КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ НА ОСНОВЕ АФУКОЗИЛИРОВАННОГО АНТИТЕЛА К CD20 В СОЧЕТАНИИ С КОНЪЮГАТОМ АНТИТЕЛО К CD22 - ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2019 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61K45/06 A61K47/00 

В настоящей заявке испрашивается приоритет по дате подачи предварительной заявки на патент США №61/818810, зарегистрированной 2 мая 2013 г., полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В настоящем изобретении предложена комбинированная терапия на основе афукозилированного антитела к CD20 в сочетании с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство для лечения рака.

Предпосылки создания изобретения

Афукозилированные антитела

Опосредованные клеткой эффекторные функции моноклональных антител можно усиливать путем конструирования их олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc. 176-180 и в US №6602684. Антитела IgG1-типа, представляющие собой антитела, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования в положении Asn297 в каждом СН2-домене. Два сложных биантенных олигосахарида, которые присоединены к Asn297, размещаются между СН2-доменами, образуя обширные контакты с каркасом полипептида, и их наличие является существенным для способности антитела опосредовать эффекторные функции, такие как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 1995, cc. 813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 1998, cc. 59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 1997, cc. 26-32). У и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc. 176-180 и в WO 1999/54342 продемонстрировано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III («GnTIII»), т.е. гликозилтрансферазы, которая катализирует образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает ADCC-активность антител in vitro. Изменение состава связанного с N297 углевода или его элиминация оказывают также воздействие на связывание Fc с FcγR и C1q ( и др., Nature Biotechnol. 17,1999, cc. 176-180; Davies J. и др., Biotechnol. Bioeng. 74, 2001, cc. 288-294; Mimura Y. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, cc. 45539-45547; Radaev S. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, cc. 16478-16483; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, cc. 6591-6604; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 277, 2002, cc. 26733-26740; Simmons L.C. и др., J. Immunol. Methods 263, 2002, cc. 133-147).

Опубликованы исследования, в которых обсуждается активность афукозилированных и фукозилированных антител, включая антитела к CD20 (см., например, Iida S. и др., Clin. Cancer Res. 12, 2006, cc. 2879-2887; Natsume A. и др., J. Immunol. Methods 306, 2005, cc. 93-103; Satoh M. и др., Expert Opin. Biol. Ther. 6, 2006, cc. 1161-1173; Kanda Y., и др., Biotechnol. Bioeng. 94, 2006, cc. 680-688; Davies J. и др., Biotechnol. Bioeng. 74, 2001, cc. 288-294). CD20 и антитела к CD20

Молекула CD20 (которую называют также эволюционно консервативным дифференцировочным антигеном человеческих В-лимфоцитов или Вр35) представляет собой широко известный гидрофобный трансмембранный белок, локализованный на пре-В и зрелых В-лимфоцитах (Valentine М.А. и др., J. Biol. Chem. 264, 1989, сс.11282-11287; и Einfeld D.A. и др., EMBO J. 7, 1988, сс.711-717; Tedder T.F. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 1988, cc. 208-212; Stamenkovic I. и др., J. Exp.Med. 167, 1988, cc. 1975-1980; Tedder T.F. и др., J. Immunol. 142, 1989, cc. 2560-2568). При неходжкинских лимфомах (HXЛ) CD20 экспрессируется на поверхности более 90% В-клеток (Anderson K.С.и др., Blood 63, 1984, сс.1424-1433), но он не выявлен на гематопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, здоровых плазматических клетках или в других здоровых тканях (Tedder T.F. и др., J. Immunol. 135, 1985, сс.973-979).

Существуют два различных типа антител к CD20, которые существенно отличаются механизмом связывания CD20 и биологической активностью (Cragg M.S. и др., Blood 103, 2004, сс.2738-2743; и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 2003, сс.1045-1052). Антитела типа I, такие, например, как ритуксимаб (не афукозилированное антитело с содержанием фукозы 85% или более), обладают сильной опосредуемой комплементом цитотоксичностью.

Антитела типа II, такие, например, как тозитумомаб (Bl), 11 В8, АТ80 или гуманизированные антитела B-Ly1, эффективно инициируют гибель клеток-мишеней посредством независимого от каспазы апоптоза при сопутствующей обработке фосфатидилсерином.

Конъюгаты антитело к СD22-лекарственное средство Другие В-клеточные антигены, такие как CD19, CD22 и CD52, представляют собой мишени, имеющие потенциальное терапевтическое значение для лечения лимфомы (Grillo-Lopez A.J. и др., Curr Pharm Biotechnol, 2, 2001, сс.301-311). CD22 представляет собой сиалогликопротеин с молекулярной массой 135 кДа, присутствующий только на В-клетках, который экспрессируется на поверхности В-клеток только на зрелых стадиях дифференцировки (Dorken В. и др., J. Immunol. 136, 1986, сс.4470-4479). Превалирующей формой CD22 является СD22бета, которая содержит во внеклеточном домене семь доменов суперсемейства иммуноглобулинов (Wilson G.L. и др., J. Exp.Med. 173, 1991, сс.137-146). В вариантной форме, т.е. СD22-альфа, отсутствуют домены 3 и 4 суперсемейства иммуноглобулинов (Stamenkovic I. и Seed В., Nature 345, 1990, сс.74-77). Установлено, что связывание лигандов с человеческим CD22 ассоциировано с доменами 1 и 2 суперсемейства иммуноглобулинов (которые обозначают также как эпитопы 1 и 2) (Engel Р. и др., J. Exp.Med. 181, 1995, сс.1581-1586).

При В-клеточной НХЛ уровни экспрессии CD22 составляют от 91% до 99% в популяциях с агрессивной и индолентной формой заболевания соответственно (Cesano А. и др.,, Blood 100, 2002, с. 350а)). CD22 может функционировать и как компонент комплекса В-клеточной активации (Sato S. и др., Semin. Immunol. 10, 1998, сс.287-296), и как молекула адгезии (Engel Р. и др., J. Immunol. 150, 1993, сс.4719-4732). В-клетки мышей с дефицитом CD22 имеют укороченную продолжительность жизни и отличаются повышенным уровнем апоптоза, это позволяет предположить, что этот антиген играет ключевую роль в выживаемости В-клеток (Otipoby K.L. и др., Nature (Lond) 384, 1996, сс.634-637). После связывании с его встречающимся(имися) в естественных условиях лигандом(ами) или антителами CD22 быстро интернализуется, обеспечивая сильный костимулирующий сигнал в первичных В-клетках и проапоптозные сигналы в неопластических В-клетках (Sato S. и др., Immunity 5, 1996, сс.551-562).

Антитела к CD22 изучены в качестве потенциальных терапевтических средств для В-клеточных видов рака и других В-клеточных пролиферативных заболеваний. Указанные антитела к CD22 включают RFB4 (Mansfield Е. и др., Blood 90, 1997, сс.2020-2026), СМС-544 (DiJoseph J.F., Blood 103, 2004, сс.1807-1814) и LL2 (Pawlak-Byczkowska E.J. и др., Cancer Res. 49, 1989, сс.4568-4577)). Антитело LL2 (прежнее название НРВ-2) представляет собой мышиное моноклональное антитело IgG2a-изотипа, направленное против антигена CD22 (Pawlak-Byczkowska E.J. и др., 1989, выше). Иммуногистологические оценки in vitro продемонстрировали наличие реактивности антитела LL2 в отношении 50 из 51 протестированного образца В-клеточной НХЛ, но не в отношении других злокачественных или здоровых нелимфоидных тканей (Pawlak-Byczkowska, 1989, выше; Stein R. и др., Cancer Immunol. Immunother. 37, 1993, сс.293-298).

Применение конъюгатов антитело-лекарственное средство для местной доставки цитотоксических или цитостатических агентов, т.е. лекарственных средств для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении различных видов рака (Syrigos и Epenetos, Anticancer Research 19, 1999, сс.605-614; Niculescu-Duvaz и Springer Adv. Drg Del. Rev. 26, 1997, cc. 151-172; US №4975278), позволяет осуществлять направленное введение фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, к опухолям и внутриклеточное накапливание в них, в случаях, когда системное введение указанных неконъюгированных лекарственных средств может приводить к неприемлемым уровням токсичности в отношении здоровых клеток, наряду с опухолевыми клетками, подлежащими элиминации (Baldwin и др., Lancet, 14 марта 1986 г., сс.603-605; Thorpe, «Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review», в: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, под ред. A. Pinchera и др., 1986, сс.475-506). При этом ожидается сочетание максимальной эффективности с минимальной токсичностью. Известны как поликлональные антитела, так и моноклональные антитела, которые можно применять в этих стратегиях (Rowland и др., Cancer Immunol. Immunother., 21, 1986, сс.183-187). Лекарственные средства, применяемые в этих методах, включают дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндесин (Rowland и др., Cancer Immunol. Immunother. 21, 1986, сс.183-187). Токсины, применяемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Kerr и др., Bioconjugate Chem. 8(6), 1997, сс.781-784; Mandler и др., Journal of the Nat. Cancer Inst. 92(19), 2000, cc. 1573-1581; Mandler и др., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10, 2000, cc. 1025-1028; Mandler и др., Bioconjugate Chem. 13, 2002, cc. 786-791), майтанзиноиды (ЕР 1391213; Liu и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1996, cc. 8618-8623) и калихеамицин (Lode и др., Cancer Res. 58, 1998, с. 2928; Hinman и др., Cancer Res. 53, 1993, cc. 3336-3342). Токсины могут проявлять свои цитотоксические и цитостатические действия посредством таких механизмов, как связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомераз (Meyer D.L. и Senter P.D. «Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Тhегару» в: Annual Reports in Medicinal Chemistry, т.38, глава 23, 2003, cc. 229-237). Некоторые цитотоксические лекарственные средства имеют тенденцию к потере или снижению активности при их конъюгации с крупными антибиотиками или белковыми лигандами рецепторов.

ZEVALIN® (ибритумомаба тиуксетан, фирма Biogen/Idec) представляет собой конъюгат антитело-радиоизотоп, состоящий из мышиного моноклонального антитела IgGl каппа, направленного против антигена CD20,

находящегося на поверхности здоровых и злокачественных В-лимфоцитов, и радиоизотопа ^IIIIn или ⁹⁰Y, связанного с помощью тиомочевинного линкера-хелатора (Wiseman и др., Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7), 2000, cc. 766-77; Wiseman и др., Blood 99(12), 2002, cc. 4336-4342; Witzig и др., J. Clin. Oncol. 20(10), 2002, cc. 2453-2463; Witzig и др., J. Clin. Oncol. 20(15), 2002, cc. 3262-3269). Хотя зевалин обладает активностью, направленной против В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ), его введение приводит к тяжелым и продолжительным цитопениям у большинства пациентов. MYLOTARG™ (гемтузумаба озогамицин, фирма Wyeth Pharmaceuticals), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела hu-CD33, связанного с калихеамицином, разрешен в 2000 г. для лечения острого миелоидного лейкоза посредством инъекции (Drugs of the Future 25(7), 2000, с. 686; US №№4970198, 5079233, 5585089, 5606040, 5693762, 5739116, 5767285, 5773001). Кантузумаба мертанзин (фирма Immunogen, Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела huC242, связанного посредством дисульфидного линкера SPP с компонентом в виде майтанзиноидного лекарственного средства, DM1, разработан для лечения видов рака, которые экспрессируют антиген CanAg, таких как рак ободочной кишки, поджелудочной железы, желудка и другие виды. MLN-2704 (фирмы Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из моноклонального антитела против специфичного для простаты мембранного антигена (PSMA), связанного с компонентом в виде майтанзиноидного лекарственного средства, DM1, разрабатывается в качестве кандидата для лечения опухолей предстательной железы. Фрагмент, представляющий собой это майтанзиноидное лекарственное средство, DM1, соединяли через линкер, не представляющий собой дисульфид, такой как SMCC, с мышиным моноклональным антителом ТА.1 (Chari и др., Cancer Research 52, 1992, cc. 127-131). Установлено, что этот конъюгат обладает в 200 раз более низкой активностью по сравнению с соответствующим конъюгатом, связанным дисульфидным линкером. Таким образом, SMCC-линкер рассматривается как «нерасщепляемый».

Несколько коротких пептидных соединений выделено из морского моллюска Dolabella auricularia (морской заяц), и установлено, что они обладают биологической активностью (Pettit и др., Tetrahedron 49, 1993, с. 9151; Nakamura и др., Tetrahedron Letters 36, 1995, сс.5059-5062; Sone и др., Journal Org Chem. 60, 1995, с. 4474). Были получены также аналоги указанных соединений и установлено, что некоторые из них обладают биологической активностью (см. обзор Pettit и др., Anti-Cancer Drug Design 13, 1998, сс.243-277). Например, ауристатин Е (US №5635483) является синтетическим аналогом встречающегося в естественных условиях морского продукта доластатина 10, агента, который ингибирует полимеризацию тубулина посредством связывания с тем же сайтом на тубулине, что и противораковое лекарственное средство винкристин (G. R. Pettit, Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70, 1997, cc. 1-79). Доластатин 10, ауристатин РЕ и ауристатин Е представляют собой линейные пептиды, имеющие 4 аминокислоты, три из которых являются уникальными для класса доластатиновых соединений, и С-концевой амид.

Ауристатиновые пептиды, ауристатин Е (АЕ) и монометилауристатин (ММАЕ), синтетические аналоги доластатина, конъюгировали с I) химерными моноклональными антителами cBR96 (специфическими в отношении антигена Y Льюиса на карциномах); II) сАС10 (специфическим в отношении CD30 на гематологических злокачественных новообразованиях) (Klussman и др., Bioconjugate Chemistry 15(4), 2004, сс.765-773; Doronina и др., Nature Biotechnology 21(7), 2003, сс.778-784; «Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands»; Francisco и др., Blood 102(4), 2003, cc. 1458-1465; US №2004/0018194; (III) антителами к CD20, такими как Rituxan® (ритуксимаб) (WO 04/032828), для лечения экспрессирующих CD20 видов рака и иммунных нарушений; (IV) антителами к EphB2 2Н9 и к IL-8 для лечения колоректального рака (Мао и др., Cancer Research 64(3), 2004, сс.781-788); (V) антителом к Е-селектину (Bhaskar и др., Cancer Res. 63, 2003, сс.6387-6394); и (VI) другими антителами к CD30 (WO 03/043583). Монометилауристатин (ММАЕ) конъюгировали также с 2Н9, антителом к EphB2R, который представляет собой тирозинкиназный рецептор типа 1 ТМ, который обладает высоким уровнем гомологии у мышей и человека и сверхэкспрессируется в клетках колоректального рака (Мао и др., Cancer Res. 64, 2004, сс.781-788).

Установлено, что монометилауристатин MMAF, вариант ауристатина Е (ММАЕ) с фенилаланином на С-конце (US №5767237; US №6124431), является менее активным, чем ММАЕ, но становится более активным после конъюгации с моноклональными антителами (Senter и др., Proceedings of the American Association for Cancer Research, т.45, номер реферата 623 от 28 марта 2004 г. ). Фенилендиамин ауристатина F (AFP); фенилаланиновый вариант ММАЕ, связывали с МАт к CD70, 1F6, через С-конец 1F6 посредством фенилендиаминового спейсера (Law и др., Proceedings of the American Association for Cancer Research, т.45, номер реферата 625 от 28 марта 2004 г.).

Конъюгаты антитело к CD22-tokcиh изучены в качестве потенциальных терапевтических соединений. Например, в более ранних работах описаны содержащие цепь А рицина иммунотоксины, направленные против CD22, в качестве потенциальных противораковых агентов (May R.D. и др., Chemical Abstracts 106(21):168656х,1987, сс.35-36; Ghetie М.А. и др., Cancer Research 48, 1988, сс.2610-2617; и Amlot P.L. и др., Blood 82(9), 1993, сс.2624-2633). Когда токсин представлял собой радиоизотоп, эпратузумаб, гуманизированная (с трансплантированным CDR) IgG1 -версия LL2, получены доказательства терапевтической активности радиоиммуноконъюгата (Juweid М.Е. и др., Clin. Cancer Res. 5 (приложение 10), 1999, сс.3292-3303; Griffiths G.L. и др., J. Nucl. Med. 44, 2003, cc. 77-84; Linden О. и др., Clin. Cancer Res. 5 (приложение 10), 1999, cc. 3287-3291).

Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) aнти-CD22-vc-MMAE разработан фирмой Genentech, и уже доказана его очень высокая эффективность на различных моделях ксенотрансплантатов (Polson A.G., Williams М. и др., Anti-CD22-MCC-DM1: an antibody-drug conjugate with a stable linker for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma. Leukemia 24(9), сентябрь 2010 г., cc. 1566-1573. Epub, 1 июля 2010 г. ). Монометилауристатин E (ММАЕ), синтетический аналог встречающегося в естественных условиях продукта доластина 10, является ингибитором микротрубочек. Указанное цитотоксическое лекарственное средство конъюгировали с антителом к CD22. После связывания ADC с опухолевой клеткой он интернализовывался и расщеплялся с высвобождением ММАЕ и таким образом индуцировал гибель клеток.

В данной области существует необходимость в дополнительных лекарственных средствах для лечения различных связанных с В-клетками видов рака, таких как лимфомы, например, неходжкинские лимфомы и другие В клеточные пролиферативные нарушения. Наиболее ценные лекарственные средства для этой цели включают конъюгаты антитело к СD22-лекарственное средством, мишенями которых являются В-клетки, они обладают существенно более низкой токсичностью, сохраняя при этом приемлемую терапевтическую эффективность. Эти и другие известные ранее ограничения и проблемы решаются с помощью настоящего изобретения.

Упоминание какой-либо ссылки в настоящей заявке не предполагает, что эта ссылка является прототипом настоящей заявки. Все процитированные в настоящем описании ссылки, включая патенты, заявки на патент и публикации, полностью включены в него в качестве ссылки. Краткое изложение сущности изобретения При создании изобретения было установлено, что комбинация афукозилированного антитела к CD20 с конъюгатом антитело к CD22-лекарственное средство обладает значительно более сильными антипролиферативными действиями.

Одним из объектов изобретения является афукозилированное антитело к CD20, в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, предназначенное для лечения рака в сочетании с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство.

Другим объектом изобретения является применение афукозилированного антитела к CD20, в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, для приготовления лекарственного средства для лечения рака в сочетании с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство.

Другим объектом изобретения является способ лечения пациента, страдающего раком, заключающийся в том, что вводят пациенту, который нуждается в таком лечении, афукозилированное антитело к CD20, в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, в сочетании с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство.

В одном из вариантов осуществления изобретения содержание фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297. Согласно другому варианту осуществления изобретения содержание фукозы составляет 0% от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения афукозилированное антитело к CD20 представляет собой антитело изотипа IgG1. В другом варианте осуществления изобретения указанный рак представляет рак, при котором происходит экспрессия CD20, предпочтительно лимофому или лимфоцитарный лейкоз. В одном из вариантов осуществления изобретения указанное афукозилированное антитело к CD20 представляет собой гуманизированное антитело B-Ly1. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело к CD20 представляет собой обинутузумаб (рекомендованное INN, WHO Drug Information, т.26, №4, 2012, с. 453). В контексте настоящего описания обинутузумаб является синонимом GA101 или RO5072759. Это название заменяет все предыдущие версии (например, т.25, №1, 2011, с. 75-76), и предыдущее название афутузумаб (рекомендованное INN, WHO Drug Information, т.23, №2, 2009, с. 176; т.22, №2, 2008, с. 124).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к CD22 в конъюгате антитело к СD22-лекарственное средство содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 10, 19-23, 32 и 33, и (б) и по меньшей мере один, два, три, четыре или пять HVR, выбранных из:

(1) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

(4) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(5) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления изобретения конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, b которой

(а) Аb обозначает антитело к CD22, представленное в настоящем описании;

(б) L обозначает линкер;

(в) D обозначает фрагмент, представляющий собой лекарственное средство.

В одном из вариантов осуществления изобретения в конъюгате антитело к СD22-лекарственное средство, имеющем формулу Ab-(L-D)p, L выбирают из 6-малеимидокапроила (МС), малеимидопропаноила (MP), валин-цитруллина (val-cit), аланин-фенилаланина (ala-phe), пара-аминобензилоксикарбонила (РАВ), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентоата (SPP), М-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB).

В одном из вариантов осуществления изобретения в конъюгате антитело к CD22-лекарственное средство, имеющем формулу Ab-(L-D)p, D выбирают из группы, состоящей из ауристатина, долостатина, DM1, DM3, DM4, ММАЕ и MMAF.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство представляет собой анти-CD22-MC-vc-РАВ-ММАЕ. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело к CD22 в указанном конъюгате представляет собой 10F4.v3.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения связывание афукозилированного антитела к CD20 с CD20 характеризуется значением KD, составляющим от 10^-8 М до 10^-13 М.

Одним из вариантов осуществления изобретения является композиция, содержащая афукозилированное антитело к CD20, в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 (в одном из вариантов осуществления изобретения афукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1), и конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство. В одном из вариантов композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, указанное антитело к CD20 представляет собой обинутузумаб. В одном из вариантов композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, указанное антитело к CD22 в конъюгате антитело к СD22-лекарственное средство содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 10, 19-23, 32 и 33, и (б) и по меньшей мере один, два, три, четыре или пять HVR, выбранных из:

(1) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

(4) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(5) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов композиции, предлагаемой в изобретении, указанное антитело к CD22 связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело, выбранное из антитела, которое имеет регистрационный номер АТСС РТА-7621 (10F4.4.1).

В одном из вариантов композиции, предлагаемой в изобретении, применяют один или несколько дополнительных других цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых агентов или соединения или ионизирующее излучение, которые усиливают действия указанных агентов.

В одном из вариантов композиции, предлагаемой в изобретении, конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, в которой

(а) Аb обозначает антитело к CD22, представленное в настоящем описании;

(б) L обозначает линкер;

(в) D обозначает фрагмент, представляющий собой лекарственное средство. В одном из вариантов композиции, предлагаемой в изобретении, конъюгат

антитело к СD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, в которой L выбран из 6-малеимидокапроила (МС), малеимидопропаноила (MP), валин-цитруллина (val-cit), аланин-фенилаланина (ala-phe), пара-аминобензилоксикарбонила (РАВ), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)пентоата (SPP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB).

В одном из вариантов композиции, предлагаемой в изобретении, конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, в которой D выбран из группы, состоящей из ауристатина, долостатина, DM1, DM3, DM4, ММАЕ и MMAF.

В одном из вариантов композиции, предлагаемой в изобретении, конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство представляет собой анти-CD22-MC-vc-РАВ-ММАЕ, предназначенный для лечения рака. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело к CD22 в указанном конъюгате представляет собой 10F4.v3. Афукозилированное антитело к CD20, в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, предназначено для лечения рака в сочетании с конъюгатом антитело к CD22-лекарственное средство.

Одним из вариантов осуществления изобретения является способ лечения пациента, который страдает раком, заключающийся в том, что вводят афукозилированное антитело к CD20, в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, в сочетании с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство пациенту, который нуждается в таком лечении.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что указанный рак представляет собой рак, при котором происходит экспрессия CD20.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что указанный рак, при котором происходит экспрессия CD20, представляет собой лимфому или лимфоцитарный лейкоз.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что указанное антитело к CD20 представляет собой гуманизированное антитело B-Ly1.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что указанное антитело к CD20 представляет собой обинутузумаб.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что применяют один или несколько дополнительных других цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых агентов или соединения или ионизирующее излучение, которые усиливают действия указанных агентов.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что указанное антитело к CD22 в конъюгате антитело к СD22-лекарственное средство содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 10, 19-23, 32 и 33, и (б) и по меньшей мере один, два, три, четыре или пять HVR, выбранных из:

(1) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

(4) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(5) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что указанное антитело к CD22 связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело, выбранное из антитела, которое имеет регистрационный номер АТСС РТА-7621 (10F4.4.1).

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, в которой

(а) Аb обозначает антитело к CD22, представленное в настоящем описании;

(6) L обозначает линкер;

(в) D обозначает фрагмент, представляющий собой лекарственное средство.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, в которой L выбран из 6-малеимидокапроила (МС), малеимидопропаноила (MP), валин-цитруллина (val-cit), аланин-фенилаланина (ala-phe), пара-аминобензилоксикарбонила (РАВ), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)пентоата (SPP), N-cyKциHимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбокси лата (SMCC) и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB).

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, в которой D выбран из группы, состоящей из ауристатина, долостатина, DM1, DM3, DM4, ММАЕ и MMAF.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, что конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство представляет собой анти-CD22-MC-vc-PAB-MMAE.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ отличается тем, антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело к CD22 -лекарственное средство представляет собой 10F4.v3.

Одним из вариантов осуществления изобретения является применение афукозилированного антитела к CD20, в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака в сочетании с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанный рак представляет собой рак, при котором происходит экспрессии CD20.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанный рак, при котором происходит экспрессии CD20, представляет собой лимфому или лимфоцитарный лейкоз.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанное антитело к CD20 представляет собой гуманизированное антитело B-Ly1.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанное антитело к CD20 представляет собой обинутузумаб.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что применяют один или несколько дополнительных других цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых агентов или соединения или ионизирующее излучение, которые усиливают действия указанных агентов.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанное антитело к CD22 в конъюгате антитело к СD22-лекарственное средство содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 10, 19-23, 32 и 33, и (б) и по меньшей мере один, два, три, четыре или пять HVR, выбранных из:

(1) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

(4) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(5) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что указанное антитело к CD22 связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело, выбранное из антитела, которое имеет регистрационный номер АТСС РТА-7621 (10F4.4.1).

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, в которой

(а) Аb обозначает антитело к CD22, представленное в настоящем описании;

(6) L обозначает линкер;

(в) D обозначает фрагмент, представляющий собой лекарственное средство.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, в которой L выбран из 6-малеимидокапроила (МС), малеимидопропаноила (MP), валин-цитруллина (val-cit), аланин-фенилаланина (ala-phe), пара-аминобензилоксикарбонила (РАВ), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)пентоата (SPP), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоата (SIAB).

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство имеет формулу Ab-(L-D)p, в которой D выбран из группы, состоящей из ауристатина, долостатина, DM1, DM3, DM4, ММАЕ и MMAF.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство представляет собой анти-CD22-MC-vc-PAB-MMAE.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело к СD22-лекарственное средство представляет собой 10F4.V3.

В одном из вариантов осуществления изобретения применение, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что применяют один или несколько дополнительных других цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых агентов или соединения или ионизирующее излучение, которые усиливают действия указанных агентов.

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - воздействие обинутузумаба (GA101), ритуксимаба, анти-СD22-ADC и комбинаций анти-CD22-ADC с GA101 или ритуксимабом, изученное на модели лимфомы WSU-DLCL2, созданной в SCID-мышах, трансгенных по FcgR3a;

на фиг. 2 - результаты статистического анализа данных, представленных на фиг.1, с помощью парного теста Вилкоксона и парного логрангового теста;

на фиг. 3 - (3А-3Б): фиг 3А - аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела к CD22 10F4, предлагаемого в изобретении (m10F4), выровненная с гуманизированной версией 1 антитела 10F4 (h10F4v1) и выровненная с человеческой последовательностью подгруппы III. HVR обозначены прямоугольниками (HVR-Н1, HVR-H2, HVR-H3). Последовательности, фланкирующие HVR, представляют собой последовательности каркасных участков (FR-H1-FR-H4). Последовательности пронумерованы согласно нумерации Кэбота. Над выделенными прямоугольниками HVR указаны CDR согласно их определению по Кэботу, Хотиа и контактирующие CDR. На фиг. 3Б - аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного антитела к CD22 10F4, предлагаемого в изобретении (m10F4), выровненная с гуманизированной версией 1 антитела 10F4 (h10F4v1) и выровненная с человеческой последовательностью каппа I. Версии 2 и 3 гуманизированного антитела 10F4 (h10F4v2 и h10F4v3) имеют аминокислотные последовательности, соответствующие секретируемой зрелой форме. Антитела h10F4v2 и h10F4v3 отличаются от h10F4v1 аминокислотой в положении 28 HVR-L1 (N28V). HVR обозначены прямоугольниками. Последовательности FR-L1, FR-L2, FR-L3 и FR-L4 фланкируют HVR (HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3). Последовательности пронумерованы согласно нумерации Кэбота. Над обозначенными прямоугольниками HVR указаны CDR согласно их определению по Кэботу, Хотиа и контактирующие CDR;

на фиг. 4 -полноразмерные аминокислотные последовательности (вариабельные и константные области) легкой и тяжелой цепей гуманизированного антитела к CD22 10F4v2, изотипа IgG1. Подчеркнутые участки соответствуют константным доменам.

Подробное описание изобретения

В изобретении предложено афукозилированное антитело к CD20 IgG1 - или IgG3-изотипа, в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, предназначенное для лечения рака в сочетании с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство.

В изобретении предложено применение афукозилированного антитела к CD20 IgG1 - или IgG3-изотипа, в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака в сочетании с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения содержание фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297.

Понятие «антитело» относится к различным формам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) полные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела и созданные с помощью генной инженерии антитела, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты указанных антител, если они сохраняют отличительные признаки антител, предлагаемых в изобретении. Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего описания относятся к препарату, содержащему молекулы антитела, которые имеют одинаковый аминокислотный состав. Соответственно понятие «человеческое моноклональное антитело» относится к антителам, обладающим одинаковой специфичностью связывания, которые имеют вариабельную и константную области, полученные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения человеческие моноклональные антитела получают с помощью гибридомы, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного животного кроме человека, например, трансгенной мыши, имеющей геном, который содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой.

Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, выведенную из одного источника или вида, и по меньшей мере часть константной области, выведенную из другого источника или вида, которое, как правило, получают методами рекомбинантной ДНК. Наиболее предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Такие мышиные/человеческие химерные антитела являются продуктом экспрессируемых генов иммуноглобулина, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют мышиные вариабельные области иммуноглобулина, и сегменты ДНК, которые кодируют человеческие константные области иммуноглобулина. Другими формами «химерных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, в которых класс или подкласс модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела называют также «антителами переключенного класса». Методы получения химерных антител основаны на общепринятых методиках рекомбинантной ДНК и методиках генной трансфекции, и в настоящее время являются хорошо известными в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, сс.6851-6855; US №5202238 и US №5204244).

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасный участок или «гипервариабельные участки» (CDR) модифицированы таким образом, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с родительским иммуноглобулином. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела, в результате чего образуется «гуманизированное антитело» (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс.323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, сс.268-270). Наиболее предпочтительные CDR соответствуют CDR, которые имеют последовательности, распознающие антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.

Подразумевается, что в контексте настоящего описания понятие «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельную и константную области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk М.А. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc. 368-374). На основе указанной технологии можно получать человеческие антитела к широкому разнообразию мишеней. Примеры человеческих антител описаны у Kellermann S.A. и др., Curr Opin Biotechnol. 13, 2002, сс.593-597.

Подразумевается, что понятие «рекомбинантное человеческое антитело» в контексте настоящего описания включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют методами рекомбинации, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой как NS0- или СНО-клетка, или из животного (например, из мыши), которое является трансгенным по генам человеческого иммуноглобулина, или антитела, экспрессируемые с помощью рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектируют клетку-хозяина. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, подвергали in vivo соматической гипермутации. Так, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантного антитела представляют собой последовательности, которые, хотя и происходят из последовательностей VH- и VL-областей человеческой зародышевой линии и являются родственными им, но могут не встречаться в существующем в естественных условиях in vivo спектре зародышевых линий человеческого антитела.

В контексте настоящего описания понятие «связывается (связывание)» или «специфически связывается (специфическое связывание)» относится к связыванию антитела с эпитопом опухолевого антигена по данным анализа in vitro, предпочтительно по данным анализа методом поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore, фирма GE-Healthcare, Уппсала, Швеция) при использовании очищенного антигена дикого типа. Аффинность связывания определяют в понятиях ка (константа скорости ассоциации антитела при образовании комплекса антитело/антиген), ко (константа диссоциации) и K_D (k_D/ka). Считается, что имеет место связывание или специфическое связывание, если аффинность связывания (K_D) составляет 10^-8 М или менее, предпочтительно от 10^-8 М до 10^-13 М (в одном из вариантов осуществления от 10^-9 М до 10^-13 М). Таким образом, афукозилированное антитело, предлагаемое в изобретении, специфически связывается с опухолевым антигеном, что характеризуется аффинностью связывания (K_D), составляющей 10^-8 моля/л или менее, предпочтительно от 10^-8 М до 10^-13 М (в одном из вариантов осуществления изобретения от 10^-9 М до 10^-13 М).

Подразумевается, что понятие «молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно она представляет собой двухцепочечную ДНК.

«Константные домены» не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но они участвуют в эффекторных функциях (таких как ADCC, связывание комплемента и CDC).

Понятия «вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания обозначают области каждой из пар легких и тяжелых цепей, которые принимают непосредственное участие в связывании антитела с антигеном. Домены человеческих вариабельных легкой и тяжелой цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых в значительной степени являются консервативными, соединенные тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адоптированы к β-складчатой конформации, и CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживают свою трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий сайт.

Понятия «гипервариабельный участок» или «антигенсвязывающий участок антитела» в контексте настоящего описания относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность участков» или «CDR». «Каркасные» или «FR»-участки представляют собой участки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельного участка, как он определен в настоящем описании. Таким образом, легкая и тяжелая цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу следующие домены: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR3 тяжелой цепи представляет собой участок, который вносит основной вклад в связывание с антигеном. CDR- и FR-участки определяют согласно стандартной номенклатуре Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-e изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991) и/или как участки из «гипервариабельной петли».

Понятие «афукозилированное антитело» относится к антителу изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1) с измененной схемой гликозилирования в Fc-области в положении Asn297, которое имеет пониженное количество остатков фукозы. Гликозилирование человеческих IgG1 или IgG3 имеет место в положении Asn297, оно обусловлено присутствием корового фукозилированного биантенного сложного олигосахарида в сайте гликозилирования, имеющего на конце вплоть до 2 остатков Gal. Эти структуры обозначают как G0-, G1- (α1,6 или α1,3) или G2-гликановые остатки в зависимости от количества концевых остатков Gal (Raju T.S., BioProcess Int. 1, 2003, сс.44-53). СНО-тип гликозилирования Fc-областей антител описан, например, у Routier F.H., Glycoconjugate J. 14, 1997, сс.201-207. Антитела, полученные в результате рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах СНО, не имеющих модификации гликозилирования (гликомодификация), как правило, имеют уровень фукозилирования в положении Asn297, составляющий по меньшей мере 85%. Очевидно, что в контексте настоящего описания понятие афукозилированное антитело включает также и антитело, у которого в его схеме гликозилирования фукоза отсутствует. Хорошо известно, что обычное положение гликозилированного остатка в антителе соответствует аспарагину в положении 297 согласно системе нумерации EU («Asn297»).

«Систему нумерации EU» или «EU-индекс», как правило, применяют для обозначения положения остатка в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, EU-индекс описан у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991, публикация специально включена в настоящее описание в качестве ссылки).

Таким образом, афукозилированное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой антитело изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1), в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297 (это означает, что по меньшей мере 40% или более олигосахаридров на Asn297 в Fc-области являются афукозилированными). В одном из вариантов осуществления изобретения содержание фукозы составляет от 40% до 60% от количества олигосахаридов на Asn297 в Fc-области. В другом варианте осуществления изобретения содержание фукозы составляет 50% или менее, а в следующем варианте осуществления изобретения содержание фукозы составляет 30% или менее от количества олигосахаридов на Asn297 в Fc-области. Согласно изобретению «содержание фукозы» означает количество указанного олигосахарида (фукозы) в олигосахаридной (сахарной) цепи на Asn297 относительно суммы всех олигосахаридов (сахаров), присоединенных к Asn 297 (например, сложных, гибридных и имеющих высокое содержание маннозы структур), измеренное с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии и рассчитанное в виде среднего значения (подробный метод определения количества фукозы описан, например, в WO 2008/077546). Согласно еще одному варианту осуществления изобретения олигосахариды Fc-области являются бисекционными. Афукозилированное антитело, предлагаемое в изобретении, можно экспрессировать в гликомодифицированной клетке-хозяине, сконструированной с целью экспрессии по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который обладает GnTIII-активностью, в количестве, достаточном для частичного фукозилирования олигосахаридов в Fc-области. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, полипептид, обладающий GnTIII-активностью, представляет собой слитый полипептид. В альтернативном варианте α1,6-фукозилтрансферазную активность клетки-хозяина можно снижать или элиминировать согласно методу, описанному в №US 6946292, с получением гликомодифицированных клеток-хозяев. Уровень фукозилирования антитела можно предопределять, например, либо путем изменения условий ферментации (например, продолжительности ферментации), либо путем объединения по меньшей мере двух антител с различным уровнем фукозилирования. Указанные афукозилированные антитела и соответствующие методы гликоинженерии описаны в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, у Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc. 176-180), WO 1999/54342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US №2006/0134709, US №2005/0054048, US №2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739. Указанные антитела, полученные с помощью методов гликоинженерии, обладают повышенной ADCC. Другие методы гликоинженерии, которые позволяют получать афукозилированные антитела, предлагаемые в изобретении, описаны, например, у Niwa R. и др., J. Immunol. Methods 306, 2005, cc. 151-160; Shinkawa Т. и др., J. Biol. Chem. 278, 2003, cc. 3466-3473; WO 03/055993 или US №2005/0249722.

Таким образом, одним из объектов изобретения является афукозилированное антитело к CD20 изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1), которое специфически связывается с CD20, и в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, предназначенное для лечения рака в сочетании с конъюгатом антитело к CD22-лекарственное средство. Другим объектом изобретения является применение афукозилированного антитела к CD20 изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1), которое специфически связывается с CD20, и в котором содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака в сочетании с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения содержание фукозы составляет от 60% до 20% от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения содержание фукозы составляет от 60% до 40% от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения содержание фукозы составляет 0% от общего количества олигосахаридов (сахаров) на Asn297.

CD20 (который называют также В-лимфоцитарным антигеном CD20, В-лимфоцитарным поверхностным антигеном B1, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5; последовательность представлена в базе данных SwissProt под номером Р11836) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой примерно 35 кДа, локализованный на пре-В и зрелых В-лимфоцитах (Valentine М.А. и др., J. Biol. Chem. 264, 1989, сс.11282-11287; Tedder T.F. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 1988, cc. 208-212; Stamenkovic I. и др., J. Exp.Med. 167, 1988, cc. 1975-1980; Einfeld D.A. и др., EMBO J. 7, 1988, cc. 711-717; Tedder T.F. и др., J. Immunol. 142, 1989, cc. 2560-2568). Соответствующий человеческий ген представляет собой имеющий 4 трансмембранных домена представитель 1 подсемейства А, известный также как MS4A1. Этот ген кодирует представителя семейства трансмембранных генов 4А. Представители этого нового семейства белков отличаются общими структурными особенностями и сходными интрон/экзонными сочленениями (границы сплайсинга) и отличаются уникальными схемами экспрессии для гематопоэтических клеток и нелимфоидных тканей. Этот ген кодирует поверхностную молекулу В-лимфоцитов, которая играет роль в развитии и дифференцировке В-клеток в плазматические клетки. Этот представитель семейства локализован на 11ql2 в кластере представителей семейства. Альтернативный сплайсинг этого гена приводит к образованию двух транскрипционных вариантов, которые кодируют один и тот же белок.

Понятия «CD20» и «антиген CD20» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо, и они включают любые варианты, изоформы и видовые гомологи человеческого CD20, которые в естественных условиях экспрессируются клетками или экспрессируются на клетках, трансфектированных геном CD20. Связывание антитела, предлагаемого в изобретении, с антигеном CD20 опосредует цитолиз клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевой клетки), путем инактивации CD20. Цитолиз клеток, экспрессирующих CD20, может происходить посредством одного или нескольких из следующих механизмов: индукция клеточной гибели/апоптоза, ADCC и CDC.

Синонимами CD20, принятыми в данной области, являются антиген CD20 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В-лимфоцитов B1, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5.

Понятие «антитело к CD20», предлагаемое в изобретении, относится к антителу, которое специфически связывается с антигеном CD20. В зависимости от характеристик связывания и биологической активности антитела к CD20 в отношении антигена CD20 можно различать два типа антител к CD20 (антитела к CD20 типа I и типа II) согласно Cragg M.S. и др., Blood 103, 2004, сс.2738-2743; и Cragg M.S. и др., Blood 101, 2003, сс.1045-1052 (см. таблицу 1).

Примерами антител к CD20 типа II являются, например, гуманизированное антитело B-Ly1 изотипа IgG1 (химерное гуманизированное антитело изотипа IgG1, описанное в WO 2005/044859), 11 В8 IgG1 (описанное в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Как правило, антитела к CD20 типа II изотипа IgG1 обладают характерными CDC-свойствами. Антитела к CD20 типа II обладают пониженной CDC (если относятся к изотипу IgG1) по сравнению с антителами типа I изотипа IgG1.

Примерами антител к CD20 типа I являются, например, ритуксимаб, HI47 IgG3 (ЕСАСС, гибридома), 2С6 IgG1 (описанное в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описанное в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описанное в WO 2004/056312).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения афукозилированные антитела к CD20, предлагаемые в изобретении, представляют собой антитело к CD20 типа II, а согласно другому варианту осуществления изобретения представляет собой афукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1.

Афукозилированные антитела к CD20, предлагаемые в изобретении, обладают повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) по сравнению с антителами к CD20, у которых не снижено содержание фукозы.

К «афукозилированному антителу к CD20 с повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC)» относится афукозилированное антитело к CD20, как оно определено в настоящем описании, обладающее повышенной ADCC по данным оценки с помощью любого приемлемого метода, известного обычному специалисту в данной области. Один из приемлемых методов анализа in vitro ADCC заключается в том, что:

1) в анализе используют клетки-мишени, для которых известно, что они экспрессируют антиген-мишень, распознаваемый антигенсвязывающей областью антитела;

2) в качестве эффекторных клеток в анализе используют мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС), выделенные из крови произвольно выбранного здорового донора;

3) анализ осуществляют согласно следующему протоколу:

I) выделяют РВМС с помощью стандартных процессов центрифугирования в градиенте плотности и суспендируют из расчета 5*10⁶ клеток/мл в RPMI-среде для культивирования клеток;

II) выращивают клетки-мишени с помощью стандартных методов культивирования тканей, собирают клетки на экспоненциальной фазе роста, жизнеспособность которых превышает 90%, отмывают в RPMI-среде для культивирования клеток, метят ⁵¹Сr (100 мкКи), отмывают дважды в среде для культивирования клеток и ресуспендируют в среде для культивирования клеток с плотностью 10⁵ клеток/мл;

III) осуществляют трансфекцию, используя по 100 мкл указанной выше конечной суспензии клеток-мишеней на каждую лунку 96-луночного титрационного микропланшета;

IV) осуществляют серийное разведение антитела от 4000 до 0,04 нг/мл в среде для культивирования клеток и добавляют по 50 мкл образовавшихся растворов антитела к клеткам-мишеням в 96-луночном титрационном микропланшете, оценивают антитело в различных концентрациях, охватывающих весь диапазон указанных выше концентраций, в трех повторностях;

V) для контроля максимального высвобождения (MR) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, вносят по 50 мкл 2%-ного (VN) водного раствора неионогенного поверхностно-активного вещества (Nonidet, фирма Sigma, Сент-Луис) вместо раствора антитела (пункт IV, выше);

VI) для контроля спонтанного высвобождения (SR) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, вносят по 50 мкл RPMI-среды для культивирования клеток вместо раствора антитела (пункт IV, выше);

VII) затем 96-луночный титрационный микропланшет центрифугируют при 50 × g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С;

VIII) добавляют по 50 мкл суспензии РВМС (пункт I, выше) в каждую лунку для обеспечения соотношения эффекторная клетка:клетка-мишень 25:1, и планшеты помещают в инкубатор в атмосферу, содержащую 5% СО₂, на 4 ч при 37°С;

IX) собирают бесклеточный супернатант из каждой лунки и количественно оценивают высвободившуюся в эксперименте радиоактивность (ER) с помощью гамма-счетчика;

X) рассчитывают процент удельного лизиса для каждой концентрации антитела с помощью формулы (ER-MR)/(MR-SR) × 100, где ER представляет собой среднюю радиоактивность (см. пункт IX, выше), определенную для указанной концентрации антитела, MR представляет собой среднюю радиоактивность (см. пункт IX, выше), определенную для MR-контролей (см. пункт V, выше), a SR представляет собой среднюю радиоактивность (см. пункт IX, выше), определенную для SR-контролей (см. пункт VI, выше);

4) считают, что имеет место «повышенный уровень ADCC», если установлено: или повышение максимального процента удельного лизиса, обнаруженного в указанном выше диапазоне концентраций антитела, и/или снижение концентрации антитела, требуемой для достижения половины от максимального процента специфического лизиса, обнаруженного в указанном выше диапазоне концентраций антитела. Повышение уровня ADCC определяют относительно уровня ADCC, измеренного с помощью описанного выше анализа, опосредуемого таким же антителом, полученным с использованием такого же типа клеток-хозяев, с использованием таких же стандартных методов получения, приготовления форм и хранения, которые хорошо известны специалистам в данной области, но которое не получено с использованием клеток-хозяев, сконструированных так, что они сверхэкспрессируют GnTIII.

Указанную «повышенную (повышенный уровень) ADCC» можно получать с помощью модификации указанных антител методами гликоинженерии, что означает повышение встречающихся в естественных условиях опосредуемых клеткой эффекторных функций моноклональных антител путем конструирования их олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у Umana, Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc. 176-180 и в US №6602684.

Понятие «комплементзависимая цитотоксичность (CDC)» относится к лизису человеческих опухолевых клеток-мишеней антителом, предлагаемым в изобретении, в присутствии комплемента. CDC предпочтительно оценивают путем обработки препарата экспрессирующих CD20 клеток антителом к CD20, предлагаемым в изобретении, в присутствии комплемента. Считается, что имеет место CDC, если антитело при его использовании в концентрации 100 нМ индуцирует лизис (гибель клеток) 20% или большего количества опухолевых клеток в течение 4 ч. Анализ предпочтительно осуществляют с помощью меченных ⁵¹Сr или Еu опухолевых клеток и оценивают высвобождение ⁵¹Сr или Еu. В качестве контроля опухолевые клетки-мишени инкубируют с комплементом без антитела.

Антитело «ритуксимаб» (референс-антитело; пример антитела к CD20 типа I) представляет собой созданное с помощью генетической инженерии химерное человеческое/мышиное содержащее человеческую гамма-1 константную область моноклональное антитело к человеческому антигену CD20. Химерное антитело содержит человеческие гамма-1 константные области и оно идентифицировано под названием «С2 В8» в US №5736137 (Anderson K.С.и др.), выданном 17 апреля 1998 г. на имя фирмы IDEC Pharmaceuticals Corporation. Ритуксимаб разрешен для лечения пациентов, страдающих рецидивирующей или рефрактерной, низкой степени злокачественности или фолликулярной, CD20-позитивной, В-клеточной неходжкинской лимфомой. Изучение механизма действия в опытах in vitro продемонстрировало, что ритуксимаб обладает зависимой от человеческого комплемента цитотоксичностью (CDC) (Reff М.Е. и др., Blood 83(2), 1994, сс.435-445). Кроме того, он обладает выраженной активностью в анализах по оценке антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (ADCC).

Ритуксимаб не является афукозилированным.

Понятие «гуманизированное антитело В-Ly1» относится к гуманизированному антителу B-Ly1, описанному в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которое получали из мышиного моноклонального антитела к CD20 B-Ly1 (вариабельная область мышиной тяжелой цепи (VH): SEQ ID NO: 28; вариабельная область мышиной легкой цепи (VL): SEQ ID NO: 29 (см. Poppema S. и Visser L., Biotest Bulletin 3, 1987, cc. 131-139) путем химеризации с использованием человеческой константной области из IgG1 и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Эти «гуманизированные антитела В-Ly1» описаны подробно в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения «гуманизированное антитело В-Ly1» имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 46 (B-HH2 - B-HH9 и B-HL8 -B-HL17, которые описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения указанный вариабельный домен выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30, 31, 34, 36, 38, 40 и 42 (В-НН2, ВНН-3, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и B-HL13 в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). В предпочтительном варианте осуществления изобретения «гуманизированное антитело В-Ly1» имеет вариабельную область легкой (VL) SEQ ID NO: 47 (B-KV1 в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Согласно одному из конкретных вариантов осуществления изобретения «гуманизированное антитело В-Ly1» имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 34 (В-НН6 в WO 2005/044859 и WO 2007/031875), и имеет вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 47 (B-KV1 в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, в одном из вариантов осуществления изобретения гуманизированное антитело B-Ly1 предпочтительно представляет собой антитело изотипа IgG1. Указанные афукозилированные гуманизированные антитела B-Ly1, предлагаемые в изобретении, созданы с помощью гликоинженерии (GE) в Fc-области согласно методам, описанным в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, у Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, сс.176-180 и WO 99/154342. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения афукозилированное созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное антитело B-Ly1 представляет собой В-НН6-B-KV1 GE. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к CD20 представляет собой обинутузумаб (рекомендованное INN, WHO Drug Information, т.26, №4, 2012, с. 453). В контексте настоящего описания обинутузумаб является синонимом GA101 или RO5072759. Это название заменяет все предыдущие версии (например, т. 25, №1, 2011, с. 75-76), и предыдущее название афутузумаб (рекомендованное INN, WHO Drug Information, т. 23, №2, 2009, с. 176; т. 22, №2, 2008, с. 124).

Указанные созданные с помощью гликоинженерии гуманизированные антитела B-Ly1 имеют измененную схему гликозилирования в Fc-области, предпочтительно имеют пониженный уровень остатков фукозы. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения содержание фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов на Asn297 (в одном из вариантов осуществления изобретения содержание фукозы составляет от 40% до 60%, в другом варианте осуществления изобретения содержание фукозы составляет 50% или менее и еще в одном варианте осуществления изобретения содержание фукозы составляет 30% или менее). Согласно другому варианту осуществления изобретения олигосахариды Fc-области предпочтительно являются бисекционными. Эти созданные с помощью гликоинженерии гуманизированные антитела B-Ly1 обладают повышенной ADCC.

«CD22» в контексте настоящего описания представляет собой имеющий молекулярную массу 135 кДа сиалогликопротеин, присутствие которого ограничено В-клетками, экспрессируемый на поверхности В-клеток только на зрелых стадиях дифференцировки (Dorken В. и др., J. Immunol. 136, 1986, сс. 4470-4479). Предоминантной формой CD22 является CD226eтa, который содержит семь доменов суперсемества иммуноглобулинов во внеклеточном домене (Wilson G.L. и др., J. Exp.Med. 173, 1991, сс.137-146). В вариантной форме, СD22-альфа, отсутствуют домены 3 и 4 суперсемейства иммуноглобулинов (Stamenkovic I. и Seed В., Nature 345, 1990, сс.74-77). Установлено, что связывание лигандов с человеческим CD22 ассоциировано с доменами 1 и 2 суперсемейства иммуноглобулинов (которые обозначают также как эпитопы 1 и 2) (Engel Р. и др., J. Exp.Med. 181, 1995, сс.1581-1586).

Понятие «антитело к CD22» относится к антителу, которое ингибирует CD22.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое связывается с CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, где антитело содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из:

(1) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

(4) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 10;

(5) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 12; и

(6) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

Согласно другому объекту изобретения антитело, которое связывается с CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, содержит (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (б) по меньшей мере один, два, три, четыре или пять HVR, выбранных из:

(1) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;

(4) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 12; и

(5) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

Согласно другому объекту изобретения антитело, которое связывается с CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, содержит (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и (б) по меньшей мере один, два, три, четыре или пять HVR, выбранных из:

(1) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;

(4) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(5) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

Согласно другому объекту изобретения антитело, которое связывается с CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, содержит (а) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (б) по меньшей мере один, два, три, четыре или пять HVR, выбранных из:

(1) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;

(4) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(5) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:14.

Согласно другому объекту изобретения антитело, которое связывается с CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, содержит (а) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 6, и (б) по меньшей мере один, два, три, четыре или пять HVR, выбранных из:

(1) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;

(2) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(3) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 10;

(4) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 12; и

(5) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит также HVR-Н1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит также HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ NO: 12, и HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах осуществления изобретения любое из указанных выше антител содержит дополнительно по меньшей мере один каркасный участок, выбранный из консенсусного каркасного участка VH подгруппы III и консенсусного каркасного участка VL подгруппы I.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое связывается с CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средства, где антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 16.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит дополнительно вариабельный домен легкой цепи, последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 17.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит дополнительно вариабельный домен легкой цепи, последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID N0:18.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 18.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и вариабельный домен легкой цепи, последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, и вариабельный домен легкой цепи, последовательность которого по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 16 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 17. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 16 и вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 18.

Одним из объектов изобретения является антитело к CD22, которое содержит (а) один, два или три HVR VH, выбранных из представленных на фиг. 2А, и/или (б) один, два или три HVR VL, выбранных из указанных на фиг. 2Б. Одним из объектов изобретения является антитело к CD22, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из представленных на фиг. 2А, и вариабельный домен легкой цепи, выбранный из представленных на фиг. 2Б.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий любое из указанных выше антител. Одним из объектов изобретения является вектор, содержащий полинуклеотид. Одним из объектов изобретения является клетка-хозяин, содержащая вектор. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО). Одним из вариантов осуществления изобретения является способ получения антитела к CD22, заключающийся в том, что культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии полинуклеотида, который кодирует антитело, и выделяют антитело.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое связывается с CD22, экспрессируемым на клеточной поверхности, которое входит в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с эпитопом в области человеческого или мышиного CD22, которая содержит домен 1 или домен 2, или домены 1 и 2. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка представляет собой клетку млекопитающего. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка представляет собой человеческую клетку. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка представляет собой раковую клетку. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка представляет собой В-клетку. В одном из вариантов осуществления изобретения раковая клетка представляет собой В-клетку.

В некоторых вариантах осуществления изобретения любое из указанных выше антител представляет собой моноклональное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой фрагмент антитела, выбранный из Fab-, Fab'-SH-, Fv-, scFv- или (Раb')2-фрагмента. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело является гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело является человеческим.

Согласно одному из объектов изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, включают сконструированные с помощью цистеина антитела, в которых одна или несколько аминокислот родительского антитела заменена(ы) на цистеин в виде свободной аминокислоты, описанные в WO 2006/034488 (которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки). Таким образом, можно подвергать инженерии, т.е. изменять посредством мутации, любую форму антитела к CD22. Например, Fab-фрагмент родительского антитела можно подвергать инженерии с получением сконструированного с помощью цистеина Fab, обозначенного в контексте настоящего описания как «тиoFab». Аналогично этому, можно подвергать инженерии родительское моноклональное антитело с получением «тиоМАт». Следует отметить, что один сайт мутации в тиоFab позволяет встраивать посредством инженерии один остаток цистеина, в то время как один сайт мутации в тиоМАт позволяет встраивать посредством инженерии два остатка цистеина из-за димерной природы антитела в виде IgG. Сконструированные с помощью цистеина антитела к CD22, предлагаемые в изобретении, включают моноклональные антитела, гуманизированные или химерные моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, слитые полипептиды и аналоги, которые, прежде всего, связываются с ассоциированными с клетками полипептидами CD22. Альтернативно этому, созданное с помощью цистеина антитело может представлять собой антитело, которое содержит цистеин в положении, указанном в настоящем описании, в антителе или Fab, полученном в результате конструирования последовательности и/или селекции антитела, без необходимости в изменении родительского антитела, например, с помощью создания и селекции антител методом фагового дисплея или путем создания de novo последовательностей каркасных участков легкой цепи и/или тяжелой цепи и константных областей. Созданное с помощью цистеина антитело содержит один или большее количество остатков цистеина в виде свободной аминокислоты, имеющих значение тиольной реакционноспособности, составляющее от 0,6 до 1,0; от 0,7 до 1,0 или от 0,8 до 1,0. Цистеин в виде свободной аминокислоты представляет собой остаток цистеина, который создан (встроен) в родительском антителе и не является частью дисульфидного мостика. Сконструированные с помощью цистеина антитела можно применять для присоединения цитотоксических и/или визуализирующих соединений в сайт встроенного с помощью инженерии цистеина, например, через малеимид или галоацетил. Нуклеофильная реакционная способность тиольной функциональности остатка Cys в отношении малеимидной группы приблизительно в 1000 раз выше по сравнению с функциональностью любой другой аминокислоты в белке, например, аминогруппы остатков лизина или N-концевой аминогруппы. Тиолспецифическая функциональность в йодоацетильных и малеимидных реагентах может вступать в реакцию с аминогруппами, но для этого требуется более высокое значение рН (>9,0) и более продолжительное время реакции (Garman, Non-Radioactive Labelling: А Practical Approach, изд-во Academic Press, London, 1997).

В одном из вариантов осуществления изобретения сконструированное с помощью цистеина антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, содержит встроенный с помощью инженерии цистеин в любом одном из следующих положений, где положение в легкой цепи имеет номер, определенный согласно номенклатуре Кэбота с соавторами (см. Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991), а положение в тяжелой цепи (включая Fc-область) имеет номер, определенный согласно EU-нумерации (см. Kabat и др., 1991, выше), где константная область легкой цепи начинается с положения 108 (нумерация по Кэботу) и константная область тяжелой цепи начинается с положения 118 (EU-нумерация). Положение можно обозначать также по положению в последовательно пронумерованных аминокислотах полноразмерной легкой цепи или тяжелой цепи. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, содержит встроенный с помощью инженерии цистеин в LC-V205C (номер по Кэботу: Val 205; а последующее положение, сконструированное так, чтобы в этом положении находился Cys, имеет номер 210,). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело к CD22 содержит встроенный с помощью инженерии цистеин в HCA118C (EU-номер: Ala 118; а последующее положение, сконструированное так, чтобы в этом положении находился Cys, имеет номер 121). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело к CD22 содержит встроенный с помощью инженерии цистеин в Fc-S400C (EU-номер: Ser 400; а последующее положение, сконструированное так, чтобы в этом положении находился Cys, имеет номер 403) В других вариантах осуществления изобретения встроенный с помощью инженерии цистеин тяжелой цепи (включая Fc-область) находится в любом одном из следующих положений (согласно EU-нумерации): 41, 88, 116, 118, 120, 171, 282, 375 или 400. Таким образом, аминокислотные замены в этих положениях родительского антитела к CD22, предлагаемого в изобретении, представляют собой: А41С, А88С, S116C, А118С, Т120С, А171С, V282C, S375C или S400C. В других вариантах осуществления изобретения встроенный с помощью инженерии цистеин легкой цепи находится в любом одном из следующих положений (нумерация согласно Кэботу): 15, 43, 110, 144, 168, 205. Таким образом, аминокислотные замены в этих положениях родительского антитела к CD22, предлагаемые в изобретении, представляют собой: V15C, А43С, VI ЮС, А144С, S168C или V205C.

Сконструированное с помощью цистеина антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, содержит один или несколько цистеинов в виде свободной аминокислоты, где сконструированное с помощью цистеина антитело к CD22 связывается с полипептидом CD22 и его получают с помощью способа, заключающегося в том, что заменяют один или несколько аминокислотных остатков родительского антитела к CD22 на цистеин, где родительское антитело содержит по меньшей мере одну последовательность HVR, выбранную из:

(а) последовательности HVR-L1 или последовательность (фиг. 3Б);

(б) последовательности HVR-L2 (фиг. 3Б);

(в) последовательности HVR-L3 (фиг. 3Б);

(г) последовательности HVR-H1 (фиг. 3А);

(д) последовательности HVR-H2 (фиг. 3А); и

(е) последовательности HVR-H3 (фиг. 3А).

Конкретными объектами изобретения является сконструированное с помощью цистеина антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, которое содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере примерно на 80% аминокислотной последовательности, в альтернативном варианте идентичную по меньшей мере примерно на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности сконструированного с помощью цистеина антитела, которое имеет полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании, или аминокислотной последовательности сконструированного с помощью цистеина антитела, представленного в настоящем описании, лишенной сигнального пептида.

Следующим объектом изобретения является выделенное сконструированное с помощью цистеина антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, содержащее аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, гибридизующейся с комплементом молекулы ДНК, которая кодирует (а) сконструированное с помощью цистеина антитело, имеющее полноразмерную аминокислотную последовательность, указанную в настоящем описании, (б) аминокислотную последовательность сконструированного с помощью цистеина антитела, лишенную сигнальную пептида, указанную в настоящем описании, (в) внеклеточный домен трансмембранного белка сконструированного с помощью цистеина антитела с сигнальным пептидом, указанным в настоящем описании, или без него, (г) аминокислотную последовательность, которая кодируется любой из нуклеотидных последовательностей, указанных в настоящем описании, или (д) любой другой специально определенный фрагмент полноразмерной аминокислотной последовательности сконструированного с помощью цистеина антитела, указанного в настоящем описании.

Конкретным объектом изобретения является выделенное сконструированное с помощью цистеина антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, без N-концевой сигнальной последовательности и/или без инициирующего метионина и кодируемое нуклеотидной последовательностью, которая кодирует указанную аминокислотную последовательность, представленную в настоящем описании. В настоящем описании представлен также способы их получения, где указанные способы заключаются в том, что культивируют клетку-хозяина, содержащую вектор, который содержит соответствующую молекулу кодирующей нуклеиновой кислоты, в условиях, пригодных для экспрессии сконструированного с помощью цистеина антитела, и выделяют сконструированное с помощью цистеина антитело из клеточной культуры.

Другим объектом изобретения является выделенное сконструированное с помощью цистеина антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, в котором либо удален трансмембранный домен, либо инактивирован трансмембранный домен. В настоящем описании представлены также способы его получения, где указанные способы заключаются в том, что культивируют клетку-хозяина, содержащую вектор, который содержит соответствующую молекулу кодирующей нуклеиновой кислоты, в условиях, пригодных для экспрессии сконструированного с помощью цистеина антитела, и выделяют сконструированное с помощью цистеина антитело из клеточной культуры.

Другими вариантами осуществления изобретения являются выделенные химерные сконструированные с помощью цистеина антитела к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, который содержит любое указанное в настоящем описании сконструированное с помощью цистеина антитело, слитое с гетерологичным (не представляющим собой CD22) полипептидом. Приведенные в качестве примера указанные химерные молекулы содержат любое из указанных в настоящем описании сконструированных с помощью цистеина антител, слитое с гетерологичным полипептидом, таким, например, как последовательность эпитопа-метки или Fc-область иммуноглобулина.

Сконструированное с помощью цистеина антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, может представлять собой моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание полипептида антитела к CD22 с соответствующим эпитопом антигена. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, необязательно можно конъюгировать с ингибирующим рост агентом или цитотоксическим агентом, таким как токсин, включая, например, ауристатин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или т.п. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, необязательно можно получать в СНО-клетках или бактериальных клетках, и они предпочтительно ингибируют рост или пролиферацию или индуцируют гибель клетки, с которой они связаны. Для диагностических целей антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, можно метить выявляемой меткой, присоединять к твердой подложке или т.п.

Другими вариантами осуществления настоящего изобретения являются векторы, содержащие ДНК, которая кодирует любое из представленных в настоящем описании антител к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, и сконструированные с помощью цистеина антитела к CD22, входящие в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении. Предложены также клетки-хозяева, содержащие любой указанный вектор. Например, клетки-хозяева могут представлять собой СНО-клетки, клетки Е. coli или клетки дрожжей.

Предложен также способ получения любого из представленных в настоящем описании полипептидов, заключающийся в том, что культивируют клетки-хозяева в условиях, пригодных для экспрессии требуемого полипептида, и выделяют требуемый полипептид из клеточной культуры.

Сконструированные с помощью цистеина антитела могут найти применение для лечения рака, и они включают антитела, специфические в отношении находящихся на клеточной поверхности и трансмембранных рецепторов и ассоциированных с опухолями антигенов (ТАА). Указанные антитела можно применять в виде «оголенных» антител (не конъюгированных с лекарственным средством или применяемым в качестве метки фрагментом) или в виде конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC). Сконструированные с помощью цистеина антитела, предлагаемые в изобретении, могут быть сайтспецифическими и могут быть эффективно сшиты с вступающим во взаимодействие с тиолом реагентом. Вступающий во взаимодействие с тиолом реагент может представлять собой многофункциональный линкерный реагент, захватывающий метку реагент, флуорофор или промежуточный продукт лекарственное средство-линкер. Сконструированное с помощью цистеина антитело можно метить выявляемой меткой, иммобилизовать на твердой подложке и/или конъюгировать с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство. Тиольную реакционную способность можно придавать любому антителу путем замены аминокислот на реакционноспособную аминокислоту цистеин в положениях в легкой цепи, выбранных из следующего диапазона аминокислотных положений: L-10 - L-20; L-38 - L-48; L-105 - L-115; L-139 - L-149; L-163 - L-173; и в положениях тяжелой цепи, выбранных из следующего диапазона аминокислотных положений: Н-35 - Н-45; Н-83 - Н-93; Н-114 - Н-127 и Н-170 - Н-184, и в Fc-области в положениях тяжелой цепи, выбранных из следующего диапазона положений: Н-268 - Н-291; Н-319 - Н-344; Н-370 - Н-380 и Н-395 - Н-405, где нумерация аминокислотных положений начинается с положения 1 согласно системе нумерации Кэбота (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., из-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) и последовательно продолжается за этим положением, как описано в WO 2006/034488. Тиольную реакционную способность можно придавать также определенным доменам антитела, таким как константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, СН2 и СН3. Замены на цистеин, обеспечивающие значение тиольной реакционноспособности, составляющее 0,6 и выше, можно осуществлять в константных доменах тяжелой цепи α, δ, ε, γ и μ интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно, включая подклассы IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Указанные антитела и их применения описаны в WO 2006/034488.

Сконструированные с помощью цистеина антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно сохраняют антигенсвязывающую способность, присущую антителам дикого типа, т.е. их копий, представляющих собой родительское антитело. Так, сконструированные с помощью цистеина антитела обладают способностью связываться, предпочтительно специфически, с антигенами. Указанные антигены включают, например, ассоциированные с опухолями антигены (ТАА), белки рецепторов клеточной поверхности и другие молекулы клеточной поверхности, трансмембранные белки, сигнальные белки, факторы, регулирующие выживание клеток, факторы, регулирующую клеточную пролиферацию, молекулы, ассоциированные с развитием или дифференцировкой тканей (например, для которых известно или ожидается, что они принимают функциональное участие в этих процессах), лимфокины, цитокины, молекулы, участвующие в регуляции клеточного цикла, молекулы, участвующие в васкулогенезе, и молекулы, ассоциированные с ангиогенезом (например, для которых известно или ожидается, что они принимают функциональное участие в ангиогенезе). Ассоциированный с опухолью антиген может представлять собой фактор дифференцировочного кластера (т.е. CD-белок, включая (но, не ограничиваясь только им) CD22). Сконструированные с помощью цистеина антитела к CD22, предлагаемые в изобретении, сохраняют антигенсвязывающую способность их родительского антитела к CD22. Так, сконструированные с помощью цистеина антитела, предлагаемые в изобретении, обладают способностью связываться, предпочтительно специфически, с антигенами CD22, включая изоформы бета и/или альфа человеческого CD22, в том числе, в случае, когда указанные антигены экспрессируются на поверхности клеток, в том числе (но, не ограничиваясь только ими) В-клеток.

Ниже представлено подробное описание приведенных в качестве примеров антител к CD22 в виде компонента конъюгата антитело-лекарственное средство, предлагаемого в изобретении, в комбинации с антителом к CD20:

Конкретные варианты антител к CD22

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6; (г) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22, 23; (д) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и (е) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три HVR-последовательности VH, выбранные из (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6. Одним из объектов изобретения является антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Одним из объектов изобретения является антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Одним из объектов изобретения является антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6, и HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6, и HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 и HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три HVR-последовательности VL, выбранные из: (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10; (б) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и (в) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14. Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, содержащим HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9. Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, содержащим HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 10. Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 19-23. В одном из объектов изобретения HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, в которой N28 заменена на V (аминокислотная замена N28V, приводящая к получению SEQ ID NO: 10). В одном из объектов изобретения HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, в которой N28 заменен на А (аминокислотная замена N28А, приводящая к получению SEQ ID NO: 19). В одном из объектов изобретения HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, в которой N28 заменен на Q (аминокислотная замена N28Q, приводящая к получению SEQ ID NO: 20). В одном из объектов изобретения HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, в которой N28 заменен на S (аминокислотная замена N28S, приводящая к получению SEQ ID NO: 21). В одном из объектов изобретения HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, в которой N28 заменен на D (аминокислотная замена N28D, приводящая к получению SEQ ID NO: 22). В одном из объектов изобретения HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, в которой N28 заменен на I (аминокислотная замена N28I, приводящая к получению SEQ ID NO: 23). Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит HVR-L1, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22, 23. В одном из объектов изобретения HVR-L1 имеет любую из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 или 23, и аминокислота в положении N30 (аспарагин в положении 30) заменена на А (аминокислотная замена N30A). В одном из объектов изобретения HVR-L1 имеет любую из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 или 23, и аминокислота в положении N30 (аспарагин в положении 30) заменена на Q (аминокислотная замена N30Q).

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит (а) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (б) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, дополнительно содержит (a) HVR-H1, содержащий SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, содержащий SEQ ID NO: 4.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит (а) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, дополнительно содержит (a) HVR-H1, содержащий SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, содержащий SEQ ID NO: 4.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит (а) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и (б) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 и 23. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD22 дополнительно содержит (a) HVR-H1, содержащий SEQ ID NO: 2, и HVR-H2, содержащий SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 или 23 содержит аминокислотную замену N30A или N30Q. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретения, содержит дополнительно HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретения, содержит дополнительно HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22, 23; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 или 23, выбранная в качестве HVR-L1, является модифицированной с помощью аминокислотной замены N30A или N30Q.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит вариабельный домен тяжелой, содержащий SEQ ID NO: 16 (см. фиг. 2А, h10F4v1). Одним из объектов изобретения является антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 17 (см. фиг. 2Б, h10F4v1). Одним из объектов изобретения является антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 18 (см. Фиг. 2B, h10F4v3).

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 26 (см. фиг. 2А, m10F4). Одним из объектов изобретения является антитело к CD22, входящее в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 27 (см. фиг. 2Б, m10F4).

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 HVR-последовательностей антитела 10F4.4.1, полученного с помощью гибридомы, которая депонирована в АТСС и имеет регистрационный номер РТА-7621.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 HVR-последовательностей антитела 5Е8.1.8 полученного с помощью гибридомы, которая депонирована в АТСС и имеет регистрационный номер РТА-7620.

Антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, которое предназначено для объединения с антителом к CD20, указанном в настоящем описании, может содержать последовательность любого приемлемого каркасного участка вариабельного домена при условии, что антитело сохраняет способность связываться с CD22. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения антитела к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, содержит консенсусную последовательность каркасного участка тяжелой цепи человеческой подгруппы III. В одном из вариантов указанных антител консенсусная последовательность каркасного участка тяжелой цепи несет замену(ы) в положении(ях) 71, 73 и/или 78. В одном из вариантов указанных антител положение 71 соответствует А, положение 73 соответствует Т и/или положение 78 соответствует А. В одном из вариантов осуществления изобретения указанные антитела содержат последовательность каркасного участка вариабельного домена тяжелой цепи антитела huMAb4D5-8, например, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 (FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4 соответственно). huMAb4D5-8 представляет собой известное антитело к HER2, поступающее в продажу под названием HERCEPTIN^® фирмы Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, шт. Калифорния, США; упомянутое также в US №№6407213 и 5821337 и у Lee и др., J. Mol. Biol., 340(5), 2004, сс.1073-1093. В одном из указанных вариантов осуществления изобретения указанные антитела содержат, кроме того, консенсусную последовательность каркасного участка человеческой легкой κI-цепи. В одном из указанных вариантах осуществления изобретения указанные антитела содержат последовательность каркасного участка вариабельного домена легкой цепи антитела huMAb4D5-8, например, SEQ ID NO: 8, 11, 13, 15 (FR-L1, FR-L2, FR-L3, FR-L4 соответственно).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, которое предназначено для объединения с антителом к CD20, указанном в настоящем описании, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий каркасную последовательность и гипервариабельные области, в котором каркасная последовательность содержит последовательности FR-H1-FR-Н4 SEQ ID NO:l, 3, 5 и 7 соответственно; HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 и HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к CD22 содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий каркасную последовательность и гипервариабельные участки, в котором каркасная последовательность содержит последовательности FR-L1-FR-L4 SEQ ID NO: 8, 11, 13 и 15 соответственно; HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 21, 22 и 23, где любая из SEQ ID NO: 9-10 или 19-23 может содержать аминокислотную замену N30А или N30Q; HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 и HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность выбранную из SEQ ID NO: 14. В одном из вариантов указанных антител вариабельный домен тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 16 и вариабельный домен легкой цепи содержит SEQ ID NO: 17 или 18.

Некоторыми вариантами осуществления изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, последовательность которой по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены, инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антитело, которое содержит указанную аминокислотную последовательность, сохраняет способность связываться с CD22. В некоторых вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменено, встроено или удалено путем делеции в SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. затрагивают FR). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, которое предназначено для объединения с антителом к CD20, указанном в настоящем описании, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16.

Некоторыми вариантами осуществления изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, представленный ниже.

(подчеркнуты HVR-остатки).

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности HVR и FR тяжелой цепи содержат следующие последовательности:

Некоторыми вариантами осуществления изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит вариабельный домен легкой цепи, представленный ниже.

(HVR - остатки подчеркнуты и положение N28 обозначено жирным шрифтом) или

(HVR- остатки подчеркнуты и положение N28V выделено жирным шрифтом).

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности HVR легкой цепи содержат следующие последовательности:

)

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательности FR легкой цепи содержат следующие последовательности:

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17 или 18. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены, инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антитело, которое содержит указанную аминокислотную последовательность, сохраняет способность связываться с CD22. В некоторых вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменено, встроено или удалено путем делеции в последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17 или 18. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. затрагивают FR). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, предназначенное для объединения с антителом к CD20, указанном в настоящем описании, содержит вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 17 или 18.

Одним из объектов изобретения является комбинация антитела к CD20, указанного в настоящем описании, с антителом к CD22, входящим в указанный конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, которое содержит (а) вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 16; и (б) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17 или 18. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены, инсерции или делении относительно референс-последовательности, но антитело, которое содержит указанную аминокислотную последовательность, сохраняет способность связываться с CD22. В некоторых вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменено, встроено или удалено путем делеции в последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 17 или 18. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. затрагивают FR). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемом в изобретении, предназначенное для объединения с антителом к CD20, указанном в настоящем описании, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18.

В одном из объектов изобретения антитело к CD22 в указанном конъюгате антитело-лекарственное средство, предлагаемое в изобретении, содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 гипервариабельных участков антитела 5Е8.1.8, полученного с помощью гибридомы, которая депонирована в АТСС и имеет регистрационный № РТА-7620.

Фрагменты антител

Под объем настоящего изобретения подпадают фрагменты антител. Фрагменты антител можно создавать традиционными методами, такими как ферментативное расщепление, или методами рекомбинации. В некоторых ситуациях применение ферментов антител обладает преимуществами по сравнению с применением полных антител. Меньший размер фрагментов обусловливает их быстрый клиренс и может облегчать их доступ к солидным опухолям. Обзор некоторых фрагментов антител см. у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, cc. 129-134.

Для получения фрагментов антител разработаны различные методики. Традиционно эти фрагменты получали с помощью протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto и др., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 1992, cc. 107-117 и Brennan и др., Science, 229, 1985, с. 81). Однако в настоящее время такие фрагменты можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Fab-, Fv- и ScFv-фрагменты антител все можно экспрессировать в Е. coli и секретировать из указанных клеток, что облегчает производство указанных фрагментов в больших количествах. Фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, описанных выше. Альтернативно этому, Fab'-SH-фрагменты можно непосредственно выделять из Е. coli и химически сшивать с получением F(аb')₂-фрагментов (Carter и др., Bio/Technology 10, 1992, сс. 163-167). Согласно другому подходу F(аb')₂-фрагменты можно выделять непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Fab- и F(аb')₂-фрагменты с удлиненным временем полужизни in vivo, которые содержат остатки эпитопа, связывающегося с рецептором спасения, описаны в US №5869046. Другие методики получения фрагментов антител должны быть очевидны практикующему специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv) (см. WO 93/16185; US №№5571894 и 5587458). К Fv и scFv относятся только фрагменты с интактными антигенсвязывающими центрами, лишенные константных областей; по этой причине их можно применять для снижения неспецифического связывания при применении in vivo. Слитые белки scFv можно конструировать для создания слияния эффекторного белка либо на амино-, либо на карбоксиконце scFv (см. Antibody Engineering, под ред. Borrebaeck, выше). Фрагмент антитела может представлять собой также «линейное антитело», например, описанное, например, в US №5641870. Указанные линейные антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

Гуманизированные антитела

Под объем изобретения подпадают также гуманизированные антитела. В данной области известны различные методы гуманизации нечеловеческих антител. Например, гуманизированное антитело может иметь один или несколько встроенных в него аминокислотных остатков, полученных из источника, отличного от антитела человека. Эти полученные из источника, отличного от антитела человека, аминокислотные остатки часто называют «импортными» остатками, поскольку их обычно получают из «импортного» вариабельного домена. Гуманизацию в целом можно осуществлять согласно методу Winter с соавторами (Jones и др., Nature, 321, 1986, сс. 522-525; Riechmann и др., Nature, 332, 1988, сс. 323-327; Verhoeyen и др., Science, 239, 1988, сс. 1534-1536) путем замены последовательностей гипервариабельного участка на соответствующие последовательности человеческого антитела. Таким образом, «гуманизированные» антитела представляют собой химерные антитела (US №4816567), в которых участок, существенно меньший, чем интактная человеческая вариабельная область, заменен соответствующей последовательностью, полученной из антитела видов кроме человека. На практике гуманизированные антитела представляют собой, как правило, человеческие антитела, в которых часть остатков гипервариабельного участка и возможно часть остатков FR заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

Выбор человеческих вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепи, предназначенных для получения гуманизированных антител, может быть важен для снижения антигенности. Согласно так называемому методу «наилучшего подбора» последовательность вариабельного домена антитела грызунов подвергают скринингу относительно полной библиотеки известных последовательностей человеческих вариабельных доменов. Человеческую последовательность, которая наиболее близка к последовательности из организма грызунов, затем применяют в качестве человеческого каркасного участка для гуманизированного антитела (Sims и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2296); Chothia и др., J. Mol. Biol., 196, 1987, с. 901). В другом методе используют определенный каркасный участок, полученный из консенсусной последовательности определенной подгруппы легких или тяжелых цепей всех человеческих антител. Один и тот же каркасный участок можно применять для нескольких различных гуманизированных антител (Carter и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89, 1992, с. 4285; Presta и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2623).

Важно также, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой связывающей способности к антигену и других важных биологических свойств. Для решения этой задачи согласно одному из методов гуманизированные антитела получают с помощью анализа родительских последовательностей и различных гуманизированных продуктов с использованием умозрительных трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и хорошо известны специалистам в данной области. Известны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных перспективных последовательностей (последовательности-«кандидаты») иммуноглобулинов. Изучение этих изображений позволяет осуществлять анализ возможной роли остатков в функции перспективной последовательности иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность перспективного иммуноглобулина (иммуноглобулин-«кандидат») связываться с его антигеном. Таким путем можно выбирать остатки в FR и объединять с реципиентными и импортными последовательностями для достижения требуемых характеристик антитела, таких как повышенная аффинность к антигену(ам)-мишени(ням). Как правило, остатки гипервариабельного участка оказывают непосредственное и наиболее существенное влияние на связывание антигена.

Человеческие антитела

Человеческие антитела к CD22, предлагаемые в изобретении, можно конструировать путем объединения последовательности(ей) вариабельных доменов Fv-клона, выбранной(ых) из человеческих фаговых дисплейных библиотек, с известной(ыми) последовательностью(ями) человеческих константных доменов, описанных выше. Альтернативно этому, человеческие моноклональные антитела к CD22, предлагаемые в изобретении, можно создавать с помощью метода гибридом. Описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы, предназначенные для получения человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor D., J. Immunol. 133, 1984, с. 3001; Brodeur B.R. и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, изд-во Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, cc. 51-63 и Boerner P. и др., J. Immunol. 147, 1991, c. 86).

В настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), которые могут после иммунизации продуцировать полный спектр человеческих антител в отсутствии производства эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция области стыка гена тяжелой цепи (JH) в химерной и зародышевой линии мутантных мышей приводит к полному ингибированию производства эндогенных антител. Перенос массива генов иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии в указанную мутантную зародышевую линию мышей может приводить к получению человеческих антител после контрольного заражения антигеном (см., например, Jakobovits и др., Ргос. Natl. Acad. Sci USA, 90, 1993, с. 2551; Jakobovits и др., Nature, 362, 1993, с. 255; Bruggermann и др., Year in Immunol., 7, 1993, с. 33).

Можно применять также перестановку генов для получения человеческих антител из нечеловеческих антител, например, антител грызунов, если человеческое антитело обладает сходными аффинностями и специфичностями с исходным нечеловеческим антителом. Согласно этому методу, который называют «эпитопный импринтинг», ген V-домена тяжелой или легкой цепи антител грызунов, полученный методами, основанными на фаговом дисплее, указанными в настоящем описании, заменяют спектром человеческих генов V-доменов, создавая популяцию химер scFv или Fab, содержащих нечеловеческую цепь/человеческую цепь. Селекция в отношении антигена приводит к выделению вариабельных областей химерных scFv или Fab, содержащих нечеловеческую цепь/человеческую цепь, в которых человеческая цепь способна восстанавливать антигенсвязывающий центр, разрушенный при удалении соответствующей нечеловеческой цепи в первичном экспонируемом фагом клоне, т.е. эпитоп обусловливает выбор человеческой цепи в качестве партнера (осуществляет импринтинг). Когда процесс повторяют, чтобы заменить оставшуюся нечеловеческую цепь, получают человеческое антитело (см. публикацию РСТ WO 93/06213, опубликованную 1 апреля 1993 г.). В отличие от традиционной гуманизации нечеловеческих антител посредством трансплантации CDR, такой метод обеспечивает получение полностью человеческих антител, которые не имеют остатков FR или CDR нечеловеческого происхождения.

Биспецифические антитела

Биспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, обладающие связывающими специфичностями в отношение по меньшей мере двух различных антигенов. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антитела представляют собой человеческие или гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из связывающих специфичностей связывается с CD22, а другая с любым другим антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами CD22. Биспецифические антитела можно применять также для локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют CD22. Эти антитела несут связывающее CD22 плечо и плечо, которое связывается с цитотоксическим агентом, таким, например, как сапорин, антитело против интерферона-α, алкалоид барвинка, цепь А рицина, метотрексат или гаптен, меченный радиоактивным изотопом. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифические антитела в виде F(ab')₂).

Методы создания биспецифических антител известны в данной области. Традиционно рекомбинантное получение биспецифических антител базируется на совместной экспрессии двух пар тяжелых-легких цепей иммуноглобулина, в которых две тяжелые цепи обладают различными специфичностями (Milstein и Cuello, Nature, 305, 1983, с. 537). Из-за случайного выбора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина указанные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна обладает правильной биспецифической структурой. Очистка правильной молекулы, которую, как правило, осуществляют с использованием стадий аффинной хроматографии, является довольной сложной, а выходы продукта являются небольшими. Аналогичные процедуры описаны в WO 93/08829, опубликованной 13 мая 1993 г., и у Traunecker и др., EMBO J., 10, 1991, с. 3655.

Согласно другому подходу вариабельные домены антитела с требуемыми связывающими специфичностями (центры связывания антитела-антигена) сливают с последовательностями константных доменов иммуноглобулина. Слияние, например, имеет место в константном домене тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащем по меньшей мере часть шарнирной области, СН2- и СН3-участки. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере в одном из слияний присутствует первый участок константной области тяжелой цепи (СН1), содержащий сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие несущие слияния тяжелых цепей иммуноглобулина и при необходимости легкую цепь иммуноглобулина, встраивают в различные экспрессионные векторы и совместно трансфектируют ими приемлемый организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость регулирования взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления изобретения, в которых неравные соотношения трех применяемых в конструкции полипептидных цепей приводят к получению оптимальных выходов. Однако можно встраивать кодирующие последовательности двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях позволяет получать высокие выходы или когда соотношения не играют особенно значимой роли.

Согласно одному из вариантов такого подхода биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой связывающей специфичностью в одном плече и гибридной пары тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина (которая обеспечивает вторую связывающую специфичность) в другом плече. Установлено, что указанная асимметричная структуру облегчает отделение требуемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновых цепей, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает простой путь отделения. Указанный подход описан в WO 94/04690. Дополнительные подробности, касающиеся создания биспецифических антител, см., например, у Suresh и др., Methods in Enzymology, 121, 1986, с. 210.

Согласно другому подходу можно конструировать поверхность раздела между парой молекул антител для повышения до максимума процента гетеродимеров, которые выделяют из культуры рекомбинантных клеток. Поверхность раздела содержит по меньшей мере часть С_H3-домена константного домена антитела. Согласно этому методу одну или несколько аминокислот с меньшими боковыми цепями из поверхности раздела первой молекулы антитела заменяют на аминокислоты с более крупными боковыми цепями (например, тирозин или триптофан). На поверхности раздела второй молекулы антитела создают компенсирующие «полости», размер которых идентичен или соответствует размеру крупной(ых) боковой(ых) цепи(ей), путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с меньшими боковыми цепями (например, аланин или треонин). Это является механизмом повышения выхода гетеродимера относительно других нежелательных конечных продуктов, таких как гомодимеры.

К биспецифическим антителам относятся перекрестносшитые антитела или «гетероконъюгаты». Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть сшито с авидином, а другое с биотином. Указанные антитела, например, могут найти применение для направленного переноса клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (US №4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/00373 и ЕР 03089). Гетероконъюгаты антител можно создавать с использованием любого соответствующего метода перекрестного сшивания. Приемлемые перекрестносшивающие агенты хорошо известны в данной области и описаны в US №4676980, наряду с рядом методов перекрестного сшивания.

Методики создания биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получать путем химического связывания. Brennan и др., Science, 229, 1985, с. 81 описали процедуру, при которой интактные антитела подвергали протеолитическому расщеплению с получением F(аb')₂-фрагментов. Указанные фрагменты восстанавливали в присутствии образующего комплекс с дитиолом арсената натрия для стабилизации соседних дитиолов и предупреждения образования межмолекулярного дисульфида. Созданные Fab'-фрагменты затем превращают в тионитробензоатные (TNB) производные. Одно из производных Fab'-TNB затем повторно конвертируют в Fab'-тиол путем восстановления с помощью меркаптоэтиламина и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB с получением биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела можно применять в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.

Достигнутый в настоящее время прогресс облегчил непосредственное выделение Fab'-SH-фрагментов из Е. coli, которые можно подвергать химическому связыванию с получением биспецифических антител. Shalaby и др., J. Exp.Med., 17, 1992, сс.217-225 описали получение полностью гуманизированного биспецифического антитела в виде молекулы F(ab')₂. Каждый Fab-фрагмент по отдельности секретировали из Е. coli и подвергали непосредственному химическому связыванию in vitro с получением биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело обладало способностью связываться с клетками, сверхэкспрессирующими HER2-рецептор, и здоровыми человеческими Т-клетками, а также запускать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов против мишеней, представляющих собой человеческие клетки опухоли молочной железы.

Описаны также различные методики создания и выделения фрагментов биспецифического антитела непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела можно получать с использованием «лейциновых молний» (Kostelny и до., J. Immunol., 148(5), 1992, сс. 1547-1553). Пептиды «лейциновых молний» из белков Fos и Jun связывали с Fab'-участками двух различных антител посредством слияния генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с получением мономеров и затем повторно окисляли с образованием гетердимеров антител. Указанный метод можно применять также для получения гомодимеров антител. Технология создания димерных антител («диабоди»), описанная Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, cc. 6444-6448, представляет собой альтернативный механизм создания фрагментов биспецифических антител. Фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) с помощью линкера, который является слишком коротким для того, чтобы позволять осуществлять спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи. Таким образом, VH- и VL-домены одного фрагмента должны спариваться с комплементарными VL- и VH-доменами другого фрагмента, образуя тем самым два антигенсвязывающих центра. Описана также другая стратегия создания фрагментов биспецифических антител, основанная на применение одноцепочечных димеров Fv (sFv) (см. Gruber и др., J. Immunol., 152, 1994, с. 5368).

Изобретение относится к антителам, имеющим более двух валентностей. Например, можно получать триспецифические антитела (Tutt и др., J. Immunol. 147, 1991, с. 60).

Многовалентные антитела

Многовалентное антитело может интернализоваться (и/или подвергаться катаболизму) быстрее, чем двухвалентное антитело клеткой, экспрессирующей антиген, с которой связываются антитела. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой многовалентные антитела (отличные от IgM-класса) с тремя или большим количеством антигенсвязывающих центров (например, четырехвалентные антитела), которые легко можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи антитела. Многовалентное антитело может содержать домен димеризации и три или большее количество антигенсвязывающих центров. В некоторых варрантах осуществления изобретения домен димериазции содержит Fc-область и шарнирную область (или состоит из них). В этом случае антитело может содержать Fc-область и три или большее количество антигенсвязывающих центров на аминоконце относительно Fc-области. В некоторых вариантах осуществления изобретения многовалентное антитело содержит от трех до примерно восьми антигенсвязывающих центров (или состоит из них). В одном из указанных вариантов осуществления изобретения многовалентное антитело содержит четыре антигенсвязывающих центра (или состоит из них). Многовалентное антитело содержит по меньшей мере одну полипептидную цепь (например, две полипептидные цепи), при этом полипептидная(ые) цепь(и) содержит(ат) два или большее количество вариабельных доменов. Например, полипептидная(ые) цепь(и) может(гут) может содержать VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc, где VD1 обозначает первый вариабельный домен, VD2 обозначает второй вариабельный домен, Fc обозначает одну полипептидную цепь Fc-области, X1 и Х2 обозначают аминокислоту или полипептид и n обозначает 0 или 1. Например, полипептидная(ые) цепь(и) может(гут) может содержать: цепь VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-Fc-область или цепь VH-CH1-VH-CH1-Fc-область. Многовалентное антитело, представленное в настоящем описании, может дополнительно содержать по меньшей мере два (например, четыре) полипептида вариабельного домена легкой цепи. Многовалентное антитело, представленное в настоящем описании, может, например, содержать от примерно двух до примерно восьми полипептидов вариабельного домена легкой цепи. Полипептиды вариабельных доменов легкой цепи, рассматриваемые в настоящем описании, содержат вариабельный домен легкой цепи и необязательно дополнительно содержат CL-домен.

Однодоменные антитела

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой однодоменное антитело. Однодоменное антитело представляет собой одну полипептидную цепь, содержащую весь вариабельный домен тяжелой цепи антитела или его часть или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (фирма Domantis, Inc., Валтам, шт. Массачусетс; см., например, US №6248516 В1). В одном из вариантов осуществления изобретения однодоменное антитело состоит из всего вариабельного домена тяжелой цепи антитела или его части.

Варианты антител

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к модификации(ям) аминокислотных последовательностей антител, представленных в настоящем описании. Например, может требоваться повышать аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела можно получать путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем синтеза пептидов. Указанные модификации включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно использовать любую комбинацию делеции, инсерции и замен, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, способностью связываться с антигеном. Аминокислотные изменения можно интродуцировать в рассматриваемую аминокислотную последовательность в процессе создания указанной последовательности.

Ценным методом идентификации конкретных остатков или областей антитела, которые можно подвергать мутагенезу, является так называемый «аланин-сканирующий мутагенез», описанный у Cunningham B.C. и Wells J.A., Science 244, 1989, сс. 1081-1085. При осуществлении этого метода остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для решения вопроса о том, будет ли это влиять на взаимодействие аминокислот с антигеном. Затем те аминокислотные положения, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к заменам, уточняют путем интродукции дополнительных или других вариантов в сайты замены. Таким образом, в то время как сайт для интродукции вариации аминокислотной последовательности является предопределенным, природа самой мутации не является предопределенной. Например, для анализа эффективности мутации в данном сайте осуществляют ala-сканирующий или неспецифический мутагенез в кодоне-мишени или области-мишени и экспрессируемые иммуноглобулины подвергают скринингу в отношении требуемой активности.

Инсерции в аминокислотные последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или большее количество остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примером результата осуществления концевых инсерции является антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекул антител включают слияние N- или С-концов антитела с ферментом (например, для ADEPT (антитело-направляемый фермент пролекарственной терапии) или полипептидом, который удлиняет время полужизни антитела в сыворотке.

В некоторых варианта осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, изменяют с целью повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Гликозилирование полипептидов, как правило, является либо N-связанным, либо О-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводного остатка к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, в которых X обозначает любую аминокислоту кроме пролина, представляют собой распознаваемые последовательности для ферментативного присоединения углеводного остатка к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из указанных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из таких сахаров, как N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя для присоединения можно использовать также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление или делению сайтов гликозилирования в антителе удобно осуществлять путем такого изменения аминокислотной последовательности, при котором создают или удаляют одну или несколько указанных выше трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменение можно осуществлять также путем добавления, делеции или замены одного или нескольких остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела (для О-связанных сайтов гликозилирования).

Если антитело содержит Fc-область, то можно изменять присоединенный к ней углевод. Например, антитела со зрелой углеводной структурой, в которой отсутствует фукоза, присоединенная к Fc-области антитела, описаны в заявке на патент US №2003/0157108 (на имя Presta L.) (см. также US №2004/0093621 (на имя фирмы Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Антитела с бисекционирующим N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) в углеводе, присоединенном к Fc-области антитела, описаны в WO 2003/011878 на имя Jean-Mairet с соавторами и в US №6602684 на имя Umana с соавторами. Антитела по меньшей мере с одним галатозным остатком в олигосахариде, присоединенном к Fc-области антитела, описаны в WO 1997/30087 на имя Patel с соавторами (см. также, WO 1998/58964 (на имя Raju S.) и WO 1999/22764 (на имя Raju S.) описание антител с измененным углеводом, присоединенном к его Fc-области; см. также в US №2005/0123546 (на имя Umana с соавторами) описание антигенсвязывающих молекул с модифицированным гликозилированием).

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант гликозилирования содержит Fc-область, в которой углеводная структура, присоединенная к Fc-области, лишена фукозы. Указанные варианты обладают улучшенной ADCC-функцией. Необязательно Fc-область дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, которые дополнительно улучшают ADCC, например, замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (Eu-нумерация остатков). Примеры публикаций, касающихся «дефукозилированных» или «с дефицитом фукозы» антител, включают:

US №2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US №2002/0164328; US №2004/0093621; US №2004/0132140; US №2004/0110704; US №2004/0110282; US №2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki и др., J. Mol. Biol. 336, 2004, cc. 1239-1249; Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, c. 614. Примерами клеточных линий, которые обладают способностью продуцировать дефукозилированные антитела, являются Lec13 СНО-клетки с дефицитом белкового фукозилирования (Ripka и др., Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, cc. 533-545; заявка на патент США №2003/0157108 А1 на имя Presta L. и WO 2004/056312 А1, на имя Adams с соавторами, прежде всего описанные в примере 11) и клеточные линии с «выключенным» геном, например, СНО-клетки с «выключенным» геном альфа- 1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, с. 614).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело изменяют для удлинения его времени полужизни в сыворотке. Для удлинения времени полужизни антитела в сыворотке в антитело можно включать эпитоп, связывающийся с рецептором спасения (прежде всего во фрагмент антитела), например, описанный в US №5739277. В контексте настоящего описания понятие «эпитоп, связывающийся с рецептором спасения» относится к эпитопу Fc-области IgG-молекулы (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который ответствен за удлинение времени полужизни in vivo в сыворотке IgG-молекулы (US №2003/0190311, US №6821505; US №6165745; US №5624821; US №5648260; US №6165745; US №5834 597).

Другим типом варианта является вариант, включающий аминокислотную замену. Эти варианты содержат по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела, который заменен на другой остаток. Представляющие интерес сайты для обусловливающего замены мутагенеза включают гипервариабельные участки, но изменения могут затрагивать также FR. Консервативные замены представлены ниже в таблице 3 под заголовком «предпочтительные замены». Если указанные замены приводят к требуемому изменению биологической активности, то можно интродуцировать более значительные замены, обозначенные как «приведенные в качестве примера замены» в таблице 3, или дополнительно описанные ниже со ссылкой на класс аминокислот, и продукты подвергать скринингу.

Для получения существенных модификаций биологических свойств антитела отбирают замены, которые существенно отличаются по их воздействию на поддержание (а) структуры полипептидного каркаса в области замены, например, пластинчатой (складчатой) или спиральной конформации, (б) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени, или (в) объема боковой цепи. Аминокислоты можно группировать на основе сходства свойств их боковых цепей (см. у A. L. Lehninger в: Biochemistry, 2-е изд., изд-во Worth Publishers, New York, 1975, cc. 73-75):

(1) неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M),

(2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (С), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q),

(3) кислотные: Asp (D), Glu (E),

(4) Lys (K), Arg (R), His(H).

Альтернативно этому, встречающиеся в естественных условиях остатки можно разделять на группы на основе общих свойств боковых цепей:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

Под неконсервативными заменами подразумевают замену представителя одного из указанных классов на представителя из другого класса. Указанные заменяющие остатки можно интродуцировать также в сайты консервативных замен или в оставшиеся (неконсервативные) сайты.

Один тип полученного в результате замены варианта включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(ые) в результате вариант(ы), отобранный(ые) для дополнительного исследования, должен(ы) иметь модификации (например, улучшения) биологических свойств относительно родительского антитела, из которого он(и) получен(ы). Удобным подходом к созданию указанных получаемых в результате замены вариантов является процесс созревания аффинности с использованием фагового дисплея. В целом, метод состоит в следующем: несколько сайтов в гипервариабельном участке (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации для создания всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Созданные таким образом антитела экспонируют на частицах нитчатого фага в виде слияний по меньшей мере с частью оболочечного белка фага (например, продукта гена III фага М13), упакованного в каждую частицу. Затем экспонируемые на фаге варианты подвергают скринингу в отношении их биологической активности (например, аффинности связывания). Для идентификации в гипервариабельном участке сайтов-кандидатов для модификации, можно осуществлять сканирующий мутагенез (например, аланин- сканирующий) с целью идентификации остатков в гипервариабельном участке, вносящих существенный вклад в связывание с антигеном. В альтернативном или дополнительном варианте может оказаться важным изучать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Указанные контактирующие остатки и соседние остатки можно рассматривать в качестве кандидатов для замены с помощью методик, известных в данной области, включая разработанные при создании настоящего изобретения. Согласно одному из разработанных вариантов панель вариантов подвергают скринингу с использованием методик, известных в данной области, включая указанные в настоящем описании, и антитела с улучшенными свойствами по данным одного или нескольких соответствующих анализов можно отбирать для дальнейшей разработки.

Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют варианты аминокислотных последовательностей антител, получают различными методами, известными в данной области. Эти методы включают (но не ограничиваясь только ими) выделение из встречающегося в естественных условиях источника (в случае вариантов встречающихся в естественных условиях аминокислотных последовательностей) или получение опосредуемого олигонуклеотидами (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученной вариантной или невариантной версии антитела.

Может оказаться желательным интродуцировать одну или несколько аминокислотных модификаций в Fc-область антител, предлагаемых в изобретении, создавая тем самым вариант Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fc-области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащей аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях, включая входящий в шарнир цистеин.

Согласно настоящему описанию и существующему уровню техники подразумевается, что в некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, может содержать одно или несколько изменений по сравнению с копией дикого типа антитела, например, в Fc-области. Указанные антитела тем не менее, должны сохранять практически такие же характеристики, требуемые для терапевтического применения, что и их копия дикого типа. Например, подразумевается, что в Fc-области можно осуществлять определенные изменения, результатом которых должно являться изменение (т.е. либо повышение, либо понижение) способности связывать C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), что описано, например, в WO 99/51642 (см. также Duncan и Winter Nature 322, 1988, cc. 738-740; US №5648260; US №5624821 и WO 94/29351, в которых описаны другие примеры вариантов Fc-области). В WO 00/42072 (на имя Presta) и WO 2004/056312 (на имя Lowman) описаны варианты антител с повышенной или пониженной способностью связываться с FcR. Содержание указанных патентных публикаций специально включено в настоящее описание в качестве ссылки (см. также Shields и др., J. Biol. Chem. 9(2), 2001, сс. 6591-6604). Антитела с удлиненным временем полужизни и повышенной способностью связываться с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который ответствен за перенос материнских IgG плоду (Guyer и др., J. Immunol. 117, 1976, с. 587 и Kim и др., J. Immunol. 24, 1994, с. 249), описаны в US №2005/0014934А1 (на имя Hinton с соавторами). Указанные антитела содержат Fc-область с одной или несколькими заменами в ней, которые повышают способность Fc-области связываться с FcRn. Варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и повышенной или пониженной способностью связываться с C1q описаны в US №6194551B1, WO 99/51642. Содержание указанных патентных публикаций специально включено в настоящее описание в качестве ссылки (см. также Idusogie и др., J. Immunol. 164, 2000, сс. 4178-4184).

Одним из объектов изобретения являются антитела, которые содержат модификации в поверхности раздела Fc-полипептидов, содержащих Fc-область, где модификации облегчают и/или усиливают гетеродимеризацию. Эти модификации включают интродукцию выпуклости в первый полипептид Fc и полости во второй полипептид Fc, где выпуклость может помещаться в полость, что усиливает комлексообразование первого и второго полипептидов Fc. Методы создания антител с указанными модификациями известны в данной области, например, описаны US №5731168.

Производные антител

Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы они содержали дополнительные небелковые фрагменты, известные в данной области и легко доступные. Предпочтительно фрагменты, пригодные для дериватизации антитела, представляют собой водорастворимые полимеры. Примерами водорастворимых полимеров являются (но не ограничиваясь только ими) полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран- или поли(н-винилпиролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущество при производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьироваться и, если присоединено более одного полимера, то они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, можно определять с учетом таких особенностей (но не ограничиваясь только ими), как конкретные свойства или функции антитела, подлежащие усовершенствованию, предполагается ли применение производного антитела в терапии в определенных условиях, и т.д.

Другим вариантом осуществления изобретения являются конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые можно избирательно нагревать, воздействуя на него излучением. В одном из вариантов осуществления изобретения небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, cc. 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны, включая (но не ограничиваясь только ими) длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой уничтожаются клетки, ближайшие к конъюгату антитело-небелковый фрагмент.

Согласно изобретению понятие «конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство» относится к агентам, имеющим формулу Ab-(L-D)p, в которой

(а) Аb обозначает антитело к CD22, представленное в настоящем описании;

(б) L обозначает линкер;

(в) D обозначает фрагмент, представляющий собой лекарственное средство.

В одном из вариантов способа, предлагаемого в изобретении, конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство представляет собой анти-СD22-МС-vc-PAB-MMAE.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство

Другим объектом изобретения являются иммуноконъюгаты или конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), которые содержат антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, лекарственное средство, ингибирующий рост агент, токсин (например, обладающий ферментативной активностью токсин бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат). Другим объектом изобретения являются также способы применения иммуноконъюгатов. В одном из объектов изобретения иммуноконъюгат содержит любое из указанных выше антител к CD22, ковалентно связанное с цитотоксическим агентом или выявляемым агентом, и он предназначен для объединения с антителом к CD20, указанным в настоящем описании.

Применение конъюгатов антитело-лекарственное средство для местного введения цитотоксических или цитостатических агентов, т.е. лекарственных средств, предназначенных для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении рака (Syrigos и Epenetos, Anticancer Research 19,1999, сс. 605-614; Niculescu-Duvaz и Springer, Adv. Drug Del. Rev. 26, 1997, cc. 151-172; US №4975278), позволяет осуществлять направленное введение фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, в опухоли и накапливать его внутри клеток, в то время как системное введение таких лекарственных агентов в неконъюгированном виде может приводить к неприемлемым уровням токсичности в отношении здоровых клеток, а не только к токсичности в отношении опухолевых клеток, которые требуется элиминировать (Baldwin и др., Lancet, 15 марта 1986, сс. 603-605; Thorpe, «Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review» в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, под ред. Pinchera и др., 1985, cc. 475-506). Тем самым обеспечивается максимальная эффективность при минимальной токсичности. Опубликованы данные о том, что в этих стратегиях можно применять как поликлональные антитела, так и моноклональные антитела (Rowland и др., Cancer Immunol. Immunother., 21, 1986, сс. 183-187). В качестве лекарственных средств в этих методах применяли дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндесин (Rowland и др., 1986, выше). Токсины, применяемые в конъюгатах антитело-токсин, включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Mandler и др., J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19), 2000, cc. 1573-1581; Mandler и др., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10, 2000, cc. 1025-1028; Mandler и др. Bioconjugate Chem. 13, 2002, cc. 786-791), майтанзиноиды (ЕР 1391213; Liu и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1996, cc. 8618-8623) и калихеамицин (Lode и др. Cancer Res. 58, 1998, с. 2928; Hinman и др. Cancer Res. 53, 1993, cc. 3336-3342). Токсины могут проявлять свое действие посредством цитотоксической и цитостатической активности с помощью механизмов, включающих связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства имеют тенденцию инактивироваться или обладать пониженной активностью при конъюгировании с крупными антителами или белковыми лигандами рецепторов.

ZEVALIN® (ибритумомаба тиуксетан, фирма Biogen/Idec) представляет собой конъюгат антитело-радиоизотоп, состоящий из мышиного моноклонального антитела IgG1 каппа, направленное против антигена CD20, находящегося на поверхности здоровых и злокачественных В-лимфоцитов и радиоизотопа 111In или 90Y, связанного с помощью тиомочевинного линкера-хелатора (Wiseman и др., Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7), 2000, cc. 766-77; Wiseman и др., Blood 99(12), 2002, cc. 4336-4342; Witzig и др., J. Clin. Oncol. 20(10), 2002, cc. 2453-2463; Witzig и др., J. Clin. Oncol. 20(15), 2002, cc. 3262-3269). Хотя зевалин обладает активностью, направленной против В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ), введение приводит к тяжелым и продолжительным цитопениям у большинства пациентов. MYLOTARG™ (гемтузумаба озогамицин, фирма Wyeth Pharmaceuticals), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела к hu-CD33, связанного с калихеамицином, одобрен в 2000 году для лечения острого миелоидного лейкоза посредством инъекции (Drugs of the Future 25(7), 2000, с. 686; US №№4970198, 5079233, 5585089, 5606040, 5693762, 5739116, 5767285, 5773001). Кантузумаба мертанзин (фирма Immunogen, Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела к huC242, связанного посредством дисульфидного линкера SPP с компонентом в виде мейтанзиноидного лекарственного средства, DM1, разработан для лечения видов рака, которые экспрессируют антиген CanAg, таких как рак ободочной кишки, поджелудочной железы, желудка и другие виды. MLN-2704 (фирмы Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из моноклонального антитела против специфичного для простаты мембранного антигена (PSMA), связанного с компонентом в виде майтанзиноидного лекарственного средства, DM1, разрабатывается в качестве кандидата для лечения опухолей предстательной железы. Ауристатиновые пептиды, ауристатин Е (АЕ) и монометилауристатин (ММАЕ), синтетические аналоги доластатина, конъюгировали с химерными моноклональными антителами cBR96 (специфическими в отношении антигена Y Льюиса на карциномах) и с сАС10 (специфическим в отношении CD30 на гематологических злокачественных новообразованиях) (Doronina и др., Nature Biotechnology 21(7), 2003, сс. 778-784), и они находятся в разработке в качестве терапевтических агентов. Химиотерапевтические агенты, которые можно применять для получения таких иммуноконъюгатов, указаны в настоящем описании. Обладающие ферментативной активностью токсины и их фрагменты, которые можно применять, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеццина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРП и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены (см., например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 г.). Различные радиоактивные изотопы можно применять для получения радиоконъюгатов антител. Их примерами являются ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re. Конъюгаты, включающие антитело и цитоксический агент, можно создавать с использованием целого ряда бифункциональных связывающих белки агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бисазидосоединения (такие как бис(пара-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис(пара-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина можно получать согласно методу, описанному у Vitetta и др., Science, 238, 1987, с. 1098). Меченная с помощью С¹⁴ 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклеотида с антителом (см. WO 94/11026).

Под объем изобретения подпадают также конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтанзиноиды, долостатины, ауростатины, трихотен и СС1065 и производных этих токсинов, которые обладают активностью токсинов.

Майтанзин и майтанзиноиды

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит антитело (полноразмерное или фрагменты), предлагаемое в изобретении, которое конъюгировано с одной или несколькими молекулами майтанзиноида.

Майтанзиноиды представляют собой ингибиторы митоза, которые проявляют действие посредством ингибирования полимеризации тубулина. Майтанзин впервые был выделен из восточно-африканского кустарника Maytenus serrata (US №3896111). Далее было установлено, что определенные микроорганизмы также продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и сложные С-3-эфиры майтанзинола (US №4151042). Синтетический майтанзинол и его производные и аналоги описаны, например в US №№. 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269;4309428; 4313946;4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 и 4371533.

Фрагменты, представляющие собой майтанзиноидные лекарственные средства, являются привлекательными компонентами в качестве лекарственных средств, входящих в конъюгаты антитела и лекарственного средства, поскольку они: (I) относительно легко могут быть получены путем ферментации или химической модификации, дериватизации продуктов ферментации, (II) применимы для дериватизации с помощью функциональных групп, пригодных для конъюгации с антителами через линкеры, отличные от дисульфидных мостиков, (III) стабильны в плазме и (IV) эффективны в отношении различных линий опухолевых клеток.

Производные майтанзина, которые можно применять в качестве фрагментов, представляющих собой майтанзиноидные лекарственные средства, хорошо известны в данной области, и их можно выделять из природных источников с помощью известных методов, получать с помощью методик генетической инженерии (см. Yu и др., PNAS 99, 2002, сс. 7968-7973), или майтанзинол и аналоги майтанзинола можно получать синтетически с помощью известных методов.

Примеры фрагментов, представляющих собой майтанзиноидные лекарственные средства, включают соединения, имеющие модифицированное ароматическое кольцо, такие как: С-19-дехлор (US №4256746) (получали путем восстановления анзамитоцина Р2 алюмогидридом лития); С-20-гидрокси (или С-20-деметил)+/-С-19-дехлор (US №№4361650 и 4307016) (получали деметилированием с использованием Streptomyces или Actinomyces или дехлорированием с помощью LAH); и С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-OCOR),+/-дехлор (US №4294757) (получали ацилированием с помощью ацилхлоридов), и имеющие модификации в других положениях.

Примеры фрагментов, представляющих собой майтанзиноидные лекарственные средства, включают также соединения, имеющие следующие модификации: C-9-SH (US №4424219) (получали путем взаимодействия майтанзинола с H₂S или P₂S₅); С-14-алкоксиметил(деметокси/СН₂OR)(US №4331598); С-14-гидроксиметил- или ацилоксиметил (СН₂ОН или СН₂ОАс) (US №4450254) (получали из Nocardia); С-15-гидрокси/ацилокси (US №4364866) (получали путем конверсии майтанзинола в Streptomyces); С-15-метокси (US №№4313946 и 4315929) (выделяли из Trewia nudlflora); С-18-N-диметил (US №№4362663 и 4322348) (получали деметилированием майтанзинола в Streptomyces); и 4,5-дезокси (US №4371533) (получали путем восстановления с помощью трихлорида титана/LAH майтанзинола).

Примерами фрагментов, представляющих собой майтанзиноидные лекарственные средства, являются: DM1; DM и DM4, которые имеют следующие структуры:

в которых волнистой линией показано ковалентное соединение атома серы лекарственного средства с линкером (L) конъюгата антитело-лекарственное средство. Описано лекарственное средство HERCEPTIN® (трастузумаб, антитело к HER2), связанное с помощью SMCC с DM1 (WO 2005/037992, которая специально полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки). Конъюгат антитело-лекарственное средство, предлагаемый в настоящем изобретении, можно получать с использованием представленных в настоящем описании процедур.

Другие примеры конъюгатов майтанзиноидных лекарственных средств и антител имеют следующие структуры и сокращенные названия (где Аb обозначает антитело и р обозначает число от 1 до примерно 8):

Приведенные в качестве примера конъюгатов антитело-лекарственное средство, в которых DM1 связан через ВМРЕО-линкер с тиольной группой антитела, имеют следующую структуру и сокращенные названия:

где Аb обозначает антитело; n обозначает 0, 1 или 2; и p обозначает 1, 2, 3 или 4.

Содержащие майтанзиноиды иммуноконъюгаты, методы их получения и их терапевтическое применение описаны, например, в US №№5208020, 5416064 и ЕР 0425235 В1, содержание которых специально включено в настоящее описание в качестве ссылки. У Liu и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1996, cc. 8618-8623 описаны иммуноконъюгаты, которые содержат майтанзиноид, обозначенный как DM1, сцепленный с моноклональным антителом С242 против человеческого колоректального рака. Установлено, что конъюгат обладает высокой цитотоксичностью в отношении клеток рака ободочной кишки в культуре и противоопухолевой активностью in vivo при анализе роста опухоли. У Chari и др., Cancer Research 52, 1992, сс. 127-131 описаны иммуноконъюгаты, в которых майтанзиноид конъюгирован через дисульфидный линкер с мышиным антителом А7, связывающимся с антигеном, который находится на клетках человеческой линии рака ободочной кишки, или с другим мышиным моноклональным антителом ТА.1, которое связывается с онкогеном HER-2/neu. Цитотоксичность конъюгата TA.l-майтансоноид тестировали in vitro с использованием человеческой линии клеток рака молочной железы SK-BR-3, в которой уровень экспрессии составляет 3×10⁵ поверхностного антигена HER-2 на клетку. При использовании конъюгата с лекарственным средством была достигнута цитотоксичность, аналогичная токсичности лекарственного средства, содержащего свободный майтанзиноид, которую можно повышать, увеличивая количество молекул майтанзиноида на молекулу антитела. Установлено, что конъюгат А7-майтанзиноид обладает пониженной системной цитотоксичностью в отношении мышей.

Конъюгаты антитело к СD22-майтанзиноид, предназначенные для объединения с антителом к CD20, указанным в настоящем описании, получали путем химического сшивания антитела с молекулой майтанзиноида без заметного снижения биологической активности и антитела, и молекулы майтанзиноида (см., например, US №5208020, описание которого специально включено в настоящее описание в качестве ссылки). Установлено, что конъюгирование в среднем 3-4 молекул майтанзиноида с молекулой антитела позволяет эффективно повышать цитотоксичность в отношении клеток-мишеней без отрицательного воздействия на функцию или растворимость антитела, хотя, как ожидается, применение даже одной молекулы токсина/молекулу антитела должно приводить к повышению цитотоксичности по сравнению с использованием «оголенного» антитела. Майтанзиноиды хорошо известны в данной области и их можно синтезировать с помощью известных методов или выделять из природных источников. Пригодные майтанзиноиды описаны, например, в US №5208020, а также в других патентах и в непатентных публикациях, процитированных выше. Предпочтительными майтанзиноидами являются майтанзинол и аналоги майтанзинола, модифицированные в ароматическом кольце или в других положениях молекулы майтанзинола, например, различные сложные эфиры майтанзинола.

В данной области известно много линкерных групп, пригодных для создания конъюгатов антитело-майтанзиноид, в том числе, например, группы, описанные в US №№5208020, 6441163 или ЕР 0425235 В1, у Chari и др., Cancer Research 52, 1992, сс. 127-131 и US №2005/0169933 А1, описание которых специально включено в настоящее описание в качестве ссылки. Конъюгаты антитело-майтанзиноид, которые содержат в качестве линкера SMCC, можно получать согласно методу, описанному в заявке на патент US №11/141344, зарегистрированной 31 мая 2005 г., озаглавленной «Конъюгаты антитело-лекарственное средство и способы получения». Линкерные группы включают дисульфидные группы, тиоэфирные группы, неустойчивые в кислой среде группы, фотолабильные группы, чувствительные к действию пептидаз группы или чувствительные к действию эстераз группы, которые описаны в вышеперечисленных патентах. Известны и другие линкерные группы, и они приведены в качестве примеров в настоящем описании.

Конъюгаты антитела и майтанзиноида можно создавать с помощью разнообразных бифункциональных сшивающих белки агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид, бисазидопроизводные (такие как бис(пара-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис(пара-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоциант), и активные бис-соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Особенно предпочтительными сшивающими агентами, которые участвуют в образовании дисульфидного мостика, являются М-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson и др, Biochem. J. 173, 1978, сс.723-737) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP).

Линкер можно присоединять к молекуле майтанзиноида в различных положениях в зависимости от типа связи. Например, сложноэфирную связь можно получать путем взаимодействия с гидроксильной группой с использованием общепринятых методов сочетания. Реакция может иметь место в положении С-3, несущем гидроксильную группу, в положении С-14, которое модифицировано гидроксиметилом, в положении С-15, которое модифицировано гидроксильной группой, и в положении С-20, несущем гидроксильную группу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения связь создают в положении С-3 майтанзинола или аналога майтанзинола.

В одном из вариантов осуществления изобретения любое из антител, предлагаемых в изобретении (полноразмерное или фрагмент), конъюгируют с одной или несколькими молекулами майтанзиноида. В одном из вариантов иммуноконъюгата цитотоксический агент D представляет собой майтанзиноид DM1. В одном из вариантов иммуноконъюгата линкер представляет собой SMCC. В одном из вариантов конъюгата антитело-линкер-лекарственное средство, предназначенного для объединения с антителом к CD20, представленном в настоящем описании, конъюгат антитело-линкер-лекарственное средство, антитело представляет собой антитело к CD22, представленное в настоящем описании, с которым ковалентно связан цитотоксический агент DM1 через линкер SMCC.

Ауристатины и долостатины

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит антитело, предлагаемое в изобретении, конъюгированное с долостатинами или пептидными аналогами и производными долостатина, ауристатинами (US №№5635483; 5780588). Установлено, что долостатины и ауристатины оказывают воздействие на динамику микротрубочек, гидролиз ГТФ и деление ядер и клеток (Woyke и др. Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12), 2001, cc. 3580-3584) и обладают противораковой (US №5663149) и фунгицидной активностью (Pettit и др. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 1998, cc. 2961-2965). Фрагмент, представляющий собой долостатиновое или ауристатиновое лекарственное средство, можно присоединять к антителу через N-(амино)-конец или С-(карбоксильный)-конец пептидного фрагмента лекарственного средства (WO 02/088172).

Приведенные в качестве примера варианты ауристатина включают связанные на N-конце монометилауристатиновые фрагменты лекарственных средств DE и DF, описанные у Senter и др., Proceedings of the American Association for Cancer Research, т.45, реферат №623, презентация от 28 марта 2004 г., публикация специально полностью включена в настоящее описании в качестве ссылки.

Приведенным в качестве примера вариантом ауристатина является ММАЕ (в формуле волнистой линией обозначена ковалентная связь с линкером (L) конъюгата антитело-лекарственное средство).

Другим приведенным в качестве примера вариантом ауристатина является MMAF (в формуле волнистой линией обозначена ковалентная связь с линкером (L) конъюгата антитело-лекарственное средство, US №2005/0238649):

Другие приведенные в качестве примера варианты, содержащие ММАЕ или MMAF и различные линкерные компоненты (указанные ниже в настоящем описании), имеют следующие структуры и сокращенные названия (в которых Аb обозначает антитело и р обозначает число от 1 до примерно 8):

Как правило, пептидные фрагменты лекарственной субстанции можно получать путем образования пептидной связи между двумя или большим количеством аминокислот и/или пептидных фрагментов. Такие пептидные связи можно получать, например, согласно методу синтеза в жидкой фазе (см. «The Peptides», изд-во Academic Press, т. 1, 1965, cc. 76-136), который хорошо известен в области химии пептидов. Фрагменты ауристатиновых/долостатиновых лекарственных средств можно получать с помощью методов, описанных в: US №5635483; US №5780588; у Pettit и др. J. Am. Chem. Soc. 111, 1989, cc. 5463-5465; Pettit и др. Anti-Cancer Drug Design 13, 1998, cc. 243-277; Petti, G.R. и др. Synthesis, 1996, cc. 719-725; Pettit и др. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15, 1996, cc. 859-863 и DoroninaNat Biotechnol 21(7), 2003, cc. 778-784.

Калихеамицин

В других вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит антитело, предлагаемое в изобретении, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Представители семейства калихеамициновых антибиотиков в субпикомолярных концентрациях обладают способностью вызывать двухцепочечные разрывы ДНК. Получение конъюгатов калихеамицина описано в US №№5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (все на имя фирмы American Cyanamid Company). Структурные аналоги калихеамицина, которые можно применять, включают (но не ограничиваясь ими) γ₁¹, α₂¹, α₃¹, N-ацетил-γ₁¹, PSAG и θ₁¹ (Hinman и др., Cancer Research 53, 1993, сс. 3336-3342; Lode и др., Cancer Research 58, 1998, сс. 2925-2928 и перечисленные выше патенты США на имя фирмы American Cyanamid). Другим противоопухолевым лекарственным средством, которое можно включать в конъюгаты с антителом, является QFA, представляющий собой антифолат. Как калихеамицин, так и QFA, имеют внутриклеточные сайты действия и плохо проникают через плазматическую мембрану. Таким образом, проникновение этих агентов в клетку в результате опосредуемой антителом интернализации значительно повышает их цитотоксическое действие.

Другие цитотоксические агенты

Другие противоопухолевые агенты, которые можно конъюгировать с антителами, предлагаемыми в изобретении, представляют собой BCNU, стрептозоцин, винкристин и 5-фторурацил, семейство агентов, известных под общим названием LL-Е33288-комплекс, которые описаны в US №№5053394, 5770710, а также эсперамицины (US №5877296).

Обладающие ферментативной активностью токсины и их фрагменты, которые можно применять, включают цепь А дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеццина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРП и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены (см., например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 г. ).

Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгату, включающему антитело и соединение, обладающее нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазу или ДНК-эндонуклеазу, такую как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).

Для избирательного разрушения опухоли антитело может содержать атом с высоким уровнем радиоактивности. Для создания радиоконъюгированных антител можно применять широкое разнообразие радиоактивных изотопов. Их Аt²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Когда конъюгат применяют для диагностики, он может содержать радиоактивный атом, применямый для сцинтиграфических исследований, например, Тс^99m или I¹²³, или спиновую метку для визуализации с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (который называют также ЯМР-томография), такую как тот же йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Радиоактивные или другие метки можно включать в конъюгат с использованием известных методов. Например, пептид можно получать путем биосинтеза или синтезировать посредством химического аминокислотного синтеза с использованием приемлемых аминокислотных предшественников, которые, например, содержат фтор-19 вместо водорода. Такие метки, как Тс^99m или I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ и In¹¹¹, можно присоединять к пептиду через остаток цистеина. Иттрий-90 можно присоединять через остаток лизина. Для включения йода-123 можно применять IODOGEN-метод (Fraker и др., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 1978, cc. 49-57). В руководстве «Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy» (Chatal, изд-во CRC Press, 1989) подробно описаны другие методы.

Конъюгаты, содержащие антитело и цитотоксический агент, можно создавать с помощью различных бифункциональных связывающих белки веществ, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бисазидопроизводные (такие как бис(лара-азидобензоил)гександиамин), производные бисдиазония (такие как бис(иора-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоциант), и активные бис-соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно получать согласно методу, описанному у Vitetta и др., Science 238, 1987, с. 1098). Меченная с помощью С-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента, который можно применять для конъюгации радиоактивного нуклеотида с антителом (см. WO 94/11026). Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», который облегчает высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно применять неустойчивый в кислой среде линкер, чувствительный к действию пептидаз линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или содержащий дисульфидную связь линкер (Chari и др., Cancer Research, 52, 1992, сс. 127-131; US №5208020).

К соединениям, предлагаемым в изобретении, относятся, прежде всего (но не ограничиваясь только ими), ADC, полученные с помощью следующих кросс-линкеров: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил(4-винилсульфон)бензоат), которые имеются в продаже (например, поставляются фирмой Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США) (см. Справочник по применению и каталог (Applications Handbook and Catalog) 2003-2004 гг., cc. 467-498).

Получение конъюгатов антител и лекарственных средств

В конъюгатах антитело-лекарственное средство (ADC), предлагаемых в изобретении, антитело (Аb) конъюгировано с помощью линкера (L) с одним или несколькими фрагментами, представляющими собой лекарственное средство (D), так что на одно антитело приходится, например от примерно 1 до примерно 20 фрагментов, представляющих собой лекарственное средство. ADC, имеющие формулу I, можно получать несколькими путями с использованием реакций органической химии, условий и реагентов, известных специалистам в данной области, включая: (1) взаимодействие нуклеофильной группы антитела с двухвалентным линкером с образованием Ab-L с помощью ковалентной связи и последующее взаимодействие с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство D; и (2) взаимодействие нуклеофильной группы фрагмента, представляющего собой лекарственное средство, с двухвалентным линкером с образованием D-L с помощью ковалентной связи и последующее взаимодействие с нуклеофильной группой антитела. В настоящем описании представлены другие методы получения ADC.

Линкер может содержать один или несколько линкерных компонентов. Примерами линкерных компонентов являются 6-малеимидокапроил («МС»), малеимидопропаноил («МР»), валин-цитруллин («val-cit»), аланин-фенилаланин («ala-phe»), пара-аминобензилоксикарбонил («РАВ»), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат («SPP»), гЧ-сукцинимидил-4-(М-

малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат («SMCC») и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоат («SIAB»). В данной области известны другие линкерные компоненты, и некоторые из них представлены в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер может содержать аминокислотные остатки. Примерами аминокислотных линкерных компонентов являются дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Примерами дипептидов являются: валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe). Примерами трипептидов являются: глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотные остатки, которые представляют собой аминокислотный линкерный компонент, включают встречающиеся в естественных условиях аминокислоты, а также минорные аминокислоты и не встречающиеся в естественных условиях аминокислотные аналоги, такие как цитруллин. Аминокислотные линкерные компоненты можно конструировать и оптимизировать с точки зрения их избирательного расщепления конкретными ферментами, например, ассоциированной с опухолью протеазой, катепсином В, С и D, или плазминовой протеазой.

Ниже приведены примеры структуры линкерного компонента (в которых волнистыми линиями обозначены сайты ковалентного связывания с другими компонентами ADC):

Дополнительные примеры структуры линкерного компонента и их сокращенные названия представлены ниже (на которых представлены антитело (Аb) и линкер и р обозначает число от 1 до примерно 8):

Нуклеофильные группы антител включают (но не ограничиваясь только ими): (I) N-концевые аминогруппы, (II) аминогруппы боковых цепей, например, лизина, (III) тиольные группы боковых цепей, например, цистеина, и (IV) гидроксильные группы или аминогруппы Сахаров, когда антитело гликозилировано. Аминогруппа, тиольная и гидроксильная группы являются нуклеофильными и обладают способностью взаимодействовать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных фрагментах и линкерах, включая: (I) активные сложные эфиры, такие как сложные NHS-эфиры, сложные HOBt-эфиры, галоформиаты и галоидангидриды; (II) галоидные алкилы и бензилы, такие как галоацетамиды; (III) альдегидные, кетоновые, карбоксильные и малеимидные группы. Некоторые антитела имеют восстанавливаемые межцепочечные дисульфиды, т.е. цистеиновые мостики. Антитела можно сделать реакционноспособными в отношении конъюгации с линкерами путем обработки восстановителем, таким как ДТТ (дитиотреитол). Таким образом, теоретически каждый цистеиновый мостик может образовывать два реакционноспособных тиольных нуклеофила. В антитело можно интродуцировать дополнительные нуклеофильные группы путем взаимодействия лизинов с 2-иминотиоланом (реагент Траута), приводящего к превращению амина в тиольную группу. Реакционноспособные тиольные группы можно интродуцировать в антитело (или его фрагмент) путем встраивания одного, двух, трех, четырех или большего количества остатков цистеина (например, с получением мутантных антител, содержащих один или несколько ненативных цистеиновых аминокислотных остатков).

Конъюгаты антитело-лекарственное средство, предлагаемые в изобретении, предназначенные для объединения с антителом к CD20, указанным в настоящем описании, можно получать также путем модификации антитела с помощью интродукции электофильных фрагментов, которые могут взаимодействовать с нуклеофильными заместителями на линкере или лекарственном средстве. Сахара гликозилированных антител можно окислять, например, с помощью перйодатных окислителей, с образованием альдегидных или кетоновых групп, которые могут взаимодействовать с аминогруппой линкеров или фрагментов лекарственного средства. Образовавшиеся группы, представляющие собой иминовые основания Шиффа, могут образовывать стабильную связь, или их можно восстанавливать, например, борогидридными реагентами, с образованием стабильных аминных связей. В одном из вариантов осуществления изобретения взаимодействие углеводного фрагмента гликозилированного антитела либо с галактозооксидазой, либо с мета-перйодатом натрия может приводить к образованию карбонильных (альдегидных и кетоновых) групп в белке, которые могут взаимодействовать с соответствующими группами на лекарственном средстве (Hermanson, фирма Bioconjugate Techniques). В другом варианте осуществления изобретения белки, содержащие N-концевые сериновые или треониновые остатки, можно подвергать взаимодействию с мета-перйодатом натрия с образованием альдегида на месте первой аминокислоты (Geoghegan и Stroh, Bioconjugate Chem. 3, 1992, сс. 138-146; US №5362852). Такой альдегид может вступать во взаимодействие с фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, или линкерным нуклеофилом.

Кроме того, нуклеофильные группы на фрагменте, представляющем собой лекарственное средство, включают (но не ограничиваясь только ими): аминогруппу, тиольную, гидроксильную, гидразидную, оксимовую, гидразиновую, тиосемикарбазоновую, гидразинкарбоксилатную и арилгидразидную группы, которые обладают способностью взаимодействовать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных фрагментах и линкерах, включая: (I) активные сложные эфиры, такие как сложные NHS-эфиры, сложные HOBt-эфиры, галоформиаты и галоидангидриды; (II) галоидные алкилы и бензилы, такие как галоацетамиды; (III) альдегидные, кетоновые, карбоксильные и малеимидные группы.

Согласно следующему объекту изобретения антитело имеет один или несколько остатков лизина, которые можно химически модифицировать для интродукции одной или нескольких сульфгидрильных групп. Компонент, представляющий собой антитело, связывается с компонентом, представляющим собой линкер, через атом серы сульфгидрильной группы. Реагенты, которые можно применять для модификации лизина, включают (но не ограничиваясь только ими) N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATА) и гидрохлорид 2-иминотиолана (реагент Траута).

В другом варианте осуществления изобретения антитело может иметь одну или несколько углеводных групп, которые можно химически модифицировать так, чтобы оно имело одну или несколько сульфгидрильных групп. Компонент, представляющий собой антитело, связывается с компонентом, представляющим собой линкер, таким как удлиняющий компонент, через атом серы сульфгидрильной группы, указанной в настоящем описании.

В следующем варианте осуществления изобретения антитело может иметь одну или несколько углеводных групп, которые могут окисляться с образованием альдегидной (-СНО) группы (см., например, Laguzza и др., J. Med. Chem. 32(3), 1989, сс. 548-555). Соответствующий альдегид может образовывать связь с реакционноспособным сайтом на удлиняющем компоненте. Реакционноспособные сайты на удлиняющем компоненте могут взаимодействовать с карбонильной группой на антителе, включающей (но не ограничиваясь только ими) гидразин и гидроксиламин. Другие протоколы модификации белков с целью присоединения компонента, представляющего собой лекарственное средство, или ассоциации с ним описаны у Coligan и др., Current Protocols in Protein Science, т. 2, изд-во John Wiley & Sons, 2002, публикация включена в настоящее изобретение в качестве ссылки.

Методы конъюгации компонентов, фрагментов, представляющих собой линкер-лекарственное средство, с белками, направленными против клеток, такими как антитела, иммуноглобулины или их фрагменты, описаны, например, в US №5208020; US №6441163; WO 2005/037992; WO 2005/081711 и WO 2006/034488, которые все специально полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.

В альтернативном варианте слитый белок, содержащий антитело и цитотоксический агент, можно создавать, например, методами рекомбинации или пептидным синтезом. Участок ДНК может содержать соответствующие области, кодирующие две части конъюгата, которые либо являются смежными друг с другом, либо разделены областью, кодирующей линкерный пептид, которая не вызывает нарушение требуемых свойств конъюгата.

Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело можно конъюгировать с «рецептором» (таким как стрептавидин) для того, чтобы использовать при осуществлении предварительного направленного переноса в опухоль, когда конъюгат антитело-рецептор вводят в организм пациента, после чего удаляют несвязанный конъюгат из кровотока с использованием агента, способствующего клиренсу, и затем вводят «лиганд» (например, авидин), который конъюгируют с цитотоксическим агентом (например, радионуклеотидом).

В одном из вариантов иммуноконъюгата, цитотоксический агент, D, представляет собой ауристатин формулы De или Dp

и в котором R² и R⁶ каждый обозначает метил, R³ и R⁴ каждый обозначает изобутил, R⁷ обозначает втор-бутил, R⁸ каждый независимо друг от друга выбран из СН₃, О-СН₃, ОН и Н; R⁹ обозначает Н; R¹⁰ обозначает; Z обозначает -О- или -NH-; R¹¹ обозначает Н, С₁-С₈алкил или -(СН₂)₂-О-(СН₂)₂-О-(СН₂)₂-О-СН₃; и R¹⁸ обозначает -C(R⁸)₂-C(R⁸)₂-apил; и

(d) р имеет значение, находящееся в диапазоне примерно от 1 до 8.

Следующими вариантами осуществления изобретения являются также) любые из описанных выше иммуноконъюгатов. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат обладает in vitro или in vivo цитолитической активностью. В одном из вариантов осуществления изобретения линкер присоединяют к антителу через тиольную группу антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения линкер может расщепляться протеазой. В одном из вариантов осуществления изобретения линкер содержит дипептид val-cit. В одном из вариантов осуществления изобретения линкер содержит пара-аминобензильное звено. В одном из вариантов осуществления изобретения пара-аминобензильное звено расположено между лекарственным средством и сайтом расщепления протеазой в линкере. В одном из вариантов осуществления изобретения wopa-аминобензильное звено представляет собой пара-аминобензилоксикарбонил (РАВ). В одном из вариантов осуществления изобретения линкер содержит 6-малеимидокапроил. В одном из вариантов осуществления изобретения 6-малеимидокапроил расположен между антителом и сайтом расщепления протеазой в линкере. Указанные выше варианты осуществления изобретения могут присутствовать индивидуально или в любой комбинации друг с другом.

В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство выбирают из ММАЕ и MMAF. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат имеет формулу

в которой Ab обозначает любое из указанных выше антител к CD22, S обозначает атом серы и р имеет значение в диапазоне от 2 до 5. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат имеет формулу

в которой Аb обозначает любое из указанных выше антител к CD22, S обозначает атом серы и р имеет значение, составляющее от примерно 1 до примерно 6, от примерно 2 до примерно 5, от примерно 2 до примерно 6, от примерно 2 до примерно 4, от примерно 2 до примерно 3, от примерно 3 до примерно 4, от примерно 3 до примерно 5, от примерно 3 до примерно 6 или от примерно 4 до примерно 6.

Анализ активности in vitro, основанный на определении IC₅₀ конъюгата антитело к CD22-лекарственное средство, предлагаемого в изобретении

«IC₅₀» означает концентрацию конкретного соединения, требуемую для ингибирования на 50% конкретной измеряемой активности. IC₅₀ агентов, которые ингибируют взаимодействие с CD22, можно измерять, среди прочего, согласно описанному ниже методу.

Понятие «цитотоксическая активность» относится к цитолитическому, цитостатическому или ростингибирующему действию конъюгата антитело-лекарственное средство или внутриклеточного метаболита конъюгата антитело-лекарственное средство. Цитотоксическую активность можно выражать в виде величины IC₅₀, которая представляет собой концентрацию (молярную или массовую) на единицу объема, при которой выживает половина клеток.

Поверхностная экспрессия человеческого CD22 на нескольких клеточных линиях лимфом

Девятнадцать клеточных линий лимфом, экспрессирующих различные уровни CD22 на их поверхности, культивировали и собирали на логарифмической фазе роста. Клетки ресуспендировали в отмывочном FACS-буфере (ЗФР; 0,5% бычьего сывороточного альбумина; 0,1% азида натрия), содержащего по 100 мкг/мл нормального мышиного IgG и нормального человеческого IgG и сохраняли на льду. Примерно 1×10⁶ клеток/100 мкл окрашивали антителом к huCD22, конъюгированным с АРС (mIgG1, клон RFB4, фирма Southern Biotech, №9361-11) или мышиным антителом IgG1-изотипа, конъюгированным с АРС (фирма BD Pharmingen, №555751), в течение 30 мин на льду. Мертвые клетки окрашивали 7-AAD (фирма BD Pharmingen, №559925). Данные получали с использованием проточного питометра BD FacsCalibur™ и анализировали с помощью программы Flow Jo™. Определяли IC₅₀ для hul0F4v3-SMCC-DM1 или каждого свободного лекарственного средства (DM1, MMAF или ММАЕ) путем культивирования, как указано выше, клеток лимфомы, сбора культивированных клеток на логарифмической фазе роста и посева 5000 клеток в 90 мкл культуральной среды на лунку 96-луночного планшета. ADC и свободное лекарственное средство серийно разводили в диапазоне, соответствующем диапазону обнаружения (начиная с 300 мкг/мл для ADC или 90нМ для свободного лекарственного средства и осуществляя разведение до достижения практически нулевого значения в отношении анализируемой мишени). Аликвоты по 10 мкл разведенного ADC или свободного лекарственного средства добавляли с дублированием в лунки, содержащие клетки, и инкубировали в течение 3 дней при 37°С. В каждую лунку добавляли по 100 мкл реагента CellTiter Glo™ инкубировали в течение 30 мин. Определяли хемилюминисценцию и данные анализировали с помощью программы Prism™.

Олигосахаридный компонент может оказывать существенное воздействие на свойства, связанные с эффективностью терапевтического гликопротеина, включая физическую стабильность, устойчивость к действию протеаз, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетические свойства и специфическая биологическая активность. Указанные свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия, но также от специфических структур олигосахаридов. Можно сделать некоторые обобщения зависимости между олигосахаридной структурой и функцией гликопротеина. Например, некоторые олигосахаридные структуры опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока посредством взаимодействий со специфическими углеводсвязывающими белками, в то время как другие могут связываться антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, сс. 975-981).

Клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для производства терапевтических гликопротеинов благодаря их способности гликозилировать белки с получением наиболее приемлемой для применения на человеке формы (Cumming D.A. и др., Glycobiology 1, 1991, сс. 115-130; Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, сс. 975-981). Бактерии очень редко гликозилируют белки, и подобно другим типам обычных хозяев, таких как клетки дрожжей, нитчатых грибов, насекомых и растений, обеспечивают схемы гликозилирования, ассоциированные с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и в некоторых случаях пониженной биологической активностью. Среди клеток млекопитающих клетки яичника китайского хомячка (СНО) нашли наиболее широкое применение в течение двух последних десятилетий. Помимо обеспечения приемлемых схем гликозилирования эти клетки позволяют устойчиво получать генетически стабильные, высокопродуктивные клональные клеточные линии. Их можно культивировать, достигая высокой плотности, в простых биореакторах с использованием бессывороточных сред, и на их основе можно разрабатывать безопасные и воспроизводимые биопроцессы. Другими обычно применяемыми клетками животных являются клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки мышиной миеломы NS0 и SP2/0. В последние годы изучали также возможность их производства в организме трансгенных животных (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, сс. 975-981).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях в константных областях тяжелой цепи, при этом каждый изотип характеризуется различной организацией N-связанных углеводных структур, которые оказывают различное действие на сборку, секрецию и функциональную активность белка (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotech. 15, 1997, сс. 26-32).Структура присоединенного N-связанного углевода значительно варьируется в зависимости от степени процессирования и может включать имеющие высокое содержание маннозы, множество разветвлений, а также биантенные сложные олигосахариды (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotech. 15, 1997, сс. 26-32). Как правило, имеет место гетерогенный процессинг коровых олигосахаридных структур, присоединенных в конкретном сайте гликозилирования, в результате чего даже моноклональные антитела существует в виде нескольких гликоформ. Было установлено также, что основные различия в гликозилировании антител имеют место между клеточными линиями, и даже при выращивании данной клеточной линии в других условиях культивирования имеют место небольшие различия (Lifely M.R. и др., Glycobiology 5(8), 1995, сс. 813-22).

Одним из путей достижения значительного повышения эффективности при сохранении простого процесса производства и возможности избежать значительных нежелательных побочных действий является усиление природных опосредуемых клеткой эффекторных функций моноклональных антител путем конструирования олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у Umana Р. и др., Nature Biotechnol., 17, 1999, сс. 176-180 и в US №6602684. Антитела IgG1-типа, представляющие собой антитела, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования в положении Asn297 в каждом СН2-домене. Два сложных биантенных олигосахарида, которые присоединены к Asn297, размещаются между СН2-доменами, образуя обширные контакты с каркасом полипептида, и их наличие является существенным для способности антитела опосредовать эффекторные функции, такие как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 1995, сс. 813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 1998, сс. 59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 1997, сс. 26-32).

Ранее было установлено, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III («GnTIII»), гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает ADCC-активность in vitro антинейробластомного химерного моноклонального антитела (chCE7), продуцируемого сконструированными клетками СНО (см. Umafia Р. и др., Nature Biotechnol., 17, 1999, сс. 176-180; и WO 1999/54342, полное содержание указанных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки). Антитело chCE7 относится к большому классу неконыогированных моноклональных антител, которые обладают высокой аффинностью и специфичностью в отношении опухолей, но имеют слишком низкую эффективность для клинического применения при их получении в стандартных промышленных клеточных линиях, в которых отсутствует фермент GnTIII (Umana Р. и др., Nature Biotechnol., 17, 1999, сс. 176-180). Это исследование было первым, в котором установлено, что существенных повышений ADCC-активности можно достигать путем конструирования продуцирующих антитело клеток, которые экспрессируют GnTIII, что приводит также к повышению относительного содержания ассоциированных с константной областью (Fc) бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные нефукозилированные олигосахариды, по сравнению с уровнями, характерными для встречающихся в естественных условиях антител.

Понятие «рак» в контексте настоящего описания относится к таким видам рака, как лимфомы, лимфолейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), бронхоальвеолярно-клеточный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркома мягкой ткани, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечных лоханок, мезотелиома, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоль позвоночника, глиома ствола головного мозга, мультиформная глиобластома, астроцитомы, шванномы, эпендимомы, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденома гипофиза, в том числе устойчивые варианты любого из указанных выше видов рака или комбинации одного или нескольких из указанных выше видов рака. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения понятие рак относится к раку, при котором происходит экспрессия CD20.

Подразумевается, что понятие «экспрессия антигена CD20» относится к значимому уровню экспрессии антигена CD20 в клетке, предпочтительно на клеточной поверхности Т- или В-клетки, более предпочтительно В-клетки опухоли или рака соответственно, предпочтительно опухоли, которая не относится к солидным опухолям. Пациентов, которые имеют «рак, при котором происходит экспрессия CD20», можно выявлять с помощью стандартных анализов, известных в данной области. Например, экспрессию антигена CD20 можно оценивать иммуногистохимическим (ИГХ) методом, FACS или путем выявления соответствующей мРНК с помощью ПЦР.

Понятие «рак, при котором происходит экспрессия СD20» в контексте настоящего описания относится ко всем видам раковых клеток, для которых характерна экспрессия антигена CD20. В контексте настоящего описания рак, при котором происходит экспрессия CD20, предпочтительно относится к лимфомам (предпочтительно В-клеточным неходжкинским лимфомам (НХЛ)) и лимфолейкозам. Указанные лимфомы и лимфолейкозы включают, например, а) фолликулярные лимфомы, б) мелкоклеточые с нерасщепленными ядрами лимфомы/лимфому Беркитта (включая эндемическую лимфому Беркитта, спорадическую лимфому Беркитта и не-беркиттовскую лимфому), в) лимфомы маргинальной зоны (включая экстранодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны (лимфомы лимфоидной ткани слизистых оболочек, MALT), нодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны и лимфому маргинальной зоны селезенки), г) лимфому из клеток зоны мантии (MCL), д) крупноклеточную лимфому (включая В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (DLCL), диффузную смешанно-клеточную лимфому, иммунобластную лимфому, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, ангиоцентрическую лимфому-легочную В-клеточную лимфому), е) волосковоклеточный лейкоз, ж) лимфоцитарную лимфому, Вальденстрема макроглобулинемию, з) острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (СLL)/мелкоклеточный лимфолейкоз (SLL), В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, и) неоплазмы из плазматических клеток, миеломы из плазматических клеток, множественную миелому, плазмацитому, к) болезнь Ходжкина.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения рак, при котором происходит экспрессия CD20, представляет собой В-клеточные неходжкинские лимфомы (НХЛ)). Согласно другому варианту осуществления изобретения рак, при котором происходит экспрессия CD20, представляет собой лимфому из клеток зоны мантии (MCL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (DLCL), лимфому Беркитта, волосковоклеточный лейкоз, фолликулярную лимфому, множественную миелому, лимфому маргинальной зоны, пост-трансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD), ассоциированную с ВИЧ лимфому, Вальденстрема макроглобулинемию или первичную лимфому ЦНС.

Понятие «метод лечения» или его эквивалент применительно, например, к раку, относится к процедуре или протоколу лечения, которую/который разрабатывают с целью снижения или устранения некоторого количества раковых клеток в организме пациента или для облегчения симптомов рака. «Метод лечения» рака или другого пролиферативного нарушения не обязательно подразумевает, что раковые клетки или другие нарушения должны быть фактически элиминированы, что количество клеток или уровень нарушения фактически должны быть снижены, или что другие симптомы рака или другого нарушения фактически должны быть облегчены. Часто метод лечения рака можно осуществлять даже с небольшой вероятностью успеха, но он с учетом истории болезни пациента и оцененной перспективы выживаемости, тем не менее, как предполагается, может оказывать общее благоприятное воздействие.

Понятия «совместное применение» «введение в сочетании (комбинации)» относятся к введению указанного афукозилированного антитела к CD20 и указанного конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство в виде двух различных препаративных форм (или в виде одной индивидуальной препаративной формы). Совместное применение может быть одновременным или последовательным в любом порядке, при этом предпочтительно существует период времени, в течение которого оба действующих вещества (или все действующие вещества) одновременно проявляют свое биологическое действие. Указанное афукозилированное антитело к CD20 и указанный конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство совместно вводят либо одновременно, либо последовательно (например, внутривенно (i.v.) с помощью непрерывной инфузии (одной для антитела к CD20 и, как правило, еще одной для указанного конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство; или антитело к CD20 вводят внутривенно (i.v.) с помощью непрерывной инфузии и указанный конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство вводят орально). Когда оба терапевтических агента совместно вводят последовательно, то вводимую дозу применяют либо в один и тот же день в виде двух различных введений, либо один из агентов вводят в день 1, а второй совместно применяемый агент вводят в день 2-7, предпочтительно день 2-4. Таким образом, понятие «последовательно» означает в пределах 7 дней после введения дозы первого компонента (антитело к CD20 или конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство), предпочтительно в пределах 4 дней после введения дозы первого компонента; а понятие «одновременно» означает в одно и то же время. Понятие «совместное применение» касательно поддерживающих доз указанного афукозилированного антитела к CD20 и конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство означает, что поддерживающие дозы можно совместно вводить одновременно, если цикл лечения обоими лекарственными средствами пригоден для этого, например, каждую неделю. Или конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство, вводят, например, каждый первый-третий день, а указанное афукозилированное антитело вводят каждую неделю. Или поддерживающие дозы применяют совместно последовательно либо в один день, либо в пределах нескольких дней.

Очевидно, что антитела вводят пациенту в «терапевтически эффективном количестве» (или просто в «эффективном количестве»), которое представляет собой количество соответствующего соединения или комбинации, вызывающее биологический или медицинский ответ ткани, системы, животного или человека, ожидаемый исследователем, ветеринаром, лечащим врачом или другим клиницистом.

Количество вводимых совместно афукозилированного антитела к CD20 и указанного конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство и время совместного введения должны зависеть от типа (вид, пол, возраст, вес и т.д.) и состояния пациента, подлежащего лечению, и серьезности подлежащего лечению заболевания или состояния. Предпочтительно указанное афукозилированное антитело к CD20 и конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство следует вводить пациенту один раз или в виде серий обработок, например, в один и тот же день или день спустя.

Если введение является внутривенным, то продолжительность начальной инфузии указанного афукозилированного антитела к CD20 и конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство может быть длиннее, чем продолжительности последующих инфузий, например, может составлять примерно 90 мин для начальной инфузии и примерно 30 мин для последующих инфузий (если начальная инфузия хорошо переносится).

В зависимости от типа и серьезности заболевания начальная возможная доза при совместном применении обоих лекарственных средств пациенту может составлять примерно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) для указанного афукозилированного антитела к CD20; и от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) для указанного конъюгата антитело к CD22-лекарственное средство. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения предпочтительная доза указанного афукозилированного антитела к CD20 (предпочтительно афукозилированного гуманизированного антитела В-Ly1) должна составлять от примерно 0,05 до примерно 30 мг/кг. Так, для совместного применения пациенту можно использовать одну или несколько из следующих доз: примерно 0,5, 2,0, 4,0, 10 или 30 мг/кг (или любую их комбинацию). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения предпочтительная доза указанного конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство должна составлять от примерно 0,05 примерно 30 мг/кг. Так, пациенту можно вводить совместно одну или несколько доз, составляющих примерно 0,5, 2,0, 4,0, 10 или 30 мг/кг (или любую их комбинацию).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения для лечения указанных видов рака указанный конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство вводят путем внутривенной инфузии, указанной выше. Вводимая путем инфузии доза составляет от примерно 1 до примерно 10000 мкг/м на дозу, как правило, из расчета одна доза в неделю, при этом в общей сложности вводят одну, две, три или четыре дозы. Альтернативно этому, дозы составляют от примерно 1 до примерно 1000 мкг/м², примерно от 1 до примерно 800 мкг/м², примерно от 1 до примерно 600 мкг/м², примерно от 1 до примерно 400 мкг/м², примерно от 10 до примерно 500 мкг/м², примерно от 10 до примерно 300 мкг/м², примерно от 10 до примерно 200 мкг/м² и примерно от 1 до примерно 200 мкг/м². Дозу можно вводить 1 раз в день, 1 раз в неделю, несколько раз в неделю, но реже, чем 1 раз в день, несколько раз в месяц, но реже, чем 1 раз в день, несколько раз в месяц, но реже, чем 1 раз в неделю, один раз в месяц или прерывисто для ослабления или облегчения симптомов заболевания. Введение может продолжаться в течение любого из указанных интервалов вплоть до достижения ремиссии опухоли или симптомов лимфомы, лейкоза, подлежащих лечению. Лечение можно продолжать после достижения ремиссии или уменьшения симптомов, если указанная ремиссия или указанное облегчение пролонгируются с помощью такого продолжающегося лечения.

В зависимости от типа (вид, пол, возраст, вес и т.д.) и состояния пациента и от типа афукозилированного антитела к CD20 доза и схема введения указанного афукозилированного антитела к CD20 может отличаться от указанных для конъюгата антитела к СD22-лекарственное средство. Например, указанное афукозилированное антитело к CD20 можно вводить, например, каждые 1-3 недели, и указанный конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство можно вводить ежедневно или каждые 2-10 дней. Можно применять начальную более высокую ударную дозу, после чего применять одну или несколько более низких доз.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения предпочтительная доза указанного афукозилированного антитела к CD20 (предпочтительно афукозилированного гуманизированного антитела B-Ly1), применяемого в сочетании с указанным конъюгатом антитело к CD22-лекарственное средство, предлагаемым в изобретении, должна составлять от 800 до 1600 мг (в одном из вариантов осуществления изобретения от 800 до 1200 мг) в день 1, 8, 15 при осуществлении 3-6-недельных циклов дозирования, затем доза должна составлять от 400 до 1200 мг (в одном из вариантов осуществления изобретения от 800 до 1200 мг) в день 1 при осуществлении вплоть до девяти 3-4-недельных циклов дозирования. Наиболее предпочтительно доза представляет собой постоянную дозу 1000 мг, которую применяют для трехнедельной схемы дозирования, с возможностью применения дополнительного цикла с использованием постоянной дозы 1000 мг на второй неделе.

В следующем варианте осуществления изобретения доза указанного конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство, применяемого в комбинации с афукозилированным антителом к CD20, предлагаемым в изобретении, составляет от примерно 1,5 до примерно 3 мг/кг при трехнедельной схеме дозирования, предпочтительно от примерно 1,7 до примерно 2,5 мг/кг, наиболее предпочтительно примерно 1,8 или примерно 2,4 мг/кг. Указанные наиболее предпочтительные дозы в настоящее время проходят испытания в клинических опытах, в которых конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство применяют в режиме монотерапии.

В следующем варианте осуществления изобретения доза афукозилированного антитела к CD20, применяемого в комбинации с указанным конъюгатом антитело к СЭ22-лекарственное средство, предлагаемым в изобретении, представляет собой постоянную дозу, составляющую примерно 1000 мг, в день 1 (цикл 1, день 1 (C1D1)), другую постоянную дозу, составляющую примерно 1000 мг, в день 8 (C1D8) и следующую постоянную дозу, составляющую примерно 1000 мг, в день 15 (C1D15), за которой следует еще шесть постоянных доз по примерно 1000 мг указанного афукозилированного антитела к CD20 (цикл 2) каждые три недели: день 22 (C2D1), день 43 (C2D2), день 64 (C2D3), день 85 (C2D4), день 106 (C2D5) и день 127 (C2D6). В указанном варианте осуществления изобретения доза конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство, применяемого в комбинации с афукозилированным антителом к CD20, предлагаемым в изобретении, составляет примерно 2,4 мг/кг каждые три недели или в альтернативном варианте 1,8 мг/кг каждые три недели. В указанном варианте осуществления изобретения дозирование указанного конъюгата антитело к CD22-лекарственное средство, применяемого в комбинации с афукозилированным антителом к CD20, предлагаемым в изобретении, осуществляют в день 1 (C1D1), день 22 (C2D1), день 43 (C2D2), день 64 (C2D3), день 85 (C2D4), день 106 (C2D5) и день 127 (C2D6).

Предпочтительно в описанных выше режимах дозирования афукозилированное антитело к CD20 представляет собой обинутузумаб или GA101. Предпочтительно также в описанных выше режимах дозирования указанный конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство представляет собой анти-CD22-MC-vc-PAB-MMAE.

В изобретении предложен также способ облегчения аутоиммунного заболевания, заключающийся в том, что вводят пациенту, страдающему аутоиммунным заболеванием, в терапевтически эффективном количестве указанное афукозилированное антитело к CD20, представленное в настоящем описании, и указанный конъюгат гуманизированное антитело 10F4-лекарственное средство по одному из предыдущих вариантах осуществления изобретения. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитело вводят внутривенно или подкожно. Конъюгат антитело-лекарственное средство вводят внутривенно в дозе, составляющей от примерно 1 мкг/м² до примерно 100 мг/м² на дозу, и в конкретном варианте осуществления изобретения доза составляет от 1 до примерно 500 мкг/м². Дозу можно вводить один раз в день, один раз в неделю, несколько раз в неделю, но реже чем 1 раз в день, несколько раз в месяц, но реже, чем один раз в день, несколько раз в месяц, но реже, чем один раз в неделю, один раз в месяц или прерывисто, для ослабления или облегчения заболевания. Введение может продолжаться в течение любого из указанных интервалов вплоть до достижения ремиссии опухоли или ослабления симптомов аутоиммунного заболевания, подлежащего лечению. Лечение можно продолжать после достижения ремиссии или ослабления симптомов, если указанная ремиссия или указанное ослабление пролонгируются с помощью такого продолжающегося лечения.

В изобретении предложен также способ лечения В-клеточного нарушения, заключающийся в том, что вводят пациенту, страдающему В-клеточным нарушением, таким как В-клеточное пролиферативное нарушение (включая (но не ограничиваясь только ими) лимфому и лейкоз), или аутоиммунным заболеванием, в терапевтически эффективном количестве указанное афукозилированное антитело к CD20, представленное в настоящем описании, и гуманизированное антитело 10F4 по одному из предыдущих вариантах осуществления изобретения, где антитело не конъюгировано с цитотоксической молекулой или выявляемой молекулой. Антитело, как правило, следует вводить в дозах, составляющих от примерно 1 мкг/м² до примерно 1000 мг/м².

Рекомендованная доза может варьироваться в зависимости от того, осуществляют ли дополнительное совместное введение химиотерапевтического средства, и в зависимости от типа химиотерапевтического средства.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения лекарственное средство можно применять для предупреждения или снижения метастазов или дальнейшей их диссеминации у пациента, страдающего раком, предпочтительно раком, при котором происходит экспрессия CD20. Лекарственное средство можно применять для удлинения продолжительности жизни указанного пациента, удлинения продолжительности жизни до прогрессирования болезни у указанного пациента, удлинения продолжительности ответа, что приводит к статистически значимому и клинически заметному улучшению состояния подвергнутого лечению пациента при оценке по продолжительности жизни, продолжительности жизни до прогрессирования болезни, уровню ответа или продолжительности ответа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения лекарственное средство можно применять для повышения уровня ответа у группы пациентов.

В контексте настоящего изобретения для лечения рака можно применять дополнительные другие цитотоксические, химиотерапевтические или противораковые средства или соединения, повышающие эффективность указанных средств (например, цитокины), в комбинации с афукозилированным антителом к CD20 и указанным конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство. Указанные молекулы должны присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для поставленных целей. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения лечение с использованием указанного афукозилированного антитела к CD20 в комбинации с указанным конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство осуществляют без применения указанных дополнительных цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых средств или соединений, повышающих эффективность указанных средств.

Такие средства представляют собой, например, алкилирующие агенты или агенты, обладающие алкилирующей активностью, такие как циклофосфамид (СТХ; например, Cytoxan®), хлорамбуцил (CHL; например, leukeran®), цисплатин (CisP; например, platinol®), бусульфан (например, myleran®), мелфалан, кармустин (BCNU), стрептозотоцин, триэтиленмеламин (ТЕМ), митомицин С, и т.п.; антиметаболиты, такие как метотрексат (МТХ), этопозид (VP16; например, vepesid®), 6-меркаптопурин (6МР), 6-тиогуанин (6TG), цитарабин (Ara-C), 5-фторурацил (5-FU), капецитабин (например, Xeloda®), дакарбазин (DTIC) и т.п.; антибиотики, такие как актиномицин D, доксорубицин (DXR; например, adriamycin®), даунорубицин (дауномицин), блеомицин, митрамицин и т.п.; алкалоиды, такие как алкалоиды барвинка, такие как винкристин (VCR), винбластин и т.п.; и другие противоопухолевые агенты, такие как паклитаксел (например, taxol®) и производные паклитаксела, цитостатические агенты, глюкокортикоиды, такие как дексаметазон (DEX; например, decadron®) и кортикостероиды, такие как преднизон, ингибиторы нуклеозидных ферментов, такие как гидроксимочевина, истощающие аминокислоты ферменты, такие как аспарагиназа, лейковорин и другие производные фолиевой кислоты, и аналогичные другие противоопухолевые агенты. В качестве дополнительных средств можно применять также следующие агенты: арнифостин (например, ethyol®), дактиномицин, мехлоретамин (азотный аналог горчичного газа), стрептозоцин, циклофосфамид, ломустин (CCNU), доксорубицин липо (например, doxil®), гемцитабин (например, gemzar®), даунорубицин липо (например, daunoxome®), прокарбазин, митомицин, доцетаксел (например, taxotere®), альдеслейкин, карбоплатин, оксалиплатин, кладрибин, камптотецин, СРТ 11 (иринотекан), 10-гидрокси-7-этилкамптотецин (SN38), флоксуридин, флударабин, ифосфамид, идарубицин, месну, интерферон бета, интерферон альфа, митоксантрон, топотекан, леупролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пэгаспаргазу, пентостатин, пипоброман, пликамицин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепу, урациловый аналог горчичного газа, винорелбин, хлорамбуцил. В одном из вариантов осуществления изобретения комбинированное лечение с использованием афукозилированного антитела к CD20 и указанного конъюгата антитело к СБ22-лекарственное средство осуществляют без указанных дополнительных средств.

Применение цитотоксических и противораковых средств, описанных выше, а также антипролиферативных мишеньспецифических противораковых лекарственных средств типа ингибиторов протеинкиназ, в химиотерапевтических схемах, как правило, хорошо охарактеризовано в области лечения рака, и в данном случае при их применении следует учитывать аналогичные положения касательно мониторинга толерантности и эффективности и контроля путей введения и доз с определенными корректировками. Например, фактические дозы цитотоксических агентов можно изменять в зависимости от ответа культивируемых клеток пациента, определенного с использованием методов на основе гистокультур. Как правило, дозы должны быть ниже по сравнению с количеством, в котором указанное средство применяют в отсутствии других дополнительных агентов.

Типичные дозы эффективного цитотоксического средства могут находиться в диапазонах, рекомендованных производителем, и с учетом ответов in vitro или ответов, полученных на созданных на животных моделях, их концентрацию или количество можно снижать на величину, составляющую примерно вплоть до одного порядка. Так, фактическая доза должна зависеть от рекомендаций лечащего врача, состояния пациента и эффективности терапевтического метода, определенного на основе чувствительности in vitro первичных культур злокачественных клеток или образца ткани из гистокультуры, или ответов, обнаруженных на соответствующих созданных на животных моделях.

В контексте настоящего изобретения эффективное количество ионизирующего излучения и/или радиофармацевтических средств можно применять в дополнение к комбинированному лечению рака, при котором происходит экспрессия CD20, с использованием афукозилированного антитела к CD20 и указанного конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство. Источник излучения может быть внутренним или внешним относительно пациента, подлежащего лечению. Когда источник является внешним относительно пациента, то терапию называют наружной лучевой терапией (EBRT). Когда источник излучения является внутренним относительно пациента, то лечение обозначают как брахитерапия (ВТ). Радиоактивные атомы, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно выбирать из группы, включающей (но не ограничиваясь только ими) радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод-123, йод-131 и индий-111. Можно также метить антитело соответствующими радиоактивными изотопами. В одном из вариантов осуществления изобретения комбинированную терапию с использованием афукозилированного антитела к CD20 и указанного конъюгата антитело к CD22-лекарственное средство применяют без ионизирующего излучения.

Лучевая терапия является стандартным средством лечения для контроля нерезектабельных или неоперабельных опухолей и/или метастазов опухолей. Улучшенные результаты были получены, когда лучевую терапию объединяли с химиотерапией. Лучевая терапия основана на принципе, что высокая доза излучения, поставляемая к области-мишени, может приводить к гибели репродуктивных клеток как в опухоли, так и в здоровых тканях. Схема введения излучения, как правило, определяют в понятиях абсорбированной дозы излучения (Гр), времени и фракционирования, и ее должен тщательно подбирать онколог. Количество излучения, полученное пациентом, должно зависеть от различных обстоятельств, но двумя наиболее важными являются локализация опухоли относительно других имеющих решающее значение структур или органов в организме и степень распространения опухоли. Типичный курс лечения пациента, подвергающегося лучевой терапии, представляет собой схему лечения в течение периода времени, составляющего от 1 до 6 недель, при этом общую дозу от 10 до 80 Гр вводят пациенту в виде однократной суточной фракционированной дозы, составляющей от 1,8 до 2,0 Гр, 5 дней в неделю. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения имеет место синергизм, когда опухоли у больных людей подвергают комбинированной терапии, предлагаемой в изобретении, и излучению. Другими словами, ингибирование роста опухолей с помощью агентов, входящих в комбинацию, предлагаемую в изобретении, повышается при объединении с излучением, необязательно в сочетании с дополнительными химиотерапевтическими или противораковыми средствами. Параметры вспомогательной лучевой терапии описаны, например, в WO 1999/60023.

Афукозилированные антитела к CD20 и/или конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство, предлагаемый в изобретении, вводят пациенту с помощью известных методов с использованием внутривенного введения в виде болюса или непрерывной инфузии в течение определенного периода времени, с помощью внутримышечного, внутрибрюшинного, спинномозгового, подкожного, внутрисуставного, интрасиновиального или подоболочечного пути введения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело вводят внутривенно или подкожно.

В контексте настоящего описания понятие «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой и все материалы, пригодные для фармацевтического введения, включая растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, придающие изотоничность и замедляющие абсорбцию агенты и другие материалы и соединения, которые являются пригодными для фармацевтического введения. За исключением случая, когда они являются несовместимыми с действующим веществом, в композициях, предлагаемых в изобретении, можно применять любые общепринятые среды или агенты. В композиции можно включать также дополнительные действующие вещества.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции можно получать обработкой антитела к CD20 и/или конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство, предлагаемого в настоящем изобретении, в сочетании с фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими носителями. В качестве носителей, например, для таблеток, таблеток с покрытием, драже и твердых желатиновых капсул, можно применять лактозу, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновые кислоты или их соли и т.п. Пригодными носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Однако в зависимости от природы действующего вещества, как правило, для мягких желатиновых капсул носители не требуются. Приемлемыми носителями для приготовления растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, глицерин, растительное масло и т.п. Приемлемыми носителями для суппозиториев являются, например, встречающиеся в естественных условиях или гидрогенизированные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.п.

Кроме того, в состав фармацевтических композиций могут входить консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, подслащивающие вещества, красители, корригенты, соли для изменения осмотического давления, буферы, маскирующие вещества или антиоксиданты. Они могут содержать также другие терапевтически эффективные субстанции.

Одним из вариантов осуществления изобретения является композиция, содержащая как указанное афукозилированное антитело к CD20 с содержанием фукозы, составляющим 60% или менее (предпочтительно афукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1), так и конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство, предназначенная для применения при лечении рака, прежде всего рака, при котором происходит экспрессия CD20 (предпочтительно лимфомы или лимфоцитарного лейкоза, например, В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ)).

Указанная фармацевтическая композиция может содержать также один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, которую применяют, в частности, при раке, содержащей (I) в эффективном количестве афукозилированное антитело к CD20 с содержанием фукозы, составляющим 60% или менее (предпочтительно афукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1), и (II) в эффективном количестве конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство. Указанная композиция необязательно содержит фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты.

Фармацевтические композиции, содержащие только афукозилированное антитело к CD20, которые применяют согласно настоящему изобретению, приготавливают для хранения путем смешения антитела, имеющего требуемую степень чистоты, необязательно в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями, экципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. Osol А.Е., 16-е изд., 1980), в форме лиофилизированных препаративных форм или водных растворов. Пригодные носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, нитратный и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид, бензетонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и мета-крезол); низкомолекулярные (состоящие менее чем примерно из 10 остатков) полипептиды; белки, такие сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; образующие соли противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Фармацевтические композиции конъюгатов антитело к СD22-лекарственное средство могут быть сходными с описанными выше для афукозилированного антитела к CD20.

Фармацевтические композиции низкомолекулярного конъюгата антитело к CD22-лекарственное средство включают композиции, пригодные для орального, назального, местного (включая трансбуккальное и подъязычное), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Предпочтительно композиции могут представлять собой стандартную дозу лекарственного средства и их можно приготавливать с помощью любых методов, хорошо известных в области фармации. Количество действующего вещества, которое можно объединять с материалом носителя, с получением однократной лекарственной формы должно зависеть от хозяина, подлежащего лечению, а также конкретного пути введения. Количество действующего вещества, которое можно объединять с материалом носителя, с получением однократной лекарственной формы должно, как правило, представлять собой количество соединения формулы I, которое обеспечивает терапевтическое действие. Как правило, в пересчете на 100% указанное количество должно находиться в диапазоне от примерно 1% до примерно 99% действующего вещества, предпочтительно от примерно 5% до примерно 70%, наиболее предпочтительно от примерно 10% до примерно 30%. Методы получения указанных композиций включают стадию приведения в контакт конъюгата антитело к CD22-лекарственное средство с носителем и необязательно одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Как правило, фармацевтические композиции конъюгата антитело к CD22-лекарственное средство получают путем тщательного и равномерного смешения конъюгата антитело к СD22-лекарственное средство с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или с обоими типами носителей, при необходимости с приданием продукту формы. Композиции, пригодные для орального введения, могут иметь форму капсул, облаток, саше, пилюль, таблеток, лепешек (полученных с использованием, корригентной основы, как правило, сахарозы и гуммиарабика или трагаканта), порошков, гранул или представлять собой растворы или суспензии в воде или не представляющей собой воду жидкости, или представляют собой жидкую эмульсию типа масло-вводе или вода-в-масле, или представляют собой эликсир или сироп, или представляют собой пастилки (полученные с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин или сахароза и гуммиарабик), и/или средство для полоскания полости рта и т.п., которые в каждом случае содержат предварительно определенное количество соединения, предлагаемого в настоящем изобретении в качестве действующего вещества. Соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, можно вводить также в виде болюса, электуария (лекарственная кашка) или пасты.

Согласно одному из дополнительных вариантов осуществления изобретения афукозилированное антитело к CD20 и конъюгат антитело к CD22 -лекарственное средство приготавливают в виде двух различных фармацевтических композиций.

Действующие вещества можно включать в микрокапсулы, полученные, например, методом коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозы, или в желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы для введения лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Указанные методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, под ред. Osol А.Е., 16-е изд., 1980.

Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобные полимеров, содержащих антитело, указанные матрицы имеют форму изделий определенной конфигурации, например, пленок или микрокапсул. Примерами матриц с замедленным высвобождением являются сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (US №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, неразложимый этиленвинилацетат, разложимые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и леупролидацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Препаративные формы, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Для этой цели можно применять фильтрацию через стерильные фильтрующие мембраны.

Одним из вариантов осуществления изобретения является композиция, содержащая гуманизированное антитело B-Ly1, которое является афукозилированным с содержанием фукозы, составляющим 60% или менее относительно общего количества олигосахаридов (сахара) на Asn297, и конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство, представленный в настоящем описании, которая предназначена для лечения рака.

Настоящее изобретение относится также в способу лечения рака, заключающемуся в том, что вводят пациенту, который нуждается в таком лечении, (I) в эффективном первом количестве афукозилированное антитело к CD20 с содержанием фукозы, составляющим 60% или менее (предпочтительно афукозилированное гуманизированное антитело B-Ly1), и (II) в эффективном втором количестве конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство.

В одном из вариантов осуществления изобретение фукоза присутствует в количестве от 40% до 60%.

Предпочтительно рак представляет собой рак, при котором происходит экспрессия CD20.

Предпочтительно рак, при котором происходит экспрессия CD20, представляет собой лимфому или лимфоцитарный лейкоз.

Предпочтительно указанное афукозилированное антитело к CD20 представляет собой антитело к CD20 типа П.

Предпочтительно антитело представляет собой гуманизированное антитело B-Ly1. Предпочтительно указанное гуманизированное антитело B-Ly1 представляет собой обинутузумаб.

Предпочтительно указанный конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство представляет собой анти-CD22-MC-vc-PAB-MMAE.

Предпочтительно указанное афукозилированное антитело к CD20 представляет собой гуманизированное антитело B-Ly1 и указанный конъюгат антитело к CD22-лекарственное средство представляет собой анти-СD22-МС-vc-РАВ-ММАЕ, и указанный рак представляет собой рак, при котором происходит экспрессия CD20, предпочтительно лимфому или лимфоцитарный лейкоз.

В контексте настоящего описания понятие «пациент» предпочтительно относится к человеку, который нуждается в лечении с использованием афукозилированного антитела к CD20 (например, к пациенту, страдающему раком, при котором происходит экспрессия CD20), для любой цели, и наиболее предпочтительно к человеку, который нуждается в указанном лечении рака или предракового состояния или повреждения. Однако понятие «пациент» можно относить также к животным кроме человека, предпочтительно млекопитающим, среди прочего, таким как собаки, кошки, лошади, коровы, свиньи, овцы и приматы кроме человека.

Изобретение относится также к афукозилированному антителу к CD20 с содержанием фукозы, составляющим 60% или менее, и конъюгату антитело к СD22-лекарственное средство, предназначенным для применения при лечении рака.

Предпочтительно указанное афукозилированное антитело к CD20 представляет собой гуманизированное антитело B-Ly1.

Предпочтительно указанный конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство в одном из вариантов способа, предлагаемого в изобретении, представляет собой анти-CD22-MC-vc-PAB-MMAE.

Предпочтительно указанное афукозилированное антитело к CD20 представляет собой гуманизированное антитело B-Ly1 и указанный конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство представляет собой анти-CD22-MC-vc-РАВ-ММАЕ.

Предпочтительно указанный рак представляет собой рак, при котором происходит экспрессия CD20, предпочтительно лимфому или лимфоцитарный лейкоз.

Приведенные ниже примеры и чертежи представлены с целью пояснения настоящего изобретения, истинный объем которого представлен в прилагаемой формуле изобретения. Очевидно, что в указанные процедуры можно вносить модификации без отклонения от сущности изобретения.

Экспериментальные процедуры

Основной задачей исследования было изучение действия GA101 (обинутузумаб, указанный в настоящем описании) в комбинации с конъюгатом антитело к СD22-лекарственное средство (CD22-ADC) на созданной с помощью ксенотрансплантата модели диссеминированной диффузной большой В-клеточной лимфомы (DLBCL) линии WSU-DLCL2 на трансгенных по человеческому CD16 SCID-мышах, в сравнении с монотерапией GA101, с монотерапией ритуксимабомом и терапией с использованием комбинации ритуксимаба и CD22-ADC. План опыта представлен в таблице 4.

Культивирование клеток и применение клеток

Клетки человеческой диффузной большой В-клеточной лимфомы линии WSU-DLCL исходно получали из государственного университета Уэйна (Wayne-State University) и после размножения депонировали во внутреннем банке клеток фирмы Roche Glycart. Линию опухолевый клеток культивировали общепринятым методом в среде DMEM, содержащей 10% FCS (фирма Gibco), при 37°С в насыщенной водяным паром атмосфере, содержащей 5% СО₂. Пассаж 15 использовали для трансплантации в трансгенных по человеческому CD016 Scid-мышей. По 5×10⁶ клеток, жизнеспособность которых составляла 96%, на животное инъецировали i.v. в хвостовую вену в 200 мкл среды для культивирования клеток Aim V (фирма GIBCO). Экспрессию CD20 и CD22 на клетках лимфомы линии WSU-DLCL2 подтверждали с помощью FACS. Для этой цели 0,2 млн клеток окрашивали в трех повторностях антителом к человеческому CD20, конъюгированному с РЕ (фирма BD Bioscience, №555623), антителом к человеческому CD22, конъюгированному с РЕ (фирма BD Bioscience, №337899), или применяемыми в качестве контролей изотипов мышиным IgG1 (фирма BD Bioscience, №555749) или мышиным IgG2b (фирма BD Bioscience, №555743). Измеряли средний уровень флуоресценции с помощью протокола для планшет-ридеров FACS CantoII (программа FACS Diva).

Животные

Шестьдесят самок мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров (мыши SCID CD16 tg), возраст которых при их поступлении составлял 7-8 недель (покупали у фирмы Charles River), содержали в среде, в которой отсутствовали специфические патогены, с суточным циклом 12 ч света/12 ч темноты согласно прилагаемым руководствам (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был проверен и утвержден местным ветеринарным органом, лицензия №Р2008016. После доставки животных их выдерживали в течение 1 недели, давая пройти акклиматизацию к новым условиям окружающей среды, и для обследования. Постоянный мониторинг состояния здоровья проводили на регулярной основе.

Обработка

Животных произвольно разделяли на группы при среднем уровне экспрессии CD16 на мышиных NK-клетках, составляющем 70%. Обработку начинали через 12 дней после трансплантации клеток. Терапевтические антитела GA101 и ритуксимаб и соответствующий наполнитель вводили i.v. в дни опыта 12, 19 и 26 в дозе 30 мг/кг в виде индивидуальных агентов. CD22-ADC вводили в день опыта 12 в дозе 4 мг/кг. Использовали свежеприготовленные непосредственно перед введением разведения антител из маточного раствора. Опыт завершали в день 273.

Мониторинг, критерии окончания и аутопсия

У животных ежедневно контролировали клинические симптомы и выявляли нежелательные явления. Критериями окончания опыта были видимые проявления заболевания: неопрятная шерсть, вздутый бок, затрудненное дыхание, нарушенная локомоция, HLP (паралич задней лапы). Когда удовлетворялся критерий окончания, мышей умерщвляли.

Статистическая обработка

Данные о выживаемости статистически анализировали с помощью парного теста Вилкоксона и парного логрангового теста.

Результаты

Клетки человеческой диффузной большой В-клеточной лимфомы линии WSU-DLCL2 инокулировали (5×10⁶ клеток) в хвостовую вену трансгенных по человеческому CD16 Scid-мышей. Мышей произвольно разделяли на группы с одинаковым уровнем экспрессии CD16 на NK-клетках и обработку начинали через 12 дней после трансплантации. Конъюгат антитело к СD22-лекарственное средство вводили в день 12 в дозе 4 мг/кг, a GA101, ритуксимаб и соответствующий наполнитель вводили i.v. в дни опыта 12, 19 и 26 в дозе 30 мг/кг. Животных в контрольной группе обрабатывали ЗФР. У всех животных ежедневно контролировали клинические симптомы и выявляли нежелательные явления и умерщвляли согласно указанным критериям окончания. Опыт завершали в день 273. Данные о выживаемости представлены в виде кривой выживаемости (фиг. 1) и их статистический анализ осуществляли с использованием парного теста Вилкоксона и парного логрангового теста (фиг. 2). Для величин, обозначенных символом * на фиг. 2, характерно значимое различие. Величины медианной и общей выживаемости в разных группах обработки представлены в таблице 4 и таблице 5. При применении комбинации GA101 + CD22-ADC и ритуксимаб + CD22-ADC медианная выживаемость не была достигнута. Установлено, что все животные, которые оставались живыми в день 273, когда эксперимент завершали, не имели опухолей по данным биопсии.

Для всех групп с помощью парного теста Вилкоксона обнаружено значимое различие с обработанной наполнителем группы за исключением GA101, хотя для GA101 и ритуксимаба не обнаружено значимое различие. Для обеих комбинаций GA101 плюс CD22-ADC, а также ритуксимаб плюс CD22-ADC, с помощью парного теста Вилкоксона обнаружено существенное повышение выживаемости по сравнению с соответствующими монотерапиями. С помощью логрангового теста для комбинаций не выявлено существенное различие с монотерипией анти-CD22-ADC, однако при использовании обеих комбинаций медианная выживаемость во всех группах не была достигнута и ее не удалось проанализировать, поскольку в обработанных комбинациями GA101 плюс CD22-ADC и ритуксимаб плюс CD22-ADC группах у 6 из 10 животных не обнаружены опухоли в момент окончания эксперимента. В противоположность этому, в группах, обработанных GA101, ритуксимабом и анти-CD22-ADC в виде монотерапий, только 1, 2 и 3 животных соответственно не имели опухолей в конце эксперимента. Таким образом, комбинация GA101 и CD22-ADC и комбинация ритуксимаб и CD22-ADC обладали более высокой эффективностью по сравнению с применением соответствующих агентов в виде монотерапии с позиций общей выживаемости.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана комбинация обинутузумаба с конъюгатом CD22 антитело - лекарственное средство, который представляет собой анти-CD22-MC-vc-PAB-MMAE, для лечения CD20 экспрессирующего рака, где анти-CD22 антитело в указанном конъюгате содержит вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 50 и вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 51. Изобретение расширяет арсенал средств, предназначенных для лечения рака, прежде всего комбинированная терапия для лечения видов рака, при которых происходит экспрессия CD20. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл.

1. Комбинация обинутузумаба с конъюгатом CD22 антитело - лекарственное средство, который представляет собой анти-CD22-MC-vc-PAB-MMAE, для лечения CD20 экспрессирующего рака, где анти-CD22 антитело в указанном конъюгате содержит вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 50 и вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 51.

2. Комбинация по п. 1, характеризующаяся тем, что CD20 экспрессирующий рак представляет собой лимфому или лимфоцитарный лейкоз.

3. Комбинация по п. 1 или 2, характеризующаяся тем, что применяют один или более дополнительных других цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых агентов или соединения или ионизирующее излучение, которые усиливают действие таких агентов.

4. Применение комбинации обинутузумаба и конъюгата антитело к CD22 - лекарственное средство, который представляет собой анти-CD22-MC-vc-PAB-ММАЕ, для лечения CD20 экспрессирующего рака, где анти-CD22 антитело в указанном конъюгате содержит вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 50 и вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 51.

5. Применение комбинации по п. 4, характеризующееся тем, что применяют один или более дополнительных других цитотоксических, химиотерапевтических или противораковых агентов или соединения или ионизирующее излучение, которые усиливают действие таких агентов.