СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ЗЕМЛЯНИКИ IN VITRO Российский патент 2019 года по МПК A01H4/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности размножения in vitro земляники садовой на жидкой среде. Результаты данного изобретения могут быть использованы при получении посадочного материала земляники садовой.

Уровень техники

Большинство биотехнологических лабораторий, работающих с культурами in vitro, используют в качестве питательной среды агаризованные среды. В основном среды содержат порядка 6-8 г/л агара. Следует отметить, что стоимость хорошего, подходящего для сред in vitro агара в настоящее время довольно высока и его применение при культивировании растений резко увеличивает себестоимость получаемого посадочного материала и снижает рентабельность производства.

В качестве достойной альтернативы способов размножения на агаризованных средах разрабатываются способы размножения растений на жидких питательных средах. Жидкие среды способствуют хорошей аэрации и поглощению поверхностного кислорода. Кроме того, в них более равномерно идет распределение всех питательных веществ и растворение токсических метаболитов. Применение жидких сред увеличивает площадь поверхности контакта ткани и питательной среды, обеспечивая, тем самым, активизацию процесса дыхания, а также благоприятствует процессу синтеза белка и поглощению солей. Среди ключевых недостатков использования жидких сред можно отметить возможное изменение значения рН в течение культивирования, а также витрификацию, которая очень сильно снижает качество микропобегов и может вызывать гибель растений (Preil, W. 2005. General introduction: a personal reflection on the use of liquid media for in vitro culture. Pages 1-18 in А.К. Hvoslef-Eide and W. Preil, eds. Liquid culture system for in vitro plant propagation. Spriger Verlag, Berlin, Germany). Поэтому разработка состава жидких сред для культур с одновременным сокращением продолжительности культивирования позволит повысить эффективность размножения растений.

Земляника является одной из наиболее значимых культур в ягодоводстве и в настоящее время она культивируется практически во всем мире. Земляника может расти в различных почвенно-климатических условиях, плодоносит в год посадки или на следующий год, созревает раньше большинства других плодовых и ягодных культур, дает высокие урожаи крупных, привлекательных, вкусных и ароматных ягод. Биохимический состав ягод определяет их пищевую и лечебную ценность. Таким образом, содержание в ягодах полезных для здоровья людей веществ и отличный вкус предопределяют востребованность земляники на рынке в свежем, замороженном и переработанном виде. Одним из способов получения посадочного материала земляники является ее размножение в условиях in vitro.

Известен способ размножения земляники садовой в биореакторе в течение 8 недель с использованием жидкой среды следующего состава: среда ВМ с добавлением 0,05 или 0,1 мМ тидиазурона (S.С. Debnath. Developing a scale-up system for the in vitro multiplication of thidiazuron-induced strawberry shoots using a bioreactor. Canadian Journal of Plant Science, 2008, 88(4): 737-746).

Недостатками использования данного способа являются длительный период культивирования (8 недель), высокая витрифицированность растений (до 30%), а также высокая стоимость цитокинина тидиазурона, который к тому же усиливает появление сомаклональных изменений.

Наиболее близким известным прототипом является способ культивирования земляники садовой в биореакторе с использованием жидкой среды следующего состава: среда Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП, 0,05 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,03 мг/л гиббереловой кислоты и 30 г/л сахарозы (L. Georgieva, I. Tsvetkov, М. Georgieva and V. Kondakova. New protocol for in vitro propagation of berry plants by tis bioreactor, Bulgarian Journal of Agricultural Science, 22 (5) 2016, 745-751).

К недостаткам ближайшего прототипа следует отнести умеренный коэффициент мультипликации (4,0) и время культивирования, не отличающее от использования агаризованных питательных сред (4 недели).

Раскрытие изобретения

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности размножения земляники садовой на жидкой среде с одновременным сокращением продолжительности культивирования и сохранением качественных характеристик растений.

Поставленная цель достигается за счет использования жидкой среды Мурасиге-Скуга (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) с добавлением 0,2 г/л 6-БАП, 20 г/л сахарозы и 10 г/л сорбитола, оказывающего в данной концентрации защиту от витрификации.

Суть изобретения состоит в том, что растения земляники садовой культивируются в колбах Эрленмейера на шейкере, с качающимся типом платформы, на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга для мультипликации, а именно с добавлением 0,2 г/л 6-БАП, 20 г/л сахарозы и 10 г/л сорбитола и переносятся на свежую питательную среду через 3 недели.

Осуществление изобретения

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. В нестерильных условиях готовится жидкая питательная среда Мурасиге-Скуга. В нее добавляются необходимые количества макро- и микроэлементов, 10 г/л сорбитола, 20 г/л сахарозы, объем доводится дистиллированной водой с подведением значения рН до 5,6-5,8. Среда разливается по 30 мл в колбы Эрленмейера объемом 250 мл, запечатывается фольгой и бумагой, завязывается резинкой. Автоклавирование проводится при 1 атм и 120°С в течение 20 минут. В остывшую среду стерильно вносятся раствор витаминов Мурасиге-Скуга и регулятор роста 6-БАП в концентрации 0,2 г/л. Все манипуляции с растительным материалом производятся в стерильных условиях ламинара. В колбу со средой вносятся 5 эксплантов длиной не менее 1 см каждый. У каждого экспланта предварительно убираются нижние листья (2-3 листа).

2. В течение трех недель проводится культивирование растений на жидкой среде в колбах Эрленмейера на шейкере с качающимся типом платформы со скоростью 100 оборотов в минуту, при освещении 1000 лк в течение 14 часов.

2. Через 3 недели производится срезка побегов для последующего укоренения, а оставшиеся нижние части растений пересаживаются на свежую питательную среду.

Техническим результатом предлагаемого способа является достижение высокого коэффициента мультипликации земляники садовой, равного 5,0, при коротком, трехнедельном периоде культивирования, а также низкий уровень витрификации растений (Таблица 1).

Изобретение может быть использовано для быстрого получения качественного и здорового посадочного материала, при этом действие изобретения распространяется на широкий спектр сортов земляники садовой, предлагаемых биотехнологическими лабораториями и предприятиями на российский рынок, в том числе на популярные, но медленно размножающиеся, в силу своих сортовых особенностей, сорта, такие как: Гигантелла Максим (Gigantella Maxim), Редгонтлет (Red Gauntlet), Роман (Roman).

Полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известными способами. Предложенный способ обеспечивает повышение эффективности размножения земляники садовой с коэффициентом мультипликации до 5,0 при одновременном снижении длительности культивирования и уровня витрификации микропобегов (таблица 1).

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности культивирования in vitro земляники садовой на жидкой среде. Способ включает в себя размножение микропобегов земляники в течение трех недель на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением ключевого компонента сорбитола. Предложенный способ позволяет достичь высокого коэффициента мультипликации земляники садовой на жидкой среде in vitro при малой продолжительности культивирования, а также почти полностью исключить витрификацию. 1 табл.

Способ размножения земляники садовой in vitro, включающий культивирование эксплантов земляники на жидкой питательной среде, отличающийся тем, что питательная среда содержит макроэлементы, микроэлементы и витамины по Мурасиге-Скуга, 0,2 мг/л 6-БАП, 20 г/л сахарозы, 10 г/л сорбитола, в качестве эксплантов используются побеги длиной не менее 1 см с удаленными 2-3 нижними листьями и длительность культивирования составляет три недели