Способ культивирования растений in vitro разных таксономических групп Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, предназначено для культивирования in vitro семян, микрочеренков и микропобегов, растений разных таксономических групп и может быть использовано для ускоренного размножения ценных сортов и гибридов растений.

В последнее время, как в нашей стране, так и за рубежом особое внимание уделяется органическому сельскому хозяйству и органическим продуктам («Organic food»), которые получены без применения химических средств борьбы с биотическими факторами окружающей среды, минеральных удобрений, гербицидов, регуляторов роста, генетически модифицированных объектов и т.д., которые не оказывают вред окружающей среде, не наносят ущерб здоровью людей, растений и животных. Кроме того, такие продукты должны обладать высокой питательностью, калорийностью, быть богаты аминокислотами, белками, углеводами, минеральными элементами, витаминами и др. компонентами, важными для жизнедеятельности человека.

Специализированные препараты, влияющие на всхожесть семян, рост и развитие рассады, урожайность и декоративные свойства растений для применения in vivo представляют собой широкое разнообразие. Однако они могут быть токсичны для человека и животных, а также для самих растений. Поиск органических веществ, имеющих минимум побочных эффектов и обладающих доступностью, а также относительной дешевизной, продолжается постоянно. Поэтому повышение морфофизиологических показателей высших растений in vivo благодаря таким препаратам в свою очередь может способствовать увеличению урожайности хозяйственно важных растений, что является ценным в контексте сельскохозяйственной значимости разработки.

Кроме того, в настоящее время в исследованиях по культивированию изолированных тканей и клеток растений in vitro постоянно ведется поиск альтернативных питательных сред и органических биостимуляторов, которые снижают затраты на биотехнологический процесс и способствуют удовлетворительному росту клеточных культур высших растений in vitro. Применение питательных сред с органическим составом является потенциально коммерчески эффективным способом, позволяющим отказаться от использования дорогостоящих компонентов питательных сред при сохранении и увеличении биосинтетического потенциала клеточных культур высших растений in vitro [Калашникова Е.А. Культура тканей и клеток растений. Учебник / Е.А. Калашникова, Р.Н. Киракосян // Москва, изд-во КноРус. - 2023. - 238 с]. Как правило, при культивировании клеточных культур in vitro применяют различные питательные среды, отличающиеся минеральным составом. Причем для растений разных таксономических групп минеральный состав питательной среды может отличаться. Так, например, для культивирования in vitro сельскохозяйственных, лекарственных, некоторых ягодных растений применяют питательную среду, содержащую минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (RU №2160002 С1, А01Н 4/00; RU №2746067 C1, A01G 31/00; RU №2634409 C1, А01Н 4/00), для культивирования in vitro древесных пород, как правило, применяют питательную среду WPM (Woody Plant Medium) [Концевая. Длительное хранение микрорастений березы в культуре тканей / И.И Концевая // Лесоведение. -2009. - №5. - С. 50-56; Крицкая Т.А. Особенности длительного депонирования культуры in vitro некоторых редких и исчезающих видов растений Саратовской области / Т.А. Крицкая, А.С. Кашин // Изв. Сарат. Ун-та. Сер. Химия. Биология. Экология. - 2016. - Т. 16. - Вып.1. - С. 75-80.], а для получения гаплоидных растений сельскохозяйственных культур in vitro используют питательную среду Гамбурга или Нич [Калашникова Е.А. Культура тканей и клеток растений. Учебник / Е.А. Калашникова, Р.Н. Киракосян // Москва, изд-во КноРус. - 2023. - 238 с]. Однако предлагаемые питательные среды не являются оптимальными для выращивания клеточных культур in vitro некоторых видов растений, и требуется их модификация.

Следует отметить, что для реализации морфогенетического потенциала культивируемых клеточных культур in vitro необходимо добавлять в состав питательной среды регуляторы роста (ауксины, цитокинины, гибберелловую кислоту и др) (RU 2529837 А01Н 4/00, 27.09.2014; RU 2628091 С2, C12N 5/04 А01Н 5/00, 08.14.2017), аминокислоты (RU №2203534 А01Н 4/00, C12N 5/04, 27.10.2001) или изменять условия выращивания (изменение спектрального состава света) [Tarakanov, Ivan G.; Kosobryukhov, Anatoly A.; Tovstyko, Daria A.; Anisimov, Alexander A.; Shulgina, Alia A.; Sleptsov, Nikolay N.; Kalashnikova, Elena A.; Vassilev, Andon V.; Kirakosyan, Rima N.Effects of Light Spectral Quality on the Micropropagated Raspberry Plants during Ex Vitro Adaptation //Plants. - 2021. - T. 10. - №. 10. - C. 2071]. Поэтому для каждого вида растений необходимо использовать специфические питательные среды, подбор которых может занять длительное время. Поэтому необходимо разрабатывать способы культивирования in vitro растения разных таксономических групп с использованием универсальных питательных сред.

Уникальным органическим продуктом является хлорелла (Chlorella vulgaris) - зеленая водоросль, которая встречается в пресноводных водоемах. В ее состав входит более 650 веществ, оказывающих благоприятное действие на весь организм человека. Поэтому в настоящее время ведутся исследования по получению новых штаммов хлореллы, обладающих повышенным биосинтезом незаменимых для человека веществ.

Многие компании, занимающиеся культивированием микроводорослей, предлагают готовый продукт в виде биомассы, которая в зависимости от конкретной микроводоросли в той или иной степени богата белком (в том числе содержащим незаменимые аминокислоты), антиоксидантами (астаксантин, фукоксантин), витаминами (А, Е, С, В9, В12), различными элементами (натрий, кальций, железо). Полученная биомасса микроводорослей может быть использована в качестве биодобавки в рационе человека (чаще всего употребляют в виде порошков или таблеток, но есть и суспензии с живыми клетками), в сельском хозяйстве в виде удобрения (повышает всхожесть семян) или в животноводстве как кормовая добавка, которая способна влиять на продуктивность сельскохозяйственных животных (как считается, опосредованно через общее улучшение состояния) и в других направлениях. Поэтому выбор данной микроводоросли в качестве источника ценных соединений для изучения ее действия на биосинтетический потенциал и морфофизиологические показатели высших растений представляет интерес.

Известен способ размножения в культуре in vitro земляники [Белошапкина О.О. Использование биопрепаратов при клональном микроразмножении земляники / О.О. Белошапкина, И.В. Жаркова // Докл. ТСХА. - 2001. - №273, ч. 2. - С. 284-289]. Способ заключался в культивировании изолированных меристем земляники на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС) [Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497], а также биологически активный препарат - иммуноцитофит. На последнем этапе клонального микроразмножения рекомендуется применять грибной (триходермин) и бактериальный (планриз) препараты в концентрациях 0,5% и 0,1% соответственно. По сравнению с контролем существенно снижается гибель микрорастений после обработки их триходермином и еще больше - планризом (на 30-40%), увеличивается приживаемость. Недостатком данного способа является применение грибных и бактериальных препаратов только на последнем этапе клонального микроразмножения (адаптация микроклонов к нестерильным условиям ex vitro).

Известен способ размножения и укоренения in vitro S. crispa (Schomburgkia crispa Lindley (Orchidaceae) - эпифитный вид, встречающийся в бразильском Серрадо - на модифицированной питательной среде WPM (Woody Plant Medium), содержащей супернатанта микроводоросли Chlorella sorokiniana, суспендированный в среде NPK и полученный в результате центрифугирования культуры в среде NPK [Pereira N.S. Application of Chlorella sorokiniana (Chlorophyceae) as supplement and/or an alternative medium for the in vitro cultivation of Schomburgkia crispa (Orchidaceae) / N.S. Pereira B.R.R. Ferreira, E.M. Carvalho, et al. // J. Appl. Phycol. 30, 2347-2358 (2018)]. В состав питательной среды помимо минеральных солей добавляли 6-бензиламинопурин (БАП) и индолил-3-масляную кислоту (ИМК) в концентрациях 2,5 и 5,0 мг/л. В этих вариантах наблюдали активный рост и укоренение микропобегов. Недостатком известного аналога является сложность получения супернатанта микроводоросли Chlorella sorokiniana, а также не приводятся его концентрации. Кроме того, не указывается добавление супернатанта в состав питательной среды, производящееся перед автоклавированием или после автоклавирования среды.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу, взятом за прототип, относится способ размножения in vitro орхидей Cattleya labiata на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС), а также экстракты микроводорослей Messastrum gracile и Chlorella vulgaris. В качестве контроля использовали питательную среду с БАП, тидиазуроном или зеатином [Corbellini J.R., Ribas, L.L.F., de Maia, F.R. et al. Effect of microalgae Messastrum gracile and Chlorella vulgaris on the in vitro propagation of orchid Cattleya labiata./ J.R. Corbellini, L.L.F. Ribas, F.R Maia. et al // J. Appl. Phycol. - 2020. - 32, - 4013-4027]. Недостатком данного способа является добавление в состав питательной среды высокой концентрации биомассы микроводорослей (4 г/л) и не указано, в какой форме (сырая или сухая биомасса) производится добавление микроводорослей в состав питательной среды, что усложняет процесс приготовления питательной среды.

Задача предполагаемого изобретения - разработать способ культивирования растений in vitro разных таксономических групп за счет выращивания растительных эксплантов (семена, микрочеренки, микропобеги) на питательной среде, в состав которой входит суспензия микроводоросли Chlorella vulgaris.

Поставленная задача достигается за счет того, что в качестве питательной среды используют суспензию хлореллы, которую первоначально выращивают на безгормональной питательной среде, содержащей только ¼ нормы макросолей по прописи Мурасига и Скуга, после чего на 5 сутки выращивания в суспензию добавляют 20 г/л сахарозы, БАП 1 мг/л и ИУК 0,5 мг/л. рН среды доводят до 5,8 (стандартные условия выращивания), полученный питательный субстрат автоклавируют и в дальнейшем его используют для культивирования in vitro изолированных растительных эксплантов (семена, микрочеренки, микропобеги) растений разных таксономических групп.

Конкретный пример осуществления предполагаемого способа.

Для культивирования изолированных растительных эксплантов можно использовать питательную среду, полученную на основе суспензионной культуры микроводоросли хлореллы. Для этого первоначально хлореллу выращивают в конических или круглодонных колбах объемом 1 л на питательной среде, содержащую ¼ нормы макросолей по прописи МС. После высева хлореллы в питательную среду определяют оптическую плотность раствора при длине волны 440 нм и 690 нм (оптическую плотность можно измерять на любом спектрофотометре, например, Сагу-50, Varian, США). Выращивание хлореллы проводят при температуре 24±1, 16-часовом фотопериоде, освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивность освещения 3 тыс.лк в течение 5 суток. В каждую колбу подается атмосферный воздух с помощью компрессора мощностью 2,5 Вт, 120 л/час. Колбы закрывают фольгой для предотвращения испарения. По истечению 5 суток вновь определяют оптическую плотность суспензии на спектрофотометре при длине волны 440 нм и 690 нм для определения прироста биомассы, а также подсчитывают индекс роста (I) и удельную скорость роста (μ) по формулам:

где X_max и Х₀ - максимальное и начальное значения оптической плотности, ед., Х₂ и X₁ - значение оптической плотности (мм) в момент времени t₂ и t₁, сут., соответственно.

После 5 суток выращивания хлореллы в жидкой питательной среде в состав среды добавляют цитокинин 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1 мг/л и ауксин индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) 0,5 мг/л, а также 20 г/л сахарозы и 8 г/л агара. рН среды доводят до показателя 5,8. Такая среда вместе с клетками хлореллы подвергается автоклавированию. После этого стерильную питательную среду разливают в условиях ламинар-бокса в культуральные сосуды (чашки Петри, стеклянные колбы, стеклянные банки, пластиковые контейнеры и др) и используют для культивирования in vitro изолированных растительных эксплантов (семена, микрочеренки, микропобеги) растений разных таксономических групп.

Пример 1. Объект исследования - семена разных таксономических групп: ель европейская (Picea rubra A.Dietr.), сосна обыкновенная (Pinus sylvestris), бархатцы (Tagetes erecta L., сорт «Красная вишня», Агрофирма «Аэлита»), капуста белокочанная (Brassica oleracea, сорт «Слава 1305», ООО «СПК Агрони»), рож яровая (Secale cereale), ячмень яровой {Hordeum vulgare L., сорт «ТСХА 4»), полба (Triticum dicoccon, сорт «Янтара»), тритикале (х Triticosecale, сорт «Тимирязевская 150»), мелиса лекарственная (Melissa officinalis, сорт «Лимонный аромат», ООО «ТПК «РОСТИ»). Семена после поверхностной стерилизации 0,1% раствором сулемы в течение 10 минут с последующей промывкой стерильной дистиллированной водой проращивали в пластиковых контейнерах объемом 250 мл на питательной среде опытного (питательная среда на основе хлореллы) и контрольного (безгормональная питательная среда, содержащая минеральные соли по прописи МС) вариантов. Асептическую культуру выращивали в световой комнате, где поддерживалась температура 23°С, 16-ти часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами. Учет результатов проводили на 30 сутки с момента посева семян in vitro. Результаты приведены в таблице 1 и рисунках.

На фиг.1 Проростки семян тритикале на среде с хлореллой (слева) и на среде МС (контроль, справа);

На фиг.2 Проростки семян ржи на среде с хлореллой (слева) и на среде МС (контроль, справа);

На фиг.3 Проростки семян ячменя на среде с хлореллой (слева) и на среде МС (контроль, справа);

На фиг.4 Проростки семян мелисы на среде с хлореллой (слева) и на среде МС (контроль, справа);

На фиг.5 Микропобеги табака при использовании среды на основе суспензии хлореллы (слева) и на среде МС (контроль, справа);

На фиг.6 Микропобеги мелисы при использовании среды на основе суспензии хлореллы (слева) и на среде МС (контроль, справа);

На фиг.7 Микропобеги иссопа при использовании среды на основе суспензии хлореллы (слева) и на среде МС (контроль, справа).

Установлено, что в питательной среде, полученной на основе суспензии хлореллы, повышается всхожесть семян и биометрические показатели проростков.

Пример 2. Объект исследования - микрочеренки и микропобеги, изолированные с асептических растений мелисы, табака и иссопа. Микрочеренки культивировали на питательной среде опытного (питательная среда на основе хлореллы) и контрольного (питательная среда, содержащая минеральные соли по прописи МС) вариантов. Ко всем вариантам питательных сред добавляли БАП 1 мг/л и ИУК 0,5 мг/л. Асептическую культуру выращивали в световой комнате, где поддерживалась температура 23°С, 16-ти часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами. Учет результатов проводили на 30 сутки с момента посева семян in vitro. Результаты приведены на рисунках 5-7.

Экспериментально установлено, что на питательной среде, полученной на основе суспензии хлореллы, повышается морфофизиологическая активность пазушных и верхушечных почек, которая проявляется в их активном росте, что сказывается на биометрических показателях.

Пример 3. Объект исследования - микроводоросль хлорелла. Выращивали на питательной среде, содержащей разную концентрацию макросолей по прописи МС (¼ нормы МС, ½ нормы МС, 1 нормы МС, 1,5 нормы МС). После высева хлореллы в питательную среду определяли оптическую плотность раствора (оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Сагу-50, Varian, США). Выращивание хлореллы проводят при температуре 24±1, 16-часовом фотопериоде, освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью освещения 3 тыс.лк в течение 5 суток. По истечению 5 суток вновь измеряли оптическую плотность суспензии для определения прироста биомассы, а также подсчитывали индекс роста (I) и удельную скорость роста (μ) (Табл. 2).

Экспериментально установлено, что при концентрации макросолей ¼ МС наблюдали самый высокий индекс роста, удельную скорость роста суспензии хлореллы, и была самая высокая оптическая плотность. Это свидетельствует о том, что в такой питательной среде накапливается больше экзометаболитов хлореллы по сравнению с другими вариантами и контролем, которые оказывают стимулирующий эффект при прорастании семян и формировании микропобегов in vitro. Поэтому данный вариант питательной среды рекомендуем для выращивания суспензии хлореллы, которая в дальнейшем будет использована в качестве базовой среды для культивирования семян и микрочеренков in vitro.

Предлагаемый способ культивирования in vitro растительных эксплантов (семян, микрочеренков и микропобегов) сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать его в практической работе и для культивирования растений разных таксономических групп:

1. Технология предполагает использовать в небольших количествах легкодоступный, дешевый материал хлореллы (можно купить в магазине).

2. Технология предполагает проведение работ в лабораторных условиях независимо от сезона.

3. Предлагаемая технология легка в исполнении и не требует привлечения дорогостоящего оборудования.

4. Предлагаемый способ позволяет получить экономическую эффективность при клонировании растений in vitro за счет использования дешевой питательной среды,

5. Предлагаемый способ позволяет быстро получать качественный посадочный материал.

6. Предлагаемый способ является универсальным для культивирования in vitro растений разных таксономических групп.

Заявляемое изобретение направлено на разработку универсального способа культивирования растений in vitro разных таксономических групп на питательной среде, полученной на основе суспензии микроводоросли хлореллы. Известных в научно-технической и патентной литературе способов с аналогичным составом питательной среды не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением универсальной питательной среды для культивирования in vitro растений разных таксономических групп, не достигался в известных решениях.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования растений in vitro разных таксономических групп, что достигается за счет использования суспензии хлореллы, в качестве основы питательной среды, которую получают первоначально на безгормональной питательной среде, содержащей ¹/₄ нормы макросолей по прописи Мурасига и Скуга, после 5 суток выращивания в суспензию добавляют 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, цитокинин 6-бензиламинопурин в концентрации 1 мг/л и ауксин индолил-3-уксусную кислоту 0,5 мг/л и используют для клонирования растений на этапе микроразмножения. Изобретение позволяет повысить всхожесть семян и биометрические показатели проростков. 7 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ культивирования растений in vitro разных таксономических групп, включающий получение проростков из семян, или микрочеренков, или микропобегов растений in vitro на питательной среде, содержащей макросоли по прописи Мурасига и Скуга, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют суспензию хлореллы, которую первоначально выращивают на безгормональной питательной среде, содержащей ¹/₄ нормы макросолей по прописи Мурасига и Скуга, после 5 суток выращивания в суспензию добавляют 20 г/л сахарозы, 8 г/л агара, цитокинин 6-бензиламинопурин в концентрации 1 мг/л и ауксин индолил-3-уксусную кислоту 0,5 мг/л.