Родственная заявка
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США с серийным номером 63/012590, поданной 20 апреля 2020 г., полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Область, к которой относится изобретение
Настоящая заявка относится к гуманизированным антителам к фактору Bb и к применению таких антител.
Предпосылки создания изобретения
Система комплемента является частью врожденной иммунной системы. Ее основной ролью является “дополнение” способности антител и фагоцитарных клеток очищать организм от вредных патогенов. Система комплемента включает три отдельных восходящих пути активации (классический путь, альтернативный путь и лектиновый путь), которые все сходятся на общем терминальном пути. Фактор B является компонентом альтернативного пути комплемента и может расщепляться на фактор Ba и фактор Bb. Фактор B также содержит серинпротеазный (SP) домен, и при активации он обеспечивает каталитическую активность C3 и C5 конвертаз альтернативного пути. Аберрантная активация системы комплемента может вызывать повреждение ткани хозяина при различных патологических состояниях, от аутоиммунного заболевания до трансплантации органов. По-прежнему существует потребность в лечении заболеваний или расстройств, связанных с системой комплемента. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этой и других потребностей.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает, в некоторых аспектах, гуманизированные антитела к фактору Bb, композиции, включающие антитела, способы получения антител и способы применения антител, например, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. Как показывают данные, представленные в настоящей заявке, гуманизированные антитела к фактору Bb по настоящему изобретению обладают аффинностью связывания в два раза большей, чем у исходного антитела. Неожиданно, изначальные попытки гуманизировать исходное мышиное антитело к фактору Bb дали множество вариантов, не обладающих приемлемой аффинностью связывания. Таким образом, для получения гуманизированных вариантов с подходящей аффинностью связывания (например, для лечения комплемент-опосредованных заболеваний или расстройств) требовалось несколько циклов гуманизации. Кроме того, только определенные VH и VL домены можно было объединить для получения антитела, которое связывалось с фактором Bb с приемлемой аффинностью связывания, см., например, антитела, испытанные в Примере 1, Таблица 9.
Некоторые аспекты настоящего изобретения обеспечивают гуманизированное антитело, которое специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека и включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
Другие аспекты настоящего изобретения обеспечивают гуманизированное антитело, которое специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека и включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека с аффинностью от 10-6 до 10-9 M.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело ингибирует активность пути комплемента. В некоторых вариантах осуществления активность пути комплемента представляет собой активность альтернативного пути (AP).
В некоторых вариантах осуществления активность AP комплемента выбрана из группы, состоящей из: AP-опосредованного отложения терминального мамбраноатакующего комплекса (MAC), AP-опосредованного гемолиза, отложения C3 фрагментов на эритроцитах или других типах клеток, C3b/Bb-опосредованного расщепления C3, и C3bBb3b-опосредованного расщепления C5.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой биспецифическое антитело или мультиспецифическое антитело.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело выбрано из группы, состоящей из Ig мономера, Fab фрагмента, F(ab’)2 фрагмента, scFv, scAb и Fv.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело включает константную область тяжелой цепи изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело включает константную область IgG4 или ее вариант.
В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 28-30.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 32-34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 36-38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
Также в настоящей заявке представлены конъюгаты, включающие гуманизированное антитело по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления включенное в конъюгат гуманизированное антитело к фактору Bb включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления включенное в конъюгат гуманизированное антитело к фактору Bb включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления включенное в конъюгат гуманизированное антитело к фактору Bb включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления включенное в конъюгат гуманизированное антитело к фактору Bb включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
Кроме того, в настоящей заявке представлены фармацевтические композиции, включающие гуманизированное антитело, описанное в настоящей заявке, или конъюгат, описанный в настоящей заявке.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает конъюгат, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает конъюгат, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает конъюгат, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает конъюгат, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция также включает фармацевтически приемлемый эксципиент.
Также в настоящей заявке представлены устройства, включающие гуманизированное антитело, описанное в настоящей заявке, конъюгат, описанный в настоящей заявке, или фармацевтическую композицию, описанную в настоящей заявке.
В некоторых вариантах осуществления устройство включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления устройство включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления устройство включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления устройство включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления устройство включает конъюгат, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления устройство включает конъюгат, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления устройство включает конъюгат, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления устройство включает конъюгат, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления устройство включает фармацевтическую композицию, которая включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления устройство включает фармацевтическую композицию, которая включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления устройство включает фармацевтическую композицию, которая включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления устройство включает фармацевтическую композицию, которая включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления устройство представляет собой инъекционное устройство, например, шприц, шприц-ручку или электронное инъекционное устройство (e-Device).
Некоторые другие аспекты настоящего изобретения обеспечивают способы лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, при этом способы включают введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела, описанного в настоящей заявке, конъюгата, описанного в настоящей заявке, или фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства.
В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства.
В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства.
В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества конъюгата, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества конъюгата, который включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства.
В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества конъюгата, который включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества конъюгата, который включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства.
В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства.
В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства.
В некоторых вариантах осуществления комплемент-опосредованное заболевание выбрано из группы, состоящей из: IgA нефропатии (болезнь Бергера), атипичного гемолитического уремического синдрома (aHUS), пароксизмальной ночной гемоглобулинурии (PNH), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (TTP), волчаночного нефрита, ANCA васкулита (васкулита, связанного с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами), мембранозной нефропатии, C3 гломерулонефрита (C3GN), фокально-сегментарного гломерулосклероза (FSGS), рассеянного склероза, макулярной дегенерации, возрастной макулярной дегенерации (AMD), ревматоидного артрита, синдрома антифосфолипидных антител, астмы, ишемически-реперфузионного повреждения, мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита (GN) II типа, спонтанной потери плода, пауци-иммунного васкулита, буллезного эпидермолиза, повторной потери плода и травматического повреждения головного мозга.
Другие аспекты настоящего изобретения обеспечивают способы ингибирования активности пути комплемента у субъекта. В некоторых вариантах осуществления активность пути комплемента представляет собой активность альтернативного пути (AP). В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb, конъюгата, включающего гуманизированное антитело к фактору Bb, или фармацевтической композиции, включающей гуманизированное антитело к фактору Bb, для ингибирования активности пути комплемента.
В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, для ингибирования активности пути комплемента. В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, для ингибирования активности пути комплемента.
В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, для ингибирования активности пути комплемента. В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, для ингибирования активности пути комплемента.
В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества конъюгата, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, для ингибирования активности пути комплемента. В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества конъюгата, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, для ингибирования активности пути комплемента.
В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества конъюгата, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, для ингибирования активности пути комплемента. В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества конъюгата, который включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, для ингибирования активности пути комплемента.
В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, для ингибирования активности пути комплемента. В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, для ингибирования активности пути комплемента.
В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, для ингибирования активности пути комплемента. В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) у субъекта включает введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, для ингибирования активности пути комплемента.
В некоторых вариантах осуществления активность AP комплемента выбрана из группы, состоящей из: AP-опосредованного отложения терминального мамбраноатакующего комплекса (MAC), AP-опосредованного гемолиза, отложения C3 фрагментов на эритроцитах или других типах клеток, C3b/Bb-опосредованного расщепления C3, и C3bBb3b-опосредованного расщепления C5. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет комплемент-опосредованное заболевание или расстройство.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту терапевтического средства.
В некоторых вариантах осуществления введение является внутривенным, подкожным или внутримышечным.
Также в настоящей заявке представлены гуманизированные антитела к фактору Bb для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. Кроме того, в настоящей заявке представлены конъюгаты, включающие гуманизированное антитело к фактору Bb, для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. Также в настоящей заявке представлены фармацевтические композиции, включающие гуманизированное антитело к фактору Bb, для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. А также в настоящей заявке представлены устройства, включающие гуманизированное антитело к фактору Bb, для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления конъюгат для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления конъюгат для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления устройство для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления устройство для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления устройство для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления устройство для применения в способе лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления комплемент-опосредованное заболевание выбрано из группы, состоящей из: IgA нефропатии (болезнь Бергера), атипичного гемолитического уремического синдрома (aHUS), пароксизмальной ночной гемоглобулинурии (PNH), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (TTP), волчаночного нефрита, ANCA васкулита, мембранозной нефропатии, C3 гломерулонефрита (C3GN), фокально-сегментарного гломерулосклероза (FSGS), рассеянного склероза, макулярной дегенерации, возрастной макулярной дегенерации (AMD), ревматоидного артрита, синдрома антифосфолипидных антител, астмы, ишемически-реперфузионного повреждения, мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита II типа, спонтанной потери плода, пауци-иммунного васкулита, буллезного эпидермолиза, повторной потери плода и травматического повреждения головного мозга.
Также в настоящей заявке представлены гуманизированные антитела к фактору Bb для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP). Кроме того, в настоящей заявке представлены конъюгаты, включающие гуманизированное антитело к фактору Bb, для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP). Также в настоящей заявке представлены фармацевтические композиции, включающие гуманизированное антитело к фактору Bb, для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP). Кроме того, в настоящей заявке представлены устройства, включающие гуманизированное антитело к фактору Bb, для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP).
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления конъюгат для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления конъюгат для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления конъюгат для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция для применения в способе ингибирования активности пути комплемента (например, активности AP) включает гуманизированное антитело к фактору Bb, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
Также в настоящей заявке представлены нуклеиновые кислоты или наборы нуклеиновых кислот, кодирующих или совместно кодирующих гуманизированное антитело, описанное в настоящей заявке; векторы или наборы векторов, включающих нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые описаны в настоящей заявке; клетки, экспрессирующие гуманизированное антитело, нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, или вектор или набор векторов, описанные в настоящей заявке.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или набор нуклеиновых кислот кодирует или совместно кодирует гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или набор нуклеиновых кислот кодирует или совместно кодирует гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или набор нуклеиновых кислот кодирует или совместно кодирует гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или набор нуклеиновых кислот кодирует или совместно кодирует гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления вектор или набор векторов включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления вектор или набор векторов включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления вектор или набор векторов включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления вектор или набор векторов включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления клетка включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления клетка включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления клетка включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления клетка включает гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления клетка включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления клетка включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления клетка включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления клетка включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления клетка включает вектор или набор векторов, который включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления клетка включает вектор или набор векторов, который включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления клетка включает вектор или набор векторов, который включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления клетка включает вектор или набор векторов, который включает нуклеиновую кислоту или набор нуклеиновых кислот, которые кодируют или совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего, например, выбранную из группы, состоящей из человеческих эмбриональных клеток почек (HEK), клеток яичников китайского хомячка (CHO), NS0 миеломных клеток, SP2 клеток, COS клеток и эпителиальных клеток молочной железы.
Другие аспекты настоящего изобретения обеспечивают способы получения гуманизированного антитела, описанного в настоящей заявке, при этом способы включают культивирование клетки, описанной в настоящей заявке, для получения гуманизированного антитела. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение гуманизированного антитела.
В некоторых вариантах осуществления способ получения гуманизированного антитела к фактору Bb включает культивирование клетки, которая включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует, или набор нуклеиновых кислот, которые совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, для получения гуманизированного антитела к фактору Bb. В некоторых вариантах осуществления способ получения гуманизированного антитела к фактору Bb включает культивирование клетки, которая включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует, или набор нуклеиновых кислот, которые совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления способ получения гуманизированного антитела к фактору Bb включает культивирование клетки, которая включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует, или набор нуклеиновых кислот, которые совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, для получения гуманизированного антитела к фактору Bb. В некоторых вариантах осуществления способ получения гуманизированного антитела к фактору Bb включает культивирование клетки, которая включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует, или набор нуклеиновых кислот, которые совместно кодируют гуманизированное антитело к фактору Bb, которое включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
Представленное выше краткое описание предназначено для иллюстрации, не ограничивающим образом, некоторых из вариантов осуществления, преимуществ, характерных признаков и применений технологии, раскрытой в настоящей заявке. Другие варианты осуществления, преимущества, характерные признаки и применения технологии, раскрытой в настоящей заявке, будут очевидны из подробного описания изобретения, чертежей, примеров и формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Прилагаемые чертежи не предназначены для представления в масштабе. На чертежах каждый идентичный или почти идентичный компонент, который проиллюстрирован на различных чертежах, представлен под одинаковым символом. Для ясности, не каждый компонент может быть помечен на каждом чертеже. На чертежах:
Фиг. 1A-1D показывают связывание вариантов гуманизированных антител (Группа 1) с фактором комплемента Bb (фактор Bb) с использованием одноцикловой кинетики. Необработанные сенсограммы и подобранные кривые (модель связывания 1:1) показаны для связывания гуманизированных вариантов и контрольных антител с фактором Bb. Кинетический анализ осуществляли на Biacore T200. Каждое антитело захватывали на содержащем Белок А CM5 чипе перед инжекцией увеличивающихся концентраций фактора Bb и определяли индивидуальное значение скорости диссоциации. *Масштабы одинаковы для каждой секции, и x имеет значение от -200 до 1400, а y имеет значение от -5 до 40.
Фиг. 2A-2C показывают связывание гуманизированных вариантов (Группа 2) с фактором Bb с использованием одноцикловой кинетики. Показаны необработанные сенсограммы и подобранные кривые (модель связывания 1:1) для переконструированных вариантов и контрольных антител, связывающихся с фактором Bb. Кинетический анализ осуществляли на Biacore T200. Каждое антитело захватывали на содержащем Белок А CM5 чипе перед инжекцией увеличивающихся концентраций фактора Bb и определяли индивидуальное значение скорости диссоциации.
ФИГ. 3 показывает SDS-PAGE гели Белка A/пост-SEC-очищенных антител. 1 мкг образца каждого восстановленного антитела загружали на NuPage 4-12% Bis-Tris гель (ThermoFisher, Loughborough, UK) и осуществляли эксперимент при 200 В в течение 35 минут. Гели окрашивали InstantBlue (Expedeon, Swavesey, UK). Mk: PAGERuler™ Plus набор предварительно окрашенных маркерных белков (ThermoFisher, Loughborough, UK).
Фиг. 4A-4C показывают связывание лидерных антител (все из Группы 2) с фактором Bb с использованием многоцикловой кинетики. Многоцикловые данные сенсограмм и подобранные кривые (модель связывания 1:1) показаны для гуманизированных вариантов, связывающихся с фактором Bb. (Фиг. 4A: Химерное VH0/Vκ0, VH4/Vκ6; Фиг. 4B: VH4/Vκ7, VH6/Vκ6; Фиг. 4C: VH6/Vκ7, VH7/Vκ7.
Фиг. 5 показывает фактор Bb-конкурентный иммуно-ферментный анализ (ELISA) гуманизированных вариантов против исходного антитела. Серийные разведения анти-фактор Bb вариантов испытывали против фиксированной концентрации мышиного исходного антитела на связывание с фактором Bb. Связанное мышиное антитело определяли с использованием анти-мышиного пероксидазного конъюгата и тетраметилбензидинового (™B) субстрата.
Фиг. 6A-6C показывают активность гуманизированных антител к фактору Bb в анализе WIESLAB® Альтернативного Пути Комплемента (CAP) (Фиг. 6A) и AP-опосредованного гемолиза (Фиг. 6B-6C) с использованием человеческой сыворотки.
Фиг. 7A-7D показывают специфичность лидерных гуманизированных вариантов в отношении активной формы (фактор Bb) человеческого фактора B (Фиг. 7A и 7B) или фактора B яванского макака (Фиг. 7C и 7D), определенную методом поверхностного плазмонного резонанса.
Фиг. 8A-8B показывают специфичность связывания химерного исходного антитела VH0/VK0-IgG4v1 (Фиг. 8A) и репрезентативного гуманизированного вариантного антитела VH6/VK7-IgG4v2 (Фиг. 8B) только с фактором Bb из различных белков комплемента.
Фиг. 9A-9B показывают активность VH6/VK7-IgG4v2 (полученных из клеток HEK) и VH6/VK7-IgG4v2 _CHO (полученных из клеток CHO) (CAP) с использованием нормальной человеческой сыворотки (Фиг. 9A) и сыворотки яванского макака (Фиг. 9B).
Фиг. 10A-10B показывают активность VH6/VK7-IgG4v2 (полученных из HEK) и VH6/VK7-IgG4v2_CHO в анализе WIESLAB® Классического Пути Комплемента (CCP) с использованием нормальной человеческой сыворотки (Фиг. 10A) и сыворотки яванского макака (Фиг. 10B).
Фиг. 11 показывает гемолиз RBC кролика с использованием VH6/VK7-IgG4v2_HEK и VH6/VK7-IgG4v2_CHO в нормальной человеческой сыворотке.
Фиг. 12 показывают аффинность и необработанные многоцикловые данные сенсограмм с подобранными кривыми для VH6/VK7-IgG4v2_CHO(слева) и VH6/VK7-IgG4v2_HEK(справа), связывающихся с с белком Bb человека.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает гуманизированные антитела, которые связываются с белком фактора комплемента Bb. Эти антитела указаны в настоящей заявке как “гуманизированные антитела к фактору Bb”. Настоящее изобретение также обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированные антитела к фактору Bb, композиции, включающие антитела, способы получения антител (например, рекомбинантные способы получения) и способы применения антител, такие как способы лечения (по меньшей мере одного) комплемент-опосредованного заболевания или расстройства.
“Антитело” охватывает антитела или иммуноглобулины любого изотипа, включая, но не ограничиваясь этим, гуманизированные антитела и химерные антитела. Антитело может представлять собой одноцепочечное антитело (scAb) или однодоменное антитело (dAb) (например, однодоменное антитело с тяжелой цепью или однодоменное антитело с легкой цепью; см. Holt et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:484). Термин “антитело” также охватывает фрагменты антител (фрагменты антител), которые сохраняют специфическое связывание с антигеном. “Антитело” также включает одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFvs), которые представляют собой слитые белки вариабельных областей тяжелых (VH) и легких цепей (VL) антител, которые соединены коротким линкерным пептидом, и диатела, которые представляют собой нековалентные димеры scFv фрагментов, которые включают VH и VL, соединенные небольшим пептидным линкером (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)). Другие слитые белки, которые включают антигенсвязывающую часть антитела и не относящийся к антителу белок, также охватываются термином “антитело”.
“Фрагменты антител” включают часть интактного антитела, например, антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают антигенсвязывающий фрагмент (Fab), Fab', F(ab')2, вариабельный Fv фрагмент (Fv), Fd фрагмент и антигенсвязывающий фрагмент химерного антигенного рецептора.
Расщепление антител папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, указанных как "Fab" фрагменты, каждый с одним антигенсвязывающим сайтом, и остаточный "Fc" фрагмент - обозначение, отражающее способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает F(ab')2 фрагмент, который содержит два антигенсвязывающих сайта и по-прежнему способен к перекрестному связыванию с антигеном.
“Fv” представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. Эта область включает димер одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий сайт на поверхности VH-VL димера. Взятые вместе, шесть CDR придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, включающая только три CDR, специфические в отношении антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя с более низкой аффинностью по сравнению с полным сайтом связывания.
“Fab” фрагменты содержат константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab фрагменты отличаются от Fab' фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце CH1 домена тяжелой цепи, включая по меньшей мере один цистеин из шарнирной области антитела. Fab'-SH является обозначением Fab', в котором цистеиновый остаток(остатки) константных доменов содержат свободную тиольную группу. F(ab')2 фрагменты антител первоначально были получены в виде пар Fab' фрагментов, которые содержат шарнирные цистеины между ними. Известны также другие химические связывания фрагментов антител.
“scFv” фрагменты антител включают VH и VL области антитела, где эти области присутствуют в одной полипептидной цепи. В некоторых случаях Fv полипептид дополнительно включает полипептидный линкер между VH и VL областями, что позволяет scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. См. обзор scFv Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
“Диатело” относится к небольшому фрагменту антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, при этом такие фрагменты включают VH, связанную с VL в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы сделать возможным спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела описаны более подробно, например, в Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
Антитело может быть одновалентным или двухвалентным. Антитело может представлять собой Ig мономер, который представляет собой “Y-образную” молекулу, которая состоит из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых цепей и двух легких цепией, соединенных дисульфидными связями.
Антитела могут быть детектируемо мечеными, например, радиоизотопом, ферментом, который образует детектируемый продукт, и/или флуоресцентным белком. Антитела также могут быть конъюгированы с другими фрагментами, такими как члены пар специфического связывания, например, биотиновый член пары специфического связывания биотин-авидин. Антитела также могут быть связаны с твердой подложкой, включая, но не ограничиваясь этим, полистирольные пластины и/или гранулы.
«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано, отделено и/или выделено из компонента его природного окружения (т.е. не встречается в природе). Загрязняющие компоненты его природного окружения представляют собой вещества, которые могут мешать использованию (например, диагностическому или терапевтическому применению) антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых случаях антитело очищают (1) до более чем 90%, более чем 95% или более чем 98% по массе антитела, как определено методом Лоури, например, до более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, с использованием секвенатора с вращающейся чашей, или (3) до гомогенности методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с окрашиванием кумасси синим или серебром. Выделенные антитела охватывают антитела in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не будет присутствовать. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело получают по меньшей мере с использованием одной стадии очистки.
«Моноклональное антитело» представляет собой антитело, продуцируемое группой идентичных клеток, все из которых были получены из одной клетки путем повторяющейся клеточной репликации. То есть клон клеток продуцирует только один вид антител. Хотя моноклональное антитело может быть получено с использованием технологии получения гибридом, также можно использовать другие способы получения, известные специалистам в данной области (например, антитела, полученные из библиотек фагового дисплея антител).
“Определяющая комплементарность область (CDR)” представляет собой несмежные антигенсвязывающие сайты, присутствующие в вариабельной области полипептидов тяжелой и легкой цепей. CDR описаны в Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immunology 27:55; Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); и MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), где определения включают частично совпадающие или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее, предполагается, что применение любого определения, относящегося к CDR антитела или привитых антител или их вариантов находится в пределах объема термина, как определено и используется в настоящей заявке.
В контексте настоящей зааявки термины «CDR-L1», «CDR-L2» и «CDR-L3» относятся соответственно к первой, второй и третьей CDR в вариабельной области легкой цепи. В контексте настоящей зааявки термины «CDR-H1», «CDR-H2» и «CDR-H3» относятся соответственно к первой, второй и третьей CDR в вариабельной области тяжелой цепи. В контексте настоящей заявки термины «CDR-1», «CDR-2» и «CDR-3» относятся соответственно к первой, второй и третьей CDR вариабельной области любой цепи.
Термин «каркас», используемый в отношении вариабельной области антитела, включает все аминокислотные остатки за пределами CDR областей в пределах вариабельной области антитела. Каркас вариабельной области обычно представляет собой прерывистую аминокислотную последовательность, которая включает только те аминокислоты, которые не входят в CDR. «Каркасная область» включает каждый домен каркаса, разделенный CDR областями.
«Гуманизированное антитело» представляет собой антитело, включающее части антител различного происхождения, где по меньшей мере одна часть включает аминокислотные последовательности человеческого происхождения. Например, гуманизированное антитело может включать части, полученные из антитела нечеловеческого происхождения с требуемой специфичностью, такого как мышиное, и из последовательностей антитела человеческого происхождения (например, химерного иммуноглобулина), химически соединенных друг с другом обычными методами (например, синтетическими) или полученных в виде непрерывного полипептида с использованием методов генной инженерии (например, ДНК, кодирующая белковые части химерного антитела, может быть экспрессирована для получения непрерывной полипептидной цепи). Другим примером гуманизированного антитела является антитело, содержащее по меньшей мере одну цепь, включающую CDR, полученную из антитела нечеловеческого происхождения, и каркасную область, полученную из легкой и/или тяжелой цепи человеческого происхождения (например, CDR-привитые антитела с изменением или без изменения каркаса). Химерные или CDR-привитые одноцепочечные антитела также охватываются термином “гуманизированный иммуноглобулин”. См., например, Cabilly et al., патент США № 4816567; Cabilly et al., европейский патент № 0125023 B1; Boss et al., патент США № 4816397; Boss et al., Европейский патент № 0120694 B1; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., европейский патент № 0194276 B1; Winter, патент США № 5225539; Winter, европейский патент № 0239400 B1; Padlan, E.A. et al., европейская патентная заявка № 0519596 A1. См. также Ladner et al., патент США № 4946778; Huston, патент США № 5476786; и Bird, R.E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)), что касается одноцепочечных антител.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело получают с использованием синтетических и/или рекомбинантных нуклеиновых кислот для получения генов (например, кДНК), кодирующих желаемую гуманизированную цепь. Например, последовательности нуклеиновых кислот (например, ДНК), кодирующие гуманизированные вариабельные области, могут быть сконструированы с использованием метода ПЦР мутагенеза для изменения последовательностей ДНК, кодирующих человеческую или гуманизированную цепь, таких как ДНК матрица из ранее гуманизированной вариабельной области (см., например, Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); и Lewis, A. P. и J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). С использованием этих или других подходящих способов также легко можно получить варианты. Например, клонированные вариабельные области могут подвергаться мутагенезу, и могут быть выбраны последовательности, кодирующие варианты с желаемой специфичностью (например, из библиотеки фагов; см., например, Krebber et al., патент США № 5514548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, published Apr. 1, 1993).
Гуманизированные антитела к фактору Bb
Аминокислотные последовательности мышиного моноклонального антитела к фактору Bb, из которых получают гуманизированные антитела к фактору Bb, описанные в настоящей заявке, представлены в Таблице 1. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb включает каркасную область вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи, которые включают последовательности, полученные из каркаса иммуноглобулина человека.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает определяющую комплементарность область тяжелой цепи 1 (CDR-H1), определяющую комплементарность область тяжелой цепи 2 (CDR-H2), и определяющую комплементарность область тяжелой цепи 3 (CDR-H3) вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает определяющую комплементарность область легкой цепи 1 (CDR-L1), определяющую комплементарность область легкой цепи 2 (CDR-L2) и определяющую комплементарность область легкой цепи 3 (CDR-L3) вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb дополнительно включает гуманизированную каркасную область тяжелой цепи и/или гуманизированную каркасную область легкой цепи.
В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с определением Kabat, гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает CDR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и CDR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с определением Kabat, гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb дополнительно включает гуманизированную каркасную область тяжелой цепи и/или гуманизированную каркасную область легкой цепи.
В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с определением IMGT, гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает CDR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и CDR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления, в соответствии с определением IMGT, гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb дополнительно включает гуманизированную каркасную область тяжелой цепи и/или гуманизированную каркасную область легкой цепи.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает VH, содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) по сравнению с VH, представленной в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает VL, содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) по сравнению с VL, представленной в SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает VH, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентична VH, представленной в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает VL, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентична VL, представленной в SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (в соответствии с системой определения Kabat), и содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) в каркасной области по сравнению с VH, представленной в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VL, включающую CDR-L1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-L2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (в соответствии с системой определения Kabat), и CDR-L3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (в соответствии с системой определения Kabat), и содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) в каркасной области по сравнению с VL, представленной в SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (в соответствии с системой определения Kabat), где каркасные области VH в совокупности по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентичны каркасным областям VH, представленной в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VL, включающую CDR-L1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-L2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (в соответствии с системой определения Kabat), и CDR-L3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (в соответствии с системой определения Kabat), где каркасные области VL в совокупности по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентичны каркасным областям VL, представленной в любой из SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (в соответствии системой определения IMGT), CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (в соответствии с системой определения IMGT), и содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) в каркасной области по сравнению с VH, представленной в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VL, включающую CDR-L1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-L2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 (в соответствии с системой определения IMGT), и CDR-L3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (в соответствии с системой определения IMGT), и содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) в каркасной области по сравнению с VL, представленной в SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (в соответствии с системой определения IMGT), где каркасные области VH в совокупности по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентичны каркасным областям VH, представленной в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VL, включающую CDR-L1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-L2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 (в соответствии с системой определения IMGT), и CDR-L3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (в соответствии с системой определения IMGT), где каркасные области VL в совокупности по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентичны каркасным областям VL, представленной в любой из SEQ ID NO: 13.
Примеры аминокислотных последовательностей и кодирующих последовательностей ДНК гуманизированных вариабельных областей тяжелых цепей гуманизированных антител к фактору Bb, описанных в настоящей заявке, представлены в Таблице 2. Примеры аминокислотных последовательностей и кодирующих последовательностей ДНК гуманизированных вариабельных областей легких цепей гуманизированных антител к фактору Bb, описанных в настоящей заявке, представлены в Таблице 3.
Примеры гуманизированных вариабельных областей тяжелой цепи
Примеры гуманизированных вариабельных областей легкой цепи
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (в соответствии с системой определения Kabat), и содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) в каркасной области по сравнению с VH, представленной в любой из SEQ ID NO: 14-20. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VL, включающую CDR-L1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-L2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (в соответствии с системой определения Kabat), и CDR-L3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (в соответствии с системой определения Kabat), и содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) в каркасной области по сравнению с VL, представленной в любой из SEQ ID NO: 21-27.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (в соответствии с системой определения Kabat), где каркасные области VH в совокупности по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентичны каркасным областям VH, представленной в любой из SEQ ID NO: 14-20. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VL, включающую CDR-L1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (в соответствии с системой определения Kabat), CDR-L2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (в соответствии с системой определения Kabat), и CDR-L3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (в соответствии с системой определения Kabat), где каркасные области VL в совокупности по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентичны каркасным областям VL, представленной в любой из SEQ ID NO: 21-27.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (в соответствии с системой определения IMGT), и содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) в каркасной области по сравнению с VH, представленной в любой из SEQ ID NO: 14-20. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VL, включающую CDR-L1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-L2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 (в соответствии с системой определения IMGT), и CDR-L3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (в соответствии с системой определения IMGT), и содержащую не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) в каркасной области по сравнению с VL, представленной в любой из SEQ ID NO: 21-27.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (в соответствии с системой определения IMGT), где каркасная область VH по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентична каркасным областям VH, представленной в любой из SEQ ID NO: 14-20. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VL, включающую CDR-L1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (в соответствии с системой определения IMGT), CDR-L2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 (в соответствии с системой определения IMGT), и CDR-L3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (в соответствии с системой определения IMGT), где каркасные области VL в совокупности по меньшей мере на 80% (например, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентичны каркасным областям VL, представленной в любой из SEQ ID NO: 21-27.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, представленную в любой из SEQ ID NO: 14-20. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VL, представленную в любой из SEQ ID NO: 21-27. Таблица 4 представляет примеры гуманизированных антител к фактору Bb, включающих одну из гуманизированных VH, представленных в Таблице 2, и одну из гуманизированных VL, представленных в Таблице 3.
Примеры вариабельных областей гуманизированных антител к фактору Bb
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKRLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARERPMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 27)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKRLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 17)
DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 26)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKRLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARERPMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 19)
DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 26)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKRLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 17)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 27)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARERPMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 20)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 27)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 14)
DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 21)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 14)
DIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 22)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 14)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 23)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 14)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDVGTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYYCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 24)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 14)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQDVGTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCHQHSSNPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 25)
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению включает гуманизированную VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и гуманизированную VL, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, представляет собой полноразмерный IgG, Ig мономер, Fab фрагмент, F(ab’)2 фрагмент, scFv, scAb или Fv. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, представляет собой полноразмерный IgG. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь любого из гуманизированных антител к фактору Bb, описанных в настоящей заявке, включает константную область тяжелой цепи (CH) или ее часть (например, CH1, CH2, CH3 или их комбинацию). Константная область тяжелой цепи может быть любого подходящего происхождения, например, человека, мыши, крысы или кролика. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи происходит из человеческого IgG (гамма-тяжелой цепи), например IgG1, IgG2 или IgG4.
В некоторых вариантах осуществления могут быть введены мутации в константную область тяжелой цепи любого из гуманизированных антител к фактору Bb, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления одну, две или более мутаций (например, аминокислотных замен) вводят в константную область тяжелой цепи (например, в CH2 домен (остатки 231-340 человеческого IgG1) и/или CH3 домен (остатки 341-447 человеческого IgG1) и/или шарнирную область, при этом нумерация соответствует системе нумерации Kabat (например, EU-индекс по Kabat)) для повышения или снижения аффинности антитела в отношении Fc рецептора (например, активированного Fc рецептора) на поверхности эффекторной клетки. Мутации в Fc области антитела, которые снижают или повышают аффинность антитела к Fc рецептору, и методы введения таких мутаций в Fc рецептор или его фрагмент известны специалистам в данной области. Примеры мутаций в Fc рецепторе антитела, которые можно осуществить для изменения аффинности антитела к Fc рецептору, описаны, например, в Smith P et al., (2012) PNAS 109: 6181-6186, патенте США № 6737056 и международных публикациях №№ WO 02/060919; WO 98/23289; и WO 97/34631, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления одну, две или более мутаций (например, аминокислотных замен) вводят в шарнирную область константной области тяжелой цепи (CH1 домен), чтобы таким образом изменить количество цистеиновых остатков в шарнирной области (например, увеличить или уменьшить), как описано, например, в патенте США № 5677425. Количество цистеиновых остатков в шарнирной области CH1 домена можно изменить, например, для облегчения сборки легкой и тяжелой цепей, или для изменения (например, повышения или снижения) стабильности антитела, или для облегчения конъюгации линкера.
В некоторых вариантах осуществления одну, две или более аминокислотных мутаций (т.е. замен, вставок или делеций) вводят в константный домен IgG или его FcRn-связывающий фрагмент для изменения (например, уменьшения или увеличения) периода полужизни антитела in vivo. В некоторых вариантах осуществления одну или более мутаций вводят в фрагмент Fc или шарнир-Fc домена. Примеры мутаций, которые будут изменять (например, уменьшать или увеличивать) период полужизни антитела in vivo, см., например, в международных публикациях №№ WO 02/060919; WO 98/23289; и WO 97/34631; и патентах США №№ 5869046; 6121022; 6277375; и 6165745.
В некоторых вариантах осуществления константная область антитела, описанного в настоящей заявке, представляет собой константную область IgG1 и включает замену метионина (M) на тирозин (Y) в положении 252, замену серина (S) на треонин (T) в положении 254 и замену треонина (T) на глутаминовую кислоту (E) в положении 256, нумерация указана в соответствии с EU-индексом по Kabat. См. патент США № 7658921, который включен в настоящую заявку посредством ссылки. Было показано, что этот тип мутантного IgG, указанный как "YTE мутант", демонстрирует четырехкратное увеличение периода полужизни по сравнению с вариантами дикого типа того же самого антитела (см. Dall'Acqua W F et al., (2006) J Biol Chem 281: 23514-24). В некоторых вариантах осуществления антитело включает константный домен IgG, включающий одну, две, три или более аминокислотных замен аминокислотных остатков в положениях 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 и 428-436, нумерация указана в соответствии с EU-индексом по Kabat. Дополнительные мутации, которые могут быть введены в константную область тяжелой цепи, которые могут увеличивать период полужизни антитела, известны в данной области техники, например, M428L/N434S (нумерация EU; M459L/N466S нумерация Kabat) мутации, как описано в Zalevsky et al., Nat Biotechnol. 2010 Feb; 28(2): 157-159.
В некоторых вариантах осуществления одну, две или более аминокислотных замен вводят в Fc-область константного домена IgG для изменения эффекторной функции (функций) антитела. Эффекторный лиганд, сродство к которому изменяется, может быть, например, Fc рецептором или C1 компонентом комплемента. Этот подход более подробно описан в патентах США №№ 5624821 и 5648260. В некоторых вариантах осуществления делеция или инактивация (посредством точечных мутаций или других способов) домена константной области может уменьшить связывание циркулирующего антитела с Fc-рецептором, тем самым увеличивая локализацию опухоли. Описание мутаций, которые удаляют или инактивируют константный домен и тем самым увеличивают локализацию опухоли, см., например, в патентах США №№ 5585097 и 8591886. В некоторых вариантах осуществления в Fc-область антитела, описанного в настоящей заявке, может быть введена по меньшей мере одна аминокислотная замена для удаления потенциальных сайтов гликозилирования на Fc-области, что может уменьшить связывание с Fc-рецептором (см., например, Shields R L et al., (2001) J Biol Chem 276: 6591-604).
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна аминокислота в константной области может быть заменена другим аминокислотным остатком, чтобы получить измененное связывание Clq и/или уменьшить или устранить комплементзависимую цитотоксичность (CDC) антитела. Этот подход более подробно описан в патенте США № 6194551 (Idusogie et al.). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один аминокислотный остаток в N-концевой области домена СН2 антитела, описанного в настоящей заявке, изменяют, чтобы изменить способность антитела фиксировать комплемент. Этот подход более подробно описан в международной публикации № WO 94/29351. В некоторых вариантах осуществления Fc-область антитела, описанного в настоящей заявке, модифицируют для повышения способности антитела опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или для повышения аффинности антитела к Fcγ рецептору. Этот подход более подробно описан в международной публикации № WO 00/42072.
В некоторых вариантах осуществления, чтобы избежать потенциальных осложнений из-за обмена Fab-плечами, что, как известно, происходит с нативными mAb IgG4, антитела, представленные в настоящей заявке, могут включать стабилизирующую мутацию ‘Adair’ (Angal S., et al., “A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody”, Mol Immunol 30, 105-108; 1993), где серин 228 (нумерация EU; остаток 241 нумерация Kabat) преобразуют в пролин, что приводит к образованию IgG1-подобной шарнирной последовательности. В некоторых вариантах осуществления для снижения остаточной антителозависимой клеточной цитотоксичности в константную область тяжелой цепи вводят мутацию L235E (нумерация EU, соответствующая L248E в нумерации Kabat), например, как описано в Benhnia et al., JOURNAL OF VIROLOGY, Dec. 2009, p. 12355-12367.
В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи в любом из гуманизированных антител к фактору Bb, описанных в настоящей заявке, представляет собой константную область IgG4 или ее вариант. Примеры константных областей IgG4 и вариантов представлены в Таблице 5.
Примеры константных областей тяжелой цепи
(также обозначается в настоящей заявке как “IgG4wt”)
(также обозначается в настоящей заявке как “IgG4v1”)
(также обозначается в настоящей заявке как “IgG4v2”)
В некоторых вариантах осуществления легкая цепь любого из гуманизированных антител к фактору Bb, описанных в настоящей заявке, может также включать константную область легкой цепи (CL). В некоторых примерах CL представляет собой легкую каппа-цепь. В других примерах CL представляет собой легкую лямбда-цепь. В некоторых вариантах осуществления CL представляет собой легкую каппа-цепь, последовательность которой представлена ниже:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 31)
Другие константные области тяжелой и легкой цепи антитела хорошо известны в данной области техники, например, те, которые представлены в базе данных IMGT (www.imgt.org) или на www.vbase2.org/vbstat.php., оба этих документа включены в настоящую заявку посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает тяжелую цепь, включающую любую из VH, представленных в Таблице 2, или любые их варианты, и константную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 99% идентична любой из SEQ ID NO: 28-30. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает тяжелую цепь, включающую любую из VH, представленных в Таблице 2, или любые их варианты, и константную область тяжелой цепи, которая содержит не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) по сравнению с любой из SEQ ID NO: 28-30. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает тяжелую цепь, включающую любую из VH, представленных в Таблице 2, или любые их варианты, и константную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 28-30.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает легкую цепь, включающую любую из VL, представленных в Таблице 3 или любые их варианты, и константную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает легкую цепь, включающую любую из VL, представленных в Таблице 3, или любые их варианты, и константную область легкой цепи, которая содержит не более чем 20 аминокислотных вариаций (например, не более чем 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной вариации) по сравнению с SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, описанное в настоящей заявке, включает легкую цепь, включающую любую из VL, представленных в Таблице 3, или любые их варианты, и константную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
Примеры аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи гуманизированного антитела к фактору Bb, описанного в настоящей заявке, представлены в Таблице 6.
Примеры тяжелой цепи и легкой цепи гуманизированного антитела к фактору Bb
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKRLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARERPMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 32)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 35)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 35)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 35)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKRLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 36)
DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 39)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKRLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 37)
DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 39)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKRLEWVATISNRGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSSLRSEDTALYYCARERPMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 38)
DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYFCHQHSSNPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 39)
- Выделенные курсивом: VH/VL
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb включает тяжелую цепь, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 32, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb включает тяжелую цепь, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb включает тяжелую цепь, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb включает тяжелую цепь, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 36, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb включает тяжелую цепь, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb включает тяжелую цепь, включающую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению связывается с белком фактора Bb (например, белком фактора Bb млекопитающего, рыбы или беспозвоночного, имеющего систему комплемента). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению связывается с белком фактора Bb млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению связывается с белком фактора Bb человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению связывается с белком фактора Bb, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.
Белок фактора Bb Homo sapiens (SEQ ID NO: 40)
KIVLDPSGSMNIYLVLDGSDSIGASNFTGAKKCLVNLIEKVASYGVKPRYGLVTYATYPKIWVKVSEADSSNADWVTKQLNEINYEDHKLKSGTNTKKALQAVYSMMSWPDDVPPEGWNRTRHVIILMTDGLHNMGGDPITVIDEIRDLLYIGKDRKNPREDYLDVYVFGVGPLVNQVNINALASKKDNEQHVFKVKDMENLEDVFYQMIDESQSLSLCGMVWEHRKGTDYHKQPWQAKISVIRPSKGHESCMGAVVSEYFVLTAAHCFTVDDKEHSIKVSVGGEKRDLEIEVVLFHPNYNINGKKEAGIPEFYDYDVALIKLKNKLKYGQTIRPICLPCTEGTTRALRLPPTTTCQQQKEELLPAQDIKALFVSEEEKKLTRKEVYIKNGDKKGSCERDAQYAPGYDKVKDISEVVTPRFLCTGGVSPYADPNTCRGDSGGPLIVHKRSRFIQVGVISWGVVDVCKNQKRQKQVPAHARDFHINLFQVLPWLKEKLQDEDLGFL
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению связывается белком комплемента Bb с аффинностью около 10-6-10-11 нМ, например, от около 10-6 M до около 10-7 M, от около 10-7 M до около 10-8 M, от около 10-8 M до около 10-9 M, от около 10-9 M до около 10-10M или от около 10-10 M до около 10-11 M. Термины “около” перед числовым значением означают ±10% от указанного числового значения.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению демонстрирует предпочтительное связывание с фактором Bb, по сравнению со связыванием с фактором B. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению связывается с фактором Bb, но по существу не связывается с растворимым фактором B. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению связывается с фактором Bb с аффинностью, которая по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7,5 раза, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 75 раз, или по меньшей мере в 100 раз выше, чем аффинность антитела к фактору B. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению связывается с фактором Bb с аффинностью, которая в 2 раза - 2,5 раза, в 2,5 раза - 5 раз, в 5 раз - 10 раз, в 10 раз - 15 раз, в 15 раз - 20 раз, в 20 раз - 25 раз, в 25 раз - 50 раз, в 50 раз - 75 раз или в 75 раз - 100 раз выше, чем аффинность антитела к фактору B.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует активность пути комплемента по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100%, по сравнению с уровнем активности комплемента в отсутствие гуманизированного антитела к фактору Bb.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует активность альтернативного пути (AP) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% по сравнению с уровнем активностью AP в отсутствие гуманизированного антитела к фактору Bb. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует активность AP с IC50 от 10-7 M до 10-9M, например, IC50 от 10-7 M до 5×10-7 M, от 5×10-7 M до 10-8 M, от 10-8 M до 5×10-8 M или от 5×10-8 M до 10-9M. В некоторых вариантах осуществления активность AP комплемента выбрана из группы, состоящей из AP-опосредованного отложения терминального мамбраноатакующего комплекса (MAC), AP-опосредованного гемолиза, отложения C3 фрагментов на эритроцитах или других типах клеток, C3b/Bb-опосредованного расщепления C3 и C3bBb3b-опосредованного расщепления C5. в некоторых вариантах осуществления ингибирование активности AP комплемента гуманизированными антителами к фактору Bb можно измерить с использованием набора Complement System Alternative Pathway WIESLAB®.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует образование мембраноатакующего комплекса (MAC) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% по сравнению с количеством MAC, образующимся в отсутствие антитела к фактору Bb.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует C3b/Bb-опосредованное расщепление C3. C3b/Bb также известен как “C3 конвертаза”. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует C3b/Bb-опосредованное расщепление C3 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% по сравнению с расщеплением C3 в отсутствие антитела к фактору Bb. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует C3b/Bb-опосредованное расщепление C3 с IC50 от 10-7 M до 10-9 M, например, IC50 от 10-7 M до 5×10-7 M, от 5×10-7 M до 10-8 M, от 10-8 M до 5×10-8 M или от 5×10-8 M до 10-9 M.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует C3b/Bb-опосредованное расщепление C3, таким образом уменьшая продуцирование продукта расщепления C3. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению может ингибировать C3b/Bb-опосредованное расщепление C3, таким образом уменьшая продуцирование продукта расщепления C3 (например, C3a и/или C3b) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% по сравнению с продуцированием продукта расщепления C3 в отсутствие антитела к фактору Bb.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует комплемент AP-опосредованный клеточный лизис по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% по сравнению со степенью клеточного лизиса в отсутствие антитела к фактору Bb. Можно использовать анализ клеточного лизиса для определения степени ингибирования AP-опосредованного клеточного лизиса. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует AP-опосредованный клеточный лизис с IC50 от 10-7 M до 10-9M, например, IC50 от 10-7 M до 5×10-7 M, от 5×10-7 M до 10-8 M, от 10-8 M до 5×10-8 M или от 5×10-8 M до 10-9 M.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует комплемент AP-опосредованный гемолиз по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% по сравнению со степенью гемолиза в отсутствие антитела к фактору Bb. Можно использовать анализ гемолиза эритроцитов (RBC) кролика для определения степени ингибирования AP-опосредованного гемолиза. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует AP-опосредованный гемолиз с IC50 от 10-7 M до 10-9M, например, IC50 от 10-7 M до 5×10-7 M, от 5×10-7 M до 10-8 M, от 10-8 M до 5×10-8 M или от 5×10-8 M до 10-9 M.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует AP-опосредованное отложение C3b, C3d или другого продукта расщепления C3 на клетке или ткани. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению может ингибировать AP-опосредованное отложение C3b, C3d или другого продукта расщепления C3 на клетке или ткани по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% по сравнению с количеством отложения C3b, C3d или другого продукта расщепления C3 на клетке или ткани в отсутствие введения антитела к фактору Bb или до введения антитела к фактору Bb. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует AP-опосредованное отложение C3b, C3d или другого продукта расщепления C3 на клетке или ткани с IC50 от 10-7 M до 10-9 M, например, IC50 от 10-7 M до 5×10-7 M, от 5×10-7 M до 10-8 M, от 10-8 M до 5×10-8 M или от 5×10-8 M до 10-9 M.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует AP-опосредованное C3b отложение на клетке или ткани по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% по сравнению с количеством отложения C3b на клетке или ткани в отсутствие гуманизированного антитела к фактору Bb. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует AP-опосредованное отложение C3b на клетке или ткани с IC50 от 10-7 M до 10-9M, например, IC50 от 10-7 M до 5×10-7 M, от 5×10-7 M до 10-8 M, от 10-8 M до 5×10-8 M или от 5×10-8 M до 10-9 M.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует AP-опосредованное отложение C3b на эритроцитах (RBC) или других типах клеток по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% по сравнению с количеством отложения C3b на RBC в отсутствие гуманизированного антитела к фактору Bb. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует AP-опосредованное отложение C3b на RBC с IC50 от 10-7 M до 10-9 M, например, IC50 от 10-7 M до 5×10-7 M, от 5×10-7 M до 10-8 M, от 10-8 M до 5×10-8 M или от 5×10-8 M до 10-9 M.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению при введении субъекту, нуждающемуся в этом, снижает количество фактора Bb в кровотоке у субъекта. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению при введении субъекту, нуждающемуся в этом, может снижать количество фактора Bb в кровотоке у субъекта по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% по сравнению с количеством фактора Bb в кровотоке у субъекту в отсутствие введения гуманизированного антитела к фактору Bb или по сравнению с количеством фактора Bb в кровотоке у субъекта до введения гуманизированного антитела к фактору Bb.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует C3bBb3b-опосредованное расщепление C5. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению ингибирует C3bBb3b-опосредованное расщепление C5 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% по сравнению с C3bBb3b-опосредованным расщеплением C5 в отсутствие гуманизированного антитела к фактору Bb.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой биспецифическое или мультиспецифическое антитело. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb может представлять собой биспецифическое антитело, включающее первую антигенсвязывающую часть, которая специфически связывается с эпитопом в белке комплемента Bb, и вторую антигенсвязывающую часть, которая связывается со вторым антигеном.
Иммуноконъюгаты
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению конъюгируют с другим агентом с образованием иммуноконъюгата. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb может содержать свободную тиольную (-SH) группу на карбоксильном конце, где свободная тиольная группа может использоваться для присоединения антитела ко второму полипептиду (например, другому антителу, включая гуманизированное антитело к фактору Bb), каркас, носитель и т.д. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb содержит по меньшей мере одну не встречающуюся в природе аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления не кодируемая естественным образом аминокислота включает карбонильную группу, ацетильную группу, аминооксигруппу, гидразиновую группу, гидразидную группу, семикарбазидную группу, азидную группу или алкиновую группу. Что касается подходящих не встречающихся в природе аминокислот, см., например, патент США № 7632924. Включение не встречающейся в природе аминокислоты может обеспечить связывание с полимером, вторым полипептидом, каркасом и т.д. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb, связанное с водорастворимым полимером, может быть получено путем взаимодействия водорастворимого полимера (например, ПЭГ), который включает карбонильную группу, с антителом, где антитело включает не кодируемую естественным образом аминокислоту, которая включает аминоокси, гидразиновую, гидразидную или семикарбазидную группу. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb, связанное с водорастворимым полимером, может быть получено путем взаимодействия антитела, которое включает алкин-содержащую аминокислоту, с водорастворимым полимером (например, ПЭГ), который включает азидную группу. В некоторых вариантах осуществления азидная или алкиновая группа связана с молекулой ПЭГ через амидную связь.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb связано (например, ковалентно связано) с полимером (например, полимером, отличным от полипептида). Подходящие полимеры включают, например, биосовместимые полимеры и водорастворимые биосовместимые полимеры. Подходящие полимеры включают синтетические полимеры и полимеры природного происхождения. Подходящие полимеры могут иметь среднюю молекулярную массу в диапазоне от 500 Да до 50000 Да, например от 5000 Да до 40000 Да или от 25000 до 40000 Да.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb включает «рентгеноконтрастную» метку, например, метку, которую можно легко визуализировать с использованием, например, рентгеновских лучей. Рентгеноконтрастные материалы хорошо известны специалистам в данной области. Наиболее распространенные рентгеноконтрастные материалы включают йодид, бромид или соли бария. Другие рентгеноконтрастные материалы также известны и включают, но не ограничиваются этим, органические производные висмута (см., например, патент США № 5939045), рентгеноконтрастные полиуретаны (см. патент США № 5346981), висмуторганические композиты (см., например, патент США 5256334) и/или рентгеноконтрастные мультимерные комплексы бария (см., например, патент США 4866132).
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb ковалентно связывают со вторым фрагментом (например, липидом, полипептидом, отличным от гуманизированного антитела к фактору Bb, синтетическим полимером и/или углеводом) с использованием, например, глутаральдегида, гомобифункционального сшивающего агента или гетеробифункционального сшивающего агента.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb иммобилизовано на твердой подложке. Подходящие носители хорошо известны в данной области техники и включают, среди прочего, коммерчески доступные материалы для колонок, полистирольные шарики, латексные шарики, магнитные шарики, частицы коллоидных металлов, стеклянные и/или кремниевые чипы и поверхности, нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, дурациты, лунки реакционных планшетов (например, многолуночные планшеты), пластиковые пробирки и т.д. Твердая подложка может включать любое из множества веществ, включая, например, стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, природную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, агарозу и магнетит. Подходящие способы иммобилизации гуманизированного антитела к фактору Bb на твердой подложке хорошо известны и включают, но не ограничиваются этим, ионные, гидрофобные и/или ковалентные взаимодействия. Твердые подложки могут быть растворимыми или нерастворимыми, например, в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления подходящая твердая подложка обычно нерастворима в водном растворе.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb содержит детектируемую метку. Подходящие детектируемые метки включают любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими способами. Подходящие включают, но не ограничиваются этим, магнитные шарики (например, DYNABEADS™), флуоресцентные красители (например, флуоресцеин изотиоцианат, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок и/или желтый флуоресцентный белок), радиоактивные метки (например, 3H, 125I, 35S, 14C или 32P), ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, люциферазу и другие, обычно используемые в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA)) и колориметрические метки, такие как коллоидные золотые или цветные стеклянные или пластиковые (например, полистирольные, полипропиленовые, латексные и т.д.) шарики.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb включает контрастное вещество или радиоизотоп, где контрастное вещество или радиоизотоп является подходящим для использования в визуализации, например, в процедурах визуализации, осуществляемых на людях. Неограничивающие примеры меток включают радиоизотопы, такие как 123I (йод), 18F (фтор), 99Tc (технеций), 111In (индий) и 67Ga (галлий), и контрастные вещества, такие как гадолиний (Gd), диспрозий и железо. Радиоактивные изотопы Gd (153Gd) также доступны и подходят для процедур визуализации у млекопитающих, отличных от человека. Можно осуществить мечение гуманизированного антитела к фактору Bb стандартными способами. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb можно йодировать с использованием хлорамина Т или 1,3,4,6-тетрахлор-3α,6α-дифенилгликоурила. Для фторирования к гуманизированному антителу к фактору Bb добавляют фтор во время синтеза посредством реакции замещения фторид-иона. Обзор синтеза белков с такими радиоизотопами см. в Muller-Gartner, H., TIB Tech., 16:122-130 (1998) и Saji, H., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 16(2):209-244 (1999). Также можно осуществить мечение гуманизированного антитела к фактору Bb контрастным веществом, используя стандартные способы. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb может быть помечено Gd путем конъюгации с антителом низкомолекулярных хелатов Gd, таких как Gd-диэтилентриаминпентауксусная кислота (GdDTPA) или Gd-тетраазациклододекантетрауксусная кислота (GdDOTA). См. Caravan et al., Chem. Rev. 99:2293-2352 (1999) и Lauffer et al., J. Magn. Reson. Imaging, 3:11-16 (1985). Гуманизированное антитело к фактору Bb можно пометить Gd, например, путем конъюгации хелатов полилизин-Gd с антителом. См., например, Curtet et al., Invest. Radiol., 33(10):752-761 (1998). Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb можно пометить Gd путем инкубации парамагнитных полимеризованных липосом, которые включают Gd хелаторный липид, с авидином и биотинилированным антителом. См., например, Sipkins et al., Nature Med., 4:623-626 (1998).
Подходящие флуоресцентные белки включают, но не ограничиваются этим, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или его варианты, синий флуоресцентный вариант GFP (BFP), голубой флуоресцентный вариант GFP (CFP), желтый флуоресцентный вариант GFP (YFP), усиленный GFP (EGFP), усиленный CFP (ECFP), усиленный YFP (EYFP), GFPS65T, Emerald, Topaz (TYFP), Venus, Citrine, mCitrine, GFPuv, дестабилизированный EGFP (dEGFP), дестабилизированный ECFP (dECFP), дестабилизированный EYFP (dEYFP), mCFPm, Cerulean, T-Sapphire, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-мономер, J-Red, димер2, t-димер2(12), mRFP1, поциллопорин, Renilla GFP, Monster GFP, paGFP, белок Kaede и киндлинговый белок, фикобилипротеины и конъюгаты фикобилипротеинов, включая B-фикоэритрин, R-фикоэритрин и аллофикоцианин. Другие примеры флуоресцентных белков включают mHoneydew, mBanana, mOrange, dTomato, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrape1, mRaspberry, mGrape2 и/или mPlum (Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909). Любой из множества флуоресцентных и окрашенных белков из видов Anthozoan, как описано, например, в Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973, является подходящим для использования.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb конъюгируют с лекарственным средством. Любое из описанных гуманизированных антител к фактору Bb можно использовать для образования конъюгата антитело-лекарственное средство. Такое средство может быть присоединено к N-концу легкой цепи, С-концу легкой цепи, N-концу тяжелой цепи или С-концу тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство присоединено к шарниру антитела или по меньшей мере к одному другому сайту антитела. Для одноцепочечного антитела лекарственное средство может быть присоединено к N- или С-концу одноцепочечного антитела. Лекарственное средство может быть конъюгировано с антителом непосредственно или через линкер с использованием методов, известных специалистам в данной области. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Примеры таких лекарственных средств (например, для применения в терапии) известны специалистам в данной области.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb связано (например, ковалентно или нековалентно) с партнером по слиянию, например, с лигандом; эпитопной меткой; пептидом; и/или белком, отличным от антитела. Подходящие партнеры по слиянию включают пептиды и полипептиды, которые придают повышенную стабильность in vivo (например, увеличенный период полужизни в сыворотке); обеспечивают легкость очистки, например, (His)n, например 6His; обеспечивают секрецию слитого белка из клетки; обеспечивают эпитопную метку, например, GST, гемагглютинин (HA; например, YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 55), FLAG (например, DYKDDDDK; SEQ ID NO: 56) и/или c-myc (например, EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 57); обеспечивают детектируемый сигнал, например, фермент, который генерирует детектируемый продукт (например, β-галактозидаза, люцифераза), или белок, который сам является детектируемым, например, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок и т.д.; и/или обеспечивают мультимеризацию, например, домен мультимеризации, такой как Fc-фрагмент иммуноглобулина. Слияние также может включать аффинный домен, включая пептидные последовательности, которые могут взаимодействовать с партнером по связыванию, например, таким, как иммобилизованный на твердой подложке, полезный для идентификации или очистки. Последовательные отдельные аминокислоты, такие как гистидин, при слиянии с белком можно использовать для одностадийной очистки слитого белка путем высокоаффинного связывания с колонкой со смолой, такой как никелевая сефароза. Примеры аффинных доменов включают His5 (HHHHH) (SEQ ID NO: 58), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO:59), C-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO:60), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:61), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO:62), гемагглютинин, например, HA Tag (YPYDVPDYA; SEQ ID NO:63), глутатинон-S-трансферазу (GST), тиоредоксин, целлюлоза-связывающий домен, RYIRS (SEQ ID NO:66), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO:64), хитин-связывающий домен, S-пептид, пептид T7, домен SH2, C-концевую РНК-метку, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO:65), металл-связывающие домены, например цинк-связывающие домены или кальций-связывающие домены, такие как домены из кальций-связывающих белков, например, кальмодулина, тропонина С, кальциневрина В, легкой цепи миозина, рековерина, S-модулина, визинина, VILIP, нейрокальцина, гиппокальцина, фрекенина, кальтрактина, большой субъединицы кальпаина, белков S100, парвальбумина, калбиндина D9K, калбиндина D28K и калретинина, интеины, биотин, стрептавидин, MyoD, последовательности лейциновой молнии и белок, связывающий мальтозу.
Способы получения гуманизированных антител к фактору Bb
В некоторых вариантах осуществления полностью человеческие антитела могут быть получены с использованием коммерчески доступных генно-модифицированных мышей, предназначенных для экспрессии специфических белков человеческого иммуноглобулина. Трансгенные животные, предназначенные для получения более желательного (например, полностью человеческих антител) или более сильного иммунного ответа, также могут быть использованы для получения гуманизированных или человеческих антител. Примерами такой технологии являются XenomouseR™ от Amgen, Inc. (Fremont, CA) и HuMAb-MouseR™ и TC Mouse™ от Medarex, Inc. (Princeton, NJ) или мыши H2L2 от Harbour Antibodies BV (Holland). В другом варианте антитела могут быть получены рекомбинантно с использованием метода фагового дисплея или дрожжевой технологии. См., например, патенты США №№ 5565332; 5580717; 5733743; и 6265150; и Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455. Альтернативно, можно использовать метод фагового дисплея (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553) для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из репертуара генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина от неиммунизированных доноров.
Антигенсвязывающие фрагменты интактного антитела (полноразмерного антитела) можно получить обычными способами. Например, F(ab')2-фрагменты могут быть получены расщеплением пепсином молекулы антитела, а Fab-фрагменты могут быть получены путем восстановления дисульфидных мостиков F(ab')2-фрагментов. Генно-инженерные антитела, такие как гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела и биспецифические антитела, могут быть получены, например, с использованием обычной рекомбинантной технологии. В одном примере ДНК, кодирующую моноклональные антитела, специфические в отношении антигена-мишени, можно легко выделить и секвенировать с использованием обычных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Гибридомные клетки служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК можно поместить по меньшей мере в один вектор экспрессии, который затем транфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки Escherichia coli (E. coli), обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HEK293 человека или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина, для синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. См., например, публикацию РСТ № WO 87/04462. Затем ДНК можно модифицировать, например, путем использования последовательности, кодирующей константные домены тяжелой и легкой цепей человека, для замены гомологичных мышиных последовательностей, Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, или путем ковалентного связывания с кодирующей иммуноглобулин последовательностью всей или части последовательности, кодирующей неиммуноглобулиновый полипептид. Таким образом, можно получить генетически модифицированные антитела, такие как «химерные» или «гибридные» антитела, которые обладают специфичностью связывания антигена-мишени.
Одноцепочечное антитело можно получить с использованием рекомбинантной технологии, например, путем связывания нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, и нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления между двумя вариабельными областями включен гибкий линкер.
Альтернативно, методы, описанные для получения одноцепочечных антител (патенты США №№ 4946778 и 4704692), можно адаптировать, например, для получения фаговой или дрожжевой библиотеки scFv, и клоны scFv, специфические в отношении фактора Bb, можно идентифицировать из библиотеки в соответствии с обычной процедурой. Положительные клоны можно подвергнуть дальнейшему скринингу для выявления тех из них, которые обладают высокой аффинностью связывания с фактором Bb.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb получают с использованием рекомбинантной технологии, как показано ниже. Нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела к фактору Bb, как описано в настоящей заявке, могут быть клонированы в один вектор экспрессии, при этом каждая нуклеотидная последовательность функционально связана с подходящим промотором. В одном примере каждая из нуклеотидных последовательностей, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь, функционально связана с отдельным промотором. Альтернативно, нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, могут быть функционально связаны с одним промотором, так что и тяжелая, и легкая цепи экспрессируются с одного и того же промотора. При необходимости сайт внутренней посадки рибосомы (IRES) может быть встроен между последовательностями, кодирующими тяжелую цепь и легкую цепь.
В некоторых примерах нуклеотидные последовательности, кодирующие две цепи антитела, клонируют в два вектора, которые могут быть введены в одни и те же или разные клетки. Когда две цепи экспрессируются в разных клетках, каждую из них можно выделить из клеток-хозяев, экспрессирующих их, и выделенные тяжелые цепи и легкие цепи можно смешать и инкубировать в подходящих условиях, обеспечивающих образование антитела.
Как правило, нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую одну или все цепи антитела, можно клонировать в подходящий вектор экспрессии в функциональной связи с подходящим промотором с использованием методов, известных в данной области. Например, нуклеотидная последовательность и вектор могут контактировать в подходящих условиях с рестрикционным ферментом для создания комплементарных концов на каждой молекуле, которые могут спариваться друг с другом и соединяться вместе лигазой. Альтернативно, синтетические нуклеиновокислотные линкеры могут быть лигированы с концами гена. Эти синтетические линкеры содержат последовательности нуклеиновых кислот, которые соответствуют конкретному сайту рестрикции в векторе. Выбор векторов экспрессии/промоторов будет зависеть от типа клеток-хозяев, используемых для получения антител.
Для экспрессии описанных в настоящей заявке антител можно использовать различные промоторы, включая, но не ограничиваясь этим, промежуточный ранний промотор цитомегаловируса (CMV), вирусный LTR, такой как LTR вируса саркомы Рауса, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, ранний промотор обезьяньего вируса 40 (SV40), промотор lac UV E. coli и промотор вируса простого герпеса tk.
Можно также использовать регулируемые промоторы. Такие регулируемые промоторы включают промоторы, использующие репрессор lac из E.coli в качестве модулятора транскрипции для регуляции транскрипции с промоторов клеток млекопитающих, несущих оператор lac [Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)], тетрациклиновый репрессор (tetR) [Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-555115 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]. Другие системы включают FK506 димер, VP16 или p65 с использованием астрадиола, RU486, дифенола мурислерона или рапамицина. Индуцибельные системы доступны от Invitrogen, Clontech и Ariad, среди прочих.
Можно использовать регулируемые промоторы, которые включают репрессор с опероном. В одном варианте осуществления lac-репрессор из E. coli может действовать как модулятор транскрипции для регуляции транскрипции с промоторов клеток млекопитающих, несущих lac-оператор [M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)]; Gossen and Bujard (1992); [M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551(1992)] объединили тетрациклиновый репрессор (tetR) с активатором транскрипции (VP 16) для создания слитого белка tetR-активатора транскрипции клеток млекопитающих, tTa (tetR-VP16), с tetO, несущим минимальный промотор, полученный из промотора цитомегаловируса человека (hCMV), для создания операторной системы tetR-tet для контроля экспрессии генов в клетках млекопитающих. В одном варианте осуществления используется тетрациклин-индуцируемый переключатель. Тетрациклиновый репрессор (tetR) сам по себе, а не слитые производные tetR-транскрипционного фактора клеток млекопитающих, может функционировать как сильный трансмодулятор для регуляции экспрессии генов в клетках млекопитающих, когда тетрациклиновый оператор правильно расположен на пути ниже от элемента TATA промотора CMVIE. (Yao et al., Human Gene Therapy). Одним конкретным преимуществом этого тетрациклин-индуцируемого переключателя является то, что он не требует использования тетрациклинового репрессора-трансактиватора клеток млекопитающих или слитого белка-репрессора, что в некоторых случаях может быть токсичным для клеток (Gossen 5 et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 92:6522-6526 (1995)), для достижения его регулируемых эффектов.
Кроме того, вектор может содержать, например, некоторые или все из следующего: селективный маркерный ген, такой как ген неомицина, для селекции стабильных или транзиторных трансфектантов в клетках млекопитающих; энхансерные/промоторные последовательности из непосредственно раннего гена CMV человека для высоких уровней транскрипции; сигналы терминации транскрипции и процессинга РНК от SV40 для стабильности мРНК; точки начала репликации полиомы SV40 и ColE1 для правильной репликации эписомы; внутренние сайты связывания рибосом (IRES), универсальные сайты множественного клонирования; и РНК промоторы Т7 и SP6 для транскрипции смысловой и антисмысловой РНК in vitro. Подходящие векторы и способы получения векторов, содержащих трансгены, хорошо известны и доступны в данной области. Примеры сигналов полиаденилирования, полезных для использования на практике описанных в настоящей заявке способов, включают, но не ограничиваются этим, сигнал полиаденилирования коллагена I человека, сигнал полиаденилирования коллагена II человека и сигнал полиаденилирования SV40.
По меньшей мере один вектор (например, векторы экспрессии), включающий нуклеиновые кислоты, кодирующие любое из антител, можно ввести в подходящие клетки-хозяева для получения антител. Клетки-хозяева можно культивировать в подходящих условиях для экспрессии антитела или любой его полипептидной цепи. Такие антитела или их полипептидные цепи могут быть выделены с использованием культивируемых клеток (например, из клеток или культурального супернатанта) обычным методом, например, методом аффинной очистки. При необходимости полипептидные цепи антитела можно инкубировать в подходящих условиях в течение подходящего периода времени, обеспечивающих продуцирование антитела.
В некоторых вариантах осуществления способы получения антитела, описанного в настоящей заявке, включают рекомбинантный вектор экспрессии, который кодирует как тяжелую цепь, так и легкую цепь антитела к фактору Bb, как также описано в настоящей заявке. Рекомбинантный вектор экспрессии можно ввести в подходящую клетку-хозяина (например, в дигидрофолатредуктаза (DHFR)-CHO клетку) обычным методом, например, методом трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. Положительные трансформированные клетки-хозяева могут быть отобраны и культивированы в подходящих условиях, обеспечивающих экспрессию двух полипептидных цепей, образующих антитело, которое можно выделить из клеток или из культуральной среды. При необходимости две цепи, выделенные из клеток-хозяев, можно инкубировать в подходящих условиях, обеспечивающих образование антитела.
В некоторых вариантах осуществления предусмотрены два рекомбинантных вектора экспрессии, один из которых кодирует тяжелую цепь антитела к фактору Bb, а другой кодирует легкую цепь антитела к фактору Bb. Оба из двух рекомбинантных векторов экспрессии можно ввести в подходящую клетку-хозяина (например, клетку DHFR-CHO) обычным методом, например, методом трансфекции, опосредованной фосфатом кальция.
Альтернативно, каждый из векторов экспрессии можно ввести в подходящие клетки-хозяева. Положительные трансформанты могут быть отобраны и культивированы в подходящих условиях, обеспечивающих экспрессию полипептидных цепей антитела. Когда два вектора экспрессии вводят в одни и те же клетки-хозяева, продуцируемое в них антитело можно выделить из клеток-хозяев или из культуральной среды. При необходимости полипептидные цепи можно выделить из клеток-хозяев или из культуральной среды, а затем инкубировать в подходящих условиях, обеспечивающих образование антитела. Когда два вектора экспрессии вводят в разные клетки-хозяева, каждая из них может быть выделена из соответствующих клеток-хозяев или из соответствующих культуральных сред. Затем две полипептидные цепи можно инкубировать в подходящих условиях для образования антитела.
Стандартные методы молекулярной биологии используют для получения рекомбинантного вектора экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антител из культуральной среды. Например, некоторые антитела можно выделить методом аффинной хроматографии с матрицей, связанной с белком A или белком G.
Любая из нуклеиновых кислот, кодирующая тяжелую цепь, легкую цепь или обе цепи антитела к фактору Bb, описанного в настоящей заявке (например, как представлено в Таблицах 2 и 3), содержащие их векторы (например, векторы экспрессии); и клетки-хозяева, включающие векторы, входят в объем настоящего изобретения.
Фармацевтические композиции и способы лечения
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие любое из гуманизированных антител к фактору Bb, описанных в настоящей заявке. Как правило, фармацевтическая композиция, также называемая в настоящей заявке составом, включает эффективное количество любого из гуманизированных антител к фактору Bb, описанных в настоящей заявке. «Эффективное количество» означает дозу, достаточную для получения желаемого результата, например, уменьшения неблагоприятного симптома, связанного с комплемент-опосредованным заболеванием или расстройством, ослабление симптома комплемент-опосредованного заболевания или расстройства, замедление прогрессирования комплемент-опосредованного заболевания или расстройства и т.д. Как правило, желательным результатом является по меньшей мере уменьшение симптома комплемент-опосредованного заболевания или расстройства по сравнению с контролем.
В способе по настоящему изобретению гуманизированное антитело к фактору Bb можно вводить субъекту с использованием подходящих средств, способных привести к желаемому терапевтическому эффекту или диагностическому эффекту. Таким образом, гуманизированное антитело к фактору Bb может быть включено в различные композиции для терапевтического введения. Более конкретно, гуманизированное антитело к фактору Bb можно сформулировать в фармацевтические композиции путем объединения с соответствующими фармацевтически приемлемыми носителями, фармацевтически приемлемыми разбавителями или другими фармацевтически приемлемыми эксципиентами. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает гуманизированное антитело к фактору Bb и фармацевтически приемлемый эксципиент.
В фармацевтических дозированных формах гуманизированные антитела к фактору Bb можно вводить в виде их фармацевтически приемлемых солей, или их также можно использовать отдельно или в соответствующей ассоциации, а также в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями. Следующие способы и эксципиенты являются только иллюстративными и никоим образом не ограничивающими.
Для пероральных препаратов гуманизированное антитело к фактору Bb можно использовать отдельно или в комбинации с соответствующими добавками для изготовления таблеток, порошков, гранул или капсул.
Гуманизированное антитело к фактору Bb можно сформулировать в препараты для инъекций путем растворения, суспендирования или эмульгирования антитела в водном или неводном растворителе; и, если желательно, с использованием обычных добавок, таких как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы и консерванты.
Фармацевтические композиции, включающие гуманизированное антитело к фактору Bb, получают путем смешивания гуманизированного антитела к фактору Bb, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, другими эксципиентами, стабилизаторами, поверхностно-активными веществами, буферами и/или регуляторами тоничности. Приемлемые носители, другие эксципиенты и/или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях. В некоторых вариантах осуществления композиции включают буфер, антиоксидант, аминокислоту или их комбинацию.
Фармацевтическая композиция может быть в жидкой форме, лиофилизированной форме или жидкой форме, восстановленной из лиофилизированной формы, при этом лиофилизированный препарат должен быть восстановлен стерильным раствором перед введением. Стандартная процедура восстановления лиофилизированной композиции заключается в добавлении объема чистой воды (обычно эквивалентного объему, удаляемому во время лиофилизации); однако растворы, включающие антибактериальные агенты, можно использовать для получения фармацевтических композиций для парентерального введения; см. также Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54.
Регулятор тоничности можно включить в композицию антитела для модулирования тоничности композиции. В некоторых вариантах осуществления водная композиция является изотонической, хотя гипертонические или гипотонические растворы могут быть подходящими. Термин «изотонический» означает раствор, обладающий такой же тоничностью, как и какой-либо другой раствор, с которым его сравнивают, например, физиологический солевой раствор или сыворотка.
Поверхностно-активное вещество также можно добавить к композиции антитела для снижения агрегации содержащегося в композиции антитела и/или сведения к минимуму образования частиц в композиции и/или уменьшения адсорбции.
Также можно добавить лиопротектор для защиты лабильного активного ингредиента (например, белка) от дестабилизирующих условий во время процесса лиофилизации.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая композиция включает гуманизированное антитело к фактору Bb и по меньшей мере одно из указанных выше веществ (например, поверхностно-активное вещество, буфер, стабилизатор, регулятор тоничности) и по существу не содержит почти ни одного консерванта.
Гуманизированное антитело к фактору Bb можно использовать в виде аэрозоля для введения посредством ингаляции. Гуманизированное антитело к фактору Bb можно сформулировать в композицию с приемлемыми пропеллентами под давлением.
Кроме того, гуманизированное антитело к фактору Bb может быть в форме суппозитория, который получают путем смешивания с различными основами, такими как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Гуманизированное антитело к фактору Bb можно вводить ректально через суппозиторий.
Другие способы введения также найдут применение в способе по настоящему изобретению. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb может быть сформулировано в виде суппозиториев и, в некоторых вариантах осуществления, в виде аэрозольных и интраназальных композиций. Для суппозиториев композиция носителя может включать традиционные связующие вещества и носители.
Интраназальные композиции обычно включают носители, которые не вызывают раздражения слизистой оболочки носа и существенно не нарушают функцию ресничек. Можно использовать разбавители, такие как вода, водный раствор соли или другие известные вещества. Назальные композиции также могут содержать консервант. Поверхностно-активное вещество может присутствовать для усиления абсорбции гуманизированного антитела к фактору Bb слизистой оболочкой носа.
Гуманизированное антитело к фактору Bb можно вводить в виде композиции для инъекций. Обычно композиции для инъекций получают в виде жидких растворов или суспензий; также могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат также может быть эмульгирован, или антитело может быть инкапсулировано в липосомальный носитель.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb формулируют в виде композиции с контролируемым высвобождением. Контролируемое высвобождение в рамках настоящего изобретения может означать любую из ряда лекарственных форм с пролонгированным высвобождением.
Гуманизированное антитело к фактору Bb вводят субъекту с использованием способа и пути, подходящих для доставки лекарственного средства, включая способы in vivo и ex vivo, а также системные и локальные пути введения.
Обычные и фармацевтически приемлемые способы введения включают, но не ограничиваются этим, интраназальный, внутримышечный, интратрахеальный, интратекальный, интракраниальный, подкожный, внутрикожный, местный, внутривенный, интраперитонеальный, интраартериальный (например, через сонную артерию), доставку в спинной или головной мозг, ректальный, назальный, пероральный и другие энтеральные и парентеральные пути введения.
Антитело по настоящему изобретению можно вводить субъекту с использованием любых доступных общепринятых способов и путей, подходящих для доставки обычных лекарственных средств, включая системные или локальные пути. Как правило, способы введения, предусматриваемые настоящим изобретением, включают, но не обязательно ограничиваются этим, энтеральный, парентеральный или ингаляционный пути.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb вводят путем инъекции и/или доставки, например, в участок артерии головного мозга или непосредственно в ткань головного мозга. Гуманизированное антитело к фактору Bb также можно вводить непосредственно в участок-мишень, например, путем биолистической доставки в участок-мишень.
Способы, представленные в настоящей заявке, можно использовать для лечения самых разных субъектов. Как правило, такими субъектами являются «млекопитающие», где этот термин широко используется для описания организмов, принадлежащих к классу млекопитающих, включая отряды хищников (например, кошки), травоядных (например, крупный рогатый скот, лошади и овцы), всеядных (например, собаки, козы и свиньи), грызунов (например, мыши, морские свинки и крысы) и приматов (например, человек, шимпанзе и обезьяны). В некоторых вариантах осуществления субъект имеет систему комплемента, например, млекопитающие, рыбы или беспозвоночные. В некоторых вариантах осуществления субъектом является имеющее систему комплемента млекопитающее, рыба или беспозвоночное животное-компаньон, сельскохозяйственное животное, рабочее животное, животное зоопарка или лабораторное животное. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек.
«Лечение» относится по меньшей мере к облегчению симптомов, связанных с патологическим состоянием, поражающим субъекта, где улучшение используется в широком смысле для обозначения по меньшей мере уменьшения величины параметра, например, симптома, связанного с патологическим состоянием, подлежащим лечению, например, комплемент-опосредованным заболеванием или расстройством. Таким образом, лечение также включает ситуации, когда патологическое состояние или по меньшей мере связанные с ним симптомы и/или вторичные эффекты полностью подавляются, например, предотвращаются или прекращаются, например прекращаются, так что субъект больше не страдает от патологического состояния или, по меньшей мере, от симптомов, характеризующих патологическое состояние.
В некоторых вариантах осуществления «субъект» представляет собой млекопитающее, включая, но не ограничиваясь этим, мышиных (крыс, мышей), не относящихся к человеку приматов, людей, псовых, кошачьих, копытных (например, лошадей, крупный рогатый скот, овец, свиней, коз) и т.д. Эти термины также охватывают любое животное, имеющее систему комплемента, такое как млекопитающие, рыбы и некоторые беспозвоночные. Таким образом, эти термины включают имеющих систему комплемента млекопитающих, рыб и беспозвоночных животных-компаньонов, сельскохозяйственных животных, рабочих животных, животных зоопарка и лабораторных животных.
«Биологический образец» включает различные типы образцов, полученных от субъекта, и может использоваться в диагностическом анализе или мониторинге. Определение охватывает кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, образцы твердых тканей, такие как образец биопсии, культуры тканей или клетки, полученные из них, и их потомство. Это определение также включает образцы, которые подвергались каким-либо манипуляциям после их получения, например, путем обработки реагентами, солюбилизации или обогащения определенными компонентами, такими как полинуклеотиды. Термин «биологический образец» охватывает клинический образец, а также включает клетки в культуре, клеточные супернатанты, клеточные лизаты, сыворотку, плазму, биологическую жидкость и образцы тканей. Термин «биологический образец» включает мочу, слюну, спинномозговую жидкость, интерстициальную жидкость, глазную жидкость, синовиальную жидкость и/или фракции крови, такие как плазма и сыворотка. Термин «биологический образец» также включает образцы твердых тканей, образцы тканевых культур и клеточные образцы.
Настоящее изобретение обеспечивает устройство или контейнер, подходящие для содержания композиции, включающей гуманизированное антитело к фактору Bb, для введения субъекту. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb может быть помещено в контейнер, подходящий для фармацевтической композиции. Контейнером может быть, например, флакон (например, с укупорочным устройством, таким как колпачок), блистерная упаковка (например, которая может предусматривать включение по меньшей мере одной дозы на блистер), пузырек, гибкая упаковка (например, герметичные майларовые или пластиковые пакеты), ампула (для разовых доз в растворе), пипетка, шприц, тонкая пленка и/или тюбик. В некоторых вариантах осуществления контейнер, такой как стерильный контейнер, включает рассматриваемую фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой флакон или шприц. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой флакон. В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой шприц. В некоторых вариантах осуществления устройство представляет собой устройство для инъекций, такое как шприц (например, предварительно заполненный шприц), шприц-ручка (например, предварительно заполненный шприц-ручка) или электронное устройство для инъекций (e-Devices).
В настоящем изобретении предложены способы лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства. Способы, как правило, включают введение эффективного количества гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления введение гуманизированного антитела к фактору Bb модулирует активность пути комплемента в клетке, ткани или жидкости субъекта и лечит комплемент-опосредованное заболевание или расстройство.
«Эффективное количество» относится к количеству антитела к фактору комплемента Bb, которое при введении млекопитающему или другому субъекту для лечения заболевания является достаточным для осуществления такого лечения заболевания. «Терапевтически эффективное количество» будет варьироваться в зависимости от антитела к комплементу Bb, заболевания и его тяжести, а также возраста, массы тела и т.д. субъекта, подлежащего лечению.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования активности пути комплемента в клетке, ткани или жидкости субъекта.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования образования MAC в клетке, ткани или жидкости субъекта.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования C3b/Bb-опосредованного расщепления C3 в клетке, ткани или жидкости субъекта.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования C3b/Bb-опосредованного расщепления C3, и уменьшения таким образом образования продукта расщепления C3.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования комплемент AP-опосредованного лизиса в клетке у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования комплемент AP-опосредованного гемолиза в клетке, ткани или жидкости (например, RBC-содержащей жидкости) субъекта.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования продукции анафилатоксина.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования AP-опосредованного отложения C3b, C3d или другого продукта расщепления C3 на клетке или ткани у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования AP-опосредованного отложения C3b на клетке или ткани у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования AP-опосредованного отложения C3b, C3d или другого продукта расщепления C3 на RBC клетках у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению представляет собой количество, которое является эффективным для снижения или ингибирования AP-опосредованного отложения C3b на RBC клетках у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению, при введении по меньшей мере в одной дозе субъекту, нуждающемуся в этом, уменьшает количество фактора Bb в кровотоке у субъекта. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению, при введении по меньшей мере одной дозы субъекту, нуждающемуся в этом, может уменьшать количество фактора Bb в кровотоке у субъекта по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% по сравнению с количеством фактора Bb в кровотоке у субъекта в отсутствие введения гуманизированного антитела к фактору Bb или по сравнению с количеством фактора Bb в кровотоке у субъекта до введения гуманизированного антитела к фактору Bb.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению, при введении в по меньшей мере одной дозе субъекту, нуждающемуся в этом, уменьшает количество фактора Bb в плазме у субъекта. Например, гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению, при введении по меньшей мере в одной дозе субъекту, нуждающемуся в этом, может уменьшать количество фактора Bb в плазме у субъекта по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% по сравнению с количеством фактора Bb в плазме у субъекта в отсутствие введения гуманизированного антитела к фактору Bb или по сравнению с количеством фактора Bb в плазме у субъекта до введения гуманизированного антитела к фактору Bb.
В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению для лечения субъекта, имеющего комплемент-опосредованное заболевание или расстройство, включает введение субъекту гуманизированного антитела к фактору Bb по настоящему изобретению или фармацевтической композиции, включающей: a) гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению; и b) фармацевтически приемлемый эксципиент, подходящий для введения такому субъекту. В некоторых вариантах осуществления субъектом является млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек. Введение можно осуществить любым путем, известным специалистам в данной области, включая пути, раскрытые в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления введение является внутривенным. В некоторых вариантах осуществления введение является интратекальным. В некоторых вариантах осуществления введение является внутримышечным. В некоторых вариантах осуществления введение является подкожным.
Комплемент-опосредованные заболевания и расстройства, которые являются подходящими для лечения гуманизированным антителом к фактору Bb по настоящему изобретению, включают заболевания и расстройства, связанные с альтернативным путем комплемента. Исследования на доклинических животным моделях и клинические испытания показывают, что альтернативный путь играет важную роль в развитии повреждения ткани и патогенезе некоторых состояний (Holers et al., Immunological Reviews 223: 300-316; Cao et al., (2016) Haematologica 101(11): 1319-1326; Schubart et al., (2019) PNAS 116(16): 7926-7931; Thurman, (2015) Am J Kidney Dis 65(1): 156-168; Vriese et al., (2015) Am J Kidney Dis 65(1): 156-168; и Gold et al., (2006) Nat. Genet. 38(4): 458-462). В некоторых вариантах осуществления комплемент-опосредованные заболевания, которые являются подходящими для лечения гуманизированным антителом к фактору Bb по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются этим, IgA нефропатию (болезнь Бергера), атипичный гемолитический уремический синдром (aHUS), пароксизмальную ночную гемоглобулинурию (PNH), идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (TTP), волчаночный нефрит, ANCA васкулит, мембранозную нефропатию, C3 гломерулонефрит (C3GN), фокально-сегментарный гломерулосклероз (FSGS), рассеянный склероз, макулярную дегенерацию, возрастную макулярную дегенерацию (AMD), ревматоидный артрит, синдром антифосфолипидных антител, астму, ишемически-реперфузионное повреждение, мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит II типа, спонтанную потерю плода, пауци-иммунный васкулит, буллезный эпидермолиз, повторную потерю плода и травматическое повреждение головного мозга.
Гуманизированное антитело к фактору Bb по настоящему изобретению можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, отдельно (например, в виде монотерапии); или в комбинированной терапии с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим средством.
“В комбинации с” в контексте настоящей заявки относится к применениям, например, где первое соединение вводят на протяжении всего курса введения второго соединения; где первое соединение вводят на протяжении периода времени, который перекрывается с введением второго соединения, например, где введение первого соединения начинается до введения второго соединения, и введение первого соединения заканчивается до завершения введения второго соединения; где введение второго соединения начинается до введения первого соединения, и введение второго соединения заканчивается до завершения введения первого соединения; где введение первого соединения начинается до начала введения второго соединения, и введение второго соединения заканчивается до завершения введения первого соединения; где введение второго соединения начинается до начала введения первого соединения, и введение первого соединения заканчивается до завершения введения второго соединения. Таким образом, “в комбинации” также может относиться к схеме, включающей введение двух или более соединений”. “В комбинации с” в контексте настоящей заявки также относится к введению двух или более соединений, которые можно вводить в одной и той же или разных композициях, одним и тем же или разными путями и в одной и той же или разных лекарственных формах.
Субъекты, подходящие для лечения гуманизированным антителом к фактору Bb, включают субъектов, у которых диагностировано комплемент-опосредованное заболевание или расстройство; субъектов с более высоким риском развития комплемент-опосредованного заболевания или расстройства, чем в популяции в целом (например, субъектов с генетической предрасположенностью к развитию комплемент-опосредованного заболевания или расстройства). Также включены субъекты, страдающие любым из комплемент-опосредованных заболеваний или расстройств, перечисленных выше. В некоторых вариантах осуществления субъект является взрослым человеком. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является ребенком.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Гуманизация мышиного моноклонального антитела к фактору Bb
Гены вариабельной области гибридомы родительского антитела к фактору Bb (см. Таблицу 1) амплифицировали, клонировали и секвенировали, что приводило к идентификации одного уникального VH домена и одного уникального Vκ домена.
Первоначально три гуманизированных VH области и пять гуманизированных Vκ областей, сконструированных с использованием технологии COMPOSITE HUMAN ANTIBODY™, были клонированы в векторы IgG4v1 тяжелой цепи и легкой каппа-цепи. Исходное антитело, два контрольных антитела и все 15 комбинаций гуманизированных антител транзиторно экспрессировали в клетках HEK EBNA.
Чтобы оценить связывание всех гуманизированных вариантов, осуществляли одноцикловый кинетический анализ на супернатантах трансфицированных клеточных культур. Кинетические эксперименты осуществляли на Biacore T200 (серийный номер 1909913) с использованием программы контроля V2. 0. 1 и программы оценки V3. 0 Biacore T200 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Все одноцикловые кинетические эксперименты осуществляли при 25°C с рабочим буфером HBS-P+ (pH 7,4) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).
Антитела разводили в рабочем буфере до конечной концентрации 1 мкг/мл, исходя из концентраций, оцененных по титру ELISA. В начале каждого цикла антитела наносили на Fc2, Fc3 и Fc4 чипа с белком А (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). IgG захватывали при скорости потока 10 мкл/мин, чтобы получить уровень иммобилизации (RL) ~63 RU, теоретическое значение для получения Rmax ~50 RU. Затем поверхности давали возможность стабилизироваться. Кинетические данные за один цикл были получены с фактором Bb (CompTech, Tyler, USA) в качестве аналита при скорости потока 30 мкл/мин, чтобы свести к минимуму любые потенциальные ограничения массопереноса. Осуществляли несколько повторов с эталонным химерным антителом для проверки стабильности поверхности и анализируемого вещества в течение кинетических циклов. Сигнал от эталонного канала Fc1 (без антитела) вычитали из сигнала Fc2, Fc3 и Fc4 для поправки на разницу в неспецифическом связывании с эталонной поверхностью. Использовали четырехточечное двукратное разведение в диапазоне от 0,78 нМ до 6,25 нМ фактора Bb без регенерации между каждой концентрацией. Фазу ассоциации для четырех инъекций возрастающих концентраций фактора Bb отслеживали в течение 200 секунд каждый раз, и индивидуальную фазу диссоциации измеряли в течение 200 секунд после последней инъекции фактора Bb. Регенерацию поверхности белка А осуществляли с использованием двух инъекций 10 мМ глицин-HCL pH 1,5.
Сенсорограммы и подогнанные данные одноциклового кинетического анализа показаны на Фиг. 1A-1D, а кинетические параметры, измеренные для взаимодействия фактора Bb с каждым антителом, показаны в Таблице 7. Относительную KD рассчитывали путем деления KD эталонного антитела VH0/Vκ0 на KD гуманизированного варианта, анализируемого в том же эксперименте.
Одноцикловые кинетические характеристики гуманизированных вариантов и контрольных антител, связывающихся с фактором Bb
(Химерное)
(контроль)
(контроль)
Анализ Biacore показал, что все гуманизированные варианты связывались с фактором Bb, однако во всех случаях относительная KD более чем в два раза отличалась от значения химерного антитела, что позволяет предположить, что некоторая аффинность связывания была утрачена. Чтобы решить эту проблему, были сконструированы и клонированы в соответствующий вектор экспрессии четыре дополнительные последовательности тяжелой цепи (VH4-VH7) и две легкой цепи (Vκ6-Vκ7). Вариантные последовательности показаны в Таблицах 2 и 3.
Анализ экспрессии и одноцикловой кинетики модифицированных вариантов
Пять контрольных антител (VH0/Vκ6, VH0/Vκ7, VH5/Vκ0, VH6/Vκ0, VH7/Vκ0) и комбинации гуманизированных тяжелых и легких цепей (всего восемь гуманизированных пар, Таблица 8) транзиторно трансфицировали в HEK EBNA адгезивные клетки (ATCC® Cat. No. CRL-10852™) с использованием метода трансфекции PEI. Титры супернатантов IgG контролировали методом ELISA IgG (Таблица 9), и трансфекции культивировали в течение 10 дней до сбора супернатантов.
Титры антител вариантов, полученных при транзиторной трансфекции (мкг/мл)
Одноцикловый кинетический анализ с использованием клеточных культуральных супернатантов осуществляли как описано выше. Сенсорограммы и подогнанные данные одноциклового кинетического анализа показаны в Фиг. 2A-2C. Было показано, что все варианты связываются с фактором Bb. Данные одноциклового кинетического анализа (Таблица 9) показали, что пять антител (VH4/Vκ6, VH4/Vκ7, VH6/Vκ6 VH6/Vκ7 и VH7/Vκ7) связывались с фактором Bb со значением, отличающимся в два раза от значения контрольного химерного антитела. Относительную KD рассчитывали путем деления KD контрольного антитела VH0/Vκ0 на KD гуманизированного варианта, анализируемого в этом же эксперименте.
Параметры одноцикловой кинетики гуманизированных вариантов и контрольных антител, связывающихся с фактором Bb
Очистка антител
VH4/Vκ6, VH4/Vκ7, VH6/Vκ6 VH6/Vκ7 и VH7/Vκ7, а также химерное антитело очищали из супернатантов клеточных культур на колонках с белком А-сефарозой (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), а затем эксклюзионной хроматографией на колонке 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) с использованием PBS pH 7,4 в качестве подвижной фазы. Антитела количественно определяли при OD280нм с использованием коэффициента экстинкции на основании предсказанной аминокислотной последовательности. Восстановленные антитела анализировали методом SDS-PAGE путем нанесения 1 мкг каждого антитела на гель (Фиг. 3) и наблюдали полосы, соответствующие профилю типичного антитела.
Многоцикловый кинетический анализ антител
Чтобы установить точное сродство к фактору Bb, осуществляли многоцикловый кинетический анализ очищенного химерного антитела и пяти антител-лидеров с использованием устройства Biacore T200 (серийный номер 1909913) с программой для оценки Biacore T200 V3. 0. 1 (Uppsala, Sweden). Антитела разводили в рабочем буфере до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. В начале каждого цикла антитела наносили на Fc2, Fc3 и Fc4 чипа с белком А (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). IgG захватывали при скорости потока 10 мкл/мин, чтобы получить уровень иммобилизации (RL) ?63 RU, теоретическое значение для получения Rmax ?50 RU. Затем поверхности давали возможность стабилизироваться. Кинетические данные были получены с фактором Bb в качестве аналита и с использованием скорости потока 30 мкл/мин, чтобы свести к минимуму любые потенциальные эффекты переноса массы. Многократные повторения холостого опыта и повторение одной концентрации аналита были запрограммированы в кинетический цикл, чтобы проверить стабильность как поверхности, так и аналита в течение кинетических циклов. Для кинетического анализа был выбран диапазон двукратных разведений от 12,5 нМ до 0,391 нМ фактора Bb. Фазу ассоциации фактора Bb отслеживали в течение 360 секунд, а фазу диссоциации отслеживали в течение 600 секунд. Регенерацию поверхности белка А осуществляли с использованием двух инъекций 10 мМ глицин-HCL, рН 1,5. Сигнал от эталонного канала Fc1 (без антитела) вычитали из сигнала Fc2, Fc3 и Fc4 для поправки на разницу в неспецифическом связывании с эталонной поверхностью, и глобальный параметр Rmax использовался в модели связывания 1-к-1.
Сенсорограммы и подогнанные данные для связывания химерных антител и гуманизированных вариантов с фактором Bb показаны на Фиг. 4А-4С. Относительную KD рассчитывали путем деления KD гуманизированных вариантов на KD химерного антитела на том же чипе. Кинетические параметры, измеренные для взаимодействия фактора Bb с химерными антителами и гуманизированными вариантами, показаны в Таблице 10. Два гуманизированных варианта, VH4/Vκ6 и VH4/Vκ7 (выделены жирным шрифтом), продемонстрировали относительные значения KD с разницей в два раза по сравнению с эталонным химерным антителом.
Параметры многоцикловой кинетики гуманизированных вариантов и контрольных антител, связывающихся с фактором Bb
Конкурентный ELISA для фактора Bb
Очищенные варианты-лидеры и химерные антитела испытывали на связывание с фактором Bb с использованием конкуренции с мышиным исходным антителом.
Фактор Bb разводили в 1x PBS до 1,0 мкг/мл и наносили по 100 мкл/лунка в течение ночи при 4°C на 96-луночный ELISA планшет. На следующий день планшеты блокировали в течение двух часов при комнатной температуре 1% казеином/PBS перед промывкой 2 раза PBS pH 7,4.
В 96-луночный планшет для разведения фиксированную концентрацию мышиного исходного антитела (0,5 мкг/мл, конечная концентрация) добавляли в равном объеме к серии четырехкратного титрования испытываемого антитела (начиная с 45 мкг/мл до 0,01 мкг/мл, конечная концентрация), разведенного в блокирующем буфере. После промывки планшета 3х при помощи PBS-T в ELISA планшет добавляли 100 мкл смеси химерного/испытываемого антитела. После инкубации при комнатной температуре в течение часа планшет промывали 3 раза PBS-T и наносили 100 мкл анти-мышиного IgG Fc-специфического HRP (Sigma, Dorset, UK), разведенного 1:1000 в PBS-T, на один час при комнатной температуре для детекции связанного мышиного антитела. Для развития цвета планшет промывали 3-кратно PBS-T, после чего добавляли 100 мкл ™B субстрата и инкубировали в течение приблизительно пяти минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 3,0 М хлористоводородной кислоты и сразу же считывали абсорбцию с использованием планшет-ридера DYNEX® при 450 нм.
Результаты были нанесены на график и показаны на Фиг. 5. Значения IC50 рассчитывали для каждого варианта, и относительные значения IC50 рассчитывали путем деления IC50 гуманизированного варианта на IC50 химерного антитела, которое анализировали на том же планшете (Таблица 11). Все варианты-лидеры продемонстрировали значения IC50 в пределах двукратного значения, полученного для исходного антитела.
Значения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50), полученные в конкурентном ELISA для гуманизированных антител-лидеров к фактору Bb
Пример 2: Активность гуманизированных вариантов
Ингибирование WIESLAB® AP гуманизированными вариантами против фактора Bb в сыворотке человека
Способность гуманизированных вариантов ингибировать активность AP комплемента измеряли с использованием набора Complement System Alternative Pathway WIESLAB®. В этом анализе с использованием планшета лунки, покрытые липополисахаридом (LPS), приводят к специфической активации альтернативного пути с детекцией осаждения мембраноатакующего комплекса (MAC), что служит в качестве показаний. 5,56% нормальную человеческую сыворотку (NHS) инкубировали с серией разведений исходного антитела и гуманизированных вариантов вместе с контрольным антителом IgG4 человека, начиная со 100 мкг/мл. Измеряли OD405нм и сравнивали с положительным и отрицательным контролями из набора. Данные наносили на график относительно положительного контроля (Фиг. 6А). Все гуманизированные варианты показали ингибирование AP-опосредованного осаждения MAC, аналогичное исходному антителу в человеческой сыворотке (Таблица 13).
Активность гуманизированных антител к фактору Bb в анализе AP WIESLAB®
IC50 (M)
Ингибирование AP-опосредованного гемолиза гуманизированными вариантами в человеческой сыворотке
Ингибирование AP путь-опосредованного гемолиза определяли с использованием сыворотки человека или обезьяны cynomolgus и эритроцитов кролика в EGTA-содержащем буфере для ингибирования классического пути. Серийные разведения исходного антитела и гуманизированных вариантов, начиная с 200 мкг/мл, инкубировали с 20% человеческой сывороткой и эритроцитами кролика (RBC) 10×106 в течение одного часа при 37°C. Степень лизиса определяли путем измерения поглощения супернатанта при 540 нм и вычитания фонового поглощения в контрольных лунках, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Результаты показаны на Фиг. 6B. На Фиг. 6C значение A540, представляющее степень гемолиза, показано для каждого варианта при 100 мкг/мл. VH4/VK6 и VH6/VK7 показывают наивысшее ингибирование гемолиза, как отражено наибольшим уменьшением A540.
Связывание исходного антитела и гуманизированных вариантов с фактором Bb обезьяны cynomolgus
Чтобы убедиться, что процесс гуманизации не влияет на межвидовую перекрестную реактивность, исходное антитело и гуманизированные производные испытывали на связывание с фактором Bb человека и обезьяны cynomolgus методом бислойной интерферометрии (BLI) с использованием Octet Red. Вкратце, биотинилированные антитела наносили на биосенсоры SA, уравновешенные в PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20 (буфер для анализа). После 60-секундного базового уровня в буфере для анализа антитела наносили на зонды на 180 секунд, после чего следовал еще один 60-секундный базовый уровень. Ассоциацию с фактором Bb (очищенным на месте) человека (Comptech) или обезьяны cynomolgus измеряли в течение 300 секунд, после чего следовала диссоциация в течение 300 секунд. Кинетические параметры рассчитывали с использованием программного обеспечения Octet Analysis и модели связывания 1:1. Данные представлены в Таблице 13, и они показывают, что гуманизация не влияла на перекрестную реактивность с фактором Bb обезьяны cynomolgus.
Связывание гуманизированных вариантов с Bb человека и cynomolgus, определенное методом BLI
Связывание VH4/VK6-IgG4v2 и VH6/VK7-IgG4v2 с фактором Bb человека и обезьяны cynomolgus
Для определения, влияет ли модификация Fc части антител на аффинность и межвидовую перекрестную реактивность, VH4/VK6-IgG4v2 и VH6/VK7-IgG4v2 испытывали вместе с их исходными антителами VH4/VK6 и VH6/VK7, соответственно, на их способность связываться с фактором Bb человека и обезьяны cynomolgus, методом BLI. VH4/VK6-IgG4v2 и VH6/VK7-IgG4v2 содержат мутации в Fc области, которые повышают аффинность к Fc рецептору. Эксперимент осуществляли аналогично тому, как описано в примере выше, и результаты представлены в Таблице 14. Как и ожидалось, модификация Fc не влияла на связывание.
Связывание гуманизированных антител к фактору Bb с фактором Bb человека и cynomolgus, определенное методом BLI
Специфичность VH4/VK6 и VH6/VK7 в отношении фактора Bb (активированной формы фактора B)
Способность VH4/VK6 и VH6/VK7 связываться с зимогеновым фактором B и фактором Bb как человека, так и обезьяны cynomolgus определяли методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием Biacore T200. Человеческий фактор B и фактор Bb закупали у Comptech, а фактор B и фактор Bb обезьяны cynomolgus очищали на месте. Вкратце, моноклональные антитела захватывали на чипе с белком A Biacore Series S в HBSP+ (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05% P20 pH 7,4) при скорости потока 30 мкл/мин. Серию из пяти концентраций каждого аналита испытывали на связывание с использованием одноцикловой кинетики с временем контакта 180 секунд для каждой концентрации с последующей диссоциацией в течение 600 секунд при 25°C и скорости потока 60 мкл/сек. Начальная концентрация фактора B человека и обезьяны cynomolgus составляла 500 нМ, с последующим 2-кратным разведением, а начальная концентрация фактора Bb человека и обезьяны cynomolgus составляла 30 нМ и 150 нМ, соответственно, с последующим 2-кратным разведением. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Biacore, используя модель связывания 1:1. Сенсорограммы показаны на Фиг. 7A-7D. Результаты представлены в Таблице 15. Вкратце, оба гуманизированных варианта показывают примерно в 10 раз более высокое сродство к человеческому фактору Bb по сравнению с фактором Bb обезьяны cynomolgus. Связывание с фактором B человека или обезьяны cynomolgus было почти неопределяемым, а небольшой сигнал, который наблюдался, был обусловлен неспецифическим связыванием.
Специфичность лидерных гуманизированных вариантов к фактору Bb человека или обезьяны cynomolgus
Связывание химерных исходных и репрезентативных гуманизированных вариантов с различными белками комплемента
Чтобы убедиться, что гуманизация не приводит к неспецифическому связыванию или перекрестной реактивности с другими белками комплемента или плазмы, химерное исходное антитело и репрезентативный гуманизированный вариант, VH6/VK7-IgG4v2, испытывали на связывание с aC1 (Comptech A104), C1r (Comptech A102), C2 (Comptech A112), C2a (полученный из C2), тромбином (EMD Millipore 605195), эластазой (EMD Millipore 324682), фактором D (Comptech A136) и фактором Bb (Comptech A155). Вкратце, белки комплемента и плазмы наносили на планшеты для ELISA при 2,5 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°C. Планшеты затем блокировали казеином на 1 час при комнатной температуре и четыре раза промывали 1X DPBS/0,05% Tween-20 с последующей однократной промывкой 1X DPBS. Серийные разведения, начиная с 50 мкг/мл, биотинилированного химерного исходного или VH6/VK7-IgG4v2 добавляли в планшет в PBS/0,1% казеина/0,1% Tween-20 и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшеты промывали, как описано, и в планшет добавляли разведение 1:10000 стрептавидина-HRP (Southern Biotech 7100-05) в PBS/0,1% казеина/0,1% Tween-20 и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Планшеты снова промывали и добавляли в планшет Ultra ™P ELISA (Thermo 34028) на 1 минуту с последующим добавлением стоп-раствора). OD 450 нм считывали в планшет-ридере и вычитали фон при 620 нм. Как химерное исходное антитело (Фиг. 8А), так и гуманизированный вариант (Фиг. 8В) демонстрируют полную специфичность к фактору Bb.
Пример 3: VH6/VK7-IgG4v2, продуцируемые из CHO vs HEK ведут себя одинаково
Для определения того, ведут ли себя VH6/VK7-IgG4v2, продуцируемые в HEK клетках, таким же образом, как продуцируемые в CHO клетках, VH6/VK7-IgG4v2 получали путем транзиентной экспрессии в HEK клетках или путем стабильной экспрессии в CHO клетках с использованием стандартных способов.
Активность антител в отношении альтернативного пути комплемента (CAP) и классического пути (CCP) определяли с использованием наборов WIESLAB® для альтернативного пути комплемента и классического пути, соответственно, в соответствии с инструкциями изготовителя. Для определения активности в отношении САР антитела испытывали в 5,56% нормальной сыворотке человека (Фиг. 9А) и 5,56% нормальной сыворотке обезьяны cynomolgus (Фиг. 9В). Для определения активности в отношении ССР антитела испытывали в 1% нормальной сыворотке человека (Фиг. 10А) и 1% нормальной сыворотке обезьяны cynomolgus (Фиг. 10В). Измеряли OD405нм и результаты нормализовали к активности сыворотки перед инъекцией антитела. VH6/VK7-IgG4v2, продуцируемые в CHO и HEK, показали одинаковую активность. Значения IC50 для обоих наборов антител были рассчитаны и показаны на Фиг. 10A-10B. VH6/VK7-IgG4v2, продуцируемый в CHO, показал такую же активность, что и VH6/VK7-IgG4v2, продуцируемый в HEK. Также сравнивали AP путь-опосредованный гемолиз VH6/VK7-IgG4v2, продуцируемых в CHO и HEK. Гемолиз определяли с использованием 20% нормальной сыворотки человека и эритроцитов кролика в буфере, содержащем EGTA для ингибирования классического пути. Степень лизиса определяли путем измерения супернатанта и вычитания фонового поглощения в контрольных лунках, содержащих этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). VH6/VK7-IgG4v2, продуцируемые в CHO и HEK, показали сходный % гемолиза (Фиг. 11).
Многоцикловый кинетический анализ осуществляли на CHO- и HEK-продуцируемых VH6/VK7-IgG4v2 антителах с использованием биослойной интерферометрии. Антитела разводили до 10 мкг/мл в PBS+0,02% Tween20, 0,1% BSA, 0,05% азида натрия и наносили на анти-hIgG Fc сенсоры (предварительно уравновешенные в том же буфере) на 90 секунд с последующим 60-минутным исходным уровнем в буфере. Связывание серии концентраций человеческого фактора Bb (Complement Technologies, #A155), в пределах от 100 нМ до 0,14 нМ в 2-кратных разведениях, измеряли в течение 300-сек ассоциации в том же буфере, за которой следовала 300-сек стадия диссоциации. Кривые связывания и подогнанные данные, а также рассчитанные значения Kd для обоих антител показаны на Фиг. 12.
Литература
Cao et al. (2016) Haematologica 101(11): 1319-1326
Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917
Bryson et el. (2010). Biodrugs 24 (1):1-8
Dall'Acqua et al. (2006) J Biol Chem 281: 23514-24
De Vriese et al. (2015) J Am Soc Nephrol 26: 2917-2929
Holers (2008) Immunological Reviews 223: 300-316
Holt et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:484
Gold et al. (2006) Nat. Genet. 38(4): 458-462
Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)
Kabat et al. U. S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)
Lefranc et al. (2003) Developmental and Comparative Immunology 27:55
MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 262:732-745
Perry et al. (2008) Drugs R D 9 (6): 385-396
Schubart et al. (2019) PNAS 116(16): 7926-7931
Smith P et al. (2012) PNAS 109: 6181-6186
Shields et al. (2001) J Biol Chem 276: 6591-604
Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909
Thurman (2015) Am J Kidney Dis 65(1): 156-168
Патент США № 6737056
Международная публикация № WO 02/060919
Международная публикация № WO 98/23289
Международная публикация № WO 97/34631.
Все публикации, патенты, патентные заявки, публикации и записи в базе данных (например, записи в базе данных последовательностей), приведенные в настоящей заявке, например, в разделах «Уровень техники», «Сущность изобретения», «Подробное описание», «Примеры» и/или «Литература», настоящим полностью включены посредством ссылки как если бы каждая отдельная публикация, патент, патентная заявка, публикация и запись в базе данных были специально и отдельно включены в настоящую заявку посредством ссылки. В случае противоречий настоящая заявка, включая любые приведенные в ней определения, будет иметь преимущественную силу.
Эквиваленты и объем
Специалистам в данной области должны быть понятны, или они смогут установить, используя не более чем рутинные эксперименты, многие эквиваленты вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке. Объем настоящего раскрытия не предназначен для ограничения вышеприведенным описанием, а скорее изложен в прилагаемой формуле изобретения.
Такие артикли, как «a», «an» и «the», могут означать по меньшей мере один, если не указано иное или иным образом не следует из контекста. Притязания или описания, которые включают «или» между двумя или более членами группы, считаются удовлетворенными, если присутствуют один, более одного или все члены группы, если не указано иное или иное не следует из контекста. Раскрытие группы, которое включает «или» между двумя или более членами группы, обеспечивает варианты осуществления, в которых присутствует ровно один член группы, варианты осуществления, в которых присутствует более одного члена группы, и варианты осуществления, в которых присутствуют все члены группы. Для краткости эти варианты осуществления не были описаны индивидуально в настоящей заявке, но следует понимать, что каждый из этих вариантов осуществления представлен в настоящей заявке и может быть конкретно заявлен или отклонен.
Должно быть понятно, что раскрытие охватывает все варианты, комбинации и перестановки, в которых по меньшей мере одно ограничение, элемент, пункт или описательный термин по меньшей мере из одного из пунктов формулы изобретения или по меньшей мере из одной соответствующей части описания введен в другой пункт формулы изобретения. Например, пункт формулы, который зависит от другого пункта формулы, может быть изменен, чтобы включить по меньшей мере одно из ограничений, присутствующих в любом другом пункте формулы, который зависит от того же базового пункта. Кроме того, если в пунктах формулы изобретения указана композиция, должно быть понятно, что включены способы получения или применения композиции в соответствии с любым из способов получения или применения, раскрытых в настоящей заявке, или в соответствии со способами, известными в данной области техники, если таковые имеются, если не указано иное, или если для обычного специалиста в данной области не будет очевидно, что возникнет противоречие или несоответствие.
Когда элементы представлены в виде перечней, например, в формате группы Маркуша, должно быть понятно, что также раскрывается каждая возможная подгруппа элементов и что любой элемент или подгруппа элементов могут быть удалены из группы. Также отмечается, что термин «включающий» является открытым и допускает включение дополнительных элементов или стадий. Должно быть понятно, что, как правило, если вариант осуществления, продукт или способ указан как включающий определенные элементы, характерные признаки или стадии, также предусматриваются варианты осуществления, продукты или способы, которые состоят или по существу состоят из таких элементов, характерных признаков или стадий. Для краткости эти варианты осуществления не были описаны в настоящей заявке по отдельности, но должно быть понятно, что каждый из этих вариантов осуществления представлен в настоящей заявке и может быть конкретно заявлен или отклонен.
В формуле изобретения, а также в приведенном выше описании все переходные фразы, такие как «включающий», «включая», «несущий», «имеющий», «содержащий», «охватывающий», «включающий в себя», «состоящий из», следует понимать как неограниченные, т.е. означающие включение, но не ограничиваясь этим. Только переходные фразы «состоящий из» и «состоящий по существу из» должны быть закрытыми или полузакрытыми переходными фразами, соответственно, как указано в United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111. 03.
Там, где указаны диапазоны, включены конечные точки. Кроме того, должно быть понятно, что, если не указано иное или иное не следует из контекста и/или понимания специалиста в данной области техники, значения, выраженные в виде диапазонов, могут принимать любое конкретное значение в пределах указанных диапазонов в некоторых вариантах осуществления, до десятых долей нижней границы диапазона, если из контекста явно не следует иное. Для краткости значения в каждом диапазоне не были указаны в настоящей заявке отдельно, но должно быть понятно, что каждое из этих значений приведено в настоящей заявке и может быть конкретно заявлено или отклонено. Также должно быть понятно, что, если не указано иное или иное не следует из контекста и/или понимания специалиста в данной области техники, значения, выраженные в виде диапазонов, могут подразумевать любой поддиапазон в пределах данного диапазона, где конечные точки поддиапазона выражаются до той же степени точности, что и десятая часть единицы нижней границы диапазона.
Там, где указываются веб-сайты, URL-адреса указаны в виде не исполняемых браузером кодов с указанием соответствующего веб-адреса в скобках. Фактические веб-адреса не содержат круглых скобок.
Кроме того, должно быть понятно, что любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения может быть явно исключен из любого по меньшей мере одного из пунктов формулы изобретения. Там, где указаны диапазоны, любое значение в пределах диапазона может быть явно исключено из любого по меньшей мере одного из пунктов формулы изобретения. Любой вариант осуществления, элемент, признак, применение или аспект композиций и/или способов по настоящему изобретению могут быть исключены из любого по меньшей мере одного пункта формулы изобретения. Для краткости все варианты осуществления, в которых исключен по меньшей мере один элемент, признак, назначение или аспект, не изложены явным образом в настоящей заявке.
Термины «около» и «по существу», предшествующие числовому значению, означают ±10% от приведенного числового значения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ДЖЕНЗИМ КОРПОРЕЙШН
<120> ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ КОМПЛЕМЕНТА BB И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> B1553.70014WO00
<140> Еще не присвоен
<141> Одновременно с этим
<150> US 63/012,590
<151> 2020-04-20
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 1
Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 2
Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 6
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 3
Glu Arg Pro Met Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 4
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 6
His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 8
Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 9
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 10
Gln Asp Val Gly Thr Ala
1 5
<210> 11
<211> 3
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 11
Trp Ala Ser
1
<210> 12
<211> 115
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 107
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 14
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 327
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 29
<211> 327
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 30
<211> 327
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 31
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 31
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 32
<211> 442
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 33
<211> 442
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 34
<211> 442
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 35
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 36
<211> 442
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 37
<211> 442
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 38
<211> 442
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asn Arg Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 39
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln His Ser Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 40
<211> 505
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 40
Lys Ile Val Leu Asp Pro Ser Gly Ser Met Asn Ile Tyr Leu Val Leu
1 5 10 15
Asp Gly Ser Asp Ser Ile Gly Ala Ser Asn Phe Thr Gly Ala Lys Lys
20 25 30
Cys Leu Val Asn Leu Ile Glu Lys Val Ala Ser Tyr Gly Val Lys Pro
35 40 45
Arg Tyr Gly Leu Val Thr Tyr Ala Thr Tyr Pro Lys Ile Trp Val Lys
50 55 60
Val Ser Glu Ala Asp Ser Ser Asn Ala Asp Trp Val Thr Lys Gln Leu
65 70 75 80
Asn Glu Ile Asn Tyr Glu Asp His Lys Leu Lys Ser Gly Thr Asn Thr
85 90 95
Lys Lys Ala Leu Gln Ala Val Tyr Ser Met Met Ser Trp Pro Asp Asp
100 105 110
Val Pro Pro Glu Gly Trp Asn Arg Thr Arg His Val Ile Ile Leu Met
115 120 125
Thr Asp Gly Leu His Asn Met Gly Gly Asp Pro Ile Thr Val Ile Asp
130 135 140
Glu Ile Arg Asp Leu Leu Tyr Ile Gly Lys Asp Arg Lys Asn Pro Arg
145 150 155 160
Glu Asp Tyr Leu Asp Val Tyr Val Phe Gly Val Gly Pro Leu Val Asn
165 170 175
Gln Val Asn Ile Asn Ala Leu Ala Ser Lys Lys Asp Asn Glu Gln His
180 185 190
Val Phe Lys Val Lys Asp Met Glu Asn Leu Glu Asp Val Phe Tyr Gln
195 200 205
Met Ile Asp Glu Ser Gln Ser Leu Ser Leu Cys Gly Met Val Trp Glu
210 215 220
His Arg Lys Gly Thr Asp Tyr His Lys Gln Pro Trp Gln Ala Lys Ile
225 230 235 240
Ser Val Ile Arg Pro Ser Lys Gly His Glu Ser Cys Met Gly Ala Val
245 250 255
Val Ser Glu Tyr Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Thr Val Asp
260 265 270
Asp Lys Glu His Ser Ile Lys Val Ser Val Gly Gly Glu Lys Arg Asp
275 280 285
Leu Glu Ile Glu Val Val Leu Phe His Pro Asn Tyr Asn Ile Asn Gly
290 295 300
Lys Lys Glu Ala Gly Ile Pro Glu Phe Tyr Asp Tyr Asp Val Ala Leu
305 310 315 320
Ile Lys Leu Lys Asn Lys Leu Lys Tyr Gly Gln Thr Ile Arg Pro Ile
325 330 335
Cys Leu Pro Cys Thr Glu Gly Thr Thr Arg Ala Leu Arg Leu Pro Pro
340 345 350
Thr Thr Thr Cys Gln Gln Gln Lys Glu Glu Leu Leu Pro Ala Gln Asp
355 360 365
Ile Lys Ala Leu Phe Val Ser Glu Glu Glu Lys Lys Leu Thr Arg Lys
370 375 380
Glu Val Tyr Ile Lys Asn Gly Asp Lys Lys Gly Ser Cys Glu Arg Asp
385 390 395 400
Ala Gln Tyr Ala Pro Gly Tyr Asp Lys Val Lys Asp Ile Ser Glu Val
405 410 415
Val Thr Pro Arg Phe Leu Cys Thr Gly Gly Val Ser Pro Tyr Ala Asp
420 425 430
Pro Asn Thr Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Val His Lys
435 440 445
Arg Ser Arg Phe Ile Gln Val Gly Val Ile Ser Trp Gly Val Val Asp
450 455 460
Val Cys Lys Asn Gln Lys Arg Gln Lys Gln Val Pro Ala His Ala Arg
465 470 475 480
Asp Phe His Ile Asn Leu Phe Gln Val Leu Pro Trp Leu Lys Glu Lys
485 490 495
Leu Gln Asp Glu Asp Leu Gly Phe Leu
500 505
<210> 41
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 41
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcca tgtcttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtaatc gtggtagtta cacctactac 180
ccagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga gcagcctgag atctgaggac acggctttgt attactgtgc gagagagagg 300
cctatggact actggggcca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345
<210> 42
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 42
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcca tgtcttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtaatc gtggtagtta cacctactac 180
ccagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctttgt attactgtgc gagagagagg 300
cctatggact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 43
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 43
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcca tgtcttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtaatc gtggtagtta cacctactac 180
gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctttgt attactgtgc gagagagagg 300
cctatggact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 44
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 44
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcca tgtcttgggt ccgccaggct 120
ccagggaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtaatc gtggtagtta cacctactac 180
ccagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga gcagcctgag atctgaggac acggctttgt attactgtgc gagagagagg 300
cctatggact actggggcca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345
<210> 45
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 45
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcca tgtcttgggt ccgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtaatc gtggtagtta cacctactac 180
ccagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga gcagcctgag atctgaggac acggctttgt attactgtgc gagagagagg 300
cctatggact actggggcca aggaacctca gtcaccgtct cctca 345
<210> 46
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 46
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcca tgtcttgggt ccgccaggct 120
ccagggaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtaatc gtggtagtta cacctactac 180
ccagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctttgt attactgtgc gagagagagg 300
cctatggact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 47
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 47
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcca tgtcttgggt ccgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtaatc gtggtagtta cacctactac 180
ccagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctttgt attactgtgc gagagagagg 300
cctatggact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 48
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 48
gacatcgtga tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggcaacctc ctaagctcct gatctattgg gcatccactc ggcacactgg ggtcccagat 180
aggttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca caatcagcag cctgcagtct 240
gaagattttg cagtttattt ctgtcaccaa catagcagca atcctctcac gtttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 49
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 49
gacatcgtga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggcaacctc ctaagctcct gatctattgg gcatccactc ggcacactgg ggtcccagat 180
aggttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca caatcagcag cctgcaggct 240
gaagattttg cagtttattt ctgtcaccaa catagcagca atcctctcac gtttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 50
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 50
gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggcaacctc ctaagctcct gatctattgg gcatccactc ggcacactgg ggtcccagat 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca caatcagcag cctgcaggct 240
gaagattttg cagtttattt ctgtcaccaa catagcagca atcctctcac gtttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 51
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 51
gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggcaacctc ctaagctcct gatctattgg gcatccactc ggcacactgg ggtcccagat 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca caatcagcag cctgcaggct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcaccaa catagcagca atcctctcac gtttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 52
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 52
gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggcaacctc ctaagctcct gatctattgg gcatccactc ggcacactgg ggtcccagat 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca caatcagcag cctgcaggct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaccaa catagcagca atcctctcac gtttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 53
<211> 322
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 53
gacatcgtga tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcatccactc ggcacactgg ggtcccagat 180
aggttcacag gcagtggatc atgggacaga tttcactctc acaatcagca gcctgcagtc 240
tgaagatttt gcagtttatt tctgtcacca acatagcagc aatcctctca cgtttggcca 300
ggggaccaag ctggagatca aa 322
<210> 54
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 54
gacatccaga tgacccagtc tccatccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcatccactc ggcacactgg ggtcccagat 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca caatcagcag cctgcaggct 240
gaagattttg cagtttattt ctgtcaccaa catagcagca atcctctcac gtttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 55
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 55
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 56
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 57
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 57
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 58
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 58
His His His His His
1 5
<210> 59
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 59
His His His His His His
1 5
<210> 60
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 60
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 61
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 61
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 62
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 62
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 63
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 64
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 64
Phe His His Thr
1
<210> 65
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 65
Trp Glu Ala Ala Ala Arg Glu Ala Cys Cys Arg Glu Cys Cys Ala Arg
1 5 10 15
Ala
<210> 66
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая
<400> 66
Arg Tyr Ile Arg Ser
1 5
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| C3-СВЯЗЫВАЮЩИЕ АГЕНТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2802307C2 |
| МОНОВАЛЕНТНЫЕ АНТИТЕЛА К ПРОПЕРДИНУ И ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ | 2018 |
|
RU2790103C2 |
| КОНСТРУКЦИИ СЛИТОГО БЕЛКА ДЛЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, СВЯЗАННОГО С КОМПЛЕМЕНТОМ | 2019 |
|
RU2824402C2 |
| АНТИТЕЛО К CLDN-18.2 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2021 |
|
RU2829997C1 |
| АНТИТЕЛА К С5 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2746356C2 |
| АНТИТЕЛА К С5 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2017 |
|
RU2789788C2 |
| АНТИ-C5 АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2018 |
|
RU2774716C2 |
| Иммунотерапия с применением антител, связывающих лиганд 1 белка программируемой смерти клеток (PD-L1) | 2017 |
|
RU2766582C2 |
| ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ И ЛЕЧЕНИЕ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ АМИЛОИДНОЙ АНГИОПАТИИ | 2008 |
|
RU2523894C2 |
| Терапевтические антитела к CD47 | 2016 |
|
RU2748401C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к гуманизированному антителу, которое специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека, к композиции, конъюгату и устройству для инъекции, его содержащим, а также к способу его получения. Также раскрыты нуклеиновая кислота и набор нуклеиновых кислот, кодирующих вышуказанное антитело, вектор и набор векторов, а также клетка, их содержащие. Изобретение эффективно для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта, а также для ингибирования активности пути комплемента у субъекта. 17 н. и 19 з.п. ф-лы, 12 ил., 15 табл., 3 пр.
1. Гуманизированное антитело, которое специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека и включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
2. Гуманизированное антитело, которое специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека и включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
3. Гуманизированное антитело по п. 1 или 2, где гуманизированное антитело специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека с аффинностью от 10-6 до 10-9 M.
4. Гуманизированное антитело по любому из пп. 1-3, где гуманизированное антитело ингибирует активность пути комплемента.
5. Гуманизированное антитело по п. 4, где активность комплемента выбрана из группы, состоящей из: AP-опосредованного отложения терминального мембраноатакующего комплекса (MAC), AP-опосредованного гемолиза, отложения C3 фрагментов на эритроцитах или других типах клеток, C3b/Bb-опосредованного расщепления C3 и C3bBb3b-опосредованного расщепления C5.
6. Гуманизированное антитело по любому из пп. 1-5, где гуманизированное антитело выбрано из группы, состоящей из Ig мономера, Fab фрагмента, F(ab')2 фрагмента, scFv, scAb и Fv.
7. Гуманизированное антитело по любому из пп. 1-5, где гуманизированное антитело включает константную область тяжелой цепи изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
8. Гуманизированное антитело по п. 7, где гуманизированное антитело включает константную область IgG4 или ее вариант.
9. Гуманизированное антитело по п. 8, где константная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 28-30.
10. Гуманизированное антитело по любому из пп. 1 и 3-9, где гуманизированное антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 32-34, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
11. Гуманизированное антитело по любому из пп. 2-9, где гуманизированное антитело включает тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 36-38, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.
12. Конъюгат, который специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека, включающий гуманизированное антитело по любому из пп. 1-11; и
детектируемую метку или лекарственное средство.
13. Фармацевтическая композиция для лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства, включающая гуманизированное антитело по любому из пп. 1-11 или конъюгат по п. 12 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
14. Устройство для инъекции гуманизированного антитела по любому из пп. 1-11, содержащее гуманизированное антитело по любому из пп. 1-11.
15. Устройство для инъекции конъюгата по п. 12, содержащее конъюгат по п. 12.
16. Устройство для инъекции фармацевтической композиции по п. 13, содержащее фармацевтическую композицию по п. 13.
17. Устройство для инъекции по любому из пп. 14-16, где устройство представляет собой шприц, шприц-ручку или электронное инъекционное устройство (e-Device).
18. Способ лечения комплемент-опосредованного заболевания или расстройства у субъекта, включающий: введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела по любому из пп. 1-11, конъюгата по п. 12 или фармацевтической композиции по п. 13 для лечения комплемент-опосредованного заболевания или растройства.
19. Способ по п. 18, где комплемент-опосредованное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из: IgA нефропатии (болезни Бергера), атипичного гемолитического уремического синдрома (aHUS), пароксизмальной ночной гемоглобулинурии (PNH), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (TTP), волчаночного нефрита, ANCA васкулита, мембранозной нефропатии, C3 гломерулонефрита (C3GN), фокально-сегментарного гломерулосклероза (FSGS), рассеянного склероза, макулярной дегенерации, возрастной макулярной дегенерации (AMD), ревматоидного артрита, синдрома антифосфолипидных антител, астмы, ишемически-реперфузионного повреждения, мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита II типа, спонтанной потери плода, пауци-иммунного васкулита, буллезного эпидермолиза, повторной потери плода и травматического повреждения головного мозга.
20. Способ ингибирования активности пути комплемента у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества гуманизированного антитела по любому из пп. 1-11, конъюгата по п. 12 или фармацевтической композиции по п. 13 для ингибирования активности комплемента.
21. Способ по п. 20, где субъект имеет комплемент-опосредованное заболевание или расстройство.
22. Способ по п. 21, где комплемент-опосредованное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из: IgA нефропатии (болезни Бергера), атипичного гемолитического уремического синдрома (aHUS), пароксизмальной ночной гемоглобулинурии (PNH), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), тромботической тромбоцитопенической пурпуры (TTP), волчаночного нефрита, ANCA васкулита, мембранозной нефропатии, C3 гломерулонефрита (C3GN), фокально-сегментарного гломерулосклероза (FSGS), рассеянного склероза, макулярной дегенерации, возрастной макулярной дегенерации (AMD), ревматоидного артрита, синдрома антифосфолипидных антител, астмы, ишемически-реперфузионного повреждения, мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита II типа, спонтанной потери плода, пауци-иммунного васкулита, буллезного эпидермолиза, повторной потери плода и травматического повреждения головного мозга.
23. Способ по любому из пп. 20-22, где активность комплемента выбрана из группы, состоящей из: AP-опосредованного отложения терминального мамбраноатакующего комплекса (MAC), AP-опосредованного гемолиза, отложения C3 фрагментов на эритроцитах или других типах клеток, C3b/Bb-опосредованного расщепления C3 и C3bBb3b-опосредованного расщепления C5.
24. Способ по любому из пп. 18-23, дополнительно включающий введение субъекту терапевтического средства.
25. Способ по любому из пп. 18-24, где введение является внутривенным, подкожным или внутримышечным.
26. Нуклеиновая кислота, кодирующая гуманизированное антитело по любому из пп. 1-11.
27. Набор нуклеиновых кислот, кодирующий гуманизированное антитело, которое специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека, причем набор нуклеиновых кислот содержит:
нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и
нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
28. Набор нуклеиновых кислот, кодирующий гуманизированное антитело, которое специфически связывается с белком фактора комплемента Bb человека, причем набор нуклеиновых кислот содержит:
нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; и
нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
29. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п. 26.
30. Экспрессионный набор векторов, включающий:
вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и
вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
31. Экспрессионный набор векторов, включающий:
вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; и
вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
32. Клетка, экспрессирующая гуманизированное антитело по любому из пп. 1-11, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 26 или набор нуклеиновых кислот по п. 27 или 28, функционально связанную с подходящим промотором, или вектор экспрессии по п. 29 или экспрессионный набор векторов по п. 30 или 31.
33. Клетка по п. 32, где клетка представляет собой клетку млекопитающего.
34. Клетка по п. 33, где клетка млекопитающего выбрана из группы, состоящей из: человеческих эмбриональных клеток почек (HEK), клеток яичников китайского хомячка (CHO), миеломных клеток NS0, клеток SP2, клеток COS и эпителиальных клеток молочной железы.
35. Способ получения гуманизированного антитела по любому из пп. 1-11, включающий культивирование клетки по любому из пп. 32-34 для получения гуманизированного антитела.
36. Способ по п. 35, дополнительно включающий выделение гуманизированного антитела.
| US 2019153079 A1, 23.05.2019 | |||
| АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ КОМПЛЕМЕНТА Bb | 2015 |
|
RU2673036C2 |
| US 7999082 B2, 16.08.2011 | |||
| US 2013136735 A1, 30.05.2013. | |||
