КЛЕТОЧНО-РЕАКТИВНЫЕ АНАЛОГИ КОМПСТАТИНА, АНАЛОГИ КОМПСТАТИНА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ИЛИ АНАЛОГИ КОМПСТАТИНА НАЦЕЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ Российский патент 2019 года по МПК C07K7/08 A61K38/10 A61K47/60 A61P37/00 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/727094, поданной 15 ноября 2012 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Уровень техники

[0002] Система комплемента представляет собой состоящую более чем из 30 белков плазмы и клеточно-связанных белков систему, играющую важную роль как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете. Белки системы комплемента функционируют в виде серий ферментативных каскадов за счет разнообразных белковых взаимодействий и процессов расщепления. Активация комплемента происходит тремя основными путями: через антителозависимый классический путь, альтернативный путь и манноза-связывающий лектиновый (MBL) путь. Ненадлежащая или избыточная активация комплемента является основной причиной или фактором, способствующим развитию ряда серьезных заболеваний и состояний, и на протяжении последних нескольких десятилетий на изучение различных ингибиторов комплемента для применения в качестве терапевтических агентов были направлены значительные усилия. Тем не менее, по-прежнему имеется потребность в инновационных подходах к ингибированию активации комплемента для различных терапевтических целей.

Краткое описание изобретения

[0003] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены клеточно-реактивные аналоги компстатина. Например, в настоящем изобретении предложены клеточно-реактивные аналоги компстатина, композиции, содержащие клеточно-реактивные аналоги компстатина, и способы получения, идентификации, описания и/или применения клеточно-реактивных аналогов компстатина. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена физиологически приемлемая композиция, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина.

[0004] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина длительного действия. Например, в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина длительного действия, композиции, содержащие аналоги компстатина длительного действия, и способы получения, идентификации, описания и/или применения аналогов компстатина длительного действия. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена физиологически приемлемая композиция, содержащая аналог компстатина длительного действия. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая аналог компстатина длительного действия.

[0005] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина нацеленного действия. Например, в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина нацеленного действия, композиции, содержащие аналоги компстатина нацеленного действия, и способы получения, идентификации, описания и/или применения аналогов компстатина нацеленного действия. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена физиологически приемлемая композиция, содержащая аналог компстатина нацеленного действия. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая аналог компстатина нацеленного действия.

[0006] В настоящем изобретении также предложены способы защиты клетки от комплемент-опосредованного повреждения. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают приведение указанной клетки в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина. Указанная клетка может относиться к любому типу клеток согласно различным вариантам реализации. Например, согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка представляет собой клетку крови. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка крови представляет собой красную клетку крови (кКК), также называемую эритроцитом. Согласно некоторым вариантам реализации в указанной клетке наблюдается аномально низкий уровень экспрессии, поверхностной плотности и/или активности одного или большего количества регуляторных белков комплемента. Например, указанная клетка может содержать мутацию в гене, кодирующем такой белок, отличающуюся тем, что указанная мутация приводит к снижению или отсутствию экспрессии и/или снижению активности кодируемого белка. Указанная клетка может относиться к любому типу клеток животных или любых видов согласно различным вариантам реализации. Например, указанная клетка может представлять собой клетку млекопитающего, например, примата (человека или не являющегося человеком примата), грызуна (например, мыши, крысы, кролика), копытного (например, свиньи, овцы, коровы), собачьих или кошачьих. Согласно многим вариантам реализации указанная защита представляет собой защиту от комплемента приматов, например, комплемента человека. Согласно некоторым вариантам реализации контакт с указанной клеткой происходит ex vivo (вне организма субъекта). Согласно некоторым вариантам реализации контакт с указанной клеткой происходит in vivo (у субъекта, например, у человека). Согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка предназначена для трансплантации субъекту или была трансплантирована субъекту. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена выделенная клетка, к которой ковалентно присоединен аналог компстатина. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложен выделенная ткань или орган, по меньшей мере к некоторым из клеток которой присоединен аналог компстатина.

[0007] В настоящем изобретении предложены способы лечения субъекта, нуждающегося в лечении комплемент-опосредованного расстройства. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает введение клеточно-реактивного аналога компстатина указанному субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает введение аналога компстатина длительного действия указанному субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия представляет собой клеточно-реактивный аналог компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанное комплемент-опосредованное расстройство представляет собой пароксизмальную ночную гемоглобинурию (ПНГ), атипичный гемолитико-уремический синдром (аГУС) или другое расстройство, связанное с комплемент-опосредованным гемолизом. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство представляет собой ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение (например, в результате инфаркта миокарда, тромбоэмболического инсульта или хирургического вмешательства. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство представляет собой травму. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство представляет собой отторжение трансплантата. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство представляет собой хроническое респираторное расстройство, например, астму или ХОЗЛ.

[0008] Все статьи, издания, патентные заявки, патенты, другие публикации, вебсайты и базы данных, упоминаемые в настоящем документе, включены в нее посредством ссылок. В случае противоречия между настоящим описанием и любой из включенных ссылок настоящее описание (включая любые поправки к нему) будет иметь решающее значение. Если не указано иное, в настоящем документе используются принятые в соответствующих областях техники значения терминов и сокращения. При реализации некоторых описанных в настоящем документе аспектов могут использоваться стандартные техники молекулярной биологии, культивирования клеток, технология рекомбинантных нуклеиновых кислот (например, ДНК), иммунологии и/или синтеза, детекции, манипулирования и количественного определения нуклеиновых кислот и полипептидов, и т.п., соответствующие квалификации специалиста в данной области техники. См., например: Ausubel, F., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science, Current Protocols in Cell Biology, выпущенные издательством John Wiley & Sons, N.Y., например, издание, актуальное на январь 2010 или более позднее; Sambrook, Russell, and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001; 4^th ed, 2012.

Краткое описание чертежей

[0009] На фиг. 1 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности аналога компстатина СА28 (SEQ ID NO: 28) и трех аналогов компстатина длительного действия (СА28-1, СА28-2, СА28-3) как функции от концентрации пептида (мкМ). Ингибирование активации комплемента исследовали in vitro с применением анализа ингибирования классического пути комплемента. На графике представлены значения, полученные усреднением результатов двух серий измерений. СА28 (круги; красный цвет), СА28-1 (кресты (х); синий цвет); СА28-2 (треугольники, зеленый цвет), СА28-3 (квадраты (фиолетовый цвет)

[0010] На фиг. 2 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-2 и СА28-3 как функции от концентрации соединения (мкМ). СА28 (квадраты, светло-серый), СА28-2 (ромбы, черный цвет), СА28-3 (круги, темно-серый цвет). СА28-3 представляет собой соединение, которое содержит несколько пептидных фрагментов. Хотя активность, приходящаяся на пептидный фрагмент, меньше активности отдельной молекулы СА28, общая активность СА28-3 в пересчете на моли выше активности СА28

[0011] На фиг. 3 представлен график концентраций СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-2 и СА28-3 в плазме от времени у яванских макаков после одной внутривенной инъекции. СА28 вводили в количестве 200 мг/кг. Каждый из СА28-2 и СА28-3 вводили в количестве 50 мг/кг. При расчете доз для указанных экспериментов предполагалось, что вводимые вещества СА28-2 и СА28-3 содержат 80% активного соединения в пересчете на сухую массу. Однако при анализе образцов стандартная кривая подразумевала 100% активного соединения в пересчете на сухую массу, примерно на 30%. Таким образом, значения Cmax выше реальных Cmax. СА28 (квадраты, светло-серый), СА28-2 (треугольники, черный), СА28-3 (круги, темно-серый).

[0012] На фиг. 4 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-4 как функции от концентрации соединения (мкМ). Ингибирование активации комплемента исследовали in vitro с применением анализа ингибирования классического пути комплемента. На графике представлены значения, полученные усреднением результатов четырех серий измерений СА28-4. СА28 (квадраты, светло-серый цвет), СА28-4 (кресты, черный цвет).

[0013] На фиг. 5 представлен график, отражающий зависимость концентраций от времени для СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-2, СА28-3 и СА28-4 у яванских макаков после одной внутривенной инъекции. СА28 вводили в количестве 200 мг/кг. Каждый из СА28-2, СА28-3 и СА28-4 вводили в количестве 50 мг/кг. При расчете доз для указанных экспериментов предполагалось, что вводимые вещества СА28-2 и СА28-3 содержат 80% активного соединения в пересчете на сухую массу. Однако при анализе образцов стандартная кривая подразумевала 100% активного соединения в пересчете на сухую массу. Таким образом, значения Cmax превосходят значения Cmax, которые были бы получены при введении указанных соединений в означенных дозах в пересчете на сухую массу, примерно на 30%. СА28 (квадраты, светло-серый), СА28-2 (треугольники, черный), СА28-3 (круги, темно-серый), СА28-4 (перевернутые треугольники, черный).

[0014] На фиг. 6 представлена хроматограмма, демонстрирующая детекцию по ультрафиолетовому излучению (УФ) аналога компстатина длительного действия на основе ПЭГ с применением ВЭЖХ с обращенной фазой. Пик со временем удерживания (RT) 33,68 минут соответствует пегилированному аналогу компстатина и имеет относительную площадь 96%.

[0015] На фиг. 7 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и аналогов компстатина длительного действия, как функции от концентрации соединения (мкМ). CA28-2CS (ромбы, красный цвет); CA28-2GS (кресты, синий цвет); CA28-2HS (треугольники, зеленый цвет); CA28-2TS (квадраты, черный цвет).

[0016] На фиг. 8 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и бифункционализированного аналога компстатина длительного действия, CA28-2GS-BF, как функции от концентрации соединения (микромоли). СА28 (незакрашенные круги, синий цвет); CA28-2G-SBF (закрашенные круги, красный цвет)

[0017] На фиг. 9 представлен график, отражающий зависимость концентрации в плазме от времени СА28 и аналога компстатина длительного действия CA28-2GS-BF у яванских макаков либо после одной внутривенной инъекции (СА28 (квадраты, красный цвет) и CA28-2GS-BF (круги, фиолетовый), либо при введении посредством подкожной инъекции один раз в сутки в течение 7 дней (только CA28-2GS-BF, звездочки, синий цвет). CA28-2GSBF вводили в концентрации 25 мг/мл. Объем дозы составлял 2 мл/кг для в/в и 0,28 мл/кг/день для подкожного введения. Данные для СА28 получали в ходе другого эксперимента, в котором указанное соединение также содержалось в 5% декстрозе, а его концентрация составляла 20 мг/мл при объеме дозы 10 мл/кг. Основа в каждом случае была представлена 5% декстрозой в виде.

[0018] На фиг. 10(A) и 10(B) приведены графики, отражающие процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и бифункционализированного аналога компстатина длительного действия, CA28-2TS-BF, как функции от концентрации соединения (микромоли). (А) Ингибирование классического пути с помощью СА28 (круги, красный цвет) и CA28-2TS-BF (кресты, синий цвет). (В) Ингибирование альтернативного пути. СА28 (круги, красный цвет) и CA28-2TS-BF (кресты, синий цвет).

[0019] На фиг. 10(C) (при размере фрагмента ПЭГ 40 кДа) показана структура CA28-2TS-BF.

[0020] На фиг. 11 представлен график, отражающий зависимость концентрации в плазме от времени СА28 и аналога компстатина длительного действия CA28-2TS-BF у яванских макаков после одной внутривенной инъекции СА28 в дозе 200 мкг/кг (квадраты, красный цвет), одной внутривенной инъекции CA28-2TS-BF в дозе 7 мкг/кг (звездочки, фиолетовый), однократной подкожной инъекции CA28-2TS-BF в дозе 7 мкг/кг (круги, синий цвет) или подкожной инъекции CA28-2TS-BF в дозе 7 мкг/кг один раз в сутки в течение 7 последовательных дней (перевернутые треугольники, зеленый цвет). Основа в каждом случае представляла собой 5% декстрозы в воде.

[0021] На фиг. 12 показан анализ с применением проточной цитометрии отложения С3 на красных клетках крови пациента с ПНГ, на которые воздействовали активированным комплементом в модифицированном тесте Хэма. (А) Представлены результаты эксперимента с разведениями, демонстрирующего эффект СА28 на отложение С3. (В) Представлены результаты эксперимента с разведениями, демонстрирующего эффект CA28-2GS-BF на отложение С3. Использованные концентрации соединения приведены на каждой панели и над ней.

[0022] На фиг. 13 показан анализ с применением проточной цитометрии отложение С3 на красных клетках крови пациента с ПНГ, на которые воздействовали активированным комплементом в модифицированном тесте Хэма в отсутствие ингибиторов комплемента (левая панель), в присутствии моноклонального антитела против С5 экулизумаба (средняя панель) и в присутствии CA28-2GS-BF (правая панель).

Подробное описание некоторых вариантов реализации изобретения

[0023] I. Определения

[0024] Термины «приблизительно» или «примерно» в отношении числа обычно включают числа, попадающие в диапазон ±10%, согласно некоторым вариантам реализации ±5%, согласно некоторым вариантам реализации ±1%, согласно некоторым вариантам реализации ±0,5% от числа, если не указано или иным образом очевидно из контекста иное (за исключением случаев, когда такое число недопустимым образом превышает 100% от возможного значения).

[0025] «Компонент комплемента» или «белок комплемента» представляет собой белок, вовлеченный в активацию системы комплемента или принимающий участие в одной или более комплемент-опосредованной активности. Компоненты классического пути комплемента включают, например, C1q, C1r, C1s, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8, С9 и C5b-9-комплекс, также называемый мембраноатакующим комплексом (МАК), и активные фрагменты или продукты ферментативного расщепления каких-либо из вышеперечисленных компонентов (например, С3а, C3b, С4а, C4b, С5а и т.п.). Компоненты альтернативного пути включают, например, факторы В, D и пропердин. Компоненты лектинового пути включают, например, MBL2, MASP-1 и MASP-2. Компоненты комплемента также включают клеточно-связанные рецепторы растворимых компонентов комплемента, отличающиеся тем, что указанный рецептор опосредует одну или несколько биологических активностей такого растворимого компонента комплемента после связывания указанного растворимого компонента комплемента. Такие рецепторы включают, например, рецептор С5а (C5aR), рецептор С3а (C3aR), рецептор комплемента 1 (CR1), рецептор комплемента 2 (CR2), рецептор комплемента 3 (CR3, также известный как CD45) и т.п. Следует иметь в виду, что термин «компонент комплемента» не подразумевает включение таких молекул и молекулярных структур, которые служат в качестве «триггеров» для активации комплемента, например, комплексов антиген-антитело, чужеродных структур, обнаруживаемых на поверхностях микроорганизмов или искусственных поверхностях, и т.п.

[0026] «Комплемент-опосредованное расстройство» представляет собой любое расстройство, для которого, согласно имеющимся данным или предположениям, по меньшей мере у некоторых субъектов, страдающих от указанного расстройства, активация комплемента является способствующим и/или по меньшей мере отчасти причинным фактором; например, расстройства, при которых активация комплемента приводит к повреждению тканей. Неограничивающие примеры комплемент-опосредованных расстройств включают, не ограничиваясь перечисленными, (i) различные расстройства, характеризующиеся гемолизом или гемолитической анемией, такие как атипичный гемолитико-уремический синдром, болезнь холодовых агглютининов, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, трансфузионные реакции; (ii) отторжение трансплантата (например, сверхострое или острое отторжение трансплантата) или дисфункция трансплантата; (iii) расстройства, включающие ишемическое/реперфузионное повреждение, такие как травма, хирургическое вмешательство (например, реконструкция при аневризме), инфаркт миокарда, ишемический инсульт; (iv) расстройства дыхательной системы, такие как астма и хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ); (v) артрит, например, ревматоидный артрит; (vi) глазные расстройства, такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), диабетическая ретинопатия, глаукома и увеит. Термин «расстройство» в настоящем документе применяют взаимозаменяемо с терминами «заболевание», «состояние» и аналогичными терминами, для обозначения любого нарушения здоровья или состояния анормального функционирования организма, например, любого состояния, при котором показана организация медицинского ухода и/или хирургического вмешательства, или в связи с которым субъект обращается за надлежащей медицинской и/или хирургической помощью. Следует также понимать, что конкретные расстройства перечислены в конкретных категориях для удобства и это не подразумевает ограничения настоящего изобретения. Следует понимать, что определенные расстройства могут быть перечислены в нескольких подходящих категориях.

[0027] «Регуляторный белок комплемента» представляет собой белок, вовлеченный в регуляцию активности комплемента. Регуляторный белок комплемента может понижающе регулировать активность комплемента, например, ингибируя активацию комплемента или инактивируя или ускоряя разрушение одного или большего количества активированных белков комплемента. Примеры регуляторных белков комплемента включают ингибитор С1, связывающий С4 белок, кластерин, витронектин, CFH, фактор I и клеточно-связанные белки CD46, CD55, CD59, CR1, CR2 и CR3.

[0028] «Выделенный» в настоящем документе означает 1) отделенный от по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми изначально обычно имеется связь в природе; 2) обработанный или очищенный с применением способа, включающего участие человека; и/или 3) не встречающийся в природе, например, присутствующий в искусственной среде. В целом, если не указано или иным образом не очевидно иное, любое вещество, продукт, агент, композиция и т.п., может при необходимости считаться «выделенным».

[0029] «Связанный» в настоящем документе в отношении двух или большего количества фрагментов означает, что указанные фрагменты физически связаны или соединены друг с другом с образованием достаточно стабильной молекулярной структуры, так что указанные фрагменты остаются связанными в условиях, при которых образуется указанная связь, и, предпочтительно, в условиях, при которых применяют указанную новую молекулярную структуру, например, в физиологических условиях. Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения указанная связь представляет собой ковалентную связь. Согласно другим вариантам реализации указанная связь является нековалентной. Фрагменты могут быть связаны либо прямо, либо непрямо. Если два фрагмента прямо связаны, они либо ковалентно связаны друг с другом, либо находятся на достаточно близком расстоянии, так что их связь поддерживается за счет межмолекулярных сил между указанными двумя фрагментами. Если два фрагмента связаны непрямо, каждый из них связан либо ковалентно, либо нековалентно с третьим фрагментом, за счет которого поддерживается связь между указанными двумя фрагментами. В целом, если говорится, что два фрагмента связаны «соединяющим фрагментом» или «соединяющей частью», связь между указанными двумя связанными фрагментами является непрямой, и, как правило, каждый из связанных фрагментов ковалентно связан с соединяющим фрагментом. Два фрагмента могут быть связаны с помощью «линкера». Линкер может представлять собой любой подходящий фрагмент, который вступает в реакцию с указанными соединениями, связывая их за разумный период времени, в условиях, соответствующих стабильности указанных соединений (участки которых могут быть защищены в надлежащих случаях, в зависимости от условий), в достаточном количестве, с удовлетворительным выходом. Как правило, линкер содержит по меньшей мере две функциональные группы, одна из которых вступает в реакцию с первым соединением, а другая вступает в реакцию с вторым соединением. Следует иметь в виду, что после того, как линкер прореагировал со связываемыми соединениями, термин «линкер» может относиться к части полученной структуры, которая происходит из указанного линкера, или, по меньшей мере, к части, которая не включает прореагировавшие функциональные группы. Соединяющий фрагмент может содержать часть, не участвующую в образовании связи с соединяемыми соединениями, основное назначение которой может состоять в пространственном разделении указанных соединений. Такая часть может называться «спейсером».

[0030] В настоящем документе фраза «физиологические условия» относится к совокупности условий, таких как температура, концентрация солей, рН, которые по меньшей мере частично имитируют условия, как правило, наблюдаемые в организме живого субъекта, например, субъекта-млекопитающего. Согласно некоторым аспектам физиологические условия относятся к условиям в водной среде, например, в среде, содержащей по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 97%, 99% или примерно 100% воды по объему. Согласно некоторым вариантам реализации другие жидкости, если они присутствуют, по существу не влияют на вторичную или третичную структуру белка. Согласно некоторым вариантам реализации физиологические условия по меньшей мере частично имитируют условия, наблюдаемые в физиологической жидкости, такой как кровь или внеклеточная жидкость, например, в интерстициальной жидкости, например, субъекта-млекопитающего. Разнообразные физиологические условия, подходящие для, например, анализов in vitro, известны в данной области техники. Обычно среда в физиологических условиях содержит физиологическую концентрацию соли, например, хлорида натрия. Согласно некоторым вариантам реализации физиологическая концентрация соли относится к концентрации, варьирующей в диапазоне от примерно 250 мОсм/л до примерно 350 мОсм/л, например, примерно 275 мОсм/л до примерно 325 мОсм/л, например, примерно 300 мОсм/л. Согласно некоторым вариантам реализации физиологические условия являются приблизительно изотоническими относительно физиологической жидкости, например, крови или внеклеточной жидкости, например, интерстициальной жидкости. Согласно некоторым вариантам реализации физиологические условия включают значения рН, варьирующие в диапазоне от примерно 6,5 до примерно 7,8, например, от примерно 7,0 до примерно 7,5. Согласно некоторым вариантам реализации физиологическая среда содержит буферное вещество, способствующее поддержанию рН среды в физиологическом диапазоне. Согласно некоторым вариантам реализации физиологические условия включают такие условия, что типичный белок млекопитающих, например, белок, который, как правило, присутствует в физиологической жидкости, такой как кровь или внеклеточная жидкость, по существу сохраняет вторичную и, в соответствующих случаях, третичную структуру, которой такой белок обладает в физиологической жидкости, в которой обычно присутствует. Согласно некоторым вариантам реализации компоненты физиологической среды, как правило, по существу нетоксичны для клеток млекопитающих в концентрации, в которой они присутствуют в физиологической среде. Разнообразные физиологические среды (иногда называемые «буферами») перечислены в различных стандартных источниках, такие как цитируемые выше (например, Sambrook, et al., Protocols series). Согласно некоторым вариантам реализации физиологическая температура варьирует в диапазоне от примерно 25 градусов С примерно до 38 градусов С, например, примерно от 30 градусов С примерно до 37 градусов С, например, от 35 градусов С до 37 градусов С.

[0031] «Полипептид» в настоящем документе относится к аминокислотному полимеру, необязательно включающему один или большее количество аналогов аминокислот. Белок представляет собой молекулу, состоящую из одного или большего количества полипептидов. Пептид представляет собой относительно короткий полипептид, длина которого, как правило, составляет примерно от 2 до 60 аминокислот, например, от 8 до 40 аминокислот. Термины «белок», «полипептид» и «пептид» могут использоваться взаимозаменяемо. Полипептиды в настоящем документе могут включать аминокислоты, такие как встречающиеся в белках в природе, аминокислоты, не встречающиеся в белках в природе и/или аналоги аминокислот, которые не являются аминокислотами. В настоящем документе «аналог» аминокислоты может представлять собой другую аминокислоту, структурно сходную с указанной аминокислотой, или соединение, не являющееся аминокислотой, структурно сходное с указанной аминокислотой. Существует значительное число известных в данной области техники аналогов 20 аминокислот, обычно обнаруживаемых в белках («стандартных» аминокислот). Одна или большее количество аминокислот полипептида может быть модифицирована, например, добавлением химического соединения, такого как углеводная группа, фосфатная группа, фарнезильная группа, изофарнезильная группа, жирнокислотная группа, линкер для конъюгирования, функционализирования или другой модификации, и т.п. Определенные подходящие неограничивающие аналоги и модификации описаны в WO 2004026328 и/или ниже. Указанный полипептид может быть ацетилирован, например, на N-конце и/или амидирован, например, на С-конце.

[0032] Термин «очищенный» в настоящем документе относится к веществам, которые были отделены от по меньшей мере некоторых или большинства компонентов, с которыми они связаны в природе или исходно при получении, или с которыми они были связаны перед очищением. В целом, такое очищение включает участие человека. Очищенные агенты могут быть частично очищенными, по существу очищенными или чистыми. Такие агенты могут быть, например, чистыми по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более чем на 99%. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновую кислоту, полипептид или малую молекулу очищают таким образом, что он(а) составляет по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более от общего количества материала с нуклеиновой кислотой, полипептидом или малой молекулой, соответственно, присутствующего в составе. Согласно некоторым вариантам реализации органическое вещество, например, нуклеиновую кислоту, полипептид или малую молекулу очищают таким образом, что он(а) составляет по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более от общего количества органического материала, присутствующего в составе. Оценка чистоты может быть основана, например, на сухой массе, размере пиков при хроматографическом определении (GC, ВЭЖХ и т.п.), распространенности молекул, электрофоретических методах, интенсивности полос на геле, спектроскопических данных (например, ЯМР), элементного анализа, высокопроизводительном секвенировании, масс-спектрометрии или любом принятом в данной области техники методе количественного определения. Согласно некоторым вариантам реализации вода, буферные вещества, ионы и/или малые молекулы (например, синтетические предшественники такие как нуклеотиды или аминокислоты), могут необязательно присутствовать в очищенном составе. Очищенный агент может быть получен путем отделения от других веществ (например, других клеточных материалов), или путем синтеза таким образом, что достигается требуемая степень чистоты. Согласно некоторым вариантам реализации «частично очищенный» в отношении молекулы, продуцируемой клеткой, означает, что молекула, продуцируемая клеткой, более не присутствует в указанной клетке, например, клетка была лизирована и, необязательно, по меньшей мере некоторый клеточный материал (например, клеточная стенка, клеточная(ые) мембрана(ы), клеточная(ые) органелла(ы) был удален, и/или указанная молекула была отделена или изолирована от по меньшей мере некоторых молекул того же типа (белок, РНК, ДНК и т.п.), присутствовавших в лизате.

[0033] «Рекомбинантные клетки-хозяева», «клетки-хозяева» и другие подобные термины обозначают прокариотические или эукариотические клетки или линии клеток, которые содержат экзогенную нуклеиновую кислоту (как правило, ДНК), такую как экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует представляющий интерес полипептид. Следует понимать, что такие термины включают потомков исходной(ых) клетки(клеток), в которую(ые) был(а) введен(а) вектор или другая нуклеиновая кислота. Подходящие клетки-хозяева включают любые клетки, обычно используемые в данной области техники для экспрессирования полинуклеотидов (например, для получения полипептида(ов), кодируемого(ых) такими полинуклеотидами), включая, например, прокариоты, такие как Е. coli или другие бактерии, такие как виды Escherichia; Lactobacillus, Bacillus (например, В subtilis), Salmonella Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus и т.п.; и эукариоты, включая, например, грибы, такие как дрожжи (например, Pichia (например, Pichia pastoris), Kluyveromyces, например, K. lactis, Hansenula, например, Н. polymorpha). Примеры других грибных клеток представлены клетками мицелиальных грибов, например, Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. или Trichoderma spp., например, штаммов A. oryzae, A. nidulans или A. niger; клетками насекомых (например, Sf9), растительными клетками и клетками животных, например, клетками млекопитающих, таких как СНО, R1.1, B-W, L-M, клетками почек африканских зеленых мартышек (например, COS-1, COS-7, BSC-1, BSC-40 и ВМТ-10) и культивируемых клеток человека. Также охвачены генетически модифицированные клетки генетически модифицированных (например, трансгенных) растений и животных, отличающиеся тем, что рекомбинантный полипептид продуцируются по меньшей мере некоторыми такими клетками. Полипептид может секретироваться в молоко, быть получен из растительного материала и т.п. Экзогенная нуклеиновая кислота может стабильно поддерживаться в виде эписомы, такой как плазмида, или может по меньшей мере частично быть интегрирована в геном клетки-хозяина, необязательно после копирования или обратного транскрибирования. Такие термины, как «клетки-хозяева» и т.п., также используются для обозначения клеток или линий клеток, которые могут использоваться в качестве реципиентов экзогенной нуклеиновой кислоты перед введением нуклеиновой кислоты. «Рекомбинантный полинуклеотид» обычно представляет собой полинуклеотид, который содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые не встречаются в природе в напрямую связанном виде. Например, указанные последовательности нуклеиновых кислот могут встречаться в разных генах или у разных видов, или одна или большее количество указанных последовательностей могут представлять собой вариант встречающейся в природе последовательности, или могут по меньшей мере частично представлять собой искусственную последовательность, не являющуюся гомологичной встречающейся в природе последовательности. «Рекомбинантный полипептид» обычно представляет собой полипептид, по меньшей мере частично получаемый путем транскрипции и трансляции экзогенной нуклеиновой кислоты рекомбинантной клеткой-хозяином или бесклеточной экспрессионной системой in vitro, и/или содержащий последовательности аминокислот, которые не встречаются в природе в напрямую связанном виде. В последнем случае рекомбинантный полипептид может называться «гибридным полипептидом». Последовательности аминокислот в гибридном полипептиде могут, например, встречаться в разных генах или у разных видов, или одна или большее количество последовательностей могут представлять собой вариант встречающейся в природе последовательности или могут по меньшей мере частично представлять собой искусственную последовательность, не являющуюся идентичной или согласно некоторым вариантам реализации не являющуюся гомологичной встречающейся в природе последовательности на участке, составляющем значительную часть длины. Следует понимать, что гибридный полипептид может содержать два или большее количество полипептидов. Например, первый и второй полипептиды А и В гибридного полипептида могут быть непосредственно связаны (А-В или В-А) или могут быть разделены частью третьего полипептида С (А-С-В или В-С-А). Согласно некоторым вариантам реализации часть С представлена полипептидным линкером, который может, например, содержать несколько остатков глицина и/или серина, или любые из широкого ряда других аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации два или большее количество полипептидов могут быть связаны неполипептидным(и) линкером(ами). «Рекомбинантный» в настоящем документе охватывает, согласно определенным вариантам реализации, полипептиды, полученные путем присоединения (например, химическим конъюгированием, ферментативным конъюгированием) более коротких рекомбинантных полипептидов, которые могут быть получены в рекомбинантных клетках-хозяевах. Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантный полипептид может содержать сигнальную последовательность, направляющую секрецию указанного полипептида, или последовательность, направляющую экспрессированный полипептид в конкретный компартмент или органеллу. Подходящие последовательности известны в данной области техники. Могут быть выбраны последовательности, подходящие для представляющего интерес типа клетки-хозяина (например, бактериальные, грибные, клетки млекопитающих, растений и т.п.). Согласно некоторым вариантам реализации сигнальная последовательность может быть расположена на N-конце или С-конце или около него (например, в пределах 10-50 аминокислот). Согласно некоторым вариантам реализации полипептид содержит метку. Метка может быть полезна для облегчения детекции и/или очищения содержащего ее белка. Примеры меток включают полигистидиновую метку (например, метка 6X-His) (SEQ ID NO: 69), глутатион-S-трансферазу, мальтоза-связывающий белок, метку NUS, метку SNUT, метку Strep, эпитопные метки, такие как V5, НА, Мус или FLAG. Согласно некоторым вариантам реализации сайт расщепления протеазы расположен в области между меткой и полипептидом, что позволяет отделить полипептид от метки посредством воздействия протеазой. Согласно некоторым вариантам реализации полинуклеотид, который кодирует рекомбинантный полипептид, по меньшей мере частично кодон оптимизирован для экспрессии в представляющей интерес клетке-хозяине (например, бактериальной, грибной, клетке млекопитающего, растения и т.п.). Метка может быть расположена на N- или С-конце или рядом с ним (например, в пределах 10-50 аминокислот) полипептида согласно различным вариантам реализации. Рекомбинантный полипептид может быть выделен, очищен и т.п. с применением любых из разнообразных способов. См., например, Sambrook, Protocols series, или другие стандартные источники. Способы применения могут включать, например, диализ (например, с применением мембран с заданным размером пор), хроматографию, преципитацию, очищение в геле или аффинные методы, при которых может, согласно некоторым вариантам реализации, использоваться метка или специфический связывающий реагент, такой как антитело.

[0034] Термин «реактивные функциональные группы» в настоящем документе относится к группам, включающим, не ограничиваясь перечисленными, олефины, ацетилены, спирты, фенолы, простые эфиры, оксиды, галиды, альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, цианаты, изоцианаты, тиоцианаты, изотиоцианаты, амины, гидразины, гидразоны, гидразиды, диазогруппы, диазоний, нитрогруппы, нитрилы, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, сульфоксиды, сульфоны, сульфоновые кислоты, сульфиновые кислоты, ацетали, кетали, ангидриды, сульфаты, изонитрилы сульфеновой кислоты, амидины, имиды, имидаты, нитроны, гидроксиламины, оксимы, гидроксамовые кислоты, тиогидроксамовые кислоты, аллены, ортоэфиры, сульфиты, енамины, инамины, мочевины, псевдомочевины, семикарбазиды, карбодиимиды, карбаматы, имины, азиды, азосоединения, азоксисоединения и нитрозосоединения, сложные эфиры н-гидроксисукцинимида, малеимиды, сульфгидрилы и т.п. Способы получения каждой из указанных функциональных групп общеизвестны в данной области техники, и их применение или модификация для конкретной цели находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники (см., например, Sandler and Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989, и Hermanson, G., Bioconjugate Techniques, 2^nd ed., Academic Press, San Diego, 2008).

[0035] «Специфическое связывание» обычно относится к физической связи между целевым полипептидом (или, в более общем случае, целевой молекулой) и связывающей молекулой, такой как антитело или лиганд. Связывание, как правило, зависит от наличия конкретной структурной особенности мишени, такой как антигенная детерминанта, эпитоп, связывающий карман или углубление, распознаваемой связывающей молекулой. Например, если антитело специфично в отношении эпитопа А, присутствие полипептида, содержащего эпитоп А, или присутствие свободного немеченого А в реакции, включающей и свободный меченый А, и связывающую молекулу, присоединяющуюся к нему, снизит количество меченого А, который связывается с указанной связывающей молекулой. Следует понимать, что специфичность не обязательно должна быть абсолютной, и обычно относится к контексту, в котором происходит связывание. Например, в данной области техники общеизвестно, что многие антитела перекрестно реагируют с другими эпитопами, помимо имеющихся в целевой молекуле. Такая перекрестная реакционная способность может быть приемлемой, это зависит от предполагаемого применения антитела. Специалист в данной области техники сможет отобрать антитела или лиганды с достаточной степенью специфичности, подходящие для любого конкретного применения (например, для обнаружения целевой молекулы, для терапевтических целей и т.п.). Следует также понимать, что специфичность может оцениваться в контексте дополнительных факторов, таких как аффинность связывающей молекулы в отношении мишени относительно аффинности указанной связывающей молекулы в отношении других мишеней, например, конкурентных. Если связывающая молекула проявляет высокую аффинность в отношении целевой молекулы, которую необходимо обнаруживать с ее помощью, и низкую аффинность в отношении нецелевых молекул, указанное антитело, вероятно, является приемлемым реагентом. После того как специфичность связывающей молекулы в одном или нескольких контекстах установлена, она может применяться в других, предпочтительно сходных, контекстах без необходимости повторных проверок ее специфичности. Согласно некоторым вариантам реализации аффинность (по оценке равновесной константы диссоциации, Kd) двух молекул, демонстрирующих специфическое связывание, составляет 10^-3 М или менее, например, 10^-4 М или менее, например, 10^-5 М или менее, например, 10^-6М или менее, 10^-7М или менее, 10^-8М или менее, или 10^-9 М или менее в протестированных условиях, например, в физиологических условиях.

[0036] «Субъект», лечение которого проводят в соответствии с настоящим изобретением, как правило, представляет собой человека, не являющегося человеком примата или низшее животное (например, мышь или крысу), у которого экспрессируется или присутствует по меньшей мере какой(ие)-либо компонент(ы) комплемента С3 примата (например, человека) и, необязательно, один или большее количество дополнительных компонентов комплемента примата. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является особью мужского пола. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является особью женского пола. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является взрослым, например, человеком в возрасте по меньшей мере 18 лет, например, от 18 до 100 лет. Согласно некоторым вариантам реализации возраст субъекта-человека составляет по меньшей мере 12 лет. Согласно некоторым вариантам реализации субъект является взрослым, например, человеком в возрасте по меньшей мере 18 лет, например, от 18 до 100 лет. Согласно некоторым вариантам реализации возраст субъекта составляет по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80 лет. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является ребенком, например, человеком в возрасте от 0 до 4 лет, или от 5 до 11 лет.

[0037] «Лечение» в настоящем документе в отношении лечения субъекта относится к обеспечению лечения, т.е. обеспечению любого типа организации медицинского ухода или хирургического лечения субъекта. Указанное лечение может предоставляться для того, чтобы обратить, облегчить, подавить прогрессирование, предотвратить или снизить вероятность наступления заболевания, или для того, чтобы обратить, облегчить, ингибировать или предотвратить прогрессирование, предотвратить или снизить вероятность появления одного или большего количества симптомов или проявлений заболевания. «Предотвращать» относится к предотвращению наступления заболевания, появления симптома или проявления заболевания в течение по меньшей мере некоторого периода времени по меньшей мере у некоторых индивидуумов. Лечение может включать введение соединения или композиции указанному субъекту после развития одного или большего количества симптомов или проявлений, свидетельствующих о заболевании, например, для того, чтобы обратить, облегчить, снизить тяжесть и/или подавить или предотвратить прогрессирование указанного заболевания и/или обратить, облегчить, снизить тяжесть и/или подавить один или большее количество симптомов или проявлений указанного заболевания. Соединение или композиция может быть введено субъекту, у которого развилось заболевание или имеется повышенный риск развития указанного заболевания по сравнению с представителем общей популяции. Соединение или композиция может быть введена субъекту, у которого развилось заболевание и имеется повышенный риск развития одного или нескольких конкретных симптомов, проявлений указанного заболевания или обострений указанного заболевания по сравнению с другими индивидуумами, у которых диагностировано указанное заболевание, либо по сравнению с типичным или средним риском возникновения такого симптома, проявления или обострения у указанного субъекта. Например, на указанного субъекта мог воздействовать «триггер», который обуславливает возникновение повышенного риска (в частности, временно повышенного риска) развития обострения у указанного субъекта. Соединение или композиция может быть введена профилактически, т.е. до развития какого-либо симптома или проявления указанного заболевания. Как правило, в этом случае у субъекта имеется риск развития указанного заболевания, например, относительно представителя общей популяции, необязательно имеющего совпадающие возраст, пол и/или другой(ие) демографический(ие) показатель(и).

[0038] «Вектор» может представлять собой любую из разнообразных молекул нуклеиновой кислоты, вирусов или их частей, способных опосредовать вход, например, перенос, транспорт и т.п. представляющей интерес нуклеиновой кислоты между разными генетическими средами или в клетку. Представляющая интерес нуклеиновая кислота может быть связана, например, введена в вектор с применением, например, рестрикции и лигирования. Векторы включают, например, ДНК или РНК плазмиды, космиды, встречающиеся в природе или модифицированные вирусные геномы или их части, нуклеиновые кислоты, которые могут быть упакованы в вирусные капсиды, мини-хромосомы, искусственные хромосомы и т.п. Плазмидные векторы, как правило, включают точку начала репликации (например, для репликации в прокариотических клетках). Плазмида может включать частично или полностью вирусный геном (например, вирусный промотор, энхансер, сигналы процессинга или упаковки, и/или последовательности, достаточные для получения нуклеиновой кислоты, которая может быть интегрирована в геном клетки-хозяина и/или получения инфекционного вируса). Вирусы или их части, которые могут использоваться для введения нуклеиновых кислот в клетки, могут называться вирусными векторами. Вирусные векторы включают, например, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы (например, лентивирусы, вирус осповакцины и другие поксвирусы, герпесвирусы (например, вирус простого герпеса) и др. Бакуловирус подходит, например, для применения в клетках насекомых. Известно значительное число растительных вирусных векторов, которые включают, например, основанные на или содержащие вирус мозаики цветной капусты, вирус табачной мозаики или один или большее количество их генетических элементов (например, промотор 35S вирус мозаики цветной капусты). Вирусные векторы могут содержать или не содержать достаточную вирусную генетическую информацию для продуцирования инфекционного вируса при введении в клетки-хозяева, т.е. вирусные векторы могут быть компетентными по репликации или дефектными по репликации. Согласно некоторым вариантам реализации, например, если отсутствует достаточная информация для продуцирования инфекционного вируса, она может обеспечиваться клеткой-хозяином или другим вектором, введенным в указанную клетку, например, есть требуется получение вируса. Согласно некоторым вариантам реализации такая информация не обеспечивается, например, если получение вируса не требуется. Нуклеиновая кислота для переноса может быть встроена во встречающийся в природе или модифицированный вирусный геном или его часть, или может присутствовать в вирусном капсиде в виде отдельной молекулы нуклеиновой кислоты. Вектор может содержать одну или большее количество нуклеиновых кислот, кодирующих маркер, подходящий для идентификации и/или выбора клеток, которые приняли вектор. Маркеры включают, например, различные белки, которые повышают или понижают либо устойчивость, либо чувствительность к антибиотикам или другим агентам (например, белок, придающий устойчивость к антибиотику, такому как пуромицин, гигромицин или бластицидин), ферменты, активность которых может быть детектирована с помощью анализов, известных в данной области техники (например, β-галактозидаза или щелочная фосфатаза), и белки или РНК, которые детектируемым образом влияют на фенотип экспрессирующих их клеток (например, флуоресцентные белки). Векторы часто включают один или большее количество надлежащим образом расположенных сайтов для рестрикционных ферментов, которые могут применяться для облегчения встраивания в вектор нуклеиновой кислоты, например, нуклеиновой кислоты, которую требуется экспрессировать. Экспрессионный вектор представляет собой вектор, в который была встроена или может быть встроена требуемая нуклеиновая кислота таким образом, что она (будет) функционально связана с регуляторными элементами (также называемыми «регуляторными последовательностями», «элементами контроля экспрессии» или «последовательностями контроля экспрессии») и может экспрессироваться в виде РНК-транскрипта (например, мРНК, которая может быть транслирована в белок, или некодирующая РНК). Экспрессионные векторы включают регуляторную(ые) последовательность(и), например, последовательности контроля экспрессии, достаточную(ые) для направления транскрипции функционально связанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере в некоторых условиях; другие элементы, необходимые для экспрессии или содействующие экспрессии, могут обеспечиваться, например, клеткой-хозяином или in vitro экспрессионной системой. Такие регуляторные последовательности, как правило, включают промотор и могут включать энхансерные последовательности или вышерасположенные активирующие последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации вектор может включать последовательности, кодирующие 5'-нетранслируемую область и/или 3'-нетранслируемую область, которая может содержать сигнал расщепления и/или полиаденилирования. В целом, регуляторные элементы могут содержаться в векторе до встраивания нуклеиновой кислоты, которую требуется экспрессировать, или могут содержаться во встроенной нуклеиновой кислоте, или могут быть встроены в вектор после встраивания нуклеиновой кислоты, которую требуется экспрессировать. В настоящем документе говорится, что нуклеиновая кислота и регуляторный(ые) элемент(ы) «функционально связаны», если они ковалентно связаны таким образом, что экспрессия или транскрипция указанной нуклеиновой кислоты находится под влиянием или контролем указанного(ых) регуляторного(ых) элемента(ов). Например, область промотора функционально связана с нуклеиновой кислотой, если указанная область промотора способна обеспечивать транскрипцию указанной нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области техники известно, что конкретные характеристики регуляторных последовательностей, подходящих для экспрессии генов, могут варьировать у разных видов или типов клеток, но могут в целом включать в качестве подходящих последовательности, задействованные при инициации транскрипции, процессинге РНК или инициации трансляции. Выбор и дизайн подходящего вектора и регуляторного(ых) элемента(ов) находятся в пределах возможностей и компетенции специалиста в данной области техники. Например, специалист в данной области техники может выбрать подходящий промотор (или другие последовательности контроля экспрессии) для экспрессии в клетках нужного вида (например, в прокариотических (бактериальных) или эукариотических (например, клетках грибов, растений, видов млекопитающих) или типа. Вектор может содержать промотор, способный направлять экспрессию в клетках млекопитающих, такой как подходящий вирусный промотор, например, из цитомегаловируса (ЦМВ), ретровируса, вируса обезьян (например, SV40), папилломавируса, вируса герпеса или другого вируса, инфицирующего клетки млекопитающих, или промотор млекопитающих, например, из такого гена, как EF1-альфа, ген убиквитина (например, убиквитин В или С), глобина, актина, фосфоглицераткиназы (ФГК) и т.п., или составного промотора, такого как протомор CAG (комбинация раннего энхансерного элемента ЦМВ и промотора куриного бета-актина). Согласно некоторым вариантам реализации может применяться промотор человека. Согласно некоторым вариантам реализации может использоваться, например, промотор, который обычно направляет транскрипцию эукариотической РНК-полимеразой I («промотор pol I») (промотор U6, H1, 7SK или тРНК, или его функциональный вариант). Согласно некоторым вариантам реализации используют промотор, который обычно направляет транскрипцию эукариотической РНК-полимеразой II («промотор pol II») или его функциональный вариант. Согласно некоторым вариантам реализации используют промотор, который обычно направляет транскрипцию эукариотической РНК-полимеразой III («промотор pol III»), например, промотор для транскрипции рибосомальной РНК (не являющейся 5S рРНК) или его функциональный вариант. Специалист в данной области техники может выбрать подходящий промотор для направления транскрипции представляющей интерес последовательности. Примеры экспрессионных векторов, которые могут применяться в клетках млекопитающих, включают, например, группу векторов pcDNA, группу векторов pSV2, группу векторов pCMV, группу векторов pRSV, группу векторов pEF1, векторы Gateway® и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации используют регулируемый(ые) (например, индуцируемый(ые) или репрессируемый(ые)) элемент(ы) контроля экспрессии, например, регулируемый промотор, таким образом, чтобы экспрессию можно было регулировать, например, включать или повышать, или выключать или понижать. Согласно некоторым вариантам реализации вектор может содержать полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, при этом указанная полинуклеотидная последовательность располагается в рамке с нуклеиновой кислотой, встроенной в указанный вектор, таким образом, что образуется N-концевой или С-концевой гибрид. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, кодируемый указанной полинуклеотидной последовательностью, может содержать сигнальную последовательность (которая направляет секрецию белка) или последовательность, которая направляет экспрессированный белок в конкретную органелла или локализацию в клетке, например, в ядро или митохондрии. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид содержит метку. Метка может быть полезна для облегчения детекции и/или очищения содержащего ее белка. Примеры меток включают полигистидиновую метку (например, метку 6X-His) (SEQ ID NO: 69), глутатион-S-трансферазу, мальтоза-связывающий белок, метку NUS, метку SNUT, метку Strep, эпитопные метки, такие как V5, НА, Myc или FLAG. Согласно некоторым вариантам реализации сайт расщепления протеазы расположен в области между белком, кодируемым встроенной нуклеиновой кислотой, и указанным полипептидом, позволяя удалять указанный полипептид с помощью воздействия протеазой. Векторы могут быть введены в клетки-хозяева с применением способов, известных в данной области техники. Специалист сможет выбрать подходящий способ на основе, например, вектора, типа клеток и т.п. Примеры подходящих способов включают, например, опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, трансфекцию с применением любого из разнообразных коммерчески доступных реагентов, например, на основе липидов или не на основе липидов, таких как FuGENE, липофектамин, TurboFect; электропорации; бомбардировки микрочастицами и т.п. Такие способы подробно описаны в стандартных источниках, например, у Sambrook, Protocols series, и др.

[0039] В настоящем документе термин «алифатический» обозначает фрагмент углеводорода, который может представлять собой прямую цепь (т.е. быть неразветвленным), быть разветвленным или циклическим (в том числе конденсированным, мостиковым и спиро-конденсированным полициклическим) и может быть полностью насыщенным, либо содержать одну или большее количество единиц ненасыщенности, но не является ароматическим. Если не указано иное, алифатические группы содержат 1-30 атомов углерода. Согласно некоторым вариантам реализации алифатические группы содержат 1-10 атомов углерода. Согласно другим вариантам реализации алифатические группы содержат 1-8 атомов углерода. Согласно другим вариантам реализации алифатические группы содержат 1-6 атомов углерода, и согласно дальнейшим вариантам реализации алифатические группы содержат 1-4 атома углерода. Подходящие алифатические группы включают, но не ограничены перечисленными, линейные или разветвленные, алкильные, алкенильные и алкинильные группы, и их гибриды, такие как (циклоалкил)алкил, (циклоалкенил)алкил или (циклоалкил)алкенил.

[0040] В настоящем документе «алкил» относится к насыщенному неразветвленному, разветвленному или циклическому углеводороду, содержащему примерно от 1 до примерно 22 атомов углерода (и всем комбинациям и субкомбинациям диапазонов и конкретных количеств атомов углерода в них), согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения - предпочтительно примерно от 1 до примерно 12, или примерно от 1 до примерно 7 атомов углерода. Алкильные группы включают, но не ограничены перечисленными, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, т-бутил, н-пентил, циклопентил, изопентил, неопентил, н-гексил, изогексил, циклогексил, циклооктил, адамантил, 3-метилпентил, 2,2-диметилбутил, и 2,3-диметилбутил.

[0041] В настоящем документе «галоген» относится к F, О, Br или I.

[0042] В настоящем документе «алканоил» относится к необязательно замещенному прямому или разветвленному алифатическому ациклическому остатку, содержащему примерно 1-10 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов, а также конкретное число атомов углерода), например, примерно от 1 до 7 атомов углерода, который, как подразумевается, присоединен к концевой С=O группе одинарной связью (и может также называться «ацильной группой»). Алканоильные группы включают, но не ограничены перечисленными, формил, ацетил, пропионил, бутирил, изобутирил, пентаноил, изопентаноил, 2-метил-бутирил, 2,2-диметоксипропионил, гексаноил, гептаноил, октаноил и т.п.; для целей настоящего изобретения формильную группу считают алканоильной группой. «Низший алканоил» относится к необязательно замещенному прямому или разветвленному алифатическому ациклическому остатку, содержащему примерно от 1 до примерно 5 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов, а также конкретное число атомов углерода). Такие группы включают, но не ограничены перечисленными, формил, ацетил, пропионил, бутирил, изобутирил, пентаноил, изопентаноил и т.п.

[0043] В настоящем документе «арил» относится к необязательно замещенной, моно- или бициклической ароматической кольцевой системе, содержащей от примерно 5 до примерно 14 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов и конкретных количеств атомов углерода в них), предпочтительно от примерно 6 до примерно 10 атомов углерода. Неограничивающие примеры включают, например, фенил и нафтил.

[0044] В настоящем документе «аралкил» относится к алкильным радикалам, несущим арильный заместитель и содержащим от примерно 6 до примерно 22 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов, а также конкретное число атомов углерода), согласно определенным вариантам реализации - предпочтительно примерно от 6 до примерно 12 атомов углерода. Аралкильные группы необязательно могут быть замещенными. Неограничивающие примеры включают, например, бензил, нафтилметил, дифенилметил, трифенилметил, фенилэтил и дифенилэтил.

[0045] В настоящем документе термины «алкокси» и «алкоксил» относятся к необязательно замещенной группе алкил-О-, где алкил соответствует приведенному выше определению. Примеры алкоксигрупп и алкоксильных групп включают метокси, этокси, н-пропокси, и-пропокси, н-бутокси и гептокси.

[0046] В настоящем документе «карбокси» относится к группе -С(=O)ОН.

[0047] В настоящем документе «алкоксикарбонил» относится к -С(=O)O-алкильной группе, где алкил соответствует приведенному выше определению.

[0048] В настоящем документе «ароил» относится к -С(=O)-арильной группе, где арил соответствует приведенному выше определению. Примеры ароильных групп включают бензоил и нафтоил.

[0049] Термин «циклическая кольцевая система» относится к ароматической или неароматической частично ненасыщенной или полностью насыщенной 3-10-членной кольцевой системе, которая включает одиночные кольца с 3-8 атомами, и би- и три-циклические кольцевые системы, которые могут включать ароматические 5- или 6-членные арильные или ароматические гетероциклические группы, конденсированные с неароматическим кольцом. Указанные гетероциклические кольца включают содержащие от 1 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из кислорода, серы и азота. Согласно определенным вариантам реализации термин «гетероциклический» относится к неароматическому 5-, 6- или 7-членному кольцу или полициклической группе, в которой по меньшей мере один кольцевой атом представляет собой гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, S и N, включая, но не ограничиваясь перечисленными, би- или трициклическую группу, содержащую конденсированные шестичленные кольца с одним-тремя гетероатомами, независимо выбранными из группы, состоящей из кислорода, серы и азота. Согласно некоторым вариантам реализации «циклическая кольцевая система» относится к циклоалкильной группе, которая согласно настоящей заявке относится к группам с 3-10, например, 4-7 атомами углерода. Циклоалкилы включают, не ограничиваясь перечисленными, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и т.п., которые являются необязательно замещенными. Согласно некоторым вариантам реализации «циклическая кольцевая система» относится к циклоалкенильному или циклоалкинильному фрагменту, который является необязательно замещенным.

[0050] Как правило, замещенные химические фрагменты содержат один или большее количество заместителей, замещающих водород. Примеры заместителей включают, например, галоген, алкил, циклоалкил, аралкил, арил, сульфгидрил, гидроксил (-ОН), алкоксил, циано (-CN), карбоксил (-СООН), -С(=O)O-алкил, аминокарбонил (-C(=O)NH₂), -N-замещенный аминокарбонил (-C(=O)NHR''), CF₃, CF₂CF₃ и т.п. Применительно к вышеперечисленным заместителям каждый фрагмент R'' может независимо представлять собой, например, любой из Н, алкила, циклоалкила, арила или аралкила.

[0051] В настоящем документе «L-аминокислота» относится к любой из встречающихся в природе левовращающих альфа-аминокислот, обычно присутствующих в белках или сложных алкильных эфирах указанных альфа-аминокислот. Термин «D-аминокислота» относится к правовращающим альфа-аминокислотам. Если не указано иное, все упоминаемые в настоящем документе аминокислоты представляют собой L-аминокислоты.

[0052] В настоящем документе «ароматическая аминокислота» представляет собой аминокислоту, содержащую по меньшей мере одно ароматическое кольцо, например, арильную группу.

[0053] В настоящем документе «ароматический аналог аминокислоты» представляет собой аналог аминокислоты, содержащий по меньшей мере одно ароматическое кольцо, например, арильную группу.

[0054] II. Краткое описание

[0055] В настоящем изобретении предложены клеточно-реактивные аналоги компстатина и имеющие к ним отношение способы, например, способы их применения. Клеточно-реактивные аналоги компстатина представляют собой соединения, включающие фрагмент аналога компстатина и клеточно-реактивную функциональную группу, способную вступать в реакцию с функциональной группой, экспонируемой на поверхности клетки, например, в физиологических условиях, с образованием ковалентной связи. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, соответственно, ковалентно присоединяется к указанной клетке. Без связи с какой-либо конкретной теорией соединенный с клеткой аналог компстатина защищает указанную клетку от комплемент-опосредованного повреждения за счет, например, связывания с С3 (который может находиться в форме С3(H₂O)) на поверхности клетки и/или поблизости от указанной клетки, ингибирования расщепления и активации С3 и/или связывания с C3b и ингибирования его отложения на указанной клетке, либо участия в каскаде активации комплемента. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения выделенные клетки приводят в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина ex vivo (вне организма). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения указанные клетки присутствуют в выделенной(ом) ткани или органе, например, в ткани или органе для трансплантации субъекту. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки приводят в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина in vivo, посредством введения указанного клеточно-реактивного аналога компстатина субъекту. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина ковалентно присоединяется к клеткам in vivo. Согласно некоторым аспектам способы согласно настоящему изобретению защищают клетки, ткани и/или органы от разрушительных эффектов активации комплемента на протяжении по меньшей мере двух недель, без необходимости повторения лечения в течение указанного времени.

[0056] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина, содержащие нацеливающий фрагмент, который нековалентно связывается с целевой молекулой, присутствующей на поверхности клеток или тканей, или с внеклеточным веществом, не присоединенным к клеткам или ткани. Такие аналоги компстатина в настоящем документе называются «аналогами компстатина нацеленного действия»). Часто целевая молекула представляет собой белок или углевод, присоединенный к клеточной мембране и экспонируемый на поверхности клетки. Нацеливающий фрагмент нацеливает аналог компстатина в клетку, ткань или область, чувствительную к активации комплемента. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения выделенные клетки приводят в контакт с аналогом компстатина нацеленного действия ex vivo (вне организма). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения указанные клетки присутствуют в выделенной(ом) ткани или органе, например, в ткани или органе для трансплантации субъекту. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения аналог компстатина нацеленного действия вводят субъекту, и он нековалентно присоединяется к клетке, ткани или внеклеточному веществу in vivo. Согласно некоторым аспектам предложенный в изобретении способ защищает клетки, ткани и/или органы от разрушительных эффектов активации комплемента на протяжении по меньшей мере двух недель, без необходимости повторения лечения в течение указанного времени. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия содержит и нацеливающий фрагмент, и клеточно-реактивный фрагмент. Указанный нацеливающий фрагмент нацеливает аналог компстатина, например, в конкретный тип клеток, нековалентно связываясь с молекулой на таких клетках. Клеточно-реактивный фрагмент затем ковалентно связывается с указанной клеткой или внеклеточным веществом. Согласно другим вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия не включает клеточно-реактивный фрагмент.

[0057] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина длительного действия, отличающиеся тем, что указанные аналоги компстатина длительного действия содержат такой фрагмент, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), увеличивающий время жизни указанного соединения в организме (например, понижая его выведение из крови). Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия не включает нацеливающий фрагмент или клеточно-реактивный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия содержит нацеливающий фрагмент и/или клеточно-реактивный фрагмент.

[0058] III. Система комплемента

[0059] Для облегчения понимания настоящего изобретения и без какого-либо ограничения настоящего изобретения в настоящем разделе приведено краткое описание комплемента и путей его активации. Более подробную информацию можно найти, например, в Kuby Immunology, 6^th ed., 2006; Paul, W.E., Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6^th ed., 2008; и Walport MJ., Complement. First of two parts. N Engl J Med., 344(14): 1058-66, 2001.

[0060] Комплемент представляет собой часть системы врожденного иммунитета, играющую важную роль в защите организма от инфекционных агентов. Система комплемента включает более чем 30 сывороточных и клеточных белков, вовлеченных в три главных пути, известных как классический, альтернативный и лектиновый пути. Классический путь обычно запускается связыванием комплекса антигена и IgM- либо IgG-антитела с С1 (хотя некоторые другие активаторы могут также инициировать указанный путь). Активированный С1 расщепляет С4 и С2 с получением С4а и C4b, наряду с С2а и C2b. C4b и С2а объединяются с образованием С3-конвертазы, которая расщепляет С3 с образованием С3а и C3b. При связывании C3b с С3-конвертазой образуется С5-конвертаза, которая расщепляет С5 на С5а и C5b. С3а, С4а и С5а являются анафилатоксинами и опосредуют различные реакции при остром воспалительном ответе. С3а и С5а являются также хемотаксическими факторами, привлекающими клетки иммунной системы, такие как нейтрофилы.

[0061] Альтернативный путь инициируется и амплифицируется, например, на поверхности микроорганизмов и различных комплексных полисахаридов. В указанном пути гидролиз С3 до С3(H2O), который происходит спонтанно на низком уровне, приводит к связыванию фактора В, который расщепляется фактором D с образованием жидкофазной С3-конвертазы, которая активирует комплемент расщеплением С3 на С3а и C3b. C3b связывается с мишенями, такими как клеточная поверхность, и образует комплекс с фактором В, который позднее расщепляется фактором D с образованием С3-конвертазы. Поверхностно-связанные С3-конвертазы расщепляют и активируют дополнительные молекулы С3, что приводит к быстрому отложению C3b непосредственно рядом с участком активации, а также к дополнительному образованию С3-конвертазы, которая, в свою очередь, синтезирует дополнительный C3b. Указанный процесс приводит к запуску цикла расщепления С3 и образования С3-конвертазы, существенно усиливающего ответ. Расщепление С3 и связывание следующей молекулы C3b с С3-конвертазой приводит к образованию С5-конвертазы. С3- и С5-конвертазы указанного пути контролируются молекулами клетки-хозяина CR1, DAF, МСР, CD59 и fH. Механизм действия указанных белков включает либо ускоряющую распад активность (т.е. способность к разложению конвертаз), либо способность функционировать в качестве кофакторов при разрушении C3b или C4b фактором I, или обе способности. В норме присутствие регуляторных белков комплемента на поверхностях клеток-хозяев предотвращает значительную активацию комплемента на них.

[0062] С5-конвертазы, синтезируемые в обоих путях, расщепляют С5 с образованием С5а и C5b. C5b затем связывается с С6, С7 и С8 с образованием C5b-8, который катализирует полимеризацию С9 с образованием мембраноатакующего комплекса (МАК) C5b-9. Указанный МАК встраивается в мембраны целевых клеток и вызывает лизис клеток. Присутствие небольших количеств МАК на мембране клеток может приводить к разнообразным последствиям помимо гибели клетки.

[0063] Лектиновый путь комплемента инициируется связыванием связывающего маннозу лектина (MBL) и MBL-связанной серин-протеазы (MASP) с углеводами. Ген МВ1-1 (известный как LMAN-1 у человека) кодирует интегральный мембранный белок I типа, локализованный в промежуточной области между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи. Ген MBL-2 кодирует растворимый связывающий маннозу белок, обнаруживаемый в сыворотке. В лектиновом пути человека MASP-1 и MASP-2 вовлечены в протеолиз С4 и С2, приводящий к описанному выше образованию С3-конвертазы.

[0064] Активность комплемента регулируется различными белками млекопитающих, называемыми белками контроля комплемента (ССР/БКК) или регуляторными белками активации комплемента (RCA) (патент США №6897290). Указанные белки различаются в отношении специфичности лигандов и механизма(ов) ингибирования комплемента. Они могут ускорять нормальный распад конвертаз и/или функционировать в качестве кофакторов фактора I, ферментативно расщепляя C3b и/или C4b на более маленькие фрагменты. БКК характеризуются присутствием нескольких (как правило, 4-56) гомологичных мотивов, известных как короткие консенсусные повторы (SCR/ККП), белковых модулей контроля комплемента (БКК) или доменов SUSHI примерно 50-70 аминокислот длиной, которые содержат консервативный мотив, включающий четыре связанных дисульфидными связями цистеина (две дисульфидные связи), пролин, триптофан и множество гидрофобных остатков. Семейство БКК включает рецептор комплемента типа 1 (CR1; C3b : C4b рецептор), рецептор комплемента типа 2 (CR2), мембранный кофакторный белок (МСР; CD46), ускоряющий распад фактор (DAF), фактор комплемента Н (fH) и C4b-связывающий белок (C4bp). CD59 представляет собой мембраносвязанный регуляторный белок комплемента, структурно не родственный указанным БКК. Регуляторные белки комплемента обычно служат для ограничения активации комплемента, которая в ином случае могла бы происходить на клетках и в тканях указанного млекопитающего, например, хозяина-человека. Таким образом, «собственные» клетки обычно защищены от разрушительных эффектов, которые возникали бы в случае активации комплемента на указанных клетках. Недостаточность или дефекты регуляторного(ых) белка(ов) комплемента вовлечена(ы) в патогенез разнообразных комплемент-опосредованных расстройств, например, описываемых в настоящем документе.

[0065] IV. Аналоги компстатина

[0066] Компстатин представляет собой циклический пептид, который связывается с С3 и ингибирует активацию комплемента. В патенте США №6319897 описан пептид с последовательностью Ile-[Cys-Val-Val-Gln-Asp-Trp-Gly-His-His-Arg-Cys]-Thr (SEQ ID NO: 1), с дисульфидной связью между двумя цистеинами, выделенными скобками. Следует понимать, что название «компстатин» не было использовано в патенте США №6319897, но затем стало применяться в научной и патентной литературе (см., например, Morikis, et al., Protein Sci., 7(3):619-27, 1998) для обозначения пептида, имеющего такую же последовательность, что и SEQ ID NO: 2, описанная в патенте США №6319897, но амидированного на С-конце, как показано в таблице 1 (SEQ ID NO: 8). Термин «компстатин» применяют в настоящем документе в соответствии с таким использованием (т.е. для обозначения последовательности SEQ ID NO: 8). Были разработаны аналоги компстатина, имеющие более высокую комплемент-ингибирующую активность по сравнению с компстатином. См., например, WO 2004/026328 (PCT/US2003/029653), Morikis, D., et al., Biochem Soc Trans. 32(Pt l):28-32, 2004, Mallik, В., et al., J. Med. Chem., 274-286, 2005; Katragadda, M., et al. J. Med. Chem., 49: 4616-4622, 2006; WO 2007062249 (PCT/US2006/045539); WO 2007044668 (PCT/US2006/039397), WO/2009/046198 (PCT/US2008/078593); WO/2010/127336 (PCT/US2010/033345) и описание ниже.

[0067] Аналоги компстатина могут быть ацетилированы или амидированы, например, на N-конце и/или С-конце. Например, аналоги компстатина могут быть ацетилированы на N-конце и амидированы на С-конце. В соответствии с принятым в данной области техники значением в настоящем документе термин «компстатин» и описанные в настоящем документе активности аналогов компстатина относительно активности компстатина относятся к компстатину, амидированному на С-конце (Mallik, 2005, выше).

[0068] Конкатемеры или мультимеры компстатина или его комплемент-ингибирующего аналога также подходят для настоящего изобретения.

[0069] В настоящем документе термин «аналог компстатина» включает компстатин и любой его комплемент-ингибирующий аналог. Термин «аналог компстатина» охватывает компстатин и другие соединения, разработанные или идентифицированные на основе компстатина, комплемент-ингибирующая активность которых составляет по меньшей мере 50% от такой активности компстатина по оценке, например, с применением любого анализа активации комплемента из общепринятых в данной области техники, или по существу аналогичных или эквивалентных анализов. Определенные подходящие анализы описаны в патенте США №6319897, WO 2004/026328, Morikis, выше, Mallik, выше, Katragadda 2006, выше, WO 2007062249 (PCT/US2006/045539); WO 2007044668 (PCT/US2006/039397), WO/2009/046198 (PCT/US2008/078593); и/или WO/2010/127336 (PCT/US2010/033345). В указанном анализе может быть измерен, например, опосредованный альтернативным или классическим путем лизис эритроцитов, или он может представлять собой ИФА-анализ ELISA. Согласно некоторым вариантам реализации применяют анализ, описанный в WO/2010/135717 (PCT/US2010/035871).

[0070] Активность аналога компстатина может быть выражена через IC₅₀ (концентрация соединения, которое ингибирует активацию комплемента на 50%), где более низкий IC₅₀, как известно в данной области техники, указывает на более высокую активность. Активность предпочтительного аналога компстатина для применения согласно настоящему изобретению по меньшей мере равна активности компстатина. Заметим, что определенные модификации, которые, как известно, снижают или полностью ингибируют комплемент-ингибирующую активность, могут быть прямо исключены из любого варианта реализации настоящего изобретения. С помощью анализа опосредованного альтернативным путем лизиса эритроцитов было установлено, что IC₅₀ для компстатина составляет 12 мкМ (WO 2004/026328). Следует иметь в виду, что точное значение IC50 для конкретного аналога компстатина при измерении будет варьировать в зависимости от условий эксперимента (например, от концентрации в сыворотке, применяемой для анализа). Используются сравнительные значения, например, полученные в экспериментах, в которых IC₅₀ определяют для нескольких разных соединений в идентичных по существу условиях. Согласно одному из вариантов реализации IC₅₀ аналога компстатина не превышает IC₅₀ компстатина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения активность указанного аналога компстатина в 2-99 раз выше активности компстатина (т.е. значение IC₅₀ указанного аналога в 2-99 раз меньше значения IC₅₀ компстатина). Например, указанная активность может быть в 10-50 раз выше активности компстатина или в 50-99 выше активности компстатина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения активность указанного аналога компстатина в 99-264 выше активности компстатина. Например, указанная активность может быть в 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260 или 264 раза выше активности компстатина. Согласно определенным вариантам реализации указанная активность в 250-300, в 300-350, в 350-400 или в 400-500 раз выше активности компстатина. Настоящее изобретение также охватывает аналоги компстатина с активностью, превышающей активность компстатина в 500-1000 или более раз. Согласно определенным вариантам реализации IC₅₀ указанного аналога компстатина составляет от примерно 0,2 мкМ до примерно 0,5 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации IC₅₀ указанного аналога компстатина составляет от примерно 0,1 мкМ до примерно 0,2 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации IC₅₀ указанного аналога компстатина составляет от примерно 0,05 мкМ до примерно 0,1 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации IC₅₀ указанного аналога компстатина составляет от примерно 0,001 мкМ до примерно 0,05 мкМ.

[0071] K_d связывания компстатина с C3 может быть измерена с применением изотермической титрационной калориметрии (Katragadda, et al., J. Biol. Chem., 279(53), 54987-54995, 2004). Было установлено, что связывающая способность различных аналогов компстатина в отношении С3 коррелирует с их активностью, при этом более низкая K_d, как известно в данной области техники, указывает на более высокую связывающую способность. Линейная корреляция между связывающей способностью и активностью была показана для некоторых протестированных аналогов (Katragadda, 2004, выше; Katragadda 2006, выше). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина связывается с C3 с K_d, значение которой составляет от 0,1 мкМ до 1,0 мкМ, от 0,05 мкМ до 0,1 мкМ, от 0,025 мкМ до 0,05 мкМ, от 0,015 мкМ до 0,025 мкМ, от 0,01 мкМ до 0,015 мкМ или от 0,001 мкМ до 0,01 мкМ.

[0072] Соединения, «разработанные или идентифицированные на основе компстатина», включают, но не ограничены перечисленными, соединения, содержащие аминокислотную цепь, последовательность которой получают: (i) модифицируя последовательность компстатина (например, заменой одной или большего количества аминокислот указанной последовательности компстатина другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, встраиванием одной или большего количества аминокислот или аналога аминокислоты в указанную последовательность компстатина или удалением одной или большего количества аминокислот из указанной последовательности компстатина); (ii) отбором из фаг-дисплейной пептидной библиотеки, в которой одна или большее количество аминокислот компстатина рандомизированы и необязательно затем модифицированы в соответствии со способом (i); или (iii) идентификацией при скрининге на соединения, конкурирующие за связывание с С3 или его фрагментом с компстатином или любым его аналогом, полученным с помощью способов (i) или (ii). Многие подходящие аналоги компстатина включают гидрофобный кластер, бета-изгиб и дисульфидный мостик.

[0073] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность указанного аналога компстатина содержит последовательность или состоит по существу из последовательности, получаемой осуществлением 1, 2, 3, или 4 замещений в последовательности компстатина, т.е. заменой 1, 2, 3 или 4 аминокислот в последовательности компстатина другой стандартной аминокислотой или нестандартной аминокислотой. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменена аминокислота в положении 4. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменена аминокислота в положении 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены аминокислоты в положениях 4 и 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены только аминокислоты в положениях 4 и 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменена аминокислота в положении 4 или 9; или, согласно определенным вариантам реализации, изменены обе аминокислоты 4 и 9, и дополнительно изменено до 2-х аминокислот в положениях, выбранных из 1, 7, 10, 11 и 13. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены аминокислоты в положениях 4, 7 и 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены аминокислоты в положении 2 или 12, либо в обоих положениях, при условии, что при указанном изменении сохраняется способность указанного соединения к циклизации. Такое(ие) изменение(ия) в положениях 2 и/или 12 может(гут) осуществляться наряду с к изменением(ями) в положениях 1, 4, 7, 9, 10, 11 и/или 13. Последовательность любого из указанных аналогов компстатина, которую получают заменой одной или большего количества аминокислот в последовательности компстатина, необязательно также включает до 1, 2 или 3 дополнительных аминокислот на С-конце. Согласно одному из вариантов реализации указанная дополнительная аминокислота представляет собой Gly. Последовательность любого из указанных аналогов компстатина, которую получают заменой одной или большего количества аминокислот в последовательности компстатина, необязательно также включает до 5 или до 10 дополнительных аминокислот на С-конце. Следует понимать, что аналоги компстатина могут обладать любой одной или несколькими характеристиками или свойствами различных вариантов реализации, описанных в настоящем документе, и характеристики или свойства любого варианта реализации могут дополнительно характеризовать любой другой описанный в настоящем документе вариант реализации, если не указано или не очевидно из контекста иное. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность указанного аналога компстатина содержит последовательность, идентичную последовательности компстатина, за исключением положений, соответствующих положениям 4 и 9 в последовательности компстатина, или состоит по существу из такой последовательности.

[0074] Компстатин и определенные аналоги компстатина, активность которых выше активности компстатина, содержат исключительно стандартные аминокислоты («стандартными аминокислотами» являются глицин, лейцин, изолейцин, валин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота, глутамин, цистеин, метионин, аргинин, лизин, пролин, серии, треонин и гистидин). Определенные аналоги компстатина, обладающие повышенной активностью, содержат одну или большее количество нестандартных аминокислот. Подходящие нестандартные аминокислоты включают моно- и мультигалогенированные (например, фторированные) аминокислоты, D-аминокислоты, гомо-аминокислоты, н-алкил-аминокислоты, дегидроаминокислоты, ароматические аминокислоты (отличные от фенилаланина, тирозина и триптофана), орто-, мета- или пара-аминобензойную кислоту, фосфоаминокислоты, метоксилированные аминокислоты и α,α-дизамещенные аминокислоты. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина получают заменой одной или большего количества L-аминокислот в аналоге компстатина, описываемом где-либо в настоящем документе, соответствующей D-аминокислотой. Такие соединения и способы их применения представляют собой аспекты настоящего изобретения. Примеры подходящих нестандартных аминокислот включают 2-нафтилаланин (2-NaI), 1-нафтилаланин (1-NaI), 2-инданилглицинкарбоновую кислоту (2Ig1), дигидротриптофан (Dht), 4-бензоил-L-фенилаланин (Вра), 2-α-аминомасляную кислоту (2-Abu), 3-α-аминомасляную кислоту (3-Abu), 4-α-аминомасляную кислоту (4-Abu), циклогексилаланин (Cha), гомоциклогексилаланин (hCha), 4-фтор-L-триптофан (4fW), 5-фтор-L-триптофан (5fW), 6-фтор-L-триптофан (6fW), 4-гидрокси-L-триптофан (4OH-W), 5-гидрокси-L-триптофан (5OH-W), 6-гидрокси-L-триптофан (6OH-W), 1-метил-L-триптофан (1MeW), 4-метил-L-триптофан (4MeW), 5-метил-L-триптофан (5MeW), 7-аза-L-триптофан (7aW), α-метил-L-триптофан (αMeW), β-метил-L-триптофан (βMeW), N-метил-L-триптофан (NMeW), орнитин (orn), цитруллин, норлейцин, γ-глутаминовую кислоту и т.п.

[0075] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина содержит один или большее количество аналогов Trp (например, в положении 4 и/или 7 относительно последовательности компстатина). Примеры аналогов Trp приведены выше. См. также Beene, et. al. Biochemistry 41: 10262-10269, 2002 (где описаны, в том числе, моно- и мультигалогенированные аналоги Trp); Babitzke & Yanofsky, J. Biol. Chem. 270: 12452-12456, 1995 (где описаны, в том числе, метилированные и галогенированные Trp, и другие Trp- и индольные аналоги); и патенты США 6214790, 6169057, 5776970, 4870097, 4576750 и 4299838. Другие аналоги Trp включают варианты, замещенные (например, метильной группой) по α- или β-углероду, и, необязательно, также в одном или большем количестве положений на индольном кольце. Аминокислоты, содержащие два или большее количество ароматических колец, включая замещенные, незамещенные или альтернативно замещенные варианты, представляют интерес в качестве аналогов Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог Trp, например, в положении 4, представляет собой 5-метокси, 5-метил-, 1-метил-, или 1-формил-триптофан. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения применяют аналог Trp (например, в положении 4), содержащий 1-алкильный заместитель, например, низший алкильный (например, C₁-C₅) заместитель. Согласно определенным вариантам реализации применяют N(α) метилтриптофан или 5-метилтриптофан. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог, содержащий 1-алканоильный заместитель, например, низший алканоил (например, С₁-С₅). Примеры включают 1-ацетил-L-триптофан и L-β-триптофан.

[0076] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp имеет повышенную гидрофобность по сравнению с Trp. Например, индольное кольцо может быть замещено одной или большим количеством алкильных (например, метальных) групп. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp принимает участие в гидрофобных взаимодействиях с С3. Такой аналог Trp может находиться, например, в положении 4 относительно последовательности компстатина. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp содержит замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или большее количество замещенных или незамещенных компонентов моноциклического ароматического кольца.

[0077] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp имеет повышенную склонность к образованию водородных связей с С3 по сравнению с Trp, но не обладает повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Указанный аналог Trp может иметь повышенную полярность по сравнению с Trp и/или повышенную способность к участию в электростатическом взаимодействии с донором водородной связи на С3. Определенные примеры аналогов Trp, которым свойственна повышенная способность к образованию водородных связей, содержат электроотрицательный заместитель на индольном кольце. Такой аналог Trp может быть расположен, например, в положении 7 относительно последовательности компстатина.

[0078] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина содержит один или большее количество аналогов Ala (например, в положении 9 относительно последовательности компстатина), например, аналоги Ala, идентичные Ala, за исключением того, что они содержат одну или большее количество СН₂-групп в боковой цепи. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Ala представляет собой неразветвленную аминокислоту с одной метальной группой, такую как 2-Abu. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина содержит один или большее количество аналогов Trp (например, в положении 4 и/или 7 относительно последовательности компстатина) и аналог Ala (например, в положении 9 относительно последовательности компстатина).

[0079] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое содержит пептид, имеющий последовательность (X'aa)_n-Gln-Asp-Хаа-Gly-(X''aa)_m, (SEQ ID NO: 2), где каждый X'aa и каждый Х''аа представляет собой независимо выбранную аминокислоту или аналог аминокислоты, причем Хаа представляет собой Trp или аналог Trp, и при этом n>1 и m>1 и значение n+m составляет от 5 до 21. Указанный пептид имеет коровую последовательность Gln-Asp-Хаа-Gly (SEQ ID NO: 70), где Хаа представляет собой Trp или аналог Trp, например, аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей с донором Н-связи по сравнению с Trp, однако согласно определенным вариантам реализации не обладает повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Например, указанный аналог может быть таким, в котором индольное кольцо Trp замещено электроотрицательным фрагментом, например, галогеном, таким как фтор. Согласно одному варианту реализации Хаа представляет собой 5-фтортриптофан. Специалисту в данной области техники будет ясно, что, при отсутствии указывающих на обратное данных, любой не встречающийся в природе пептид, последовательность которого содержит указанную коровую последовательность, и который ингибирует активацию комплемента и/или связывается с С3, будет получен на основе последовательности компстатина. Согласно альтернативному варианту реализации Хаа представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты, не являющийся аналогом Trp, допускающий образование бета-изгиба пептидом Gln-Asp-Хаа-Gly.

[0080] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln-Asp-Хаа-Gly (SEQ ID NO: 3), где X'aa и Хаа выбраны из Trp и аналогов Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln-Asp-Хаа-Gly (SEQ ID NO: 3), где X'aa и Хаа выбраны из Trp, аналогов Trp и других аминокислот или аналогов аминокислот, содержащих по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанная коровая последовательность образует бета-изгиб в контексте пептида. Указанный β-изгиб может быть гибким, позволяя пептиду существовать в двух или большем количестве конформаций, по оценке, например, с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Согласно определенным вариантам реализации Х'аа представляет собой аналог Trp, содержащий замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или большее количество замещенных или незамещенных компонентов моноциклического ароматического кольца. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа выбран из группы, состоящей из 2-нафтилаланина, 1-нафтилаланина, 2-инданилглицин-карбоновой кислоты, дигидротриптофана и бензоилфенилаланина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Например, Х'аа может представлять собой 1-метилтриптофан. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Хаа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей по сравнению с Trp, но, согласно определенным вариантам реализации, не обладающий повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей по сравнению с Trp, содержит модификацию на индольном кольце Trp, например, в положении 5, такую как замещение атома галогена на атом Н в положении 5. Например, Хаа может представлять собой 5-фтортриптофан.

[0081] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln-Asp-Хаа-Gly-X''aa (SEQ ID NO: 4), где каждый из Х'аа и Хаа независимо выбран из Trp и аналогов Trp, а Х''аа выбран из His, Ala, аналогов Ala, Phe и Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp, такой как 1-метилтриптофан или другой аналог Trp с алкильным заместителем на индольном кольце (например, в положении 1, 4, 5, или 6). Согласно определенным вариантам реализации Х'аа представляет собой аналог Trp, содержащий замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или большее количество замещенных или незамещенных компонентов моноциклического ароматического кольца. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа выбран из группы, состоящей из 2-нафтилаланина, 1-нафтилаланина, 2-инданилглицин-карбоновой кислоты, дигидротриптофана и бензоилфенилаланина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Хаа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей с С3 по сравнению с Trp, но, согласно определенным вариантам реализации, не обладает повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей по сравнению с Trp, содержит модификацию на индольном кольце Trp, например, в положении 5, такую как замещение атома галогена на атом Н в положении 5. Например, Хаа может представлять собой 5-фтортриптофан. Согласно определенным вариантам реализации Х''аа представляет собой Ala или аналог Ala, такой как Abu, или другую неразветвленную аминокислоту с одной метальной группой. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln-Asp-Хаа-Gly-X''aa (SEQ ID NO: 4), где каждый из Х'аа и Хаа независимо выбран из Trp, аналогов Trp и аминокислот или аналогов аминокислот, содержащих по меньшей мере одну ароматическую боковую цепь, и Х''аа выбран из His, Ala, аналогов Ala, Phe и Trp. Согласно определенным вариантам реализации Х''аа выбран из аналогов Trp, ароматических аминокислот и аналогов ароматических аминокислот.

[0082] Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид является циклическим. Указанный пептид может быть циклизован с помощью связи между любыми двумя аминокислотами, одна из которых представляет собой (Х'аа)_n, а другая расположена в (Х''аа)_m. Согласно определенным вариантам реализации длина циклической части указанного пептида составляет от 9 до 15 аминокислот, например, 10-12 аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации длина циклической части указанного пептида составляет 11 аминокислот, со связью (например, дисульфидной связью) между аминокислотами в положениях 2 и 12. Например, длина пептида может составлять 13 аминокислот, со связью между аминокислотами в положениях 2 и 12, которая обеспечивает образование циклической части длиной 11 аминокислот.

[0083] Согласно определенным вариантам реализации указанный пептид содержит последовательность или состоит из последовательности X'aa1-Х'аа2-Х'аа3-Х'аа4-Gln-Asp-Xaa-Gly-X''aa1-Х''аа2-Х''аа3-Х''аа4-Х''аа5 (SEQ ID NO: 5). Согласно определенным вариантам реализации Х'аа4 и Хаа выбраны из Trp и аналогов Trp, и X'aa1, Х'аа2, Х'аа3, Х''аа1, Х''аа2, Х''аа3, Х''аа4 и Х''аа5 независимо выбраны из аминокислот и аналогов аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации Х'аа4 и Хаа выбраны из ароматических аминокислот и аналогов ароматических аминокислот. Любой(ые) один или большее количество из X'aa1, Х'аа2, Х'аа3, Х''аа1, Х''аа2, Х''аа3, Х''аа4 и Х''аа5 могут быть идентичны аминокислоте в соответствующем положении компстатина. Согласно одному из вариантов реализации Х''аа1 представляет собой Ala или неразветвленную аминокислоту с одиночной метильной группой. Указанный пептид может быть циклизован посредством ковалентной связи между (i) X'aa1, Х'аа2 или Х'аа3; и (ii) Х''аа2, Х''аа3, Х''аа4 или Х''аа5. Согласно одному варианту реализации указанный пептид циклизован посредством ковалентной связи между Х'аа2 и Х''аа4. Согласно одному варианту реализации каждая из указанных ковалентно связанных аминокислот представляет собой Cys, и указанная ковалентная связь представляет собой дисульфидную (S-S) связь. Согласно другим вариантам реализации указанная ковалентная связь представляет собой С-С, С-О, C-S, или C-N связь. Согласно определенным вариантам реализации один из указанных ковалентно связанных остатков представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, другой ковалентно связанный остаток представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты с боковой цепью, содержащей группу карбоновой кислоты, и указанная ковалентная связь представляет собой амидную связь. Аминокислоты или аналоги аминокислот с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, включают лизин и диаминокарбоновые кислоты с общей структурой NH₂(CH₂)_nCH(NH₂)COOH, такие как 2,3-диаминопропионовая кислота (ДАПК), 2,4-диаминомасляная кислота (ДАМК) и орнитин (orn), где n=1 (ДАПК), 2 (ДАМК) и 3 (оrn), соответственно. Примеры аминокислот с боковой цепью, содержащей группу карбоновой кислоты, включают дикарбоксильные аминокислоты, такие как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота. Могут также применяться аналоги, такие как бета-гидрокси-L-глутаминовая кислота. Согласно некоторым вариантам реализации пептид циклизован тиоэфирной связью, например, согласно описанию в PCT/US2011/052442 (WO/2012/040259). Например, согласно некоторым вариантам реализации дисульфидная связь в любом из указанных пептидов заменена тиоэфирной связью. Согласно некоторым вариантам реализации образуется цистатионин. Согласно некоторым вариантам реализации указанный цистатионин представляет собой дельта-цистатионин или гамма-цистатионин. Согласно некоторым вариантам реализации модификация включает замену дисульфидной связи Cys-Cys между цистеинами на Х'аа2 и Х''аа4 в SEQ ID NO: 5 (или в соответствующих положениях в других последовательностях) с добавлением СН₂, с образованием гомоцистеина на Х'аа2 или Х''аа4, и введение тиоэфирной связи с образованием цистатионина. Согласно одному из вариантов реализации указанный цистатионин представляет собой гамма-цистатионин. Согласно другому варианту реализации указанный цистатионин представляет собой дельта-цистатионин. Другая модификация в соответствии с настоящим изобретением включает замену дисульфидной связи тиоэфирной связью без добавления СН₂, с образованием таким образом лантитионина. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина, содержащий тиоэфир вместо дисульфидной связи, имеет повышенную стабильность, по меньшей мере в некоторых условиях, по сравнению с аналогом компстатина, содержащим дисульфидную связь.

[0084] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое содержит пептид, имеющий последовательность:

[0085] Xaa1-Cys-Val-Хаа2-Gln-Asp-Xaa2*-Gly-Хаа3-His-Arg-Cys-Xaa4 (SEQ ID NO: 6); где:

Xaa1 представляет собой Ile, Val, Leu, В¹-Ile, В¹-Val, В¹-Leu или дипептид, содержащий Gly-Ile или B¹-Gly-Ile, и В¹ представляет собой первый блокирующий фрагмент;

Хаа2 и Хаа2* независимо выбраны из Trp и аналогов Trp;

Хаа3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp или аналог Trp;

Хаа4 представляет собой L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, дипептид, выбранный из Thr-Ala и Thr-Asn, или трипептид, содержащий Thr-Ala-Asn, при этом карбоксиконцевой -ОН любого из указанных L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Ala или Asn необязательно заменен на второй блокирующий фрагмент В²; и

указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации Хаа4 представляет собой Leu, Nle, His или Phe, или дипептид, выбранный из Хаа5-Ala и Xaa5-Asn, или трипептид Xaa5-Ala-Asn, где Хаа5 выбран из Leu, Nle, His или Phe, и где карбоксиконцевой -ОН любого из указанных L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Leu, Nle, His, Phe, Ala или Asn необязательно заменен на второй блокирующий фрагмент В²; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью.

[0086] Согласно другим вариантам реализации Xaa1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту или аналог аминокислоты, и Хаа2, Хаа2*, Хаа3, и Хаа4 соответствуют определению, данному выше. Если Xaa1 отсутствует, к N-концевому остатку Cys может быть присоединен блокирующий фрагмент В¹.

[0087] Согласно другому варианту реализации Хаа4 представляет собой любую(ой) аминокислоту или аналог аминокислоты, a Xaa1, Хаа2, Хаа2*, и Хаа3 соответствуют определению, данному выше. Согласно еще одному варианту реализации Хаа4 представляет собой дипептид, выбранный из группы, состоящей из: Thr-Ala и Thr-Asn, где карбоксиконцевой -ОН, или Ala или Asn необязательно заменен на второй блокирующий фрагмент В².

[0088] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 может представлять собой Trp.

[0089] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 может представлять собой аналог Trp, содержащий замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или большее количество замещенных или незамещенных компонентов моноциклического ароматического кольца. Например, указанный аналог Trp может быть выбран из 2-нафтилаланина (2-NaI), 1-нафтилаланина (1-NaI), 2-инданилглицин- карбоновой кислоты (Ig1), дигидротриптофана (Dht) и 4-бензоил-L-фенилаланина.

[0090] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 может представлять собой аналог Trp с повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Например, указанный аналог Trp может быть выбран из 1-метилтриптофана, 4-метилтриптофана, 5-метилтриптофана и 6-метилтриптофана. Согласно одному из вариантов реализации указанный аналог Trp представляет собой 1-метилтриптофан. Согласно одному из вариантов реализации Хаа2 представляет собой 1-метилтриптофан, Хаа2* представляет собой Trp, Хаа3 представляет собой Ala, а другие аминокислоты идентичны соответствующим аминокислотам компстатина.

[0091] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2* может представлять собой аналог Trp, такой как аналог Trp с повышенной склонностью к образованию водородной связи с С3 по сравнению с Trp, которому, согласно определенным вариантам реализации, не свойственна повышенная по сравнению с Trp гидрофобность. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp содержит электроотрицательный заместитель на индольном кольце. Например, указанный аналог Trp может быть выбран из 5-фтортриптофана и 6-фтортриптофана.

[0092] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Хаа2 представляет собой Trp, а Хаа2* представляет собой аналог Trp с повышенной склонностью к образованию водородной связи с C3 по сравнению с Trp, которому, согласно определенным вариантам реализации, не свойственна повышенная по сравнению с Trp гидрофобность. Согласно определенным вариантам реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6, Хаа2 представляет собой аналог Trp с повышенной по сравнению с Trp гидрофобностью, такой как аналог Trp, выбранный из 1-метилтриптофана, 4-метилтриптофана, 5-метилтриптофана и 6-метилтриптофана, и Хаа2* представляет собой аналог Trp с повышенной склонностью к образованию водородной связи с C3 по сравнению с Trp, которому, согласно определенным вариантам реализации, не свойственна повышенная гидрофобность по сравнению с Trp. Например, согласно одному варианту реализации Хаа2 представляет собой метилтриптофан, а Хаа2* представляет собой 5-фтортриптофан.

[0093] Согласно некоторым из упомянутых выше вариантов реализации Хаа3 представляет собой Ala. Согласно некоторым из упомянутых выше вариантов реализации Хаа3 представляет собой неразветвленную аминокислоту с одиночной метильной группой, например, Abu.

[0094] В настоящем изобретении также предложены аналоги компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 согласно приведенному выше описанию, где Хаа2 и Хаа2* независимо выбраны из Trp, аналогов Trp, и других аминокислот или аналогов аминокислот, которые содержат по меньшей мере одно ароматическое кольцо, и Хаа3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp, аналог Trp, либо другую ароматическую аминокислоту или аналог ароматической аминокислоты.

[0095] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент, присутствующий на N- или С-конце любого из описанных в настоящем документе аналогов компстатина, представляет собой любой фрагмент, стабилизирующий пептид, предотвращая его разрушение, которое иначе произошло бы в крови или интерстициальной жидкости млекопитающего (например, человека или не являющегося человеком примата). Например, блокирующий фрагмент В¹ может представлять собой любой фрагмент, изменяющий структуру N-конца пептида таким образом, чтобы ингибировать расщепление пептидной связи между N-концевой аминокислотой указанного пептида и смежной аминокислотой. Блокирующий фрагмент В² может представлять собой любой фрагмент, изменяющий структуру С-конца пептида таким образом, чтобы ингибировать расщепление пептидной связи между С-концевой аминокислотой указанного пептида и смежной аминокислотой. Могут применяться любые подходящие блокирующие фрагменты, известные в данной области техники. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В¹ содержит ацильную группу (т.е. часть карбоновой кислоты, остающуюся после удаления -ОН-группы). Указанная ацильная группа, как правило, содержит от 1 до 12 атомов углерода, например, от 1 до 6 атомов углерода. Например, согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В¹ выбран из группы, состоящей из: формила, ацетила, проприонила, бутирила, изобутирила, валерила, изовалерила и т.п. Согласно одному из вариантов реализации блокирующий фрагмент В¹ представляет собой ацетильную группу, т.е. Xaa1 представляет собой Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu или Ac-Gly-Ile.

[0096] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В² представляет собой первичный или вторичный амин (-NH₂ или -NHR¹, где R представляет собой органический фрагмент, такой как алкильная группа).

[0097] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В¹ представляет собой любой фрагмент, нейтрализующий или уменьшающий положительный заряд, который в ином случае может присутствовать на N-конце при физиологических уровнях рН. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В² представляет собой любой фрагмент, нейтрализующий или уменьшающий отрицательный заряд, который в ином случае может присутствовать на С-конце при физиологических уровнях рН.

[0098] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина ацетилирован или амидирован на N-конце и/или С-конце, соответственно. Аналог компстатина может быть ацетилирован на N-конце, амидирован на С-конце и/или и ацетилирован на N-конце, и амидирован на С-конце. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит алкильную или арильную группу на N-конце, а не ацетильную группу.

[0099] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое содержит пептид, имеющий последовательность:

[00100] Xaa1-Cys-Val-Хаа2-Gln-Asp-Xaa2*-Gly-Хаа3-His-Arg-Cys-Xaa4 (SEQ ID NO: 7); где:

Xaa1 представляет собой Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu или дипептид, содержащий Gly-Ile или Ac-Gly-Ile;

Xaa2 и Xaa2* независимо выбраны из Trp и аналогов Trp;

Хаа3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp или аналог Trp;

Хаа4 представляет собой L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, дипептид, выбранный из Thr-Ala и Thr-Asn, или трипептид, содержащий Thr-Ala-Asn, при этом карбоксиконцевой -ОН любого из L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Ala или Asn необязательно заменен на -NH₂; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации Хаа4 представляет собой Leu, Nle, His или Phe, или дипептид, выбранный из Хаа5-Ala и Xaa5-Asn, или трипептид Xaa5-Ala-Asn, где Хаа5 выбран из Leu, Nle, His или Phe, и где карбоксиконцевой -ОН любого из указанных L-Thr, D-Thr, Ilе, Val, Gly, Leu, Nle, His, Phe, Ala или Asn необязательно заменен вторым блокирующим фрагментом В2; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью.

[00101] Согласно некоторым вариантам реализации Xaa1, Хаа2, Хаа2*, Хаа3 и Хаа4 соответствуют приведенному выше описанию для различных вариантов реализации последовательности SEQ ID NO: 6. Например, согласно определенным вариантам реализации Хаа2* представляет собой Trp. Согласно определенным вариантам реализации Хаа2 представляет собой аналог Trp с повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp, например, 1-метилтриптофан. Согласно определенным вариантам реализации Хаа3 представляет собой Ala. Согласно определенным вариантам реализации Хаа3 представляет собой неразветвленную аминокислоту с одиночной метальной группой.

[00102] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Xaa1 представляет собой Ile и Хаа4 представляет собой L-Thr.

[00103] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Xaa1 представляет собой Ile, Хаа2* представляет собой Trp и Хаа4 представляет собой L-Thr.

[00104] В настоящем изобретении также предложены аналоги компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 7, согласно приведенному выше описанию, где Хаа2 и Хаа2* независимо выбраны из Trp, аналогов Trp, других аминокислот или аналогов ароматических аминокислот, и Хаа3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp, аналог Trp, либо другую ароматическую аминокислоту или аналог ароматической аминокислоты.

[00105] Согласно определенным вариантам реализации любого из указанных аналогов компстатина, описанных в настоящем документе, применяют аналог Phe, но не Phe.

[00106] В таблице 1 приведен неограничивающий список аналогов компстатина, подходящих для настоящего изобретения. В левой колонке приведены сокращенные обозначения указанных аналогов с отмеченными конкретными модификациями в означенных положениях (1-13) относительно исходного пептида, компстатина. В соответствии с использованием в данной области техники термин «компстатин» в настоящем документе, как и сравнительные активности описанных в настоящем документе аналогов компстатина по сравнению с компстатином, относятся к пептиду компстатину, амидированному на С-конце. Если не указано иное, пептиды в таблице 1 амидированы на С-конце. Выделение жирным шрифтом применяют для обозначения определенных модификаций. Активность относительно активности компстатина приведена на основании данных из опубликованных источников и описываемых в них анализов (WO 2004/026328, WO 2007044668, Mallik, 2005; Katragadda, 2006). В случаях обращения к нескольким публикациям, где указывается активность, используют значение, опубликованное позже; следует понимать, что значения могут корректироваться в случае расхождений между данными анализов. Следует также иметь в виду, что согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения пептиды, перечисленные в таблице 1, при применении в терапевтических композициях и способах согласно настоящему изобретению циклизованы посредством дисульфидной связи между двумя остатками Cys. Варианты способов циклизации указанных пептидов также входят в объем настоящего изобретения. Как уже отмечалось, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения одна или большее количество аминокислот аналога компстатина (например, любого из аналогов компстатина, описанных в настоящем документе) может представлять собой N-алкил-аминокислоту (например, N-метил-аминокислоту). Например, без ограничения, по меньшей мере один аминокислота в составе циклической части указанного пептида, по меньшей мере одна аминокислота в направлении N-конца относительно циклической части и/или по меньшей мере одна аминокислота в направлении С-конца относительно циклической части может представлять собой N-алкил-аминокислоту, например, N-метил-аминокислоту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит, например, N-метилглицин, к примеру, в положении, соответствующем положению 8 компстатина и/или в положении, соответствующем положению 13 компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество из аналогов компстатина в таблице 1 содержит по меньшей мере один N-метилглицин, например, в положении, соответствующем положению 8 компстатина и/или в положении, соответствующем положению 13 компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество аналогов компстатина в таблице 1 содержит по меньшей мере один N-метил-изолейцин, например, в положении, соответствующем положению 13 компстатина. Например, Thr на С-конце или около С-конца пептида, последовательность которого приведена в таблице 1, или любой другой последовательности аналога компстатина, может быть заменен на N-метил-Ile. Как очевидно, согласно некоторым вариантам реализации N-метилированные аминокислоты содержат N-метил-Gly в положении 8 и N-метил-Ile в положении 13. Согласно некоторым вариантам реализации N-метилированные аминокислоты содержат N-метил-Gly в коровой последовательности, такой как последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Согласно некоторым вариантам реализации N-метилированные аминокислоты содержат N-метил-Gly в такой коровой последовательности, как последовательность SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

[00107]

[00108] Согласно определенным вариантам реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность, выбранную из последовательностей 9-36. Согласно определенным вариантам реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 и 36. Согласно определенным вариантам реализации композиций и/или способов согласно настоящему изобретению указанный аналог компстатина имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 30 и 31. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 28. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 32. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 34. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 36.

[00109] Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В¹ содержит аминокислоту, которая может быть представлена как Хаа0. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В² содержит аминокислоту, которая может быть представлена как XaaN. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В¹ и/или В² содержит нестандартную аминокислоту, такую как D-аминокислота, N-алкил-аминокислота (например, N-метил-аминокислота). Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В¹ и/или В² содержит нестандартную аминокислоту, которая представляет собой аналог стандартной аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации аналог аминокислоты содержит низший алкил, низший алкокси, или галогеновый заместитель по сравнению со стандартной аминокислотой, аналогом которой он является. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель находится на боковой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель находится на альфа-углеродном атоме. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В¹, содержащий аминокислоту, например, нестандартную аминокислоту, также содержит фрагмент В^1а. Например, блокирующий фрагмент В¹ может быть представлен как В^1а-Хаа0. Согласно некоторым вариантам реализации В^1а нейтрализует или уменьшает положительный заряд, который может в противном случае присутствовать на N-конце при физиологических значениях рН. Согласно некоторым вариантам реализации В^1а содержит или состоит из, например, ацильной группы, которая, например, содержит от 1 до 12 атомов углерода, например, от 1 до 6 атомов углерода. Согласно определенным вариантам реализации блокирующий фрагмент В^1а выбирают из группы, состоящей из: формила, ацетила, пропионила, бутирила, изобутирила, валерила, изовалерила и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В², содержащий аминокислоту, например, нестандартную аминокислоту, может также содержать фрагмент B^2a. Например, блокирующий фрагмент В² может быть представлен как XaaN-B^2a, где N обозначает соответствующий номер аминокислоты (который зависит от системы нумерации, используемой для остальной части пептида). Согласно некоторым вариантам реализации В^2а нейтрализует или уменьшает отрицательный заряд, который может в противном случае присутствовать на С-конце при физиологических значениях рН. Согласно некоторым вариантам реализации В^2а содержит или состоит из первичного или вторичного амина (например, NH₂). Следует понимать, что блокирующая активность фрагмента В^1а-Хаа0 и/или XaaN-B^2a может быть обеспечена любым из или обоими компонентами указанного фрагмента согласно различным вариантам реализации. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент или его часть, например, остаток аминокислоты, может вносить вклад в увеличение аффинности указанного соединения в отношении С3 или C3b и/или повышать активность указанного соединения. Согласно некоторым вариантам реализации вклад в аффинность или активность остатка аминокислоты может быть по меньшей мере таким же значимым, как и вклад в блокирующую активность. Например, согласно некоторым вариантам реализации Хаа0 и/или XaaN в В^1а-Хаа0 и/или XaaN-B^2a могут функционировать, главным образом повышая аффинность или активность указанного соединения, тогда как В^1а и/или В^2а могут ингибировать расщепление и/или нейтрализовать заряд пептида. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит последовательность аминокислот, соответствующую любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-36, при этом указанная последовательность из SEQ ID NO: 5-36 дополнительно удлинена на N-и/или С-конце. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность может быть представлена как В^1а-Хаа0-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ-XaaN-B^2a, где «ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ» представлена любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-36, при этом В^1а и В^2а могут независимым образом присутствовать или отсутствовать. Например, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит В^1а-Хаа0-X'aa1-Х'аа2-Х'аа3-Х'аа4-Gln-Asp-Xaa-Gly-X''aa1-Х''аа2-Х''аа3-Х''аа4-Х''аа5-XaaN-B^2a (SEQ ID NO: 71), где X'aa1-X'aa2-Х'аа3-X'aa4, Хаа, X''aa1, X''aa2, Х''аа3, X''aa4 и X''aa5 соответствуют приведенным выше для последовательности SEQ ID NO: 5.

[00110] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит В^1а-Хаа0-Xaa1-Cys-Val-Хаа2-Gln-Asp-Xaa2*-Gly-Хаа3-His-Arg-Cys-Xaa4-XaaN-B^2a (SEQ ID NO: 72), где Xaa1, Xaa2, Xaa2*, Хаа3, и Xaa4 соответствуют приведенным выше для последовательности SEQ ID NO: 6, или где Xaa1, Хаа2, Хаа2*, Хаа3, и Хаа4 соответствуют указанным для последовательности SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.

[00111] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит В^1а-Хаа0-Xaa1-Хаа2-Хаа3-Хаа4-Хаа5-Хаа6-Хаа7-Хаа8-Хаа9-Хаа10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-XaaN-B^2a (SEQ ID NO: 73), где Xaa1, Xaa2, Хаа3, Xaa4, Xaa5, Хаа6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, и Xaa13 идентичны аминокислотам в положениях 1-13 любых их последовательностей SEQ ID NO: 9-36.

[00112] Согласно некоторым вариантам реализации Хаа0 и/или XaaN в любой последовательности аналога компстатина содержит аминокислоту, которая содержит ароматическое кольцо с алкильным заместителем в одном или большем количестве положений. Согласно некоторым вариантам реализации алкильный заместитель представляет собой низший алкильный заместитель. Например, согласно некоторым вариантам реализации алкильный заместитель представляет собой метальную или этильную группу. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель расположен в любом положении, не устраняющем ароматический характер указанного соединения. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель расположен в любом положении, не устраняющем ароматический характер кольца, к которому присоединен указанный заместитель. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель расположен в положении 1, 2, 3, 4 или 5. Согласно некоторым вариантам реализации Хаа0 содержит О-метильный аналог тирозина, 2-гидроксифенилаланина или 3-гидроксифенилаланина. Для целей настоящего описания «m» в нижнем регистре, за которым следует трехбуквенное обозначение аминокислоты, может применяться для конкретного указания на то, что аминокислота представляет собой N-метил-аминокислоту. Например, обозначение «mGly» используется в настоящем документе для обозначения N-метилглицина (также иногда называемого саркозином, или Sar). Согласно некоторым вариантам реализации Хаа0 представляет собой или содержит mGly, Tyr, Phe, Arg, Trp, Thr, Tyr(Me), Cha, mPhe, mVal, mIle, mAla, DTyr, DPhe, DArg, DTrp, DThr, DTyr(Me), mPhe, mVal, mIle, DAla или DCha. Например, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит пептид, имеющий последовательность B¹-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-mGly-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-В² (SEQ ID NO: 74) или B¹-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-mGly-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-B² (SEQ ID NO: 75). Два остатка Cys в активных соединениях соединены дисульфидным мостиком. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пептид ацетилирован на N-конце и/или амидирован на С-конце. Согласно некоторым вариантам реализации В¹ содержит В^1а-Хаа0 и/или В² содержит XaaN-B^2a, согласно описанию выше. Например, согласно некоторым вариантам реализации В¹ содержит или состоит из Gly, mGly, Tyr, Phe, Arg, Trp, Thr, Tyr(Me), mPhe, mVal, mIle, mAla, DTyr, DPhe, DTrp, DCha, Dala; и В² содержит NH₂, например, карбоксиконцевой -ОН в mIle заменен на NH₂. Согласно некоторым вариантам реализации В¹ содержит или состоит из mGly, Tyr, DTyr, или Tyr(Ме), и В² содержит NH₂, например, карбоксиконцевой -ОН в mIle заменен на NH₂. Согласно некоторым вариантам реализации Ilе в положении Xaa1 заменен на Gly. Эффективность ингибирования комплемента и/или показатели связывания C3b выбранных аналогов компстатина описаны в WO/2010/127336 (PCT/US2010/033345) и/или у Qu, et al., Immunobiology (2012), doi:10.1016/j.imbio.2012.06.003.

[00113] Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент или его часть, например, остаток аминокислоты, может вносить вклад в увеличение аффинности соединения в отношении С3 или C3b, и/или повышать активность указанного соединения. Согласно некоторым вариантам реализации вклад в аффинность или активность аминокислоты или аналога аминокислоты может быть более значимым, чем блокирующая активность.

[00114] Согласно определенным вариантам реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность, соответствующую приведенной в таблице 1, но Ac-группа в ней заменена на вариант блокирующего фрагмента В¹, соответствующий описанию в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации-NH₂ группа заменена на вариант блокирующего фрагмента В², соответствующий описанию в настоящем документе.

[00115] Согласно одному из вариантов реализации указанный аналог компстатина связывается по существу с той же областью β-цепи С3 человека, что и компстатин. Согласно одному варианту реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с фрагментом С-концевой части β-цепи С3 человека с молекулярной массой, составляющей примерно 40 кДа, с которым связывается компстатин (Soulika, A.M., et al., Mol. Immunol, 35: 160, 1998; Soulika, A.M., et al., Mol. Immunol. 43(12): 2023-9, 2006). Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания компстатина, определяемым структурой компстатина-С3, например, кристаллической структурой или установленной с применением ЯМР трехмерной структурой. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать компстатин в структуре компстатин-С3 и формирует по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и компстатин. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания пептида с последовательностью, приведенной в таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34, или 36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или другой последовательностью аналога компстатина, описанной в настоящем документе, в структуре пептид-С3, например, а кристаллической структуре. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 30 или 31, в структуре пептид-С3, например, в кристаллической структуре. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью SEQ ID NO: 9-36, например, соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или другой последовательностью аналога компстатина, описанной в настоящем документе, в структуре пептид-С3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и указанный пептид. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью SEQ ID NO: 30 или 31 в структуре пептид-С3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и указанный пептид.

[00116] Специалист в данной области техники легко сможет определить, связывается ли аналог компстатина с фрагментом С-концевой части β-цепи С3, с применением рутинных экспериментальных методов. Например, специалист в данной области техники может синтезировать фотосшиваемый вариант указанного аналога компстатина включением фотосшивающей аминокислоты, такой как p-бензоил-L-фенилаланин (Вра) в указанное соединение, например, на С-конце указанной последовательности (Soulika, A.M., et al, выше). Необязательно могут быть включены дополнительные аминокислоты, например, эпитопная метка, такая как метка FLAG или НА-метка, для облегчения обнаружения указанного соединения, например, с применением вестерн-блоттинга. Аналог компстатина инкубируют с указанным фрагментом и инициируют сшивание. Колокализация указанного аналога компстатина и С3 фрагмента указывает на связывание. Поверхностный плазмонный резонанс может также применяться для определения того, связывается ли аналог компстатина с участком связывания компстатина на С3 или его фрагменте. Специалист в данной области техники может использовать программное обеспечение для молекулярного моделирования, чтобы предсказать, образует ли соединение по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и компстатин или пептид с последовательностью любого из указанных в таблице 1 пептидов, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, или, согласно некоторым вариантам реализации, SEQ ID NO: 30 или 31, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или с другой последовательностью аналога компстатина, описанной в настоящем документе.

[00117] Аналоги компстатина могут быть получены с помощью различных известных в данной области техники способов искусственного синтеза пептидов, посредством конденсирования остатков аминокислот, например, в соответствии со стандартными способами пептидного синтеза, могут быть получены экспрессированием, in vitro или в живых клетках, подходящих кодирующих последовательностей нуклеиновых кислот с помощью известных в данной области техники способов. Например, пептиды могут быть синтезированы с применением стандартных твердофазных методик согласно описанию у Malik, выше, Katragadda, выше, WO 2004026328 и/или WO 2007062249. Может быть проведена, а затем снята защита потенциально реакционноспособных фрагментов, таких как аминогруппы и карбоксильные группы, реактивные функциональные группы и т.п., с применением различных защитных групп и методик, известных в данной области техники. См., например, «Protective Groups in Organic Synthesis» («Защитные группы в органическом синтезе»), 3^rd ed. Greene, Т.W. and Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999. Пептиды могут быть очищены с применением стандартных методов, таких как ВЭЖХ с обращенной фазой. Разделение диастереомеров пептидов, при необходимости, может быть выполнено с применением известных способов, таких как ВЭЖХ с обращенной фазой. При необходимости составы могут быть лиофилизированы и затем растворены в подходящем растворителе, например, в воде. рН полученного раствора может быть скорректирован, например, до физиологических значений рН, с применением основания, такого как NaOH. Пептидные составы при необходимости могут быть охарактеризованы с помощью масс-спектроскопии, например, для подтверждения массы и/или образования дисульфидной связи. См., например, Mallik, 2005, и Katragadda, 2006.

[00118] Аналог компстатина, необязательно связанный с клеточно-реактивным фрагментом или нацеливающим фрагментом, может быть модифицирован добавлением такой молекулы, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), либо сходных молекул, для стабилизации соединения, снижения его иммуногенности, увеличения времени жизни в организме, повышения или понижения растворимости и/или повышения устойчивости к разложению. Способы пегилирования общеизвестны в данной области техники (V Veronese, F.M. & Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456, 2002; Davis, F.F., Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 457-458, 2002); Hinds, K.D. & Kim, S.W. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 505-530 (2002; Roberts, M.J., Bentley, M.D. & Harris, J.M. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 459-476; 2002); Wang, Y.S. et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 547-570, 2002). Широкий ряд полимеров, таких как ПЭГ и модифицированные ПЭГ, в том числе дериватизированные ПЭГ, к которым можно удобным образом присоединить полипептиды, описан в каталоге Nektar (Nektar Advanced Pegylation 2005-2006 Product Catalog, Nektar Therapeutics, Сан-Карлос, Калифорния), где также приведены подробные описания подходящих процедур конъюгации. Согласно еще одному варианту реализации аналог компстатина конденсирован с Fc-доменом иммуноглобулина или его частью. Согласно некоторым другим вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом альбумина или со связывающим альбумин пептидом. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина модифицируют с помощью одного или большего количества полипептидных или неполипептидных компонентов, например, указанный аналог компстатина пегилируют, либо конъюгируют с другим фрагментом. Согласно некоторым вариантам реализации указанный компонент не является Fc-доменом иммуноглобулина или его частью. Аналог компстатина может быть представлен мультимером или частью супермолекулярного комплекса, который может включать либо один вид молекулярных соединений, либо несколько разных видов (например, несколько разных аналогов).

[00119] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина представляет собой многовалентное соединение, содержащее множество фрагментов аналога компстатина, ковалентно или нековалентно связанных с полимерным скелетом или скаффолдом. Указанные фрагменты аналога компстатина могут быть идентичными или разными. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанное многовалентное соединение содержит несколько экземпляров, или копий, одного фрагмента аналога компстатина. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения указанное многовалентное соединение содержит один или большее количество экземпляров каждого из двух или большего количества неидентичных фрагментов аналога компстатина, например, 3, 4, 5 или более разных фрагментов аналога компстатина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения число фрагментов аналога компстатина («n») составляет от 2 до 6. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения n составляет от 7 до 20. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения n составляет от 20 до 100. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 100 до 1000. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения n составляет от 1000 до 10000. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 10000 до 50000. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 50000 до 100000. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 100000 до 1000000.

[00120] Фрагменты аналога компстатина могут быть присоединены непосредственно к полимерному скаффолду или могут быть присоединены соединяющим фрагментом, который связывает указанный фрагмент аналога компстатина и полимерный скаффолд. Указанный соединяющий фрагмент может быть присоединен к одному фрагменту аналога компстатина и к полимерному скаффолду. Как вариант, к соединяющему фрагменту может быть присоединено несколько фрагментов аналога компстатина таким образом, что указанный соединяющий фрагмент прикрепляет к полимерному скаффолду несколько фрагментов аналога компстатина.

[00121] Согласно некоторым вариантам реализации указанный аналог компстатина содержит аминокислоту с боковой цепью, содержащую первичный или вторичный амин, например, остаток Lys. Например, остаток Lys, или последовательность, содержащую остаток Lys, добавляют на N-конце и/или С-конец указанного аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации остаток Lys отделен от циклической части указанного аналога компстатина жестким или гибким спейсером. Указанный спейсер может, например, включать замещенную или незамещенную, насыщенную или ненасыщенную алкильную цепь, цепь олиго(этиленгликоля) и/или другие фрагменты, например, согласно описанию в Разделе VI применительно к линкерам. Длина указанной цепи может составлять, например, от 2 до 20 атомов углерода. Согласно другим вариантам реализации указанный спейсер представляет собой пептид. Длина указанного пептидного спейсера может составлять, например, от 1 и 20 аминокислот, например, от 4 до 20 аминокислот. Подходящие спейсеры могут включать или состоять, например, из нескольких остатков Gly, нескольких остатков Ser, либо и тех, и других остатков. Аминокислота с боковой цепью, содержащая первичный или вторичный амин и/или по меньшей мере одна аминокислота в спейсере необязательно представляет собой D-аминокислоту. Может использоваться любой из разнообразных полимерных скелетов или скаффолдов. Например, полимерный скелет или скаффолд может представлять собой полиамид, полисахарид, полиангидрид, полиакриламид, полиметакрилат, полипептид, полиэтилен оксид или дендример. Подходящие способы и полимерные скелеты описаны, например, в WO 98/46270 (PCT/US98/07171) или WO 98/47002 (PCT/US98/06963). Согласно одному из вариантов реализации указанный полимерный скелет или скаффолд содержит несколько реактивных функциональных групп, таких как карбоновые кислоты, ангидридные или сукцинимидные группы. Проводят реакцию указанного полимерного скелета или скаффолда с аналогами компстатина. Согласно одному из вариантов реализации указанный аналог компстатина содержит любую из множества различных реакционноспособных функциональных групп, такую как карбоновые кислоты, ангидридные или сукцинимидные группы, с которыми проводят реакцию подходящих групп на полимерном скелете. Как вариант, сначала проводят реакцию мономерных единиц, которые могут быть соединены друг с другом с образованием полимерного скелета или скаффолда, с аналогами компстатина, и полученные мономеры полимеризуют. Согласно другому варианту реализации короткие цепи предварительно полимеризуют, функционализируют, а затем из смеси коротких цепей разных композиций собирают более длинные полимеры.

[00122] V. Миметики компстатина

[00123] Структура компстатина известна в данной области техники, а также известны ЯМР-структуры для ряда аналогов компстатина с более высокой активностью, чем у компстатина (Malik, выше). Структурная информация может применяться для разработки миметиков компстатина.

[00124] Согласно одному из вариантов реализации миметик компстатина представляет собой любое соединение, которое конкурирует с компстатином или любым аналогом компстатина (например, аналогом компстатина, последовательность которого приведена в таблице 1) за связывание с С3 или его фрагментом (таким как 40 кДа фрагмент β-цепи, с которым связывается компстатин). Согласно некоторым вариантам реализации указанный миметик компстатина обладает активностью, равной или превышающей активность компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанный миметик компстатина более стабилен, перорально доступен или обладает лучшей биодоступностью, чем компстатин. Указанный миметик компстатина может представлять собой пептид, нуклеиновую кислоту или малую молекулу. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания компстатина, определяемым структурой компстатин-С3, например, кристаллической структурой или трехмерной структурой, установленной в ходе ЯМР-экспериментов. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать компстатин в структуре компстатин-С3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и компстатин. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания пептида, имеющего последовательность, приведенную в таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, или, согласно определенным вариантам реализации, SEQ ID NO: 30 или 31, или с другой последовательностью аналога компстатина, в структуре пептид-С3. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью, приведенной в таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, или, согласно определенным вариантам реализации, SEQ ID NO: 30 или 31, или другой последовательностью аналога компстатина, в структуре пептид-С3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и указанный пептид. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина имеет непептидный остов, но содержит боковые цепи, расположенные соответственно последовательности, полученной на основе последовательности компстатина.

[00125] Специалисту в данной области техники будет понятно, что после того как конкретная нужная конформация короткого пептида подтверждена, для получения пептида или пептидомиметика, соответствующего указанной конформации, могут применяться общеизвестные способы. См., например, G.R. Marshall (1993), Tetrahedron, 49: 3547-3558; Hruby and Nikiforovich (1991), Molecular Conformation and Biological Interactions, P. Balaram & S. Ramasehan, eds., Indian Acad, of Sci., Bangalore, PP. 429-455), Eguchi M, Kahn M., Mini Rev Med Chem., 2(5): 447-62, 2002. Особое значение для настоящего изобретения имеет то, что структура пептидных аналогов может быть дополнительно скорректирована с учетом влияния остатков аминокислот различных боковых цепей, например, на эффекты функциональных групп или пространственные ограничения, согласно имеющимся в соответствующей области техники данным относительно компстатина и его аналогов, в том числе.

[00126] Специалистам в данной области техники будет понятно, что для получения конкретной конформации остова и функциональных групп боковых цепей, необходимых для связывания с С3 и ингибирования активации комплемента, пептидный миметик может подходить так же хорошо, как и пептид. Соответственно, предполагается, что в объем настоящего изобретения входит получение и применение С3-связывающего ингибирующего комплемент соединения с использованием либо встречающихся в природе аминокислот, производных аминокислот, аналогов аминокислот, либо не являющихся аминокислотами молекул, способных соединяться с образованием остова в подходящей конформации. Непептидный аналог или аналог, содержащий пептидные и непептидные компоненты, в настоящем документе иногда называется «пептидомиметиком» или «изостерическим миметиком» для обозначения замещений или разновидностей пептида, обладающих в общем аналогичными конформационными особенностями остова и/или других функциональных групп, таким образом, достаточно сходные с приводимыми в качестве примеров пептидами для ингибирования активации комплемента. В более общем случае миметиком компстатина является любое соединение, в котором фармакофоры размещаются аналогично их положению в компстатине, даже если остов отличается.

[00127] Применение пептидомиметиков при разработке высокоаффинных аналогов пептидов общеизвестно в данной области техники. Принимая во внимание ротационные ограничения, сходные с ограничениями, свойственными остаткам аминокислот в составе пептида, можно провести анализ аналогов, содержащих неаминокислотные фрагменты, и уточнить их конформационные мотивы при помощи диаграммы Рамачандрана (Hruby & Nikiforovich 1991), наряду с другими известными методами.

[00128] Специалист в данной области техники легко сможет подобрать подходящие методы скрининга для идентификации дополнительных миметиков компстатина и отбора обладающих требуемой ингибирующей активностью. Например, компстатин или его аналог может быть помечен (например, радиоактивной или флуоресцентной меткой) и приведен в контакт с С3 в присутствии разных концентраций тестируемого соединения. Оценивают способность указанного тестируемого соединения уменьшать связывание аналога компстатина с С3. Тестируемое соединение, которое значительно уменьшает связывание указанного аналога компстатина с С3, представляет собой потенциальный миметик компстатина. Например, тестируемое соединение, которое уменьшает концентрацию в равновесном состоянии комплекса аналога компстатина с С3, или которое уменьшает скорость образования комплекса аналога компстатина с С3 по меньшей мере на 25% или по меньшей мере на 50%, представляет собой потенциальный миметик компстатина. Специалисту в данной области техники будет ясно, что может применяться несколько вариантов скрининга. Соединения для скрининга включают природные продукты, библиотеки аптамеров, фаг-дисплейные библиотеки, библиотеки соединений, синтезированных с применением комбинаторной химии и т.п. Настоящее изобретение охватывает синтезирование комбинаторной библиотеки соединений на основе описанной выше коровой последовательности и скрининг указанной библиотеки для идентификации миметиков компстатина. Любой из указанных способов может также применяться для идентификации новых аналогов компстатина, имеющих более высокую ингибирующую активность, чем аналоги компстатина, протестированные к настоящему времени. Следует иметь в виду, что миметики компстатина могут применяться в клеточно-реактивных соединениях согласно настоящему изобретению, и в настоящем изобретении предложены такие клеточно-реактивные миметики компстатина.

[00129] VI. Клеточно-реактивные аналоги компстатина или аналоги компстатина длительного действия

[00130] В настоящем изобретении предложены разнообразные клеточно-реактивные аналоги компстатина. Согласно некоторым аспектам клеточно-реактивный аналог компстатина содержит соединение с формулой A-L-M, где А представляет собой фрагмент, содержащий клеточно-реактивную функциональную группу J, L представляет собой необязательно присутствующую соединяющую часть, и М содержит фрагмент аналога компстатина. Указанный фрагмент аналога компстатина может, согласно различным вариантам реализации, включать любой аналог компстатина, например, любой из описанных выше аналогом компстатина. Формула A-L-M охватывает варианты реализации, в которых A-L присутствует на N-конце указанного фрагмента аналога компстатина, варианты реализации, в которых A-L присутствует на С-конце указанного фрагмента аналога компстатина, варианты реализации, в которых A-L присоединен к боковой цепи аминокислоты указанного фрагмента аналога компстатина, и варианты реализации, в которых одинаковые или разные A-L присутствуют на обоих концах М. Следует иметь в виду, что в тех случаях, когда определенный(ые) аналог(и) компстатина присутствует(ют) в качестве фрагмента аналога компстатина в соединении с формулой A-L-M, функциональная группа указанного аналога компстатина будет вступать в реакцию с функциональной группой L с образованием ковалентной связи с А или L. Например, клеточно-реактивный аналог компстатина, где фрагмент аналога компстатина включает аналог компстатина с аминокислотой с боковой цепью, содержащей первичную аминогруппу (NH₂) (такой аналог компстатина, который может быть представлен формулой R¹-(NH₂)), может иметь формулу R¹-NH-L-А, где образовалась новая ковалентная связь с L (например, N-С) и утрачен водород. Соответственно, термин «фрагмент аналога компстатина» включает молекулярные структуры, в которых по меньшей мере один атом аналога компстатина принимает участие в образовании ковалентной связи со вторым фрагментом, например, модификации боковой цепи. Сходный принцип применим к фрагментам аналога компстатина, присутствующим в описанном выше многовалентном соединении. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент на N-конце или С-конце аналога компстатина, например, аналога компстатина, описанного выше в Разделе IV, заменен на A-L в структуре клеточно-реактивного аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации или L содержит блокирующий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина имеет молярную активность, составляющую по меньшей мере примерно 10%, 20%, или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более от активности соответствующего аналога компстатина, имеющего такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, один или большее количество блокирующих фрагментов), но не содержащего клеточно-реактивный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации, отличающимся тем, что клеточно-реактивный аналог компстатина содержит несколько фрагментов аналога компстатина, молярная активность указанного клеточно-реактивного аналога компстатина составляет по меньшей мере примерно 10%, 20%, или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более от суммарной активности указанных фрагментов аналога компстатина.

[00131] Клеточно-реактивный фрагмент А согласно различным вариантам реализации может включать любую из разнообразных клеточно-реактивных функциональных групп J. В целом, клеточно-реактивная функциональная группа может быть выбрана по меньшей мере частично на основании таких факторов, как (а) конкретная функциональная группа, на которую необходимо нацеленно воздействовать; (b) способность указанной реактивной функциональной группы вступать в реакцию с целевой функциональной группой в физиологически приемлемых ex vivo условиях (например, при физиологически приемлемых значениях рН и осмолярности) и/или in vivo условиях (например, в крови); (с) специфичность реакции между указанной реактивной функциональной группой и целевой функциональной группой в физиологически приемлемых ex vivo условиях и/или in vivo; (d) стабильность (например, в in vivo условиях) ковалентной связи, образующейся при реакции указанной реактивной функциональной группы с целевой функциональной группой; (е) простота синтеза клеточно-реактивного аналога компстатина, содержащего указанную реактивную функциональную группу и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации выбирают реактивную функциональную группу, которая вступает в реакцию с целевой химической группой без высвобождения замещаемой группы. Согласно некоторым вариантам реализации выбирают реактивную функциональную группу, которая приводит к высвобождению замещаемой группы при реакции с мишенью. Соединения, содержащие такие группы, могут подходить, например, для мониторинга прогресса и/или степени реакции. Согласно некоторым вариантам реализации замещаемая группа является физиологически приемлемой для клеток, тканей или органов в синтезируемом количестве (например, в отношении концентрации и/или синтезируемого абсолютного количества) и/или медицински приемлемой для субъекта в синтезируемом in vivo количестве (например, в отношении концентрации в соответствующей физиологической жидкости, такой как кровь, и/или в отношении абсолютного синтезируемого количества). Согласно некоторым вариантам реализации синтезированную ex vivo замещаемую группу по меньшей мере частично удаляют, например, промыванием клеток, либо промыванием или перфузированием ткани или органа, например, солевым раствором.

[00132] Согласно многим вариантам реализации клеточно-реактивная функциональная группа, подходящая для настоящего изобретения, вступает в реакцию с боковой цепью остатка аминокислоты и/или с N-концевой аминогруппой или С-концевой карбоксильной группой белка. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточно-реактивная функциональная группа реакционноспособна в отношении сульфгидрильных (-SH) групп, которые присутствуют в боковых цепях остатков цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации применяют малеимидную группу. Малеимидные группы вступают в реакцию с сульфгидрильными группами остатков цистеина в белках при физиологических рН и образуют стабильную тиоэфирную связь. Согласно некоторым вариантам реализации применяют галогенацетильную группу, такую как йодоацетильная или бромацетильная группа. Галогенацетилы вступают в реакцию с сульфгидрильными группами при физиологических рН. Реакция йодоацетильной группы протекает с нуклеофильным замещением йода атомом серы из сульфгидрильной группы с образованием в результате стабильной тиоэфирной связи. Согласно другим вариантам реализации используют йодацетамидную группу. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивная функциональная группа вступает в реакцию с аминогруппами (-NH₂), которые присутствуют на N-концах белков и в боковых цепях остатков лизина (ε-аминогруппа). Согласно некоторым вариантам реализации применяют активированный сложный эфир, например, сукцинимидиловый сложный эфир (т.е. сложный NHS-эфир). Например, при синтезе может применяться н-гидроксисукцинимид (NHS) или его водорастворимый аналог (сульфо-NHS), таким образом, полученный клеточно-реактивный аналог компстатина содержит сложный NHS-эфир. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивная функциональная группа вступает в реакцию с карбоксильными (-СООН) группами, которые присутствуют на С-концах белков и в боковых цепях различных аминокислотные остатки. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина реакционноспособен в отношении гидроксильных (-ОН) групп, которые присутствуют в боковых цепях различных аминокислот и в углеводных фрагментах гликозилированных белков.

[00133] В целом, соединяющая часть L может включать любой один или большее количество алифатических и/или ароматических фрагментов, допускающих образование стабильного соединения, объединяющего связанные фрагменты. Термин «стабильный» в настоящем документе предпочтительно относится к соединениям, обладающим достаточной стабильностью, чтобы позволять получение и сохранение целостности указанного соединения на протяжении достаточного периода времени, например, подходящего для одной или нескольких из описанных в настоящем документе целей. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит насыщенную или ненасыщенную замещенную или незамещенную разветвленную или неразветвленную алифатическую цепь длиной от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 6, или 5 или менее атомов углерода, где под длиной имеется в виде число атомов С в главной (наиболее длинной) цепи. Согласно некоторым вариантам реализации указанная алифатическая цепь содержит один или большее количество гетероатомов (О, N, S), который может быть выбран независимо. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере 50% атомов главной цепи L являются атомами углерода. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент насыщенного алкила (СН₂)_n, где n составляет от 1 до 30.

[00134] Согласно некоторым вариантам реализации L содержит один или большее количество гетероатомов и имеет длину в общей сложности от 1 до 1000, от 1 до 800, от 1 до 600, от 1 до 400, от 1 до 300, от 1 до 200, от 1 до 100, от 1 до 50, от 1 до 30, или от 1 до 10 атомов углерода в цепи. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент олиго(этиленгликоля) (-(O-СН₂-СН₂-)_n), где значение n составляет от 1 до 500, от 1 до 400, от 1 до 300, от 1 до 200, от 1 до 100, от 10 до 200, от 200 до 300, от 100 до 200, от 40 до 500, от 30 до 500, от 20 до 500, от 10 до 500, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20 или от 1 до 10.

[00135] Согласно некоторым вариантам реализации L содержит ненасыщенный фрагмент, такой как -СН=СН- или -СН₂-СН=СН-; фрагмент, содержащий неароматическую циклическую кольцевую систему (например, циклогексильный фрагмент), ароматический фрагмент (например, ароматическую циклическую кольцевую систему, такую как фенильный фрагмент); фрагмент простого эфира (-С-O-С-); амидный фрагмент (-C(=O)-N-); фрагмент сложного эфира (-СО-O-); карбонильный фрагмент (-С(=O)-); фрагмент имина (-C=N-); фрагмент тиоэфира (-C-S-С-); аминокислотный остаток; и/или любой фрагмент, который может быть образован в ходе реакции двух совместимых реактивных функциональных групп. Согласно определенным вариантам реализации в одном или большем количестве фрагментов соединяющей части либо в клеточно-реактивном фрагменте один или большее количество атомов водорода (или других атомов) независимо замещены одним или большим количеством фрагментов, например, но не ограничиваясь перечисленными, алифатическими; ароматическими, арилом; алкилом, аралкилом, алканоилом, ароилом, алкокси; тио; F; Cl; Br; I; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCl2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; - или -GRG1 где G представляет собой -O-, -S-, -NRG2-, -С(=O)-, -S(=O)-, -SO2-, -С(=O)O-, -C(=O)NRG2-, -ОС(=О)-, -NRG2C(=O)-, -OC(=O)O-, -OC(=O)NRG2-, -NRG2C(=O)O-, -NRG2C(=O)NRG2-, -C(=S)-, -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=S)S-, -C(=NRG2)-, -C(=NRG2)O-, -C(=NRG2)NRG3-, -OC(=NRG2)-, -NRG2C(=NRG3)-, -NRG2SO2-, -NRG2SO2NRG3-, или -SO2NRG2-, где каждый из RG1, RG2 и RG3 независимо включает, не ограничиваясь перечисленными, водород, галоген или необязательно замещенный алифатический, ароматический или арильный фрагмент. Следует иметь в виду, что циклические кольцевые системы, в случае присутствия в качестве заместителей, могут необязательно быть присоединены посредством линейного фрагмента. Предпочтительно применяют такие комбинации заместителей и переменных параметров, предусмотренных настоящим изобретением, которые обеспечивают образование стабильных соединений, подходящих для любого одного или более из описанных в настоящем документе способов, например, подходящих для лечения одного или большего количества расстройств и/или для контакта с клеткой, тканью или органом согласно описанию в настоящем документе, и/или подходящих в качестве промежуточных соединений при получении одного или более из таких соединений.

[00136] L, согласно различным вариантам реализации, может включать любой один или большее количество фрагментов из описанных в предыдущем параграфе. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит два или большее количество разных фрагментов, связанных друг с другом с образованием структуры, как правило, длиной от 1 до примерно 60 атомов, от 1 до примерно 50 атомов, например, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, или от 1 до 6 атомов, где под длиной подразумевается число атомов в главной (наиболее длинной) цепи. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит два или большее количество разных фрагментов, связанных друг с другом с образованием структуры, как правило, содержащей от 1 до примерно 40, например, от 1 до 30, например, от 1 до 20, от 1 до 10, или от 1 до 6 атомов углерода в главной (наиболее длинной) цепи. В целом, структура такого клеточно-реактивного аналога компстатина может быть представлена формулой A-(L^Pj)j-M, где значение j составляет, как правило, от 1 до 10, и каждый L^Pj независимо выбран из фрагментов, описанных в предыдущем параграфе. Согласно многим вариантам реализации L содержит одну или большее количество углеродсодержащих цепей, таких как -(СН₂)n- и/или -(O-СН₂-СН₂-)n, которая(ые) соединена(ы) ковалентно друг с другом и/или с клеточно-реактивной функциональной группой или аналогом компстатина, например, посредством фрагментов (например, амидных фрагментов, фрагментов сложных эфиров или простых эфиров), образующихся при реакции двух совместимых реактивных функциональных групп. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент олиго(этиленгликоля) и/или насыщенную алкильную цепь. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит -(CH₂)_m-C(=O)-NH-(CH₂CH₂O)_n(СН₂)_рС(=O)- или -(CH₂)_m-C(=O)-NH-(CH₂)_p(OCH₂CH₂)_nC(=O)-. Согласно некоторым вариантам реализации m, n, и р подобраны таким образом, что число атомов углерода в указанной цепи составляет от 1 до 500, например, от 2 до 400, от 2 до 300, от 2 до 200, от 2 до 100, от 2 до 50, от 4 до 40, от 6 до 30, или от 8 до 20. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 500 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 400 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 300 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 200 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 100 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 50 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 25 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 8 и/или значение р составляет от 2 до 10. Необязательно по меньшей мере один -СН₂- заменен на CH-R, где R может представлять собой любой заместитель. Необязательно по меньшей мере один -СН₂- заменен на гетероатом, циклическую кольцевую систему, фрагмент амида, сложного эфира или простого эфира. Согласно некоторым вариантам реализации L не включает алкильную группу, содержащую более чем 3 атома углерода в наиболее длинной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации L не включает алкильную группу, содержащую более чем 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 атомов углерода в наиболее длинной цепи.

[00137] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А содержит клеточно-реактивную функциональную группу J и линкер L¹, содержащий соединяющую часть L^P1 и реактивную функциональную группу, которая вступает в реакцию с аналогом компстатина с образованием А-М. Согласно некоторым вариантам реализации применяют бифункциональный линкер L², содержащий две реактивные функциональные группы и соединяющую часть L^P2. Реактивные функциональные группы из L вступают в реакцию с подходящими реактивными функциональными группами из А и М с образованием клеточно-реактивного аналога компстатина A-L-M. Согласно некоторым вариантам реализации указанный аналог компстатина содержит линкер L³, содержащий соединяющую часть L^P3. Например, согласно приведенному ниже описанию, линкер, содержащий реактивную функциональную группу, может присутствовать на N- или С-конце, либо фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, может быть присоединен к N- или С-концу посредством линкера. Соответственно, L может содержать несколько соединяющих частей L^P, привнесенных, например, А, линкером(ами), применяемым(и) для объединения А и М, и/или аналогом компстатина. Следует понимать, что в случае присутствия в структуре A-L-M определенная(ые) реактивная(ые) функциональная(ые) групп(ы), присутствующая(ие) до реакции в L¹, L², L³ и т.п., пройдет(ут) через реакцию, так что только часть(и) указанной(ых) реактивной(ых) функциональной(ых) групп(ы) будет(ут) присутствовать в конечной структуре A-L-M, и указанное соединение будет содержать фрагменты, образованные в ходе реакции указанных функциональных групп. В общем случае, если соединение содержит две или большее количество соединяющих частей, указанные соединяющие части могут быть одинаковыми либо разными, и могут быть независимо выбраны согласно различным вариантам реализации. Несколько соединяющих частей L^P могут быть соединены друг с другом с образованием большей соединяющей части L, и по меньшей мере к некоторым из таких соединяющих частей может быть присоединен один или большее количество аналогов компстатина и/или одна или большее количество клеточно-реактивных функциональных групп. В молекулах, содержащих несколько аналогов компстатина, указанные аналоги компстатина могут быть одинаковыми либо разными, и в том случае, если они разные, могут быть независимо выбраны. То же относится и к соединяющим частям, и к реактивным функциональным группам. Настоящее изобретение охватывает применение многовалентных аналогов компстатина, содержащих одну или большее количество клеточно-реактивных функциональных групп, и применение конкатемеров аналогов компстатина, содержащих одну или большее количество клеточно-реактивных функциональных групп. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одна связь представляет собой стабильную нековалентную связь, такую как биотин/(стрепт)авидиновая связь, или другую нековалентную связь приблизительно эквивалентной силы.

[00138] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина содержит аналог компстатина, в котором любая из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 71, 72, 73, 74 или 75, удлинена за счет одной или большего количества аминокислот на N-конце, С-конца, или на обоих концах, причем по меньшей мере одна из указанных аминокислот имеет боковую цепь, содержащую реактивную функциональную группу, такую как первичный или вторичный амин, сульфгидрильная группа, карбоксильная группа (которая может присутствовать в виде карбоксилатной группы), гуанидиногруппа, фенольная группа, индольное кольцо, тиоэфир или имидазольное кольцо. Согласно некоторым вариантам реализации указанная(ые) аминокислота(ы) представляет(ют) собой L-аминокислоту(ы). Согласно некоторым вариантам реализации любая одна или более из указанных аминокислот представляет собой D-аминокислоту. Если добавлено несколько аминокислот, указанные аминокислоты могут быть независимо выбраны. Согласно некоторым вариантам реализации указанную реактивную функциональную группу (например, первичный или вторичный амин) используют в качестве мишени для добавления фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу. Аминокислоты с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, включают лизин (Lys) и диаминокарбоновые кислоты с общей структурой NH₂(CH₂)_nCH(NH₂)COOH, такие как 2,3-диаминопропионовая кислота (ДАПК), 2,4-диаминомасляная кислота (ДАМК) и орнитин (orn), где n=1 (ДАПК), 2 (ДАМК) и 3 (orn), соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одна аминокислота представляет собой цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аргинин, тирозин, триптофан, метионин или гистидин. Цистеин содержит боковую цепь, содержащую сульфгидрильную группу. Аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота содержат боковую цепь, содержащую карбоксильную группу (способную к ионизации до карбоксилатной группы). Аргинин содержит боковую цепь, содержащую гуанидиногруппу. Тирозин содержит боковую цепь, содержащую фенольную группу (способную к ионизации до фенолатной группы). Триптофан содержит боковую цепь, содержащую индольное кольцо. Метионин содержит боковую цепь, содержащую тиоэфирную группу. Гистидин содержит боковую цепь, содержащую имидазольное кольцо. Доступен широкий ряд нестандартных аминокислот, содержащих боковые цепи, включающие одну или большее количество таких реактивных функциональных групп, в том числе встречающиеся в природе аминокислоты и аминокислоты, отсутствующие в природе. См., например, Hughes, В. (ed.), Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry, Volumes 1-4, Wiley-VCH (2009-2011); Blaskovich, M., Handbook on Syntheses of Amino Acids General Routes to Amino Acids, Oxford University Press, 2010. Настоящее изобретение охватывает варианты реализации, в которых одну или большее количество нестандартных аминокислот применяют для добавления к основе фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу. Любая одна или более из указанных аминокислот может быть защищена подходящим образом во время синтеза указанного соединения. Так, одна или большее количество аминокислот могут быть защищены во время реакции(й), вовлекающей(их) боковую цепь целевой аминокислоты (мишени). Согласно некоторым вариантам реализации, которые отличаются тем, что в качестве основы для добавления фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу, применяют содержащую сульфгидрил аминокислоту, указанный сульфгидрил защищают во время циклизации указанного соединения за счет образования внутримолекулярной дисульфидной связи между другими аминокислотами, например, цистеинами.

[00139] В содержащемся в данном параграфе описании аминокислота с боковой цепью, содержащей аминогруппу, приводится в качестве примера. Настоящее изобретение охватывает аналогичные варианты реализации, когда применяется аминокислота с боковой цепью, содержащей другие реактивные функциональные группы. Согласно некоторым вариантам реализации аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, присоединяют непосредственно к N-концу или С-концу любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или посредством пептидной связи. Согласно некоторым вариантам реализации аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, присоединяют к N- или С-концу любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или посредством соединяющей части, которая может содержать любой один или большее количество соединяющих фрагментов из описанных выше. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере две аминокислоты добавляют на одном либо на обоих концах. Указанные две или большее количество добавленных аминокислот могут быть соединены друг с другом пептидными связями, или по меньшей мере некоторые из указанных добавленных аминокислот могут быть соединены друг с другом посредством соединяющей части, которая может содержать любой один или большее количество соединяющих фрагментов из описанных в настоящем документе. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина содержит фрагмент аналога компстатина М с формулой B1-R1- M₁ -R2-B2, где M₁ представляет любую из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, либо R1 или R2 может отсутствовать; по меньшей мере один R1 и R2 содержит аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин; и В1 и В2 представляют собой необязательно присутствующие блокирующие фрагменты. R1 и/или R2 может/могут быть присоединен(ы) к M₁ посредством пептидной связи или не-пептидной связи. R1 и/или R2 может/могут содержать соединяющую часть L^P3. Например, R1 может иметь формулу М₂-L^P3 и/или R2 может иметь формулу L^P3-М₂, где L^P3 представляет собой соединяющую часть, и М₂ содержит по меньшей мере одну аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин. Например, М₂ может представлять собой Lys или аминокислотную цепь, содержащую Lys. Согласно некоторым вариантам реализации L^P3 содержит одну или большее количество аминокислот или состоит из одной или большего количества аминокислот. Например, длина L^P3 может составлять от 1 до примерно 20 аминокислот, например, от 4 до 20 аминокислот длиной. Согласно некоторым вариантам реализации L^P3 содержит несколько остатков Gly, Ser и/или Ala, либо состоит из нескольких остатков Gly, Ser и/или Ala. Согласно некоторым вариантам реализации L^P3 не включает аминокислоты, содержащие реакционноспособную SH-группу, такие как Cys. Согласно некоторым вариантам реализации L^P3 содержит фрагмент олиго(этиленгликоля) и/или насыщенную алкильную цепь. Согласно некоторым вариантам реализации L^P3 присоединен к N-концевой аминокислоте M₁ амидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации L^P3 присоединен к С-концевой аминокислоте M₁ посредством амидной связи. Указанное соединение может быть затем удлинено на любом либо на обоих концах добавлением следующей(их) соединяющей(их) части(ей) и/или аминокислот(ы). Указанные аминокислоты могут быть одинаковыми либо разными; в том случае, если аминокислоты разные, они могут быть выбраны независимо. Согласно некоторым вариантам реализации применяют две или большее количество аминокислот с боковыми цепями, содержащих реактивные функциональные группы, отличающиеся тем, что указанные реактивные функциональные группы могут одинаковыми либо разными. Указанные две или большее количество реактивных функциональных групп могут применяться в качестве основы для добавления двух или большего количества фрагментов. Согласно некоторым вариантам реализации добавляют два или большее количество клеточно-реактивных фрагментов. Согласно некоторым вариантам реализации добавляют клеточно-реактивный фрагмент и нацеливающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации после включения указанной аминокислоты в пептидную цепь к боковой цепи аминокислоты присоединяют линкер и/или клеточно-реактивный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации линкер и/или клеточно-реактивный фрагмент уже присоединен к боковой цепи аминокислоты до применения указанной аминокислоты при синтезе клеточно-реактивного аналога компстатина. Например, может применяться производное Lys, содержащее присоединенный к его боковой цепи линкер. Указанный линкер может содержать клеточно-реактивную функциональную группу или может позже быть модифицирован таким образом, чтобы включать клеточно-реактивную функциональную группу.

[00140] Более подробное описание определенных клеточно-реактивных аналогов компстатина приводится ниже. В приведенном ниже описании пептид с последовательностью аминокислот Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr (SEQ ID NO: 37) (соответствующий аналогу компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 28, где звездочками в SEQ ID NO: 37 обозначены цистеины в активном соединении, соединенные дисульфидной связью, и (1Me)Trp означает 1-метил-триптофан)), применяют в качестве типового фрагмента аналога компстатина; малеимид (сокращенно Mal) применяют в качестве примера клеточно-реактивной функциональной группы; (СН2)_n и (O-СН2-СН2)_n применяют в качестве примеров соединяющих частей; лизин применяют в качестве примера аминокислоты, содержащей реактивную функциональную группу (в некоторых соединениях), и ацетилирование и амидирование N- и С-концов, соответственно, применяют в качестве необязательно присутствующих типовых блокирующих фрагментов в некоторых соединениях и выделяют курсивом, т.е. Ас и NH₂, соответственно. Следует иметь в виду, что указанные соединения могут быть получены с применением разнообразных методов синтеза и с использованием разнообразных предшественников. Обсуждение различных методов синтеза и предшественников ниже не подразумевает ограничения настоящего изобретения. В общем случае, любое свойство любого из описанных ниже или в настоящем документе соединений может быть без ограничений скомбинировано со свойством(ами) других описанных ниже или в настоящем документе соединений, и настоящее изобретение охватывает такие варианты реализации.

[00141] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный фрагмент обеспечивает клеточно-реактивной соединение, содержащее малеимидную группу (в качестве клеточно-реактивной функциональной группы) и алкановую кислоту (RCOOH), где R представляет собой алкильную группу. Например, может применяться 6-малеимидокапроновая кислота (Mal-(СН₂)₅-СООН), изображенная ниже.

[00142] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный фрагмент обеспечивает производное алкановой кислоты, которое содержит активированный фрагмент карбоновой кислоты, например, фрагмент ОН которой был преобразован в лучшую замещаемую группу. Например, может быть проведена реакция карбоксильной группы соединения I с ЭДК, с последующей реакцией с NHS (который может необязательно быть представлен водорастворимым сульфо-NHS), с получением сложноэфирного производного N-гидроксисукцинимида 6-малеимидокапроновой кислоты, т.е. сложного эфира N-гидроксисукцинимида (NHS) 6-малеимидогексановой кислоты (изображенного ниже).

[00143] Соединение с последовательностью SEQ ID NO: 37 может быть модифицировано на N- и/или С-конце для получения клеточно-реактивного аналога компстатина. Например, соединение II может применяться для синтеза следующего клеточно-реактивного аналога компстатина посредством реакции с N-концевой аминогруппой Ilе.

[00144] Малеимид-(СН₂)₅-С(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 38). Следует иметь в виду, что в последовательности SEQ ID NO: 38 фрагмент -С(=O) присоединен к непосредственно С-концевой аминокислоте (Ile) посредством связи C-N, где N является частью указанной аминокислоты и не показан.

[00145] Согласно другим вариантам реализации малеимидная группа соединена с Thr на С-конце с получением следующего клеточно-реактивного аналога компстатина:

[00146] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(С=O)-(СН₂)₅-малеимид (SEQ ID NO: 39).

[00147] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина может быть синтезирован с применением бифункционального линкера (например, гетеробифункционального линкера). Типовой гетеробифункциональный линкер, содержащий фрагменты (СН₂-СН₂-O)_n и (СН₂)_m (где m=2), приведен ниже:

[00148] Соединение III содержит малеимидную группу в качестве клеточно-реактивной функциональной группы и фрагмент сложного NHS-эфира, который легко вступает в реакцию с аминогруппой (например, N-концевой аминогруппой или аминогруппой боковой цепи аминокислоты).

[00149] Вариант реализации соединения III, где n=2, может применяться для синтеза следующего клеточно-реактивного аналога компстатина с применением аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 37:

[00150] Малеимид-(CH₂)₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂C(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 40)

[00151] Следует иметь в виду, что в соединении с последовательностью SEQ ID NO: 40 фрагмент -С(=O) присоединен к N-концевой аминокислоте (остаток Не) посредством связи C-N, где N является частью указанной аминокислоты и не показан. Согласно некоторым вариантам реализации линкер имеет формулу Соединения III, где n≥1. Примеры значений n для фрагмента (СН₂-СН₂-O)_n приведены в настоящем документе.

[00152] Согласно некоторым вариантам реализации алкильная цепь, соединяющая фрагмент малеимида с остальной частью молекулы, содержит большее или меньшее число метиленовых единиц, фрагмент олиго(этиленгликоля) содержит большее или меньшее число единиц этиленгликоля и/или указанный фрагмент олиго(этиленгликоля) фланкирован большим или меньшим количеством метиленовых единиц с любой или с обеих сторон, по сравнению с соединением с последовательностью SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40. Примеры клеточно-реактивных аналогов компстатина, иллюстрирующие некоторые из таких вариантов, приведены ниже (SEQ ID NO: 41-46):

[00153] Малеимид-(СН₂)₂-С(=O)-NH-СН₂СН₂ОСН₂СН₂С(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 41)

[00154] Малеимид-(CH₂)₃-C(=O)-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂C(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 42)

[00155] Малеимид-(CH₂)₅-C(=O)-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂C(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 43)

[00156] Малеимид-(СН₂)₄-С(=O)-NH-СН₂СН₂ОСН₂СН₂ОСН₂СН₂С(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 44)

[00157] Малеимид-(СН₂)₂-С(=O)-NH-СН₂СН₂ОСН₂СН₂ОСН₂СН₂С(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 45)

[00158] Малеимид-(СН₂)₅-С(=O)-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂C(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 46)

[00159] Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 37 удлинен включением остатка Lys на N- или С-конце указанного пептида, например, согласно приведенному ниже примеру для С-концевой связи:

[00160] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-NH₂ (SEQ ID NO: 47).

[00161] Согласно некоторым вариантам реализации остаток Lys присоединен к N-или С- концу последовательности SEQ ID NO: 37 посредством пептидного линкера, например, согласно приведенному ниже примеру для С-концевой связи:

[00162] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)₅-Lys-NH₂ (SEQ ID NO: 48).

[00163] Согласно некоторым вариантам реализации к N- или С-концу аналога компстатина добавляют линкер, содержащий первичный или вторичный амин. Согласно некоторым вариантам реализации указанный линкер содержит алкильную цепь и/или фрагмент олиго(этиленгликоля). Например, может применяться NH₂(CH₂CH₂O)nCH₂C(=O)OH (например, 8-амино-3,6-диоксаоктановая кислота (АЕЕАс) или 11-амино-3,6,9-триоксаундекановая кислота) или ее сложный NHS-эфир (например, сложный NHS-эфир 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты или 11-амино-3,6,9-триоксаундекановой кислоты). Согласно некоторым вариантам реализации полученное соединение представлено следующим (часть, соответствующая линкеру, выделена жирным шрифтом):

[00164] NH₂(СН₂)₅С(=O)-Ile-Cys-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 49)

[00165] NH₂(CH₂CH₂O)₂CH₂C(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 50)

[00166] Согласно некоторым вариантам реализации остаток Lys присоединен к N-или С-концу SEQ ID NO: 37 посредством линкера, включающего непептидную часть. Например, указанный линкер может включать алкильную цепь, цепь олиго(этиленгликоля) и/или циклическую кольцевую систему. Согласно некоторым вариантам реализации применяют 8-АЕЕАс или ее сложный NHS-эфир, получая (в случае присоединения Lys на С-конце) следующее соединение (часть, относящаяся к 8-АЕЕАс, выделена жирным шрифтом):

[00167] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂-C(=O)-Lys-NH₂ (SEQ ID NO: 51)

[00168] Следует иметь в виду, что в последовательностях SEQ ID NO: 49 и 50 фрагмент -С(=O) присоединен к смежному остатку Ilе посредством C-N связи, где N является частью указанной аминокислоты и не показан. Сходным образом, в SEQ ID NO: 51 фрагмент -С(=O) присоединен к смежному остатку Lys посредством C-N связи, где N является частью указанной аминокислоты и не показан. Следует также иметь в виду, что в SEQ ID NO: 51 фрагмент NH присоединен к непосредственно N-концевой аминокислоте (Thr) посредством C-N связи, где С представляет собой атом углерода карбонила указанной аминокислоты и не показан.

[00169] Соединения с последовательностями SEQ ID NO: 47-51, могут легко быть модифицированы по первичной аминогруппе с получением клеточно-реактивного аналога компстатина. Например, может быть проведена реакция соединений с последовательностями SEQ ID NO: 47-51 (или других соединений, содержащих первичный или вторичный амин и фрагмент аналога компстатина) со сложным эфиром N-сукцинимидила 6-малеимидокапроновой кислоты с получением следующих клеточно-реактивных аналогов компстатина:

[00170] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-(C(=O)-(CH₂)₅-Mal)-NH₂ (SEQ ID NO: 52).

[00171] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)₅-Lys-(C(=O)-(CH₂)₅-Mal)-NH₂ (SEQ ID NO: 53).

[00172] Mal-(CH₂)₅-(C(=O)-NH(CH2)₅C(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 54)

[00173] Mal-(CH₂)₅-(C(=O)NH(CH₂CH₂O)₂CH₂C(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH₂ (SEQ ID NO: 55)

[00174] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH₂)₅-Mal)-NH₂ (SEQ ID NO: 56)

[00175] Согласно другому варианту реализации клеточно-реактивный аналог компстатина представлен следующим: Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-C(=O)-CH₂(OCH₂CH2)₂NH(C(=O)-(CH₂)₅-Mal)-NH₂ (SEQ ID NO: 57).

[00176] В настоящем изобретении предложены варианты последовательностей SEQ ID NO: 38-57, где -Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr- (SEQ ID NO: 76) заменен на последовательность аминокислот, содержащую последовательность аминокислот любого другого аналога компстатина, например, согласно любой из последовательностей SEQ ID NO 3-27 или 29-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, при условии, что блокирующий(ие) фрагмент(ы), присутствующий(ие) на N-и/или С-концах аналога компстатина, могут отсутствовать, быть заменены на линкер (который может содержать блокирующий фрагмент) или присоединены к другой N-или С-концевой аминокислоте, присутствующей в соответствующем(их) варианте(ах).

[00177] Другие бифункциональные кросс-линкеры, содержащие малеимид в качестве клеточно-реактивного фрагмента и сложный NHS-эфир в качестве амино-реакционноспособного фрагмента, подходящего для различных вариантов реализации настоящего изобретения, включают, например, сукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)бутират (SMPB); сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC); сложный эфир N-γ-малеимидобутирил-оксисукцинимида (GMBS). Добавление сульфоната к кольцу NHS дает водорастворимые аналоги, такие как сульфосукцинимидил(4-йодоацетил)-аминобензоат (сульфо-SIAB), сульфо-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), сульфо-сукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)бутират (сульфо-SMPB), сульфо-N-γ-малеимидобутирил-оксисукцинимид сложный эфир (сульфо-GMBS) и т.п., которые могут позволить избежать необходимости использования органического растворителя. Согласно некоторым вариантам реализации применяют длинноцепочечный вариант любого из вышеназванных аналогов, содержащий спейсерный отрезок между фрагментом сложного NHS-эфира и остальной частью указанной молекулы. Указанный спейсер может включать, например, алкильную цепь. Примером является сукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбокси-[6-амидокапроат].

[00178] Согласно некоторым вариантам реализации применяют бифункциональный линкер, содержащий сложный NHS-эфир (в качестве амино-реакционноспособного фрагмента) и йодоацетильную группу (реакционноспособную в отношении сульфгидрильных групп). Такие линкеры включают, например, н-сукцинимидил(4-йодоацетил)-аминобензоат (SIAB); сукцинимидил 6-[(йодоацетил)-амино]гексаноат (SIAX); сукцинимидил 6-[6-(((йодоацетил)амино)-гексаноил) амино]гексаноат (SIAXX); сукцинимидил 4-((йодоацетил)амино)метил)-циклогексан-1-карбоксилат (SIAC); сукцинимидил 6-((((4-(йодоацетил)амино)метил-циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (SIACX);

[00179] Согласно некоторым вариантам реализации применяют бифункциональный линкер, содержащий сложный NHS-эфир (в качестве амино-реакционноспособного фрагмента) и пиридил-дисульфидную группу (в качестве клеточно-реактивного фрагмента, реакционноспособного в отношении сульфгидрильных групп). Примеры включают N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP); сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (SMPT) и варианты, содержащие сульфонат на кольце NHS и/или спейсер, содержащий алкильную цепь между фрагментом сложного NHS-эфира и остальной частью молекулы (например, сукцинимидил 6-(3-[2-пиридилдитио]-пропионамидо)гексаноат) (LC-SPDP). Могут применяться варианты таких линкеров, включающие дополнительные или другие фрагменты. Например, для спейсера может быть использована более длинная или более короткая алкильная цепь, либо вместо алкильной цепи может быть использован фрагмент олиго(этиленгликоля).

[00180] В общем случае клеточно-реактивный аналог компстатина может быть синтезирован с применением разнообразных методов. Клеточно-реактивный соединения, включающие клеточно-реактивную функциональную группу и линкер, часто доступны для приобретения в виде готовых составляющих. Например, 6-малеимидокапроновую кислоту и сложный эфир N-гидроксисукцинимида 6-малеимидокапроновой кислоты можно приобрести у различных поставщиков. Как вариант, такие соединения могут быть синтезированы с применением известных в данной области техники способов. См., например, Keller О, Rudinger J. Helv Chim Acta. 58(2): 531-41, 1975 и Hashida S, et al., J Appl Biochem., 6(1-2): 56-63, 1984. См. также Hermanson, G. выше, и ссылки в указанном источнике, для ознакомления с описаниями способов и реагентов, подходящих для синтеза конъюгатов. В целом, настоящее изобретение охватывает любой способ получения соединения, содержащего фрагмент аналога компстатина и клеточно-реактивную функциональную группу, и полученные соединения.

[00181] Согласно некоторым вариантам реализации при синтезе линейного пептида применяют аминокислоту, содержащую линкер, присоединенный к боковой цепи. Указанный линейный пептид может быть синтезирован с применением стандартных методов пептидного синтеза, известных в данной области техники, например, с помощью стандартного твердофазного синтеза пептидов. Линейный пептид затем циклизуют (например, окислением остатков Cys с образованием внутримолекулярного дисульфида). Затем может быть проведена реакция указанного циклического соединения с линкером, содержащим клеточно-реактивную функциональную группу. Согласно другим вариантам реализации проводят реакцию фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу, с линейным соединением, перед его циклизацией. В общем случае реактивные функциональные группы могут быть подходящим образом защищены, чтобы избежать ненужной реакции между ними во время синтеза клеточно-реактивного аналога компстатина. Клеточно-реактивная функциональная группа, любая из боковых цепей аминокислот и/или любой или оба конца указанного пептида могут быть защищены во время указанной реакции, а затем защита может быть снята. Например, SH-группы остатков Cys и/или SH-реакционноспособные фрагменты, такие как малеимиды, могут быть защищены до окончания циклизации, чтобы избежать реакции между ними. Условия реакции подбирают по меньшей мере частично с учетом необходимых для конкретной(ых) реактивной(ых) функциональной(ых) групп(ы) условий получения удовлетворительного выхода за приемлемый период времени. Температура, рН и концентрация реагентов могут быть скорректированы для обеспечения нужной степени или скорости реакции. См., например, Hermanson, выше. Требуемый продукт может быть очищен, например, с удалением непрореагировавшего соединения, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу, непрореагировавшего аналога компстатина, линкера(ов), продуктов, отличных от требуемого клеточно-реактивного аналога компстатина, которые могли образоваться в ходе реакции, других веществ, присутствующих в реакционной смеси и т.п. Композиции и способы получения клеточно-реактивных аналогов компстатина и промежуточные материалы при их синтезе, представляют собой аспекты настоящего изобретения.

[00182] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения вышеописанный(ые) линкер(ы) применяют при получении аналогов компстатина, содержащих такой фрагмент, как цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ) или другой(ие) полимер(ы), например, стабилизирующий указанное соединение, увеличивающий время его жизни в организме, повышающий его растворимость, уменьшающий иммуногенность и/или повышающий его устойчивость к разрушению. Без какого-либо ограничения настоящего изобретения в настоящем документе такой фрагмент может называться «снижающим клиренс фрагментом» (СКФ), а аналог компстатина, содержащий такой фрагмент, может называться «аналогом компстатина длительного действия». Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни в плазме аналога компстатина длительного действия составляет по меньшей мере 1 день, например, 1-3 дня, 3-7 дней, 7-14 дней, или 14-28 дней, при введении в/в в дозе 10 мкг/кг людям или не являющимся людьми приматам, или в дозе, составляющей примерно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг, 5-10 мкг/кг, например, 7 мкг/кг. Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни в плазме аналога компстатина длительного действия составляет по меньшей мере 1 день, например, 1-3 дней, 3-7 дней, 7-14 дней или 14-28 дней, при введении подкожно, например, в дозе, составляющей примерно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг, 5-10 мкг/кг, например, 7 мкг/кг, людям или не являющимся людьми приматам. Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни (например, конечное время полужизни) в плазме аналога компстатина длительного действия составляет примерно от 4-10, 5-9, 5-8, 6-9, 7-9, или 8-9 дней, например, примерно 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 дней при введении внутривенно, например, в дозе, составляющей примерно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг или 5-10 мкг/кг, например, 7 мкг/кг, людям или не являющимся людьми приматам. Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни (например, конечное время полужизни) в плазме аналога компстатина длительного действия составляет примерно от 4-10, 5-9, 5-8, 6-9, 7-9, или 8-9 дней, например, примерно 4;4,5; 5;5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 дней, при введении подкожно, например, в дозе, составляющей примерно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг, 5-10 мкг/кг, например, 7 мкг/кг, людям или не являющимся людьми приматам. Согласно определенным вариантам реализации аналог компстатина длительного действия характеризуется тем, что он интенсивно абсорбируется из участка введения на протяжении периода времени после подкожной инъекции и обеспечивает, например, через или спустя примерно 1-2 дня после введения, уровень в крови, сопоставимый с уровнем, которого можно добиться при введении того же количества соединения внутривенно. Согласно некоторым вариантам реализации указанный уровень в крови через или спустя примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более дней после введения подкожной дозы находится в пределах примерно 5%, 10%, 15%, 20%, или 25% от уровня в крови, которого можно добиться при введении того же количества соединения внутривенно. См., например, фиг. 11, демонстрирующую фармакокинетику вводимой внутривенно и подкожно дозы для типового описанного в настоящем документе соединения примерно через 1-2 дня после введения. Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни в плазме аналога компстатина длительного действия при введении в/в в дозе 10 мкг/кг людям или не являющимся людьми приматам увеличивается по меньшей мере в 2 раза, например, например, в 2-5, 5-10, 10-50, или 50-100, или 100-150, или 150-200 раз по сравнению с соответствующим аналогом компстатина, имеющим такую же последовательность (и, в надлежащих случаях, содержащим один или большее количество блокирующих фрагментов) но не содержащим указанный СКФ. Следует понимать, что согласно различным вариантам реализации такое увеличение времени полужизни может наблюдаться после введения другими путями, например, подкожного введения, и/или при применении других доз, например, других описанных в настоящем документе доз, например, 20 мкг/кг. Как уже отмечалось, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75 удлинен посредством одной или большего количества аминокислот на N-конце, С-конце или на обоих концах, при этом по меньшей мере одна из указанных аминокислот содержит боковую цепь, содержащую реактивную функциональную группу, такую как первичный или вторичный амин, сульфгидрильную группу, карбоксильную группу (которая может присутствовать в виде карбоксилатной группы), гуанидиногруппу, фенольную группу, индольное кольцо, тиоэфир или имидазольное кольцо, что облегчает конъюгирование с реактивной функциональной группой с присоединением СКФ к указанному аналогу компстатина. Следует понимать, что в соответствующем аналоге компстатина, не содержащем СКФ, может также отсутствовать одна или несколько таких аминокислот из присутствующих в аналоге компстатина длительного действия, которому он соответствует. Таким образом, подразумевается, что соответствующий аналог компстатина, содержащий любой из SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, и не содержащий СКФ, «имеет такую же последовательность аминокислот», что и последовательности SEQ ID NO: 3-36, 37, 71. 72, 73, 74 или 75, соответственно. Например, подразумевается, что соответствующий аналог компстатина, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36 и не содержащий СКФ, «имеет такую же последовательность аминокислот», что и SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации время полужизни в плазме представляет собой конечное время полужизни после введения одной в/в дозы. Согласно некоторым вариантам реализации время полужизни в плазме представляет собой конечное время полужизни после достижения равновесного состояния после введения нескольких в/в доз. Согласно некоторым вариантам реализации после введения примату одной в/в дозы или после введения нескольких в/в доз достигается значение Cmax аналога компстатина длительного действия в плазме, превышающее значение для соответствующего аналога компстатина, не содержащего СКФ, по меньшей мере в 5 раз, например, в 5-50 раз. Согласно некоторым вариантам реализации после введения примату одной в/в дозы или после введения нескольких в/в доз достигается значение Cmax аналога компстатина длительного действия в плазме, превышающее значение для соответствующего аналога компстатина, не содержащего СКФ, в 10-20 раз. Согласно некоторым вариантам реализации примат представляет собой человека. Согласно некоторым вариантам реализации примат представляет собой не являющегося человеком примата, например, обезьяну, такую как яванский макак или макак-резус. Согласно некоторым вариантам реализации почечный клиренс аналога компстатина длительного действия в течение первых 24 часов после введения в/в в дозе 10 мг/кг или 20 мкг/кг людям или не являющимся людьми приматам ниже по меньшей мере в 2 раза, например, в 2-5, 5-10, 10-50 или 50-100, или в 100-150, или в 150-200 раз, чем почечный клиренс соответствующего аналога компстатина. Следует понимать, что согласно различным вариантам реализации такое снижение почечного клиренса может наблюдаться после введения другими путями, например, подкожного введения, и/или при применении других доз, например, других описанных в настоящем документе доз, например, 20 мкг/кг. Концентрация аналога компстатина в образцах крови и/или мочи может быть измерена с применением, например, УФ, ВЭЖХ, масс-спектроскопии (МС) или антител к СКФ, или комбинации таких способов, как ЖХ/МС или ЖХ/МС/МС. Параметры фармакокинетики, такие как время полужизни и клиренс, могут быть определены с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Фармакокинетический анализ может быть выполнен, например, с применением программного обеспечения WinNonlin v 5.2 (Pharsight Corporation, Сент-Луис, Миссури) или других подходящих программ.

[00183] Согласно определенным вариантам реализации СКФ стабилен в физиологических условиях на протяжении по меньшей мере 24 часов или более. Согласно определенным вариантам реализации СКФ стабилен в крови, плазме или сыворотке млекопитающего, например, примата, например, человека или не являющегося человеком примата (например, обезьяны) на протяжении по меньшей мере 24 часов. Согласно различным вариантам реализации по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более молекул СКФ остаются интактными при инкубировании в физиологических условиях на протяжении 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 120 часов, 144 часов, 168 часов или более. Согласно различным вариантам реализации по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более молекул СКФ остаются интактными при инкубировании в крови, плазме или сыворотке при 37 градусах С на протяжении 48 часов, 72 часов, 96 часов, 120 часов, 144 часов, 168 часов или более. Инкубирование может проводиться с применением СКФ в концентрации от 1 мкг/мл до примерно 100 мг/мл согласно различным вариантам реализации. Образцы могут анализироваться в различные моменты времени. Размер или интактность могут оцениваться с применением, например, хроматографии (например, ВЭЖХ), масс-спектрометрии, вестерн-блоттинга или любого другого подходящего способа. Такие характеристики стабильности могут быть приданы фрагменту, конъюгированному с СКФ. Согласно различным вариантам реализации аналог компстатина длительного действия, содержащий СКФ, может обладать любыми из вышеупомянутых характеристик стабильности. Согласно некоторым аспектам интактный в отношении аналога компстатина длительного действия означает, что указанный фрагмент аналога компстатина остается конъюгированным с СКФ, и размер СКФ остается примерно таким же, как и в начале инкубирования или введения.

[00184] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия обладает молярной активностью, составляющей по меньшей мере примерно 10%, 20%, 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более от активности соответствующего аналога компстатина, имеющего такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, содержащего один или большее количество блокирующих фрагментов), но не содержащего СКФ. В некоторых вариантах реализации, согласно которым аналог компстатина длительного действия содержит несколько фрагментов аналога компстатина, молярная активность указанного аналога компстатина длительного действия составляет по меньшей мере примерно 10%, 20%, или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более от суммарной активности указанных фрагментов аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации полиэтиленгликоль (ПЭГ) содержит фрагмент (СН₂СН₂О)_n с молекулярной массой, составляющей по меньшей мере 500 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации описанный выше линкер содержит фрагмент (СН₂СН₂О)_n со средней молекулярной массой от примерно 500; 1000; 1500; 2000; 5000; 10000; 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000; до 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации средняя молекулярная масса ПЭГ составляет по меньшей мере 20000 Дальтон, и до примерно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон. «Средняя молекулярная масса» относится к среднему значению молекулярной массы. Согласно некоторым вариантам реализации полидисперсность D фрагмента (СН₂СН₂О)n составляет от 1,0005 до 1,50, например, от 1,005 до 1,10; 1,15;1,20; 1,25; 1,30; 1,40 или 1,50; или принимает любое значение от 1,0005 до 1,50.

[00185] Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент (СН₂СН₂О)n является монодисперсным, и значение полидисперсности фрагмента (СН₂СН₂О)n составляет 1,0. Такие монодисперсные фрагменты (СН₂СН₂О)n известны в данной области техники, коммерчески доступны у Quanta BioDesign (Пауэлл, Огайо) и включают, в качестве неограничивающего примера, монодисперсные фрагменты, значение n для которых составляет 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 или 24.

[00186] Согласно некоторым вариантам реализации соединение содержит несколько фрагментов (СН₂СН₂О)_n, отличающихся тем, что общая молекулярная масса указанных (СН₂СН₂О)_n фрагментов составляет примерно от 1000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 до 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации средняя общая молекулярная масса указанного соединения или фрагментов (СН₂СН₂О)_n составляет по меньшей мере 20000 Дальтон, и до примерно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации указанное соединение содержит несколько фрагментов (СН₂СН₂О)_n определенной длины, например, n=4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или более. Согласно некоторым вариантам реализации указанное соединение содержит достаточное число фрагментов (СН₂СН₂О)_n определенной длины, чтобы общая молекулярная масса указанных фрагментов (СН₂СН₂О)_n составляла от примерно 1000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 до 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации средняя общая молекулярная масса указанного соединения или фрагментов (СН₂СН₂О)_n составляет по меньшей мере 20000 Дальтон и до примерно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации значение n составляет от примерно 30 до примерно 3000. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент аналога компстатина присоединяют на каждом из концов линейного ПЭГ. Бифункциональный ПЭГ, содержащий реактивную функциональную группу на каждом конце указанной цепи, может применяться, например, согласно приведенному выше описанию. Согласно некоторым вариантам реализации указанные реактивные функциональные группы идентичны, тогда как согласно некоторым вариантам реализации на каждом конце присутствуют разные реактивные функциональные группы. Согласно некоторым вариантам реализации несколько фрагментов (СН₂СН₂О)_n представлено в виде разветвленных структур. Ветви могут быть присоединены к линейному полимерному остову (например, в виде гребенчатой структуры) или могут отходить от одной или большего количества групп центрального ядра, например, в виде звездообразной структуры. Согласно некоторым вариантам реализации разветвленная молекула содержит от 3 до 10 цепей (СН₂СН₂О)_n. Согласно некоторым вариантам реализации разветвленная молекула содержит от 4 до 8 цепей (СН₂СН₂О)_n. Согласно некоторым вариантам реализации разветвленная молекула содержит 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 цепи (СН₂СН₂О)_n. Согласно некоторым вариантам реализации звездообразная молекула содержит 10-100, 10-50, 10-30 или 10-20 цепей (СН₂СН₂О)_n, отходящих от группы центрального ядра. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия, таким образом, может содержать, например, 3-10 фрагментов аналога компстатина, например, 4-8 фрагментов аналога компстатина, каждый из которых присоединен к цепи (СН₂СН₂О)_n посредством функциональной группы на конце указанной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия может содержать, например, 10-100 фрагментов аналога компстатина, каждый из которых присоединен к цепи (СН₂СН₂О)_n посредством функциональной группы на конце указанной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации ветви (иногда называемые «ответвлениями») разветвленных или звездообразных ПЭГ содержат примерно одинаковое количество фрагментов (СН₂СН₂О). Согласно некоторым вариантам реализации длины по меньшей мере некоторых ветвей могут отличаться. Следует понимать, что согласно некоторым вариантам реализации одна или большее количество цепей (СН₂СН₂О)_n не содержит присоединенного фрагмента аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере примерно к 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 100% указанных цепей присоединен фрагмент аналога компстатина.

[00187] В показанных в настоящем документе классах и соединениях фрагмент полиэтиленгликоля изображен с атомом кислорода с правой стороны повторяющегося звена или с левой стороны повторяющегося звена. В тех случаях, когда изображен только один вариант ориентации, настоящее изобретение охватывает обе ориентации (т.е. (СН₂СН₂О)_n и (СН₂СН₂О)_n) фрагментов полиэтиленгликоля для конкретного соединения или класса; либо, в тех случаях, когда соединение или класс содержит несколько фрагментов полиэтиленгликоля, настоящим изобретением охвачены все комбинации ориентаций.

[00188] Формулы некоторых примеров монофункциональных ПЭГ, содержащих реактивную функциональную группу, приведены ниже. С иллюстративной целью показаны формулы, в которых указанная(ые) реактивная(ые) функциональная(ые) группа(ы) включает(ют) сложный NHS-эфир, но могут применяться и другие реактивные функциональные группы, например, соответствующие приведенному выше описанию. Согласно некоторым вариантам реализации показан (СН₂СН₂О)_n с метоксигруппой (ОСН₃) на левом конце, однако следует понимать, что изображенные ниже и в других местах в настоящем документе цепи могут оканчиваться другим OR-фрагментом (например, алифатической группой, алкильной группой, низшей алкильной группой или любой другой подходящей концевой группой ПЭГ) или ОН-группой. Следует также иметь в виду, что, согласно различным вариантам реализации, фрагмент (СН₂СН₂О)_n с NHS-группой могут соединять фрагменты, отличные от изображенных.

[00189] Согласно некоторым вариантам реализации монофункциональный ПЭГ имеет формулу А:

где «Реактивная функциональная группа» и n соответствуют определению, данному выше и описанию классов и подклассов в настоящем документе;

R¹ представляет собой водород, алифатическую группу или любую подходящую концевую группу; и

Т представляет собой ковалентную связь или прямую или разветвленную углеводородную цепь C_1-12, где одна или большее количество углеродных единиц Т необязательно и независимо заменена на -О-, -S-, -N(R^x)-, -С(О)-, -С(O)O-, -ОС(О)-, -N(R^x)C(O)-, -C(O)N(R^x)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R^x)SO₂- или -SO₂N(R^x)-; и

каждый R^x независимо представляет собой водород или алифатический C_1-6.

[00190] Примеры монофункциональных ПЭГ формулы А включают:

[00191] В формуле I фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -CO-(CH₂)_m-COO-NHS, где m=2. Согласно некоторым вариантам реализации монофункциональный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле I, где значение m составляет от 1 до 10, например, от 1 до 5. Например, согласно некоторым вариантам реализации m равен 3, как показано ниже:

[00192] В формуле II фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -(CH₂)_m-COO-NHS, где m=1. Согласно некоторым вариантам реализации монофункциональный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле II, где значение m составляет от 1 до 10 (например, где m равен 5, как показано в формуле III, приведенной ниже), или где m равен 0 (как показано ниже в формуле IIIa).

[00193] Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный линейный ПЭГ включает фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу на каждом из концов. Указанные реактивные функциональные группы могут быть одинаковыми (гомобифункциональными) или разными (гетеробифункциональными). Согласно некоторым вариантам реализации структура бифункционального ПЭГ может быть симметричной, при этом для соединения реактивной функциональной группы с кислородными атомами на каждом конце цепи -(СН₂СН₂О)_n применяют одинаковые фрагменты. Согласно некоторым вариантам реализации для соединения указанных двух реактивных функциональных групп с ПЭГ-частью указанной молекулы применяют разные фрагменты. Структуры типовых бифункциональных ПЭГ изображены ниже. Для иллюстративных целей приведены формулы, в которых указанная(ые) реактивная(ые) функциональная(ые) группа(ы) включают сложный NHS-эфир, но могут использоваться и другие реактивные функциональные группы.

[00194] Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный линейный ПЭГ имеет формулу В:

где каждый Т и «Реактивная функциональная группа» независимо соответствуют приведенным выше определениям и описаны в классах и подклассах в настоящем документе, и n соответствует приведенным выше определениям и описан в классах и подклассах в настоящем документе.

[00195] Примеры бифункциональных ПЭГ, имеющих формулу В, включают:

[00196] В формуле IV фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -(CH₂)_m-COO-NHS, где m=1. Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле IV, где значение m составляет от 1 до 10, например, от 1 до 5. Согласно определенным вариантам реализации m=0, например, фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -COO-NHS. Например, согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный ПЭГ имеет структуру формулы IVa, как показано ниже:

[00197] В формуле V фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -CO-(CH₂)_m-COO-NHS, где m=2. Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональные ПЭГ имеют структуру, соответствующую формуле V, где значение m составляет от 1 до 10, например, от 1 до 5. Согласно определенным вариантам реализации, например, m=2, как показано ниже:

[00198] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен аналог компстатина, конъюгированный с полимером. Согласно некоторым вариантам реализации для синтеза таких конъюгатов проводят реакцию функциональной группы (например, амина, гидроксила или тиольной группы) на аналоге компстатина с ПЭГ-содержащим соединением, имеющим «реактивную функциональную группу» согласно описанию в настоящей заявке. К примеру, формулы III и IV, соответственно, могут образовывать конъюгаты аналога компстатина со структурой:

где представляет собой точку присоединения аминогруппы на аналоге компстатина. Согласно определенным вариантам реализации аминогруппа представляет собой группу боковой цепи лизина.

[00199] Следует иметь в виду, что могут быть получены соответствующие конъюгаты с любым из описанных в настоящей заявке ПЭГ-содержащих соединений и классов, в зависимости от выбора реактивной функциональной группы и/или функциональной группы компстатина. Например, формулы IVa и Va, соответственно, могут образовывать конъюгаты аналога компстатина со структурой

Согласно определенным вариантам реализации ПЭГ-компонент таких конъюгатов имеет среднюю молекулярную массу, составляющую примерно 20 кДа - 100 кДа, примерно 20 кДа - 90 кДа, примерно 20 кДа - 80 кДа, примерно 20 кДа - 70 кДа, примерно 20 кДа - 60 кДа, примерно 20 кДа - 50 кДа, примерно 30 кДа - 80 кДа, примерно 30 кДа - 70 кДа, примерно 30 кДа - 60 кДа, примерно 30 кДа - 50 кДа, примерно 30 кДа - 45 кДа, примерно 35 кДа - 50 кДа, примерно 35 кДа - 45 кДа, примерно 36 кДа - 44 кДа, примерно 37 кДа - 43 кДа, примерно 38 кДа - 42 кДа или примерно 39 кДа - 41 кДа. Согласно определенным вариантам реализации ПЭГ-компонент таких конъюгатов имеет среднюю молекулярную массу, составляющую примерно 40 кДа. Термин «бифункциональный» или «бифункционализированный» иногда используется в настоящем документе для обозначения соединения, содержащего два фрагмента аналога компстатина, связанных с СКФ. Такие соединения могут обозначаться буквами «BF». Согласно некоторым вариантам реализации бифункционализированное соединение является симметричным. Согласно некоторым вариантам реализации связи между СКФ и каждым из фрагментов аналога компстатина бифункционализированного соединения являются идентичными. Согласно некоторым вариантам реализации каждая связь между СКФ и аналогом компстатина бифункционализированного соединения содержит карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации каждая связь между СКФ и аналогом компстатина бифункционализированного соединения содержит карбамат и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации каждый аналог компстатина бифункционализированного соединения непосредственно связан с СКФ через карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации каждый аналог компстатина бифункционализированного соединения непосредственно связан с СКФ через карбамат, и указанное бифункционализированное соединение имеет структуру:

[00200] Согласно некоторым вариантам реализации формул и вариантов реализации, описанных в настоящем документе, представляет точку присоединения группы боковой цепи лизина в аналоге компстатина, имеющем структуру:

где символом обозначена точка присоединения химического фрагмента к оставшейся части молекулы или химической формулы.

[00201] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный, гребенчатый или звездообразный ПЭГ содержит фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу на конце каждой из нескольких цепей -(СН₂СН₂О)_n. Указанные реактивные функциональные группы могут быть одинаковыми, либо по меньшей мере две группы могут быть разными. Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный, гребенчатый или звездообразный ПЭГ имеет формулу, выбранную из следующих:

[00202] где каждый R² независимо представляет собой «реактивную функциональную группу», или R¹, и каждый из Т, n и «реактивных функциональных групп» независимо соответствует приведенным выше определениям и описан в классах и подклассах в настоящей заявке. Структура примеров разветвленных ПЭГ (с 8 ответвлениями, или ветвями), содержащих NHS-фрагменты в качестве реактивных функциональных групп, изображена ниже:

[00203] Структура примеров разветвленных ПЭГ (с 4 ответвлениями или ветвями) содержащих NHS-фрагменты в качестве реактивных функциональных групп, изображена ниже:

[00204] Число ветвей, отходящих от остова, может варьировать. Например, число 4 в приведенных выше формулах VI и VII может быть изменено на любое другое целое число от 0 до 10 согласно различным вариантам реализации. Согласно определенным вариантам реализации одна или большее количество ветвей не содержат реакционноспособной функциональной группы; указанная ветвь оканчивается группой -СН₂СН₂ОН или -CH₂CH₂OR согласно приведенному выше описанию.

[00205] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле VII, VIII или IX (или их вариантам с другим количеством ветвей) при условии, что х представляет собой

[00206] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле VII, VIII или IX (или их вариантам с другим количеством ветвей) при условии, что х представляет собой

[00207] Разумеется, метиленовая (СН₂) группа в приведенном выше фрагменте х может, как вариант, включать более длинную алкильную цепь (СН₂)_m, где m принимает значения до 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 или 30, или может содержать один или большее количество других фрагментов из описанных в настоящей заявке.

[00208] Согласно некоторым вариантам реализации примеры разветвленных ПЭГ, содержащих NHS или малеимидные реакционноспособные группы, изображены ниже:

[00209] Согласно некоторым вариантам реализации применяют вариант с формулой X или XI, где 3 или каждая из 4 ветвей включает реактивную функциональную группу.

[00210] Также могут быть приведены следующие примеры ПЭГ:

[00211]

Как уже отмечалось, следует иметь в виду, что, согласно описанию в настоящей заявке, в различных вариантах реализации между пептидным компонентом и фрагментом (CH₂CH₂O)_n-R аналога компстатина длительного действия может быть введен любой из разнообразных фрагментов, такой как линейный алкил, сложный эфир, амид, ароматическое кольцо (например, замещенный или незамещенный фенил), замещенная или незамещенная циклоалкильная структура, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации такой(ие) фрагмент(ы) может(гут) придавать соединению большую чувствительность к гидролизу, который может отсоединять пептидную часть указанного соединения от СКФ. Согласно некоторым вариантам реализации такое высвобождение может увеличивать проникновение в ткани in vivo и/или повышать активность указанного соединения. Согласно некоторым вариантам реализации гидролиз представляет собой общий (например, кислотно-щелочной) гидролиз. Согласно некоторым вариантам реализации гидролиз представляет собой катализируемый ферментами, например, катализируемый эстеразой. Разумеется, могут происходить оба типа гидролиза. Примеры ПЭГ, содержащих один или большее количество таких фрагментов и сложный NHS-эфир в качестве реактивной функциональной группы, приведены ниже:

[00212]

[00213]

[00214]

[00215] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный (с несколькими ветвями) ПЭГ или звездообразный ПЭГ содержит пентаэритритное ядро, гексаглицериновое ядро или трипентаэритритное ядро. Следует понимать, что согласно определенным вариантам реализации ветви не обязательно отходят от одной точки.

[00216] Монофункциональные, бифункциональные, разветвленные и другие ПЭГ, содержащие одну или большее количество реактивных функциональных групп, могут, согласно некоторым вариантам реализации, быть получены, например, от NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк или от ВОС Sciences, 45-16 Рэмси Роад, Ширли, Нью-Йорк 11967, США, в том числе, или могут быть получены с применением способов, известных в данной области техники.

[00217] Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина непосредственно связан с СКФ через карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит карбамат и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит карбамат и не содержит связи, более чувствительной к гидролизу в водной среде, чем карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит фрагмент ПЭГ или состоит из фрагмента ПЭГ.

[00218] Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит амид. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина непосредственно связан с СКФ через амид. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит амид и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит амид и не содержит связи, более чувствительной к гидролизу в водной среде, чем амид. Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит фрагмент ПЭГ или состоит из фрагмента ПЭГ.

[00219] Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связаны с СКФ посредством связи, содержащей карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связан с СКФ посредством связи, которая не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связан с СКФ посредством связи, которая содержит карбамат и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связаны с СКФ посредством связи, которая содержит карбамат и не содержит связи, более чувствительной к гидролизу в водной среде, чем карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации каждый аналог компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) непосредственно связан с СКФ через карбамат.

[00220] Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит фрагмент ПЭГ или состоит из фрагмента ПЭГ. Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связан с СКФ посредством связи содержащей амид. Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связан с СКФ посредством связи, которая содержит амид и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связаны с СКФ посредством связи, которая содержит амид и не содержит связи, более чувствительной к гидролизу в водной среде, чем амид. Согласно некоторым вариантам реализации каждый аналог компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) непосредственно связан с СКФ через амид. Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит фрагмент ПЭГ или состоит из фрагмента ПЭГ.

[00221] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен аналог компстатина, конъюгированный с полимером, при этом указанный полимер не является ПЭГ. Согласно некоторым вариантам реализации полимер представляет собой полиоксазолин (ПОЗ). Примеры моно- и полифункционализированных полиоксазолиновых производных для прямой конъюгации или для конъюгации посредством линкера, изображены ниже:

Z-T-[N(COR^x)CH₂CH₂]_n-T-R¹;

R¹-{[N(CO-T-Z)CH₂CH₂]_m-[N(COR^x)CH₂CH₂]_n}^a-T-R¹;

R¹-{[N(CO-T-Z¹)CH₂CH₂]_p-[N(COR^x)CH₂CH₂]_n-[N(CO-T-Z²)CH₂CH₂]_m}^a-T-R¹;

R¹-{[N(CO-T-Z¹)CH₂CH₂]_p-[N(COR^x)CH₂CH₂]_n-[N(CO-T-Z²)CH₂CH₂]_m}^a-T-Z;

R^l-[N(COR^x)CH₂CH₂]_n-T-B(-R¹)(-T-Z)-T-[N(COR^x)CH₂CH₂]_m-R¹;

где:

каждый из Z, Z¹ и Z² независимым образом представляет собой реактивную функциональную группу, соответствующую приведенному выше определению и описанную в классах и подклассах в настоящем документе;

каждый из Т, R^x, и R¹ независимым образом соответствует приведенному выше определению и описан в классах и подклассах в настоящем документе;

каждый из m, n, и p независимым образом представляет собой целое число от 0 до 1000, с тем ограничением, что сумма m, n, и p для каждой формулы не равна 0;

а = «ran», то есть случайный («random») сополимер, или «block», то есть блок-сополимер;

В представляет собой разветвленный фрагмент, связанный линкером или без линкера с другими частями полимера. Другие примеры функционализированных полиоксазолиновых производных для конъюгации подробно описаны в данной области техники, включая, но не ограничиваясь описанными в опубликованных патентных заявках РСТ №№ WO/2010/006282, WO/2009/089542, WO/2009/043027 и WO/2008/106186, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

[00222] Примеры конъюгатов аналога компстатина с полиоксазолиновыми полимерами изображены ниже:

,

,

,

где каждая переменная независимым образом соответствует приведенному выше определению и описана в классах и подклассах в настоящем документе.

[00223] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен аналог компстатина, конъюгированный с полимером, при этом указанный аналог компстатина соединены с полимером через один или большее количество линкеров. Согласно некоторым вариантам реализации полимер выбирают из содержащих ПЭГ соединений и родов, описанных выше и в классах и подклассах в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены конъюгаты аналогов компстатина с содержащими ПЭГ соединениями и родами, описанными в настоящем документе, отличающиеся тем, что указанный аналог компстатина соединен с содержащими ПЭГ фрагментами через один или большее количество линкеров. Моно- и полифункциональные ПЭГ, которые содержат одну или большее количество реактивных функциональных групп для конъюгации, определены выше и описаны в классах и подклассах в настоящем документе, включая, но не ограничиваясь соответствующими формулами A, I, Ia, II, III, IIIa, В, IV, IVa, V, Va, С, D, Е, F, G, Н, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV или XVI.

[00224] Подходящие линкеры для соединения аналога компстатина и фрагмента полимера, такие как ПЭГ или полиоксазолин, подробно описаны выше и в классах и подклассах в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации линкер содержит несколько функциональных групп, при этом одна функциональная группа соединена с аналогом компстатина, и другая соединена с фрагментом полимера. Согласно некоторым вариантам реализации линкер представляет собой бифункциональное соединение. Согласно некоторым вариантам реализации линкер имеет структуру NH₂(CH₂CH₂O)nCH₂C(=O)OH, где n принимает значения от 1 до 1000. Согласно некоторым вариантам реализации линкер представляет собой 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (АЕЕАс). Согласно некоторым вариантам реализации линкер активируют для конъюгации с фрагментом полимера или функциональной группой аналога компстатина. Например, согласно некоторым вариантам реализации карбоксильную группу АЕЕАс активируют до конъюгации с аминогруппой боковой цепи группы лизина.

[00225] Согласно некоторым вариантам реализации для конъюгации с фрагментом полимера, либо прямой, либо посредством линкера, используют подходящую функциональную группу (например, аминная, гидроксильная, тиольная группа или группа карбоновой кислоты) на аналоге компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован через аминную группу с фрагментом ПЭГ посредством линкера. Согласно некоторым вариантам реализации аминная группа представляет собой α-аминогруппу остатка аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации аминная группа представляет собой аминную группу боковой цепи лизина. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом ПЭГ через аминогруппу боковой цепи лизина (ε-аминогруппа) посредством линкера, имеющего структуру NH₂(CH₂CH₂O)nCH₂C(=O)OH, где n принимает значения от 1 до 1000. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом ПЭГ через аминогруппу боковой цепи лизина посредством линкера АЕЕАс. Согласно некоторым вариантам реализации линкер NH₂(CH₂CH₂O)nCH₂C(=O)OH вводит фрагмент -NH(CH₂CH₂O)nCH₂C(=O)- на боковую цепь лизина компстатина после конъюгации. Согласно некоторым вариантам реализации линкер АЕЕАс вводит - фрагмент NH(СН₂СН₂О)₂СН₂С(=О)- на боковую цепь лизина компстатина после конъюгации.

[00226] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом полимера посредством линкера, при этом указанный линкер содержит фрагмент АЕЕАс и остаток аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом полимера посредством линкера, при этом указанный линкер содержит фрагмент АЕЕАс и остаток лизина. Согласно некоторым вариантам реализации полимер представлен ПЭГ. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец аналога компстатина соединен с аминогруппой АЕЕАс, и С-конец АЕЕАс соединен с остатком лизина. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец аналога компстатина соединен с аминогруппой АЕЕАс, и С-конец АЕЕАс соединен с α-аминогруппой остатка лизина. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец аналога компстатина соединен с аминогруппой АЕЕАс, С-конец АЕЕАс соединен с α-аминогруппой остатка лизина, а фрагмент полимера, например, фрагмент ПЭГ, конъюгирован через ε-аминогруппу указанного остатка лизина. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец остатка лизина модифицирован. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец остатка лизина модифицирован путем амидирования. Согласно некоторым вариантам реализации N-конец аналога компстатина модифицирован. Согласно некоторым вариантам реализации N-конец аналога компстатина ацетилирован.

[00227] Примеры конъюгатов, содержащих линкер АЕЕАс и полимер, изображены ниже, при этом обозначает точку присоединения аминной группы на аналоге компстатина, обозначает аналог компстатина, присоединенный через С-конец, и при этом каждая из других переменных независимым образом соответствует приведенному выше определению и описана в классах и подклассах в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации аминная группа представляет собой аминогруппу боковой цепи лизина.

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

,

.

[00228] Согласно определенным вариантам реализации аналог компстатина может быть представлен как M-AEEAc-Lys-B₂, где B₂ представляет собой блокирующий фрагмент, например, NH2, М представляет любые из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, при условии, что С-концевая аминокислота, соответствующая любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, связана пептидной связью с AEEAc-Lys-B₂. NHS-фрагмент монофункционального или мультифункционального (например, бифункционального) ПЭГ вступает в реакцию со свободным амином боковой цепи лизина с образованием монофункционализированного (один фрагмент аналога компстатина) или мультифункционализированного (несколько фрагментов аналога компстатина) аналога компстатина длительного действия. Согласно различным вариантам реализации любая аминокислота, содержащая боковую цепь, которая содержит реактивную функциональную группу, может применяться вместо Lys (или в дополнение к Lys). Может быть проведена реакция монофункционального или мультифункционального ПЭГ, содержащего подходящую реактивную функциональную группу, с такой боковой цепью, аналогично реакции ПЭГ с активированным сложным NHS-эфиром с Lys.

[00229] В отношении любых из описанных выше формул и структур следует понимать, что варианты реализации, в которых компонент с аналогом компстатина содержит любой описанный в настоящем документе аналог компстатина, например, прямо раскрыт любой аналог компстатина, соответствующий последовательностям SEQ ID NO; 3-36, 37, 71, 72, 73, 74, 75. Например, без ограничения, аналог компстатина может содержать последовательность аминокислот, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 28. Пример аналога компстатина длительного действия, в котором компонент с аналогом компстатина содержит последовательность аминокислот, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 28 изображен на фиг. 10(C). Следует понимать, что фрагмент ПЭГ может иметь различную молекулярную массу или среднюю молекулярную массу в различных вариантах реализации, согласно описанию в настоящем документе. Например, может варьировать молекулярная масса индивидуальных цепей в составе и/или разные составы могут иметь разную среднюю молекулярную массу и/или полидисперсность, согласно описанию в настоящем документе. Согласно определенным вариантам реализации фрагмент ПЭГ в соединении на фиг. 10(C) имеет среднюю молекулярную массу, составляющую примерно от 20 кДа до 100 кДа, примерно 20 кДа - 90 кДа, примерно 20 кДа - 80 кДа, примерно 20 кДа - 70 кДа, примерно 20 кДа - 60 кДа, примерно 20 кДа - 50 кДа, примерно 30 кДа - 80 кДа, примерно 30 кДа - 70 кДа, примерно 30 кДа - 60 кДа, примерно 30 кДа - 50 кДа, примерно 30 кДа - 45 кДа, примерно 35 кДа - 50 кДа, примерно 35 кДа - 45 кДа, примерно 36 кДа - 44 кДа, примерно 37 кДа - 43 кДа, примерно 38 кДа - 42 кДа, или примерно 39 кДа - 41 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент ПЭГ в соединении на фиг. 10(C) имеет среднюю молекулярную массу примерно от 30 кДа до примерно 50 кДа, например, примерно от 35 кДа до примерно 45 кДа, примерно от 37,5 кДа до примерно 42,5 кДа. Согласно определенным вариантам реализации, при которых фрагмент ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу, составляющую примерно 40 кДа, например, от 37,5 кДа до 42,5 кДа, 38 кДа, 39 кДа, 40 кДа, 41 кДа, 42 кДа, указанное соединение иногда называется в настоящем документе CA28-2TS-BF. Согласно определенным вариантам реализации соединение, содержащее СКФ, например, фрагмент ПЭГ, который имеет среднюю молекулярную массу, составляющую примерно 40 кДа, например, от 37,5 кДа до 42,5 кДа, 38 кДа, 39 кДа, 40 кДа, 41 кДа, 42 кДа, конечное время полужизни указанного соединения составляет по меньшей мере примерно 5 дней, например, примерно 5-10 дней, например, примерно 5, 6, 7, 8, 9 дней, при введении в/в или подкожно не являющимся человеком приматам или людям, например, в дозе примерно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг, или 5-10 мкг/кг.

[00230] Согласно некоторым аспектам настоящее изобретение относится к использованию клик-химии в отношении аналогов компстатина. «Клик-химия» общеизвестна в данной области техники и подходит для применения согласно некоторым аспектам настоящего изобретения. Клик-химия включает, согласно определенным вариантам реализации, универсальные реакции циклоприсоединения между азидами и алкинами, обеспечивающие ряд полезных применений. Способы осуществления реакций клик-химии известны в данной области техники, и описаны в источниках: Kolb, Н.С.; Sharpless, К.В., Drug Disc. Today, 2003, 1128-1137; Moses, J.E.; Moorhouse, A.D.; Chem. Soc. Rev., 2007, 1249-1262; которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Клик-химия представляет собой распространенный способ биоконъюгации благодаря высокой реакционноспособности и селективности, даже в биологических средах. См.: Kolb, Н.С.; Finn, M.G.; Sharpless, K.В. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021; и Wang, Q.; Chan, T.R.; Hilgraf, R.; Fokin, V.V.; Sharpless, K.В.; Finn, M.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193. Кроме того, доступные на сегодняшний день рекомбинантные техники и методы синтеза позволяют вводить азиды и несущие алкины неканонические аминокислоты в пептиды, белки, клетки, вирусы, бактерии и другие биологические объекты, которые состоят из белков или экспонируют белки. См.: Link, A.J.; Vink, М.K.S.; Tirrell, D.A. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10598-10602; Deiters, A.; Cropp, T.A.; Mukherji, M.; Chin, J.W.; Anderson, C; Schultz, P.G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11782-11783.

[00231] В настоящем документе, термин «клик-химическая группа» иногда используется для обозначения реактивной функциональной группы, способной принимать участие в клик-химической реакции с подходящей второй реактивной функциональной группой, при этом указанная вторая реактивная функциональная группа также представляет собой клик-химическую группу. Указанные первая и вторая клик-химические группы или объекты (например, молекулы), содержащие такие группы, могут называться комплементарными. Первый и второй объекты, например, молекулы, которые содержат комплементарные клик-химические группы, могут называться клик-химическими партнерами. Объект или молекула, содержащий(ая) клик-химическую группу, может называться «клик-функционализированным(ой)». Связь, образующаяся за счет реакции комплементарных клик-химических партнеров, может называться «клик-химической связью».

[00232] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены клик-функционализированные аналоги компстатина, например, для конъюгации с комплементарным фрагментом на молекуле-партнере или биомолекуле-партнере. Согласно некоторым вариантам реализации комплементарная молекула-партнер или биомолекула-партнер представляет собой полимер, пептид, белок или молекулу, функционирующую в качестве уменьшающего клиренс фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации указанный «клик-функционализированный» фрагмент представляет собой алкин или производное алкина, способный(ое) проходить [3+2] реакции циклоприсоединения с комплементарными несущими азиды молекулами и биомолекулами. Согласно другому варианту реализации «клик-функционализированная» функциональная группа представляет собой азид или производное азида, способный проходить [3+2] реакции циклоприсоединения с комплементарными несущими алкины молекулами и биомолекулами (т.е. клик-химия).

[00233] Согласно некоторым вариантам реализации клик-функционализированный аналог компстатина несет азидную группу на любой группе боковой цепи аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации клик-функционализированный аналог компстатина несет азидную группу на группе боковой цепи лизина.

[00234] Согласно некоторым вариантам реализации клик-функционализированный аналог компстатина несет алкиновую группу на любой группе боковой цепи аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации клик-функционализированный аналог компстатина несет алкиновую группу на группе боковой цепи лизина.

[00235] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены конъюгаты компстатина, содержащие аналог компстатина, молекулу, функционирующую в качестве уменьшающего клиренс фрагмента, и триазольный линкер. Согласно некоторым вариантам реализации триазольный линкер представляет собой результат клик-химической конъюгации между конъюгатом компстатина и молекулой, функционирующей в качестве уменьшающего клиренс фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации СКФ может представлять собой любой раскрытый в настоящем документе СКФ. Например, СКФ может представлять собой ПЭГ, полипептид или ПОЗ.

[00236] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены конъюгаты компстатина, содержащие аналог компстатина, фрагмент ПЭГ и триазольный линкер. Согласно некоторым вариантам реализации триазольный линкер представляет собой результат клик-химической конъюгации между конъюгатом компстатина и фрагментом ПЭГ.

[00237] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены конъюгаты компстатина, содержащие аналог компстатина, полиоксазолин фрагмент и триазольный линкер. Согласно некоторым вариантам реализации триазольный линкер представляет собой результат клик-химической конъюгации между конъюгатом компстатина и фрагментом полиоксазолина.

[00238] Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическая реакция между аналогом компстатина и другим фрагментом катализируется переходным металлом. Медь-содержащие молекулы, катализирующие «клик»-реакцию включают, не ограничиваясь перечисленными, медную проволоку, бромид меди (CuBr), хлорид меди (CuCl), сульфат меди (CuSO₄), сульфат пентагидрат меди (CuSO₄⋅5H₂O), ацетат меди (Cu₂(AcO₄), йодид меди (CuI), [Cu(MeCN)₄](OTf), [Cu(MeCN)₄](PF₆), источники коллоидной меди и источники иммобилизованной меди. Согласно некоторым вариантам реализации другие металлы, такие как рутений. Восстанавливающие агенты, а также органические и неорганические металл-связывающие лиганды могут применяться в сочетании с металлическими катализаторами и включают, не ограничиваясь перечисленными, аскорбат натрия, трис(триазолил)аминовые лиганды, трис(карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), сульфонированные батофенантролиновые лиганды и лиганды на основе бензимидазола.

[00239] Согласно некоторым вариантам реализации аналоги компстатина конъюгируют с другими фрагментами с применением клик-химии без металлов (также известной как клик-химия без меди), обеспечивающей получение композиции или конъюгатов без металлов. В отличие от стандартной клик-химии, также известной как медь-катализируемая клик-химия (CuАСС), клик-химические реакции без металлов протекают между либо деформированным циклическим алкином, либо предшественником алкина, таким как оксанорборнадиен, и азидной группой. Как следует из названия, металлический катализатор не является необходимым для протекания реакции. Примеры таких химических реакций включают реакции, включающие циклооктиновые производные (Codelli, et. al. J. Am. Chem. Soc, 2008, 130, 11486-11493; Jewett, et. al. J. Am. Chem. Soc, 2010, 132, 3688-3690; Ning, et. al. Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 2253-2255), дифтор-оксанорборненовые производные (van Berkel, et. al. ChemBioChem, 2007, 8, 1504-1508) или нитрилоксидные производные (Lutz, et. al. Macromolecules, 2009, 42, 5411-5413). Согласно определенным вариантам реализации клик-химическая реакция без металлов представляет собой реакцию [3+2] циклоприсоединения, реакцию Дильса-Альдера или радикальную реакцию присоединения тиол-алкенов без металлов. Примеры клик-химических реакций и клик-химических групп описаны, например, у Joerg Lahann, Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science, 2009, John Wiley & Sons Ltd, ISBN 978-0-470-69970-6; Becer, Hoogenboom, and Schubert, Click Chemistry beyond Metal-Catalyzed Cycloaddition, Angewandte Chemie International Edition (2009) 48: 4900-4908. Согласно определенным вариантам реализации клик-химическая группа содержит диарилциклооктин.

[00240] Некоторые примеры клик-химических реакций без металлов представлены на схеме ниже.

[00241] Определенные клик-фрагменты без металлов известны из литературы. Примеры включают 4-дибензоциклооктинол (DIBO) (по Ning et. al; Angew Chem Int Ed, 2008, 47, 2253); двуфтористые циклооктины (DIFO или DFO) (по Codelli, et. al.; J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 11486-11493.); биарилазациклооктинон (BARAC) (no Jewett et. al.; J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 3688); или бициклононин (BCN) (по Dommerholt, et. al.; Angew Chem Int Ed, 2010, 49, 9422-9425) или дибензилциклооктин (DBCO) .

[00242] Схема реакции, включающей реакцию DBCO и азида, показана ниже:

[00243] В приведенной выше схеме, согласно различным вариантам реализации, А может содержать или состоять из фрагмента аналога компстатина, и В может содержать или состоять из СКФ, например, полимера, такого как ПЭГ, или ПОЗ, или полипептид, или В может содержать или состоять из фрагмента аналога компстатина и может содержать или состоять из СКФ, например, полимера, такого как ПЭГ, или ПОЗ, или полипептид.

[00244] Согласно некоторым вариантам реализации «клик-функционализированный фрагмент без металла» представляет собой ацетилен или производное ацетилена, способное проходить реакции [3+2] циклоприсоединения с комплементарными несущими азиды молекулами и биомолекулами без применения металлического катализатора.

[00245] Согласно некоторым вариантам реализации группы R и R' клик-химических реагентов без металлов представляют собой аналог компстатина или любую молекулу, описанную в настоящем документе, с которой может быть конъюгирован аналог компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации такие аналоги компстатина несут клик-функционализированный фрагмент на боковой цепи лизина. Согласно некоторым вариантам реализации такие аналоги компстатина соединены с клик-функционализированным фрагментом посредством линкера. Согласно некоторым вариантам реализации такие аналоги компстатина соединены с клик-функционализированным фрагментом посредством АЕЕАс.

[00246] Согласно некоторым вариантам реализации клик-химический реагент содержит DBCO. Примеры реагентов и примеры их применения приведены ниже:

[00247] DBCO-кислота. Согласно некоторым вариантам реализации DBCO-кислота может применяться для проведения реакции с амин-содержащим фрагментом.

[00248] Сложный DBCO- NHS-эфир (выше) или сложный DВСО-сульфо-NHS-эфир (ниже) может применяться для включения функциональной группы DBCO в амин-содержащую молекулу, такую как аналог компстатина или полипептид, содержащий остаток лизина.

[00249] Сложный DBCO-PEG4-NHS-эфир. Согласно некоторым вариантам реализации такой реагент подходит для введения фрагмента DBCO посредством реакции с доступной аминной функциональной группой. Согласно некоторым аспектам присутствие цепи ПЭГ в качестве гидрофильного спейсера может быть полезно для, например, повышения растворимости или обеспечения гибкости.

[00250] DBCO-амин. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химический реагент содержит карбонил/карбоксил-реактивный дибензилциклооктин, который может вступать в реакцию с кислотами, активными сложными эфирами и/или альдегидами.

[00251] Согласно определенным вариантам реализации клик-химическая реакция включает циклооктин, изображенный ниже:

[00252] Согласно определенным вариантам реализации клик-химические реакции включают реакции между нитронами и циклооктинами (см., например, Ning, Xinghai; Temming, Rinske P.; Dommerholt, Jan; Guo, Jun; Ania, Daniel В.; Debets, Marjoke F.; Wolfert, Margreet A.; Boons, Geert-Jan et al. (2010). "Protein Modification by Strain-Promoted Alkyne-Nitrone Cycloaddition". Angewandte Chemie International Edition 49 (17): 3065), образование оксимов/гидразонов из альдегидов и кетонов, лигирование тетразинов (см., например, Blackman, Melissa L.; Royzen, Maksim; Fox, Joseph M. (2008). "The Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation based on Inverse-electron-demand Diels-Alder Reactivity". Journal of the American Chemical Society 130 (41): 13518-9), лигирование тетразолов, клик-реакцию на основе изонитрила (см., например, Stackmann, Henning; Neves, © A.; Stairs, Shaun; Brindle, Kevin M.; Leeper, Finian J. (2011). "Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation with biomolecules". Organic & Biomolecular Chemistry 9 (21): 7303) и квадрициклановое лигирование (см., например, Sletten, Ellen М.; Bertozzi, Carolyn R. (2011). "A Bioorthogonal Quadricyclane Ligation". Journal of the American Chemical Society 133 (44): 17570-3). Согласно определенным вариантам реализации клик-химическая реакция представляет собой лигирование по Штаудингеру (фосфин-азид).

[00253] Любой аналог компстатина может быть модифицирован включением клик-химической группы согласно различным вариантам реализации. Например, аналог компстатина, содержащий последовательность, соответствующую любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, может быть модифицирован таким образом. Согласно некоторым вариантам реализации любая такая последовательность также содержит остаток лизина или фрагмент AEEAc-Lys, например, на С-конце. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую группу встраивают после пептидного синтеза. Например, может быть проведена реакция боковой цепи Lys с азидоуксусной кислотой для введения азидного фрагмента в качестве клик-химической группы. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую группу встраивают после циклизации, и согласно некоторым вариантам реализации после добавления блокирующего фрагмента на N- и/или С-конце. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую группу встраивают во время пептидного синтеза. Например, при синтезе аналога компстатина может применяться аминокислота, содержащая боковую цепь, которая содержит клик-химическую группу. Различные подобные аминокислоты коммерчески доступны из ряда источников, например, ААРРТес (Луисвилл, Кентукки), Jena Bioscience GmBH (Йена, Германия). Согласно некоторым аспектам в настоящем документе предложены способы получения клик-химически функционализированного аналога компстатина.

[00254] Согласно некоторым вариантам реализации предложены композиции, содержащие аналог компстатина и клик-химический реагент. Клик-химический реагент может представлять собой любую молекулу, способную вступать в реакцию с боковой цепью аминокислоты или концом соединения, содержащего аналог компстатина, таким образом, чтобы внедрить клик-химическую группу, например, любую клик-химическую группу, известную в данной области техники. Согласно некоторым аспектам композиция может инкубироваться в подходящих условиях (которые могут включать обеспечение подходящего катализатора, света (например, УФ)) для функционализирования аналога компстатина клик-химической функциональной группой. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина, которые содержат любую клик-химическую группу, включающую описанные в настоящем документе, но не ограничивающуюся ими. Согласно некоторым вариантам реализации предложены способы получения аналога компстатина длительного действия. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают смешивание аналога компстатина, содержащего первую клик-химическую группу, с СКФ, содержащим комплементарную клик-химическую группу, в условиях, подходящих для протекания клик-химической реакции. Дополнительные этапы могут включать очищение полученного конъюгата. Согласно некоторым вариантам реализации очищение включает удаление по меньшей мере некоторых непрореагировавших компонентов, например, с применением подходящего поглотителя.

[00255] Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую реакцию используют для соединения двух или большего количества СКФ, по меньшей мере два из которых содержат присоединенный фрагмент аналога компстатина. Указанные фрагменты аналога компстатина могут быть одинаковыми или разными согласно различным вариантам реализации. Указанные фрагменты аналога компстатина могут быть или не быть присоединены к СКФ посредством клик-химической реакции. Например, согласно некоторым вариантам реализации первый гетеробифункциональный ПЭГ, содержащий первую клик-химическую группу на первом конце и сложный NHS-эфир на втором конце, соединяют с фрагментом аналога компстатина через сложный NHS-эфир. В ходе отдельной реакции второй гетеробифункциональный ПЭГ, содержащий вторую клик-химическую группу на первом конце и сложный NHS-эфир на втором конце, соединяют с фрагментом аналога компстатина через сложный NHS-эфир. С полученными двумя соединениями затем проводят клик-химическую реакцию для получения большей молекулы, содержащей два фрагмента аналога компстатина. ПЭГ упоминается как пример СКФ, однако следует понимать, что указанный подход может применяться с любым СКФ. Например, согласно некоторым вариантам реализации он может применяться с СКФ, содержащим полипептид, например, ЧСА или его частью, или альбумином или альбумин-связывающим пептидом, или антителом или его частью. Согласно некоторым вариантам реализации указанный подход может применяться с ПОЗ.

[00256] Аналоги компстатина, содержащие клик-химическую группу, могут находить разнообразное применение. Согласно некоторым вариантам реализации проводят реакцию аналога компстатина, содержащего первую клик-химическую группу, с любым веществом, содержащим комплементарную клик-химическую группу. Вещество, содержащее комплементарную клик-химическую группу, может содержать, например, метку (например, флуорофор, флуоресцентный белок, радиоактивный изотоп и т.п.), аффинный реагент, антитело, нацеливающий фрагмент, металл, частицу и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую группу используют для присоединения фрагмента аналога компстатина к поверхности, при этом указанная поверхность содержит или функционализирована таким образом, чтобы содержать комплементарную клик-химическую группу. Согласно некоторым вариантам реализации поверхность является сенсорной, например, поверхность или сенсор для захвата/детекции С3. Согласно некоторым вариантам реализации поверхность образует часть медицинского устройства, систему трубок, мембрану, резервуар, имплантат или другой материал, который может контактировать с кровью (например, экстракорпорально) или быть временно или на неопределенный срок имплантирован в организм субъекта (например, протез или устройство для доставки лекарственного средства). Согласно некоторым вариантам реализации поверхность функционализирована аналогом компстатина для уменьшения на ней активации комплемента. Согласно некоторым вариантам реализации устройство или систему трубок используют для циркуляции крови, например, для диализа, во время хирургического вмешательства и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации устройство представляет собой гемодиализатор или экстракорпоральный аппарат для поддержания кровообращения. Такие функционализированные аналогом компстатина устройства и способы их получения предложены в настоящем изобретении.

[00257] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит и клеточно-реактивную функциональную группу, и СКФ. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены варианты молекул любого из вышеупомянутых клеточно-реактивных аналогов компстатина, в которых клеточно-реактивная функциональная группа или фрагмент заменен на фрагмент (CH₂CH₂O)_n с молекулярной массой, составляющей по меньшей мере 500 дальтон, например, по меньшей мере 1500 дальтон - примерно 100000 дальтон (например, со средней молекулярной массой, составляющей примерно 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000; или 100000 дальтон). Согласно некоторым вариантам реализации средняя молекулярная масса указанного соединения или фрагментов (CH₂CH₂O)_n составляет по меньшей мере 20000 Дальтон, и до примерно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон.

[00258] Ниже приведены примеры аналогов компстатина длительного действия, отличающиеся тем, что значение n достаточно для обеспечения средней молекулярной массы, составляющей от примерно 500; 1000; 1500; 2000; 5000; 10000; 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000 и 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации n является достаточным, чтобы обеспечивать среднюю молекулярную массу, составляющую примерно от 20000 Дальтон и до примерно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон.

[00259] (CH₂CH₂O)_nC(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH₂) (SEQ ID NO: 58)

[00260] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂-C(=O)-Lys-C(=O)-(CH₂CH₂O)n-NH₂ (SEQ ID NO: 59)

[00261] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-C(=O)-(CH₂CH₂O)n-NH₂ (SEQ ID NO: 60).

[00262] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)₅-Lys-C(=O)-(CH₂CH₂O)n-NH₂ (SEQ ID NO: 61)

[00263] Ac-(CH₂CH₂O)nC(=O)Lys-(Gly)5-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂) (SEQ ID NO: 62)

[00264] Ac-(CH₂CH₂O)nC(=O)Lys-Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH₂) (SEQ ID NO: 63)

[00265] В последовательности SEQ ID NO: 58 (CH₂CH₂O)n соединен амидной связью с N-концевой аминокислотой. В последовательностях SEQ ID NO: 59-63 указанный фрагмент (CH₂CH₂O)n соединен амидной связью с боковой цепью Lys; соответственно, следует понимать, что NH₂ на С-конце в последовательностях SEQ ID NO: 59, 60 и 61 указывает на амидирование С-конца указанного пептида, а в последовательностях SEQ ID NO: 62 и 63 Ас на N-конце указывает на ацетилирование N-конца указанного пептида, согласно приведенному выше описанию. Специалистам в данной области техники также будет понятно, что свободный конец фрагмента (CH₂CH₂O)_n, как правило, оканчивается (OR), где подчеркнутым О обозначен атом О на концевой (CH₂CH₂O) группе. Часто (OR) представляет собой такой фрагмент, как гидроксильная (ОН) или метоксигруппа (-ОСН₃), хотя могут использоваться и другие группы (например, другие алкоксигруппы). Соответственно, последовательность SEQ ID NO: 59, например, может быть представлена последовательностью Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH₂CH₂O)_n-R)-NH2 (SEQ ID NO: 64), где R представляет собой, например, либо Н, либо СН₃, в случае линейного ПЭГ. В случае бифункционального, разветвленного или звездообразного ПЭГ R представляет собой остальную часть указанной молекулы. Далее, следует понимать, что фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, может варьировать, согласно описанию в настоящей заявке (например, соответствуя любой из формул, приведенных в настоящей заявке). Например, аналоги компстатина длительного действия, содержащие ту же пептидную последовательность, что и SEQ ID NO: 64, в которых фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, содержит сложный эфир и/или алкильную цепь, могут быть представлены следующими

Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH2)_m-(CH₂CH₂O)_n-R)-NH2 (SEQ ID NO: 65);

Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH₂)_m-C(=O)-(CH₂CH₂O)_n-R)-NH2 (SEQ ID NO: 66)

Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH₂)_m-C(=O)-(CH₂)j (CH₂CH₂O)_n-R)-NH2 (SEQ ID NO: 67)

В последовательностях SEQ ID NO: 65-67 m, согласно различным вариантам реализации, может варьировать от 1 до примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 или 30. В последовательностях SEQ ID NO: 67 j, согласно различным вариантам реализации, может варьировать от 1 и до примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 или 30. Следует также иметь в виду, что, согласно описанию в настоящей заявке, в различных вариантах реализации между Lys-(C(=O)- и (CH₂CH₂O)_n-R могут быть введены другие фрагменты, такие как амид, ароматическое кольцо (например, замещенный или незамещенный фенил) или замещенная или незамещенная циклоалкильная структура.

[00266] В настоящем изобретении предложены варианты последовательностей SEQ ID NO: 58-67, в которых -Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr- (SEQ ID NO: 76) заменен последовательностью аминокислот, содержащей последовательность аминокислот любого другого аналога компстатина, например, любой из последовательностей SEQ ID NO 3-27 или 29-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, при условии, что блокирующий(ие) фрагмент(ы), присутствующий(ие) на N- и/или С-концах аналога компстатина, может(могут) отсутствовать, быть заменен линкером (который может содержать блокирующий фрагмент) или присоединен к другой N- или С-концевой аминокислоте, присутствующей в соответствующем варианте(вариантах).

[00267] Любой аналог компстатина, например, любое соединение, содержащее любую из последовательностей SEQ ID NO: 3-37, 71, 72, 73, 74 или 75 может, согласно различным вариантам реализации, быть присоединено через N-конец или С-конец, или рядом с N-концом или С-концом (например, через боковую цепь аминокислоты на N-концевой или С-концевой аминокислоте или рядом с ней), прямо или непрямо, к любому фрагменту, содержащему реактивную функциональную группу, например, любому соединению с формулой I-XVI или формулой А-Н.

[00268] Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит полипептид, который присутствует в сыворотке человека, или его фрагмент, или по существу аналогичный вариант указанного полипептида или его фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид, фрагмент или вариант имеет молекулярную массу, составляющую от 5 кДа до 150 кДа, например, по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 кДа или более, например, от 100 до 120, или от 120 до 150 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего реакционноспособную функциональную группу, с одной или большим количеством аминокислотных боковых цепей указанного полипептида, отличающуюся тем, что указанная боковая цепь содержит совместимую функциональную группу. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего реакционноспособную функциональную группу, с N-концевым амином и/или С-концевой карбоксильной группой указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего амино-реактивную функциональную группу, с аминокислотами с боковой цепью, содержащими первичный амин (например, с лизином), и/или с N-концевым амином указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего карбоксил-реактивную функциональную группу, с С-концевой карбоксильной группой указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент аналога компстатина присоединяют на каждом конце указанного полипептида и, необязательно, к боковой цепи одной или большего количества внутренних аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего сульфгидрил-реактивную функциональную группу, с одной или большим количеством сульфгидрильных групп указанного полипептида.

[00269] Согласно некоторым вариантам реализации в указанный полипептид вводят по меньшей мере одну реактивную функциональную группу. Например, согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одну боковую цепь указанного полипептида модифицируют, преобразуя первую реактивную функциональную группу в другую реактивную функциональную группу перед проведением реакции с указанным аналогом компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят тиол. Доступно несколько способов введения тиолов в биомолекулы, в том числе восстановление внутренних дисульфидов, а также преобразование аминов, альдегидов или групп карбоновых кислот в тиольные группы. Дисульфидные поперечные связи цистинов в белках могут быть восстановлены до остатков цистеина с применением дитиотреитола (DTT/ДТТ), трис-(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР/ ТКЭФ), или трис-(2-цианоэтил)фосфина. Амины могут быть непрямо тиолированы посредством реакции с сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионатом (SPDP) с последующим восстановлением конъюгата 3-(2-пиридилдитио)пропионила с применением ДТТ или ТКЭФ. Амины могут быть непрямо тиолированы посредством реакции с сукцинимидилацетилтиоацетатом, с последующим удалением ацетильной группы 50 мМ гидроксиламином или гидразином при близких к нейтральным значениях рН. Амины могут быть прямо тиолированы с помощью реакции с 2-иминотиоланом, при которой сохраняется общий заряд указанной молекулы и вводится свободный тиол. Остатки триптофана в не содержащих тиолов белках могут быть окислены до остатков меркаптотриптофана, которые могут затем быть модифицированы йодоацетамидами или малеимидами. Может быть проведена реакция полипептида, содержащего один или большее количество тиолов, с аналогом компстатина, содержащим малеимидную группу, такую как Ac-Ile-Cys*-Val-Trp(1-Ме)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-(C(=O)-(CH₂)₅-Mal)-NH₂ (SEQ ID NO: 68), для синтеза аналога компстатина длительного действия.

[00270] Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид получают рекомбинантным способом. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид по меньшей мере частично получают рекомбинантным способом (например, в бактериальных или эукариотических клетках-хозяевах, таких как клетки грибов, насекомых, растений или позвоночных животных) и/или по меньшей мере частично получают с применением химического синтеза. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид является очищенным. Например, согласно некоторым вариантам реализации очищают полипептид из лизата клеток-хозяев или из культуральной среды, в которую он был секретирован клетками-хозяевами. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид гликозилирован. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид не гликозилирован. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид представляет собой сывороточный альбумин человека (HSA). Согласно некоторым вариантам реализации по существу аналогичный вариант указанного полипептида обладает достаточным сходством с полипептидом, вариантом которого он является, чтобы не распознаваться как чужеродный нормальной иммунной системой субъекта, например, субъекта-человека. Согласно некоторым вариантам реализации изменения в последовательностях по существу аналогичного варианта по сравнению с полипептидом, вариантом которого она является, подбирают таким образом, чтобы избежать образования эпитопов МНС класса I. Для предсказания наличия эпитопа МНС класса I в последовательности могут применяться различные известные в данной области техники способы.

[00271] Согласно некоторым вариантам реализации одна или большее количество аминокислот в полипептиде, или линкере, или композиции могут быть выбраны таким образом, чтобы быть гидрофобными или гидрофильными, или выбраны таким образом, чтобы придавать повышенную гидрофильность или, согласно некоторым вариантам реализации, повышенную гидрофобность, соединению, которое их содержит. Как известно в данной области техники, термины «гидрофильный» и «гидрофобный» используются для обозначения степени сродства вещества к воде. Согласно некоторым аспектам гидрофильное вещество обладает высоким сродством к воде, проявляя тенденцию к растворению в воде, смешиванию с водой или к смачиванию водой, тогда как у гидрофобного вещества по существу отсутствует сродство к воде, и оно проявляет тенденцию отталкивать и не абсорбировать воду, и не растворяться в воде, не смешиваться с водой или не смачиваться водой. Аминокислоты могут быть классифицированы на основании их гидрофобности, как общеизвестно в данной области техники. Примерами «гидрофильных аминокислот» являются аргинин, лизин, треонин, аланин, аспарагин, глутамин, аспартат, глутамат, серии и глицин. Примерами «гидрофобных аминокислот» являются триптофан, тирозин, фенилаланин, метионин, лейцин, изолейцин и валин. Согласно определенным вариантам реализации используют аналог стандартной аминокислоты, при этом указанный аналог обладает повышенной или пониженной гидрофильностью или гидрофобностью по сравнению с аминокислотой, аналогом которой является.

[00272] В настоящем изобретении также предложены мультимеры, например, конкатемеры, содержащие два или большее количество (например, от 2 до 10) аналогов компстатина, содержащих СКФ, отличающиеся тем, что средняя молекулярная масса полученной молекулы (или ее СКФ-компонентов) составляет от 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000; до 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации средняя молекулярная масса полученной молекулы (или ее СКФ-компонентов) составляет по меньшей мере 20000 Дальтон, и до примерно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации указанные аналоги компстатина, содержащие СКФ, могут быть связаны с помощью любых из вышеописанных соединяющих фрагментов. Композиции и способы получения аналогов компстатина длительного действия, а также промежуточные продукты синтеза представляют собой аспекты настоящего изобретения.

[00273] Широкий спектр методов и анализов, подходящих для детекции полимеров, например, ПЭГ, ПОЗ и/или полипептидов, и/или подходящих для измерения физических и/или структурных свойств полимеров, например, ПЭГ, ПОЗ и/или полипептидов, известен в данной области техники и может, при необходимости, применяться для детекции аналога компстатина, например, клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия, аналога компстатина нацеленного действия или фрагмента аналога компстатина. Например, доступны способы и анализы, подходящие для определения таких свойств, как агрегация, растворимость, размер, структура, характеристики плавления, чистота, присутствие продуктов разложения или загрязняющих примесей, содержание воды, гидродинамический радиус и т.п. Такие способы включают, например, аналитическое центрифугирование, различные виды хроматографии, такие как жидкостная хроматография (например, ионообменная ВЭЖХ, эксклюзионная ВЭЖХ, ВЭЖХ с обращенной фазой), рассеяние света, капиллярный электрофорез, круговой дихроизм, изотермическая калориметрия, Дифференциальная сканирующая калориметрия, флуоресценция, инфракрасное излучение (ИК), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), Рамановская спектроскопия, рефрактометрия, УФ-спектроскопия / спектроскопия в видимой области, масс-спектрометрия, иммунологические способы и т.п. Следует понимать, что способы могут быть скомбинированы. Согласно некоторым аспектам клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или аналог компстатина нацеленного действия (или композиция, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или аналог компстатина нацеленного действия) обладает одним или большим количеством свойств, описанных в настоящем документе, по оценке с применением любых из вышеперечисленных способы. Согласно некоторым аспектам способы подходящие для детекции и/или количественного определения аналога компстатина длительного действия описаны в настоящем документе.

[00274] VII. Аналоги компстатина нацеленного действия

[00275] В настоящем изобретении предложены аналоги компстатина нацеленного действия, включающие нацеливающий фрагмент и фрагмент аналога компстатина, отличающийся тем, что указанный нацеливающий фрагмент нековалентно связывается с целевой молекулой. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина нацеленного действия, аналогичные клеточно-реактивным аналогам компстатина, описанным в Разделе VI, отличающиеся тем, что указанные соединения включают нацеливающий фрагмент помимо или вместо клеточно-реактивного фрагмента. Указанный нацеливающий фрагмент может включать, например, антитело, полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту (например, аптамер), углевод, малую молекулу или супрамолекулярный комплекс, который(ая) специфически связывается с целевой молекулой. Согласно некоторым вариантам реализации аффинность (по оценке равновесной константы диссоциации, Kd) нацеливающего фрагмента в отношении целевой молекулы (по оценке равновесной константы диссоциации, Kd) составляет 10^-3 М или менее, например, 10^-4 М или менее, например, 10^-5 М или менее, например, 10^-6М или менее, 10^-7М или менее, 10^-8М или менее, или 10^-9 М или менее в протестированных условиях, например, в физиологических условиях.

[00276] В тех вариантах реализации настоящего изобретения, в которых нацеливающий фрагмент представляет собой антитело, указанное антитело может представлять собой любой иммуноглобулин или его производное, сохраняющее связывающую способность, или любой белок, содержащий связывающий домен, гомологичный или в основном гомологичный связывающему домену иммуноглобулина. Такие белки могут быть получены из природных источников, либо частично или полностью получены синтетически (например, с применением технологий рекомбинантной ДНК, химического синтеза и т.п.). Указанное антитело может принадлежать любому виду, например, человеку, грызуну, кролику, козе, курице и т.п. Указанное антитело может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, в том числе к любому классу иммуноглобулинов человека: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения указанное антитело может представлять собой такой фрагмент антитела, как Fab', F(ab').sub.2, scFv (одноцепочечный вариабельный), или другой фрагмент, сохраняющий участок связывания антигена, или полученный рекомбинантным способом scFv фрагмент, включая полученные рекомбинантным способом фрагменты. См., например, Allen, Т., Nature Reviews Cancer, Vol. 2, 750-765, 2002 и включенные туда ссылки. Могут применяться моновалентные, бивалентные или многовалентные антитела. Указанное антитело может представлять собой гибридное антитело, например, такое, в котором вариабельный домен, полученный от грызуна, конденсирован с константным доменом, полученным от человека, соответственно, сохраняющее специфичность антитела грызуна. Согласно некоторым вариантам реализации антитело человека или его часть синтезируют, например, у грызунов, геном которых включает гены иммуноглобулинов человека, с применением технологии дисплея, такой как фаговый дисплей и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации гуманизированное антитело синтезируют прививкой одной или большего количества определяющих комплементарность областей от не являющегося человеком вида (например, мыши) к последовательности антитела человека. Указанное антитело может быть частично или полностью гуманизировано. См., например, Almagro JC, Fransson J.Humanization of antibodies. Front Biosci. 13: 1619-33 (2008) для ознакомления с обзором различных способов получения гуманизированных антител, которые могут применяться для получения нацеливающего фрагмента, подходящего для настоящего изобретения. Антитело может быть поликлональным или моноклональным, хотя для целей настоящего изобретения моноклональные антитела, как правило, предпочтительнее. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения применяют F(ab')2 или F(ab') фрагмент, тогда как согласно другим вариантам реализации применяют антитела, содержащие Fc-домен. В данной области техники известны способы получения специфически связывающихся антител практически для любой нужной молекулы. Так, моноклональные или поликлональные антитела могут быть очищены из природных источников, например, из крови или асцитной жидкости животного, у которого синтезируется указанное антитело (например, после иммунизации указанной молекулой или ее антигенным фрагментом) или могут быть получены рекомбинантным путем, в культуре клеток. В данной области техники известны способы получения фрагментов антител, например, с помощью расщепления, дисульфидного восстановления или синтеза.

[00277] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающий фрагмент может представлять собой любую молекулу, специфически связывающуюся с целевой молекулой посредством механизма, отличного от взаимодействия антиген-антитело. Такой нацеливающий фрагмент называют «лигандом». Например, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения лиганд может представлять собой полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту (например, ДНК или РНК), углевод, липид или фосфолипид, либо малую молекулу. Согласно некоторым вариантам реализации малая молекула представляет собой органическое соединение, либо встречающееся в природе, либо полученное искусственным путем, которое имеет относительно низкую молекулярную массу и не является белком, полипептидом, нуклеиновой кислотой или липидом, как правило, с молекулярной массой, составляющей менее чем примерно 1500 г/моль, и, как правило, содержащее несколько углерод-углеродных связей. В общем случае аптамер представляет собой олигонуклеотид (например, РНК или ДНК, необязательно содержащий один или большее количество модифицированных нуклеозидов (например, основания или сахара, отличные от 5 стандартных оснований (A, G, С, Т, U) или сахаров (рибозы и дезоксирибозы), присутствующих в РНК и ДНК чаще всего), или модифицированные межнуклеозидные связи (например, не-фосфодиэфирные связи), которые, например, стабилизируют указанную молекулу, например, придавая ей большую устойчивость к разложению нуклеазами), который связывается с конкретным белком. Согласно некоторым вариантам реализации длина олигонуклеотида составляет до примерно 100 нуклеозидов, например, от 12 до 100 нуклеозидов. Аптамеры могут быть получены с помощью процесса in vitro эволюции, называемого SELEX, и в данной области техники известны способы получения аптамеров, специфичных в отношении представляющего интерес белка. См., например, Brody Е N, Gold L. J Biotechnol. 2000 March; 74(1): 5-13. Согласно некоторым вариантам реализации применяют пептидную нуклеиновую кислоту или блокированную нуклеиновую кислоту.

[00278] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающий фрагмент содержит пептид. Согласно некоторым вариантам реализации пептид, который связывается с представляющей интерес целевой молекулой, идентифицируют с применением технологии дисплея, такой как фаговый дисплей, рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей и т.п.

[00279] В качестве лигандов могут применяться малые молекулы. Способы идентификации таких лигандов известны в данной области техники. Например, можно идентифицировать малые молекулы-лиганды для многочисленных представляющих интерес белков с помощью in vitro скрининга библиотек малых молекул, в том числе комбинаторных библиотек, и компьютерного скрининга, например, для идентификации малых органических соединений, которые связываются с углублениями на поверхности белков (карманами) (Huang, Z., Pharm. & Ther. 86: 201-215, 2000).

[00280] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающие фрагменты не являются белками или молекулами, которые обычно применяют в качестве носителей и конъюгируют с антигенами для стимуляции синтеза антител. Примерами являются белки-переносчики или такие молекулы, как бычий сывороточный альбумин, гемоцианин фиссуреллы, бычий гамма-глобулин и дифтерийный токсин. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный нацеливающий фрагмент не является Fc частью молекулы иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам реализации нацеливающий фрагмент представляет собой часть комплекса, содержащего один или большее количество дополнительных фрагментов, к которым он ковалентно или нековалентно присоединен.

[00281] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения целевая молекула может представлять собой любую молекулу, синтезируемую клеткой (включая любые формы, экспрессируемые на поверхности указанной клетки, или их модифицированные формы, по меньшей мере отчасти формирующиеся в результате экстраклеточной модификации). Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой внеклеточное вещество, присутствующее в ткани или на ткани. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула характерна для конкретного заболевания или физиологического состояния или характерна для одного или большего количества типов клеток или тканей. Целевая молекула часто представляет собой молекулу, по меньшей мере частично присутствующую на поверхности клетки, (например, трансмембранный или иным образом соединенный к мембраной белок) так что по меньшей мере часть указанной молекулы доступна для связывания с экстраклеточным связывающим агентом, таким как антитело. Целевая молекула может быть, но не обязательно, специфичной для какого-либо типа клеток. Например, специфичная для определенного типа клеток целевая молекула часто представляет собой белок, пептид, мРНК, липид или углевод, который присутствует на клетках или в клетках конкретного типа (типов) в большем количестве, чем на клетках или в клетках многих других типов. В некоторых случаях специфичная для определенного типа клеток целевая молекула присутствует в детектируемых количествах только в клетках или на клетках конкретного представляющего интерес типа. В то же время следует иметь в виду, что подходящая специфичная для определенного типа клеток целевая молекула не обязательно должна быть абсолютно специфичной для представляющего интерес типа клеток, чтобы считаться специфичной для указанного типа клеток. Согласно некоторым вариантам реализации уровни экспрессии специфичной для конкретного типа клеток целевой молекулы по меньшей мере в 3 раза выше в клетках данного типа, чем в клетках эталонной популяции, которая может представлять собой, например, смесь, содержащую приблизительно равные количества клеток нескольких (например, 5-10 или более) разных тканей или органов. Согласно некоторым вариантам реализации специфичная для определенного типа клеток целевая молекула присутствует в количествах, по меньшей мере в 4-5 раз, 5-10 раз или более чем в 10 раз по сравнению со средней экспрессией в эталонной популяции. Согласно некоторым вариантам реализации обнаружение или измерение специфичной для типа клеток целевой молекулы позволяет специалисту в данной области техники отличить тип или типы клеток, представляющий(ие) интерес, от клеток многих, большинства или всех других типов. В целом, присутствие и/или высокое содержание большинства целевых молекул может быть определено с применением одной или нескольких стандартных техник, таких как нозерн-блоттинг, in situ гибридизация, ОТ-ПЦР, секвенирование, иммунологических способов, таких как иммуноблоттинг, иммунодетекция (например, иммуногистохимическая), или обнаружение с помощью флуоресценции после окрашивания флуоренцентно мечеными антителами (например, с применением FACS), олигонуклеотидных или кДНК микрочипов или мембранных чипов, белкового анализа на микрочипах, масс-спектроскопии и т.п.

[00282] Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой канал, переносчик, рецептор или другую молекулу, по меньшей мере частично экспонируемую на поверхности клетки. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой переносчик анионов или водный канал (например, белок аквапорин).

[00283] Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой белок, по меньшей мере частично экспонируемый на поверхности эритроцитов, такой как гликофорин (например, гликофорин А, В, С или D) или белок полосы 3.

[00284] Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула представляет собой белок, по меньшей мере частично экспонируемый на поверхности эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула присутствует на поверхности нормальных здоровых сосудов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула присутствует на поверхности активированных эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула присутствует на поверхности активированных эндотелиальных клеток, но не на поверхности неактивированных эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой молекулу, экспрессия или экспонирование которой индуцируется таким стимулом, как повреждение или воспаление. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула будет распознана как «несобственная» реципиентом при получении трансплантата, содержащего клетки, экспрессирующие указанную целевую молекулу. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула представляет собой углеводный ксеноантиген, антитела к которому, как правило, обнаруживаются у человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанный углевод включает антиген группы крови. Согласно некоторым вариантам реализации указанный углевод включает ксеноантиген, например, эпитоп альфа-Gal (Galalphal-3Galbetal-(3)4GlcNAc-R) (см., например, Macher ВА and Galili U. The Galalphal, 3Galbetal, 4GlcNAc-R (alpha-Gal) epitope: a carbohydrate of unique evolution and clinical relevance. Biochim Biophys Acta. 1780(2): 75-88 (2008).

[00285] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит и нацеливающий фрагмент, и СКФ.

[00286] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия содержит несколько нацеливающих фрагментов, которые могут быть одинаковыми или разными. Разные нацеливающие фрагменты могут связываться с одной и той же целевой молекулой или с разными целевыми молекулами. В настоящем изобретении предложен аналог компстатина нацеленного действия, являющий многовалентным в отношении нацеливающего фрагмента, аналога компстатина, или обоих.

[00287] В целом, настоящее изобретение охватывает любой способ получения соединения, содержащего фрагмент аналога компстатина и нацеливающий фрагмент, и полученные соединения. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия может быть получен с применением способов, в целом аналогичных описанным в Разделе VI, отличающихся тем, что нацеливающий фрагмент применяют вместо клеточно-реактивного фрагмента или наряду с ним. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия, содержащий пептид в качестве нацеливающего фрагмента, синтезируют в виде полипептидной цепи, содержащей фрагмент аналога компстатина и пептидный нацеливающий фрагмент. Указанная полипептидная цепь необязательно содержит один или большее количество спейсерных пептидов между фрагментом аналога компстатина и нацеливающим фрагментом.

[00288] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия имеет молярную активность, составляющую по меньшей мере примерно 10%, 20% или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более, от активности соответствующего аналога компстатина, имеющего такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, один или большее количество блокирующих фрагментов), но не содержащего нацеливающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации, отличающимся тем, что аналог компстатина нацеленного действия содержит несколько фрагментов аналога компстатина, молярная активность указанного аналога компстатина нацеленного действия составляет по меньшей мере примерно 10%, 20%, или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более, от суммарной активности указанных фрагментов аналога компстатина. Композиции и способы получения аналогов компстатина нацеленного действия и промежуточные продукты синтеза являются аспектами настоящего изобретения.

[00289] VIII. Применение

[00290] Клеточно-реактивные аналоги компстатина длительного действия или нацеленного действия имеют широкий ряд применений. В настоящей заявке, без какого-либо ограничения настоящего изобретения, описаны определенные варианты применения клеточно-реактивных аналогов компстатина длительного действия или нацеленного действия и связанные с ними аспекты настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, страдающему от комплемент-опосредованного повреждения или имеющему риск возникновения комплемент-опосредованного повреждения органа, ткани или клетки. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина приводят в контакт с органом, тканью или клетками ex vivo, и он ковалентно связывается с ними. Указанный орган, ткань или клетки вводят субъекту, и они защищены от повреждения, которое в иных обстоятельствах происходило бы под действием системы комплемента реципиента.

[00291] Для целей, описанных в настоящей заявке, могут применяться аналоги компстатина, которые не связываются ковалентно с клетками. Например, может применяться аналог компстатина, модифицированный фрагментом, увеличивающим время жизни указанного соединения в организме и/или аналог компстатина, содержащий фрагмент, нацеливающий указанный аналог компстатина по отношению к типу клеток или к области, чувствительному(ой) к активации комплемента; настоящее изобретение охватывает такие варианты применения. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог компстатина длительного действия. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог компстатина, содержащий нацеливающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог компстатина, содержащий как фрагмент, увеличивающий время жизни указанного соединения в организме, так и нацеливающий фрагмент. В тех случаях, когда ниже идет речь о клеточно-реактивном аналоге компстатина, в настоящем изобретении предложены аналогичные композиции и способы, относящиеся к аналогам компстатина нацеленного действия, а также (по крайней мере в аспектах, подразумевающих введение аналога компстатина субъекту) варианты реализации, отличающиеся тем, что аналог компстатина, не включающий нацеливающий фрагмент или клеточно-реактивный фрагмент, необязательно аналог компстатина длительного действия, применяют вместо клеточно-реактивного аналога компстатина или наряду с ним.

[00292] Определенные представляющие интерес варианты применения включают: (1) защиту эритроцитов (кКК) от опосредованного комплементом повреждения у индивидуумов с такими расстройствами, как пароксизмальная ночная гемоглобинурия или атипичный гемолитико-уремический синдром, или другими расстройствами, характеризующимися комплемент-опосредованным лизисом кКК; (2) защиту трансплантированных органов, тканей и клеток от комплемент-опосредованного повреждения; (3) уменьшение ишемического/реперфузионного (И/Р) повреждения (например, у индивидуумов, страдающих от травмы, обструкции сосудов, инфаркта миокарда, или в других ситуациях, при которых может происходить И/Р повреждение); и (4) защиту различных структур организма (например, сетчатки) или мембран (например, синовиальной мембраны), которые могут подвергаться действию компонентов комплемента, от комплемент-опосредованного повреждения при любом из разнообразных комплемент-опосредованных расстройств. Благоприятные эффекты ингибирования активации комплемента на поверхности клеток или других структур организма не ограничены обусловленными непосредственно защитой собственно указанных клеток или структур от прямого комплемент-опосредованного повреждения (например, предотвращением лизиса клеток). Так, ингибирование активации комплемента с применением клеточно-реактивного аналога компстатина может снижать синтез анафилатоксинов и, в результате, приток/активацию нейтрофилов и другие провоспалительные проявления, и/или снижать потенциально разрушительное высвобождение внутриклеточного содержимого, потенциально оказывая, таким образом, благоприятное действие на отдаленные системы органов или на весь организм.

[00293] А. Защита клеток крови

[00294] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина нацеленного действия на клетки и/или аналог компстатина ненацеленного действия (например ненацеленный аналог компстатина длительного действия) применяют для защиты клеток крови от комплемент-опосредованного повреждения. Указанные клетки крови могут представлять собой любой клеточный компонент крови, например, эритроциты (красные клетки крови, кКК), лейкоциты (белые клетки крови, бКК) и/или тромбоциты. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина клеточно-нацеленного действия нацелен на целевую молекулу, экспонируемую на поверхности клеток кКК, такую как гликофорин или белок полосы 3. С комплемент-опосредованным повреждением клеток крови связаны разнообразные расстройства. Такие расстройства могут развиваться в результате, например, дефицита или дефектов одного или большего количества клеточных или растворимых СРБ у индивидуума, например, из-за (а) мутации(й) гена(ов), кодирующего(их) такие белки; (b) мутации(ий) в генах, необходимых для синтеза или нормального функционирования одного или большего количества СРБ, и/или (с) присутствия аутоантител к одному или большего количества СРБ. Комплемент-опосредованный лизис кКК может происходить в результате присутствия аутоантител к антигенам кКК, которые могут появляться в связи с разнообразными причинами (часто идиопатическими). У индивидуумов с такой(ими) мутацией(ями) в генах, кодирующих СРБ, и/или антителами против СРБ или против собственных кКК имеется повышенный риск расстройств, включающих комплемент-опосредованное повреждение кКК. У индивидуумов, перенесших один или большее количество характерных для расстройства эпизодов, имеется повышенный риск рецидива.

[00295] Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) представляет собой относительно редкое расстройство, включающее приобретенную гемолитическую анемию, характеризующуюся комплемент-опосредованным интраваскулярным гемолизом, гемоглобинурией, недостаточностью костного мозга и тромбофилией (склонностью к формированию тромбов). Она поражает примерно 16 индивидуумов на миллион по всему миру, встречается у представителей обоих полов и может возникнуть в любом возрасте, часто поражая молодых людей (Bessler, М. & Hiken, J., Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 104-110 (2008); Hillmen, P. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 116-123 (2008)). ПНГ представляет собой хроническое истощающее заболевание с периодическими эпизодами острого гемолиза, приводящее к тяжелым клиническим проявлениям и сокращению продолжительности жизни. Помимо анемии, многие пациенты испытывают боли в животе, страдают от дисфагии, эректильной дисфункции и легочной гипертензии, у них имеется повышенный риск почечной недостаточности и тромбоэмболических осложнений.

[00296] ПНГ впервые была описана как отдельное явление в первом десятилетии XIX века, но только в 1950-х годах, после открытия альтернативного пути активации комплемента, была точно установлена причина гемолиза при ПНГ (Parker CJ. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: an historical overview. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 93-103 (2008)). В норме CD55 и CD59 присоединены к клеточной мембране гликозилфосфатидилинозитольными (ГФИ) якорями (гликолипидными структурами, заякоривающими определенные белки на плазматической мембране). ПНГ возникает как последствие незлокачественной клональной экспансии гемопоэтической стволовой клетки(клеток), которая(ые) приобрела(и) соматическую мутацию в гене PIGA, кодирующем белок, вовлеченный в синтез ГФИ-якорей (Takeda J, et al. Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cell. 73: 703-711 (1993)). Потомки таких стволовых клеток дефицитны по ГФИ-заякоренным белкам, в том числе CD55 и CD59. Указанный дефект делает клетки чувствительными к комплемент-опосредованному лизису кКК. Для постановки диагноза часто применяют проточно-цитометрический анализ с применением антител к ГФИ-заякоренным белкам. Он позволяет обнаружить дефицит ГФИ-заякоренных белков на поверхности клетки, определить степень дефицита и долю пораженных клеток (Brodsky RA. Advances in the diagnosis and therapy of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood Rev. 22(2): 65-74 (2008). Клетки кКК при ПНГ III типа полностью дефицитны по ГФИ-связанным белкам и высокочувствительны к комплементу, тогда как кКК при ПНГ II типа частично дефицитны и менее чувствительны. FLAER представляет собой флуоренцентно меченый неактивный вариант проаэролизина (бактериального токсина, который связывает ГФИ-якоря), и его все чаще используют вместе с проточной цитометрией для диагностики ПНГ. Отсутствие связывания Flaer с гранулоцитами является достаточным для диагностирования ПНГ. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина защищает кКК при ПНГ от отложения C3b.

[00297] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, страдающему от атипичного гемолитического синдрома (аГУС). аГУС представляет собой хроническое расстройство, характеризующееся микроангиопатической гемолитической анемией, тромбоцитопенией и острой почечной недостаточностью, и обусловленное неадекватной активацией комплемента, часто по причине наличия мутаций в генах, кодирующих регуляторные белки комплемента (Warwicker, P., et al.. Kidney Int 53, 836-844 (1998); Kavanagh, D. & Goodship, T. Pediatr Nephrol 25, 2431-2442 (2010). Мутации в гене фактора комплемента Н (CFH) являются наиболее частой генетической аномалией среди пациентов с аГУС, и 60-70% указанных пациентов умирает или достигает терминальной стадии почечной недостаточности в течение одного года после начала заболевания (Kavanagh & Goodship, выше.) Также описаны мутации фактора I, фактора В, С3, связанных с фактором Н белков 1-5 и тромбомодулина. Другие причины аГУС включают наличие аутоантител против регуляторных белков комплемента, таких как CFH. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, у которого, как было установлено, имеется мутация фактора I, фактора В, С3, связанных с фактором Н белков 1-5 или тромбомодулина, либо, как было установлено, присутствуют антитела против регуляторного белка комплемента, например, CFH.

[00298] Комплемент-опосредованный гемолиз наблюдается в разнородной группе других состояний, включающей аутоиммунные гемолитические анемии, вовлекающие антитела, которые связываются с кКК, и приводящие к комплемент-опосредованному гемолизу. Например, такой гемолиз может происходить при первичной хронической болезни холодовых агглютининов и в ходе определенных реакций на лекарственные препараты и другие чужеродные вещества (Berentsen, S., et al., Hematology 12, 361-370 (2007); Rosse, W.F., Hillmen, P. & Schreiber, A.D. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 48-62 (2004)). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина вводят субъекту, страдающему от хронической болезни холодовых агглютининов или субъекту, у которого имеется риск возникновения хронической болезни холодовых агглютининов. Согласно другому варианту реализации клеточно-реактивный аналог компстатина применяют для лечения субъекта, страдающего от HELLP-синдрома, или субъекта, у которого имеется риск возникновения HELLP-синдрома, который диагностируют по наличию гемолиза, повышенных уровней печеночных ферментов и низкому содержанию тромбоцитов, и который по меньшей мере у некоторых субъектов связан с мутациями регуляторного(ых) белка(ов) комплемента (Fakhouri, F., et al., 112: 4542-4545 (2008)).

[00299] Согласно другим вариантам реализации клеточно-реактивные аналоги компстатина применяют для защиты кКК или других клеточных компонентов крови, предназначенных для переливания субъекту. Некоторые примеры таких применений подробнее описаны ниже. Как уже отмечалось, аналоги компстатина нацеленного действия и/или длительного действия могут применяться в описанных выше способах ингибирования комплемент-опосредованного гемолиза и/или повреждения кКК. Согласно некоторым вариантам реализации для лечения ПНГ или аГУС применяют аналог компстатина длительного действия, содержащий фрагмент (CH2CH2O).

[00300] В. Трансплантация

[00301] Трансплантация представляет собой приобретающий все большее значение метод лечения, который обеспечивает способы замещения органов и тканей, поврежденных при травме, заболевании или других состояниях. Почки, печень, легкие, поджелудочная железа и сердце относятся к органам, которые могут быть успешно трансплантированы. Часто трансплантируемые ткани включают кости, хрящи, сухожилия, роговицу, кожу, клапаны сердца и кровеносные сосуды. Трансплантация панкреатического островка или островковых клеток представляет собой перспективный подход для лечения диабета, например, диабета I типа. Для целей настоящего изобретения орган, ткань или клетка (или популяция клеток), который(ая) предназначен(а) для трансплантации, трансплантируется или был(а) трансплантирован(а), может быть называться «трансплантат». Для целей настоящего изобретения переливание крови считается «трансплантацией».

[00302] При трансплантации трансплантат подвергается разнообразным разрушительным воздействиям и стимулам, которые могут вносить вклад в развитие дисфункции трансплантата и, потенциально, недостаточности трансплантата. Например, ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение представляет собой распространенную и весомую причину заболеваемости и смертности для многих трансплантатов (в частности, солидных органов) и может быть главным фактором, определяющим вероятность выживания трансплантата. Отторжение трансплантата представляет собой один из основных рисков, связанных с трансплантацией между генетически отличными индивидуумами, и может приводить к недостаточности трансплантата и необходимости извлечения указанного трансплантата из тела реципиента.

[00303] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина с нацеленным действием на клетки и/или аналог компстатина длительного действия применяют для защиты трансплантата от комплемент-опосредованного повреждения. Аналог компстатина с нацеленным действием на клетки вступает в реакцию с клетками трансплантата, ковалентно присоединяется к нему и ингибирует активацию комплемента. Аналог компстатина с нацеленным действием на клетки связывается с целевой молекулой в трансплантате (например, экспрессируемой эндотелиальными клетками или другими клетками трансплантата) и ингибирует активацию комплемента. Целевая молекула может, например, представлять собой молекулу, экспрессия которой индуцируется или стимулируется таким стимулом, как повреждение или воспаление, молекулу, которая распознается как «несобственная» реципиентом, углеводный ксеноантиген, антитела против которого обычно имеются у людей, например, антиген группы крови, или ксеноантиген, например, молекулу, содержащую эпитоп альфа-Gal. Согласно некоторым вариантам реализации снижение активации комплемента может проявляться в виде снижения средних показателей отложения C4d в кровеносных сосудах трансплантатов, которые были приведены в контакт с аналогом компстатина, например, с клеточно-реактивным аналогом компстатина, по сравнению со средним уровнем отложения C4d в трансплантатах, которые не были приведены в контакт с аналогом компстатина (например, у субъектов с аналогичными трансплантатами, получающих другую аналогичную терапию).

[00304] Трансплантат может быть приведен в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина длительного действия или нацеленного действия до, во время и/или после трансплантирования, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения. Например, перед трансплантацией трансплантат, извлеченный из тела донора, может быть приведен в контакт с жидкостью, содержащей клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Например, указанный трансплантат может быть погружен в указанный раствор и/или перфузирован указанным раствором. Согласно другому варианту реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят донору перед извлечением трансплантата. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят реципиенту во время и/или после введения трансплантата. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный компстатин, аналог длительного действия или нацеленного действия вводят местно в трансплантированный трансплантат. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина вводят системно, например, внутривенно.

[00305] В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая: (а) выделенный трансплантат и (b) клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция дополнительно содержит жидкий раствор, подходящий для приведения в контакт (например, подходящий для ополаскивания, промывания, погружения, перфузии, поддержания или хранения) с трансплантатом (например, органом), в частности, выделенным трансплантатом, извлеченным из тела донора и предназначенным для трансплантирования реципиенту. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая: (а) жидкий раствор, подходящий для приведения в контакт с трансплантатом (например, органом); и (b) клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Указанный жидкий раствор может представлять собой любой жидкий раствор, физиологически приемлемый для данного трансплантата (например, подходящий осмотический состав, не цитотоксичный), медицински приемлемый с учетом последующего введения трансплантата реципиенту (например, предпочтительно стерильный или по меньшей мере не содержащий неприемлемых количеств микроорганизмов или других загрязняющих примесей) и совместимый с клеточно-реактивным аналогом компстатина (т.е. не устраняющий реакционную способность указанного аналога компстатина), или совместимый с аналогом компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно некоторым вариантам реализации раствор представляет собой любой известный в данной области техники раствор, предназначенный для любых таких целей. Согласно некоторым вариантам реализации жидкий раствор представляет собой раствор Маршалла, или гиперосмолярный цитратный раствор (Soltran^®, Baxter Healthcare), раствор Университета Висконсина в Мэдисоне (UW) (ViaSpan™, Bristol Myers Squibb), раствор гистидин-триптофан-кетоглутарат (НТК) (Custodial^®, Kohler Medical Limited), EuroCollins (Fresenius) и Celsior^® (Sangstat Medical), Polysol, IGL-1 или AQIX^® RS-1. Разумеется, могут применяться другие растворы, относящиеся к физиологически приемлемым композициям, например, содержащие эквивалентные или сходные ингредиенты в тех же или в других концентрациях. Согласно некоторым вариантам реализации раствор не содержит ингредиента(ов), с которым(и) указанный клеточно-реактивный аналог компстатина предположительно будет активно вступать в реакцию, и любой раствор может быть модифицирован таким образом, чтобы не содержать таких ингредиентов, или может быть получен без таких ингредиентов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный клеточно-реактивный аналог компстатина присутствует в трансплантат-совместимом растворе в концентрации, например, от 0,01 мг/мл до 100 мг/мл, или может быть добавлен к указанному раствору для получения такой концентрации.

[00306] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен набор, содержащий: (а) клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия; и (b) трансплантат-совместимый раствор или его твердые (например, в виде порошка) компоненты. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может быть представлен твердой формой (например, порошком) или раствором, в по меньшей мере частично растворенной форме. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия и/или трансплантат-совместимый раствор представлены в заранее установленных количествах, таким образом, что при их сочетании образуется раствор, содержащий указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, с подходящей концентрацией для приведения в контакт с трансплантатом. Во многих вариантах реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия и трансплантат-совместимый раствор или его твердые (например, в виде порошка) компоненты находятся в отдельных емкостях, входящих в набор. Согласно некоторым вариантам реализации и клеточно-реактивный аналог компстатина, и компоненты трансплантат-совместимого раствора представлены твердой формой (например, порошком), в отдельных емкостях или в виде смеси. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор содержит инструкции по применению, например, инструкции по добавлению клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия в трансплантат-совместимый раствор и/или инструкции по приведению трансплантата в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина. Указанный набор необязательно содержит этикетку, утвержденную государственным агентством, ответственным за контроль продуктов, применяемых для трансплантации, клеточной терапии и/или переливания крови.

[00307] В настоящем изобретении также предложен способ ковалентного связывания аналога компстатина с выделенным трансплантатом, включающий контакт указанного выделенного трансплантата с клеточно-реактивным аналогом компстатина. В настоящем изобретении также предложен выделенный трансплантат, к которому ковалентно присоединен аналог компстатина. Как правило, к указанному выделенному трансплантату присоединено множество молекул аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой или содержит солидный орган, такой как почка, печень, легкое, поджелудочная железа или сердце. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой или содержит кость, хрящ, фасцию, сухожилие, связки, роговицу, склеру, перикард, кожу, сердечный клапан, кровеносный сосуд, амниотическую мембрану или твердую мозговую оболочку. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат содержит несколько органов, например, трансплантат сердца-легкого или поджелудочной железы-почки. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат включает орган или ткань не полностью. В частности, трансплантат может содержать часть органа или ткани, например, долю печени, участок кровеносного сосуда, лоскут кожи или сердечный клапан. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат содержит препарат, содержащий выделенные клетки или фрагменты ткани, извлеченные из исходной ткани, но сохраняющие по меньшей мере отчасти архитектуру ткани, например, панкреатические островки. Согласно некоторым вариантам реализации препарат содержит выделенные клетки, не связанные друг с другом соединительной тканью, например, гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, полученные из периферической и/или пуповинной крови, либо цельную кровь или любой содержащий клетки продукт крови, например, эритроциты (кКК) или тромбоциты. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат получен от скончавшегося донора (например, после смерти мозга (DBD-донор) или после сердечной смерти). Согласно некоторым вариантам реализации, в зависимости от конкретного типа трансплантата, трансплантат получают от живого донора. Например, почки, участки печени, клетки крови относятся к типам трансплантатов, которые часто получают от живого донора без чрезмерного риска для указанного донора и в соответствии с разумной медицинской практикой.

[00308] Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой ксенотрансплантат (т.е. донор и реципиент принадлежат к разным видам). Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой аутотрансплантат (т.е. трансплантат, переносимый из одной части тела в другую часть тела одного и того же индивидуума). Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой изотрансплантат (т.е. донор и реципиент генетически идентичны). Согласно большинству вариантов реализации указанный трансплантат представляет собой аллотрансплантат (т.е. донор и реципиент являются генетически неидентичными представителями одного вида). В случае аллотрансплантата донор и реципиент могут либо быть, либо не быть генетически связаны (например, они могут быть членами одной семьи). Как правило, донор и реципиент совместимы по группе крови (по меньшей мере совместимы в системе АВО и необязательно - в системах Rh, Kell и/или в других системах антигенной совместимости клеток крови). Кровь реципиента может подвергаться скринингу на аллогенные антитела к трансплантату и/или реципиенту и донору, так как присутствие таких антител может приводить к сверхострому отторжению (т.е. отторжению, начинающемуся практически немедленно, например, в течение нескольких минут после начала контакта трансплантата с кровью реципиента). Анализ комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) может применяться для скрининга сыворотки субъекта на анти-HLA антитела. Сыворотку инкубируют с панелью лимфоцитов с известным HLA-фенотипом. Если сыворотка содержит антитела против молекул HLA на клетках-мишенях, происходит гибель клетки в результате комплемент-опосредованного лизиса. Использование отобранной панели клеток-мишени позволяет определить специфичность обнаруженного антитела. Другие техники, подходящие для определения присутствия или отсутствия анти-HLA антител и, необязательно, определения их HLA-специфичности, включают ИФА ELISA, проточно-цитометрический анализ, технологии на основе микрогранул (например, технологию Luminex). Методология проведения указанных анализов общеизвестна, и существуют разнообразные коммерчески доступные наборы для их проведения.

[00309] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует комплемент-опосредованное отторжение. Например, согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует сверхострое отторжение. Сверхострое отторжение обусловлено по меньшей мере частично антитело-опосредованной активацией системы комплемента у реципиента через классический путь и, в результате, отложением МАК на трансплантате. Это, как правило, происходит из-за уже присутствующих у реципиента антител, которые вступают в реакцию с трансплантатом. Хотя и желательно попытаться избежать сверхострого отторжения до трансплантации, обеспечив подбор совместимого трансплантата, это не всегда возможно, например, ввиду ограниченности времени и/или ресурсов. Кроме того, у некоторых реципиентов (например, у индивидуумов после неоднократного переливания, у индивидуумов, ранее получавших трансплантаты, у женщин после нескольких беременностей) может уже существовать такое значительное количество антител, в том числе, потенциально, антител к антигенам, проверку на которые обычно не проводят, что своевременно подобрать гарантированно совместимый трансплантат может быть трудно или даже практически невозможно. У таких индивидуумов имеется повышенный риск сверхострого отторжения.

[00310] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует острое отторжение или недостаточность трансплантата. В настоящей заявке «острое отторжение» относится к отторжению, возникающему по меньшей мере через 24 часа, обычно по меньшей мере через несколько дней - неделю после трансплантации, и до 6 месяцев после трансплантации. Острое антитело-опосредованное отторжение (АОО) часто включает резкое повышение уровня донор-специфических аллоантител (ДСА) в течение нескольких первых недель после трансплантации. Без связи с конкретной теорией, возможно, что уже существующие клетки плазмы и/или конверсия В-клеток памяти в новые клетки плазмы играют определенную роль в повышении синтеза ДСА. Такие антитела могут вызывать комплемент-опосредованное повреждение трансплантата, которое может быть ингибировано путем приведения указанного трансплантата в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина. Без связи с конкретной теорией, ингибирование активации комплемента в трансплантате может уменьшать лейкоцитарную инфильтрацию (например, нейтрофилами), также вносящую вклад в острую недостаточность трансплантата.

[00311] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует комплемент-опосредованное И/Р повреждение трансплантата. Согласно более подробному описанию, приведенному ниже, И/Р повреждение может происходить при реперфузии ткани, поступление крови в которую временно прерывалось, как это происходит в трансплантируемых органах. Уменьшение И/Р повреждения снижает вероятность наступления острой дисфункции трансплантата или снижает ее тяжесть, и уменьшает вероятность развития острой недостаточности трансплантата.

[00312] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует хроническое отторжение и/или хроническую недостаточность трансплантата. В настоящей заявке «хроническое отторжение или недостаточность трансплантата» относится к отторжению или недостаточности, наступающему(ей) по меньшей мере через 6 месяцев после трансплантации, например, через 6 месяцев - 1, 2, 3, 4, 5 лет или более, после трансплантации, часто через месяцы или годы нормального функционирования трансплантата. Это обусловлено хроническим воспалительным и иммунным ответом против указанного трансплантата. Для целей настоящего изобретения хроническое отторжение может включать хроническую васкулопатию аллотрансплантата - этот термин применяют для обозначения фиброза внутренних кровеносных сосудов трансплантированной ткани. Так как за счет программ иммуносупрессивной терапии частота развития острого отторжения была снижена, все более значимым в качестве причины дисфункции и недостаточности трансплантатов становится хроническое отторжение. Появляется все больше доказательств того, что синтез аллоантител В-клетками является важным элементом возникновения хронического отторжения и недостаточности трансплантатов (Kwun J. and Knechtle SJ, Transplantation, 88(8): 955-61 (2009). Более ранее повреждение трансплантата может представлять собой способствующий фактор, приводящий к хроническим процессам, таким как фиброз, которые могут приводить, в конечном счете, к хроническому отторжению. Таким образом, ингибирование такого раннего повреждения с помощью применения клеточно-реактивного аналога компстатина может задерживать и/или снижать вероятность наступления или тяжесть хронического отторжения трансплантата.

[00313] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия вводят реципиенту трансплантата для ингибирования отторжения трансплантата и/или недостаточности трансплантата.

[00314] С. Ишемическое/реперфузионное повреждение

[00315] Ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение представляет собой важную причину повреждения тканей после травм и при других условиях, связанных с временным прекращением кровотока, например, при инфаркте миокарда, инсульте, тяжелой инфекции, заболевании сосудов, реконструкции при аневризме, сердечно-легочном шунтировании и трансплантации.

[00316] При травме системная гипоксемия, гипотензия и локальное прерывание кровоснабжения в результате ушибов, синдрома сдавливания и повреждения сосудов приводят к ишемии, повреждающей метаболически активные ткани. Восстановление кровоснабжения запускает интенсивную системную воспалительную реакцию, часто более пагубную, чем собственно ишемия. После реперфузии области ишемии синтезируемые и высвобождающиеся местно факторы попадают в систему кровообращения и достигают отдаленных областей, иногда вызывая значительные повреждения органов, не затронутых изначальным ишемическим инсультом, например, легких и кишечника, приводя к дисфункции одного органа и к мультиорганной дисфункции. Активация комплемента происходит вскоре после реперфузии и представляет собой ключевой посредник пост-ишемического повреждения, действующий как прямо, так и опосредованно через хемоаттрактивные и стимулирующие эффекты на нейтрофилы. Все три основных пути комплемента активируются и, функционируя совместно или независимо, включаются в связанные с И/Р нежелательные явления, затрагивающие многие системы органов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, незадолго до этого (например, на протяжении предшествующих 2, 4, 8, 12, 24 или 48 часов) перенесшему травму, например, травму, приводящую к возникновению риска И/Р повреждения у указанного субъекта, например, из-за системной гипоксемии, гипотензии и/или локального прерывания кровоснабжения. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина может быть введен интраваскулярно, необязательно в кровеносный сосуд, через который кровь поступает в поврежденную часть тела, либо непосредственно в указанную часть тела. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от повреждения спинного мозга, травматического повреждения головного мозга, ожога и/или геморрагического шока.

[00317] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту до, во время или после хирургической процедуры, например, хирургической процедуры, которая, как ожидается, временно приостановит поступление крови в ткань, орган или часть тела. Примеры таких процедур включают сердечно-легочное шунтирование, ангиопластику, восстановление/замену клапана сердца, реконструкцию при аневризме или другие хирургические операции на сосудах. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина может быть введен до, после и/или на протяжении периода времени, частично совпадающего с хирургической процедурой.

[00318] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, перенесшему ИМ, тромбоэмболический инсульт, тромбоз глубоких вен или эмболию легких. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина может быть введен в комбинации с тромболитическим агентом, таким как тканевый активатор плазминогена (tPA) (например, альтеплазой (активазой), ретеплазой (ретавазой), тенектеплазой (TNK-азой)), анистреплазой (эминазой), стрептокиназой (кабикиназой, стрептазой) или урокиназой (аббокиназой). Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может быть введен до, после и/или на протяжении периода времени, частично совпадающего с периодом введения тромболитического агента.

[00319] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту для лечения И/Р повреждения.

[00320] Р. Другие комплемент-опосредованные расстройства

[00321] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят в глаз для лечения глазного расстройства, такого как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), диабетическая ретинопатия, глаукома или увеит. Например, клеточно-реактивный аналог компстатина может быть введен в стекловидную полость (например, посредством интравитреальной инъекции) для лечения субъекта, страдающего от ВМД, или субъекта, у которого имеется риск возникновения ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят в переднюю камеру, например, для лечения переднего увеита.

[00322] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от аутоиммунного заболевания, или субъекта, у которого имеется риск возникновения аутоиммунного заболевания, например, аутоиммунного заболевания, опосредованного по меньшей мере частично антителами против одного или большего количества собственных антигенов.

[00323] Клеточно-реактивные аналоги компстатина, аналоги компстатина длительного действия или аналоги компстатина нацеленного действия могут быть введены в синовиальную полость, например, субъекту, страдающему от артрита (например, ревматоидный артрит). Разумеется, они могут быть введены системно дополнительно или

[00324] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от внутримозгового кровоизлияния, или субъекта, у которого имеется риск возникновения внутримозгового кровоизлияния.

[00325] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от миастении гравис, или субъекта, у которого имеется риск возникновения миастении гравис.

[00326] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от нейромиелита зрительного нерва (NMO/HЗH), или субъекта, у которого имеется риск возникновения НЗН.

[00327] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита (МПГН), или субъекта, у которого имеется риск возникновения МПГН, например, МПГН I типа, МПГН II типа или МПГН III типа.

[00328] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от нейродегенеративного заболевания, или субъекта, у которого имеется риск возникновения нейродегенеративного заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от нейропатической боли, или субъекта, у которого имеется риск развития нейропатической боли. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от риносинусита или назального полипоза или субъекта, у которого имеется риск возникновения риносинусита или назального полипоза. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от рака, или субъекта, у которого имеется риск возникновения рака. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от сепсиса, или субъекта, у которого имеется риск возникновения сепсиса. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от респираторного дистресс-синдрома взрослых, или субъекта, у которого имеется риск возникновения респираторного дистресс-синдрома взрослых.

[00329] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от анафилаксии или инфузионной реакции, или субъекта, у которого имеется риск возникновения анафилаксии или инфузионной реакции. Например, согласно некоторым вариантам реализации субъект может получать предварительное лечение до, во время или после получения лекарственного средства или основы, которые могут вызывать анафилаксию или инфузионную реакцию. Согласно некоторым вариантам реализации субъект, у которого имеется риск возникновения анафилаксии, или субъект, страдающий от анафилактической реакции на пищевой продукт (например, арахис, моллюски или другие пищевые аллергены), укус насекомого (например, пчелы, осы), получает лечение клеточно-реактивным аналогом компстатина длительного действия или нацеленного действия.

[00330] Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения, быть введен местно или системно.

[00331] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения респираторного заболевания, например, астмы или хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ). Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может, например, быть введен в дыхательные пути ингаляционным путем, например, в виде сухого порошка или распылением, или может быть введен путем инъецирования, например, внутривенно, внутримышечно или подкожно, согласно различным вариантам реализации. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения тяжелой астмы, например, астмы, которая недостаточно контролируется бронходилататорами и/или ингаляционными кортикостероидами.

[00332] Согласно некоторым аспектам предложены способы лечения комплемент-опосредованного расстройства, например, хронического комплемент-опосредованного расстройства, включающие введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного расстройства. Указанный аналог компстатина длительного действия, согласно различным вариантам реализации, может представлять собой любой описанный в настоящем документе аналог компстатина длительного действия. Согласно некоторым аспектам предложены способы лечения связанного с Th17 расстройства, включающие введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного расстройства.

[00333] Согласно некоторым аспектам «хроническое расстройство» представляет собой расстройство, персистирующее в течение по меньшей мере 3 месяцев и/или считающееся в данной области техники хроническим расстройством. Согласно многим вариантам реализации хроническое расстройство персистирует в течение по меньшей мере 6 месяцев, например, по меньшей мере 1 год или более, например, в течение неопределенного срока. Специалисту в данной области техники будет понятно, что по меньшей мере некоторые проявления различных хронических расстройств могут быть перемежающимися и/или их тяжесть может нарастать и убывать с течением времени. Хроническое расстройство может быть прогрессирующим, например, имеющим тенденцию к нарастанию тяжести или поражению областей с течением времени. В настоящем документе обсуждается ряд хронических комплемент-опосредованных расстройств. Хроническое комплемент-опосредованное расстройство может представлять собой любое хроническое расстройство, при котором задействована активация комплемента (например, избыточная или неадекватная активация комплемента), например, в качестве способствующего и/или по меньшей мере отчасти причинного фактора. Для удобства расстройства иногда группируют на основании органа или системы, в частности, часто поражаемого(ой) у субъектов, страдающих указанным расстройством. Следует иметь в виду, что некоторые расстройства могут поражать несколько органов или систем, и такая(ие) классификация(ии) никоим образом не являются ограничивающими. Кроме того, некоторые проявления (например, симптомы) могут наблюдаться у субъектов, страдающих любым из ряда различных расстройств. С неограничивающей информацией относительно представляющих интерес с точки зрения настоящего изобретения расстройств можно ознакомиться, например, в стандартных терапевтических руководствах, таких как Cecil Textbook of Medicine (например, издание 23), Harrison's Principles of Internal Medicine (например, издание 17), и/или стандартных руководствах, посвященных конкретным областям медицины, конкретным системам или органам организма и/или конкретным расстройствам.

[00334] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой связанное с Th2 расстройство. В настоящем документе связанное с Th2 расстройство представляет собой расстройство, характеризующееся избыточным количеством и/или избыточной или неадекватной активностью CD4+ хелперных Т-клеток подтипа Th2 («Th2-клеток») в организме или его части, например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре. Например, может иметь место преобладание Th2-клеток относительно CD4+ хелперных Т-клеток подтипа Th1 («Th1-клеток») например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре, пораженной расстройством. Как известно в данной области техники, Th2-клетки, как правило секретируют характерные цитокины, такие как интерлейкин-4 (ИЛ-4), интерлейкин-5 (ИЛ-5) и интерлейкин-13 (ИЛ-13), тогда как Тh1-клетки, как правило, секретируют интерферон-γ (IFN-γ) и фактор некроза опухоли β (ФНО-β). Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th2 расстройство характеризуется избыточным синтезом и/или количеством ИЛ-4, ИЛ-5 и/или ИЛ-13, например, относительно IFN-γ и/или ФНО-β, например, по меньшей мере в некоторых из по меньшей мере одной ткани, органа или структуры.

[00335] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой связанное с Th17 расстройство. Согласно некоторым аспектам, описанным более подробно в заявке PCT/US2012/043845, поданной 22 июня 2012 г., озаглавленной «Способы лечения хронических расстройств ингибиторами комплемента» ("Methods of Treating Chronic Disorders with Complement Inhibitors"), активация комплемента и Th17-клетки вовлечены в цикл, который задействует дендритные клетки и антитела и способствует поддержанию патологического иммунологического микроокружения, лежащего в основе ряда расстройств. Без привязки к конкретной теории указанное патологическое иммунологическое микроокружение, однажды возникнув, самоподдерживается и способствует повреждению клеток и тканей. Согласно некоторым аспектам аналоги компстатина длительного действия подходят для лечения связанных с Th17 расстройств.

[00336] В настоящем документе связанное с Th17 расстройство представляет собой расстройство, характеризующееся избыточным количеством и/или избыточной или неадекватной активностью CD4+ хелперных Т-клеток подтипа Th17 («Th17-клетки») в организме или его части, например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре. Например, может наблюдаться преобладание Th17-клеток относительно Th1- и/или Th2-клеток, например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре, пораженной расстройством. Согласно некоторым вариантам реализации преобладание Th17-клеток представляет собой относительное преобладание, например, пропорция Th17-клеток относительно Th1-клеток, и/или пропорция Th17-клеток относительно Th2-клеток увеличивается относительно нормальных значений. Согласно некоторым вариантам реализации пропорция Th17-клеток относительно регуляторных Т-клеток (регуляторные CD4⁺CD25⁺ Т-клетки, также называемые «Treg-клетками») увеличивается относительно нормальных значений. Образованию Th17-клеток и/или активации Th17-клеток способствуют различные цитокины, например, интерлейкин 6 (ИЛ-6), интерлейкин 21 (ИЛ-21), интерлейкин 23 (ИЛ-23) и/или интерлейкин 1β (ИЛ-1β). Образование Th17-клеток включает дифференцировку предшественников Т-клеток, например, необученных CD4+ Т-клеток, в фенотип Th17, и их созревание в функциональные Th17-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации образование Th17-клеток охватывает любой аспект развития, пролиферации (размножения), выживания и/или созревания Th17-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 расстройство характеризуется избыточным синтезом и/или количеством ИЛ-6, IL-21, ИЛ-23 и/или ИЛ-1β. Th17-клетки, как правило, секретируют характерные цитокины, такие как интерлейкин-17А (ИЛ-17А), интерлейкин-17F (ИЛ-17F), интерлейкин-21 (ИЛ-21) и интерлейкин-22 (ИЛ-22). Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 расстройство характеризуется избыточным синтезом и/или количеством эффекторного Th17-цитокина, например, ИЛ-17А, ИЛ-17F, ИЛ-21 и/или ИЛ-22. Согласно некоторым вариантам реализации избыточный синтез или количество цитокина является детектируемым в крови. Согласно некоторым вариантам реализации избыточной синтез или количество цитокина является детектируемым локально, например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре. Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 расстройство связано с уменьшенным количеством Treg и/или уменьшенным количеством связанного с Treg цитокина. Согласно некоторым вариантам реализации Th17-расстройство представляет собой любое хроническое воспалительное заболевание; указанный термин охватывает ряд болезней, характеризующихся самоподдерживающейся иммунной атакой в отношении различных тканей, которая предположительно уже не связана с первоначальным вызвавшим указанную болезнь повреждением (которое может быть неизвестно). Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 расстройство представляет собой любое аутоиммунное заболевание. Большинство, если не все «хронические воспалительные заболевания» могут фактически представлять собой аутоиммунные заболевания. Примеры связанных с Th17 расстройств включают воспалительные заболевания кожи, такие как псориаз и атопический дерматит; системную склеродермию и склероз; воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) (такое как болезнь Крона и язвенный колит); болезнь Бехчета; дерматомиозит; полимиозит; рассеянный склероз (PC); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; остеоартрит; волчаночный нефрит; ревматоидный артрит (RA), синдром Шегрена, рассеянный склероз, васкулит; воспалительные расстройства центральной нервной системы (ЦНС), хронический гепатит; хронический панкреатит, гломерулонефрит; саркоидоз; тиреоидит, патологический иммунный ответ на трансплантацию ткани /органа (например, отторжение трансплантата); ХОЗЛ, астму, бронхиолит, гиперчувствительность, пневмонит, идиопатический фиброз легких (ИФЛ), периодонтит и гингивит. Согласно некоторым вариантам реализации Th17 заболевание представляет собой классическое известное аутоиммунное заболевание, такое как диабет I типа или псориаз. Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 расстройство представляет собой возрастную макулярную дегенерацию.

[00337] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой связанное с IgE расстройство. В настоящем документе «связанное с IgE расстройство» представляет собой расстройство, характеризующееся избыточным и/или неадекватным синтезом и/или количеством IgE, избыточной или неадекватной активностью продуцирующих IgE клеток (например, продуцирующих IgE В-клеток или плазмоцитов), и/или избыточной и/или неадекватной активностью IgE-отвечающих клеток, таких как эозинофилы или тучные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации связанное с IgE расстройство характеризуется повышенными уровнями общего IgE и/или, согласно некоторым вариантам реализации, аллергенспецифического IgE в плазме субъекта и/или локально.

[00338] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство характеризуется присутствием аутоантител и/или иммунных комплексов в организме, которые могут активировать комплемент через, например, классический путь. Аутоантитела могут, например, связываться с собственными антигенами, например, на клетках или тканях в организме. Согласно некоторым вариантам реализации аутоантитела связываются с антигенами в кровеносных сосудах, коже, нервах, мышцах, соединительной ткани, сердце, почках, щитовидной железе и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство не характеризуется наличием аутоантител и/или иммунных комплексов.

[00339] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой респираторное расстройство. Согласно некоторым вариантам реализации хроническое респираторное расстройство представляет собой астму или хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ). Согласно некоторым вариантам реализации хроническое респираторное расстройство представляет собой фиброз легких (например, идиопатический фиброз легких), радиационно-индуцированное повреждение легких, аллергический бронхолегочный аспергиллез, гиперчувствительный пневмонит (также известен как аллергический альвеолит), эозинофильную пневмонию, интерстициальную пневмонию, саркоид, гранулематоз Вегенера или облитерирующий бронхиолит. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения субъекта, нуждающегося в лечении хронического респираторного расстройства, например, астмы, ХОЗЛ, фиброза легких, радиационно-индуцированного повреждения легких, аллергического бронхолегочного аспергиллеза, гиперчувствительного пневмонита (также известного как аллергический альвеолит), эозинофильной пневмонии, интерстициальной пневмонии, саркоида, гранулематоза Вегенера или облитерирующего бронхиолита, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного расстройства.

[00340] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой аллергический ринит, риносинусит или назальный полипоз. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения субъекта, нуждающегося в лечении аллергического ринита, риносинусита или назального полипоза, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного расстройства.

[00341] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой расстройство, поражающее костно-мышечную систему. Примеры таких расстройств включают воспалительные состояния суставов (например, артрит, такой как ревматоидный артрит или псориатический артрит, ювенильный хронический артрит, спондилоартропатии, синдром Рейтера, подагра). Согласно некоторым вариантам реализации расстройство костно-мышечной системы приводит к таким симптомам, как боль, скованность и/или ограниченная подвижность пораженной(ых) части(ей) тела. Воспалительные миопатии включают дерматомиозит, полимиозит и различные другие расстройства с хроническим мышечным воспалением неизвестной этиологии, которые приводят к мышечной слабости. Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой миастению гравис. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения любых из вышеперечисленных расстройств, поражающих костно-мышечную систему, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного расстройства.

[00342] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой расстройство, поражающее покровную систему. Примеры таких расстройств включают, например, атопический дерматит, псориаз, пузырчатку, системную красную волчанку, дерматомиозит, склеродермию, склеродерматомиозит, синдром Шегрена и хроническую крапивницу. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложен способ лечения любых из вышеперечисленных расстройств, поражающих покровную систему, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного расстройства.

[00343] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство поражает нервную систему, например, центральную нервную систему (ЦНС) и/или периферическую нервную систему (ПНС). Примеры таких расстройств включают, например, рассеянный склероз, другие хронические демиелинизирующие заболевания, боковой амиотрофический склероз, хроническая боль, инсульт, аллергический неврит, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения любых из вышеперечисленных расстройств поражающих нервную систему, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента в соответствии с режимом дозирования, описанным в настоящем документе, субъекту, нуждающемуся в лечении указанного расстройства.

[00344] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство поражает циркуляторную систему. Например, согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство представляет собой васкулит или другое расстройство, связанное с воспалением сосудов, например, кровеносных сосудов и/или лимфатических сосудов. Согласно некоторым вариантам реализации васкулит представляет собой узелковый полиартрит, гранулематоз Вегенера, гигантоклеточный артериит, синдром Черджа-Стросса, микроскопический полиангиит, пурпура Шенлейна-Геноха, синдром Такаясу, болезнь Кавасаки или болезнь Бехчета. Согласно некоторым вариантам реализации субъект, например, субъект, нуждающийся в лечении васкулита, положителен по антинейтрофильным цитоплазматическим антителам (АНЦА).

[00345] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство поражает желудочно-кишечный тракт. Например, указанное расстройство может представлять собой воспалительное заболевание кишечника, например, болезнь Крона или язвенный колит. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения хронического комплемент-опосредованного расстройства, поражающего желудочно-кишечный тракт, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного расстройства.

[00346] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой тиреоидит (например, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, послеродовый тиреоидит), миокардит, гепатит (например, гепатит С), панкреатит, гломерулонефрит (например, мембранопролиферативный гломерулонефрит или мембранозный гломерулонефрит) или панникулит.

[00347] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены способы лечения субъекта, страдающего хронической болью, отличающиеся тем, что указанные способы включают введение ингибитора комплемента длительного действия нуждающемуся в этом субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает нейропатической болью. Нейропатическая боль была определена как боль, инициируемая или вызываемая первичным повреждением или дисфункцией нервной системы, в частности, боль, возникающая как прямое следствие повреждения или заболевания, поражающего соматосенсорную систему. Например, нейропатическая боль может возникать в результате повреждений, в которые вовлечены соматосенсорные пути с повреждением малых волокон периферических нервов и/или спиноталамокортикальной системы в ЦНС. Согласно некоторым вариантам реализации нейропатическая боль возникает в результате аутоиммунного заболевания (например, рассеянного склероза), метаболического заболевания (например, диабета), инфекции (например, вирусного заболевания, такого как опоясывающий лишай или ВИЧ), заболевание сосудов (например, инсульт), травма (например, телесное повреждение, хирургическое вмешательство) или раковое заболевание. Например, нейропатическая боль может представлять собой боль, которая персистирует после излечения телесного повреждения или после исчезновения стимула для периферических нервных окончаний, или боль, которая возникает из-за повреждения нервов. Примеры состояний нейропатической боли или связанных с нейропатической болью включают болезненную диабетическую нейропатию, постгерпетическую невралгию (например, боль, персистирующую или повторно возникающую на участке поражения острым опоясывающим лишаем через 3 или более месяцев после острого эпизода), невралгию тройничного нерва, связанную с раковым заболеванием нейропатическую боль, связанную с химиотерапией нейропатическую боль, связанную с ВИЧ нейропатическую боль (например, при ВИЧ-нейропатии), центральную/постинсультную нейропатическую боль, нейропатию, связанную с болью в спине, например, болью в пояснице (например, при радикулопатии, такой как сжатие корешков спинномозговых нервов, например, сжатие поясничных корешков, которое может происходить в результате грыжи диска), стеноз позвоночного канала, боль при повреждении периферических нервов, фантомные боли конечностей, полинейропатию, боль, связанную с повреждением спинного мозга, миелопатия и рассеянный склероз. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор комплемента вводят в соответствии с предложенным в изобретении режимом дозирования для лечения нейропатической боли у субъекта с одним или несколькими упомянутыми выше состояниями.

[00348] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное расстройство представляет собой хроническое глазное расстройство. Согласно некоторым вариантам реализации указанное хроническое глазное расстройство характеризуется макулярной дегенерацией, хориоидальной неоваскуляризацией (ХНВ), неоваскуляризацией сетчатки (НВС), глазным воспалением или любой комбинацией вышеперечисленного. Макулярная дегенерация, ХНВ, НВС и/или глазное воспаление может представлять собой определяющий и/или диагностический признак указанного расстройства. Примеры расстройств, которые характеризуются одним или большим количеством указанных признаков, включают, не ограничиваясь перечисленными, связанные с макулярной дегенерацией состояния, диабетическую ретинопатию, ретинопатию недоношенных, пролиферативную витреоретинопатию, увеит, кератит, конъюнктивит и склерит. Связанные с макулярной дегенерацией состояния включают, например, возрастную макулярную дегенерацию (ВМД). Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении влажной ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении сухой ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении географической атрофии (ГА). Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении глазного воспаления. Глазное воспаление может поражать значительное число структур глаза, например, конъюнктиву (конъюнктивит), роговицу (кератит), эписклеру, склеру (склерит), увеальный тракт, сетчатку, сосудистую сеть и/или зрительный нерв. Признаки глазного воспаления могут включать присутствие связанных с воспалением клеток, таких как белые клетки крови (например, нейтрофилы, макрофаги) в глазу, присутствие эндогенного(ых) воспалительного(ых) медиатора(ов), один или большее количество таких симптомов, как боль в глазу, краснота, чувствительность к свету, нечеткость зрения и «мушки» перед глазами, и т.п. Увеит представляет собой общий термин, который относится к воспалению в сосудистой оболочке (увеальном тракте) глаза, например, в любых структурах сосудистой оболочки, включая радужку, цилиарное тело или хороид. Специфические типы увеита включают ирит, иридоциклит, циклит, парспланит и хориоидит. Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении географической атрофии (ГА). Согласно некоторым вариантам реализации хроническое глазное расстройство представляет собой глазное расстройство, характеризующееся повреждением зрительного нерва (например, дегенерацией зрительного нерва), такое как глаукома.

[00349] Как отмечалось выше, согласно некоторым вариантам реализации хроническое респираторное заболевание представляет собой астму. Информацию относительно факторов риска, эпидемиологии, патогенеза, диагностики, современных методов современных методов ведения пациентов с астмой и т.п., можно найти, например, в руководстве: "Expert Panel Report 3: Guidelines for the Diagnosis и Management of Asthma". National Heart Lung and Blood Institute. 2007. http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/asthma/asthgdln.pdf. ("NHLBI Guidelines"; www.nhlbi.nih.gov/guidelines/asthma/asthgdln.htm), Global Initiative for Asthma, Global Strategy for Asthma Management and Prevention 2010 "GINA Report") и/или стандартных терапевтических руководствах, таких как Cecil Textbook of Medicine (20th edition), Harrison's Principles of Internal Medicine (17th edition), и/или стандартных руководствах, посвященных пульмонологии. Астма представляет собой хроническое воспалительное расстройство дыхательных путей, при котором играют роль многие клетки и клеточные элементы, такие как тучные клетки, эозинофилы, Т-лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы и эпителиальные клетки. У индивидуумов, страдающих астмой, наблюдаются повторяющиеся эпизоды, связанные с такими симптомами, как обструкция, дыхательная недостаточность (также называемая диспноэ, или одышкой), стесненность в груди и кашель. Указанные эпизоды обычно связаны с распространенной, но вариабельной обструкцией дыхательных путей, часто обратимой, спонтанно или в результате лечения. Воспаление также приводит к связанному увеличению существующей бронхиальной гиперреактивности в отношении разнообразных стимулов. Гиперреактивность дыхательных путей (чрезмерная бронхоконстрикция в ответ на стимулы) представляет собой типичный признак астмы. В целом, ограничение поступления воздуха обусловлено бронхоконстрикцией и отеком дыхательных путей. У некоторых пациентов с астмой обратимость ограничения поступления воздуха может быть неполной. Например, ремоделирование дыхательных путей может приводить к устойчивому сужению дыхательных путей. Структурные изменения могут включать утолщение суббазальной мембраны, субэпителиальный фиброз, гипертрофию и гиперплазию гладких мышц дыхательных путей, пролиферацию и дилатацию кровеносных сосудов, гиперплазию и гиперсекрецию слизистых желез.

[00350] У индивидуумов с астмой могут наблюдаться обострения, идентифицируемые как события, характеризующиеся изменением предшествующего статуса индивидуума. Тяжелые обострения астмы могут быть определены как события, которые требуют срочных действий со стороны индивидуума и его/ее лечащего врача для предотвращения серьезного нежелательного исхода, такого как госпитализация или смерть от астмы. Например, при тяжелом обострении астмы может требоваться применение системных кортикостероидов (например, кортикостероидов для перорального применения) у субъекта, у которого астма обычно поддается достаточному контролю без ОКС, или может требоваться увеличение установленной поддерживающей дозы. Умеренные обострения астмы могут быть определены как события, причиняющие субъекту беспокойство, которые указывают на необходимость изменения лечения, но не являющиеся тяжелыми. Указанные события клинически идентифицируют как выходящие за рамки обычного для указанного субъекта диапазона повседневных вариаций астмы.

[00351] Современные медикаменты для применения при астме, как правило, разделяют на два общих класса: медикаменты для долгосрочного контроля («контролирующие медикаменты»), такие как ингаляционные кортикостероиды (ИГКС), кортикостероиды для перорального применения (ПКС), бронходилататоры длительного действия (БДД), модификаторы лейкотриенов (например, антагонисты лейкотриеновых рецепторов или ингибиторы синтеза лейкотриенов, антитела против IgE (омализумаб (Xolair®)), хромолин и недокромил, применяемые для достижения и поддержания контроля персистирующей астмы, и медикаменты быстрого действия, такие как бронходилататоры короткого действия (БКД), применяемые для лечения острых симптомов и обострений. Для целей настоящего изобретения указанные варианты лечения могут называться «традиционной терапией». Лечение обострений может также включать увеличение дозы и/или интенсивности терапии контролирующими медикаментами. Например, для восстановления контроля над астмой может применяться курс ПКС. Современные руководства предусматривают ежедневное введение контролирующего медикамента или, во многих случаях, введение нескольких доз контролирующего медикамента ежедневно субъектам с персистирующей астмой (за исключением Xolair, который вводится один раз в 2 или 4 недели).

[00352] Как правило, считается, что у субъекта имеется персистирующая астма, если у указанного субъекта наблюдаются симптомы в среднем чаще чем дважды в неделю и/или субъект, как правило, использует медикамент быстрого действия (например, БКД) чаще чем дважды в неделю для контроля симптомов. «Тяжесть астмы» может быть классифицирована на основании интенсивности лечения, требующегося для контроля астмы у субъекта после лечения релевантных сопутствующих патологий и оптимизации ингаляционных техник и режима (см., например, GINA Report; Taylor, DR, Eur Respir J 2008; 32: 545-554). Описание интенсивности лечения может основываться на рекомендованных медикаментах и дозах согласно алгоритму пошагового лечения, с которым можно ознакомиться в таких руководствах, как NHLBI Guidelines 2007, GINA Report, и предшествующих им, и/или в стандартных медицинских руководствах. Например, астма может быть классифицирована как периодическая, мягкая, умеренная или тяжелая согласно данным в таблице X, где «лечение» относится к лечению, достаточному для обеспечения наилучшего уровня контроля астмы у субъекта. (Следует понимать, что категории мягкой, умеренной и тяжелой астмы в целом относятся к персистирующей, а не периодической астме). Специалисту в данной области техники будет понятно, что таблица X приведена для примера, и что не все из указанных медикаментов доступны в любой системе здравоохранения, что может влиять на оценку тяжести астмы в некоторых условиях. Следует также понимать, что на классификацию мягкой/умеренной астмы могут влиять другие разрабатываемые или новые методы. Тем не менее, остается применимым принцип определения астмы как мягкой, если возможно обеспечение достаточного контроля с применением в значительной степени низкоинтенсивного лечения, и тяжелой, если требуется высокоинтенсивное лечение. Тяжесть астмы может также или в альтернативном варианте быть классифицирована на основании присущей заболеванию интенсивности в отсутствие лечения (см., например, NHBLI Guidelines 2007). Оценка может быть сделана на основании текущих спирометрических показателей и описания пациентом симптомов за предшествующие 2-4 недели. Показатели текущих нарушений и будущий риск могут быть оценены и включены в определение уровня тяжести астмы. Согласно некоторым вариантам реализации тяжесть астмы определяют согласно фиг. 3.4(a), 3.4(b), 3.4(c) руководства NHBLI Guidelines, для индивидуумов возрастом 0-4, 5-11 или ≥12 лет, соответственно.

[00353] «Контроль астмы» относится к степени снижения или устранения проявлений астмы при лечении (фармакологическом или нефармакологическом). Контроль астмы может оцениваться на основании таких факторов, как частота симптомов, наличие симптомов в ночное время, объективные показатели функции легких, такие как спирометрические показатели (например, %ОФВ₁ от предсказанного, вариабельность ОФВ₁, необходимость применения БКД для контроля симптомов. Показатели текущих нарушений и будущий риск могут быть оценены и включены в определение уровня контроля астмы. Согласно некоторым вариантам реализации контроль над астмой определяют согласно фиг. 4.3(a), 4.3(b) или 4.3(c) руководства NHBLI Guidelines, для индивидуумов возрастом 0-4, 5-11 или ≥12 лет, соответственно.

[00354] В целом, специалист в данной области техники может выбрать подходящие способы определения степени тяжести и/или степени контроля астмы, и может использоваться любая система классификации, признанная целесообразной специалистами в данной области техники.

[00355] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект, страдающий персистирующей астмой, получает лечение ингибитором комплемента с применением предложенного в настоящем изобретении режима дозирования. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект страдает мягкой или умеренной астмой. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект страдает тяжелой астмой. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает астмой, не поддающейся достаточному контролю при применении традиционной терапии. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает астмой, требующей, при лечении с применением традиционной терапии, использования ИГКС обеспечения для достаточного контроля. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает астмой, достаточный контроль которой невозможно обеспечить, несмотря на использование ИГКС. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает астмой, требующей, при лечении с применением традиционной терапии, использования ПКС для обеспечения достаточного контроля. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает астмой, достаточный контроль которой невозможно обеспечить, несмотря на применение высокоинтенсивной традиционной терапии, включающей ПКС. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор комплемента длительного действия вводится в качестве контролирующего медикамента или позволяет субъекту избежать применения или уменьшить дозу традиционного контролирующего медикамента.

[00356] Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект страдает аллергической астмой, что применимо к большинству страдающих астмой индивидуумов. Согласно некоторым вариантам реализации считается, что у страдающего астмой субъекта имеется аллергическая астма, если неаллергенный триггер астмы (например, простуда, физические упражнения) неизвестен и/или не идентифицирован по стандартной диагностической оценке. Согласно некоторым вариантам реализации считается, что у страдающего астмой субъекта имеется аллергическая астма, если у указанного субъекта (i) воспроизводимо развиваются симптомы астмы (или ухудшение симптомов астмы) после воздействия аллергена, или аллергена(ов), к которому(ым) чувствителен указанный субъект; (ii) наблюдаются IgE, специфичные в отношении аллергена, или аллергена(ов), к которому(ым) чувствителен указанный субъект; (iii) наблюдаются положительные результаты кожной скарификационной пробы на аллерген, или на аллерген(ы), к которому(ым) чувствителен указанный субъект; и/или (iv) наблюдает(ют)ся другой(ие) характерный(ые) симптом(ы), соответствующие атопии, такие как аллергический ринит, экзема или повышенные уровни общего IgE в сыворотке. Следует иметь в виду, что конкретный аллергенный триггер может не быть идентифицирован, однако может подозреваться или предполагаться, если у субъекта наблюдается ухудшение симптомов, например, в конкретных условиях.

[00357] Стимуляция аллергеном при вдыхании представляет собой технику широко используемую при оценке аллергических заболеваний дыхательных путей. Вдыхание аллергена приводит к перекрестной реакции между специфическим в отношении аллергена IgE, связанным с IgE-рецепторами, например, на тучных клетках и базофилах. Происходит активация секреторных путей, что приводит к высвобождению медиаторов бронхоконстрикции и проницаемости сосудов. У индивидуумов с аллергической астмой могут развиваться различные проявления после стимуляции аллергеном, например, ранний астматический ответ (EAR), замедленный астматический ответ (LAR), гиперреактивность дыхательных путей (AHR) и эозинофилия дыхательных путей, каждый из которых может быть детектирован и количественно определен в соответствии с известным уровнем техники. Например, эозинофилия дыхательных путей может быть детектирована по повышению уровня эозинофилов в мокроте и/или жидкости бронхоальвеолярного лаважа. EAR, иногда называемый немедленным астматическим ответом (IAR), представляет собой ответ на стимуляцию аллергеном при вдыхании, который можно детектировать вскоре после вдыхания, как правило, в течение 10 минут (мин) после вдыхания, например, по уменьшению ОФВ₁. EAR, как правило, достигаем максимума в течение 30 мин и исчезает в течение 2-3 часов (ч) после стимуляции. Например, можно считать, что у субъекта наблюдается «положительный» EAR, если его/ее ОФВ₁ уменьшается по меньшей мере на 15%, например, по меньшей мере на 20%, в пределах указанного периода времени, относительно исходного ОФВ₁ (где «исходный» в указанном контексте относится к состоянию до стимуляции, например, состоянию, эквивалентному обычному состоянию указанного субъекта в отсутствие обострения астмы и отсутствие воздействия аллергических стимулов, к которым чувствителен указанный субъект). Начало замедленного астматического ответа (LAR), как правило, наступает через 3-8 ч после стимуляции; он характеризуется клеточным воспалением дыхательных путей, повышением бронхососудистой проницаемости и секрецией слизи. Как правило, его детектируют по уменьшению ОФВ₁, величина которого может быть большей, чем связанного с EAR, и потенциально более клинически значимому. Например, можно считать, что у субъекта наблюдается «положительный» LAR, если его/ее ОФВ₁ в пределах релевантного периода времени уменьшается по меньшей мере на 15%, например, по меньшей мере 20% относительно исходного ОФВ₁. Отложенный ответ дыхательных путей (DAR) может начинаться примерно через 26-32 ч, достигая максимума примерно через 32 и 48 ч и исчезая в течение примерно 56 ч после стимуляции (Pelikan, Z. Ann Allergy Asthma Immunol. 2010, 104(5): 394-404).

[00358] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое респираторное расстройство представляет собой хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ). ХОЗЛ охватывает спектр состояний, характеризующихся ограничением поступления воздуха, которые не являются полностью обратимыми даже при условии терапии и, как правило, прогрессируют. Симптомы ХОЗЛ включают диспноэ (дыхательную недостаточность), пониженную толерантность к физической нагрузке, кашель, образование мокроты, хрипы и стесненность в груди. Индивидуумы с ХОЗЛ могут испытывать эпизоды острого (например, развивающегося менее чем за неделю и часто за 24 часов или менее) ухудшения симптомов (называемых обострениями ХОЗЛ), частота и продолжительность которых может варьировать и которые связаны со значительными осложнениями. Они могут запускаться такими событиями, как инфекция дыхательных путей, воздействие токсичных частиц или могут иметь неизвестную этиологию. Курение является наиболее распространенным фактором риска развития ХОЗЛ; в развитие и прогрессирование указанного заболевания могут вносить вклад и другие воздействия при вдыхании. Роль генетических факторов в ХОЗЛ является областью активных исследований. У небольшого процента пациентов с ХОЗЛ имеется наследственный дефицит альфа-1-антитрипсина, основного циркулирующего ингибитора сериновых протеаз, и указанный дефицит может приводить к быстро прогрессирующей форме заболевания.

[00359] Характерные патофизиологические признаки ХОЗЛ включают сужение и структурные изменения малых дыхательных путей и разрушение паренхимы легких (в частности, вокруг альвеол), чаще всего в результате хронического воспаления. Хроническое ограничение поступления воздуха, наблюдаемое при ХОЗЛ, как правило, включает сочетание указанных факторов, и относительная значимость их вклада в симптомы ограничения поступления воздуха варьирует у разных индивидуумов. Термин «эмфизема» относится к расширению воздушных полостей (альвеол), расположенных дистальнее терминальных бронхиол, с разрушением их стенок. Следует отметить, что термин «эмфизема» часто используется в клинике для обозначения медицинского состояния, связанного с такими патологическими изменениями. Некоторые индивидуумы с ХОЗЛ страдают хроническим бронхитом, который определен в клинических терминах как кашель с образованием мокроты часть дней из 3 месяцев в году, в течение 2 последовательных лет. Дополнительную информацию относительно факторов риска, эпидемиологии, патогенеза, диагностики и современных методов ведения пациентов с ХОЗЛ можно найти, например, в руководстве "Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease" («Глобальная стратегия диагностики, ведения пациентов и профилактики при хронической обструктивной болезни легких», обновлялось в 2009 г.), доступном на веб-сайте Global Initiative on Chronic Obstructive Pulmonary Disease, Inc. (GOLD) (www.goldcopd.org), также называемом в настоящем документе "GOLD Report"; руководстве Американского торакального общества / Европейского респираторного общества (American Thoracic Society/European Respiratory Society Guidelines, 2004), доступном на веб-сайте ATS по ссылке: www.thoracic.org/clinical/copd-guidelines/resources/copddoc.pdf, называемом в настоящем документе "ATC/ERS COPD Guidelines"; и стандартных терапевтических руководствах, таких как Cecil Textbook of Medicine (20^th edition), Harrison's Principles of Internal Medicine (17^th edition); и/или стандартных руководствах, посвященных пульмонологии.

[00360] Согласно некоторым вариантам реализации способы, раскрытые в настоящем документе, обеспечивают ингибирование (взаимодействие, разрушение) описанного выше цикла DC-Th17-B-Ab-C-DC. Например, введение ингибитора комплемента может нарушать цикл, в ходе которого комплемент стимулирует ДК-клетки направлять дифференцировку в сторону фенотипа Th17. В результате количество и/или активность Th17-клеток уменьшается, что, в свою очередь, уменьшает степень опосредованной Th17 стимуляции В-клеток и продуцирование поликлональных антител. Согласно некоторым вариантам реализации указанные эффекты приводят к «перезагрузке» иммунологического микроокружения со сдвигом в сторону более нормального, менее патологического состояния. Согласно описанию в примере 1 данные, подтверждающие возможность пролонгированного ингибирующего эффекта ингибирования комплемента на связанный с Th17 синтез цитокинов, получали в модели астмы на животных.

[00361] Согласно некоторым вариантам реализации ингибирование цикла DC-Th17-B-Ab-C-DC оказывает модифицирующий заболевание эффект. Без привязки к конкретной теории ингибирование цикла DC-Th17-B-Ab-C-DC может не просто лечить симптомы расстройства, но взаимодействовать с фундаментальными патологическими механизмами, которые могут вносить вклад в продолжающееся повреждение ткани, даже в тех случаях, когда симптомы находятся под достаточным контролем, и/или которые могут вносить вклад в обострения заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирование цикла DC-Th17-B-Ab-C-DC приводит к ремиссии хронического расстройства. Согласно некоторым вариантам реализации ремиссия относится к состоянию отсутствия или отсутствия по существу болезненной активности у субъекта с хроническим расстройством, при наличии вероятности рецидива заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации ремиссия может поддерживаться на протяжении продолжительного периода времени (например, по меньшей мере 6 месяцев, например, 6-12 месяцев, 12-24 месяца или более) в отсутствие дальнейшей терапии, или при использовании уменьшенной дозы или увеличенного интервала дозирования. Согласно некоторым аспектам ингибирование комплемента может изменять иммунологическое микроокружение ткани, богатой Th17-клетками и преобразовывать ее в микроокружение, богатое регуляторными Т-клетками (Treg). Это может позволить иммунной системе «перезагрузиться» и войти в состояние ремиссии. Согласно некоторым вариантам реализации ремиссия, например, может поддерживаться до наступления триггерного события. Триггерное событие может представлять собой, например, инфекцию (которая может приводить к продуцированию поликлональных антител, вступающих в реакцию как с инфекционным агентом, так и с собственным белком), воздействие конкретных условий окружающей среды (например, высоких уровней примесей в воздухе, таких как озон, или конкретное вещество, или компоненты дыма, например, сигаретного дыма, аллергенов) и т.п. Роль могут играть генетические факторы. Например, у индивидуумов, у которых имеются конкретные аллели генов, кодирующих компоненты комплемента, может наблюдаться более высокий исходный уровень активности комплемента, более реактивная система комплемента и/или более низкий исходный уровень активности эндогенных регуляторных белков комплемента. Согласно некоторым вариантам реализации индивидуум имеет генотип, связанный с повышенным риском ВМД. Например, у указанного субъекта может иметься полиморфизм в гене, кодирующем белок комплемента или регуляторный белок комплемента, например, CFH, С3, фактор В, при этом указанный полиморфизм связан с повышенным риском ВМД.

[00362] Согласно некоторым вариантам реализации иммунологическое микроокружение может начать прогрессировать в направлении патологического состояния с течением времени, например, у субъекта, у которого еще не развились симптомы хронического расстройства, или у субъекта, у которого развилось указанное расстройство и который получал лечение согласно описанию в настоящем документе. Такой переход может происходить стохастически (например, быть обусловлен, по меньшей мере частично, предположительно случайными флуктуациями уровней и/или аффинности антител) и/или в результате аккумуляции «подпороговых» триггерных событий, не обладающих достаточной интенсивностью для запуска симптоматической вспышки расстройства.

[00363] Согласно некоторым вариантам реализации предполагается, что относительно короткий курс аналога компстатина длительного действия, например, от 1 недели до 6 недель, например, примерно 2-4 недели, может обеспечивать длительный благоприятный эффект. Согласно некоторым вариантам реализации обеспечивается ремиссия на протяжении продолжительного периода времени, например, 1-3 месяца, 3-6 месяцев, 6-12 месяцев, 12-24 месяца или более. Согласно некоторым вариантам реализации у субъекта может проводиться мониторинг и/или профилактическое лечение до возвращения симптомов. Например, субъект может получать лечение до или во время воздействия триггерного события. Согласно некоторым вариантам реализации у субъекта может проводиться мониторинг, например, мониторинг повышения уровня биомаркера, например, биомаркера, содержащего индикатор Th17-клеток или Th17-клеточной активности, или активации комплемента, и субъект может получать лечение при повышении уровня такого биомаркера. См., например, более подробное описание в PCT/US2012/043845.

[00364] IX. Композиции и введение

[00365] В настоящем изобретении предложены разнообразные композиции, содержащие клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно различным вариантам реализации композиция может обладать любым свойством или комбинацией свойств, описанных в настоящей заявке, при условии, что они не являются взаимоисключающими. В настоящем изобретении предложены варианты реализации таких композиций и способы их применения, отличающиеся тем, что указанный аналог компстатина представляет собой любой аналог компстатина.

[00366] Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит очищенный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Очистка может осуществляться с применением разнообразных способов, которые специалист в данной области техники может выбрать, опираясь на требуемую степень чистоты различных компонентов, присутствующих в указанной композиции перед очисткой. Например, может применяться фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография, аффинная хроматография и/или другие способы и их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивных аналогов компстатина длительного действия или нацеленного действия в процентах от общей массы аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия в процентах от общего количества аналога компстатина в пересчете на моли. Согласно некоторым вариантам реализации композиция состоит или по существу состоит из клеточно-реактивного аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия.

[00367] Согласно некоторым вариантам реализации композиция, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина, и соединение, содержащее клеточно-реактивную функциональную группу, характеризуются тем, что отношение клеточно-реактивного аналога компстатина к соединению, содержащему клеточно-реактивную функциональную группу, в пересчете на моли составляет по меньшей мере 10:1, 20:1, 50:1, 100:1, 500:1, 1,000:1 или более. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина в процентах от общей массы аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина в процентах от общего количества аналога компстатина в пересчете на моли. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина по массе. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более аналога компстатина длительного действия по массе. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более аналога компстатина нацеленного действия по массе. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более аналога компстатина нацеленного действия по массе. Согласно некоторым вариантам реализации масса представляет собой сухую массу.

[00368] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Указанной композиции фармацевтического класса согласно различным вариантам реализации может быть свойственна любая из вышеперечисленных характеристик в отношении чистоты. Указанная композиция фармацевтического класса в достаточной степени свободна от эндотоксинов, тяжелых металлов и неидентифицированных и/или неохарактеризованных веществ, чтобы быть приемлемой, без дополнительной очистки, для применения в качестве фармацевтической композиции, подходящей для введения субъекту-человеку или для получения фармацевтической композиции для введения субъекту-человеку. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция фармацевтического класса является стерильной.

[00369] Подходящие составы, например, по существу чистые составы клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или аналога компстатина нацеленного действия или другого активного агента, могут быть скомбинированы с фармацевтически приемлемыми носителями или основами и т.п.для получения подходящей фармацевтической композиции. Термин «фармацевтически приемлемый носитель или основа» относится к нетоксичному носителю или основе, не устраняющему фармакологическую активность указанного соединения, вместе с которым он входит в состав. Специалисту в данной области техники будет понятно, что носитель или основа «нетоксичен/нетоксична», если он совместимс введением субъекту в количестве, подходящем для доставки соединения, без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые носители или носители, которые могут применяться в композициях согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены перечисленными, воду, физиологический солевой раствор, раствор Рингера, раствор ацетата натрия или ацетата калия, 5% декстрозу и т.п. Указанная композиция может включать другие компоненты, подходящие для нужного состава, например, соответствующие описанию в настоящей заявке. Дополнительные активные соединения, например, соединения, независимо подходящие для лечения субъекта, страдающего от комплемент-опосредованного расстройства, могут также быть включены в указанные композиции. В настоящем изобретении предложены такие фармацевтические композиции, содержащие клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия и, необязательно, второй активный агент, подходящий для лечения субъекта, страдающего от комплемент-опосредованного расстройства.

[00370] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтически приемлемая композиция, подходящая для введения человеку, упаковка которой содержит этикетку, утвержденную государственным агентством, ответственным за контроль фармацевтических агентов, например, Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (FDA). Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен фармацевтический набор или упаковка, содержащий: (а) фармацевтически приемлемый клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия в твердой форме; (b) фармацевтически приемлемый носитель или основу. Указанный набор или упаковка необязательно содержит инструкции относительно растворения в носителе клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно некоторым вариантам реализации предложен фармацевтический набор или упаковка. Указанная упаковка или набор содержит количество фармацевтической композиции, достаточное по меньшей мере для однократного дозирования, например, содержит от 1 до 200 доз, либо любое промежуточное количество или субдиапазон доз. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая упаковка или набор содержит одну или большее количество игл и, необязательно, один или большее количество шприцев. Согласно некоторым вариантам реализации предложен по меньшей мере один предварительно заправленный шприц. Согласно некоторым вариантам реализации предложена(ы) одна или большее количество единичных лекарственных форм или заранее отмеренных аликвот. Согласно некоторым вариантам реализации предложены инструкции по введению, которые, согласно некоторым вариантам реализации, включают инструкции для самостоятельного введения, например, путем подкожной инъекции.

[00371] Фармацевтическая композиция может быть введена субъекту любым подходящим путем, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, внутривенно, внутримышечно, подкожно, ингаляционным путем, назально, интратекально, интракраниально, интраартериально, перорально, ректально, трансдермально, внутрикожно, подкожно и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации композицию, содержащую клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, вводят внутривенно. Согласно некоторым вариантам реализации композицию, содержащую клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, вводят интраартериально. Указанная композиция может быть введена местно, либо в сосудистую систему, снабжающую орган или ткань, либо экстраваскулярно поблизости от органа или ткани. Следует понимать, что термин «введение» охватывает непосредственно введение соединения или композиции субъекту, инструктирование третьих лиц для введения соединения или композиции субъекту, назначение или предложение соединения или композиции субъекту (например, для самостоятельного введения), самостоятельное введение и, в соответствующих случаях, другие способы предоставления соединения или композиции субъекту.

[00372] Фармацевтические композиции, подходящие для инъецирования (например, для внутривенного введения) или введения через помпу или катетер, как правило, включают стерильные водные растворы (для водорастворимых композиций) или дисперсии, и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Стерильные растворы могут быть получены введением указанного соединения в нужном количестве в подходящий растворитель, необязательно с одним ингредиентом или с комбинацией ингредиентов, таких как буферы, например, ацетаты, цитраты, лактаты или фосфаты; агенты для коррекции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, глутатион или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; и другие подходящие ингредиенты и т.п., по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Специалистам в данной области техники известны многие физиологически приемлемые соединения, которые могут быть включены в фармацевтическую композицию. Другие подходящие соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза; декстраны; аминокислоты, такие как глицин; полиолы, например, маннит. Указанные соединения могут, например, служить в качестве наполнителей и/или стабилизаторов, например, для порошка, и/или если в процесс получения или хранения входит лиофилизация. Поверхностно-активное(ые) вещество(а), например, Tween-80, Pluronic-F108/F68, дезоксихолевая кислота, фосфатидилхолин и т.п., может(гут) быть включены в композицию, например, для улучшения растворимости или получения микроэмульсии для доставки гидрофобных лекарственных средств. Значение рН при необходимости может быть скорректировано с помощью кислот или оснований, например, соляной кислоты или гидроксида натрия. Состав для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или инфузионные мешки, либо в многодозовые флаконы, изготовленные из стекла или пластика. Предпочтительно растворы для инъекций являются стерильными и не содержат неприемлемых количеств эндотоксина.

[00373] Как правило, дисперсии получают введением активного соединения в стерильную основу, которая содержит основную дисперсионную среду и другие подходящие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций способы получения могут включать вакуумную и сублимационую сушку, позволяющие получить порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный нужный ингредиент, например, из предварительно стерилизованного фильтрацией раствора.

[00374] Согласно определенным вариантам реализации может применяться пероральное введение. Композиции для перорального введения обычно включают инертный разбавитель или съедобный носитель. Для перорального терапевтического введения активное соединение может быть введено в состав со вспомогательными веществами и применяться в форме таблеток, пастилок или капсул, например, желатиновых капсул. В состав композиции могут быть включены фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъювантные материалы. Указанные таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов, либо соединения сходной природы: связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, агент для улучшения распадаемости, такой как альгиновая кислота, Primogel или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или Sterotes; скользящее вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или вкусоароматический агент, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Перорально может быть также введена жидкая композиция. Составы для пероральной доставки могут содержать агенты для повышения стабильности в желудочно-кишечном тракте и/или для усиления абсорбции.

[00375] При введении ингаляционным путем аналог компстатина может быть введен в форме спрей-аэрозоля из емкости под давлением или диспенсера, содержащего подходящее распыляющее вещество, например, газ, такой как углекислый газ. Может применяться дозирующий ингалятор или распылитель. Аэрозоль может содержать жидкие частицы или сухой аэрозоль (например, сухие порошки, крупные пористые частицы и т.п.).

[00376] Для местного нанесения аналог компстатина может быть получен в виде подходящей мази, содержащей активный компонент, суспензированный или растворенный в одном или большем количестве носителей. Носители для местного нанесения включают, но не ограничены перечисленными, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, полиоксипропиленовое соединение, эмульгирующий воск и воду. Как вариант, фармацевтически приемлемые композиции могут быть получены в виде подходящего лосьона или крема, содержащего аналог компстатина, суспензированный или растворенный в одном или большем количестве фармацевтически приемлемых носителей. Подходящие носители включают, но не ограничены перечисленными, минеральное масло, сорбитмоностеарат, полисорбат 60, воск цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду.

[00377] Системное введение может также осуществляться трансмукозально или трансдермально. Для трансмукозального или трансдермального введения в указанном составе могут применяться пенетранты, подходящие для проникновения через такой барьер. Такие пенетранты общеизвестны в данной области техники и включают, например, для трансмукозального введения, поверхностно-активные вещества, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты. Трансмукозальное введение может осуществляться, например, посредством применения назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения, как правило, вводят в состав мазей, бальзамов, гелей или кремов, общеизвестных в данной области техники.

[00378] Указанные соединения могут также быть получены в форме суппозиториев (например, на стандартных основах для суппозиториев, таких как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм для ректальной доставки.

[00379] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина или другое активное соединение вводят в состав с носителями, которые защищают указанное соединение от быстрого выведения из организма, например, в составы с контролируемым высвобождением, такие как имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Например, аналог компстатина может быть включен в состав или инкапсулирован в составе с микрочастицами или наночастицами. Могут применяться биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры, полимеры простых эфиров, полимолочная кислота, ПМГК и т.п. Липосомы или другие частицы на основе липидов могут применяться в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии с известными специалистам в данной области техники способам, например, согласно описанию в патенте США №4522811 и/или других источников, ссылки на которые приведены в настоящей заявке. Могут применяться составы-депо, содержащие аналог компстатина. Указанный аналог компстатина высвобождается из депо на протяжении периода времени, например, таким образом, чтобы обеспечить терапевтическую концентрацию на протяжении более длительного периода времени, чем при внутривенном введении соединения. Согласно некоторым аспектам СКФ придает аналогу компстатина свойства депо. Специалисту в данной области техники будет понятно, что для получения состава с контролируемым высвобождением, имплантата и т.п. необходимо выбирать материалы и способы, позволяющие сохранить активность указанного соединения.

[00380] Следует иметь в виду, что аналог компстатина и/или дополнительный(ые) активный(ые) агент(ы) могут быть представлены в виде фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Примеры подходящих кислых солей включают ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гликолат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Также фармацевтически приемлемые соли могут быть при необходимости получены в виде солей щелочных или щелочноземельных металлов, таких как соли натрия, калия или кальция, в зависимости от свойств активного агента.

[00381] Следует понимать, что упоминаемые в настоящей заявке фармацевтически приемлемые носители, соединения и способы получения приводятся в качестве примеров и являются неограничивающими. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21st Edition. Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005 для ознакомления с дополнительным описанием фармацевтически приемлемых соединений и способов получения фармацевтических композиций различных видов.

[00382] Фармацевтическая композиция может быть введена в количестве, эффективном для достижения требуемого благоприятного эффекта. Согласно некоторым вариантам реализации эффективное количество является достаточным для обеспечения одного или большего количества следующих благоприятных эффектов: (i) уменьшения по меньшей мере одного симптома или признака комплемент-опосредованного расстройства; (ii) повышения качества жизни; (iii) снижения уровня госпитализации; (iv) снижения смертности. Специалисту в данной области техники будет понятно, что конкретный благоприятный эффект будет зависеть по меньшей мере частично от различных факторов, например, от конкретного расстройства, лечение которого проводится. Специалисту в данной области техники известны симптомы и признаки, которые могут наблюдаться у субъектов с комплемент-опосредованными расстройствами. Примеры симптомов и признаков различных расстройств комплемента представлены в настоящем документе. Так, согласно некоторым вариантам реализации, например, если субъект страдает ПНГ или аГУС, благоприятный эффект представляет собой уменьшение комплемент-опосредованного лизиса красных клеток крови. Согласно некоторым аспектам благоприятный эффект является статистически значимым и/или терапевтически значимым по оценке специалиста в данной области техники.

[00383] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию, содержащую клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, вводят парентерально. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят внутривенно. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят посредством внутривенной инъекции. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят в виде в/в болюса или в/в инфузии. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят в виде в/в капельного вливания. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят в виде в/в болюса с последующей в/в инфузией или в/в капельным вливанием. Согласно некоторым вариантам реализации в/в инфузию проводят на протяжении примерно 1, 2, 3, 4, 5, 15, 20, 30, 60 или 120 минут. Согласно некоторым вариантам реализации в/в капельное вливание проводят на протяжении более чем примерно 60 минут, например, на протяжении примерно 1, 2, 3 или более часов. Согласно некоторым вариантам реализации вводят общее количество аналога компстатина, составляющее от примерно 0,1 мг/кг/день до примерно 2000 мг/кг/день, например, от примерно 1 мг/кг/день до примерно 1000 мг/кг/день, например, от примерно 5 мг/кг/день до примерно 500 мг/кг/день. Согласно некоторым вариантам реализации вводят общее количество аналога компстатина, составляющее от примерно 10 мг/кг/день до примерно 100 мг/кг/день, например, от примерно 10 мг/кг/день до примерно 50 мг/кг/день например, от примерно 10 мг/кг/день до примерно 20 мг/кг/день. Согласно некоторым вариантам реализации вводят примерно от 0,5 мг/кг/день до примерно 10 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят примерно от 1 мг/кг/день до примерно 5 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят примерно от 1 мг/кг/день до примерно 3 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят примерно от 3 мг/кг/день до примерно 5 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят примерно от 5 мг/кг/день до примерно 7,5 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят примерно от 7,5 мг/кг/день до примерно 10 мг/кг/день аналога компстатина. Следует иметь в виду, что введение нужного общего суточного количества может осуществляться реализацией разнообразных режимов дозирования. Например, нужное количество аналога компстатина может быть введено при однократном введении или при многократном введении, например, в течение 24-часового периода. Например, субъект может получать две или большее количество доз на протяжении 24-часового периода, и указанные дозы могут быть введены за одинаковые периоды времени или за разные периоды времени. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят с интервалами более 24 часов. Например, согласно различным вариантам реализации дозы могут быть введены в среднем через день, каждые 3-4 дней, еженедельно, раз в две недели и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации ковалентно присоединенные аналоги компстатина, аналоги компстатина длительного действия или нацеленного действия защищают клетки, ткани, органы, на протяжении периода недель или месяцев без необходимости повторения лечения. Например, субъекты могут получать поддерживающее повторное лечение с интервалами 1-2 недели, 2-4 недели, 4-6 недель, 6-8 недель или даже реже. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере некоторые дозы вводят подкожно. Например, согласно некоторым вариантам реализации предусматривается введение приблизительно 0,1-5 мг/кг/день, например, примерно 0,5-2 мг/кг/день; например, в объеме, равном приблизительно 0,25 мл - 2 мл, например, в объеме, составляющем примерно 1 мл. Согласно некоторым вариантам реализации концентрация составляет примерно 50 мг/мл - примерно 300 мг/мл, например, примерно 50 мг/мл - примерно 100 мг/мл или примерно 100 мг/мл - примерно 200 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации введение осуществляется ежедневно. Согласно некоторым вариантам реализации введение осуществляют 1 или 2 раза в сутки. Как подробно описано в приведенных ниже примерах, при ежедневном подкожном введении примера аналога компстатина длительного действия легко достигаются уровни в крови, существенно превышающие 5 мкМ. Согласно некоторым вариантам реализации внутримышечное введение используют для доставки аналогичных количеств соединения. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия вводят субъекту, используя терапевтически эффективное количество, при этом такое введение приводит к достижению концентраций указанного соединения в крови, превышающих уровень более чем по меньшей мере 1 мкМ, по меньшей мере 2 мкМ, по меньшей мере 2.5 мкМ, по меньшей мере 3 мкМ, по меньшей мере 4 мкМ, по меньшей мере 5 мкМ, по меньшей мере 6 мкМ, по меньшей мере 7 мкМ, по меньшей мере 8 мкМ, по меньшей мере 9 мкМ, по меньшей мере 10 мкМ, по меньшей мере 11 мкМ, по меньшей мере 12 мкМ, или по меньшей мере 13 мкМ, по меньшей мере 14 мкМ, по меньшей мере 15 мкМ, по меньшей мере 16 мкМ, по меньшей мере 18 мкМ, или по меньшей мере примерно 20 мкМ, или по меньшей мере примерно 25 мкМ, или уровень, находящийся в пределах любого диапазона от 4 мкМ до примерно 15 мкМ, или примерно 20 мкМ, или примерно 25 мкМ. Согласно некоторым вариантам реализации такой уровень сохраняется на протяжении по меньшей мере примерно 24 часов, или по меньшей мере примерно 48 часов, или по меньшей мере примерно 72 часов, или по меньшей мере примерно 96 часов, или по меньшей мере примерно 120 часов, или по меньшей мере примерно 144 часов после однократной в/в/инъекции или после ежедневных подкожных инъекций на протяжении примерно 5-7 дней. При пролонгированном усвоении уровни могут поддерживаться в течение более длительного периода, например, до примерно 10 дней, 12 дней, 14 дней или более. Согласно некоторым вариантам реализации субъект получает такое лечение, чтобы поддерживать равновесный уровень, составляющий примерно 1,0 мкМ, примерно 2,0 мкМ, примерно 2,5 мкМ, примерно 3,0 мкМ, примерно 3,5 мкМ, примерно 4,0 мкМ, примерно 4,5 мкМ, примерно 5,0 мкМ, примерно 5,5 мкМ, примерно 6,0 мкМ, примерно 6,5 мкМ, примерно 7,0 мкМ, примерно 7,5 мкМ, примерно 8,0 мкМ, примерно 8,5 мкМ, примерно 9,0 мкМ, примерно 9,5 мкМ или примерно 10 мкМ. Согласно некоторым вариантам реализации равновесный уровень составляет примерно от 1,0 мкМ до примерно 10,0 мкМ, например, примерно от 2,0 мкМ до примерно 5,0 мкМ, примерно от 2,5 мкМ до примерно 5,0 мкМ, примерно от 5,0 мкМ до примерно 7,5 мкМ, или примерно от 7,5 мкМ до примерно 10 мкМ, или принимает любое промежуточное значение в пределах любого из вышеуказанных диапазонов. Согласно некоторым вариантам реализации концентрация является достаточной для ингибирования по существу лизиса красных клеток крови пациентов с ПНГ, на которые воздействовали сывороткой человека in vitro, например, с применением модифицированного анализа Хэма с сывороткой человека (см., например, пример 8). Согласно некоторым вариантам реализации концентрация является достаточной для уменьшения по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более лизиса красных клеток крови пациентов с ПНГ, на которые воздействовали сывороткой человека in vitro, например, с применением модифицированного анализа Хэма с сывороткой человека (см., например, пример 8). Согласно некоторым вариантам реализации анализ Хэма может проводиться с сывороткой человека, уровень магния в которой доведен примерно до 0,005 моль/л и рН понижен до примерно 6,2 для активации комплемента. В примерах 18 и 19 приведены данные, подтверждающие способность аналогов компстатина, описанных в настоящем документе, ингибировать лизис кКК от пациентов с ПНГ.

[00384] Согласно некоторым аспектам аналоги компстатина, например, аналоги компстатина длительного действия, могут защищать красные клетки крови пациентов с ПНГ от аккумуляции на поверхности значительных количеств С3 и/или продуктов активации С3. Так, пораженные ПНГ красные клетки крови, которые защищены от комплемент-опосредованного лизиса аналогами компстатина, например, аналогами компстатина длительного действия, могут также быть защищены от аккумуляции на поверхности значительных количеств С3 и/или продуктов активации С3. Как известно в данной области техники, экулизумаб (Soliris®, Alexion Pharmaceuticals. Inc.), представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против С5, одобренное для лечения ПНГ и аГУС в ряде стран (см., например, Dmytrijuk A, FDA report: eculizumab (Soliris) for the treatment of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Oncologist. 2008 Sep; 13(9): 993-1000. doi: 10.1634/theoncologist.2008-0086. Epub 2008 Sep 10; Westra D., A new era in the diagnosis and treatment of atypical haemolytic uraemic syndrome. Neth J Med. 2012 Apr; 70(3): 121-9). Сообщалось, что при воздействии экулизумабом на пораженные ПНГ кКК, на поверхности указанных клеток может наблюдаться аккумуляция значительных количеств С3 и/или продуктов активации С3, что может вносить вклад в их выведение и/или экстраваскулярный гемолиз (например, в селезенке), и, соответственно, может по меньшей мере частично обуславливать персистирующие гематологические аномалии, например, персистирующую анемию, которая наблюдается у некоторых пациентов с ПНГ, несмотря на лечение экулизумабом. Без привязки к конкретной теории, это может происходить из-за ингибирования образования МАК экулизумабом, защищающим клетки от опосредованного МАК лизиса, но не ингибирующего активацию С3 или отложение С3 и/или продуктов активации С3, и оставляющего пораженные ПНГ клетки уязвимыми для поверхностной активации С3 и отложения С3 и/или продуктов активации С3 ввиду отсутствия ГФИ-заякоренных комплемент-ингибирующих белков. Без привязки к конкретной теории, способность аналогов компстатина, описанных в настоящем документе, ингибировать активацию С3 и таким образом ингибировать продуцирование продуктов активации С3, может обеспечить существенное преимущество. Согласно некоторым вариантам реализации субъект, который получал или получает лечение экулизумабом и у которого продолжают наблюдаться признаки гемолиза, например, клинически значимого гемолиза, например, приводящего к анемии и/или требующего переливания крови, получает лечение аналогом компстатина, описанным в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина используют в концентрации, достаточной для того, чтобы уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали указанным аналогом компстатина (in vitro (например, в анализе Хэма) или in vivo) находился в пределах диапазона, наблюдаемого в нормальных кКК от здоровых субъектов. Согласно некоторым вариантам реализации уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали указанным аналогом компстатина (in vitro (например, в анализе Хэма) или in vivo) отстоит не более чем примерно на 1,2; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; или 5,0 от среднего уровня или верхнего предела нормального уровня. Согласно некоторым вариантам реализации уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали аналогом компстатина (in vitro (например, в анализе Хэма) или in vivo) ниже уровня С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали Soliris в концентрации, обеспечивающей эквивалентную защиту против комплемент-опосредованного лизиса. Согласно некоторым вариантам реализации уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК на которые воздействовали аналог компстатина (in vitro или in vivo) не превышает примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, или 50% от уровня С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали экулизумабом в концентрации, обеспечивающей эквивалентную защиту против комплемент-опосредованного лизиса. Согласно некоторым вариантам реализации уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали указанным аналогом компстатина (in vitro или in vivo) отстоит не более чем примерно на 1,2; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; или 5,0 от среднего уровня или верхнего предела нормального диапазона. Согласно некоторым вариантам реализации пораженные ПНГ клетки содержат или состоят из пораженных ПНГ клеток II типа, пораженных ПНГ клеток III типа или их сочетания. Согласно некоторым вариантам реализации указанные кКК состоят по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более из клеток III типа и/или II типа. Согласно некоторым вариантам реализации указанные клетки могут содержать некоторое количество клеток I типа. Согласно некоторым вариантам реализации кКК могут быть классифицированы как клетки I, II или III типа на основании уровня на поверхности ГФИ-заякоренного белка, такого как CD59, который может быть измерен с применением проточной цитометрии, иммунофлуоресценции или ИФА ELISA, например, с применением антитела (например, моноклонального антитела) или другого связывающего агента, который связывает указанный ГФИ-заякоренный белок. Согласно некоторым аспектам ингибирование отложения С3 и/или продуктов активации С3 на клетках или поверхностях может применяться в качестве индикатора эффективности аналога компстатина при других комплемент-опосредованных заболеваниях, таких как аГУС, других комплемент-опосредованных гемолитических заболеваниях или других комплемент-опосредованных заболеваниях. Например, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина ингибирует такое отложение на эндотелиальных клетках у субъекта с аГУС. Согласно некоторым вариантам реализации указанный уровень С3 и/или продукта(ов) активации С3 может быть измерен с применением проточной цитометрии, иммунофлуоресценции или ИФА ELISA, например, с применением антитела (например, моноклонального антитела) или другого связывающего агента, который связывает С3 и/или один или большее количество продуктов активации С3. Согласно некоторым вариантам реализации продукт активации С3 представляет собой C3b, С3с или C3d. Согласно некоторым вариантам реализации связывающий агент связывает C3d. Согласно некоторым вариантам реализации связывающий агент связывает C3d и по меньшей мере один другой продукт активации С3. Согласно некоторым вариантам реализации кКК от пациента с ПНГ, приведенные в контакт с аналогом компстатина in vitro (например, в анализе Хэма), защищены от активированного комплемента таким образом, что относительное содержание (процент) клеток I и II типа, и клеток III типа или относительное содержание или процент клеток III и I; II и I; или III и II типа приблизительно соответствуют полученным в контрольном анализе при применении инактивированного комплемента (например, термоинактивированного комплемента). Согласно некоторым вариантам реализации кКК от пациента с ПНГ, приведенные в контакт с аналогом компстатина in vitro (например, в анализе Хэма), защищены от активированного комплемента таким образом, что относительное содержание или процент клеток I и II типа, и клеток III типа, или относительное содержание или процент клеток III и I; II и I; или III и II типа отличаются не более чем на 5% от содержания или процента, полученного в контрольном анализе при применении инактивированного комплемента (например, термоинактивированного комплемента) используют. Согласно некоторым вариантам реализации комплемент может быть инактивирован термической обработкой, которая может быть реализована путем нагревания компонентов комплемента, или сыворотки или плазмы, содержащей компоненты комплемента до 56°С или более.

[00385] Согласно некоторым вариантам реализации для определения уровня лизиса может дополнительно или альтернативно применяться измерение ЛДГ (фермента, в значительных количествах присутствующего в красных клетках крови, который может служить маркером гемолиза), измерение одного или большего количества гематологических показателей, например, измерение гематокрита, уровня гемоглобина, подсчет ретикулоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации один или большее количество таких способов может применяться для определения уровня лизиса кКК, например, кКК, чувствительных к комплемент-опосредованному лизису, например, клеток от пациентов с ПНГ, клеток от пациентов с аГУС, клеток от субъектов с другими комплемент-опосредованными гематологическими расстройствами, клеток, подвергающихся воздействию аномально высоких уровней активированного комплемента. Согласно некоторым аспектам в настоящем описании предложен способ, включающий приведение одной или большего количества клеток в контакт in vitro или in vivo с аналогом компстатина, описанным в настоящем документе, и измерение эффекта указанного аналога компстатина на один или большее количество индикаторов комплемент-опосредованного повреждения клеток и/или активации или отложения комплемента на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанный контакт одной или большего количества клеток на протяжении достаточного периода времени при достаточной концентрации приводит к уменьшению аномально высокого значения или увеличению аномально низкого значения до значений, находящихся в пределах нормального диапазона или до значений, отстоящих не более чем на 5%, 10%, 15%, 20%, или 25% от нижнего или верхнего предела нормального диапазона.

[00386] Согласно некоторым аспектам в настоящем описании предложен способ выбора или модификации режима дозирования или одного или большего количества компонентов режима дозирования для пациента с комплемент-опосредованным гемолитическим заболеванием, таким как ПНГ. Указанные один или большее количество компонентов режима дозирования могут включать дозу, интервал дозирования, способ введения (например, в/в или подкожный) или их комбинацию. Доза может представлять собой нагрузочную дозу, поддерживающую дозу, или и то, и другое. Согласно некоторым вариантам реализации от пациента могут быть получены один или большее количество образцов крови, и режим дозирования аналога компстатина, например, аналога компстатина длительного действия, или его компонент может быть выбран или модифицирован таким образом, чтобы обеспечивать достижение нужного уровня защиты кКК пациента от лизиса и/или от аккумуляции С3 и/или продукта(ов) активации С3 in vitro. Согласно некоторым вариантам реализации пациенту могут быть введены одна или большее количество доз аналога компстатина, например, аналога компстатина длительного действия, а затем от пациента могут быть получены один или большее количество образцов крови и проведена их оценка на уровень С3 и/или продукта(ов) активации С3 на поверхности. Согласно некоторым вариантам реализации режим дозирования или его компонент, например, доза, интервал дозирования или способ введения, может быть выбран или модифицирован таким образом, чтобы обеспечивать достижение нужного уровня защиты кКК пациента от лизиса и/или от аккумуляции С3 и/или продуктов активации С3 in vitro или in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации режим дозирования или его компонент, например, доза, интервал дозирования или способ введения, может быть выбран или модифицирован таким образом, чтобы обеспечивать достижение нужного уровня защиты кКК пациента от экстраваскулярного выведения и/или экстраваскулярного лизиса in vivo. Нужный уровень может быть, например, представлен уровнем, принятым в данной области техники как обеспечивающий клинически значимый благоприятный эффект, уровнем, обеспечивающим клинически значимый благоприятный эффект у конкретного пациента, уровнем в пределах нормального диапазона, уровнем, выбранным медицинским специалистом, или любым другим выбранным уровнем. Нормальный диапазон для параметра может быть известен в данной области техники и/или может представлять собой референсный диапазон, установленный лабораторией, например, клинической лабораторией, при этом указанное значение релевантного параметра при измерении по меньшей мере у 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% общей популяции или по меньшей мере у 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% здоровых индивидуумов (необязательно при совпадающих одной или нескольких демографических переменных, таких как пол, возраст и т.п.) или полученных от них биологических образцах (таких как образцы крови) находится в пределах указанного референсного диапазона. Референсный диапазон может быть установлен с применением популяции образцов, репрезентативной для общей популяции или репрезентативной для здоровых индивидуумов.

[00387] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия, содержащий СКФ, сконструирован таким образом, чтобы обеспечивать более медленную системную абсорбцию после подкожного или внутримышечного введения субъекту по сравнению с аналогом компстатина, не содержащим СКФ. Согласно некоторым вариантам реализации конкретные свойства СКФ, например, длина, выбирают таким образом, чтобы обеспечивать нужную скорость системной абсорбции после подкожного или внутримышечного введения по сравнению по меньшей мере с некоторыми другими СКФ. Согласно некоторым вариантам реализации Cmax понижена по сравнению с сопоставимой дозой аналога компстатина, не связанного с СКФ, что, таким образом, может вносить вклад в поддержание концентрации указанного соединения в плазме в пределах нужного окна концентраций, например, терапевтического окна. Согласно некоторым вариантам реализации композиция с аналогом компстатина длительного действия характеризуется тем, что доза при введении подкожно полностью абсорбируется в пределах примерно 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 15, 30, 45, 60, 90 или 120 часов после введения по оценке на основании визуального осмотра участка инъекции.

[00388] Следует понимать, что может присутствовать начальная стадия лечения, на протяжении которой лечение проводят чаще и/или вводят более высокие дозы.. Например, субъекту с ПНГ или аГУС может потребоваться введение нескольких доз для обеспечения защиты существенной части кКК указанного субъекта. После этого могут быть введены более низкие дозы и/или дозирование может быть менее частым, например, для защиты вновь образующихся кКК и/или для поддержания защиты существующих кКК. Разумеется, сходные методы могут в подходящих случаях применяться для лечения любого заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации лечение начинают с в/в введения, а затем переходят к подкожному, внутримышечному или внутрикожному введению для поддерживающей терапии. В зависимости от заболевания лечение может продолжаться с интервалами, например, на протяжении месяцев, лет или неограниченного периода времени. Подходящие дозы и режим дозирования зависят по меньшей мере частично от эффективности и времени полужизни указанного аналога компстатина (или другого активного агента), и могут необязательно корректироваться для конкретного реципиента, например, посредством введения повышающихся доз до достижения нужного заранее известного отклика, например, требуемой степени ингибирования комплемента и/или защиты клеток. При необходимости, конкретный уровень дозы для любого конкретного субъекта может быть по крайней мере отчасти выбран на основании разнообразных факторов, включающих активность конкретного используемого соединения, конкретное состояние, лечение которого проводится, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, маршрут введения, скорость выведения, комбинирование с любым лекарственным средством и/или выраженность экспрессии или активности белка комплемента, измеренная в одном или большем количестве образцов, полученных от указанного субъекта.

[00389] Настоящее изобретение охватывает введение аналога компстатина в комбинации с дополнительной терапией. Такая дополнительная терапия может включать введение любого(ых) агента(ов) из используемых данной области техники или потенциально подходящих для лечения субъекта, страдающего от указанного заболевания.

[00390] Если два или большее количество терапевтических средств (например, соединений или композиций) применяют или вводят «в комбинации» друг с другом, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения они могут быть введены в одно время, на протяжении частично совпадающих периодов времени или последовательно (например, могут быть разделены во времени периодом протяженностью до 2 недель). Они могут быть введены одним и тем же путем либо разными путями. Согласно некоторым вариантам реализации указанные соединения или композиции вводят с интервалом не более 48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина может быть введен до или после введения дополнительного(ых) соединения(ий), например, достаточно близко во времени, так что указанный аналог компстатина и дополнительное(ые) соединение(ия) присутствует(ют) в подходящих количествах в организме по меньшей мере однажды. Согласно некоторым вариантам реализации указанные соединения или композиции вводят достаточно близко во времени, так что не более чем 90% ранее введенной композиции метаболизируется до неактивных метаболитов или устраняется, например, выведением из организма, к моменту введения второго соединения или композиции.

[00391] Согласно некоторым вариантам реализации вводят композицию, включающую и клеточно-реактивный аналог компстатина, и дополнительные соединение(ия).

[00392] Пример 1: Получение пегилированных аналогов компстатина, по существу сохраняющих комплемент-ингибирующую активность

[00393] Синтезировали аналог компстатина с последовательностью аминокислот аналога компстатина SEQ ID NO: 28, но содержащий фрагмент AEEAc-Lys, расположенный в направлении С-конца от остатка Thr последовательности SEQ ID NO: 28 для последующего конъюгирования активированным сложным NHS-эфиром ПЭГ с аминогруппой боковой цепи Lys. Указанное соединение синтезировали с применением стандартных способов. Вкратце, аминокислоты (включая АЕЕАс) получали в виде Fmoc-защищенных аминокислот, отличающихся тем, что α-аминогруппу каждой аминокислоты защищают с помощью Fmoc. Функциональные группы боковых цепей также блокировали различными подходящими защитными группами. Синтез осуществляли твердофазным методом, описанным у Merrifield (J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)). Цепи собирали на твердой фазе, по завершении которой N-конец ацетилировали; затем пептид отщепляли от твердой фазы, одновременно снимали защиту ацидолизом с применением TFA, и амидировали. Линейный пептид затем окисляли и очищали. Полученный аналог компстатина представлен следующим: Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 51), сокращенно CA28-AEEAc-Lys. Отметим, что для краткости N-концевая ацетильная группа и С-концевые аминогруппы в аббревиатуре не указаны. Монофункциональный линейный активированный сложный NHS-эфир ПЭГ с молекулярными массами 30 кДа и 40 кДа (NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк, кат. № SUNBRIGHT® ME-300GS и кат. № SUNBRIGHT® МЕ-400GS), соответственно, соединяли с боковыми цепями лизина CA28-AEEAc-Lys с получением следующих аналогов компстатина длительного действия: СА28-АЕЕАс-Lys-(ПЭГ30k) и CA28-AEEAc-Lys-(PEG40K), и очищали. Отметим, что число после термина «ПЭГ» и перед буквой «k» представляет собой молекулярную массу указанного фрагмент ПЭГ в килодальтонах, и «k» представляет собой сокращение от «кДа»). CA28-AEEAc-Lys-(ПЭГ30k) также называют СА28-1. CA28-AEEAc-Lys-(PEG40K) также называют СА28-2.

[00394] Ингибирующую активность синтезированных соединений оценивали посредством изменения эффекта указанных соединений на активацию комплемента классическим путем с применением стандартного анализа ингибирования комплемента. В указанном протоколе измеряют отложение C3b в формате ELISA. Отложение C3b, мониторинг которого проводят указанным способом, опосредовано активированным классическим путем комплементом. Вкратце, 96-луночные планшеты покрывают БСА. Добавляют плазму человека, куриный овальбумин (OVA), поликлональные анти-OVA антитела и тестируемое соединение (называемое «лекарственным средством»), инкубируют, а затем добавляют чР-конъюгированное антитело против С3 человека. После дополнительного инкубирования добавляют субстрат и регистрируют сигнал. Детальная информация о протоколе приведена ниже:

[00395] Протокол анализа ингибирования классического пути комплемента

Материалы:

• 96-луночный планшет (полистироловый планшет, Thermo Scientific, 9205)

• Куриный овальбумин (Sigma A5503-5G)

• Антитело кролика против куриного овальбумина (Abcam ab1221)

• Блокирующий буфер (буфер Startingblock, Thermo Scientific 37538)

• Вероналовый буфер (концентрация 5Х, Lonza 12-624Е)

• Плазма человека (собранная с добавлением лепирудина с конечной концентрацией 50 мкг/мл)

• HRP-конъюгированное козье антитело против С3 человека, (MP Biomedicals, 55237)

• Отмывочный буфер Tween-20 (0,05% Tween 20-ФСБ буфер)

• ТМБ (Субстрат пероксидазы, BD 555214) - 1:1 смесь BD 51-2607KC и 51-2606KC.

• 1M H₂SO₄

Протокол:

1. Добавить 100 мкл/лунку 1% куриного овальбумина (в ФСБ)

2. Инкубировать в течение ночи при 4°С или комнатной температуре в течение 1-2 ч.

3. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету.

4. Блокировать добавлением 200 мкл блокирующего буфера

5. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре

6. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету

7. Добавить 100 мкл поликлонального антитела против куриного овальбумина в разведении 1:1000 в блокирующем буфере

8. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре

9. Дважды промыть отмывочным буфером

10. Добавить по 50 мкл VB⁺⁺ в лунки №2-12

11. Добавить 100 мкл лекарственного средства в начальном разведении (2Х в VB⁺⁺) в лунку 1.

12. Приготовить серийные разведения (1:2) указанного лекарственного средства из лунок 1-10 следующим образом:

a. Взять 50 мкл раствора из исходной лунки

b. Добавить указанный раствор в следующую лунку

c. Перемешать многократным пипетированием

d. Повторять до лунки №10

Примечание: из лунки №10 удалить 50 мкл и утилизировать.

13. Добавить 50 мкл плазмы в разведении 2Х (разведение 1:37,5 исходной плазмы) в лунки 1-11

14. Инкубировать в течение 1 часа

15. Промыть отмывочным буфером

16. Добавить 100 мкл чР-антитела против С3 в разведении 1/1000 в блокирующем буфере

17. Инкубировать в течение 1 часа

18. Промыть отмывочным буфером

19. Добавить по 100 мкл ТМБ во все лунки

20. Инкубировать в течение 5-10 мин в темноте

21. Добавить 50 мкл 1М H₂SO₄

22. Произвести считывание планшета на 450 нм

VB⁺⁺

Формула:

Барбитал 5 мМ NaCl 72,5 мМ MgCl₂ 10 мМ CaCl₂ 0,15 мМ рН 7,4

Исходные растворы:

Для получения 50 мл рабочего буфера:

• Взвесить 210 мг NaCl

• Добавить 10 мл 5X VB

• Добавить 100 мкл CaCl₂ (500Х)

• Добавить 250 мкл MgCl (200Х)

• Довести объем до 50 мл добавлением H₂O

• Довести рН до 7,4

[00396] Данные анализировали с применением программного обеспечения GraphPad Prism5. Наборы данных для каждого эксперимента нормализовали по проценту активации по сравнению с контролем со 100% активацией, соответствующим лунке, в которую не добавляют соединение. Значения концентраций лекарственного средства (значения X) логарифмически преобразовывали, и процент активации (Pa) (Y значения) переводили в процент подавления (Pi), используя следующую формулу: Pi=100-Pa (Yi=100-Ya). Строили график зависимости процента подавления от концентрации лекарственного средства; для аппроксимации полученного набора данных использовали сигмоидальную функцию зависимости доза-ответ [Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10((Log ЕС-Х)))]. Значения IC₅₀ получали, используя параметры аппроксимирующей функции.

[00397] Результаты приведены на Фиг. 1, значения IC₅₀ приведены в таблице 2 (в примере 2). Согласно приведенным данным, СА28-1 и СА28-2 проявляли активность, составляющую примерно 30% от активности СА28 в пересчете на моли.

[00398] Пример 2: Получение аналогов компстатина длительного действия, демонстрирующих повышенную молярную активность

[00399] ПЭГ с активированным сложным NHS-эфиром с 8 ответвлениями молекулярной массой 40 кДа (NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк, кат. № SUNBRIGHT® HGEO-400GS; химическая формула: гексаглицерин окта(сукцинимидилоксиглутарил) полиоксиэтилен) присоединяли к боковой цепи лизина CA28-AEEAc-Lys с получением следующего аналога компстатина длительного действия: (CA28-AEEAc)₈-PEG40K, также называемого СА28-3.

Комплемент-подавляющую активность СА28-3 исследовали с применением описанного в примере 1 анализа. Результаты приведены на графике на Фиг. 1, а значение IC50 приведено в таблице 2, и то, и другое - как функция от концентрации СА28. Концентрацию СА28 рассчитывали с применением коэффициента экстинкции СА28 на 283 нм (10208,14 л⋅моль^-1⋅см^-1). На основании другого анализа (поглощение УФ в зависимости от массы материала, и элементного CHN-анализа) было сделано заключение, что на молекулу СА28-3 приходится 7,5 фрагмента СА28. Таким образом, активность СА28-3 в пересчете на моли в 7,5 раз выше показанной на Фиг. 1 и приведенной в таблице 2. Таким образом, значение IC50 в таблице 2 в 7,5 раз выше реального значения IC50 СА28-3 в пересчете на моли. При подсчете значение IC50 СА28-3 в пересчете на моли составляет примерно 0,26 (меньше, чем у исходного соединения СА28). На Фиг. 2 представлен процент подавляющей активацию комплемента активности СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-2 и СА28-3, как функция от концентрации СА28-3 (мкМ), т.е. активность СА28-3 была скорректирована с учетом того, что указанное соединение включает 7,5 фрагментов СА28. В пересчете на моли комплемент-подавляющая активность СА28-3 выше, чем у СА28.

[00400] Растворимость СА28-1, CD28-2 и СА28-3 в воде в присутствии или в отсутствие разнообразных буферных веществ и/или вспомогательных веществ была, согласно наблюдениям, выше растворимости исходного соединения СА28.

[00401] Пример 3: Аналоги компстатина длительного действия, демонстрирующие существенное увеличение времени полужизни в плазме и Cmax

[00402] В данном примере описывается определение параметров фармакокинетики аналогов компстатина длительного действия СА28-2 и СА28-3 после введения яванским макакам.

[00403] Дозирование и получение образцов

[00404] СА28-2 и СА28-3 вводили в момент времени 0 посредством внутривенной инъекций самкам яванского макака (три на группу, возраст 2-5 лет, 2,9-3,5 кг). Соединения вводили в количестве 50 мг/кг в 5% растворе декстрозы в воде в концентрации 25 мг/мл. Образцы крови (объемом ~1 мл каждый) собирали из бедренной вены в следующие моменты времени: до дозирования, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час (ч), 4 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч, 96 ч (4 дня) и 192 ч (8 дней) после дозирования. Образцы собирали посредством прямой венепункции, помещали в пробирку для сыворотки с красной крышкой, не содержащую антикоагулянта, и выдерживали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут. Образцы крови центрифугировали при температуре 4°С на 3000×g в течение 5 минут. На протяжении всего процесса обработки образцы поддерживали в охлажденном состоянии. Образцы сыворотки собирали после центрифугирования и помещали в пробирки для образцов. Образцы хранили в морозильной камере, настроенной на поддержание температур от -60°С до -80°С. Все животные демонстрировали нормальную активность на протяжении всего исследования. У животных не было отмечено связанных с соединением нарушений на протяжении исследования.

[00405] Анализ образцов. Образцы плазмы, полученные согласно приведенному выше описанию, анализировали с помощью ЖХ/МС/МС с применением следующих способов определения концентрации соединения: 50 мкл образца смешивали с внутренним стандартом (CA28-AEEAc-Arg), затем добавляли 100 мкл 1М NH₄OAc, рН 3,5 с НОАс и перемешивали. Затем добавляли 250 мкл ацетонитрила и перемешивали. Образец центрифугировали, супернатант переливали в другую пробирку и высушивали. Образец повторно растворяли и инжектировали в систему ЖХ/МС/МС. Подвижная фаза А была представлена 5 мМ NH₄OAc с 0,1% FA, Подвижная фаза В была представлена (ACN : 50 мМ NH₄OAc) в пропорции 90:10 с 0,1% FA. Использовали ЖХ колонку Intrada WP-RP 2×150 мм, 3 мкм. Количественное определение проводили на тройном квадрупольном масс-спектрометре Applied Biosystems API-4000 в режиме положительных ионов. Для фрагментирования соединения в источнике масс-спектрометра применяли индуцированную столкновениями диссоциацию (ДИС), ионы с m/z 144 отбирали по массе в Q1, фрагментировали, ионы с m/z 77 отбирали по массе в Q3 и детектировали. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Analyst 1.4.2.

[00406] Результаты. Концентрации в мкг/мл СА28-2 и СА28-3 в сыворотке в каждый момент времени приведены в таблице 3 ниже. Представлены данные для каждой из 3-х обезьян, получавших указанное соединение. Средние значения и стандартные отклонения легко рассчитать. Данные для всех животных хорошо согласуются. Для СА28 приведены уже имевшиеся данные, полученные в предыдущем исследовании, в котором СА28 внутривенно вводили яванским макакам. В данном исследовании СА28 определяли в образцах с применением ВЭЖХ.

[00407] Результаты для каждого соединения усредняли, полученный график представлен на Фиг. 3. Значительное увеличение времени полужизни и Cmax по сравнению с СА28 наблюдалось и для СА28-2, и для СА28-3. Конечное время полужизни и для СА28-2, и для СА28-3 составляло приблизительно 4-4,5 дня. Исходя из указанных данных, внутривенное введение с интервалами приблизительно 1-2 недели предположительно будет обеспечивать постоянные уровни соединения и эффективно подавлять активацию комплемента у субъектов-людей, хотя интервалы дозирования могут быть и более короткими, и более длинными.

[00408] Пример 4: Аналог компстатина длительного действия, содержащий ЧСА в качестве снижающего клиренс фрагмента

[00409] Лизины боковых цепей сывороточного альбумина человека (ЧСА) преобразовывали в тиолы с применением 2-иминотиолана и проводили их реакцию с аналогом компстатина, содержащим малеимид в качестве реактивной функциональной группы: Ac-Ile-Cys*-Val-Trp(1-Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-(C(=O)-(CH₂)₅-Mal)-NH₂ (SEQ ID NO: 68). Комплемент-подавляющую активность (Фиг. 4) полученного аналога компстатина длительного действия (СА28-4) исследовали in vitro согласно описанию в примере 1, а фармакокинетические свойства исследовали in vivo согласно описанию в примере 3. Параметры фармакокинетики СА28-4 после введения яванским макакам определяли согласно описанию в предыдущем примере. Результаты приведены на Фиг. 5 (вместе с результатами для СА28, СА28-1, СА28-2 и СА28-3). Данные ФК для СА28-4 представлены в таблице 4.

[00410] Пример 5: Синтез и активность аналогов компстатина на основе ПЭГ при применении различных активированных NHS-ПЭГ

[00411] Аналог компстатина, имеющий последовательность аминокислот аналога компстатина, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 28, но включающий фрагмент AEEAc-Lys, расположенный в направлении С-конца от остатка Thr, соответствующий последовательности SEQ ID NO: 28 для целей последующей конъюгации активированных NHS-сложноэфирных ПЭГ с аминогруппой боковой цепи Lys синтезировали согласно описанию в примере 1. Полученный аналог компстатина представлен следующим: Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-NH₂ (SEQ ID NO: 51), сокращенно CA28-AEEAc-Lys. Монофункциональные линейные активированные ПЭГ с монометокси-сложным NHS-эфиром/карбонатом молекулярной массой 40 кДа, различающиеся химией присоединения NHS-карбоксилата (NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк, кат. №№. SUNBRIGHT® ME-400CS, SUNBRIGHT® ME-400GS, SUNBRIGHT® МЕ-400HS, SUNBRIGHT® ME-400TS) соединяли с боковой цепью лизина СА28-АЕЕАс-Lys амидной связью. (Остаток Lys представлен Lys15, так как линкер АЕЕАс содержит остаток аминокислоты.) Все соединения были ацетилированы на N-конце, амидированы на С-конце, и циклизованы посредством дисульфидной связи между Cys2 и Cys12. (Ацетилирование, амидирование и циклизацию проводили до соединения с ПЭГ.) Соединения получали в виде трифторацетатных солей и очищали. Указанные соединения представлены приведенными в следующей таблице (Таблица 5). Буквенные обозначения CS, GS, HS и TS соответствуют разным линкерным фрагментам между фрагментом ПЭГ и NHS-фрагментом, согласно более подробному описанию в таблице 5. Следует понимать, что различные названия и обозначения для каждого соединения могут использоваться взаимозаменяемо. Отметим, что СА28-2 (см. пример 1) идентичен CA28-2GS.

[00412] Соединения анализировали посредством ВЭЖХ с обращенной фазой. На фиг. 6 приведена репрезентативная хроматограмма одного из указанных соединений. Использовали колонку VariTide RPC. Элюент А: 0,1% ТФУ в воде; Элюент В: 0,1% ТФУ в 50% АЦН/40% воды. Скорость потока составляла 1,000 мл/мин с градиентом от 0%В до 100%В на протяжении 40 минут. Пик со временем удерживания 33,68 минут соответствует пегилированному соединению и имеет относительную площадь 96,50%.

[00413] Ингибирующую активность указанных соединений оценивали путем измерения эффекта указанных соединений на активацию комплемента через классический путь с применением стандартного анализа ингибирования комплемента согласно описанию в примере 1. Результаты представлены на графике на фиг. 7. Указанные результаты представляют собой комбинацию результатов двух отдельных экспериментов. Соединения демонстрировали в значительной степени аналогичную комплемент-ингибирующую активность.

[00414] Пример 6: Синтез и активность бифункционализированных аналогов компстатина на основе ПЭГ

[00415] Бифункциональные линейные с активированным монометокси-NHS-сложным эфиром/карбонатом ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа, различающиеся в отношении химии присоединения NHS-карбоксилата, получали от NOF America Corp. (Уайт-Плейнс, Нью-Йорк). Активированные ПЭГ соединяли с боковой цепью лизина CA28-AEEAc-Lys амидной связью таким образом, что с каждой цепью ПЭГ были соединены два фрагмента CA28-AEEAc-Lys. Все соединения были ацетилированы на N-конце и амидированы на С-конце фрагментов CA28-AEEAc-Lys, и циклизованы посредством дисульфидной связи между Cys2 и Cys12. (Ацетилирование, амидирование и циклизацию проводили до соединения с ПЭГ.) Соединения получали в виде ацетатных солей и очищали. Указанные соединения представлены соединениями, приведенными в следующей таблице (Таблица 6).

[00416]

[00417] Ингибирующую активность CA28-2GS-BF оценивали путем измерения эффекта указанного соединения на активацию комплемента через классический путь с применением стандартного анализа ингибирования комплемента согласно описанию в примере 1 и анализировали согласно описанию в примере 1. Результаты представлены на графике на фиг. 8. Согласно описанию выше, CA28-2GS-BF содержит два фрагмента аналога компстатина на молекулу. Хотя активность в пересчете на фрагмент аналога компстатина у CA28-2GS-BF ниже, чем активность индивидуальной молекулы СА28, активность указанных двух соединений в молярном выражении фактически идентична в широком диапазоне концентраций.

[00418] Пример 7: Подкожное введение бифункционализированного аналога компстатина на основе ПЭГ

[00419] В данном примере описано определение фармакокинетических показателей аналога компстатина длительного действия CA28-2GS-BF после введения яванским макакам либо посредством однократной внутривенной (в/в) инъекции, либо посредством многократного (один раз в сутки) подкожного введения в течение семи дней.

[00420] Дозирование и получение образцов CA28-2GS вводили в момент времени 0 посредством внутривенной инъекции или многократных подкожных инъекций (ежедневно в течение семи дней) самцам яванского макака. В указанном исследовании использовали шесть ранее получавших терапию самцов яванского макака возрастом 1-5 лет, масса тела которых варьировала от 4,6 до 5,3 кг. На момент начала семидневного исследования животные были здоровы. Исследование не было слепым. Животные имели свободный доступ к воде и дважды в сутки получали коммерческий корм до начала исследования. Корм предоставлялся животным с применением устройства типовой конструкции (SOP) до начала исследования. Животных не ограничивали в пище. Животным вводили внутривенно и подкожно дозы в момент времени 0 в соответствующий день. Для подкожного введения использовали иглу калибра 22. Соединение вводили в концентрации 50 мкг/кг в 5% декстрозе в воде в концентрации 25 мг/мл. Пробы крови (~1 мл каждая) собирали из бедренной вены в следующие моменты времени: День 1: Предварительное дозирование, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час (ч), 4 ч, 8 ч. Дни 2-9: 0 мин. День 16: Последний образец на основании дозирования в 1 день. Каждый образец крови (~1,0 мл) собирали из бедренной или подкожной вены обезьяны посредством прямой венепункции и помещали в пробирку для сыворотки с красной крышкой, не содержащую антикоагулянта, и выдерживали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут. Образцы крови центрифугировали при температуре 4°С на 3000×g в течение 5 минут. Образцы поддерживали в охлажденном состоянии на всем протяжении обработки. Образцы сыворотки собирали после центрифугирования и помещали в пробирки для образцов. Образцы хранили в морозильной установке для поддержания температуры -60°С - -80°С. Образцы сыворотки и остатки дозирующих растворов для анализа транспортировали в замороженном состоянии на сухом льду.

[00421] Каждый участок подкожного введения осматривали для установления скорости абсорбции инъекционного объема, а также установления того, остается ли после введения состава уплотнение или оно полностью рассасывается. Участки введения доз осматривали при каждом отборе образцов и в дневное время в течение дней 2-7. Все дозы абсорбировались на протяжении исследования. На основании наблюдений установлено, что дозы абсорбировались в пределах 15 минут после введения. Все животные проявляли нормальную активность на протяжении всего исследования. У животных не отмечалось связанных с соединением аномалий на протяжении всего исследования.

[00422] Анализ образцов. Образцы плазмы, полученные согласно описанию выше, анализировали с применением ЖХ/МС/МС, усиленной ИСД (индуцированной столкновениями диссоциацией) способом, аналогичным описанному в примере 3.

[00423] Результаты. Зависимость концентрации CA28-2GS-BF в сыворотке от времени при введении в/в или подкожно согласно описанию выше представлена на графиках на фиг. 9. Точки данных соответствуют всем детектированным пегилированным СА28-соединениям. Данные для СА28, представленные на фиг. 9, представляют собой ретроспективные данные, полученные в предыдущем исследовании, в ходе которого СА28 вводили внутривенно яванским макакам. В указанном исследовании СА28 детектировали в образцах с применением ВЭЖХ.

[00424] Пиковая концентрация в сыворотке, составляющая 500 мкг/мл (11 мкМ), достигалась путем подкожного введения CA28-2GS-BF. Конечное время полужизни CA28-2GS-BF составляло приблизительно 5 дней при введении либо в/в, либо подкожно. Результаты обобщены в таблицах ниже:

[00425] Пример 8: Ингибирование комплемент-опосредованного лизиса красных клеток крови от пациентов с ПНГ

[00426] Проводили модифицированный тест Хэма для измерения способности аналогов компстатина ингибировать комплемент-опосредованный лизис красных клеток крови от пациентов с ПНГ in vitro. Комплемент активировали подкисленной сывороткой с добавлением магния для лизиса пораженных ПНГ красных клеток. Проводили инкубирование в течение 90 минут. Данные регистрировали с применением проточной цитометрии пораженных ПНГ красных клеток с применением стандартных маркеров. В качестве контроля использовали термоинактивированную сыворотку (не вызывающую гемолиз). Подкисленная сыворотка без добавления ингибитора комплемента вызывает максимальный лизис. Эксперимент проводили с серийными двукратными разведениями аналогов компстатина СА28, СА28-2, CA28-2CS, CA28-2CS-BD, CA28-2GS, CA28-2GS-BF, CA28-2HS, CA28-2HS-BF, CA28-2TS, CA28-2GS-BF и СА28-3. Определяли концентрацию каждого соединения, необходимую для полной блокады гемолиза in vitro. Также красные клетки крови окрашивали для определения отложения фрагментов С3 с применением поликлональных антител против С3, которые не содержат каких-либо мостиков, обуславливающих агглютинацию (например, Ab4214 или Ab14396, оба коммерчески доступные в виде FITC-конъюгатов от Abcam, Кембридж, Великобритания) для измерения способности указанных соединений ингибировать отложение фрагментов С3 на красных клетках крови при ПНГ. Результаты сравнивали с полученными для экулизумаба с применением тех же анализов.

[00427] Пример 9: Аналоги компстатина длительного действия у пациентов с ПНГ

[00428] Когорту субъектов, у которых диагностировано ПНГ, делили на 4 группы. Субъекты в Группах 1 и 2 получали лечение внутривенным введением СА28-2 или СА28-3, соответственно, в дозе, составляющей от 5 мг/кг и 20 мг/кг, с интервалами от 1 и 2 недель. Лечение необязательно начинали с введения с более короткими интервалами, и затем при поддерживающей терапии частоту снижают. Субъекты в Группе 3 получали лечение Экулизумабом в соответствии с рекомендованным режимом дозирования. Группа 4 служила в качестве контрольной (без терапии ингибитором комплемента). Проводили мониторинг изменений от времени интраваскулярного гемолиза (на основе измерений ЛДГ и/или мечения кКК (51)Cr), ретикулоцитоза (индикатора анемии), гематокрита, концентрации гемоглобина в крови, опсонизации эритроцитов (отложения продуктов активации С3, таких как C3b, на эритроцитах, которое может быть обнаружено с применением проточной цитометрии), симптомов ПНГ, необходимости переливания, случаев тромбоэмболии, связанного с гемолизом истощения оксида азота, показателей легочной гипертензии, качества жизни и выживаемости. Сравнивали результаты между группами и более ранние данные для контрольных ПНГ-пациентов, полученные при клинических испытаниях Экулизумаба. Уменьшение персистентной анемии (о котором, например, свидетельствует снижение ретикулоцитоза, уменьшение признаков гемолиза, повышение гематокрита, повышение уровня гемоглобина), улучшение качества жизни, уменьшение симптомов ПНГ, снижение потребности в переливании, снижение частоты случаев тромбоэмболии, уменьшение связанного с гемолизом истощения оксида азота, уменьшение показателей легочной гипертензии, повышение качества жизни и/или повышение выживаемости, у субъектов, получающих СА28-2 (Группа 1) или СА28-3 (Группа 2), по сравнению с субъектами в группе 4, свидетельствует об эффективности.

[00429] Пример 10: Аналоги компстатина длительного действия у пациентов с ПНГ

[00430] Повторяли пример 9 с той разницей, что субъектами являлись индивидуумы с ПНГ, остающиеся зависимыми от переливаний, и/или содержание гемоглобина у которых продолжает оставаться ниже предельного значения (например, 9,0 г/дл), несмотря на лечение Экулизумабом. Сравнивали результаты между группами.

[00431] Пример 11: Аналоги компстатина длительного действия у пациентов с аГУС

[00432] Когорту субъектов, у которых диагностировано аГУС, разделяли на 4 группы. Субъекты в Группах 1 и 2 получали лечение внутривенным введением СА28-2 или СА28-3, соответственно, в дозе, составляющей от 5 мг/кг до 20 мг/кг, с интервалами времени от 1 до 2 недель. Лечение необязательно начинали с введения с более короткими интервалами, и затем при поддерживающей терапии частоту снижают. Субъекты в Группе 3 получают лечение Экулизумабом в соответствии с рекомендованным режимом дозирования. Проводили мониторинг изменений от времени интраваскулярного гемолиза (на основе измерений ЛДГ), опсонизации эритроцитов (отложения продуктов активации С3, таких как C3b, на эритроцитах), симптомов аГУС, почечной функции, необходимость плазмообмена или диализа, качества жизни и выживаемости. Сравнивали результаты между группами и более ранние данные для контрольных аГУС-пациентов, полученные при клинических испытаниях Экулизумаба. Уменьшение признаков гемолиза, улучшение качества жизни, уменьшение симптомов аГУС, уменьшение потребности в плазмообмене или диализе, повышение качества жизни и/или повышения выживаемости у субъектов, получающих СА28-2 или СА28-3, по сравнению с субъектами в группе 4 свидетельствуют об эффективности.

[00433] Пример 12: Примеры 8-11 повторяли с применением CA28-2GS-BF, СА28-2HS, CA28-2HS-BF, CA28-2TS и CA28-2GS-TS-BF.

[00434] Пример 14: Примеры 9-12 повторяли с применением CA28-2GS-BF, СА28-2HS, CA28-2HS-BF, CA28-2TS и CA28-2GS-TS-BF при ежедневном введении посредством подкожной инъекции.

[00435] Пример 14: Примеры 8-11 повторяли с применением дополнительных аналогов компстатина длительного действия.

[00436] Пример 15: Примеры 8-11 повторяли с применением клеточно-реактивных аналогов компстатина.

[00437] Пример 16: Активация комплемент-ингибирующей активности аналога компстатина длительного действия

[00438] СА28 и CA28-AEEAc-Lys синтезировали согласно описанию выше. СА28-2TS-BF синтезировали с применением реактивного бифункционального ПЭГ TS-типа в отношении химии присоединения NHS-карбоксилата, который связывали с двумя молекулами CA28-AEEAc-Lys через первичный амин боковой цепи лизина. Ингибирующую активность СА28 и CA28-2TS-BF в отношении активации комплемента оценивали путем измерения эффекта указанных соединений на активацию комплемента через классический путь и через альтернативный путь с применением стандартных анализов на ингибирование комплемента. Протокол анализа активации через классический путь описан в примере 1. В протоколе активации через альтернативный путь также измеряется отложение C3b в формате ELISA, и он описан ниже. Отложение C3b, мониторинг которого осуществляют с применением указанный способ, достигается за счет комплемента, активированного через альтернативный путь посредством липополисахарида (ЛПС). Вкратце, 96-луночные планшеты покрывают ЛПС. Добавляют тестируемое соединение (называемое «лекарственным средством») с последующим добавлением плазмы или сыворотки в качестве источника комплемента, и инкубируют. Затем добавляют чР-конъюгированное антитело против С3 человека. После дополнительного инкубирования добавляют субстрат и регистрируют сигнал. Подробное описание протокола приведено ниже:

[00439] Анализ активации комплемента через альтернативный путь на основе ИФА ELISA

Материалы:

• 96-луночный планшет для ИФА ELISA (Corning 3590)

• ЛПС из Salmonella typhosa - Sigma L7136 (40 мкг/мл в ФСБ)

• БСА 1% в ФСБ - Calbiochem #126626, разведение 1/30

• Вероналовый буфер + 10 мМ MgCl₂ + 10 мМ ЭГТК (VB-Mg ЭГТК)

• Плазма человека (собранная с добавлением лепирудина с конечной концентрацией 5 мкг/мл)

• чР-конъюгированные AT против С3 человека (поликлональные AT к С3-HRP Ab, Cappel 55237)

• Отмывочный буфер Tween-20 (0,05% в ФСБ)

• ТМБ (Субстрат пероксидазы) - смесь 1:1 BD 51-2607KC и 51-2606KC.

• 3М H₂SO₄

• Ридер для микропланшетов

Протокол:

1. Добавить по 50 мкл/лунку ЛПС в концентрации 40 мкг/мл (в ФСБ)

2. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре

3. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету.

4. Блокировать добавлением 200 мкл 1% БСА/ФСБ

5. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре

6. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету

7. Добавить по 50 мкл VB-Mg ЭГТК в лунки №2-12

8. Добавить 100 мкл лекарственного средства в первом разведении (2х в VB-Mg ЭГТК) в лунку 1.

9. Приготовить серийные разведения (1:2) лекарственного средства из лунок 1-10 следующим образом:

a. Взять 50 мкл раствора из исходной лунки

b. Добавить указанный раствор в следующую лунку

c. Перемешать многократным пипетированием

d. Повторять до лунки №10

Примечание: из лунки №10 удалить 50 мкл и утилизировать

10. Добавить по 50 мкл в разведении 2х в плазме в лунки 1-11

11. Инкубировать в течение 1 часа

12. Дважды промыть отмывочным буфером

13. Добавить по 50 мкл C3-HRP Ab в разведении 1/1000 в 1% БСА/ФСБ

14. Инкубировать в течение 1 часа

15. Добавить по 100 мкл ТМБ во все лунки

16. Инкубировать в течение 30 мин

17. Добавить 50 мкл 3М H₂SO₄

18. Произвести считывание планшета на 450 нм

Формула VB Mg ЭГТК

Барбитал 5 мМ NaCl 72,5 мМ MgCl2 10 мМ ЭГТК 10 мМ рН 7,3-7,4

Исходные растворы:

Для получения 20 мл рабочего буфера:

• Взвесить 84 мг NaCl

• Добавить 4 мл 5Х VB

• Добавить 2 мл ЭДТК 10Х

• Добавить 2 мл MgCl 10Х

• Довести объем до 20 мл добавлением Н₂О

• Довести рН до 7,4

[00440] Результаты

[00441] На фиг. 10(A) представлен процент ингибирования классического пути активации комплемента за счет ингибирующей активности СА28 и CA28-2TS-BF как функция от молярной концентраций указанных соединений. На фиг. 10(B) представлен процент ингибирования альтернативного пути активации комплемента за счет ингибирующей активности СА28 и CA28-2TS-BF как функция от молярной концентраций указанных соединений. Необработанные данные приведены в таблице 9 ниже (4 повторности для каждого условия). Исходя из кривых ингибирования, представленных на фигурах, и лежащих в основе данных, комплемент-ингибирующая активность CA28-2TS-BF по меньшей мере равна активности СА28 в молярном выражении в пределах экспериментальной ошибки указанного анализа Указанные результаты дополнительно подтверждают пригодность аналогов компстатина длительного действия, описанных в настоящем документе, например, для терапевтического применения.

[00442]

[00443] Пример 17: Фармакокинетические свойства аналога компстатина длительного действия при внутривенном или подкожном введении

[00444] В данном примере описано определение фармакокинетических показателей аналога компстатина длительного действия CA28-2TS-BF после введения яванским макакам посредством однократной внутривенной (в/в) инъекции, при однократном подкожном введении или подкожном введении один раз в сутки в течение семи дней. CA28-2TS-BF синтезировали с применением реактивного бифункционального ПЭГ TS-типа в отношении химии присоединения NHS-карбоксилата, который связывали с двумя молекулами CA28-AEEAc-Lys через первичный амин боковой цепи лизина.

[00445] Дозирование и получение образцов

[00446] CA28-2TS-BF вводили яванским макакам в момент времени 0 посредством внутривенной инъекции в подкожную вену, или посредством однократной подкожной инъекции или повторных подкожных инъекций (один раз в сутки в течение семи дней). В указанном исследовании использовали шесть ранее получавших терапию самок яванского макака (по три на группу) возрастом 2-5 лет, масса которых варьировала от 2,6 до 3,9 кг. На момент начала исследования животные были здоровы. Исследование не было слепым. Животные имели свободный доступ к воде и дважды в сутки получали коммерческий корм до начала исследования. Корм предоставлялся животным с применением устройства типовой конструкции (SOP) до начала исследования. Животных не ограничивали в пище. Животным вводили по 7 мкг/кг внутривенно или подкожно в момент времени 0 в соответствующий(ие) день(дни). Концентрация дозируемого соединения в растворе составляла 3,5 мг/мл для в/в введения и 25 мг/мл для подкожного введения. Объем дозы составлял 2 мл/кг для в/в введения и 0,28 мл/кг для подкожного введения. Для подкожного введения использовали иглу калибра 23G3/4. Соединение вводили в 5% декстрозе в воде.

[00447] Пробы крови (~0,5-1 мл) собирали из бедренной вены в следующие моменты времени: День 1: Предварительное дозирование, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час (ч), 4 ч, 8 ч. Дни 2-9: 0 мин. День 15: Последний образец на основании дозирования на 1 день. Каждый образец крови собирали из бедренной вены обезьяны посредством прямой венепункции и помещали в пробирку для сыворотки с красной крышкой, не содержащую антикоагулянта, и выдерживали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут. Образцы крови центрифугировали при температуре 4°С на 3000×g в течение 5 минут. Образцы поддерживали в охлажденном состоянии на всем протяжении обработки. Образцы сыворотки собирали после центрифугирования и помещали в пробирки для образцов. Образцы хранили в морозильной установке для поддержания температур от -60°С до -80°С. Образцы сыворотки и остатки дозирующих растворов для анализа транспортировали в замороженной состоянии на сухом льду.

[00448] Каждый участок подкожного введения осматривали для установления скорости абсорбции инъекционного объема, а также установления того, остается ли после введения состава уплотнение или оно полностью рассасывается. Участки введения доз у животных, получавших подкожные инъекции, осматривали вечером каждого дня дозирования. На участках введения дозы не наблюдалось уплотнений и доза полностью абсорбировалась к этому времени, по оценке с помощью визуального осмотра. Всех животных осматривали дважды в сутки; животные проявляли нормальную активность на протяжении всего исследования. У животных не отмечалось связанных с соединением аномалий на протяжении всего исследования.

[00449] Анализ образцов. Образцы плазмы, полученные согласно описанию выше, анализировали с применением ЖХ/МС/МС, усиленной ИСД (индуцированной столкновениями диссоциацией) способом, аналогичным описанному в примере 3.

[00450] Результаты.

[00451] Концентрации CA28-2TS-BF в сыворотке в зависимости от времени при введении в/в или подкожно согласно описанию выше представлены на графиках на фиг. 11. Точки данных соответствуют всем детектированным пегилированным СА28-соединениям. Данные для СА28, представленные на фиг. 11 представляют собой ретроспективные данные, полученные в предыдущем исследовании, в ходе которого СА28 вводили внутривенно яванским макакам. В указанном исследовании СА28 детектировали в образцах с применением ВЭЖХ/МС.

[00452]

[00453] Пиковая концентрация в сыворотке, составляющая примерно 500 мкг/мл, достигалась путем подкожного введения CA28-2TS-BF один раз в сутки в течение 7 дней. Конечное время полужизни CA28-2TS-BF составляло приблизительно 8 дней при введении либо в/в, либо путем однократной подкожной инъекции. Необработанные данные приведены в таблицах 10(A) (в/в введение) и 10(B) (подкожное введение) ниже. (На фиг. 11 и в таблицах 10(A) и 10(B) день дозирования считается днем 0).

[00454]

[00455] Как отмечалось выше, CA28-2TS-BF синтезировали с применением реактивного бифункционального ПЭГ TS-типа, обеспечивающего образование карбамата после реакции с первичным амином лизина. CA28-2GS-BF синтезировали с применением реактивного бифункционального ПЭГ GS-типа в отношении химии присоединения NHS-карбоксилата, обеспечивающего образование амида после реакции с первичным амином лизина. Указанное соединение также содержит сложноэфирную связь, отсутствующую в CA28-2TS-BF. Следует отметить, что конечное время полужизни, составляющее примерно 8 дней, достигаемый при применении CA28-2TS-BF в указанном эксперименте, был заметно больше периода для CA28-2GS-BF, время полужизни которого, как было обнаружено, составляет примерно 5 дней в аналогичном эксперименте (см. пример 8). Пример 18: Аналоги компстатина ингибируют отложение С3 на красных клетках крови пациентов с ПНГ и защищают против комплемент-опосредованного лизиса

[00456] Проводили модифицированный тест Хэма для оценки способности аналогов компстатина защищать пораженные ПНГ кКК от комплемент-опосредованного лизиса. Клетки кКК от пациента с ПНГ, на которые воздействовали подкисленной сывороткой человека (в качестве источника компонентов комплемента) и магнием (Mg²⁺, необходим для активации альтернативного пути) в отсутствие ингибиторов комплемента или в присутствии варьирующих количеств аналогов компстатина СА28 или CA28-2GS-BF. Воздействие термоинактивированной сывороткой человека использовали в качестве контроля, соответствующего отсутствию значимого комплемент-опосредованного лизиса, поскольку комплемент инактивируется при нагревании. Воздействие подкисленной сывороткой человека и магнием (Mg²⁺) в отсутствие ингибиторов комплемента (панель, обозначенная как «Mg²⁺») использовали в качестве контроля, соответствующего максимальному лизису.

[00457] После инкубирования клетки окрашивали антителами к CD59 и C3d. Уровень Cd59 позволял классификацию пораженных ПНГ кКК как клетки типа I, типа II или типа III. Окрашивание на C3d, продукт активации и расщепления С3, использовали в качестве маркера С3 и отложения продуктов активации (нагрузки) С3. Анализ с применением проточной цитометрии проводили для оценки CD59 и C3d на поверхностях кКК и количественного определения процентов клеток типа I, типа II и типа III, присутствующих в различных образцах.

[00458] Результаты эксперимента с разведениями, демонстрирующего эффект разных концентраций СА28 на отложение С3 и процент клеток, представлены на фиг. 12(A). Результаты эксперимента с разведениями, демонстрирующего эффект разных концентраций CA28-2GS-BF на отложение С3 и процент клеток, представлены на фиг. 12(B). Количественные результаты представлены в таблице 11 ниже. Клетки I типа (выделены оранжевым цветом на фиг. 12) содержат нормальные уровни CD59. Клетки типа III (выделены синим цветом на фиг. 12) по существу не содержат детектируемого CD59. Указанные клетки очень чувствительны к комплемент-опосредованному лизису. Уровни CD59 в клетках II типа (отмечены фиолетовым цветом на фиг. 12) понижены по сравнению с нормальными клетками или клетками I типа, и они обладают средней чувствительностью к комплемент-опосредованному лизису. При активации комплемента клетки типа III быстро подвергаются лизису. Об уменьшении или отсутствии лизиса может свидетельствовать присутствие повышенного количества клеток типа III, на которое указывает более высокий процент клеток типа III на панели, где лизис отсутствует, по сравнению с панелью (в присутствии Mg²⁺ (максимальный лизис)), как на фиг. 12(A), так и на 12(B). Другими словами, положительный контроль содержит относительно меньшее количество клеток типа III, чем отрицательный контроль. Клетки II типа могут в конечном итоге подвергаться лизису в присутствии активированного комплемента, однако перед этим могут аккумулировать значительное количество продуктов активации С3, таких как, C3d. Об уменьшении или отсутствии лизиса могут свидетельствовать повышенные уровни С3 или продуктов активации С3 на клетках II типа, на что указывает сравнение уровня C3d на клетках II типа на панели, где лизис отсутствует, с уровнем C3d на клетках II типа на панели с максимальным лизисом на обоих фигурах, фиг. 12(A) и фиг. 12(B). Другими словами, на клетках на панели с максимальным лизисом присутствует большее количество C3d, чем на клетках на панели, где лизис отсутствует. Клетки I типа содержат функциональный CD59; таким образом, они деактивируют конвертазу и, соответственно, не аккумулируют такие количества C3d, как клетки II типа. При этом количество C3d, которое они аккумулируют, может использоваться в качестве суррогатного индикатора уровня лизиса более уязвимых клеток (типа II и III). Соответственно, пониженное количество C3d на клетках типа I указывает на защиту против лизиса. Сдвиг относительных процентных долей клеток типов I, II и III относительно процентных долей на контрольных панелях с максимальным лизисом (Mg²⁺) в сторону процентных долей на контрольных панелях, где лизис отсутствует (термоинактивированная сыворотка), указывает на защиту против комплемент-опосредованного лизиса. Указанные процентные доли представлены в таблице ниже. Столбец, обозначенный «%С'3» в таблице 11, относится к проценту клеток, учтенных как «положительные» по С3 и продуктам активации С3 («нагрузка С3»). Как видно на фиг. 12(A) и (В) и из таблицы 11, СА28 и CA28-2GS-BF в протестированных концентрациях демонстрировали аналогичную защиту против лизиса пораженных ПНГ красных клеток, при фактическом отсутствии нагрузки С3 пораженных ПНГ красных клеток при концентрации соединения 100 мкг/мл или более высоких концентрациях. Отметим, что процентные доли клеток III, II и I типа в присутствии 100 мкг/мл или более аналога компстатина по существу совпадали с процентными долями в контроле с отсутствием лизиса, указывая на полную защиту от комплемент-опосредованного лизиса по оценке с помощью указанного анализа. Концентрации ниже 100 мкг/мл, но выше 60 мкг/мл, например, по меньшей мере 70 мкг/мл, по меньшей мере 80 мг/мл, или по меньшей мере 90 мкг/мл, но ниже 100 мкг/мл не тестировались в указанном эксперименте, но могут также обеспечить существенную защиту. 100 мкг/мл CA28-2GS-BF соответствует концентрации, составляющей примерно 2,5 мкМ, которая легко достижима in vivo согласно описанию в настоящем документе.

[00459]

[00460] Пример 19: Эффект аналога компстатина и Soliris на отложение С3 на красных клетках крови пациента с ПНГ

[00461] Проводили эксперимент, аналогичный описанному в примере 18, для дополнительной демонстрации защитного эффекта аналога компстатина CA28-2GS-BF и его сравнения с эффектом антитела против С5 Soliris. Модифицированный согласно примеру 18 анализ Хэма проводили с применением пораженных ПНГ кКК инкубированных в присутствии активированного комплемента либо в отсутствие ингибитора комплемента (левая панель), либо в присутствии Soliris (средняя панель) или CA28-2GS-BF (50 мкг/мл) (правая панель). После окрашивания антитела с применением антител против CD59 и C3d проводили проточную цитометрию. Результаты представлены на фиг. 13. На указанной фигуре квадрант 1 (Q1) и квадрант 3 (Q3) соответствуют клеткам типа III. Квадрант 2 (Q2) и квадрант 4 (Q4) соответствуют клеткам I и II типа. Q1 и Q2 соответствуют клеткам со значительным и аномально высоким количеством отложения продукта активации С3 (например, C3d). Q3 и Q4 соответствуют клеткам без значительного отложения C3d или с несколько повышенным уровнем (правая часть Q4), но меньшим относительно клеток в Q2. Процент клеток в разных квадрантах приведен под каждой панелью на фиг. 13 и в таблице 12 ниже.

[00462]

[00463] Как видно, в отсутствие ингибиторов значительное большинство клеток располагаются в Q4 (тип I или тип II, с низкими уровнями отложения продуктов активации С3). Клетки типа III должны были в основном быть лизированы, таким образом, их процент (Q1 и Q3) невелик. Клетки в Q2, которые аккумулируют продукты отложения С3, в конечном итоге подвергаются лизису, таким образом, их количество остается относительно небольшим. В присутствии экулизумаба клетки типа III защищены от лизиса по меньшей мере изначально, но аккумулируют продукты активации С3 (например, C3d), что видно по высокому проценту клеток в Q1 по сравнению с панелью без ингибитора (36,79% относительно 0,09%). Относительное содержание клеток Q2+Q4 (тип I и II) ниже в результате повышенной выживаемости клеток типа III. Тем не менее, очевидно, что значительное отложение продуктов активации С3 (например, C3d) происходит на клетках типа III, что может в конечном итоге приводить к лизису или выведению (in vivo). На обработанных СА28-2GS-BF (правая панель) пораженных ПНГ кКК по существу не наблюдается отложение C3d независимо от того, относятся ли они к типу I, II или III, в отличие от результатов, полученных с экулизумабом. Процент клеток в Q1 и Q2 пренебрежимо мал. Наблюдается резкое увеличение процента клеток типа III (61,55%) по сравнению с результатами, полученными без ингибитора или с экулизумабом, что указывает (наряду с отсутствием отложения C3d) на повышенную защиту от лизиса за счет СА28-2GS-BF.

* * * * *

[00464] Специалистам в данной области техники известны многие эквиваленты конкретных вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящей заявке, либо такие эквиваленты могут быть выявлены с применением не более чем рутинных экспериментов. Предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничен приведенным выше описанием и отражен в прилагаемой формуле изобретения. Следует иметь в виду, что настоящее изобретение никоим образом не зависит от конкретных результатов, полученных в любом конкретном примере или в любом конкретном варианте реализации. Употребление существительных в единственном числе и термина «указанный/ые» может подразумевать «один/одна или большее количество, чем один/одна», если иное не указано или не очевидно из контекста. Подразумевается, что пункты формулы изобретения или описание, включающие союз «или» между одним или большим количеством представителей группы, удовлетворены, если присутствует(ют), использует(ют)ся или иным образом связан(ы) с определенным продуктом или процессом один, более чем один или все представители указанной группы, если иное не указано или не очевидно из контекста. Настоящее изобретение включает варианты реализации, в которых присутствует, используется или иным образом связан с определенным продуктом или процессом ровно один представитель указанной группы. Например, без ограничения, следует понимать, что в тех случаях, когда в формуле изобретения или в описании указано, что остаток в конкретном положении может быть выбран из конкретной группы аминокислот или аналогов аминокислот, настоящее изобретение включает индивидуальные варианты реализации, в которых остаток в указанном положении представляет собой любую(ой) из перечисленных аминокислот или аналогов аминокислот. Настоящее изобретение также включает варианты реализации, в которых присутствует(ют), использует(ют)ся или иным образом связан(ы) с определенным продуктом или процессом более чем один либо все представители указанной группы. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все варианты, комбинации и пермутации, в которых одно или большее количество ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.п., из одного или большего количества из приведенных пунктов формулы или приведенного выше описания введен в другой пункт формулы. Например, любой пункт формулы, зависимый от другого пункта формулы, может быть модифицирован таким образом, чтобы включать один или большее количество элементов, ограничений, условий или описательных терминов, присутствующих в любом другом пункте формулы, зависимом от того же основного пункта. Кроме того, в тех случаях, когда в формуле изобретения упоминается композиция, следует понимать, что в объем настоящего изобретения включены способы введения указанной композиции, соответствующие любому из описанных в настоящей заявке способов, и способы применения указанной композиции для любой из описанных в настоящей заявке целей; в объем настоящего изобретения включены и способы получения композиции в соответствии с любым из способов получения, описанных в настоящей заявке, если не указано иное, или если специалисту в данной области техники не очевидно, что возникнет противоречие или несоответствие. Способы лечения субъекта могут включать этап обеспечения субъекта, нуждающегося в таком лечении (например, субъекта, который перенес заболевание, либо субъекта, у которого имеется повышенный риск заболевания), этап диагностирования заболевания у субъекта и/или этап выбора субъекта для лечения клеточно-реактивным аналогом компстатина. В тех случаях, когда элементы представлены в виде списков, следует понимать, что также раскрыта каждая подгруппа указанных элементов, и что из указанной группы может(могут) быть удален(ы) любой(ые) элемент(ы). Для краткости только некоторые из указанных вариантов реализации конкретно представлены в настоящей заявке, однако настоящее изобретение включает все подобные варианты реализации. Следует также понимать, что, в общем случае, если сказано, что настоящее изобретение или аспекты настоящего изобретения, включает(ют) конкретные элементы, свойства и т.п., определенные варианты реализации настоящего изобретения или аспекты настоящего изобретения состоят, либо состоят по существу, из таких элементов, свойств и т.п. Описания различных заболеваний, расстройств и состояний в различных разделах настоящей заявки приведены для удобства и не подразумевают ограничения настоящего изобретения.

[00465] При указании диапазонов включены предельные значения. Кроме того, следует понимать, что если иное не указано или не очевидно из контекста и для специалиста в данной области техники, под значениями, выраженными через диапазоны, может, согласно разным вариантам реализации настоящего изобретения, подразумеваться любое конкретное значение или поддиапазон в пределах указанных диапазонов, до десятых долей единиц нижней границы указанного диапазона, если из контекста явно не следует иное. Любой конкретный вариант реализации, аспект, элемент, признак и т.п., настоящего изобретения может быть явным образом исключен(а) из формулы изобретения, даже если такое исключение не приведено в настоящей заявке явным образом. Например, любой аналог компстатина, функциональная группа, соединяющая часть, уменьшающего клиренс фрагмента, заболевание или показание могут быть явным образом исключены.

Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены клеточно-реактивные аналоги компстатина и композиции, содержащие клеточно-реактивные аналоги компстатина.

Аналог компстатина длительного действия содержит снижающий клиренс фрагмент, присоединенный к двум фрагментам аналога компстатина, причем каждый фрагмент аналога компстатина содержит циклический пептид, удлиненный остатком лизина или последовательностью, содержащей остаток лизина на N-конце, С-конце или на обоих концах, причем указанный остаток лизина отделен от циклической части указанного пептида жестким или гибким спейсером, содержащим фрагмент олиго(этиленгликоля), и при этом указанный циклический пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOs: 3-36, 71, 72, 73 или 74; указанный снижающий клиренс фрагмент содержит линейный полимер, причем указанный линейный полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ) со средней молекулярной массой от примерно 30 кДа до примерно 40 кДа, причем каждый конец указанного линейного полимера связан с одним из фрагментов аналога компстатина карбаматом, причем (i) указанный спейсер содержит -(CH₂)_m- и -(O-CH₂-CH₂-)_n, соединенные ковалентно, где m составляет от 1 до 10, и n составляет от 1 и 10; и/или

(ii) указанный спейсер содержит 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (AEEAc) или 11-амино-3,6,9- триоксаундекановую кислоту. Клеточно-реактивные аналоги компстатина предназначены для лечения комплемент-опосредованного расстройства, например, для ингибирования комплемент-опосредованного повреждения клетки, ткани или органа. 12 таб., 13 ил., 7 пр.

1. Аналог компстатина длительного действия, содержащий снижающий клиренс фрагмент, присоединенный к двум фрагментам аналога компстатина, причем каждый фрагмент аналога компстатина содержит циклический пептид, удлиненный остатком лизина или последовательностью, содержащей остаток лизина, на N-конце, С-конце или на обоих концах, причем указанный остаток лизина отделен от циклической части указанного пептида жестким или гибким спейсером, содержащим фрагмент олиго(этиленгликоля), и при этом указанный циклический пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOs: 3-36, 71, 72, 73 или 74; указанный снижающий клиренс фрагмент содержит линейный полимер, причем указанный линейный полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ) со средней молекулярной массой от примерно 30 кДа до примерно 40 кДа, причем каждый конец указанного линейного полимера связан с одним из фрагментов аналога компстатина карбаматом, причем

(i) указанный спейсер содержит -(CH₂)_m- и -(O-CH₂-CH₂-)_n, соединенные ковалентно, где m составляет от 1 до 10, и n составляет от 1 и 10; и/или

(ii) указанный спейсер содержит 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (AEEAc) или 11-амино-3,6,9- триоксаундекановую кислоту.

2. Аналог компстатина длительного действия по п. 1, отличающийся тем, что указанный спейсер содержит -(CH₂)_m- и -(O-CH₂-CH₂-)_n, соединенные ковалентно, где m составляет от 1 до 10, и n составляет от 1 до 10.

3. Аналог компстатина длительного действия по п. 2, отличающийся тем, что m равен 1, а n равен 2.

4. Аналог компстатина длительного действия по п. 1, отличающийся тем, что указанный спейсер содержит 8-амино-3,6- диоксаоктановую кислоту (AEEAc) или 11-амино-3,6,9-триоксаундекановую кислоту.

5. Аналог компстатина длительного действия по п. 1, отличающийся тем, что указанный ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу, составляющую примерно 40 кДа.

6. Аналог компстатина длительного действия по п. 1, имеющий конечное время полужизни, равное примерно 3 дня, при введении примату.

7. Аналог компстатина длительного действия по п. 6, имеющий конечное время полужизни, равное примерно 5 дней, при введении примату.

8. Аналог компстатина длительного действия по п. 1, имеющий молярную активность, равную по меньшей мере 90% от активности аналога компстатина, содержащего такую же аминокислотную последовательность аналога компстатина, что и указанный фрагмент аналога компстатина, но не связанную со снижающим клиренс фрагментом.

9. Аналог компстатина длительного действия по п. 1, отличающийся тем, что указанный циклический пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 28.

10. Аналог компстатина длительного действия, содержащий снижающий клиренс фрагмент, присоединенный к двум фрагментам аналога компстатина, причем каждый фрагмент аналога компстатина содержит циклический пептид, удлиненный остатком лизина или последовательностью, содержащей остаток лизина, на N-конце, С- конце или на обоих концах, причем указанный остаток лизина отделен от циклической части указанного пептида жестким или гибким спейсером, содержащим фрагмент олиго(этиленгликоля), и при этом указанный циклический пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NOs: 3-36, 71, 72, 73 или 74; указанный снижающий клиренс фрагмент содержит линейный полимер, причем указанный линейный полимер представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ) со средней молекулярной массой от примерно 30 кДа до примерно 40 кДа, причем каждый конец указанного линейного полимера связан с одним из фрагментов аналога компстатина карбаматом или амидом, причем указанный спейсер содержит 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (AEEAc) или 11-амино-3,6,9- триоксаундекановую кислоту.

11. Аналог компстатина длительного действия по п.10, отличающийся тем, что указанный ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу, составляющую 40 кДа.

12. Аналог компстатина длительного действия по любому из пп.10-11, имеющий конечное время полужизни, равное примерно 5 дней, при внутривенном введении примату.

13. Аналог компстатина длительного действия по любому из пп.10-12, имеющий молярную активность, равную по меньшей мере 90% или, предпочтительно, по меньшей мере равную активности аналога компстатина, содержащего такую же аминокислотную последовательность аналога компстатина, что и указанный фрагмент аналога компстатина, но не связанную со снижающим клиренс фрагментом.

14. Аналог компстатина длительного действия по п.10, отличающийся тем, что каждый конец указанного линейного полимера связан с одним из фрагментов аналога компстатина карбаматом.

15. Композиция фармацевтического класса для уменьшения чувствительности клетки или органа к комплемент-зависимому повреждению или для лечения комплемент-опосредованного расстройства, содержащая аналог компстатина длительного действия по любому из предшествующих пунктов, необязательно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.

16. Композиция фармацевтического класса по п. 15 для применения в качестве медикамента.

17. Композиция фармацевтического класса по п. 15 или 16 для применения для подкожного или внутривенного введения субъекту или для введения в глаз субъекта.

18. Композиция фармацевтического класса по п. 17 для введения в глаз субъекта, у которого имеется риск развития возрастной макулярной дегенерации.

19. Композиция фармацевтического класса по п. 17 или 18, отличающаяся тем, что введение осуществляют путем интравитреальной инъекции.

20. Способ получения аналога компстатина длительного действия по п. 10, включающий реакцию соединения IVa:

с фрагментом аналога компстатина, где указанный фрагмент аналога компстатина имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 3-36, 71, 72, 73 или 74.

21. Способ получения аналога компстатина длительного действия по любому из пп. 1-10, включающий реакцию соединения Формулы В:

где Т представляет собой ковалентную связь или линейную или разветвленную углеводородную цепь C_1-12 , где одна или большее количество углеродных единиц T необязательно и независимо заменена на -O-, -S-, -N(R^x)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R^x)C(O)-, -C(O)N(R^x)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R^x)SO₂- или -SO₂N(R^x)-, и каждый R^x независимо представляет собой углерод или алифатический C_1-6, предпочтительно,

или

с фрагментом аналога компстатина, где указанный фрагмент аналога компстатина имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74.