостном соединении с шестой дополнительной емкостью, включающей четвертый раствор, например, через восьмой вентиль. Следовательно, предпочтительно, чтобы третья дополнительная емкость включала первый раствор, при этом первый раствор включает NH₄OAc, например, 2,5 М NH₄OAc, для очистки осажденных молекул иРНК, четвертая дополнительная емкость - воду, например, воду для инъекций (WFI) в качестве второго раствора, а пятая дополнительная емкость - третий раствор, при этом третий раствор включает ЭДТА в качестве хелатирующего агента и необязательно MOPS. В случае, если четвертый раствор не является водой, шестая дополнительная емкость предпочтительно включает хлорид и/или цитрат натрия. Более того, может присутствовать вспомогательный насос для автоматической регулировки скоростей потоков, переносимых из любой из указанных по меньшей мере трех дополнительных емкостей в резервуар.

Следовательно, резервуар предпочтительно включает осажденные молекулы иРНК в суспензии, которую переносят из системы продуцирования иРНК через первый вентиль при открытии первого вентиля в течение предварительно определенного времени. При открытии пятого вентиля в течение предварительно определенного времени первый раствор можно добавлять в суспензию осажденных молекул иРНК, и затем смесь можно переносить для по меньшей мере одного цикла непрерывной фильтрации TFF в фильтрационном устройстве, при этом фильтрационная мембрана предпочтительно характеризуется пределом отсечения по молекулярной массе от 300 кДа до 0,65 мкм. Таким образом, суспензию, включающую осажденные молекулы иРНК, можно очищать, например, от компонентов, содержащихся в смеси IVT, таких как белки, соли и/или NTP согласно стадии (Iа) способа, описанного в данном контексте. Суспензию, включающую очищенные осажденные молекулы иРНК, предпочтительно переносят обратно в резервуар в виде концентрата. Для осуществления стадии (Iб), то есть промывки и растворения очищенных осаженных молекул иРНК, полученных на стадии (Iа), шестой вентиль отрывают в течение предварительно определенного времени. Таким образом, второй раствор можно добавлять в присутствующую в резервуаре суспензию, включающую осажденные молекулы иРНК. При проведении по меньшей мере одного цикла непрерывной фильтрации TFF с использованием фильтрационного устройства, предпочтительно фильтрационной мембраны с пределом отсечения от 1 кДа до 0,65 мкм, например, можно удалить NH₄OAc, включенный в первый раствор. При открытии седьмого вентиля в течение предварительно определенного времени, затем можно добавлять третий раствор к промытым и растворенным молекулам иРНК в резервуаре. При осуществлении по меньшей мере одного цикла непрерывной фильтрации TFF с использованием фильтрационного устройства, если фильтрационная мембрана характеризуется пределом отсечения 50 кДа, более предпочтительно 100 кДа, можно эффективно удалять молекулы незрелой иРНК и продукты гидролиза молекул иРНК на стадии (IIа) способа, описанного в данном контексте. Затем можно проводить стадию (IIб), для промывки очищенных молекул иРНК, полученных на стадии (IIа), например, при удалении компонентов третьего раствора. Следовательно, отрывают либо шестой либо восьмой вентиль в течение предварительно определенного времени для добавления либо воды, либо четвертого раствора, включающего хлорид и/или цитрат натрия, к очищенным молекулам иРНК в течение по меньшей мере одного цикла непрерывной TFF с использованием фильтрационного устройства, включающего фильтрационную мембрану, характеризующуюся предпочтительно пределом отсечения 50 кДа.

Необязательно проводят дополнительную стадию между стадиями (Iб) и (IIа). Следовательно, система TFF может дополнительно включать седьмую дополнительную емкость, которая находится в жидкостном соединении, например, с резервуаром, предпочтительно через девятый вентиль. Указанная седьмая дополнительная емкость может включать пятый раствор, при этом пятый раствор включает предпочтительно по меньшей мере хелатирующий агент в составе третьего раствора, предпочтительно ЭДТА, в более высокой концентрации, чем в указанном третьем растворе. При открытии девятого вентиля в течение предварительно определенного времени после выполнения стадии (Iб) можно добавлять пятый раствор к молекулам иРНК, растворенным во втором растворе. Преимущество этой операции заключается в том, что при этом можно повысить эффективность и воспроизводимость способа по настоящему изобретению за счет снижения времени, которое требуется для регулировки концентрации по меньшей мере хелатирующего агента в системе TFF до соответствующей концентрации, как указано в данном контексте для третьего раствора. Более того, может присутствовать вспомогательный насос для автоматической регуляции скоростей потоков, переносимых из седьмой дополнительной емкости в резервуар (не показано).

Необязательно, система получения молекул иРНК может дополнительно включать дополнительную емкость, предпочтительно в жидкостном соединении с соединяющим шлангом системы получения молекул иРНК, предпочтительно через промежуточный вентиль. Промежуточная емкость может представлять собой предпочтительно стерильный мешок. При открытии первого вентиля и промежуточного вентиля в течение предварительно заданного времени, по меньшей мере часть суспензии или раствора, включающих молекулы иРНК, можно переносить из системы TFF в систему получения молекул иРНК и/или из системы получения молекул иРНК в систему TFF. Преимущество такой операции заключается в сохранении по меньшей мере части указанных суспензии или раствора, предпочтительно в течение предварительно заданного времени. Таким образом по меньшей мере указанную часть указанных суспензии или раствора можно подвергать дополнительному циклу очистки, например, на стадиях (Iа) и (Iб), на стадиях (IIа) и (IIб), и/или их комбинации. Кроме того, во время хранения по меньшей мере части суспензии или раствора в промежуточной емкости систему TFF и/или систему получения молекул иРНК можно очистить, промыть водой и/или буферным раствором и/или стерилизовать. Необязательно или в другом варианте, промежуточную емкость можно использовать для получения по меньшей мере части раствора или суспензии, содержащихся в промежуточной емкости, предпочтительно раствора или суспензии, включающих очищенные молекулы иРНК. Необязательно система может дополнительно включать фильтр для дополнительной стадии фильтрации (не показан). Указанный фильтр может включать фильтрационную мембрану с размером пор менее 0,3 мкм, например, 0,22 мкм, для конечной стадии фильтрации и, таким образом, его можно использовать для конечной фильтрации суспензии, включающей очищенные молекулы иРНК, полученные из промежуточной емкости.

Преимущество заключается в модификации очищаемых молекул иРНК, например, дефосфорилированием, при добавлении 5'-кэпа или 3'-поли(А)-хвоста. Прежде всего, предпочтительно осуществлять стадии (Iа)-(IIб) по меньшей мере один раз перед 3'-полиаденилированием молекул иРНК, и стадии (Iа)-(Iб) предпочтительно осуществлять по меньшей мере один раз перед 5'-кэпингом. Необязательно полученные молекулы иРНК можно дефосфорилировать после по меньшей мере первой стадии (Iа) и по меньшей мере первой стадии (Iб) с последующими по меньшей мере второй стадией (Iа) и по меньшей мере второй стадией (Iб). Следовательно, система может дополнительно включать одну или более следующих конструкций (не показано): вторую' дополнительную емкость, предпочтительно включающую реагенты, необходимые для кэппинга, и предпочтительно в жидкостном соединении с соединительными шлангами системы получения иРНК через четвертый' вентиль, вторую'' дополнительную емкость, предпочтительно включающую реагенты, необходимые для дефосфорилирования, и предпочтительно в жидкостном соединении с соединительными шлангами системы получения иРНК через четвертый'' вентиль, и вторую''' дополнительную емкость, предпочтительно включающую реагенты, необходимые для ферментативного добавления поли(А)-хвоста, например, по меньшей мере поли(А)-полимеразу, и предпочтительно в жидкостном соединении с соединительными шлангами системы получения иРНК через четвертый''' вентиль. Когда открывается первый вентиль и промежуточный вентиль в течение предварительно определенного периода времени по меньшей мере часть соответствующей суспензии, содержащей очищаемые молекулы иРНК, можно перенести из системы TFF в промежуточную емкость системы получения иРНК. Когда закрывается первый вентиль и открывается четвертый', четвертый'' и/или четвертый''' вентиль, можно осуществить кэппинг, дефосфорилирование и/или полиаденилирование молекул иРНК предпочтительно в промежуточной емкости. В другом варианте или дополнительно в случае, если реакционная емкость не представляет собой ферментер, реакционную емкость можно использовать вместо промежуточной емкости и, таким образом, открывать второй вентиль вместо промежуточного. Когда закрывается четвертый', четвертый'' и/или четвертый''' вентиль и открывается первый вентиль суспензию, включающую модифицированные молекулы иРНК, можно перенести из системы получения иРНК в систему TFF.

Следует отметить, что фильтрационное устройство может включать более одной фильтрационной мембраны, которую можно заменять в автоматическом режиме. Предпочтительно фильтрационное устройство включает более одной ячейки фильтрационного устройства, например, каждое включает фильтрационную колонку, и молекулы иРНК переносят для непрерывной фильтрации TFF в по меньшей мере одну из ячеек, содержащих фильтрационную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе, как указано выше для соответствующей стадии способа.

Кроме того, как показано на Фиг. 2, система может включать выходную секцию, например, выходную емкость в жидкостном соединении с резервуаром, например, через десятый вентиль. Предпочтительно, указанная выходная емкость относится к жидкостному соединению или находится в жидкостном соединении со стерильным, предпочтительно одноразовым, пакетом для хранения по меньшей мере части раствора или суспензии, содержащих очищенные молекулы иРНК. Когда открывается десятый вентиль, можно получить очищенные молекулы иРНК. В другом варианте в ходе (последней выполненной) стадии (IIб) очищенные молекулы иРНК могут содержаться скорее в фильтрате, чем в концентрате. Необязательно система может также содержать фильтр для дополнительной стадии фильтрации (не показано). Указанный фильтр может содержать фильтрационную мембрану с размером пор менее 0,3 мкм, например, 0,22 мкм, для конечной стадии фильтрации и, таким образом, его можно использовать для конечной фильтрации суспензии, содержащей очищенные молекулы иРНК, например, фильтрата или суспензии, полученной из выходной емкости. Кроме того, может присутствовать вспомогательный насос для автоматической регуляции скоростей жидкостей, переносимых из резервуара в выходную секцию (не показано).

Система может дополнительно включать предпочтительно регулируемый в автоматическом режиме охлаждающий и/или нагревательный элемент (не показано). Указанный охлаждающий и/или нагревательный элемент может быть расположен по меньшей мере практически вокруг одной или более системы шлангов, емкостей (например, реакционной емкости, промежуточной емкости, дополнительной емкости и/или резервуара) и/или фильтрационного устройства. Предпочтительно охлаждающий элемент расположен по меньшей мере частично вокруг резервуара и/или фильтрационного устройства. Таким образом, способ по настоящему изобретению можно осуществлять при температуре от 0°С до 25°С, предпочтительно для большинства стадий от 2°С до 8°С при контроле с использованием соответствующего охлаждающего и/или нагревательного элемента. Таким образом, можно получить большие количества очищенных молекул иРНК.

Предпочтительно система может дополнительно содержать предпочтительно регулируемый в автоматическом режиме элемент для регуляции рН (не показано). Указанный элемент может включать устройство для измерения рН раствора и/или суспензии, такое как рН-метр, и необязательно вентиль для регуляции рН, где последний предпочтительно находится в жидкостном соединении по меньшей мере с одной из емкостей (например, с реакционной емкостью, промежуточной емкостью, дополнительной емкостью и/или резервуаром). Таким образом, можно измерять и/или контролировать рН раствора и/или суспензии в соответствующей емкости. Дополнительно или в другом варианте можно измерять рН фильтрата, предпочтительно в непрерывном режиме. Таким образом, можно осуществлять мониторинг способа очистки иРНК с контролем качества.

Кроме того, можно измерять концентрацию и/или чистоту нуклеиновой кислоты, предпочтительно с использованием фильтрата. Это можно осуществить фотометрически при измерении поглощения молекул, включая молекулы иРНК, в УФ диапазоне приблизительно при 260 и 280 нм. Например, отношение величины, полученной при приблизительно 260 нм, к величине, полученной при приблизительно 280 нм, может указывать на степень чистоты соответствующей нуклеиновой кислоты в растворе или суспензии. Например, отношение приблизительно от 1,8 до приблизительно 2,0 может указывать на высокую степень чистоты молекул ДНК или РНК, в то время, как например, отношение менее 1,8 может указывать на примеси, например, белков. Таким образом, можно получать информацию о составе, например, фильтрата, включая концентрацию молекул иРНК. Необязательно или в другом варианте концентрацию молекул иРНК можно определять на основании, предпочтительно измерения проводимости в непрерывном режиме. Таким образом, система может, кроме того, включать предпочтительно регулируемый в автоматическом режиме элемент для количественного определения нуклеиновой кислоты (не показано), такой как спектрометр и/или спектрофотометр, например, Nanodrop, и/или устройства для измерения проводимости.

Любую из емкостей (например, реакционную емкость, промежуточную емкость, дополнительную камеру и/или резервуар) или все емкости можно располагать на соответствующих весах. Таким образом, можно измерять массу соответствующей емкости, определять массу раствора или суспензии, содержащих очищаемые молекулы иРНК или очищенные в соответствующей емкости, и соответствующее количество добавляемого соответствующего раствора или компонента, например, первого, второго, третьего, четвертого и/или пятого раствора и/или реагентов IVT. Таким образом, можно оптимизировать и автоматизировать способ получения и/или очистки иРНК.

Для обеспечения автоматической регуляции способа получения и/или очистки иРНК система предпочтительно включает средства контроля, предназначенные для контроля средств, описанных выше, например, вентилей, (вспомогательных) насосов, нагревательного и/или охлаждающего элемента, элемента регуляции рН, элемента для количественной оценки нуклеиновой кислоты, средства для осуществления измерения проводимости и/или массы. Термин "система", использованный в данном контексте, означает устройство и эти термины могут быть использованы взаимозаменяемо.

В отношении соединительных шлангов системы получения молекул иРНК указанные шланги могут представлять собой соединительные шланги, как показано на Фиг. 2, например, в жидкостном соединении с реакционной емкостью и другими последовательно соединенными емкостями. В другом варианте соединительные шланги могут два или более шланга, соединяющим соответствующие емкости. Таким образом, соединительные шланги могут, например, означать по меньшей мере первую систему шлангов в жидкостном соединении с реакционной емкостью и первой дополнительной емкостью, и вторую систему шлангов в жидкостном соединении с реакционной емкостью и второй дополнительной емкостью. Предпочтительно одна или более из указанных двух или более систем шлангов содержит вентиль между соответствующими емкостями и необязательно дополнительным насосом.

Любой из компонентов системы, описанной выше, может представлять собой одноразовый компонент. Предпочтительно, одна или более емкостей (например, промежуточная, реакционная и/или дополнительная емкость) и/или один или более (промежуточных) вентилей могут представлять собой соответствующий одноразовые емкости и вентили, соответственно. Предпочтительно промежуточная емкость и/или реакционная емкость представляют собой одноразовые емкости. Необязательно, вся система может представлять собой одноразовую систему, например, для получения и очистки специфических молекул иРНК. Преимущество такой системы заключается в том, что соответствующую молекулу иРНК можно получить и очистить в стерильных условиях, исключая затратных по времени и средствам стадий промывки, очистки и/или стерилизации, которые в других условиях были бы необходимыми для снижения риска загрязнения. Таким образом, предпочтительно один или более компонентов системы, описанной выше, представляют собой соответствующие одноразовые компоненты.

Система, как показано в качестве примера на Фиг. 2, характеризуется несколькими преимуществами. В такой закрытой системе риск загрязнений, например, РНКазой, сведен к минимуму, и в то же время пропускная способность может быть увеличена, поскольку с использованием непрерывной фильтрации TFF можно исключить закупоривание фильтрационных мембран. Кроме того, такую систему можно использовать простым способом, например, с использованием регулируемого насосом переноса жидкости, и даже в полностью автоматизированном режиме, например, с использованием автоматически регулируемых (вспомогательных) насосов и/или вентилей. Более того, систему легко масштабировать и настраивать в соответствии с особыми требованиями заказчика. Таким образом, можно осуществлять очистку молекул иРНК с высокой производительностью высокоэффективным и автоматическим способом согласно описанному в данном контексте способу с использованием системы, как показано на Фиг. 2.

Настоящее изобретение относится также к способу получения фармацевтической композиции, включающему (а) очистку молекул иРНК согласно способу очистки молекул иРНК, описанному выше, и (б) переработку полученных таким образом молекул иРНК в фармацевтическую композицию. Это представляет особый интерес для применения очищенных молекул иРНК в области фармацевтики, такой как введение молекул иРНК для обеспечения синтеза белка, дефицит или дефект которого связан с заболеванием и/или присутствие которого требуется в клетке или оказывает благоприятное действие на клетку.

Предпочтительно, функция аминокислотной последовательности, которую можно транслировать из молекулы иРНК, очищенной по настоящему изобретению, в клетке или в ее окружении является необходимой или оказывает благоприятное действие, например, аминокислотная последовательность, недостаток или дефектная форма которой является причиной заболевания или расстройства, обеспечение которой может облегчать или предотвращать заболевание или расстройство, или аминокислотная последовательность, которая может ускорить процесс, благоприятный для организма, в клетке или в ее окружении. Кодируемая аминокислотная последовательность может представлять собой полную аминокислотную последовательность или ее функциональный вариант.Кроме того, кодируемая аминокислотная последовательность может действовать в качестве фактора, индуктора, регулятора, стимулятора или фермента, или их функционального фрагмента, где эта аминокислотная последовательность проявляет функцию, необходимую для устранения заболевания, прежде всего метаболического нарушения или для запуска процессов in vivo, таких как образование новых кровеносных сосудов, тканей и т.д. Термин "функциональный вариант", использованный в данном контексте, означает фрагмент, который в клетке может проявлять функцию аминокислотной последовательности, функция которой в клетке является необходимой или недостаток или дефектная форма которой являются патогенными.

Предпочтительно, такая аминокислотная последовательность характеризуется преимуществами в отношении применения для дополнительных или медицинских целей для создания или восстановления физиологических функций, вызванных биосинтезом субоптимальных аминокислотных последовательностей, и, таким образом, также для прямого или непрямого благоприятного влияния на ход заболеваний. Нарушениями с известной генетической основой являются муковисцидоз, гемофилия, гипертензия, повышенный уровень холестерина, рак, нейродегенеративные нарушения, психические заболевания и др. Каталог в режиме "онлайн" с 22993 записями генетический нарушений и нарушений генов человека с соответствующими генами и описанием их фенотипов доступен на веб-странице ONIM (Online Mendelian Inheritance in Man, http://onim.org), все последовательности доступны в базе данных Uniprot (http://www.uniprot.org). В качестве неограничивающих примеров в табл. 2 приведены некоторые врожденные заболевания и соответствующий(е) ген(ы). Вследствие высокого уровня взаимодействия клеточных сигнальных путей мутации определенного гена вызывают множественные патогенные симптомы, из которых только характерные приведены в табл. 2.

Белок также может вызывать иммуногенную реакцию, например, в качестве антигена. Такие белки можно применять в дополнительных или медицинских целях, включая вакцинацию.

В случае стадии очистки молекул иРНК используют те же подходы, как описано выше в связи со способом очистки иРНК по настоящему изобретению, где указанный способ включает стадии (Iа) очистки осажденных молекул иРНК из суспензии, включающей осажденные молекулы иРНК, с использованием первого раствора, (Iб) промывки и растворения очищенных осажденных молекул иРНК, полученных на стадии (Iа), с использованием второго раствора, (IIа) очистки молекул иРНК из растворенных молекул иРНК, полученных на стадии (Iб), с использованием третьего раствора, включающего хелатирующий агент, такой ЭДТА, с последующей стадией (IIб) промывки очищенных молекул иРНК, полученных на стадии (IIа), с использованием четвертого раствора, где стадии (Ia) - (II,) выполняют с использованием фильтрации в тангенциальном потоке.

В случае стадии переработки полученных таким образом очищенных молекул иРНКА в фармацевтическую композицию указанная стадия может включать добавление хлорида или цитрата натрия в случае использования молекул иРНК, очищенных водой, в качестве четвертого раствора на стадии (IIб) и на последней стадии (IIб) в случае проведения более одной стадии (IIб), соответственно. Преимущество заключается в том, что если очищенные молекулы иРНК не были получены в растворе, уже содержащем хлорид или цитрат натрия, или если очищенные молекулы иРНК были получены в растворе, уже содержащем хлорид или цитрат натрия, но при концентрации, отличной от концентрации, требуемой при введении. В последнем случае способ может также включать стадию определения соответствующей концентрации и изменении ее при необходимости. Предпочтительно, очищенные молекулы иРНК включены в раствор, который дополнительно содержит хлорид или цитрат натрия при концентрации, благоприятной для введения с использованием четвертого раствора, включающего указанный хлорид или цитрат натрия при соответствующей концентрации и рН от 3 до 6, предпочтительно от 4 до 5, на (последней) стадии (IIб) способа очистки молекул иРНК, описанного выше.

Переработка полученных очищенных молекул иРНК в фармацевтическую композицию может включать стадию добавления фармацевтически приемлемого носителя. Очищенные молекулы иРНК предпочтительно включены в эффективном количестве, т.е. в количестве, достаточном для запуска детектируемого терапевтического ответа у субъекта, которому будут вводить фармацевтическую композицию. Очищенные молекулы иРНК и/или фармацевтическая композиция могут присутствовать в стерильных водных или неводных растворах, суспензиях и эмульсиях, а также в кремах и суппозиториях, но также могут присутствовать в форме порошков, таблеток или аэрозолей.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель", использованный в данном контексте, означает химические соединения, материалы, ингредиенты и/или композиции, которые, с медицинской точки зрения, являются пригодными для использования при контактировании с тканями человека и животных без избыточной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соизмеримых с приемлемым соотношением польза/риск. Таким образом, фармацевтически приемлемым носителем является неактивное вещество, перерабатываемое одновременно с фармацевтически активным веществом, для облегчения его использования с точки зрения дозы, адсорбции, растворимости или фармакокинетических параметров.

Примеры пригодных фармацевтически приемлемых носителей хорошо известны в данной области техники и включают фосфатные солевые буферные растворы, буферные вещества, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы смачивающих агентов и стерильные растворы. Прежде всего, водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и буферные среды. Примеры неводных растворителей включают пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры, такие как этилолеат.Другие примеры фармацевтически приемлемых носителей включают не ограничиваясь только ими, раствор Рингера и раствор декстрозы, цитрат, фосфат и другие органические кислоты, солеобразующие противоионы, например, натрий и калий, низкомолекулярные (более 10 аминокислотных остатков) полипептиды, белки, например, сывороточный альбумин или желатин гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как гистидин, глутамин, лизин, аспарагин, аргинин или глицин, углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины, моносахариды, дисахариды, другие сахара, например, сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, хелатирующие агенты, например, ЭДТА, неионные ПАВ, например, монолаурат полиоксиэтиленсорбитана, которые выпускаются под торговыми названиями Tween, пропиленгликоль, плюроники или полиэтиленгликоль, антиоксиданты, включающие метионин, аскорбиновую кислоту и токоферол, и/или консерванты например, октадецилдиметилбензиламмоний хлорид, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, например, метил- или пропилпарабен, катехол, резорцин циклогексанол, 3-пентанол и мета-крезол. Пригодные фармацевтически примелемые носители и их составы более подробно описаны в книге Remington' Pharmaceutical Sciences, 17^е изд., (1985), Mack Publishing Со. Кроме того, могут присутствовать консерванты, стабилизаторы и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы, наносистемы или липосомы, и т.п.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, включающей молекулы иРНК, очищенные любым соответствующим способов, описанным в данном контексте, и полученных способом, описанным выше. Фармацевтическая композиция характеризуется преимуществами в связи с регуляцией и/или усилением трансляции аминокислотной последовательности, такой как белок, в клетках субъекта, которому вводят фармацевтическую композицию, где присутствие указанной аминокислотной последовательности, такой как белок, является благоприятным и/или необходимым для субъекта, например, в контексте заболевания.

Что касается фармацевтической композиции молекул иРНК, их очистки и получения фармацевтической композиции, можно использовать аналогичные способы, как описано выше, включая признаки и преимущества, упомянутые в контексте соответствующих вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных выше.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить с использованием множества классов и способов введения, известных специалистам в данной области техники, таких как инъекция с использованием иглы, использование ингаляторов, распылителей, кремов, пен, гелей, лосьонов и мазей. Доза и продолжительность действия зависит от функции, которую выполняют указанные очищенные молекулы иРНК, и которые следует специально корректировать в каждом случае. Продолжительность действия должна быть по возможности длительной, например, если указанные очищенные молекулы иРНК используются для длительного лечения заболевания, вызванного генетически дефицитным геном, в то время как по другим показаниям его можно регулировать до требуемого временного промежутка. Кроме того, возможно системное введение указанных очищенных молекул мРНК, переработанных в пригодные фармацевтические композиции.

Фиг. 1. Схема системы непрерывной фильтрации в тангенциальном потоке (TFF) с циркулирующими молекулами иРНК согласно способу по настоящему изобретению. Молекулы иРНК находятся в суспензии на стадии (Iа), растворяются на стадии (Iб), и находятся в растворе в случае стадий (IIа) и (IIб), соответственно.

Фиг. 2. Схема типичной системы для очистки молекул иРНК согласно способу по настоящему изобретению (с примерным расположением вентилей, (дополнительных) насосов и/или (дополнительных) емкостей).

Фиг. 3. Электрофорез в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием коллоидным Кумасси концентрата TFF, включающий немодифицированный tdTomato, кодирующий молекулы иРНК, после очистки соответствующей транскрипционной смеси in vitro (IVT) в соответствии со стадиями (Iа) и (Iб) при КТ. Полоса 1: смесь ферментов в ацетате аммония (NH₄OAc) в качестве контроля, полоса 2: смесь ферментов после заполнения системы TFF, полоса 3: смесь ферментов после TFF в не содержащей нуклеазу воде, полоса 4: смесь IVT, полоса 5: смесь IVT после заполнения системы TFF, полоса 6: смесь IVT после TFF в не содержащей нуклеазу воде, полоса 7: смесь ферментов в не содержащей нуклеазу воде в качестве контроля. Смесь ферментов состоит из ингибитора РНКазы, полимеразы Т7 РНК, неорганической пирофосфатазы и ДНКазы I.

Фиг. 4. Электрофорез в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием коллоидным Кумасси концентрата TFF, включающий немодифицированный tdTomato, кодирующий молекулы иРНК, после очистки соответствующей транскрипционной смеси in vitro (IVT) согласно стадиям (Ia) и (Iб) при КТ. Полоса 1: смесь ферментов в не содержащей нуклеазу воде в качестве контроля, полоса 2: смесь ферментов перед TFF, полоса 3: смесь IVT после заполнения системы TFF, полоса 4: смесь IVT после фильтрации в не содержащей нуклеазу воде TFF, полоса 5: смесь IVT после TFF в не содержащей нуклеазу воде (после диафильтрации в присутствии 2,5 М ацетата аммония и не содержащей нуклеазы воды, соответствующую смесь концентрировали в 2,5 раза для эффективного детектирования удаления белков). Смесь ферментов состоит из ингибитора РНКазы, полимеразы Т7 РНК, неорганической пирофосфатазы и ДНКазы I.

Фиг. 5. Электрофорез в ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием коллоидным Кумасси концентрата TFF, включающий немодифицированный tdTomato, кодирующий молекулы иРНК, после очистки соответствующей транскрипционной смеси in vitro (IVT) согласно стадиям (Ia) и (Iб) при 4°С. Полоса 1: смесь ферментов в не содержащей нуклеазу воде в качестве контроля, полоса 2: смесь IVT перед TFF, полоса 3: смесь IVT после промывки одним объемом (равным исходному объему), полоса 4: смесь IVT после TFF в не содержащей нуклеазу воде, полоса 5: смесь IVT после TFF в не содержащей нуклеазу воде (после диафильтрации в присутствии 2,5 М ацетата аммония и не содержащей нуклеазы воды, соответствующую смесь концентрировали в 2,5 раза для эффективного детектирования удаления белков). Смесь ферментов состоит из ингибитора РНКазы, полимеразы Т7 РНК, неорганической пирофосфатазы и ДНКазы I.

Фиг. 6. А) Вестерн-блоттинт белка hCFTR, транслированного в клетках НЕК293 после трансфекции иРНК hCFTR, очищенной фильтрацией TFF, и иРНК hCFTR, очищенной осаждением ацетатом аммония с последующей промывкой 70% этанолом, переработанной в композицию с использованием Lipofectamine Messenger Мах. Показаны полосы белка Hsp90 в качестве контроля. Нетрансфектированные клетки использовали в качестве отрицательного контроля. Г) Количество экспрессированного hCFTR оценивали денситоматрическим анализом с использованием программного обеспечения Image Lab и нормализовали на белок HSP90. Нетрансфектированные клетки (UT) использовали в качестве отрицательного контроля.

Фиг. 7. Остаточные количества добавленных нуклеотидов в молекулы иРНК белков, не являющихся hCFTR, по сравнению с количеством целевых молекул иРНК после варьирования объемов для промывки в процентах. Фильтрацию в тангенциальном потоке осуществляли при КТ.

Фиг. 8. Остаточные количества добавленных олигонуклеотидов в молекулы иРНК, не являющихся hCFTR, по сравнению с количеством целевых молекул иРНК после варьирования объемов для промывки в процентах. Фильтрацию в тангенциальном потоке осуществляли при 4°С.

Фиг. 9. Капиллярный гель-электрофорез с использованием устройства для анализа фрагментов Fragment Analyzer осуществляли с использованием иРНК tdTomato, при добавлении различных олигонуклеотидов ДНК (15 нт, 25 нт и 120 нт), содержащих антисмысловой олигонуклеотид ДНК (25 нт) до (А) и после (Б) очистки фильтрацией TFF при 4°С.Низкомолекулярный маркер является внутренним стандартом, который присутствует в наборе реагентов устройства для анализа фрагментов Fragment Analyzer для нормализации времен удерживания пика в каждом цикле капиллярного ЭФ (олигонуклеотид РНК длиной 15 нт).

Фиг. 10. В качестве примера скорость объемного потока фильтрата измеряли при различных величинах трансмембранного давления.

Фиг. 11. Капиллярный гель-электрофорез с использованием устройства для анализа фрагментов Fragment Analyzer осуществляли с использованием иРНК hCFTR при добавлении олигонуклеотидов различной длины ДНК (25 нт и 120 нт) и высокомолекулярных молекул иРНК GLP-1 (256 нт), до очистки согласно подходу 1 (А) и после стадии (Iб) (Б), после стадии (IIа) (В), и после стадии (IIб) (Г) при КТ. Низкомолекулярный маркер является внутренним стандартом, который присутствует в наборе реагентов для устройства для анализа фрагментов Fragment Analyzer для нормирования времен удерживания пика в каждом цикле капиллярного ЭФ (олигонуклеотид РНК длиной 15 нт).

Фиг. 12. Капиллярный гель-электрофорез с использованием устройства для анализа фрагментов Fragment Analyzer осуществляли с использованием иРНК hCFT при добавлении олигонуклеотидов ДНК различной длины (25 нт и 120 нт) и высокомолекулярных молекул иРНК GLP-1 (256 нт), до (А) и после (Б) стадии очистки согласно подходу 2 при КТ. Низкомолекулярный маркер является внутренним стандартом, который присутствует в наборе реагентов устройства для анализа фрагментов Fragment Analyzer для нормирования времен удерживания пика в каждом цикле капиллярного ЭФ (олигонуклеотид РНК длиной 15 нт).

Другие объекты и преимущества настоящего изобретения будут описаны в приведенных ниже примерах, которые предназначены для иллюстрации, но ограничиваясь только ими. Все публикации, патенты, заявки на выдачу патента или другие документы, цитированные в данной заявке, полностью включены в нее в виде ссылок.

Примеры

Способы и материалы описаны в данном контексте для применения в настоящем изобретении, также можно использовать другие пригодные способы и материалы, известные в данной области техники. Материалы, способы и примеры предназначены только для иллюстрации, но не ограничиваясь только ими.

Сокращения, использованные в данном контексте, и их соответствующие описания представлены в табл. 3.

Используемые материалы, устройства, программное обеспечение и системы анализов

Материалы приведены в табл. 4

Устройства перечислены в табл. 5.

Программное обеспечение приведено в таблице 6.

Исследуемая система приведена в табл. 7.

Очистка смеси IVT с использованием TFF - стадии (Iа) и (Iб)

Как описано ниже, использовали смесь для транскрипции in vitro (IVT), включающую немодифицированные транскрибированные in vitro нацеленные на tdTomato целевые молекулы иРНК, содержащие 1644 нуклеотида. Кроме того, использовали смесь ферментов, включающую полимеразу Т7 РНК, неорганическую пирофосфатазу, ингибитор РНКазы и ДНКазу I.

Осаждение РНК

Смесь IVT и смесь ферментов каждую осаждали равным количеством охлажденного во льду 5 М NH₄OAc при рН 7 до конечной концентрации 2,5 М NH₄OAc и выдерживали во льду по меньшей мере в течение 30 мин. Перед TFF соответствующую смесь разбавляли 1:1 2,5 М раствором NH₄OAc, с рН 7, до конечной концентрации иРНК приблизительно 0,5 мг/мл в смеси. Смесь IVT или смесь ферментов пропускали через систему TFF, которую предварительно промывали в течение 10 мин при циркулировании смеси IVT со скоростью 50 мл/мин при закрытом вентиле устройства для фильтрата.

Стадия (Iа)

Удаление белков, нуклеотидов и солей

Диафильтрацию соответствующей смеси осуществляли со скоростью 50 мл/мин при постоянном ТМР приблизительно 200-300 мбар с использованием фильтрационной колонки 500 кДа MWCO mPES. Соответствующую смесь подвергали диафильтрации 10 объемами для промывки 2,5 М раствора NH₄OAc рН 7. В ходе данной стадии осуществляется эффективное удаление ферментов, нуклеотидов, а также буферных компонентов, содержащихся в смеси для транскрипции in vitro. Стадию (Ia) можно использовать для удаления любых других белков и/или ферментов из любых других промежуточных стадий получения (например, дефосфорилирования, пост-кэппинга, полиаденилирования, …). В случае некоторых ферментов (например, полимеразы поли(А), которая связывается с исследуемыми молекулами иРНК с высокой аффинностью) в буферный раствор на основе ацетата аммония с рН 7 можно добавлять ПАВ (например, SDS, LDS, …). В случае, если полимеразу поли(А) используют для полиаденилирования, последующую стадию (Iа) предпочтительно проводили при температуре в интервале от 20°С до 30°С, предпочтительно в интервале от 23°С до 27°С, более предпочтительно при 25°С. Такая температура является предпочтительной для эффективного удаления полимеразы поли(А).

Стадия (Iб)

Удаление NH₄OAc, использованного стадии (Iа)

Для удаления NH₄OAc и для растворения молекул иРНК использовали фильтрационную колонку 100 кДа MWCO mPES для диафильтрации с использованиемЮ объемов для промывки с использованием воды, не содержащей нуклеазы, при скорости потока 50 мл/мин и ТМР приблизительно 200-300 мбар. В другом варианте в зависимости от размера молекул иРНК можно использовать фильтрационную колонку 50 кДа MWCO mPES.

Для исследования эффективности очистки стадий (Iа) и (Iб) из концентрата TFF, содержащего молекулы иРНК, можно отобрать образцы до и после TFF (т.е. стадии (Iб)) и проанализировать их, например, с использованием УФ-измерения, анализатора для фрагментов, гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE) с последующим, например, окрашиванием коллоидным красителем Кумасси.

Как показано на Фиг. 3-5, ферменты можно эффективно удалять из молекул иРНК в ходе стадий (Iа) и (Iб), как описано выше. Таким образом, молекулы иРНК удерживаются в системе TFF, в то время как ферменты и/или белки эффективно удаляются. Согласно анализу размытых пиков предварительный размытый пик составлял 4,7% до очистки TFF с отклонением+1,3% для очистки TFF при 4°С и +1,8% после очистки TFF при КТ. Таким образом, деградации иРНК не наблюдали.

Очистка осажденной и растворенной иРНК с использованием TFF Выполнение стадий (IIа) и (IIб)

В приведенном ниже описании осажденную и растворенную иРНК использовали для дополнительной очистки

Тестирование различных фильтрационных мембран и влияния ЭДТА на перенос иРНК

Различные фильтрационные мембраны с различным размером пор были протестированы в отношении переноса молекул иРНК с использованием либо воды, не содержащей нуклеазы, либо воды, не содержащей нуклеазы, при добавлении 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Тестировали четыре колонки mPES с пределом отсечения по молекулярной массе (MWCO) 500 кДа, 300 кДа, 100 кДа и 50 кДа, соответственно. Трансмембранное давление (ТМР) устанавливали с использованием вентиля для концентрата в системе TFF и поддерживали при 40 мбар для колонок с MWCO 500 кДа и 50 кДа, соответственно, и при 100 мбар для колонок с MWCO 100 кДа и 300 кДа, соответственно. Скорость основного насоса устанавливали 15 мл/мин и TFF осуществляли при КТ. Исходная концентрация молекул иРНК в питающем потоке составила 0,1 мг/мл, и концентрации молекул иРНК в концентрате и фильтрате определяли с использованием УФ-измерений. Каждую колонку тестировали при промывке 10-кратными объемами исходного образца.

В отсутствии ЭДТА молекулы иРНК удерживаются в тестируемой колонке с MWCO 500 кДа. Было предположено, что меньший размер пор (т.е. 300 кДа, 100 кДа и 50 кДа) не позволяет проходить молекулам иРНК и, следовательно, дальнейшее тестирование в отсутствии ЭДТА не проводили.

В присутствии ЭДТА молекулы иРНК неожиданно проходили через поры фильтрационной мембраны с MWCO 500 кДа и также частично проходили через фильтрационную мембрану с MWCO 300 кДа. Однако, молекулы иРНК успешно удерживаются при использовании фильтрационных мембран с MWCO 100 и 50 кДа в присутствии 10 мМ ЭДТА. Следовательно, колонка MWCO с 100 кДа была выбрана для фильтрации молекул иРНК в экспериментах, представленных ниже.

Следует отметить, что случайное осаждение молекул иРНК наблюдали в некоторых случаях после фильтрации в присутствии 10 мМ ЭДТА. Однако, такое осаждение можно эффективно предотвращать при использовании буферного раствора, включающего 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА.

Получение буферного раствора для диафильтрации 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА.

Получали буферный раствор на основе 1 М 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS), где MOPS растворяли в воде, не содержащей нуклеазу. рН 1 М буферного раствора MOPS доводили до 7 с использованием 32% NaOH. Полученный 1 М буферный раствор MOPS рН 7 смешивали с 0,5 М ЭДТА и с водой, не содержащей нуклеазу, при этом получали буферный раствор для диафильтрации, содержащий 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА.

Определение объемов буферного раствора для промывки для удаления олигонуклеотидов нуклеиновой кислоты

Эффективность процесса TFF, т.е. минимальное число циклов промывки, необходимое для полного удаления примесей, таких как олигонуклеотиды нуклеиновой кислоты, представляющих собой незрелые транскрипты и/или продукты гидролиза, сильно зависящие от отталкивания молекулы от мембраны фильтра и ее размера пор. Следовательно, соответствующий эффект объемов буферного раствора для промывки исследовали для определения числа циклов для промывки для удаления добавленных олигонуклеотидов нуклеиновой кислоты из осажденной и растворенной иРНК, включающей исследуемые молекулы иРНК.

Для данного эксперимента скорость потока TFF устанавливали равной 15 мл/мин и ТМР поддерживали постоянным и равным приблизительно 40 мбар с использованием фильтрационной колонки mPES MWCO 100 кДа. Общий питающий объем составлял 5 мл, в 500 мкл молекул иРНК добавляли олигонуклеотиды ДНК длиной 10 нуклеотидов, составляющих 2,5 мас. % целевой молекулы иРНК, 50 нуклеотидов, составляющих 2,5 мас. % целевой молекулы иРНК и 120 нуклеотидов, составляющих 5 мас. % целевой молекулы иРНК. Образцы для анализа обращенно-фазовой HPLC промывали, 5-, 10-, 15- и 20-кратными объемами исходного объема питающего буферного раствора для диафильтрации, содержащего 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА. Перед добавлением образца вентиль для фильтрата и вентиль для концентрата открывали для циркуляции концентрата со скоростью 50 мл/мин в течение 5 мин. Для каждого цикла для промывки 100 мкл образца пропускали через стерильный шприц и образцы выдерживали во льду до анализа. TFF осуществляли при комнатной температуре. Образцы исследовали с использованием анализа обращенно-фазовой HPLC с детектируемой при 260 нм площадью пика, соответствующей относительным количествам олигонуклеотида ДНК в образце. Соответствующие площади до TFF (контроль) принимали за 100% содержание олигонуклеотида.

Во всех случаях олигонуклеотиды нуклеиновой кислоты не были детектированы после промывки 5-, 10-, 15- и 20-кратными объемами для промывки в отношении питающего объема, соответственно. Следовательно, результаты свидетельствовали о том, что уже после 5 объемов буферного раствора для промывки, олигонуклеотиды нуклеиновой кислоты в концентрате не определяются. Минимальный 10-кратный объем буферного раствора для промывки был определен достаточным для удаления нуклеотидов нуклеиновой кислоты из молекул иРНК.

Определение объемов для промывки не содержащей нуклеазы воды для удаления ЭДТА

Поскольку удаление олигонуклеотидов ДНК с использованием TFF осуществляют с использованием буферного раствора для промывки, т.е. буферного раствора для диафильтрации, содержащего 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА, то последующая стадия фильтрации является преимуществом при замене буферного раствора для промывки на не содержащую нуклеазу воду. Следовательно, проводили эксперимент для определения количества циклов промывки, необходимых для удаления буферного раствора для промывки из молекул иРНК. Питающий раствор из предыдущего эксперимента, содержащий молекулы иРНК и общий объем которого составляет приблизительно 5 мл, и который предварительно подвергали фильтрации 20-кратными объемами буферного раствора для промывки для диафильтрации, снова подвергали диафильтрации с использованием не содержащей нуклеазы воды со скоростью потока 15 мл/мин при постоянном ТМР 40 мбар с использованием фильтрационной колонки mPES с MWCO 100 кДа. Образцы для анализа обращенно-фазовой HPLC отбирали после 5-, 10-, 15- и 20-кратных объемов для промывки исходного питающего объема не содержащей нуклеазы воды. Для определения количества оставшегося ЭДТА после каждого цикла промывки не содержащей нуклеазы водой буферный раствор для диафильтрации, содержащий 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА, титровали и записывали стандартную калибровочную кривую (см. табл. 3, стандартная калибровочная кривая MOPS-ЭДТА: log(y)=0,6467 log(x)+l,9128, r=0,99462, r²=0,99877, модельная кривая: log/log). Поскольку для буферного раствора MOPS абсорбционный сигнал при 260 нм отсутствует, то концентрации, приведенные в табл. 8 и табл. 9, соответствуют концентрациям ЭДТА. Эксперимент проводили при КТ 22°С. В табл. 9 данные приведены после удаления ЭДТА после каждого цикла промывки.

Как показано в табл. 9, уменьшенные количества ЭДТА в соответствии с площадью пика, определенного обращенно-фазовой HPLC, после увеличения объемов для промывки свидетельствуют о том, что для частичного удаления остаточного ЭДТА необходимыми являются минимум 10 объемов для промывки не содержащей нуклеазы воды.

Тестирование определенных параметров

В предыдущих экспериментах, проведенных при КТ, было определено минимальное число циклов для промывки с использованием буферного раствора для диафильтрации, необходимых для удаления олигонуклеотидов ДНК в ходе стадии (IIа), а также минимальное число циклов промывки с использованием воды, не содержащей нуклеазы, необходимое для удаления остаточного ЭДТА в ходе стадии (IIб). Для тестирования определенных параметров, в 500 мкг иРНК добавляли олигонуклеотиды нуклеиновой кислоты длиной 10 нуклеотидов, соответствующих 2,5 мас. % целевой молекулы иРНК, 50 нуклеотидов, соответствующих 2,5 мас. % целевой молекулы иРНК и 120 нуклеотидов, соответствующих 5 мас. % объема целевой молекулы иРНК в общем питающем объеме 5 мл (названном «до TFF» в табл. 8 и табл. 9).

Для экспериментов, описанных ниже, использовали следующие условия, если не указано иное. Питающий раствор, содержащий 0,1 мг/мл молекул иРНК, подвергали диафильтрации с использованием фильтрационной колонки mPES с MWCO 100 кДа со скоростью потока 15 мл/мин и ТМР приблизительно 40 мбар. Использованные объемы для промывки в обоих случаях составляли 10х, т.е. 10 объемов для промывки буферным раствором для диафильтрации, включающим 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА, с последующей промывкой 10 объемами не содержащей нуклеазу воды (названном «после TFF» в табл. 8 и табл. 9). Поскольку молекулы иРНК могут разлагаться при гидролизе, особенно при повышенных температурах, эксперименты проводили при 4°С, т.е. с использованием ледяной воды, для обеспечения минимального гидролиза молекул иРНК.

Данные условия привели к эффективному удалению олигонуклеотидов ДНК всех трех исследованных длин (табл. 10), а также остаточного буферного раствора для диафильтрации (табл. 11), как было показано с использованием обращенно-фазовой HPLC. Кроме того, был проведен анализ размытых пиков после капиллярного гель-электрофореза с использованием анализатора фрагментов до и после очистки (табл. 12). Анализ размытых пиков свидетельствует о том, что целостность иРНК не изменялась в ходе очистки TFF и, таким образом, условия данного способа не оказывают на нее влияния.

Определение трансляционной эффективности очищенных молекул иРНК

Кроме того, представляло значительный интерес определить трансляционную эффективность полученных очищенных молекул иРНК. Следовательно, 1,4×10⁶ клеток HEK293 высевали в 6-луночные планшеты и подвергали трансфекции 3,75 мкг молкул иРНК, очищенными, как описано выше и согласно стандартной методике, соответственно. Трансфекцию осуществляли с использованием MessengerMax (1:15). Через 24 ч клетки подвергали лизису и исследовали с использованием ЭФ ДДС-ПААГ и Вестерн-блоттинга, соответственно, с использованием в каждом случае по 50 мг клеточного лизата.

Как можно видеть на Фиг. 6, сравнимое количество молекул иРНК было детектировано с использованием Вестерн-блоттинга (А) и оценено количественно (Б).

Определение пороговой величины для удаления иРНК разных длин

В общее количество 300 мкг целевых иРНК hCFTR добавляли различные молекулы иРНК различной длины с использованием общего объема 5 мл. Прежде всего, использовали 6 различных типов молекул иРНК для добавления каждого типа, соответствующего 16,7% в расчете на объем целевых молекул иРНК. Три типа молекул иРНК содержат кэп и хвост поли(А), и характеризуются общей длиной 3632 нуклеотида, 1864 нуклеотида и 1111 нуклеотида, соответственно. Два типа не содержат ни кэп, ни хвост поли(А) и характеризуются общей длиной 494 нуклеотида и 256 нуклеотидов, соответственно. Последний тип относится к олигонуклеотиду ДНК длиной 120 нуклеотидов, который использовали в качестве положительного контроля.

Раствор, содержащий добавленные молекулы иРНК, подвергали фильтрации, как описано выше, при КТ (Фиг. 7) и при 4°С (Фиг. 8), соответственно. Образцы промывали до TFF (непосредственно после получения образца) 5, 10, 15 и 20 объемами для промывки в расчете на исходный объем образца с использованием буферного раствора для диафильтрации, как описано выше, и после дополнительной промывки с использованием 10 объемов для промывки не содержащей нуклеазы воды. Для каждого цикла промывки 100 мкл образца промывали с использованием стерильного шприца и выдерживали во льду до анализа. Прохождение через поры фильтра оценивали с использованием капиллярного гель-электрофореза с использованием анализатора фрагментов.

Как показано на Фиг. 7 и Фиг. 8, предел отсечения для молекул иРНК с длиной по меньшей мере 951 нуклеотид наблюдается с использованием колонки 100 кДатРЕ8. Для молекул иРНК длиной менее 951 нуклеотид предпочтительными являются колонки с меньшим MWCO, такие как, например, колонки mPES MWCO 50 или 70 кДа.

Увеличение концентрации молекул иРНК с 0,1 мг/мл до 1 мг/мл

В приведенной ниже конечной серии экспериментов (Фиг. 9) процедуру фильтрации, описанную ниже, применяли к раствору, включающему в качестве целевой молекулы иРНК немодифицированную иРНК tdTomato длиной 1644 нуклеотида. Прежде всего, анализировали общий объем питающего раствора, включающий 1 мг/мл молекул иРНК, соответствующих общему количеству 5 мг молекул иРНК, также олигонуклеотид ДНК длиной 15 нулеотидов и антисмысловой олигонуклеотид длиной 25 нуклеотидов, который комплементарно связывается с исследуемыми молекулами иРНК, и представляющих 2,5 мас. % целевой молекулы иРНК, и олигонуклеотиды длиной 120 нуклеотидов, представляющих 5 мас. % целевой молекулы иРНК. Такой добавленный питающий раствор подвергали диафильтрации при 4°С с использованием фильтрационной колонки mPES MWCO 100 кДа при скорости потока 15 мл/мин и ТМР приблизительно 40 мбар. Используемые объемы для промывки представляли собой i) 10 объемов не содержащей нуклеазы воды, за которым следовало ii) 10 объемов буферного раствора для диафильтрации, содержащего 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА, за которым следовало iii) 10 объемов не содержащей нуклеазы воды.

Исследовали величины размытых пиков в качестве индикатора целостности иРНК. Прежде всего, были получены следующие величины размытых пиков: предварительный размытый пик 6,4% до TFF и предварительный размытый пик 5,9% после TFF. Площади предварительных размытых пиков соответствуют доле иРНК в отношении гидролизованных продуктов. Таким образом, продукты гидролиза по данным анализа фрагментов отсутствуют и установлено, что очистка TFF не влияет на целостность иРНК.

Типичная схема определения оптимальных параметров TFF с использованием стандартных измерений

Ниже приведено краткое описание оптимизации метода TFF для специалистов в данной области техники, как описано выше, с использованием стандартных измерений

Стадия (Iа)

Скорость потока TFF можно регулировать для обеспечения достаточной скорости сдвига для рециркуляции осажденных молекул иРНК в системе TFF и для смывания осажденных молекул иРНК с поверхности фильтра. Достаточный поток фильтрата обеспечивается при открытии вентиля фильтрата. Удаление ферментов можно определить, например, электрофорезом в ДДС-ПААГ и требуемые объемы для промывки можно регулировать стандартными измерениями (предпочтительно 1-20 объемов для промывки, более предпочтительно 5-15 объемов для промывки, более предпочтительно 9-11 объемов для промывки). Один объем для промывки можно определить как объем, равный объему среды для диафильтрации, например, буферного раствора ацетата аммония рН 7, в расчете на исходный питающий объем.

Стадия (Iб)

Можно использовать аналогичные параметры, как описано на стадии (Iа). В данном случае буферный раствор можно заменять, например, на не содержащую нуклеазу воду для растворения молекул иРНК и для удаления буферного вещества (например, ацетата аммония). Удаление буферного вещества можно определить, например, при измерении проводимости, измерением поглощения в УФ, и требуемые объемы для промывки можно подбирать стандартными измерениями (предпочтительно 1-20 объемов, более предпочтительно 5-15 объемов, более предпочтительно 9-11 объемов для промывки). Один объем для промывки можно определить как объем, равный объему среды для диафильтрации, например, буферного раствора ацетата аммония рН 7, в расчете на исходный питающий объем.

Стадия (IIа)

Скорость потока TFF можно регулировать для обеспечения достаточной скорости сдвига для рециркуляции осажденных молекул иРНК в системе TFF и для смывания осажденных молекул иРНК с поверхности фильтра. Достаточный поток фильтрата обеспечивается при открытии вентиля фильтрата. Потери исследуемой иРНК можно контролировать, например, при измерении поглощения в УФ (например, измерения при выключенной или включенной системе) в линии фильтрата. Если наблюдается потеря исследуемой иРНК скорость потока и/или ТМР можно регулировать стандартными измерениями до тех пор, пока не будет наблюдаться дополнительная потеря исследуемой иРНК. Требуемые объемы для промывки можно подбирать стандартными измерениями в зависимости от количества примесей (например, незрелые транскрипты и/или продукты гидролиза) (предпочтительно 1-20 объемов, более предпочтительно 5-15 объемов, более предпочтительно 9-11 объемов для промывки). Один объем для промывки можно определить как объем, равный объему среды для диафильтрации, например, буферного раствора ацетата аммония рН 7, в расчете на исходный питающий объем.

Стадия (IIб)

Можно использовать аналогичные параметры, как описано на стадии (IIа). В данном случае буферный раствор можно заменять, например, на не содержащую нуклеазу воду для удаления буферного раствора, например, MOPS-ЭДТА. Удаление буферного раствора можно определить, например, при измерении проводимости, измерении УФ-поглощения, и требуемые объемы для промывки можно подбирать стандартными измерениями (предпочтительно 1-20 объемов, более предпочтительно 5-15 объемов, более предпочтительно 9-11 объемов для промывки). Один объем для промывки можно определить как объем, равный объему среды для диафильтрации, например, буферного раствора ацетата аммония рН 7, в расчете на исходный питающий объем.

Эксперименты по контролю ТМР могут способствовать определению оптимальных условий очистки молекул иРНК. Например, общий объем питающего раствора 5 мл, включающий концентрацию целевых молекул иРНК 1,0 мг/мл в буферном растворе для диафильтрации, использованном на стадии (IIа), как описано выше, подвергали диафильтрации с использованием фильтрационной колонки mPES MWCO 100 кДа и скоростью потока 15 мл/мин. Питающий поток измеряли в мл/мин при 6 различных величинах ТМР в интервале от приблизительно 50 мбар до приблизительно 150 мбар. Как видно на Фиг. 10 для иРНК tdTomato, оптимальное ТМР составляет приблизительно 50 мбар при скорости потока 15 мл/мин, но может зависеть от условий эксперимента.

Пример сравнения

Ниже описан пример, выполненный для сравнения результатов, полученных способом, описанным в данном контексте (подход 1) и способом, описанным в заявке WO 2015/164773 А1 (подход 2).

Подход 1

Транскрибированную in vitro немодифицированную иРНК hCFTR (см. заявку на выдачу патента США 9713626 В2, пеллет массой 5 мг) добавляли олигонуклеотиды ДНК длиной 25 нуклеотидов (нт) и 120 нуклеотидов (нт), а также молекулы иРНК глюкагон-подобного пептида 1 длиной 256 нуклеотидов (молекулы иРНК GLP-1 (SEQ ID NO: 1). Олигонуклеотиды ДНК длиной 25 нуклеотидов добавляли в иРНК в количестве 2,5% в расчете на общее количество мРНК в мкг. Олигонуклеотиды ДНК длиной 120 нуклеотидов вводили в иРНК в количестве 5,0% в расчете на общее количество мРНК в мкг.Молекулы иРНК GLP-1 длиной 256 нуклеотидов добавляли в иРНК в количестве 16% в расчете на общее количество иРНК в мкг.

Добавленные молекулы иРНК осаждали с использованием 2,5 М NH₄OAc (рН 7).

Для удаления белков, солей и незрелых транскриптов осуществляли стадию (Iа) с использованием 10 объемов для промывки 2,5 М NH₄OAc и фильтрационной колонки mPES MWCO 500 кДа, скорости потока 15 мл/мин и ТМР 200-300 мбар (концентрация иРНК: 0,5 мг/мл).

Для удаления NH₄OAc и для растворения молекул иРНК осуществляли стадию (Iб) с использованием 10 объемов для промывки не содержащей нуклеазы воды и фильтрационной колонки mPES MWCO 50 кДа, скорости потока 15 мл/мин и ТМР 200-300 мбар (концентрация иРНК: 0,5 мг/мл).

Для удаления двухвалентных катионов, незрелых транскриптов и/или продуктов гидролиза осуществляли стадию (IIа) с использованием 10 объемов для промывки 40 мМ MOPS и 10 мМ ЭДТА и фильтрационной колонки mPES с MWCO 100 кДа, скорости потока 15 мл/мин и ТМР приблизительно 20 мбар (концентрация иРНК: 1,0 мг/мл).

Для удаления буферного раствора для диафильтрации MOPS-ЭДТА осуществляли стадию (IIб) с использованием 10 объемов для промывки не содержащей нуклеазы воды и фильтрационной колонки mPES MWCO 100 кДа, скорости потока 15 мл/мин и ТМР приблизительно 20 мбар (концентрация иРНК: 1,0 мг/мл).

Полученные молекулы иРНК исследовали с использованием анализатора фрагментов/обращенно-фазовой HPLC для контроля удаления добавленных олигонуклеотидов и прибора Nanodrop для определения восстановления молекул иРНК.

Подход 2 (описанный в заявке WO 2015/164773 А1)

В транскрибированную in vitro немодифицированную иРНК hCFTR (см. заявку на выдачу патента США 9713626 В2, пеллет массой 10,26 мг) добавляли олигонуклеотиды ДНК длиной 25 нуклеотидов (нт) и 120 нуклеотидов (нт), а также молекулами иРНК глюкагон-подобного пептида 1 длиной 256 нуклеотидов (молекулы иРНК GLP-1 (SEQ ID NO: 1). Олигонуклеотиды ДНК длиной 25 нуклеотидов (нт) добавляли в иРНК в количестве 2,5% в расчете на общее количество мРНК в мкг.Олигонуклеотиды ДНК длиной 120 нуклеотидов добавляли в иРНК в количестве 5,0% в расчете на общее количество иРНК в мкг.Молекулы иРНК GLP-1 длиной 256 нуклеотидов добавляли в иРНК в количестве 16% в расчете на общее количество иРНК в мкг.

Добавленные молекулы иРНК осаждали с использованием i) тиоцианата гуанидиния, лаурилсаркозилнатрия и цитрата натрия до конечных концентраций 2,09 М тиоцианата гуанидиния, 0,26% лаурилсаркозилнатрия и 13,0 мМ цитрата натрия и ii) абсолютным этанолом до конечной концентрации ~38% ЕЮН, и инкубировали в течение 5 мин при КТ.

Нанесение осуществляли с использованием приблизительно 22 мл осажденной иРНК при скорости потока приблизительно 6 мл/мин с использованием фильтрационной колонки mPES MWCO 500 кДа (концентрация иРНК: 0,52 мг/мл).

Промывку осуществляли при повторении следующих двух стадий более 5 раз при скорости потока приблизительно 6 мл/мин с использованием фильтрационной колонки mPES MWCO 500 кДа (концентрация иРНК: 0,52 мг/мл): стадия а) промывка с использованием 5 мл 2,09 М тиоцианата гуанидиния, 0,26% лаурилсаркозилнатрия и 13,0 мМ цитрата натрия, ~38% EtOH, и стадия б) промывка с использованием 5 мл 80% этанола.

Элюирование (стадия В) осуществляли при обработке полученной твердой иРНК 5 мл не содержащей нуклеазы воды и рециркуляцией в течение 5-10 мин (с закрытым вентилем фильтрата) для обеспечения растворения. Данную процедуру повторяли до тех пор, пока при скорости потока примерно 6 мл/мин и использовании фильтрационной колонки mPES MWCO 500 кДа (концентрация иРНК: 0,52 мг/мл) не детектировали молекулы иРНК.

Диализ (стадию Г) осуществляли с использованием примерно 5 объемов для промывки, содержащих 1 мМ цитрата натрия (рН 6.4), скорости потока примерно 6 мл/мин и фильтрационной колонки mPES MWCO 500 кДа (концентрация иРНК: 0,52 мг/мл).

Полученные молекулы иРНК исследовали с использованием анализатора фрагментов/обращенно-фазовой HPLC для удаления примесей олигонуклеотидов и прибора Nanodrop для определения выхода полученных молекул иРНК.

Следует отметить, что приведенные ниже изменения использовали в случае подхода 2, описанного выше, по сравнению со способом, описанным в заявке WO 2015/164773 А1: После линейного уменьшения масштаба для поддерживания постоянной скорости сдвига в фильтрационной колонке, изначально запланированная скорость потока составляла 6 мл/мин. Однако такая скорость потока приводила к очень низкому ТМР, т.е. эффективная скорость потока фильтрта составила 0 мл/мин и диафильтрация оказалась невозможной. Поэтому скорость потока ступенчато повышали до регистрации достаточного ТМР, приводящему к значительному потоку фильтрата. Таким образом, конечная скорость потока, использованная на стадиях а) - г) находилась в интервале 20-24 мл/мин (скорость потока фильтрата от 1,1 до 1,25 мл/мин).

Результаты, показанные в табл. 13, были получены с использованием анализатора фрагментов, который проводили на неочищенных и очищенных образцах иРНК hCFTR. Соответствующие электрофореграммы представлены на Фиг. 11 для подхода 1 и на Фиг. 12 для подхода 2, соответственно.

В случае подхода 1 удаление примесей олигонуклеотидов (25 нуклеотидов и 120 нуклеотидов) в основном обеспечивалось на стадии (Iа)/(Iб). Стадия (IIа) необходима для удаления иРНК длиной 256 нуклеотидов, моделирующих длинные продукты гидролиза. На стадии (IIб) не происходит дополнительное удаление иРНК длиной 256 нуклеотидов, в свою очередь происходит удаление продуктов гидролиза и незрелых последовательностей (стадия (IIа) с использованием высокоэффективного хелатирующего агента, такого как ЭДТА.

В случае подхода 2 удаление примесей олигонуклеотидов (25 нуклеотидов и 120 нуклеотидов) наблюдалось только частично на стадиях А - В. На стадии Г олигонуклеотиды ДНК длиной 120 нуклеотидов удалялись не полностью. иРНК длиной 256 нуклеотидов, моделирующие длинные продукты гидролиза, практически полностью оставались в образце после очистки TFF. Таким образом, проведение диализа с использованием 1 мМ цитрата натрия (стадия Г) не оказывает значительного эффекта на дополнительное удаление олигонуклеотидов ДНК длиной 120 нуклеотидов, моделирующих длинные продукты гидролиза.

Ниже подробно описана последовательность иРНК длиной 256 нуклеотидов, использованная в данном контексте.

SEQ ID No: 1

Последовательность кодон-оптимизированного GLP-1

часть промотера Т7, С: этрис минимальный 5'UTR, за которым следует дополнительный нуклеотид U, TISU 5'UTR, стартовый кодон, последовательность иРНКкодон-оптимизированного GLP-1, стоп-кодон. часть участка рестрикции EcoRI.

Для экспериментов с добавлением олигонуклеотидов использовали не-полиаденилированную иРНК.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ очистки молекул иРНК и способ получения фармацевтической композиции, включающий стадию очистки иРНК вышеуказанным способом очистки молекул иРНК. Способ очистки включает стадии (Iа) очистки осажденных молекул иРНК из суспензии, включающей осажденные молекулы иРНК, с использованием первого раствора, (Iб) промывки и растворения очищенных осажденных молекул иРНК, полученных на стадии (Iа), с использованием второго раствора, (IIа) очистки молекул иРНК из растворенных молекул иРНК, полученных на стадии (Iб), с использованием третьего раствора, включающего хелатирующий агент, и (IIб) промывки очищенных молекул иРНК, полученных на стадии (IIа) с использованием четвертого раствора. Стадии (Iа)-(IIб) проводят с использованием фильтрации в тангенциальном потоке. Изобретение расширяет арсенал высокопроизводительных способов получения очищенных молекул иРНК. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 12 ил., 13 табл., 1 пр.

1. Способ очистки молекул иРНК, где указанный способ включает

(Iа) очистку осажденных молекул иРНК из суспензии, включающей осажденные молекулы иРНК, с использованием первого раствора,

(Iб) промывку и растворение очищенных осажденных молекул иРНК, полученных на стадии (Iа), с использованием второго раствора,

(IIа) очистку молекул иРНК из растворенных молекул иРНК, полученных на стадии (Iб), с использованием третьего раствора, включающего хелатирующий агент, а затем

(IIб) промывку очищенных молекул иРНК, полученных на стадии (IIа) с использованием четвертого раствора,

где стадии (Iа)-(IIб) проводят с использованием фильтрации в тангенциальном потоке.

2. Способ по п. 1, где хелатирующим агентом является ЭДТА.

3. Способ по п. 1 или 2, где значение рН третьего раствора находится в интервале от 1 до 10.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где третий раствор включает буферное вещество MOPS.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадии (Iа)-(IIб) проводят при температуре от 0°С до 25°С.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где перед стадией (Iа) указанную суспензию получают с использованием ацетата аммония для осаждения молекул иРНК, и где первый раствор содержит ацетат аммония.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где второй раствор представляет собой воду или где четвертый раствор представляет собой воду или включает хлорид и/или цитрат натрия.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где молекулы иРНК содержатся в концентрате после фильтрации в тангенциальном потоке.

9. Способ по п. 8, где концентрат, полученный на стадии (Iа), используют в качестве питающего потока раствора для фильтрации в тангенциальном потоке на стадии (Iб), концентрат, полученный на стадии (Iб), используют в качестве питающего потока раствора на стадии (IIа), и концентрат, полученный на стадии (IIа), используют в качестве питающего раствора на стадии (IIб).

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где молекулы иРНК, содержащиеся в суспензии, получают транскрипцией in vitro.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ дополнительно включает дефосфорилирование и/или полиаденилирование и/или пост-кэппинг молекул иРНК.

12. Способ по п. 11, где способ включает дефосфорилирование молекул иРНК, полученных на стадии (Iб), с последующим выполнением этапов (Iа)-(IIб), с последующим полиаденилированием полученных молекул мРНК, с последующим выполнением стадий (Iа)-(IIб).

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где в случае стадии (Iа) для фильтрации в тангенциальном потоке используют фильтрационную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе от 300 кДа до 0,65 мкм, и/или где в случае стадий (Iб) и (IIб) используют фильтрационную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе 1 кДа до 0,65 мкм, и/или в случае стадии (IIа) используют фильтрационную мембрану с пределом отсечения по молекулярной массе по меньшей мере 70 кДа.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где объем диафильтрации любого первого, второго, третьего и/или четвертого раствора составляет 1-кратный объем суспензии на стадии (Iа).

15. Способ получения фармацевтической композиции, включающий

(а) очистку молекул иРНК способом по любому из пп. 1-14 и

(б) переработку полученных таким образом молекул иРНК в фармацевтическую композицию.