СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕНАЛЬНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ И СОДЕРЖАЩЕЕ ИХ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2019 года по МПК C12N5/71 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в ренальные клетки-предшественники (или клетки-предшественники почки). Настоящее изобретение также относится к терапевтическому лекарственному средству против заболеваний почек, содержащему полученные таким образом ренальные клетки-предшественники.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Почка является важным органом, который обладает функциями для поддержания физического здоровья посредством удаления, через фильтрацию, продуктов выделения, таких как опасные или вредные вещества, образованные в результате метаболической активности внутри живых организмов, из крови. Примером заболевания почек является почечная недостаточность, и примером терапевтического способа для него является диализ. Однако нагрузка, налагаемая расходами на медицинское обслуживание, необходимое для такой терапии, является высокой, и таким образом, почечная недостаточность еще является общемировой проблемой, не только в медицинской перспективе, но также в медицинском экономическом аспекте. Другим примером способов терапии для почечной недостаточности является трансплантация почек, хотя недостаток донорских органов является серьезным проблемным вопросом.

В то же время, опубликованы плюрипотентные клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки (клетки ES) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (клетки iPS), которые можно получать посредством введения специфических для недифференцированных клеток генов в соматические клетки (Патентные документы 1 и 2). В качестве терапевтического способа для почечной недостаточности, таким образом, исследовали терапию, включающую в себя трансплантацию ренальных клеток, полученных посредством индукции дифференцировки этих плюрипотентных стволовых клеток. Кроме того, рассматривают также разработку терапевтических лекарственных средств с использованием гомогенных ренальных клеток, происходящих из этих плюрипотентных стволовых клеток.

Почки млекопитающих образуются посредством трех стадий развития почки - пронефроса, мезонефроса и метанефроса. Известно, что среди этих стадий метанефрос образуется в задней области промежуточной мезодермы. В этом контексте, изучали способы индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши в промежуточную мезодерму с целью нефрогенеза (Непатентный документ 1), и OSR1 подтвердили в качестве маркера, характерного для промежуточной мезодермы. Кроме того, в исследовании с использованием клеток iPS человека («клетки iPS человека с репортером OSR1-GFP»), в которые ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) вводили с использованием вектора бактериальной искусственной хромосомы (BAC) посредством гомологичной рекомбинации с эндогенным аллелем OSR1, индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в промежуточную мезодерму успешно достигали с использованием активина A, Wnt, BMP и множества низкомолекулярных соединений (Непатентный документ 2 и Патентный документ 3).

При рассмотрении трансплантации в ткани почки, является предпочтительным индуцировать ренальные клетки-предшественники на более поздней стадии дифференцировки в почку, чем стадия промежуточной мезодермы. SIX2 известен как фактор, характеризующий ренальные клетки-предшественники (Непатентный документ 4). Однако не существует разработанного способа искусственной индукции ренальных клеток-предшественников из промежуточной мезодермы.

ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Патентные документы

Патентный документ 1: патент США No. 5843780

Патентный документ 2: WO2007/069666

Патентный документ 3: WO2012/011610

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Mae S, et al. (2010), Biochem Biophys Res Commun. 393: 877-82

Непатентный документ 2: Mae S, et al. (2013), Nat Commun. 4: 1367

Непатентный документ 3: Osafune K, et al. (2006), Development. 133: 151-61

Непатентный документ 4: Kobayashi A, et al. (2008), Cell Stem Cell. 3: 169-81

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является предоставление способа индукции дифференцировки клеток промежуточной мезодермы в ренальные клетки-предшественники, более конкретно, для предоставления способа индукции дифференцировки клеток промежуточной мезодермы в ренальные клетки-предшественники, включающего в себя стадию индукции клеток промежуточной мезодермы, индуцированных из плюрипотентных стволовых клеток, в ренальные клетки-предшественники.

Авторы настоящего изобретения провели исследования, сконцентрированные на достижении указанной выше цели. В результате, авторы настоящего изобретения обнаружили, впервые, что является возможным индуцировать дифференцировку клеток промежуточной мезодермы в ренальные клетки-предшественники посредством культивирования клеток промежуточной мезодермы в среде, содержащей активатор передачи сигнала TGFβ и ингибитор BMP. Настоящее изобретение завершено на основании таких обнаружений.

Конкретно, настоящее изобретение относится к следующим признакам.

[1] Способ получения ренальных клеток-предшественников из клеток промежуточной мезодермы, включающий в себя следующую стадию: культивирование клеток промежуточной мезодермы в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и ингибитор(ы) BMP, индуцируя таким образом ренальные клетки-предшественники из клеток промежуточной мезодермы.

[2] Способ по [1], где ренальные клетки-предшественники представляют собой положительные по SIX2 клетки.

[3] Способ по [1] или [2], где клетки промежуточной мезодермы представляют собой положительные по OSR1 клетки.

[4] Способ по любому из [1]-[3], где активатор передачи сигнала TGFβ представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, IDE1 и IDE2.

[5] Способ по любому из [1]-[4], где ингибитор BMP представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из дорсоморфина, ноггина, LDN193189 и DMH1.

[6] Способ по любому из [1]-[3], где активатор передачи сигнала TGFβ представляет собой TGFβ1, и ингибитор BMP представляет собой DMH1.

[7] Способ по любому из [1]-[6], где клетки промежуточной мезодермы представляют собой клетки промежуточной мезодермы, индуцированные из плюрипотентных стволовых клеток.

[8] Способ по [7], где клетки промежуточной мезодермы представляют собой клетки промежуточной мезодермы, полученные способом, включающим в себя следующие стадии:

(i) культивирование плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из активина A, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты; и

(ii) культивирование клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из BMP7, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты.

[9] Способ по [8], где стадия (ii) включает следующие стадии:

(ii-1) культивирование клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из BMP7 и ингибитора(ингибиторов) GSK-3β; и

(ii-2) культивирование клеток, полученных на стадии (ii-1), в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из активатора(активаторов) передачи сигнала TGFβ и производного(производных) ретиноевой кислоты.

[10] Способ по [9], где стадия (ii-1) представляет собой стадию проведения культивирования в среде, содержащей BMP7 и ингибитор(ы) GSK-3β, и стадия (ii-2) представляет собой стадию проведения культивирования в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и производное(производные) ретиноевой кислоты.

[11] Способ по любому из [8]-[10], где ингибитор GSK3β представляет собой CHIR99021.

[12] Способ по любому из [8]-[11], где производное ретиноевой кислоты представляет собой AM580 или TTNPB.

[13] Способ по любому из [7]-[12], где плюрипотентные стволовые клетки представляют собой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS).

[14] Способ по [13], где клетки iPS представляют собой клетки iPS человека.

[15] Способ получения ренальных клеток-предшественников из плюрипотентных стволовых клеток, включающий в себя следующие стадии:

(i) культивирование плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из активина A, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты;

(ii) культивирование клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из BMP7, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты; и

(iii) культивирование клеток, полученных на стадии (ii), в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и ингибитор(ы) BMP.

[16] Способ по [15], где ренальные клетки-предшественники представляют собой положительные по SIX2 клетки.

[17] Способ по [15] или [16], где клетки, полученные на стадии (ii), представляют собой положительные по OSR1 клетки.

[18] Способ по любому из [15]-[17], где активатор передачи сигнала TGFβ представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, IDE1, и IDE2.

[19] Способ по любому из [15]-[18], где ингибитор BMP представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из дорсоморфина, ноггина, LDN193189 и DMH1.

[20] Способ по любому из [15]-[17], где активатор передачи сигнала TGFβ представляет собой TGFβ1, и ингибитор BMP представляет собой DMH1.

[21] Способ по любому из [15]-[20], где стадия (ii) включает в себя следующие стадии:

(ii-1) культивирование клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из BMP7 и ингибитора(ингибиторов) GSK-3β; и

(ii-2) культивирование клеток, полученных на стадии (ii-1), в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из активатора(активаторов) передачи сигнала TGFβ и производного(производных) ретиноевой кислоты.

[22] Способ по [21], где стадия (ii-1) представляет собой стадию проведения культивирования в среде, содержащей BMP7 и ингибитор(ы) GSK-3β, и стадия (ii-2) представляет собой стадию проведения культивирования в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и производное(производные) ретиноевой кислоты.

[23] Способ по любому из [15]-[22], где ингибитор GSK3β представляет собой CHIR99021.

[24] Способ по любому из [15]-[23], где производное ретиноевой кислоты представляет собой AM580 или TTNPB.

[25] Способ по любому из [15]-[24], где плюрипотентные стволовые клетки представляют собой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS).

[26] Способ по [25], где клетки iPS представляют собой клетки iPS человека.

[27] Ренальная клетка-предшественник, полученная способом по любому из [1]-[26].

[28] Фармацевтическая композиция, содержащая ренальные клетки-предшественники, полученные способом по любому из [1]-[26].

[29] Терапевтическое лекарственное средство против заболеваний почек, содержащее ренальные клетки-предшественники, полученные способом по любому из [1]-[26].

[30] Способ лечения заболевания почек, включающий в себя стадию введения ренальных клеток-предшественников, полученных способом по любому из [1]-[26], нуждающемуся в лечении пациенту.

[31] Ренальная клетка-предшественник, полученная способом по любому из [1]-[26], для применения в лечении заболеваний почек.

[32] Применение ренальных клеток-предшественников, полученных способом по любому из [1]-[26], в изготовлении фармацевтической композиции для лечения заболеваний почек.

По настоящему изобретению, впервые стала возможной искусственная индукция ренальных клеток-предшественников из клеток промежуточной мезодермы. Кроме того, по настоящему изобретению, впервые стала возможной искусственная индукция ренальных клеток-предшественников из плюрипотентных стволовых клеток (например, клеток iPS). Кроме того, подтверждено, что ренальные клетки-предшественники, полученные способом по настоящему изобретению, являются эффективными для лечения в моделях заболеваний почек на животных. Ренальные клетки-предшественники, полученные способом по настоящему изобретению, можно использовать в лечении или регенеративной медицине для заболеваний почек, включая почечную недостаточность.

В настоящем описании приведено содержание, описанное в описаниях и/или фигурах из Патентных заявок No. 2013-123072 (Дата подачи: 11 июня 2013 года) и 2014-92108 (Дата подачи: 25 апреля 2014 года), приоритет которых испрашивается по настоящей заявке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1, включая фиг. 1A-1D, показано содержание положительных по SIX2 клеток, индуцированных посредством дифференцировки в примерах 2-4. На фиг. 1A показаны результаты культивирования в среде, содержащей DMSO, в качестве контроля. На фиг. 1B показаны результаты индукции дифференцировки способом индукции 1 (пример 2). На фиг. 1C показаны результаты индукции дифференцировки способом индукции 2 (пример 3). На фиг. 1D показаны результаты индукции дифференцировки способом индукции 3 (пример 4). На каждой фигуре, tdTomato представляет собой репортерный ген.

На фиг. 2, включая фиг. 2A-2H, показано содержание положительных по SIX2 клеток, индуцированных посредством дифференцировки в примере 5. На фиг. 2A показан результаты культивирования в среде, содержащей DMSO, в качестве контроля. На фиг. 2B, 2C, и 2D показаны результаты, полученные с использованием ноггина, LDN193189 и DMH1, соответственно, вместо дорсоморфина, на стадии 3 способа индукции 1. На фиг. 2E и 2F показаны результаты, полученные с использованием IDE1 и IDE2, соответственно, вместо TGFβ1, на стадии 3 способа индукции 1. На фиг. 2G показаны результаты, полученные с использованием TGFβ2 и LDN193189 на стадии 3 способа индукции 1. на фиг. 2H показаны результаты, полученные с использованием TGFβ3 и LDN193189 на стадии 3 способа индукции 1.

На фиг. 3, включая фиг. 3A и 3B, показан пример способа получения OSR1+SIX2+ ренальных клеток-предшественников из клеток iPS человека. На фиг. 3A показан способ дифференцировки в OSR1+SIX2+ ренальные клетки-предшественники с использованием трехмерной культуры EB (эмбриоидных телец). На фиг. 3B показаны результаты анализа характера дифференцировки OSR1+SIX2+ клеток с течением времени, измеренного посредством проточной цитометрии, и конкретно, результаты двумерного распределения популяции клеток (n=5). На фиг. 3C показаны результаты анализа экспрессии мРНК с течением времени для каждого из генов, показанных в популяциях дифференцированных клеток. На каждом графике показаны уровни экспрессии гена относительно уровней экспрессии β-актина от суток 1 до суток 28 (n=3). На фиг. 3D показаны результаты анализа характера дифференцировки OSR1+SIX2+ клеток с течением времени, измеренного посредством проточной цитометрии в примере 7, и более конкретно, результаты анализа популяций клеток с течением времени (n=5). На фиг. 3D, на d1 показаны результаты для клеток iPS на сутки 1, и на d3 показаны результаты для EB (сутки 3), полученные в среде (стадия 1), содержащей CHIR99021 и активин A. На фиг. 3D, на d6-d28 показаны результаты для группы с DMSO (обозначенной как «DMSO») и для группы обработки TGFβ1+TTNPB (обозначенной как «Tx») от суток 6 до суток 28, соответственно. Клетки культивировали в среде, содержащей CHIR99021 и BMP7, на стадии 2 в течение 3 суток (сутки 3 - сутки 6), а затем разделяли на группу DMSO и группу Tx на сутки 6, с последующим культивированием на стадиях 3 и 4. Для группы DMSO, клетки культивировали в среде, содержащей DMSO вместо TGFβ1 и TTNPB, на стадии 3 (где среду заменяли на такую же среду на сутки 8), а затем культивировали в среде, содержащей DMSO вместо TGFβ1 и DMH1, на стадии 4 (где среду заменяли на такую же среду каждые 3 суток). На фиг. 3E показана экспрессия маркеров ренальных клеток-предшественников на OSR1+SIX2+ ренальных клетках-предшественниках, дифференцированных из 4A6C3-10 на сутки 28 культивирования.

На фиг. 4 показаны эффекты каждой комбинации активаторов передачи сигнала TGFβ и ингибиторов BMP на индукцию OSR1+SIX2+ клеток из клеток iPS человека. Данные выражены как среднее ± S.E.M (n=5).

На фиг. 5, включая фиг. 5A и 5B, показаны результаты индукции дифференцировки способом индукции 4 с использованием различных клеток iPS человека и клеток ES человека (т.е., уровни экспрессии OSR1 (фиг. 5A) и уровни экспрессии SIX2 (фиг. 5B)). Результаты представляют собой уровни экспрессии OSR1 и SIX2 в каждых клетках относительно уровней экспрессии в 4A6C3-10.

На фиг. 6, включая фиг. 6A-6F, показаны результаты тестов оценки ренальных клеток-предшественников. На фиг. 6A показаны изображения при иммуноокрашивании OSR1+SIX2+ клеток после культивирования в среде REGM в течение 7 суток. На этой фигуре, нефрин представляет собой маркер гломерулярных подоцитов, AQP1 и мегалин представляют собой маркеры проксимальных канальцев, и уромукоид представляет собой маркер петли Генле. Эти маркеры окрашены розовым, и ядра окрашены синим. Масштабная линейка составляет 50 мкм. На фиг. 6B показано микроскопическое изображение (левая панель) и изображения при иммуноокрашивании (оставшиеся 3 панели) после 7-суточного совместного культивирования OSR1+SIX2+ клеточной массы и экспрессирующих Wnt4 NIH3T3. На фиг. 6C показано микроскопическое изображение (левая панель) и изображения при иммуноокрашивании (оставшиеся 3 панели) после 7-суточного совместного культивирования OSR1+SIX2+ клеточной массы и спинного мозга эмбрионов E11,5 мыши. На фиг. 6D показаны изображения при иммуноокрашивании после органного культивирования OSR1+SIX2+ клеточной массы и метанефрических клеток эмбрионов E11,5 мыши. На фиг. 6E показано изображение при иммуноокрашивании после трансплантации OSR1+SIX2+ клеточной массы в эпидидимальную жировую ткань NOD. CB17-Prkdc^scid/J. На этой фигуре WT1 и подокаликсин (PODX) представляют собой маркеры гломерулярных подоцитов (красный и розовый, соответственно), LTL представляет собой маркер проксимальных канальцев (красный), ламинин представляет собой маркер поляризованного эпителия (розовый), CDH1 представляет собой маркер дистальных канальцев (розовый), CDH6 представляет собой маркер почечных везикул (розовый), и HuNu представляет собой человеческое ядро (зеленый), в то время как мышиное ядро окрашено синим, и масштабная линейка составляет 50 мкм. На фиг. 6F показаны микроскопические изображения (левые панели) после 7-суточного органного культивирования каждой клеточной массы происходящих из клеток iPS фракций (OSR1-SIX2-, OSR1+SIX2-, OSR1-SIX2+ и OSR1+SIX2+) и зачатка мочеточника E11,5 мыши, и изображение при иммуноокрашивании (правая панель) после совместного культивирования клеточной массы OSR1+SIX2+ и зачатка мочеточника. На этой фигуре, DBA представляет собой маркер зачатка мочеточника (красный), и масштабная линейка составляет 50 мкм. HuNu представляет человеческое ядро (зеленый), в то время как мышиное ядро окрашено синим.

На фиг. 7, включая фиг. 7A-7D, показаны результаты экспериментов по трансплантации в моделях заболевания почек на мышах. На фиг. 7A и 7B показаны изображения при иммуноокрашивании срезов почек для моделей на мышах острой почечной недостаточности (AKI) (фиг. 7A) и для моделей на мышах хронической почечной недостаточности (фиг. 7B), где модели находятся на двух неделях после трансплантации OSR1+SIX2+ клеточной массы в паренхиму почки. LTL и AQP1 представляют собой маркеры проксимальных канальцев, которые окрашены зеленым и красным, соответственно. HuNu представляет человеческое ядро (розовый). Масштабная линейка составляет 50 мкм. На фиг. 7C показан результаты анализов уровней BUN и уровней Cr в сыворотке с течением времени для моделей AKI на мышах, подвергнутых ренальной субкапсулярной трансплантации hiPSC-RP (n=10, iPSC-RPs, треугольники), недифференцированных клеток iPS человека (n=10, iPSCs, квадраты) или физиологического солевого раствора (n=10, солевой раствор, круги) [*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 по сравнению с солевым раствором]. На фиг. 7D показаны гистологические обнаружения для тканей почки, полученных из мыши, подвергнутой трансплантации hiPSC-RP (iPSC-RPs) или физиологического солевого раствора (солевой раствор). Ткани почки окрашивали периодной кислотой-реактивом Шиффа (PAS, верхние панели) или трихромом по Массону (MT, нижние панели) на сутки 3 после ишемии-реперфузии (I/R). На фиг. 7E показаны результаты определения площади расширенных канальцев с цилиндрами или фиброза в почках хозяина на сутки 3 после I/R [**P < 0,01 по сравнению с солевым раствором, n=3 на группу].

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение подробно описано ниже.

Настоящее изобретение относится к способу получения ренальных клеток-предшественников, включающему в себя стадию культивирования клеток промежуточной мезодермы в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и ингибитор(ы) BMP.

Термин «клетки промежуточной мезодермы», как используют в настоящем документе, относится к любым клеткам, из которых индуцируют ренальные клетки-предшественники при культивировании в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и ингибитор(ы) BMP по изобретению. Примеры известных способов получения клеток промежуточной мезодермы включают в себя способы индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека в клетки промежуточной мезодермы (Непатентные документы 1 и 2, и Патентный документ 3). OSR1 известен также в качестве маркера, характеризующего клетки промежуточной мезодермы, и примеры клеток промежуточной мезодермы, используемых в способе по изобретению, включают в себя клетки промежуточной мезодермы, которые являются положительными по OSR1. Например, является возможным культивировать плюрипотентные стволовые клетки (например, клетки iPS человека с репортером OSR1-GFP, описанные в примерах ниже), обладающие репортерным геном (например, GFP), введенным под контролем промотора OSR1, а затем выделять клетки промежуточной мезодермы, которые являются положительными по OSR1, с использованием, в качестве показателя, экспрессии репортерного гена, известными в данной области способами (например, способами с использованием сортировщика клеток). Также возможно подтверждать экспрессию OSR1 в клетках промежуточной мезодермы с использованием способов анализа экспрессии генов, таких как количественная RT-PCR (Nat 4 Commun, 1367, (2013)). По настоящему изобретению, клетки промежуточной мезодермы, являющиеся положительными по OSR1, включают в себя клетки, экспрессирующие белок OSR1, и клетки, экспрессирующие белок, кодируемый геном под контролем промотора OSR1. По настоящему изобретению, примеры OSR1 включают в себя гены, обладающие нуклеотидными последовательностями под No. доступа в NCBI NM_145260.2 (человек) и NM_011859.3 (мышь), белки, кодируемые генами, и природные варианты, обладающие функциями таких генов. Предпочтительно, клетки промежуточной мезодермы, используемые в способе по изобретению, представляют собой отрицательные по SIX2 и положительные по OSR1 клетки.

По настоящему изобретению, ренальные клетки-предшественники представляют собой клетки, с которыми можно проводить манипуляции, как с клетками, эквивалентными клеткам-предшественникам нефрона, и можно проводить их дифференцировку in vitro в органные структуры, такие как гломерулоподобная структура и канальцеподобная структура почки. Способность к дифференцировке в органную структуру можно оценивать, например, способом, описанным в Osafune K, et al. (2006), Development 133: 151-61. Известным характерным фактором для поддержания состояния клеток-предшественников нефрона является SIX2 (Непатентный документ 4). Примеры ренальных клеток-предшественников, индуцированных способом по изобретению, включают в себя положительные по SIX2 ренальные клетки-предшественники. Например, является возможным культивировать плюрипотентные стволовые клетки (например, клетки iPS человека с репортерами OSR1-GFP и SIX2-tdTomato, как описано в примерах ниже), обладающие репортерным геном (например, tdTomato), введенным под контролем промотора SIX2, а затем выделять положительные по SIX2 ренальные клетки-предшественники с использованием, в качестве показателя, экспрессии репортерного гена, известными в данной области способами (например, способами с использованием сортировщика клеток). Также возможно подтверждать экспрессию SIX2 в ренальных клетках-предшественниках способами анализа экспрессии генов, такими как количественная RT-PCR (Nat 4 Commun 1367, (2013)). По настоящему изобретению, положительные по SIX2 ренальные клетки-предшественники включают в себя клетки, экспрессируюшие белок SIX2, и клетки, экспрессирующие белок, кодируемый геном под контролем промотора SIX2. По настоящему изобретению, примеры SIX2 включают в себя гены, обладающие нуклеотидными последовательностями под No. доступа в NCBI NM_016932.4 (человек) и NM_011380.2 (мышь), белки, кодируемые этими генами, и природные варианты, обладающие функциями таких генов. Предпочтительно, ренальные клетки-предшественники, индуцированные способом по изобретению, представляют собой положительные по OSR1 и положительные по SIX2 клетки.

По настоящему изобретению, клетки промежуточной мезодермы или ренальные клетки-предшественники можно предоставлять в форме популяции клеток, содержащей другие виды клеток, или очищенной популяции клеток, и в этом случае, предпочтительно, клетки промежуточной мезодермы или ренальные клетки-предшественники содержатся в количестве 5% или более, 6% или более, 7% или более, 8% или более, 9% или более, и 10%, 20%, 28% или 30% или более в популяции клеток.

В способе по изобретению, промежуточную мезодерму можно культивировать в суспензионной культуре или в адгезионной культуре с использованием чашек для культивирования с покрытием в состоянии отдельных клеток, которые в значительной степени диссоциированы (или разделены) с использованием любого способа, или в состоянии клеточной массы, в которой клетки соединены друг с другом. В настоящем документе, способы диссоциации клеток промежуточной мезодермы включают в себя, например, способы механической диссоциации и способы диссоциации с использованием раствора для диссоциации, обладающего протеазной активностью и коллагеназной активностью (например, раствора, содержащего трипсин и коллагеназу, такого как Accutase (TM) или Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc.)), или раствора для диссоциации, обладающего только коллагеназной активностью.

Суспензионная культура, используемая в способе по настоящему изобретению, обозначает культивирование клеток неадгерентным способом в чашке для культивирования. Примеры чашек для культивирования, которые можно использовать, включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, чашку для культивирования без искусственной обработки (например, покрытия внеклеточным матриксом или т.п.) для улучшения адгезии клеток, и чашку для культивирования, искусственным способом обработанную для предотвращения адгезии (например, покрытую поли(гидроксиэтилметакрилатом) (поли-HEMA)).

Адгезионная культура, используемая в способе по настоящему изобретению, обозначает культивирование клеток в чашке для культивирования с покрытием. Примеры покрывающих средств включают в себя матригель (BD Biosciences), синтемакс (Corning), коллаген, желатин, ламинин, гепарансульфатный протеогликан, энтактин и их сочетания. Предпочтительно, покрывающие средства представляют собой матригель, синтемакс или желатин.

Среду, используемую на стадии культивирования клеток промежуточной мезодермы по изобретению, можно получать посредством добавления активатора(активаторов) передачи сигнала TGFβ и ингибитора(ингибиторов) BMP к минимальной среде для культивирования клеток животных. Примеры минимальной среды включают в себя IMDM, среду 199, минимальную поддерживающую среду Игла (EMEM), αMEM, модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), среду Хэма (F12), RPMI 1640, среду Фишера и их смеси. Среда может содержать сыворотку (например, эмбриональную телячью сыворотку (FBS)) или может являться бессывороточной. При необходимости, среда может содержать один или несколько заменителей сыворотки, таких как альбумин, трансферрин, нокаутный заменитель сыворотки (KSR) (заменитель сыворотки для культуры клеток ES) (Invitrogen), добавку N2 (Invitrogen), добавку B27 (Invitrogen), жирные кислоты, инсулин, предшественники коллагена, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол и 3’-тиоглицерин, и она может дополнительно содержать одно или несколько других веществ, таких как липиды, аминокислоты, L-глутамин, GlutaMAX (Invitrogen), заменимые аминокислоты (NEAA), витамины, фактор роста, антибиотик, антиоксидант, пировиноградная кислота, забуферивающие средства, неорганические соли и их эквиваленты. В одном из вариантов осуществления минимальная среда представляет собой смесь, содержащую DMEM и F12 при 1:1 (DMEM/F12), дополненную GlutaMAX, KSR, заменимыми аминокислотами, 2-меркаптоэтанолом и антибиотиком.

Активатор передачи сигнала TGFβ, используемый по настоящему изобретению, конкретно не ограничен при условии, что он активирует путь передачи сигнала TGFβ. Примеры активаторов передачи сигнала TGFβ включают в себя белки, такие как TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3 (доступные из Peprotech, R&D и т.д.), и соединения, такие как IDE1 ((Z)-2-((2-(6-карбоксигексаноил)гидразоно)метил)бензойная кислота) и IDE2 (7-(2-циклопентилиденгидразинил)-7-оксогептановая кислота) (Borowiak M, et al, Cell Stem Cell. 2009, 4: 348-58). IDE1 и IDE2 доступны из Stemgent, Tocris, и т.д. Предпочтительным активатором передачи сигнала TGFβ является TGFβ1.

По настоящему изобретению, концентрацию активатора передачи сигнала TGFβ может соответствующим образом определять специалист в данной области в зависимости от подлежащих использованию активаторов передачи сигнала TGFβ. Когда белок, такой как TGFβ1, TGFβ2 или TGFβ3, используют в качестве активатора передачи сигнала TGFβ, его концентрация составляет, например, 0,1 нг/мл - 100 нг/мл, предпочтительно, 1 нг/мл - 10 нг/мл, более предпочтительно, 5 нг/мл - 10 нг/мл. Кроме того, когда IDE1 или IDE2 используют в качестве активатора передачи сигнала TGFβ, его концентрация составляет 1 мкМ - 100 мкМ, предпочтительно, 25 мкМ - 75 мкМ, более предпочтительно, 40 мкМ - 60 мкМ.

Ингибитор BMP, используемый по настоящему изобретению, конкретно не ограничен при условии, что он ингибирует путь передачи сигнала BMP (морфогенетического белка кости). Примеры ингибитора BMP включают в себя: ингибиторные белки, такие как хордин, ноггин и фоллистатин; дорсоморфин (6-[4-(2-пиперидин-1-илэтокси)фенил]-3-пиридин-4-илпиразоло[1,5-a]пиримидин) и его производные (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4: 33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3 (8): e2904); DMH1 (4-[6-(4-изопропоксифенил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил]хинолон, 4-[6-[4-(1-метилэтокси)фенил]пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил]-хинолин); и LDN193189 (4-(6-(4-(пиперазин-1-ил)фенил)пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-ил)хинолин). Дорсоморфин и LDN193189 являются коммерчески доступными из Sigma-Aldrich, Stemgent, Merck, Axon Medchem, Peprotech, и т.д. Предпочтительно, ингибитор BMP представляет собой DMH1, ноггин, LDN193189 или дорсоморфин, более предпочтительно DMH1.

По настоящему изобретению, используемую концентрацию ингибитора BMP может соответствующим образом определять специалист в данной области в зависимости от ингибиторов BMP, подлежащих использованию. Когда ингибиторный белок, такой как хордин, ноггин или фоллистатин, используют в качестве ингибитора BMP, его концентрация составляет, например, 0,1 нг/мл - 1000 нг/мл, предпочтительно, 1 нг/мл - 500 нг/мл, более предпочтительно, 10 нг/мл - 100 нг/мл. Кроме того, когда дорсоморфин, DMH1 или LDN193189 используют в качестве ингибитора BMP, их концентрация составляет 0,01 мкМ - 100 мкМ, предпочтительно, 0,1 мкМ - 10 мкМ, более предпочтительно, 0,5 мкМ - 1 мкМ.

На стадии культивирования клеток промежуточной мезодермы по изобретению, любой один из или любую комбинацию из FGF9, FGF20, BMP7, производного ретиноевой кислоты и ингибитора GSK-3β можно добавлять в минимальную среду.

По настоящему изобретению, не существует верхнего предела суток культивирования на стадии культивирования клеток промежуточной мезодермы, поскольку длительное культивирование значительно не влияет на эффективность получения ренальных клеток-предшественников. Количество суток культивирования составляет, например, 2 суток или более, 4 суток или более, 6 суток или более, 8 суток или более, 10 суток или более, 11 суток или более, 12 суток или более, 13 суток или более, 14 суток или более, 15 суток или более, 16 суток или более, 17 суток или более, 18 суток или более, 19 суток или более, или 20 суток или более.

На стадии культивирования клетки промежуточной мезодермы, температура культивирования составляет, но без ограничения, от приблизительно 30°C до приблизительно 40°C и предпочтительно, приблизительно 37°C. Культивирование проводят в атмосфере содержащего CO₂ воздуха. Концентрация CO₂ предпочтительно составляет от приблизительно 2% до приблизительно 5%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки промежуточной мезодермы представляют собой клетки промежуточной мезодермы, индуцированные из плюрипотентных стволовых клеток. В этом случае, можно выделять индуцированные клетки промежуточной мезодермы, с последующей индукцией ренальных клеток-предшественников из выделенных клеток промежуточной мезодермы на стадии культивирования по настоящему изобретению. Альтернативно, клетки промежуточной мезодермы можно индуцировать из плюрипотентных стволовых клеток, с последующим подверганием клеток промежуточной мезодермы прямому культивированию, без их выделения, на стадии культивирования по настоящему изобретению, так чтобы индуцировать ренальные клетки-предшественники.

Когда клетки промежуточной мезодермы являются выделенными, можно использовать плюрипотентные стволовые клетки, обладающие репортерным геном, экспрессированным под контролем эндогенного промотора OSR1. Примером способа введения репортерного гена под контролем промотора OSR1 в плюрипотентные стволовые клетки является гомологичная рекомбинация с использованием вектора BAC или т.п., которая описана, например, в WO2012/011610. Кроме того, чтобы выделять индуцированные ренальные клетки-предшественники, можно использовать плюрипотентные стволовые клетки, обладающие репортерным геном, экспрессированным под контролем промотора SIX2. Такие плюрипотентные стволовые клетки можно получать способами, описанными выше. Примеры репортерного гена, подлежащего использованию, включают в себя гены, кодирующие известные репортерные белки, такие как β-галактозидаза, β-глюкозидаза, люцифераза, зеленый флуоресцентный белок (GFP), tdTomato и белки клеточной поверхности. Клетки промежуточной мезодермы или ренальные клетки-предшественники, индуцированные из вышеуказанных плюрипотентных стволовых клеток, можно выделять известными в данной области способами, такими как способ с использованием сортировщика клеток, использующего экспрессию репортерного белка в качестве показателя, способ сортировки клеток с использованием антитела против белка клеточной поверхности посредством магнитных свойств магнитных бусин (например, MACS) и способ с использованием носителя, на котором иммобилизовано антитело или т.п. (например, колонки для обогащения клеток).

Термин «плюрипотентные стволовые клетки», как используют в настоящем документе, относится к стволовым клеткам, обладающим плюрипотентностью, способным к дифференцировке в различные типы клеток, присутствующие в живых организмах, а также способностью к пролиферации, включая любые плюрипотентные стволовые клетки, из которых индуцируют клетки промежуточной мезодермы, которые можно использовать по изобретению. Примеры плюрипотентных стволовых клеток включают в себя эмбриональные стволовые клетки (ES), эмбриональные стволовые клетки с переносом ядра (ntES), происходящие из клонированных эмбрионов, зародышевые стволовые клетки («клетки GS»), эмбриональные половые клетки («клетки EG»), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) и культивированные происходящие из фибробластов или происходящие из стволовых клеток костного мозга плюрипотентные клетки (клетки Muse), но конкретно не ограничены ими. Предпочтительно, плюрипотентные стволовые клетки представляют собой клетки iPS, с той точки зрения, что клетки iPS можно получать без разрушения эмбрионов, яйцеклеток (или зародышей) или т.п. при получении. Более предпочтительно, плюрипотентные стволовые клетки представляют собой клетки iPS человека.

Способы получения клеток iPS известны в данной области, и таким образом, клетки iPS можно получать посредством введения факторов перепрограммирования в любые соматические клетки. В настоящем документе, примеры факторов перепрограммирования включают в себя следующие гены или продукты генов: Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, бета-катенин, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 и Glis1. Эти факторы перепрограммирования можно использовать отдельно или в комбинации. Примеры комбинаций факторов перепрограммирования описаны в следующих документах: WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413; WO2009/057831; WO2009/075119; WO2009/079007; WO2009/091659; WO2009/101084; WO2009/101407; WO2009/102983; WO2009/114949; WO2009/117439; WO2009/126250; WO2009/126251; WO2009/126655; WO2009/157593; WO2010/009015; WO2010/033906; WO2010/033920; WO2010/042800; WO2010/050626; WO2010/056831; WO2010/068955; WO2010/098419; WO2010/102267; WO 2010/111409; WO2010/111422; WO2010/115050; WO2010/124290; WO2010/147395; WO2010/147612; Huangfu, D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:795-797, Shi, Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2:525-528; Eminli, S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474; Huangfu, D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275; Shi, Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574; Zhao, Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479; Marson, A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135; Feng, B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203; Judson, RL, et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461; Lyssiotis, CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A 106: 8912-8917; Kim, JB, et al. (2009), Nature 461: 649-643; Ichida, JK, et al. (2009), Cell Stem Cell 5: 491-503; Heng, JC, et al. (2010), Cell Stem Cell 6: 167-74; Han, J, et al. (2010), Nature 463: 1096-100; Mali, P, et al. (2010), Stem Cells 28: 713-720; и Maekawa, M, et al. (2011), Nature 474: 225-9.

Примеры соматических клеток в качестве неограничивающих примеров включают в себя любые из фетальных соматических клеток, неонатальных соматических клеток и зрелых здоровых или пораженных соматических клеток, которые могут представлять собой первичные культивируемые клетки, субкультивируемые клетки или устойчивые клетки. Конкретно, примеры соматических клеток включают в себя: (1) стволовые клетки ткани (или соматические стволовые клетки), такие как нейрональные стволовые клетки, гематопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки и стволовые клетки пульпы зуба; (2) клетки-предшественники ткани; и (3) дифференцированные клетки, такие как гемоциты (например, клетки периферической крови и клетки пуповинной крови), лимфоциты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, мышечные клетки, фибробласты (например, клетки кожи), клетки волос, гепатоциты, клетки слизистой желудка, энтероциты, клетки селезенки, клетки поджелудочной железы (например, экзокринные клетки поджелудочной железы), клетки головного мозга, клетки легкого, клетки почки и жировые клетки.

Кроме того, когда клетки iPS используют в качестве материала для трансплантации клеток, является предпочтительным использование соматических клеток, обладающих генотипом HLA, который является идентичным или по существу идентичным генотипу реципиента, во избежание отторжения. Выражение «по существу идентичный», используемое в настоящем документе, означает соответствие генотипов HLA до такой степени, что иммунологическую реакцию трансплантированных клеток можно супрессировать с использованием иммуносупрессора. Например, можно использовать соматические клетки, обладающие генотипом HLA, для которого показано, что три генных локуса, т.е. HLA-A, HLA-B и HLA-DR, или четыре генных локуса, включающие в себя три указанных выше генных локуса и HLA-C, являются идентичными локусам реципиента.

По настоящему изобретению, способ, включающий в себя следующие стадии, можно использовать для индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки промежуточной мезодермы:

(i) культивирование плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из активина A, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты; и

(ii) культивирование клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из BMP7, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты.

Каждая стадия более подробно описана ниже.

(i) Стадия культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из активина A, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты:

На этой стадии можно осуществлять диссоциацию плюрипотентных стволовых клеток известным в данной области способом, а затем культивировать в суспензионной культуре или адгезионной культуре. Примеры способа диссоциации плюрипотентных стволовых клеток включают в себя механическую диссоциацию и диссоциацию с использованием раствора для диссоциации, обладающего протеазной активностью и коллагеназной активностью (например, Accutase (TM) или Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc.)) или раствора для диссоциации, обладающего только коллагеназной активностью. Предпочтительно, способ диссоциации представляет собой способ, включающий в себя диссоциацию клеток с использованием раствора для диссоциации, обладающего протеазной активностью и коллагеназной активностью, и используют диспергирование клеток до отдельных клеток с измельчением механическим способом. Предпочтительно, плюрипотентные стволовые клетки человека, используемые на этой стадии, представляют собой колонии, культивированные так, чтобы достигать 70%-80% конфлюэнтности на чашке, подлежащей использованию.

Среду, используемую на стадии (i), можно получать посредством добавления одного или нескольких веществ, выбранных из группы, состоящей из активина A, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты, в минимальную среду для культуры клеток животных. В одном из вариантов осуществления вещества, используемые на этой стадии представляют собой: комбинацию активина A и ингибитора(ингибиторов) GSK-3β; или комбинацию ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты. Примеры минимальной среды включают в себя IMDM, среду 199, минимальную поддерживающую среду Игла (EMEM), αMEM, модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), среду Хэма F12 (F12), RPMI 1640, среду Фишера и их смеси. Среда может содержать сыворотку (например, FBS) или может являться бессывороточной. При необходимости, среда может содержать один или несколько заменителей сыворотки, таких как альбумин, трансферрин, нокаутный заменитель сыворотки (KSR) (представляющий собой заменитель сыворотки для культуры клеток ES) (Invitrogen), добавку N2 (Invitrogen), добавку B27 (Invitrogen), жирные кислоты, инсулин, предшественники коллагена, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол и 3’-тиоглицерин, и она может дополнительно содержать одно или несколько других веществ, таких как липиды, аминокислоты, L-глутамин, GlutaMAX (Invitrogen), заменимые аминокислоты (NEAA), витамины, фактор роста, низкомолекулярные соединения, антибиотик, антиоксидант, пировиноградная кислота, забуферивающее средство или неорганические соли. В одном из вариантов осуществления этой стадии, минимальная среда представляет собой DMEM/F12, содержащую GlutaMAX, сыворотку и антибиотик.

На стадии (i), примеры активина A включают в себя активин A, происходящий из человека или другого животного, и его функциональные варианты. Например, можно использовать активин A, коммерчески доступный из R&D Systems, и т.д. Концентрация активина A, используемая на этой стадии, составляет 1 нг/мл - 1000 нг/мл, предпочтительно 10 нг/мл - 500 нг/мл, более предпочтительно, 50 нг/мл - 200 нг/мл.

На стадии (i), ингибитор GSK-3β конкретно не ограничен при условии, что он может ингибировать функцию GSK-3β, такую как киназная активность. Примеры ингибитора GSK-3β включают в себя BIO (другое наименование ингибитор IX GSK-3β; 6-броминдирубин-3’-оксим), представляющий собой производное индирубина, SB216763 (3-(2,4-дихлорфенил)-4-(1-метил-1H-индол-3-ил)-1H-пиррол-2,5-дион), представляющий собой производное малеинимида, ингибитор VII GSK-3β (α,4-дибромацетофенон), представляющий собой фенил-α-бромметилкетоновое соединение, L803-mts (другое наименование пептидный ингибитор GSK-3β; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2:SEQ ID NO. 1), представляющий собой проникающий в клетку фосфорилированный пептид, и CHIR99021 (Nature (2008) 453:519-523), обладающий высокой избирательностью. Эти соединения доступны, например, из Stemgent, Calbiochem, и Biomol, или альтернативно, их можно получать самостоятельно. Предпочтительным ингибитором GSK-3β, используемым на этой стадии, является CHIR99021. Концентрацию ингибитора GSK-3β, используемую на этой стадии, может соответствующим образом определять специалист в данной области в зависимости от ингибиторов GSK-3β, подлежащих использованию. Например, когда CHIR99021 используют в качестве ингибитора GSK-3β, его концентрация составляет 0,01 мкМ - 100 мкМ, предпочтительно, 0,1 мкМ - 10 мкМ, более предпочтительно, 1 мкМ - 3 мкМ.

На стадии (i), производные ретиноевой кислоты могут представлять собой искусственно модифицированные ретиноевые кислоты, сохраняющие функцию природной ретиноевой кислоты, такие как соединения ретиноида или соединения витамина D3. Примеры соединений ретиноида включают в себя ретиноевую кислоту, 3-дегидроретиноевую кислоту, 4-[[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)карбонил]амино]-бензойную кислоту (AM580) (Tamura, K. et al., Cell Differ. Dev. 32:17-26 (1990)), 4-[(1E)-2-(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-1-пропен-1-ил]-бензойную кислоту (TTNPB) (Strickland S, et al., Cancer Res. 43:5268-5272 (1983)), соединения, описанные в Tanenaga, K. et al., Cancer Res. 40:914-919 (1980), пальмитат ретинола, ретинол, ретиналь, 3-дегидроретинол и 3-дегидроретиналь. Примеры соединений ретиноевой кислоты включают в себя соединения ретиноида, обладающие карбоксильной группой, такие как ретиноевая кислота, 3-дегидроретиноевая кислота, AM580, или TTNPB. Примеры соединений витамина D3 включают в себя соединения, описанные в Abe, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78:4990-4994 (1981) и соединения, описанные в Schwartz, E. L.et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 24:18 (1983). В одном из вариантов осуществления этой стадии, производное ретиноевой кислоты представляет собой соединение ретиноида или соединение витамина D3. В другом варианте осуществления этой стадии, производное ретиноевой кислоты представляет собой соединение ретиноида. Также в другом варианте осуществления производное ретиноевой кислоты представляет собой соединение ретиноевой кислоты. Примеры предпочтительного производного ретиноевой кислоты, используемого на этой стадии, включают в себя AM580 или TTNPB. Концентрацию производного ретиноевой кислоты, используемую на этой стадии, может соответствующим образом определять специалист в данной области в зависимости от производных ретиноевой кислоты, подлежащих использованию. Например, когда AM580 или TTNPB используют в качестве производного ретиноевой кислоты, их концентрация составляет 0,01 мкМ - 100 мкМ, предпочтительно 0,1 мкМ - 10 мкМ, более предпочтительно, 0,5 мкМ - 2 мкМ.

Среда, используемая на стадии (i), может дополнительно содержать ингибитор ROCK. В частности, когда эта стадия включает в себя стадию диспергирования плюрипотентных стволовых клеток до отдельных клеток, является предпочтительным содержание ингибитора ROCK в среде.

Ингибитор ROCK конкретно не ограничен при условии, что он может ингибировать функцию Rho-киназы (ROCK), и его примеры включают в себя: Y-27632 (см., например, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)), Fasudil/HA1077 (см., например, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), H-1152 (см., например, Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93:225-232 (2002)), Wf-536 (см., например, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4):319-324 (2003)) и их производные; и антисмысловые нуклеиновые кислоты, индуцирующие РНК-интерференцию нуклеиновые кислоты (например, миРНК), и доминантно-негативные мутанты ROCK и экспрессирующие векторы для них. Кроме того, другие известные низкомолекулярные соединения также можно использовать в качестве ингибиторов ROCK (см., например, Патентную публикацию США No. 2005/0209261, Патентную публикацию США No. 2005/0192304, Патентную публикацию США No. 2004/0014755, Патентную публикацию США No. 2004/0002508, Патентную публикацию США No. 2004/0002507, Патентную публикацию США No. 2003/0125344, Патентную публикацию США No. 2003/0087919, WO2003/062227, WO2003/059913, WO2003/062225, WO2002/076976, и WO2004/039796). По настоящему изобретению, можно использовать один или два, или более типов ингибиторов ROCK. Предпочтительным примером ингибитора ROCK, используемого на этой стадии, является Y-27632. Концентрацию ингибитора ROCK, используемую на этой стадии, может соответствующим образом определять специалист в данной области в зависимости от ингибиторов ROCK, подлежащих использованию. Например, когда Y-27632 используют в качестве ингибитора ROCK, его концентрация составляет 0,1 мкМ - 100 мкМ, предпочтительно, 1 мкМ - 50 мкМ, более предпочтительно, 5 мкМ - 20 мкМ.

Температура культивирования на стадии (i) может составлять, в качестве неограничивающих примеров, от приблизительно 30°C до приблизительно 40°C и предпочтительно, приблизительно 37°C, и культивирование проводят в атмосфере содержащего CO₂ воздуха. Концентрация CO₂ составляет от приблизительно 2% до приблизительно 5% и предпочтительно, приблизительно 5%. Период культивирования на этой стадии составляет, например, 2 суток или менее и предпочтительно, 2 суток.

(ii) Стадия культивирования клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из BMP7, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты:

На этой стадии, непосредственно популяцию клеток, полученную после суспензионного культивирования на стадии (i) выше, можно подвергать адгезионному культивированию на чашке для культивирования с покрытием, содержащей любую из сред, или альтернативно, можно продолжать культивирование клеток, полученных адгезионным культивированием на стадии (i), заменяя в то же время среду.

Среду, используемую на стадии (ii), можно получать посредством добавления одного или нескольких веществ, выбранных из группы, состоящей из BMP7, ингибитора(ингибиторов) GSK-3β и производного(производных) ретиноевой кислоты, в минимальную среду для культивирования клеток животных. В одном из вариантов осуществления вещества, используемые на этой стадии, представляют собой комбинацию BMP7 и ингибитора(ингибиторов) GSK-3β, или производного(производных) ретиноевой кислоты. Примеры минимальной среды включают в себя IMDM, среду 199, минимальную поддерживающую среду Игла (EMEM), αMEM, модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), среду Хэма F12 (F12), RPMI 1640, среду Фишера и их смеси. Среда может содержать сыворотку (например, FBS) или может являться бессывороточной. При необходимости, среда может содержать один или несколько заменителей сыворотки, таких как альбумин, трансферрин, нокаутный заменитель сыворотки (KSR) (представляющий собой заменитель сыворотки для культуры клеток ES) (Invitrogen), добавку N2 (Invitrogen), добавку B27 (Invitrogen), жирные кислоты, инсулин, предшественники коллагена, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол или 3’-тиоглицерин, или может дополнительно содержать одно или несколько других веществ, таких как липиды, аминокислоты, L-глутамин, GlutaMAX (Invitrogen), заменимые аминокислоты (NEAA), витамины, фактор роста, антибиотик, антиоксидант, пировиноградную кислоту, буферное средство, неорганические соли или их эквиваленты. В одном из вариантов осуществления этой стадии, минимальная среда представляет собой смесь, содержащую DMEM и F12 при 1:1 (DMEM/F12), дополненную GlutaMAX, KSR, заменимые аминокислоты, 2-меркаптоэтанол и антибиотик.

На стадии (ii), например, клетки, полученные на стадии (i), можно культивировать в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из BMP7 и ингибитора(ингибиторов) GSK-3β, затем в среде, содержащей производное(производные) ретиноевой кислоты. Предпочтительно, на стадии (ii), клетки, полученные на стадии (i), культивируют в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из BMP7 и ингибитора(ингибиторов) GSK-3β, затем в среде, содержащей производное(производные) ретиноевой кислоты и активатор(ы) передачи сигнала TGFβ.

Таким образом, стадию (ii) можно разделить на следующие стадии:

(ii-1) культивирование клеток в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из BMP7 и ингибитора(ингибиторов) GSK-3β; и

(ii-2) культивирование клеток в среде, содержащей одно или несколько веществ, выбранных из активатора(активаторов) передачи сигнала TGFβ и производного(производных) ретиноевой кислоты.

Более предпочтительно, на стадии (ii), стадия (ii-1) представляет собой стадию культивирования клеток в среде, содержащей BMP7 и ингибитор(ы) GSK-3β, и стадия (ii-2) представляет собой стадию культивирования клеток в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и производное(производные) ретиноевой кислоты.

На стадии (ii), примеры BMP7 включают в себя BMP7 человека (No. доступа в NCBI: NM_001719.2), происходящий из другого животного BMP7, и их функциональные варианты. Например, можно использовать BMP7, коммерчески доступный из Invitrogen, R&D, и т.д. Концентрация BMP7, используемая на этой стадии, составляет 1 нг/мл - 1000 нг/мл, предпочтительно, 10 нг/мл - 500 нг/мл, более предпочтительно, 50 нг/мл - 200 нг/мл.

На стадии (ii), можно использовать ингибиторы GSK-3β, как проиллюстрировано на стадии (i) выше. Предпочтительным ингибитором GSK-3β является CHIR99021. Концентрацию ингибитора GSK-3β, используемую на этой стадии, может соответствующим образом определять специалист в данной области в зависимости от ингибиторов GSK-3β, подлежащих использованию. Например, когда CHIR99021 используют в качестве ингибитора GSK-3β, его концентрация составляет 0,01 мкМ - 100 мкМ, предпочтительно, 0,1 мкМ - 10 мкМ, более предпочтительно, 1 мкМ - 3 мкМ.

На стадии (ii), активатор передачи сигнала TGFβ конкретно не ограничен при условии, что он активирует путь передачи сигнала TGFβ. Примеры активатора передачи сигнала TGFβ, которые можно использовать, включают в себя: TGFβ1, TGFβ2 и TGFβ3; или IDE1 и IDE2. Предпочтительным активатором передачи сигнала TGFβ является TGFβ1. На стадии (ii), концентрацию активатора передачи сигнала TGFβ, подлежащую использованию, может соответствующим образом определять специалист в данной области в зависимости от активаторов передачи сигнала TGFβ, подлежащих использованию. Например, когда белок, такой как TGFβ1, TGFβ2, или TGFβ3 используют в качестве активатора передачи сигнала TGFβ, его концентрация составляет 0,1 нг/мл - 100 нг/мл, предпочтительно, 1 нг/мл - 10 нг/мл, более предпочтительно, 5 нг/мл - 10 нг/мл. Кроме того, когда используют IDE1 или IDE2, его концентрация составляет 1 мкМ - 100 мкМ, предпочтительно, 25 мкМ - 75 мкМ, более предпочтительно, 40 мкМ - 60 мкМ.

На стадии (ii) можно использовать производные ретиноевой кислоты, как проиллюстрировано на стадии (i). Предпочтительным производным ретиноевой кислоты является AM580 или TTNPB. Концентрацию производного ретиноевой кислоты, используемую на этой стадии, может соответствующим образом определять специалист в данной области в зависимости от производных ретиноевой кислоты, подлежащих использованию. Например, когда AM580 или TTNPB используют в качестве производного ретиноевой кислоты, их концентрация составляет 0,01 мкМ - 100 мкМ, предпочтительно, 0,1 мкМ - 10 мкМ, более предпочтительно, 0,5 мкМ - 2 мкМ.

На стадиях (ii), (ii-1) и (ii-2), температура культивирования может составлять, в качестве неограничивающих примеров, от приблизительно 30°C до приблизительно 40°C, предпочтительно, приблизительно 37°C, и культивирование проводят в атмосфере содержащего CO₂ воздуха. Концентрация CO₂ составляет от приблизительно 2% до приблизительно 5%, предпочтительно, приблизительно 5%. Не существует верхнего предела периода культивирования, поскольку длительное культивирование значительно не влияет на эффективность получения ренальных клеток-предшественников. Например, период культивирования на стадии (ii) составляет 3 суток или более, предпочтительно, от 3 суток или более до 12 суток или менее, более предпочтительно, от 3 суток или более до 9 суток или менее. Когда стадия (ii) включает в себя стадии (ii-1) и (ii-2), период культивирования на стадии (ii) является таким, как описано выше, в то время как период культивирования на стадии (ii-1) составляет, например, 1 сутки или более, предпочтительно, от 2 суток или более до 11 суток или менее, более предпочтительно, от 2 суток или более до 6 суток или менее, и период культивирования на стадии (ii-2) составляет, например, 1 сутки или более, предпочтительно, от 2 суток или более до 11 суток или менее, более предпочтительно, от 3 суток или более до 6 суток или менее. В этом случае, среду желательно менять каждые 3 суток.

Настоящее изобретение относится к: ренальным клеткам-предшественникам, полученным способами, описанными выше; фармацевтической композиции, содержащей ренальные клетки-предшественники; терапевтическому лекарственному средству против заболеваний почек, содержащему ренальные клетки-предшественники; способу лечения заболевания почек, включающему в себя стадию введения терапевтически эффективного количества ренальных клеток-предшественников; ренальным клеткам-предшественникам для применения в лечении заболеваний почек; и применению ренальных клеток-предшественников в изготовлении фармацевтических композиций для лечения заболеваний почек. Примеры способа введения терапевтического лекарственного средства нуждающимся в лечении пациентам включают в себя: способ, включающий в себя получение слоя или слоев ренальных клеток-предшественников и нанесение слоя или слоев на почки пациентов; способ, включающий в себя трансплантацию пациентам непосредственно клеточной суспензии, полученной посредством суспендирования полученных ренальных клеток-предшественников в физиологическом солевом растворе или т.п., или клеточной массы, полученной посредством трехмерного культивирования полученных ренальных клеток-предшественников (например, Dev Cell. 11 Sep 2012; 23 (3):637-651), в почки пациентов; и способ трансплантации массы ренальных клеток-предшественников, полученной посредством трехмерного культивирования на каркасе, состоящем из матригеля или т.п. Участок трансплантации конкретно не ограничен при условии, что он находится внутри почки, однако и предпочтительно, представляет собой субкапсулярную область почки. Примеры заболеваний почек включают в себя острую почечную недостаточность, хроническую почечную недостаточность, и хронические заболевания почек, не достигшие стадии хронической почечной недостаточности.

По настоящему изобретению, количество ренальных клеток-предшественников, содержащихся в терапевтическом лекарственном средстве против заболеваний почек, конкретно не ограничено при условии, что приживления трансплантата достигают после введения. Его можно соответствующим образом увеличивать или уменьшать в соответствии с размером очага поражения или тела пациента.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение более подробно описано со ссылкой на примеры ниже. Однако, объем настоящего изобретения не ограничен ими.

[ПРИМЕР 1]

[Получение линии клеток iPS человека с нокином OSR1-GFP и SIX2-GFP]

Клетки iPS человека (201B7) получены от профессора Shinya Yamanaka, Kyoto University (Kyoto, Japan), и их культивировали общепринятым способом (Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-72). Затем линию клеток iPS человека с репортером OSR1-GFP, способных к экспрессии GFP, функционально связанной с экспрессией эндогенного OSR1, получали способом, описанным в Mae S, et al, Nat Commun. 4: 1367, 2013. Затем, как описано Mae et al (там же), IRES-tdTomato вводили ниже стоп-кодона SIX2 линии клеток iPS человека с репортером OSR1-GFP посредством гомологичной рекомбинации с использованием клона BAC (RP11-819H19, Children’s Hospital Oakland Research Institute), в который вставлен IRES-tdTomato, таким образом получая линию клеток iPS человека с репортерами OSR1-GFP и SIX2-tdTomato, способных к экспрессии tdTomato, функционально связанной с экспрессией эндогенного SIX2.

[ПРИМЕР 2]

[Способ индукции 1 положительных по SIX2 клеток]

<Стадия 1>

Линию клеток iPS человека с репортерами OSR1-GFP и SIX2-tdTomato, полученную способом из примера 1, культивировали при 37°C в атмосфере 2-5% CO₂ для достижения конфлюэнтности на 10-см чашках, содержащих среду для клеток ES/iPS приматов (ReproCELL), дополненную 5 нг/мл bFGF (Wako) с использованием клеток SNL (McMahon, A.P. and Bradley, A. (1990) Cell 62; 1073-1085) (клеток, обработанных 15,5 мкг/мл митомицина (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) в течение 2-3 часов и рассеянных с плотностью 3×10⁵ клеток /10-см чашку) в качестве фидерных клеток. Раствор CTK (2,5% трипсин (Invitrogen), 1 мг/мл коллагеназа IV (Invitrogen), 0,1 M CaCl₂, 10 мл KnockOut SR (Invitrogen) и 29,5 мл H₂O) добавляли для диссоциации клеток. После удаления фидерных клеток, диссоциированные клетки суспендировали в среде DMEM/F12, содержащей 1 мкМ CHIR99021 (Stemgent, 04-0004), 100 нг/мл активина A (R&D Systems, 338-AC), 1% GlutaMAX (100X) (Invitrogen, 35050-061), 2%FBS (Hyclone), и 0,5% PenStrep (Invitrogen, 10565). Затем клеточные суспензии переносили в планшет с низким связыванием клеток (6-луночный планшет с низким связыванием клеток (Nunc, 145383)), так что каждая лунка содержала от одной третьей до одной шестой клеточной суспензии, полученной с 10-см чашки, с последующим суспензионным культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 2 суток.

<Стадия 2>

Клеточную массу, полученную на стадии 1, переносили в 24-луночный или 6-луночный планшет, покрытый матригелем (матрица матригеля BD с пониженным содержанием факторов роста (BD Biosciences, 356230) (где планшет покрывали 0,2 мг/мл матригеля в DMEM и обрабатывали при 37°C в течение 30 минут или при 4°C в течение ночи) или 24-луночный, или 6-луночный планшет, обработанный синтемаксом (субстрат синтемакс II-SC Corning (Corning, 3535XX1)) (где планшет покрывали синтемаксом, разведенным в 40 раз стерильной водой и обрабатывали при комнатной температуре в течение 2 часов). Среду заменяли на среду DMEM/F12, содержащую 1 мкМ CHIR99021, 100 нг/мл BMP7 (рекомбинантый человеческий BMP7 (R&D Systems, 3534-BP)), 0,1% 2-меркаптоэтанол (1000X) (Invitrogen, 21985), 1% GlutaMAX (100X), 10% KnockOut SR (Invitrogen), 0,1 мМ MEM NEAA (Invitrogen, 11140), и 0,5% PenStrep, с последующим адгезионным культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 3-6 суток. В случае культивирования в течение 3 суток или более, среду заменяли каждые 3 суток на среду, удовлетворяющую тем же условиям.

<Стадия 3>

Среду отбирали с клеток, полученных на стадии 2. Клетки промывали с помощью PBS, а затем среду заменяли на среду DMEM/F12, содержащую 5 нг/мл TGFβ1 (Peprotech, 100-21C), 0,5 мкМ дорсоморфин (ингибитор AMPK, Соединение C (Merck, 171260)), 0,1% 2-меркаптоэтанол (1000X), 1% GlutaMAX (100X), 10% KnockOut SR, 0,1 мМ MEM NEAA и 0,5% PenStrep, с последующим суспензионным культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 15-22 суток. В этом случае, среду заменяли каждые 3 суток на среду, удовлетворяющую тем же условиям. Соотношение положительных по SIX2-tdTomato клеток для полученных клеток определяли с использованием проточного цитометра (Becton, Dickinson and Company) для оценки, и обнаружили, что оно составляет 21,5±2,0% (фиг. 1B).

[ПРИМЕР 3]

[Способ индукции 2 положительных по SIX2 клеток]

<Стадия 1>

Линию клеток iPS человека с репортерами OSR1-GFP и SIX2-tdTomato, полученную способом из примера 1, культивировали способом, описанным на стадии 1 способа индукции 1, для достижения конфлюэнтности на 10-см чашках с использованием клеток SNL в качестве фидерных клеток. Раствор CTK добавляли для диссоциации клеток. После удаления фидерных клеток, диссоциированные клетки суспендировали в среде DMEM/F12, содержащей 1 мкМ TTNPB (Sigma, T3757), 1 мкМ CHIR99021, 1% GlutaMAX (100X), 2% FBS и 0,5% PenStrep. Затем клеточные суспензии переносили в планшет с низким связыванием клеток (6-луночный планшет с низким связыванием клеток), так что каждая лунка содержала от одной третьей до одной шестой клеточной суспензии, полученной с 10-см чашки, с последующим суспензионным культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 2 суток.

<Стадия 2>

Клеточную массу, полученную на стадии 1, переносили в планшеты, покрытые матригелем, или планшеты, покрытые синтемаксом (полученные способом, описанным на стадии 2 способа индукции 1). Среду заменяли на среду DMEM/F12, содержащую 1 мкМ TTNPB, 0,1% 2-меркаптоэтанол (1000X), 1% GlutaMAX (100X), 10% KnockOut SR, 0,1 мМ MEM NEAA и 0,5% PenStrep, с последующим адгезионным культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 3-9 суток. В этом случае, среду заменяли каждые 3 суток на среду, удовлетворяющую тем же условиям.

<Стадия 3>

Среду отбирали с клеток, полученных на стадии 2. Клетки промывали с помощью PBS, а затем среду заменяли на среду DMEM/F12, содержащую 5 нг/мл TGFβ1, 0,5 мкМ дорсоморфин, 0,1% 2-меркаптоэтанол (1000X), 1% GlutaMAX (100X), 10% KnockOut SR, 0,1 мМ MEM NEAA и 0,5% PenStrep, с последующим суспензионным культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 12-22 суток. В этом случае, среду заменяли каждые 3 суток на среду, удовлетворяющую тем же условиям. Соотношение положительных по SIX2-tdTomato клеток в полученных клетках определяли с использованием проточного цитометра для оценки, и обнаружили, что оно составляет 20,6±5,3% (фиг. 1C).

[ПРИМЕР 4]

[Способ индукции 3 положительных по SIX2 клеток]

<Стадия 1>

Линию клеток iPS человека с репортерами OSR1-GFP и SIX2-tdTomato, полученную способом из примера 1, культивировали способом, описанным на стадии 1 способа индукции 1, для достижения конфлюэнтности на 10-см чашках с использованием клеток SNL в качестве фидерных клеток. Раствор CTK добавляли для диссоциации клеток. После удаления фидерных клеток, Accutase (TM) (Innovative Клетка Technologies, AT-104) добавляли для диспергирования клеток iPS для получения отдельных клеток. Затем полученные клетки суспендировали в среде DMEM/F12, содержащей 10 мкМ Y-27632 (Wako, 253-00513), 1 мкМ CHIR99021, 1 мкМ TTNPB, 1% GlutaMAX (100X), 2% FBS, и 0,5% PenStrep. Полученные клеточные суспензии (1×10⁵ клетки/лунку (для 96-луночного планшета)) переносили в планшет, покрытый 0,1% желатином (желатин из кожи свиньи, типа A (Sigma, G1890)), с последующим адгезионным культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 2 суток.

<Стадия 2>

Клетки, полученные на стадии 1, промывали с помощью PBS. Среду заменяли на среду DMEM/F12, содержащую 1 мкМ TTNPB, 0,1% 2-меркаптоэтанол (1000X), 1% GlutaMAX (100X), 10% KnockOut SR, 0,1 мМ MEM NEAA и 0,5% PenStrep, с последующим адгезионным культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 3-9 суток. В этом случае, среду заменяли каждые 3 суток на среду, удовлетворяющую тем же условиям.

<Стадия 3>

Accutase (TM) добавляли к клеткам, полученным на стадии 2, для диссоциации клеток. Положительные по OSR1 клетки сортировали посредством FACS с использованием экспрессии OSR1 (GFP) в качестве показателя. Полученные положительные по OSR1 клетки переносили в планшет с низким связыванием клеток (6-луночный планшет с низким связыванием клеток) при 1×10⁶ клетки/лунку в среде DMEM/F12, содержащей 5 нг/мл TGFβ1, 0,5 мкМ дорсоморфин, 0,1% 2-меркаптоэтанол (1000X), 1% GlutaMAX (100X), 10% KnockOut SR, 0,1 мМ MEM NEAA и 0,5% PenStrep, с последующим суспензионным культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение 2 суток. Полученную клеточную массу переносили в планшеты, покрытые матригелем (матрица матригеля BD с пониженным содержанием факторов роста), и затем подвергали адгезионному культивированию в среде DMEM/F12, содержащей 5 нг/мл TGFβ1, 0,5 мкМ дорсоморфин, 0,1% 2-меркаптоэтанол (1000X), 1% GlutaMAX (100X), 10% KnockOut SR, 0,1 мМ MEM NEAA, и 0,5% PenStrep, при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 2-13 суток. В этом случае, среду заменяли каждые 3 суток на среду, удовлетворяющую тем же условиям. Соотношение положительных по SIX2-tdTomato клеток в полученных клетках определяли с использованием проточного цитометра для оценки, и обнаружили, что оно составляет 31,1±10,0% (фиг. 1D).

[ПРИМЕР 5]

[Исследование с использованием альтернатив для дорсоморфина]

На стадии 3 способа индукции 1 положительных по SIX2 клеток, дорсоморфин заменяли на 100 нг/мл ноггин (Peprotech), 0,5 мкМ LDN193189 (Axon MedChem, 1509) или 0,5 мкМ DMH1 (Tocris, 4126) для индукции дифференцировки указанным выше способом. В результате обнаружили, что соотношения положительных по SIX2-tdTomato клеток составляли 7,5%, 20,4% и 15,4%, соответственно (фиг. 2B, 2C и 2D, соответственно).

[Исследование с использованием альтернатив для TGFβ1]

На стадии 3 способа индукции 1 положительных по SIX2- клеток, TGFβ1 заменяли на 50 мкМ IDE1 (Tocris) или 50 мкМ IDE2 (Tocris) для индукции дифференцировки указанным выше способом. В результате обнаружили, что соотношения положительных по SIX2-tdTomato клеток составляли 8,4% и 39,4%, соответственно (фиг. 2E и 2F).

[Исследование с использованием комбинации альтернатив]

На стадии 3 способа индукции 1 положительных по SIX2 клеток, дорсоморфин заменяли на 0,5 мкМ LDN193189, в то время как TGFβ1 - на 10 нг/мл TGFβ2 (Peprotech) или 10 нг/мл TGFβ3 (R&D), для индукции дифференцировки указанным выше способом. В результате обнаружили, что соотношения положительных по SIX2-tdTomato клеток составляли 8,6% и 9,3%, соответственно (фиг. 2G и 2H).

[ПРИМЕР 6]

[Получение линии клеток iPS человека с нокином OSR1-GFP и SIX2-tdTomato]

Линию клеток iPS человека с репортерами OSR1-GFP и SIX2-tdTomato (4A6C3-10) получали из линии клеток iPS человека с репортером OSR1-GFP (3D45), описанной в Mae S, et al, Nat Commun. 4:1367, 2013 с использованием способа, сходного со способом в примере 1.

[ПРИМЕР 7]

[Способ индукции 4 положительных по SIX2 клеток]

<Стадия 1>

Линию клеток iPS человека с репортерами OSR1-GFP и SIX2-tdTomato получали способом, описанным в примере 6

4A6C3-10 культивировали при 37°C в атмосфере 2%-5% CO₂ для достижения 70% до 80% конфлюэнтности на 10-см чашках, содержащих среду для клеток ES приматов (ReproCELL), дополненную 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина (Invitrogen) и 5 нг/мл рекомбинантного человеческого основного фактора роста фибробластов (bFGF, Wako) с использованием полученных из эмбриона мыши ICR (плода в возрасте 12,5 суток) эмбриональных фибробластов мыши (MEF) или фидерных клеток SNL (McMahon, A.P. and Bradley, A. (1990) Cell 62; 1073-1085) (эти клетки предварительно обрабатывали 15,5 мкг/мл митомицина (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) в течение 2-3 часов и рассевали при плотности 2×10⁵ клетки /6-см чашку) в качестве фидерных клеток. 10-см чашки, содержащие клетки, промывали с помощью PBS и обрабатывали раствором CTK (PBS, содержащего 0,25% трипсин (Invitrogen), 0,1% коллагеназа IV (Invitrogen), 20% KnockOut SR (KSR, Invitrogen) и 1 мМ CaCl₂) при 37°C в течение 4 минут. Раствор CTK удаляли посредством промывки PBS. Затем среду заменяли на DMEM/F12+Glutamax (Invitrogen), содержащую 0,1 мМ MEM NEAA (Invitrogen), 1000 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 0,55 мМ 2-меркаптоэтанол (Invitrogen) и 20% KSR. Затем клетки соскребали с использованием скребка для клеток и рассевали в 6-см чашки, покрытые 0,2% желатином, для удаления фидерных клеток. Через один час клетки промывали с помощью DMEM/F12+Glutamax [среды со стадии 1], содержащей 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина и 2% FBS (HyClone), переносили в чашки со сверхнизким прикреплением (Corning 3471) со средой со стадии 1, содержащей 100 нг/мл рекомбинантого человеческого/мышиного/крысиного активина A (R&D Systems) и 1 мкМ CHIR99021, и культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 2 суток.

<Стадия 2>

Для дифференцировки в промежуточную мезодерму, клеточную массу (эмбриоидных телец (EB)), полученную на стадии 1, переносили в 24-луночный планшет, покрытый синтемаксом II (Corning), среду заменяли на DMEM/F12+Glutamax, содержащую 0,1 мМ MEM NEAA, 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 0,55 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%KSR, 100 нг/мл BMP7 (рекомбинантный человеческий BMP7, R&D Systems) и 1 мкМ CHIR99021, и клетки культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 3 суток.

<Стадия 3>

После стадии 2, среду заменяли на DMEM/F12+Glutamax, содержащую 0,1 мМ MEM NEAA, 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 0,55 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% KSR, 1 мкМ TTNPB (Sigma T3757) и 5 нг/мл TGFβ1 (Peprotech), с последующим культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 5 суток. Среду заменяли на среду, удовлетворяющую тем же условиям, через двое суток после начала культивирования (т.е., на сутки 8 от начала стадии 1 (сутки 1)).

<Стадия 4>

После стадии 3, среду заменяли на DMEM/F12+Glutamax, содержащую 0,1 мМ MEM NEAA, 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 0,55 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% KSR, 5 нг/мл TGFβ1 и 0,5 мкМ DMH1 (Tocris), с последующим культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение 17 суток (т.е., культивирование в течение всего 28 суток от начала стадии 1 (сутки 1); фиг. 3A). В этом случае, среду заменяли каждые 3 суток на среду, удовлетворяющую тем же условиям. Соотношение положительных по OSR1 и положительных по SIX2- (OSR1+SIX2+) клеток в полученных клетках определяли с использованием проточного цитометра для оценки, и обнаружили, что оно составляет 32,8% на сутки 28 культивирования (фиг. 3B). Кроме того, соотношение OSR1+SIX2+ клеток достигало максимального уровня на сутки 25 культивирования, а затем подтверждали, что оно сохранялось до суток 28 культивирования (фиг. 3D).

[ПРИМЕР 8]

[Исследование с использованием различных комбинаций активаторов передачи сигнала TGFβ и ингибиторов BMP]

Индукцию клеток OSR1+SIX2+ из линии клеток iPS 4A6C3-10 исследовали с использованием различных комбинаций активаторов передачи сигнала TGFβ и ингибиторов BMP. Конкретно, индукцию OSR1+SIX2+ клеток из 4A6C3-10 исследовали в условиях 1)-10), описанных ниже.

На стадиях 1-2 в условиях 1) - 10) использовали способы, использованные на стадиях 1-2 из примера 7, соответственно. На стадии 3 в условиях 1)-7) и 10) использовали способ, использованный на стадии 3 из примера 7. На стадии 3 в условиях 8) культивирование проводили в такой же среде, как на стадии 3 из примера 7, за исключением того, что 5 нг/мл TGFβ1 и 1 мкМ TTNPB заменяли на 5 нг/мл TGFβ2 (Peprotech). На стадии 3 в условиях 9) культивирование проводили в такой же среде, как на стадии 3 из примера 7, за исключением того, что 5 нг/мл TGFβ1 и 1 мкМ TTNPB заменяли на 5 нг/мл TGFβ3 (Peprotech). На стадии 4 в условиях 1)-10), культивирование проводили способом, использованным на стадии 4 из примера 7, или проводили в такой же среде, как на стадии 4 из примера 7, за исключением того, что 5 нг/мл TGFβ1 и 0,5 мкМ DMH1 заменяли на следующее: условия 1), только DMSO; условия 2), 5 нг/мл TGFβ1; условия 3), 0,5 мкМ DMH1; условия 4), 5 нг/мл TGFβ1 и 100 нг/мл ноггин (Peprotech); условия 5), 5 нг/мл TGFβ1 и 0,5 мкМ дорсоморфин (Merck); условия 6), 5 нг/мл TGFβ1 и 0,5 мкМ LDN193189 (Axon MedChem); условия 7), 5 нг/мл TGFβ1 (Peprotech) и 0,5 мкМ DMH1 (как в примере 7); условия 8), 5 нг/мл TGFβ2 (Peprotech) и 0,5 мкМ DMH1; условия 9), 5 нг/мл TGFβ3 (Peprotech) и 0,5 мкМ DMH1; и условия 10), 50 мкМ IDE2 (Tocris) и 0,5 мкМ DMH1.

В результате (как показано на фиг. 4), подтвердили, что использование TGFβ1 в качестве активатора передачи сигнала TGFβ и DMH1 в качестве ингибитора BMP, является эффективным для индукции OSR1+SIX2+ клеток. На стадии 4 из примера 7, когда культивирование проводили в среде, содержащей SB431542 (Tocris) (10 мкМ), ингибитор рецептора 1 TGFβ, вместе с 5 нг/мл TGFβ1 и 0,5 мкМ DMH1 (условия 11), дифференцировку в OSR1+SIX2+ клетки ингибировали.

[ПРИМЕР 9]

[Исследование с использованием различных клеток iPS человека и клеток ES человека]

Пятнадцать типов клеток iPS человека (происходящие из периферической крови клетки iPS 585A1, 585B1, 604A1, 604B1, 648A1, 648B1 и 692D2; происходящие из пуповинной крови клетки iPS 606A1, 606B1 и 610B1; происходящие из взрослых дермальных фибробластов человека (aHDF) клетки iPS 201B6, 201B7, 253G1 и 253G4; и 4A6C3-10) и три типа клеток ES человека (khES1, khES3 и H9) (Proc Natl Acad Sci USA 109, 12538-12543 (2012), Stem Cells 31, 458-466 (2013)) обрабатывали способом, описанным в примере 7, и затем анализировали по экспрессии гена OSR1 и SIX2 с использованием количественной RT-PCR (Nat 4 Commun 1367, (2013)). Экспрессию OSR1 и SIX2 во множестве линий клеток, отличных от 4A6C3-10, подтверждали способом, описанным в примере 7 (фиг. 5). Таким образом, подтвердили, что способ можно использовать для других клеток iPS и клеток ES.

[ПРИМЕР 10]

[Анализ маркеров экспрессии]

Различные маркеры экспрессии в 4A6C3-10, обработанных на treated in the induction стадии индукции из примера 7 анализировали с использованием RT-PCR или количественной RT-PCR. На фиг. 3C и 3E показаны результаты. Экспрессию BRACHYURY и TBX6, служащих маркерами появляющейся ранней задней мезодермы, подтверждали в клетках после стадии 1, и экспрессию OSR1, служащего маркером промежуточной мезодермы, подтверждали в клетках после стадии 2 (фиг. 3C). Затем активировалась экспрессия генов WT1, PAX2, SIX2 и заднего HOX, служащих метанефрическими мезенхимальными маркерами (фиг. 3C). Экспрессию CITED1, EYA1, PAX2, WT1, SALL1, ITGA8, CDH11, GDNF, HOXA11 и HOXD11, служащих маркерами ренальных клеток-предшественников, подтверждали в клетках OSR1+SIX2+ на сутки 28 культивирования. В отличие от этого, FOXD1, служащий стромальным маркером, и HOXB7, служащий маркером мезонефрального протока и зачатка мочеточника, не детектировали в клетках (фиг. 3E).

[Оценка ренальных клеток-предшественников]

OSR1+SIX2+ клетки на сутки 28, обработанные на стадии индукции из примера 7, выделяли посредством проточной цитометрии, рассевали в 96-луночный планшет, покрытый синтемаксом II при плотности 3,0×10⁴ клеток/лунку, и культивировали в среде REGM (LONZA), дополненной 10 мкМ Y-27632 при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 7 суток. Полученные клетки подвергали иммуноокрашиванию против нефрина (маркера гломерулярных подоцитов), AQP1 и мегалина (маркеров проксимальных канальцев), и уромукоида (маркера петли Генле) для подтверждения клеток, положительных по каждому маркеру (фиг. 6A).

Затем OSR1+SIX2+ клетки высевали в 96-луночный планшет с веретеновидным дном с низкой адгезией (Lipidure Coat, NOF), содержащий культуральный супернатант UBC (см. ниже), дополненный 50 нг/мл BMP7 (R&D Systems) и 10 мкМ Y-27632 (Wako) при плотности 1,0×10⁵ клеток/лунку и культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO2 в течение 24 часов. Затем среду заменяли на культуральный супернатант UBC, дополненный 50 нг/мл BMP7, 0,5 мкМ BIO (Wako) и 10 мкМ Y-27632, с последующим культивированием в течение 2-3 суток. Затем клетки выделяли, рассевали на обработанные митомицином NIH3T3, способные к экспрессии Wnt4 (Osafune K, et al. (2006), Development 133: 151-61), при плотности 3,0×10⁴ клеток/лунку (24-луночный планшет), и культивировали в течение 5-7 суток. Полученные клетки подвергали иммуноокрашиванию против лектина Lotus Tetragonolobus (LTL) (маркера проксимальных канальцев), ламинина (маркера клеток поляризованного эпителия), CDH1 (маркера дистальных канальцев), и подокаликсина и WT1 (маркеров гломерулярных подоцитов) для подтверждения клеток, положительных для каждого маркера (фиг. 6B).

Затем OSR1+SIX2+ клетки подвергали органной культуре вместе со спинным мозгом эмбриона E11,5 мыши. Конкретно, OSR1+SIX2+ клетки высевали в 96-луночный планшет с веретеновидным дном с низкой адгезией (Lipidure Coat, NOF), содержащий культуральный супернатант UBC (см. ниже), дополненный 50 нг/мл BMP7 (R&D Systems) и 10 мкМ Y-27632 (Wako) при плотности 1,0×10⁵ клетки/лунку и культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 24 часов. Затем среду заменяли на культуральный супернатант UBC, дополненный 50 нг/мл BMP7, 0,5 мкМ BIO (Wako) и 10 мкМ Y-27632, с последующим культивированием в течение 2-3 суток. Затем клетки выделяли и культивировали вместе со спинным мозгом эмбриона E11,5 мыши на границе между воздухом и культуральным раствором на поликарбонатном фильтре (Millipore), обладающим 0,4-мкм порами, при 37°C. DMEM (Nacalai Tesque), дополненную 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина и 10% FBS, добавляли со стороны культурального раствора (Osafune K, et al. (2006), Development 133:151-61). Через одну неделю, полученные клетки подвергали иммуноокрашиванию против LTL, ламинина, CDH1, подокаликсина и WT1 для подтверждения клеток, положительных по каждому маркеру (фиг. 6C).

Подобным образом, OSR1+SIX2+ клетки подвергали органному культивированию вместе с метанефросом эмбриона E11,5 мыши. Конкретно, OSR1+SIX2+ клетки высевали в 96-луночный планшет с веретеновидным дном с низкой адгезией (Lipidure Coat, NOF), содержащий культуральный супернатант UBC (см. ниже), дополненный 50 нг/мл BMP7 (R&D Systems) и 10 мкМ Y-27632 (Wako) при плотности 1,0×10⁵ клетки/лунку и культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 24 часов. Затем среду заменяли на культуральный супернатант UBC, дополненный 50 нг/мл BMP7, 0,5 мкМ BIO (Wako) и 10 мкМ Y-27632, с последующим культивированием в течение 2-3 суток. Затем клетки выделяли и диссоциировали с использованием Accumax. Метанефрос эмбриона E11,5 мыши получали из ICR мыши, нарезали в DMEM, оставляли в 0,05% трипсине-ЭДТА в течение 10 минут, и диссоциировали пипетированием. Таким образом разделенным клеткам метанефроса эмбриона мыши позволяли стоять неподвижно в DMEM, дополненной 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина и 10% FBS, при 37°C в течение 10 минут и фильтровали через 40-мкм сетчатый фильтр для клеток (BD). Полученные клетки метанефроса эмбриона мыши (5,0×10⁵ клеток) смешивали с вышеуказанными OSR1+SIX2+ клетками (5,0×10⁵ клеток), диссоциированными с использованием Accumax. Смешанные клетки культивировали одни полные сутки и ночь в 96-луночном планшете с веретеновидным дном с низкой адгезией в DMEM, дополненной 10 мкМ Y-27632, 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, и 10%FBS, так чтобы сформировались агрегаты. Полученные агрегаты культивировали на границе раздела воздух-жидкость на поликарбонатном фильтре (Millipore), обладающем 0,4-мкм порами, при 37°C. DMEM (Nacalai Tesque), дополненную 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина и 10% FBS, добавляли со стороны культурального раствора (Uchino, S. et al. JAMA 294, 813-818 (2005)). Через одну неделю, полученные клетки подвергали иммуноокрашиванию против CDH6 (маркера почечных везикул), LTL, ламинина, CDH1, подокаликсина и WT1 для подтверждения клеток, положительных по каждому маркеру (фиг. 6D).

Затем OSR1+SIX2+ клетки высевали при плотности 1,0×10⁵ клеток/лунку в 96-луночный планшет с веретеновидным дном с низкой адгезией (Lipidure Coat, NOF), содержащий культуральный супернатант UBC (см. ниже), дополненный 50 нг/мл BMP7 (R&D Systems) и 10 мкМ Y-27632 (Wako) и культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Затем среду заменяли на культуральный супернатант UBC, дополненный 50 нг/мл BMP7, 0,5 мкМ BIO (Wako), и 10 мкМ Y-27632, с последующим культивированием в течение 2-3 суток. Затем клетки выделяли и трансплантировали в эпидидимальную жировую ткань иммунодефицитных мышей (NOD. CB17-Prkdc^scid/J (Charles river)). Через тридцать суток, ткани в участках трансплантации собирали. В результате наблюдали положительную по LTL и ламинину подобную проксимальным канальцам структуру (фиг. 6E).

Затем клетки из каждой фракции на сутки 28 культивирования (OSR1-SIX2-, OSR1+SIX2-, OSR1-SIX2+, и OSR1+SIX2+), обработанные на стадии индукции из примера 7 подвергали органному культивированию вместе с зачатком мочеточника эмбриона E11,5 мыши. Конкретно, происходящие из iPSC клетки высевали при плотности 1,0×10⁵ клетки/лунку в 96-луночный планшет с веретеновидным дном с низкой адгезией (Lipidure Coat, NOF), содержащий культуральный супернатант UBC (см. ниже), дополненный 50 нг/мл BMP7 (R&D Systems) и 10 мкМ Y-27632 (Wako) и культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 24 часов. Затем среду заменяли на культуральный супернатант UBC, дополненный 50 нг/мл BMP7, 0,5 мкМ BIO (Wako), и 10 мкМ Y-27632, с последующим культивированием в течение 2-3 суток. Затем клетки выделяли и диссоциировали с использованием Accumax. Зачаток мочеточника эмбриона E11,5 мыши получали от мыши ICR. Клетки полученного зачатка мочеточника эмбриона мыши (5,0×10⁵ клеток) смешивали с клетками (5,0×10⁵ клеток), диссоциированными с использованием Accumax, из каждой из групп клеток OSR1-SIX2-, OSR1+SIX2-, OSR1-SIX2+, и OSR1+SIX2+. Смешанные клетки культивировали одни полные сутки и ночь в 96-луночном планшете с веретеновидным дном с низкой адгезией в DMEM, дополненной 10 мкМ Y-27632, 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина и 10% FBS, так чтобы сформировались агрегаты. Полученные агрегаты культивировали на границе раздела воздух-жидкость на поликарбонатном фильтре (Millipore), обладающем 0,4-мкм порами, при 37°C. DMEM (Nacalai Tesque), дополненную 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина и 10% FBS, добавляли со стороны культурального раствора (Uchino, S. et al. JAMA 294, 813-818 (2005)). Через одну неделю, наблюдали полученные агрегаты клеток и, в результате, агрегаты, сформированные исключительно из клеток OSR1+SIX2+, обладали структурой канальцев (фиг. 6F, слева). Кроме того, агрегаты, сформированные из OSR1+SIX2+ клеток подвергали иммуноокрашиванию против DBA (маркера зачатка мочеточника) и, в результате, подтвердили ответвления, происходящие из зачатка мочеточника мыши (фиг. 6F, справа).

Вышеуказанные результаты показали, что OSR1+SIX2+ клетки, индуцированные посредством дифференцировки способом, описанным в примере 7, представляли собой ренальные клетки-предшественники.

[Культуральный супернатант UBC]

Кондиционированную клетками зачатка мочеточника (UBC) среду получали посредством модифицированного варианта способа, описанного в Am J Physiol 273, F757-767 (1997). UBC (предоставленные Dr. Sakurai, Proc Natl Acad Sci 94 USA 6279-6284 (1997)) культивировали в минимальной поддерживающей среде (MEM; Invitrogen), содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку (FBS). Когда клетки достигали 80% конфлюэнтности, их промывали с помощью PBS, и среду заменяли на DMEM/F12+Glutamax, содержащую 0,1 мМ MEM NEAA, 500 Ед/мл пенициллина/стрептомицина, 0,55 мМ 2-меркаптоэтанол и 10% KSR. Затем клетки культивировали в течение 3 суток для получения культурального супернатанта. Культуральный супернатант фильтровали через 0,22-мкм фильтр перед использованием.

[ПРИМЕР 11]

[Терапевтический эффект происходящих из iPS человека ренальных клеток-предшественников]

Происходящие из iPS человека ренальные клетки-предшественники (OSR1+SIX2+ клетки; также обозначаемые как «RP-OS») и группу клеток, содержащую происходящие из iPS человека ренальные клетки-предшественники (OSR1+SIX2- клетки и OSR1+SIX2+ клетки; также обозначаемые как «hiPSC-RP»), которые получали на сутки 25-28 после индукции дифференцировки способом, описанным в примере 7, выделяли посредством проточной цитометрии. Каждые из клеток и группы клеток высевали при плотности 1,0×10⁵ клеток/лунку в 96-луночный планшет с веретеновидным дном с низкой адгезией (Lipidure Coat, NOF), содержащий культуральный супернатант UBC (см. выше), дополненный 50 нг/мл BMP7 (R&D Systems) и 10 мкМ Y-27632 (Wako) и культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 24 часов. Затем среду заменяли на культуральный супернатант UBC, дополненный 50 нг/мл BMP7, 0,5 мкМ BIO (Wako), и 10 мкМ Y-27632, с последующим культивированием в течение 24 часов. В качестве контроля, недифференцированные клетки iPS человека (4A6C3-10) высевали при плотности 1,0×10⁵ клеток/лунку в 96-луночном планшете с веретеновидным дном с низкой адгезией, содержащем среду для клеток ES приматов (ReproCELL), дополненную 10 мкМ Y-27632, с последующим культивированием при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 48 часов. Культивируемые клетки промывали физиологическим солевым раствором для удаления среды. Затем, как описано ниже, 15 видов клеточной массы hiPSC-RP трансплантировали в субкапсулярное пространство почек в моделях на мышах острой почечной недостаточности (AKI). Кроме того, эксперименты для подтверждения тканевой дифференцировки OSR1+SIX2+ клеток (фиг. 7A и 7B) проводили посредством инъекции пяти видов клеточной массы RP-OS в паренхиму почки в модели AKI на мышах или в модели хронической почечной недостаточности на мышах посредством пипетирования, как описано ниже.

[Тест на модели на мышах острой почечной недостаточности (AKI)]

Модель AKI ишемии-реперфузии на мышах получали в соответствии с известным способом (Aging Cell 8, 192-200 (2009), J Am Soc 20 Nephrol 1544-1555 (2009), J Am Soc Nephrol 25, 316-328 (2014)). Самок иммунодефицитных мышей (NOD. CB17-Prkdc^scid/J (Charles River) в возрасте шести недель) подвергали анестезии посредством ингаляции изофлурана и поддерживали при 37°C. Боковой надрез выполняли для каждой мыши для проведения правой нефрэктомии. Затем левую почечную артерию блокировали с использованием нетравматичного зажима для микрососудов (Natsume Seisakusho Co., Ltd., Japan) в течение 45 минут. Зажим удаляли, а затем RP-OS, hiPSC-RP или 4A6C3-10 трансплантировали мыши (и физиологический солевой раствор инъецировали контрольным мышам). Уровни азота мочевины крови (BUN) и креатинина сыворотки (Cr), являющихся маркерами функции почек, в периферической крови мыши, определяли с использованием DRI-CHEM 7000VZ (FUJIFILM, Japan). Развитие состояния AKI подтверждали с помощью увеличения уровня BUN (>41 мг/дл) после ишемии-реперфузии без инфаркта почки. Для анализа тканей почки, окрашивание периодной кислотой-реактивом Шиффа (PAS) или трихромом по Массону (MT) проводили на сутки 3 после ишемии-реперфузии (I/R).

[Тест на модели на мышах хронической почечной недостаточности]

Модель на мышах хронической почечной недостаточности (модель нефрэктомии 5/6) получали с использованием известного способа (Nephrol Dial Transplant 26, 832-838 (2011)). Самок иммунодефицитных мышей (NOD. CB17-Prkdc^scid/J) в возрасте шести недель подвергали анестезии посредством ингаляции изофлурана и поддерживали при 37°C. После правой нефрэктомии, верхний и нижний полюсы левой почки вырезали у каждой мыши. Через две недели после хирургической операции, клеточные массы RP-OS трансплантировали мыши. Через трое суток или две недели после трансплантации, мышь умерщвляли, и тканевые срезы почки тестировали посредством иммуноокрашивания.

[Результаты]

Через две недели после трансплантации RP-OS в паренхиму почки, некоторые из трансплантированных клеток RP-OS встраивались в почку хозяина, так чтобы дифференцироваться в положительные по маркеру проксимальных канальцев LTL и AQP1 клетки как в модели AKI (фиг. 7A), так и в модели хронической почечной недостаточности (фиг. 7B). Однако в результате трансплантации RP-OS в паренхиму почки, не наблюдали очевидных эффектов на функцию почек в какой-либо модели (данные не показаны). Поскольку существует сообщение, что ренальная субкапсулярная трансплантация позволяет доставку увеличенного количества мезенхимальных стволовых клеток непосредственно в поврежденную почку по сравнению с внутривенной инъекции (Transplant Proc 41, 947-951 (2009)), авторы настоящего изобретения тестировали терапевтические эффекты ренальной субкапсулярной трансплантации hiPSC-RP. В результате обнаружили, что уровень BUN и уровень Cr в сыворотке были значительно снижены в группе трансплантации hiPSC-RP на сутки 2, 4 и 6 после ишемии-реперфузии, по сравнению с контрольной группой и группой трансплантации недифференцированных клеток iPS человека (фиг. 7C). Результаты гистологического анализа подтвердили, что расширенные канальцы с цилиндрами в области паренхимы почки в группе трансплантации hiPSC-RP были значительно меньше, чем в контрольной группе, и область фиброза в группе трансплантации hiPSC-RP была уже, чем в контрольной группе (Фиг. 7D и 7E). Тот факт, что hiPSC-RP не были встроены в почку хозяина, позволяет предполагать, что терапевтические эффекты hiPSC-RP, подтвержденные посредством этого способа, были в основном основаны на паракринном действии.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Как подробно описано выше, настоящее изобретение относится к способу индукции дифференцировки клеток промежуточной мезодермы в ренальные клетки-предшественники. Соответственно, ренальные клетки-предшественники, полученные этим способом, можно использовать в регенеративной медицине для заболеваний почек, таких как почечная недостаточность.

Полное содержание всех публикаций, патентов и патентных заявок, процитированных в настоящем документе, полностью приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения ренальных клеток-предшественников из клеток промежуточной мезодермы, включающему культивирование клеток промежуточной мезодермы в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и ингибитор(ы) BMP. Также раскрыт способ получения ренальных клеток-предшественников из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, также предусматривающий культивирование клеток в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и ингибитор(ы) BMP. Изобретение позволяет эффективно получать ренальные клетки-предшественники. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 11 пр.

1. Способ получения ренальных клеток-предшественников из клеток промежуточной мезодермы, включающий в себя следующие стадии: культивирование клеток промежуточной мезодермы в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и ингибитор(ы) BMP, индуцируя таким образом ренальные клетки-предшественники из клеток промежуточной мезодермы, где клетки промежуточной мезодермы являются клетками промежуточной мезодермы, индуцированными из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS), и положительными по OSR1 клетками, где клетки промежуточной мезодермы представляют собой клетки промежуточной мезодермы, полученные способом, включающим следующие стадии:

(i) культивирование iPS клеток в среде, содержащей активин A и ингибитор(ингибиторы) GSK-3β, или в среде, содержащей ингибитор(ингибиторы) GSK-3β и производное(производные) ретиноевой кислоты; и

(ii-1) культивирование клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей BMP7 и ингибитор(ингибиторы) GSK-3β, или среде, содержащей производное(производные) ретиноевой кислоты, или

(ii-2) (a) культивирование клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей BMP7 и ингибитор(ингибиторы) GSK-3β, и (b) культивирование клеток, полученных на стадии (а), в среде, содержащей активатор(активаторы) передачи сигнала TGFβ и производное(производные) ретиноевой кислоты.

2. Способ по п. 1, где ренальные клетки-предшественники представляют собой положительные по SIX2 клетки.

3. Способ по п. 1 или 2, где активатор передачи сигнала TGFβ представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, IDE1 и IDE2.

4. Способ по п. 1 или 2, где ингибитор BMP представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из дорсоморфина, ноггина, LDN193189 и DMH1.

5. Способ по п. 1 или 2, где активатор передачи сигнала TGFβ представляет собой TGFβ1, и ингибитор BMP представляет собой DMH1.

6. Способ по п. 1 или 2, где ингибитор GSK-3β представляет собой CHIR99021.

7. Способ по п. 1 или 2, где производное ретиноевой кислоты представляет собой AM580 или TTNPB.

8. Способ по п. 1 или 2, где клетки iPS представляют собой клетки iPS человека.

9. Способ получения ренальных клеток-предшественников из индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, включающий в себя следующие стадии:

(i) культивирование iPS клеток в среде, содержащей активин A и ингибитор(ингибиторы) GSK-3β, или в среде, содержащей ингибитор(ингибиторы) GSK-3β и производное(производные) ретиноевой кислоты;

(ii-1) культивирование клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей BMP7 и ингибитор(ингибиторы) GSK-3β или среде, содержащей производное(производные) ретиноевой кислоты, или

(ii-2) (a) культивирование клеток, полученных на стадии (i), в среде, содержащей BMP7 и ингибитор(ингибиторы) GSK-3β, и (b) культивирование клеток, полученных на стадии (а), в среде, содержащей активатор(активаторы) передачи сигнала TGFβ и производное(производные) ретиноевой кислоты,

где клетки, полученные на стадии (ii-1) или стадии (ii-2), представляют собой положительные по OSR1 клетки; и

(iii) культивирование клеток, полученных на стадии (ii-1) или стадии (ii-2), в среде, содержащей активатор(ы) передачи сигнала TGFβ и ингибитор(ы) BMP.

10. Способ по п. 9, где ренальные клетки-предшественники представляют собой положительные по SIX2 клетки.

11. Способ по п. 9 или 10, где активатор передачи сигнала TGFβ представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, IDE1 и IDE2.

12. Способ по п. 9 или 10, где ингибитор BMP представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, состоящей из дорсоморфина, ноггина, LDN193189 и DMH1.

13. Способ по п. 9 или 10, где активатор передачи сигнала TGFβ представляет собой TGFβ1, и ингибитор BMP представляет собой DMH1.

14. Способ по п. 9 или 10, где ингибитор GSK-3β представляет собой CHIR99021.

15. Способ по п. 9 или 10, где производное ретиноевой кислоты представляет собой AM580 или TTNPB.

16. Способ по п. 9 или 10, где клетки iPS представляют собой клетки iPS человека.