Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам к человеческому альфа-синуклеину и способам их применения.

Предпосылки создания изобретения

Болезнь Паркинсона характеризуется прогрессирующей потерей дофаминовых (DA) нейронов нигростриатной системы и присутствием телец Леви (LB) и нейритов Леви (LN), белковыми внутринейронными включениями, в основном состоящими из филаментозных агрегатов альфа-синуклеина. Альфа-синуклеин представляет собой белок, который в головном мозге играет центральную роль в контроле функции дофаминергических нейронов и который, вероятно, имеет решающее значение для PD-патофизиологии. Фактически помимо того факта, что альфа-синуклеин является основным белковым компонентом LB, генетические исследования позволили установить, что некоторые точечные мутации в гене альфа-синуклеина и их мультипликация вызывает семейные формы PD. Имеется большой объем доказательств того, что связанная с альфа-синуклеином патология в дофаминергических синапсах может лежать в основе дисфункции и дегенерации нейронов в головном мозг при PD (Bellucci А. и др., Brain Res. 1432, 2012, сс. 95-113).

Тельца Леви, которые представляют собой отложения альфа-синуклеина, являются патологическим признаком болезни Паркинсона (PD) (Goeder М., Nat. Rev. Neurosci 2, 2001, сс. 492-501). Определение стадии патологии головного мозга, связанного со спорадической PD, описано у Braak и др. (Neurobiology of aging 24, 2003, сс. 197-211).

Фибриллярные агрегаты альфа-синуклеина являются основным компонентом телец Леви и нейритов Леви. В современных научных исследованиях высказано предположение о том, что дофибриллярные олигомеры альфа-синуклеина могут иметь основное значение в прогрессировании болезни Паркинсона (Luk K.С. и др., Science 338, 2012, сс. 949-953; Auluck Р.K. и др., Science 295, 2002, сс. 865-868; Bodner R.A. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 2006, сс. 4246-4251; Bucciantini M. и др., J. Biol. Chem. 279, 2004, сс. 31374-31382; El-Agnaf O.M. и др., FASEB J. 20, 2006, сс. 419-425; Kayed R. и др., Science 300, 2003, сс. 486-489; Lashuel Н.А. и др., J. Mol. Biol. 322, 2002, сс. 1089-1102; Masliah Е. и др., Science 287, 2000, сс. 1265-1269.).

Chai Y-J. с соавторами описали, что секретируемая олигомерная форма а-синуклеина влияет на несколько стадий мембранного транспорта (FEBS Lett. 587, 2013, сс. 452-459). Экзосомы BV-2-клеток, индуцированные альфа-синуклеином, являющимся важным медиатором нейродегенарации при PD, описаны у Chang С. и др., Neurosci. Lett. 548, 2013, сс. 190-195). У Feng R.L. соавторами описано, что альфа-синуклеин опосредует изменения проводимости мембран, т.е. описана потенциальная роль олигомеров альфа-синуклеина в уязвимости клеток (Eur. J. Neurosci. 32, 2010, сс. 10-17). У Lee H-J. с соавторами описано, что недостаток аутофагии усиливает экзоцитоз и внутриклеточный перенос альфа-синуклеина (Exp. Mol. Med. 45, 2013, е22). Патология синапсов, связанная с агрегацией альфа-синуклеина при деменции с тельцами Леви, болезни Паркинсона и деменции, связанной с болезнью Паркинсона, описаны у Schulz-Schaeffer W.J. (Acta Neuropathol. 120, 2010, сс. 131-143).

Основная часть альфа-синуклеина в головном мозге человека присутствует в виде ацетилированной на N-конце формы (Kellie J.F. и др., Sci. Rep. 4, 2014, с. 5797), и указанное N-концевое ацетилирование ингибирует агрегацию альфа-синуклеина (Bartels Т. и др., PLoS One 9, 2014, е103727).

Описаны различные олигомерные формы рекомбинантного альфа-синуклеина: олигомеры типа А (цитотоксические, влияют на приток Са²⁺), олигомеры типа С (виды, представляющие собой затравки для агрегатов), фибриллы, смешенные с липидами (затравка для агрегации внутриклеточных агрегатов), мутант с утроенным пролином (TP) А30Р/А56Р/А76Р (образует в основном токсичные олигомеры) (см., например, Danzer K.М. и др., J. Neurosci. 27, 2007, сс. 9220-9232; Danzer K.М. и др., J. Neurochem. 111, 2009, сс. 192-203; Luk С.K. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2009, сс. 20051-20056; Desplates P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2009, cc. 13010-13015; Karpinar D.P. и др., EMBO J. 28, 2009, cc. 3256-3268; Lee H-J. и др., J. Biol. Chem. 285, 2010, cc. 9262-9272; Hansen С. и др., J. Clin. Invest. 121, 2011, cc. 715-725).

Патологический перенос альфа-синуклеина, который инициирует нейродегенерацию типа болезни Паркинсона у нетрансгенных мышей, описан у Luk K.С. и др., (Science 338, 2012, сс. 949-953). Индуцируемая олигомерами альфа-синуклеина затравка, являющаяся основой для распространения связанной с альфа-синуклеином патологии и экзосомального переноса по типу «от клетки к клетке» олигомеров альфа-синуклеина, описана у Danzer К.М. и др. (J. Neurochem. 111, 2009, сс. 192-203; Mol. Neurodegen. 7, 2012, с. 42). Braidy с соавторами описали перенос альфа-синуклеина и митохондриальную токсичность в первичных человеческих эмбриональных энтерических нейронах in vitro (Neurotox. Res., 2013, epub от 5 октября 2013 г.). Desplats Р. с соавторами описали образование включений и гибель нейронов в результате переноса альфа-синуклеина от нейрона к нейрону (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 2009, cc. 13010-13015). Непосредственный перенос альфа-синуклеина из нейрона в астроглию вызывает воспалительные ответы в виде синуклеинопатий, что описано у Lee и др. (J. Biol. Chem. 285, 2010, сс. 9262-9272). Lee S-J. с соавторами описали перенос от клетке к клетке агрегатов альфа-синуклеина (Meth. Mol. Biol. 849, 2012, сс. 347-359; Nat. Rev. Neurol. 6, 2010, cc. 702-706). По-видимому, наиболее убедительное доказательство развития связанной с альфа-синуклеином патологии путем возможного переноса затравки агрегации альфа-синуклеина получено с помощью посмертного анализа головного мозга некоторых страдающих PD пациентов, у которых обнаружена патология Леви в эмбриональных нейронах, которые трансплантировали в их головной мозг на 11-16 лет раньше (Li J-Y. и др., Nat. Med. 14, 2008, сс. 501-503).

Агрегированный альфа-синуклеин опосредует дофаминергическую нейротоксичность in vivo (Periquet М. и др., J. Neurosci. 27, 2007, сс. 3338-3346). Pieri L. с соатворами описали, что фибриллярный альфа-синуклеин и экзон 1 гена белка хантингтина в сочетании друг с другом являются токсичными для клеток (Biophys. J. 102, 2012, сс. 2894-2905). Van Rooijen с соавторами при изучение механизма действия описали повышение проницаемости мембран олигомерным альфа-синуклеином (PLoS One 5, 2010, е14292).

В самые последние годы Wagner с соавторами продемонстрировали с использованием клеточных анализов и на модели трансгенных по альфа-синуклеину мышей, что малая молекула Anlel38b действует в качестве модулятора, защищающего (замедляет скорость роста отложений) от олигомеров альфа-синуклеина, и ее можно применять для модифицирующей заболевание терапии болезни Паркинсона (Wagner J. и др., Acta Neuropathol. 125, 2013, сс. 795-813). Lynch S.M. с соатворами установили, что внутриклеточные антитела (интрабоди) в виде scFv против неамилоидного компонента альфа-синуклеина снижают внутриклеточную агрегацию и токсичность (J. Mol. Biol. 377, 2008, сс. 136-147). Стратегия создания ингибиторов агрегации и токсичности альфа-синуклеина в качестве нового пути лечения болезни Паркинсона и родственных заболеваний описана у El-Agnaf О.М. и др. (FASEB J., 2004). Emadi S. с соавторами описали ингибирование агрегации альфа-синуклеина с помощью одноцепочечных фрагментов человеческого антитела и выделение одноцепочечных фрагментов человеческого антитела против олигомерного альфа-синуклеина, которые ингибируют агрегацию и предупреждают проявление индуцируемой альфа-синуклеином токсичности (Biochem. 43, 2004, сс. 2871-2878; J. Mol. Biol. 368, 2007, сс. 1132-1144). Smith с соавторами описали воздействия внутривенного иммуноглобулина на агрегацию и нейротоксичность альфа-синуклеина (Int. Immunopharmacol. 14, 2012, сс. 550-557). Целенаправленное воздействие на внутриклеточный и внеклеточный альфа-синуклеин в качестве терапевтической стратегии при болезни Паркинсона и других синуклеинопатий описано у Vekrelis K. и Stefanis L. (Expert. Opin. Trier. Targets 16, 2012, cc. 421-432).

Клиренс, которому способствуют антитела, при церебральной синуклеинопатий в соответствующих трансгенных мышах продемонстрирован при осуществления активного (Masliah Е. и др., Neuron 46, 2005, сс. 857-868) и пассивного (Masliah Е. и др., PLoS One 6, 2011, е19338) путей иммунизации. Связывание внеклеточного альфа-синуклеина специфическими антителами, препятствующее переносу агрегатов от клетки к клетке, описано Bae E-J. и др. (J. Neurosci. 32, 2012, сс. 13454-13469).

Применение мимотопов эпитопов альфа-синуклеина для лечения болезней с тельцами Леви описано в WO 2011/020133. В WO 2007/011907 описаны антитела к альфа-синуклеину и относящиеся к ним методы. Слияние несущей высокий заряд протеосомальной перенацеливающей последовательности повышает экспрессию различных растворимых внутриклеточных антител к синуклеину, что продемонстрировано у Joshi и др. (MABS 4, 2012, сс. 686-693). Emadi и др. (J. Mol. Biol. 368, 2007, сс. 1132-1144) описали выделение одноцепочечного фрагмента человеческого антитела против олигомерного альфа-синуклеина, который ингибирует агрегацию и предупреждает индуцируемую альфа-синуклеином токсичность. Обнаружение морфологически различных олигомерных форм альфа-синуклеина описано у Emadi и др. (J. Biol. Chem. 284, 2009, сс. 11048-11058). У Zhou и др. (Mol. Ther. 10, 2004, сс. 1023-1031) описано, что одноцепочечный Fv человеческого внутриклеточного антитела блокирует аномальные клеточные воздействия сверхэкспрессируемого альфа-синуклеин. Данные о том, что антитела против альфа-синуклеина снижают олигомеризацию в живых клетках, описаны у Nasstrom и др. (PLoS One 6, 2011, е27230). Связывающие протофибриллы антитела и их применение в методах терапии и диагностики болезни Паркинсона, деменции с тельцами Леви и других альфа-синуклеинопатий описаны в WO 2011/104696. Выделение рекомбинантных антител против специфических морфологических форм белков с использованием атомно-силовой микроскопии и технологий фагового дисплея описано у Barkhordarian и др. (Prot. Eng. Des. Select. 19, 2006, сс. 497-502). Kvam и др. (PLoS One 4, 2009, e5727) установили, что конформационное нацеливание фибриллярных полиглутаминовых белков в живых клетках усиливает агрегацию и цитотоксичность.

Краткое изложение сущности изобретения

В изобретении предложены антитела к человеческому альфа-синуклеину и способы их применения.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое специфически связывается с человеческим альфа-синуклеином, где человеческий альфа-синуклеин имеет свободный N-концевой остаток метионина.

Понятие «свободный N-концевой остаток метионина» означает остаток метионина в полипептиде, который локализован на N-конце полипептида и который не модифицирован за исключением амидной связи, с помощью которой он конъюгирован с остальной частью полипептида. Указанный свободный N-концевой остаток метионина в одном из вариантов осуществления изобретения представляет собой немодифицированный остаток метионина. Указанный свободный N-концевой остаток метионина в одном из вариантов осуществления изобретения имеет свободную аминогруппу. Человеческий альфа-синуклеин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело специфически связывается с человеческим и мышиным альфа-синуклеином, где человеческий и мышиный альфа-синуклеин имеет свободный N-концевой остаток метионина.

В одном из вариантов осуществления изобретения альфа-синуклеин представляет собой мономерный альфа-синуклеин.

В одном из вариантов осуществления изобретения альфа-синуклеин представляет собой мономерный и олигомерный альфа-синуклеин.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело получали путем гуманизации антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело и содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело, в котором вариабельный домен тяжелой цепи получен из вариабельного домена тяжелой цепи, имеющего SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи получен из вариабельного домена легкой цепи, имеющего SEQ ID NO: 27.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое связывается с таким же эпитопом или с перекрывающим эпитопом, что и антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20.

Одним из объектов изобретения является антитело, которое содержит в тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, 22 и 17, и в легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25.

Одним из объектов изобретения является вариант антитела, полученный из антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления изобретения вариант антитела представляет собой гуманизированное антитело, полученное гуманизацией антитела, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 27.

Одним из объектов изобретения является гуманизированное антитело, которое содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 15-17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 18-20, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

Одним из объектов изобретения является гуманизированное антитело, которое содержит в вариабельном домене тяжелой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 20, 21 и 17, и в вариабельном домене легкой цепи HVR, имеющие SEQ ID NO: 23-25, в котором в каждом HVR от 0 до 3 аминокислотных остатков заменены.

Одним из объектов изобретения является гуманизированное антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, полученный из вариабельного домена тяжелой цепи, имеющего SEQ ID NO: 26, и вариабельный домен легкой цепи, полученный из вариабельного домена легкой цепи, имеющего SEQ ID NO: 27.

В одном из вариантов осуществления всех указанных ранее объектов изобретения антитело конъюгируют с челночным модулем для гематоэнцефалического барьера.

В одном из вариантов осуществления изобретения челночный модуль для гематоэнцефалического барьера представляет собой антитело или фрагмент антитела, которое/который специфически связывается с LRP1 (белок 1, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности), LRP8 (белок 8, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности), рецептором человеческого трансферрина или рецептором человеческого инсулиноподобного фактора роста.

В одном из вариантов осуществления всех указанных ранее объектов изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело.

В одном из вариантов осуществления всех указанных ранее объектов изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело или химерное антитело.

В одном из вариантов осуществления всех указанных ранее объектов изобретения антитело представляет собой

а) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 или

б) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4, или

в) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G,

г) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G,

д) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи, и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи, или

е) полноразмерное антитело человеческого подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи, и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в соответствующей другой тяжелой цепи.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

а) антитело содержит две тяжелые цепи антитела, каждая из которых содержит вариабельный домен тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи, в котором

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

II) константная область представляет собой константную область человеческого IgG1, в которой С-концевой остаток лизина может присутствовать или отсутствовать, и

III) константная область содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G,

б) антитело содержит две легкие цепи антитела, каждая из которых содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, в котором

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

II) константная область представляет собой константную область человеческой легкой каппа-цепи или константную область человеческой легкой лямбда-цепи.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

а) антитело содержит две тяжелые цепи антитела, каждая из которых содержит вариабельный домен тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи, в котором

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 17, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

II) константная область представляет собой константную область человеческого IgG1, в которой С-концевой остаток лизина может присутствовать или отсутствовать, и

III) константная область содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G,

б) антитело содержит две легкие цепи антитела, каждая из которых содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, в котором

I) вариабельный домен содержит HVR, имеющие SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, при этом в каждом HVR независимо друг от друга 0, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка заменены,

II) константная область представляет собой константную область человеческой легкой каппа-цепи или константную область человеческой легкой лямбда-цепи.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

а) антитело содержит две тяжелые цепи антитела, каждая из которых содержит вариабельный домен тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи, в котором

I) вариабельный домен содержит представляет собой гуманизированную форму нечеловеческого (кроличьего) вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 26,

II) константная область представляет собой константную область человеческого IgG1, в которой С-концевой остаток лизина может присутствовать или отсутствовать, и

III) константная область содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G,

б) антитело содержит две легкие цепи антитела, каждая из которых содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи, в котором

I) вариабельный домен представляет собой гуманизированную форму нечеловеческого (кроличьего) вариабельного домена, имеющую SEQ ID NO: 27,

II) константная область представляет собой константную область человеческой легкой каппа-цепи или константную область человеческой легкой лямбда-цепи.

Одним из объектов изобретения является антитело к человеческому альфа-синуклеину, отличающееся тем, что

а) антитело содержит две тяжелых цепи антитела, каждая из которых содержит в направлении от N- к С-концу вариабельный домен тяжелой цепи, константную область тяжелой цепи, пептидный линкер и scFab- или scFv-фрагмент антитела, который специфически связывается с рецептором человеческого трансферрина, в котором