Способ модификации поверхности биоразлагаемых полимерных материалов Российский патент 2019 года по МПК A61K38/38 C08F8/30 A61L27/00 

Изобретение относится к области химии полимеров и медицины, а именно к способу модификации поверхности биоразлагаемых полимерных материалов, для придания им заданных свойств (гемосовместимости, тромборезистентности, ускоренной эндотелизации, антибактериальных или противовирусных свойства и др.) для применение в медицинской промышленности для создания, например, протезов кровеносных сосудов, сосудистых заплат для артериальной реконструкции или создания лекарственных форм препаратов с пролонгированным сроком действия.

В современной медицине широко используются различные биоразлагаемые полимерные материалы. В частности, биоразлагаемые полимеры используются для реконструкции кровеносных сосудов. Наноразмерные частицы из биоразлагаемых материалов широко используются при создании средств направленной доставки лекарственных препаратов. Использование полимеров в системе кровообращения выдвигает к ним ряд требований, основное из которых -гемосовместимость. В тоже время к полимерам могут предъявляться и другие требования в зависимости от конкретных решаемых задач.

В настоящее время для придания полимерным материалам, контактирующих с кровью, заданных свойств, используются различные подходы. Так, например, для придания полимеру, из которого изготовлен сосудистый протез, антибактериальных свойств, изделие погружают в насыщенный раствор спирторастворимого антибиотика на 24-72 ч, перед использованием извлекают и помещают в 1%-ный раствор клея «Сульфакрилат» (патент RU 2141280 С1, опубл. 20.11.1999).

Близкий по смыслу подход введения биологически активных веществ в сосудистый протез, изготавливаемый методом электроспининга, предложен в патентной заявке US 2014/0309726 А1, опубл. 16.10.2014. Представленный сосудистый трансплантат содержит внутренний слой, выполненный из биоразлагаемого полиэфирного соединения - полиглицеролсебаката, и наружную оболочку, выполненную из поликапролактона и/или полимеров или сополимеров гликоевой и молочной кислоты. Для снижения тромбогенных свойств импланта и повышения его биосовместимости, внутреннюю поверхность обрабатывают раствором гепарина, а наружную оболочку пропитывают любыми биологически активными компонентами, способствующими регенерации тканей (например, фактором роста стволовых клеток (SCF), сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) и др.).

Недостатком известного способа является не контролируемое высвобождение адсорбированных компонентов. Кроме того, прямая адсорбция гепарина на полимерах не обеспечивает достаточной тромборезистентности, поскольку, с одной стороны, взаимодействие "гидрофобная поверхность полимера - гидрофильная молекула гепарина" является слабым, а, с другой стороны, гепарин имеет большое сродство к ряду составляющих крови, что приводит к его быстрому удалению с полимерной поверхности.

Для замедления высвобождения лекарственного средства из состава полимерного материала предложен способ получения микроволокнистого сосудистого протеза методом электроспининга, где лекарственное средство в растворе диметилсульфоксида (паклитаксел, сиролимус или диклофенак) непосредственно вводят в исходный раствор полимера (патент RU 2669344 С1, опубл. 10.10.2018).

Однако применение диметилсульфоксида может приводить к изменению физических характеристик полимера, что может иметь критическое значение при создание сосудистых протезов или иных изделий для артериальной реконструкции.

В ряде работ предложен способ ковалентного присоединения факторов клеточной адгезии - пептидов, содержащих RGD-фрагмент, к биоразлагаемым поверхностям тканеинженерных сосудистых графтов на основе поликапролактона (Gabriel М, et. al. Biomater. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. // Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition, 2006, Vol. 17, No. 5, pp. 567-577). Способ включает двухэтапную модификацию поверхности, где на первом этапе полимер обрабатывают 40% водным раствором этилендиамина, а на втором этапе выполняют модификацию поверхности пептидом, содержащим RGD фрагмент (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), используя в качестве кросс-сшивающего агента глутаровый альдегид.

Недостатком способа является использование глутарового альдегида, приводящего к образованию цитотоксичных продуктов (Hass, V. et. al. Collagen cross-linkers on dentin bonding: Stability of the adhesive interfaces, degree of conversion of the adhesive, cytotoxicity and in situ MMP inhibition. // Dent Mater 32, 732, 2016), а также способствующего кальцификации (Fahrenholtz, M.M. et.al., Development of a heart valve model surface for optimization of surface modifications. Acta Biomater, 2015, V. 26, P. 64) и развитию воспалительных процессов (Delgado, L.M. et. al., To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. // Tissue Eng Part В Rev, 2015, V. 21, P. 298).

Известно, что ключевым моментом, влияющим на процесс свертывания крови в сосудистых протезах и заплатах является адсорбция на поверхности полимеров белков (Смурова Е.В., Доброва Н.Б. Создание полимерных материалов с тромборезистентными свойствами, Химия и технология высокомолекулярных соединений, Москва, ВИНИТИ, 1976, т. 10, с. 30-60), которая бывает благоприятной и неблагоприятной. Так, адсорбция человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) несколько ингибирует дальнейшие этапы свертывания крови на полимерной поверхности, а адсорбция фибриногена, напротив, ускоряет процесс свертывания крови.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения тромборезистентных полимерных материалов, контактирующих с кровью путем их последовательной обработки поверхностно-активным веществом (ПАВ), затем гепарином, затем глутаровым альбумином, при этом в качестве ПАВ используют 1-2% раствор альбумина человека или 0,5% раствор фибриногена, а обработку ими проводят при 30-40°С в течение 1,5-2,5 часа, отмывают материал водой, с последующей сорбцией гепарина на альбуминизированной поверхности и «сшивки» гепраин-альбумин путем обработки глутаровым альдегидом. Обработку гепарином производят из водного раствора с концентрацией 40-5000 ед/мл при 30-40°С в течение 1-1,5 часа, а глутаровым альдегидом при 50-60°С в течение 15-30 минут (SU 1097336 А1, опубл. 15.06.1984). Данный способ позволяет избежать сорбции на поверхности полимеров нежелательных белков, ускоряющих свертывание крови.

Недостатком способа является использование токсичного реагента (глутарового альдегида) и применение высокой температуры (50-60°С). Кроме того, сорбция альбумина в значительной степени зависит от типа используемого полимера и в случае использования биоразлагаемых полимеров на основе полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) эффективность сорбции в физиологических условиях может оказаться недостаточной для существования модифицированного слоя в течении продолжительного времени.

Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего возможность получения стабильной в физиологических условиях альбуминизированной поверхности, обладающей заданными биологическими свойствами.

Технический результат: повышение эффективности сорбции альбумина и повышение стабильности модифицированных поверхностей полимерных материалов.

Поставленная задача достигается последовательной обработкой поверхности биоразлагаемых полимеров сначала алифатическими аминогруппами, затем активированным эфиром полиненасыщенной жирной кислоты, далее альбумином, с присоединенным по SH группе цистина 34 ЧСА малеимидным производным, необходимым для придания заданных свойств полимеру.

Предлагаемый способ заключается в следующем. На первой стадии поверхность полимера обрабатывают раствором алифатического диамина в 60% водном растворе изопропилового спирта при температуре 24°С - 30°С в течение 30-60 мин. После чего поверхность тщательно последовательно промывают 50% водным раствором изопропилового спирта, далее деионизированной водой, 0,3% раствором не ионного детергента Tween-20 в деионизированной воде. В качестве алифатического диамина может быть взят гексаметилендиамин, 4,7,10-trioxa-1,13-тридекандиамин и т.п.

На второй стадии, поверхность полимера, содержащую алифатические аминогруппы, обрабатывают 10 мМ раствором гидроксисукцинимидного эфира линолевой (9,12-уноктадиеновой) кислоты в абсолютным изопропиловом спирте, содержащем 0,1% триэтиламина при температуре 37-40°С в течении 60 минут. Модифицированную поверхность полимера тщательно последовательно промывают изопропиловым спиртом, 50% водным раствором изопропилового спирта, 0,3% раствором Tween-20 в деионизированной воде, деионизированной водой.

Предварительно, выполняют модификацию человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) требуемым малеимидным производным биологически активного соединения (БАВ) известным способом (Popova T.V., et. al, Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2018. - V. 28. - P. 260-264). В качестве биологически активного соединения могут быть взяты антибиотик, RGD-пептид, гепарин и т.п.

Для этого, к 0,001 М раствору ЧСА в фосфатном буфере (PBS) с рН 7.4 добавляют 0,01 М раствор малеимидного производного БАВ в воде или 0,03 М раствор в диметилсульфоксиде, смесь инкубируют при 37°С в течение 18 часов, низкомолекулярные компоненты реакционной смеси отделяют с помощью концентратора «Centricon» при 9000 g. Полученный коньюгат ЧСА с соответствующим малеимидным производным (коньюгат ЧСА) используют на следующей стадии.

Поверхность полимера, содержащую остатки линолевой кислоты, обрабатывают водным раствором конъюгата ЧСА в течении 15-30 минут, затем модифицированную поверхность полимера промывают водой, три раза 0,9% раствором хлорида натрия, далее опять водой.

Предложенный способ отличается простотой и отсутствием токсичных реагентов, конкретнее, отсутствует обработка поверхности полимера глутаровым альдегидом, приводящая к нарушению нативной структуры белка и образованию токсичных продуктов. Введение на поверхность полимера полиненасыщенной жирной кислоты значительно увеличивает эффективность связывания ЧСА за счет наличия у ЧСА специфического центра связывания, а предварительная модификация ЧСА различными биологически активными соединениями позволяет вводить на поверхность полимера различные требуемые компоненты (один или несколько) используя общую процедуру.

Определяющими существенными признаками заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1) Поверхность полимера последовательно обрабатывают сначала 10% раствором диамина (преимущественно гексаметилендиамином или 4,7,10-trioxa-1,13-тридекандиамином) в 60% водном растворе изопропилового спирта при 24-30°С в течение 30-60 мин, а затем 10 мМ раствором N-гидроксисукцинимидного эфира линолевой (9,12-уноктадиеновой) кислоты в изопропиловом спирте, что позволяет существенно повысить прочность связывания ЧСА с поверхностью полимера за счет введения на поверхность через линкерную группу полиненасыщенных жирных кислот.

2) Поверхность полимера, содержащую остатки линолевой кислоты, обрабатывают водным раствором предварительно модифицированного ЧСА в течении 15-30 минут, что позволяет использовать широкий набор коммерчески доступных или легко получаемых биологически активных соединений (RGD-пептиды, антибиотики, антикоогулянты, красители и т.п.).

В связи с тем, что поиск по источникам патентной и научно-технической информации не выявил аналогичного технического решения, можно сделать вывод, что заявляемый способ модификации поверхности биоразлагаемых полимерных материалов для придания им заданных свойств, отвечает критериям патентоспособности, а именно обладает «новизной» и «изобретательским уровнем».

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фигура 1. Структура RGD-пептида, содержащего малеимидный фрагмент и флюоресцентный краситель.

Фигура 2. Кинетика вымывания конъюгата ЧСА с поверхности, модифицированной остатками линолевой кислоты (ряд 1) и немодифицированной поверхности (ряд 2).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

А). Полимерную пластину на основе полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) (1:1) площадью 10 см² обрабатывали 10% раствором 4,7,10-trioxa-1,13-тридекандиамина в 60% водном растворе изопропилового спирта при 24°С в течение 60 мин. После чего поверхность тщательно последовательно промывали от избытка исходных реагентов 50% водным раствором изопропилового спирта (3×50 мл), далее деионизированной водой (2×50 мл), 0,3% раствором Tween-20 в деионизированной воде. Количественное определение аминогрупп проводили с помощью нингидринового теста. От модифицированной поверхности отрезали фрагмент площадью 1 см², помещали в пробирки на 1,5 мл и обрабатывали 1 мл 1% раствором нингидрина в этаноле в присутствии 20 мкл 0,05% аскорбиновой кислоты. Реакцию проводили при 80°С в течение 30 минут, образцы тщательно промывали этанолом, высушивали, растворяли в 0,5 мл хлороформа. К полученному раствору добавляли 0,5 мл изопропанола и измеряли оптическую плотность (L=1 см) при длине волны 568 нм. Количество аминогрупп на 1 см² составляло 8,4±0.2×10^-9 М/см².

Б). Обработанную аминогруппами полимерную пластину высушивали, промывали абсолютным изопропиловым спиртом (3×20 мл) и помещали в 10 мМ раствор N-гидроксисукцинимидного эфира линолевой (9,12-уноктадиеновой) кислоты в абсолютном изопропиловом спирте, содержащем 0,1% триэтиламина. Обработку проводили в шейкере при 40°С в течении 60 минут. Обработанный образец последовательно промывали изопропиловым спиртом (3×50 мл), 50% водным раствором изопропилового спирта, 0,3% раствором Tween-20 в деионизированной воде (50 мл), деионизированной водой (30×50 мл).

Количество не прореагировавших аминогрупп на 1 см² не превышает 0,4±0.1×10^-9 М/см².

В) Модификация ЧСА. К 1 мл 0,001 М раствора ЧСА (66.4 мг) в фосфатном буфере (PBS) с рН 7.4 добавляли 7 мг малеимидного производного RGD-пептида, содержащего в структуре флюоресцентный краситель Су3 (фиг. 1), в 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 18 ч. После инкубации реакционную смесь очищали от низкомолекулярных веществ с помощью концентратора «Centricon» (Amicon Centriprep YM30, Millipore, Bedford) при 9000 g. Для этого раствор белка концентрировали до минимально возможного объема (~0,2 мл), добавляли буфер PBS (0,4 мл×4), а затем воду (0,4 мл×6), после добавления каждой порции буфера или воды раствор концентрировали. Объем полученного на заключительном этапе раствора конъюгата ЧСА с малеимидным производным RGD-пептида доводили водой до 20 мл и использовали на следующей стадии.

Г) Обработанный образец полимерного материала, полученный на стадии Б, помещали в раствор конъюгата ЧСА с малеимидным производным RGD пептида, полученным на стадии В (концентрация альбумина 3,3 г/л). Образец выдерживали на шейкере при 37°С в течение 15 минут, пластину промывали водой (2×50 мл), 0,9% раствором хлорида натрия (3×50 мл), водой (50 мл).

Для определения количества сорбированного белка образец модифицированного полимерного материала (1 см²) растворяли в гексафторизопропиловом спирте и измеряли оптическую плотность (L=1 см) при длине волны 550 нм. Количество сорбированного белка составляло 3,1±0,2 мкг/см².

Пример 2.

А). Полимерную пластину на основе полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) (1:1) площадью 10 см² обрабатывали 10% раствором гексаметилендиамина в 60% водном растворе изопропилового спирта при 30°С в течение 30 мин. После чего поверхность тщательно последовательно промывали 50% водным раствором изопропилового спирта (3×50 мл), далее деионизированной водой (2×50 мл), 0,3%) раствором Tween-20 в деионизированной воде. Количественное определение аминогрупп проводили с помощью нингидринового теста как описано в примере 1. Количество аминогрупп на 1 см² составляло 7,5±0.2×10^-9 М/см².

Б). Обработанную аминогруппами полимерную пластину обрабатывали 10 мМ раствором N-гидроксисукцинимидного эфира линолевой кислоты при температуре 37 в течении 60 минут, как описано в примере 1.

Количество не прореагировавших аминогрупп на 1 см² не превышает 0,6±0.1×10^-9 М/см²

В) Модификацию ЧСА проводили, как описано в примере 1.

Г) Обработанный образец полимерного материала, полученный на стадии Б, помещали в раствор конъюгата ЧСА с малеимидным производным RGD пептида, полученным на стадии В (концентрация альбумина 3,3 г/л). Образец выдерживали на шейкере при 37°С в течение 15 минут, пластину промывали водой (2×50 мл), 0,9% раствором хлорида натрия (3×50 мл), водой (50 мл).

Для определения количества сорбированного белка образец модифицированного материала (1 см²) растворяли в гексафторизопропиловом спирте и измеряли оптическую плотность (L=1 см) при длине волны 550 нм. Количество сорбированного белка составляло 2,9±0,2 мкг/см².

Пример 3 Сравнительный анализ эффективности связывания конъюгата ЧСА с модифицированной, согласно заявляемому способу, и не модифицированной поверхностью.

Полимерные пластины на основе полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) площадью 10 см² с немодифицированной поверхностью, и поверхностью, модифицированной линолевой кислотой, как описано в примере 1 (стадии А и Б), обрабатывали конъюгатом ЧСА с RGD-пептидом, содержащим в структуре флюоресцентный краситель Су3 (стадия В, пример 1) как описано в примере 1 (стадия Г), без промывки раствором хлорида натрия.

Образцы модифицированного полимера помещали в 0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор) при 37°С и выдерживали в шейкере. Через 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 и 72 часа измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 550 нм. За 100% принята величина сорбированного белка, определенная как описано в пункте Г, пример 2. Полученный результат представлен на фиг. 2.

Как видно из фиг. 2, в отличии от немодифицированной поверхности, модификация поверхности полимера, в соответствии с заявляемым способом, обеспечивает прочное связывание конъюгатов альбумина с поверхностью полимера. После первоночальной промывки физиологическим раствором количество связанного альбумина уменьшается на 6% и в дальнейшем практически не изменяется.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получать модифицированные поверхности полимеров с заданными биологическими свойствами, которые отличаются повышенной стабильностью в физиологических условиях, а также обладают за счет наличия конъюгатов альбумина высокой био- и гемосовместимостью для использования в медицинской практике. Процедура модификации полимера отличается простотой, воспроизводимостью и технологичностью.

Настоящее изобретение относится к способу модификации поверхности биоразлагаемых полимеров, используемых в области химии полимеров и медицины. Способ включает обработку поверхности полимера раствором алифатического диамина в 60% водном растворе изопропилового спирта при температуре 24°С - 30°С в течение 30-60 минут, затем 10 мМ раствором гидроксисукцинимидного эфира линолевой (9,12-уноктадиеновой) кислоты в изопропиловом спирте, содержащем 0,1% триэтиламина при температуре 37-40°С в течение 60 минут, далее поверхность полимера обрабатывают водным раствором конъюгата человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) с соответствующим малеимидным производным биологически активного соединения в течение 15-30 минут. Предварительно выполняют модификацию ЧСА требуемым малеимидным производным биологически активного соединения. Способ приводит к повышению эффективности сорбции альбумина и повышению стабильности модифицированных поверхностей полимерных материалов. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

1. Способ модификации поверхности биоразлагаемых полимерных материалов, включающий обработку поверхности альбумином, отличающийся тем, что на первой стадии поверхность полимера обрабатывают раствором алифатического диамина в 60% водном растворе изопропилового спирта при температуре 24°С - 30°С в течение 30-60 минут, на второй стадии поверхность полимера, содержащего алифатический амин, обрабатывают 10 мМ раствором гидроксисукцинимидного эфира линолевой (9,12-уноктадиеновой) кислоты в изопропиловом спирте, содержащем 0,1% триэтиламина при температуре, 37-40°С в течении 60 минут, затем поверхность полимера, содержащую остатки линолевой кислоты, обрабатывают водным раствором конъюгата человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) с соответствующим малеимидным производным биологически активного соединения в течение 15-30 минут, при этом после каждой стадии модификации поверхность полимерных материалов промывают от избытка исходных реагентов, при этом предварительно выполняют модификацию ЧСА требуемым малеимидным производным биологически активного соединения.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве алифатического диамина используют гексаметилендиамин или 4,7,10-trioxa-1,13-тридекандиамин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после первой стадии модификации поверхность полимера последовательно промывают 50% водным раствором изопропилового спирта, затем водой, далее 0,3% раствором Tween-20 в воде.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после второй стадии модификации поверхность полимера последовательно промывают изопропиловым спиртом, затем 50% водным раствором изопропилового спирта, далее 0,3% раствором Tween-20 в воде, далее водой.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на последней стадии модифицированную поверхность полимера промывают водой, затем 0,9% раствором хлорида натрия, далее опять водой.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что биологически активные соединения выбирают из группы: антибиотик, RGD-пептид, гепарин.