РАННЕЕ ОБНАРУЖЕНИЕ АКТИВАЦИИ ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ИЛИ НЕЙРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ Российский патент 2022 года по МПК A61K45/00 A61K39/395 A61P25/28 C07K16/28 

[1]Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным №62/461945, поданной 22 февраля 2017 года, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[2] Файл, содержащий перечень последовательностей, озаглавленный 58008 172847 Seq List ST25.txt размером 5880 байт (измеренный в MS-Windows®) и созданный 20 февраля 2018 года, содержит 10 последовательностей, представлен с помощью системы EFS бюро по регистрации патентов и товарных знаков США и полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[3] Семафорин 4D (SEMA4D), также известный как CD100, представляет собой трансмембранный белок, который принадлежит к генному семейству семафорина. SEMA4D экспрессируется на клеточной поверхности как гомодимер, но при активации клетки SEMA4D может высвобождаться с поверхности клетки посредством протеолитического расщепления с образованием SSEMA4D, растворимой формы данного белка, которая также является биологически активной. См. Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 5:159-167 (2003); Kikutani et al, Nature Immunol. 9:17-23 (2008).

[4] SEMA4D в большом количестве экспрессируется в лимфоидных органах, включая селезенку, вилочковую железу и лимфатические узлы, а также в нелимфоидных органах, таких как головной мозг, сердце и почки. В лимфоидных органах SEMA4D в большом количестве экспрессируется на покоящихся Т-клетках, но лишь слабо экспрессируется на покоящихся В-клетках и антиген-презентирующих клетках (АРС), таких как дендритные клетки (DC). Однако его экспрессия активируется в таких клетках после активации под действием различных иммунологических стимулов. Высвобождение растворимого SEMA4D из иммунных клеток также повышается при активации клетки.

[5] SEMA4D участвует в нейродегенеративных расстройствах, аутоиммунных заболеваниях, демиелинизирующих заболеваниях и раке. В центральной нервной системе (ЦНС) SEMA4D экспрессируется, например, на инфильтрующих иммунных клетках и олигодендроцитарных клетках-предшественниках, а его рецепторы экспрессируются, например, на нейронах, олигодендроцитах, астроцитах и эндотелиальных клетках (Okuno, Т., et al., J. Immunol. 184:1499-1506 (2010)). SEMA4D может действовать как молекула аксонального поиска пути (Swiercz et al, Neuron 55:51-63 (2002)) и может, среди прочих функций, опосредовать ГАМК-эргическое и глутаматергическое развитие синапсов (Paradis et al, Neuron 53:217-232 (2007)).

[6] Показано также, что SEMA4D играет роль в миграции и дифференцировке нейронных и олигодендроцитарных клеток-предшественников, воспалении ЦНС и нейродегенерации. Например, SEMA4D-дефицитные мыши устойчивы к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) (Kumanogoh A et al, Immunity 13:621-631 (2000)), а блокада SEMA4D может подавлять микроглиальную активацию и нейровоспаление при ЕАЕ (Okuno, Т., et al., J. Immunol. 7 1499-1506 (2010)). Кроме того, стимуляция SEMA4D эндотелиальных клеток может приводить к выработке провоспалительного цитокина IL-8 (Yang, YH et al, PLoS One 6:e25826 (2011)).

[7] Болезнь Хантингтона (HD) представляет собой наследственное, неизлечимое заболевание, обусловленное патогенной экспансией полиглутамин-кодирующего тракта CAG в экзоне 1 гена хантингтина (НТТ) до 36 или более повторов (Huntington's Disease Collaborative Research Group (HDCRG) Cell 72:971-983 (1993)). 36 или более глутаминов (расширенный polyQ) в НТТ приводят к выработке измененной формы, называемой тНТТ (мутантный НТТ), которая увеличивает скорость дегенерации некоторых типов нейронов. Степень дегенерации связана с длиной polyQ, и на ее долю приходится примерно 60% вариаций возраста начала заболевания и скорости прогрессирования симптомов HD. HD представляет собой аутосомно-доминантное генетическое расстройство, при котором каждый человек, родитель которого страдает от HD, рождается с вероятностью (риском 50/50) наследования одного мутированного гена хантингтина (через одну из X или Y половых хромосом, содержащих его). У любого, кто унаследовал указанный ген, в определенный момент жизни развивается данное заболевание. По данным Национального института неврологических расстройств и инсульта (NINDS), в США в любой момент времени существуют 30000 пациентов, страдающих от HD, и еще 150000 индивидуумов имеют 50% риск развития данного заболевания. HD представляет собой сложное и изнурительное смертельное заболевание, от которого нет лекарств.

[8] HD характеризуется двигательным и когнитивным расстройством и психиатрическим нарушением, смерть от которого обычно происходит через 15-20 лет после начала болезни. Хотя начало заболевания, которое клинически устанавливают по наличию двигательных нарушений, обычно происходит в среднем возрасте, многие признаки HD могут присутствовать за несколько лет или десятилетий до него, включая, например, иммунную активацию (Bjorkqvist М et al, J. Exp. Med 205:1869-1877 (2008)), атрофию полосатого тела и потерю белого вещества головного мозга (Tabrizi S J et al, Lancet Neurol. 8:791-801 (2009)). Кроме того, может возникать существенно сниженный функциональный цикл клеток нейронной и олигодендроцитарной линии в полосатом теле человека с HD (Ernst A et al., Cell 756:1072-1083 (2014)). Ранним признаком HD может быть транскрипционная дисрегуляция; например, экспрессия SEMA4D и его основного рецептора в ЦНС, плексина В1, может быть повышена в полосатом теле и коре пациента с HD, но не в мозжечке (Hodges et al, Hum. Mol. Genet. 75:965-977 (2006)).

[9] Ингибирование передачи сигналов SEMA4D посредством анти-SEMA4D лечения представляет собой новый подход к лечению HD. В конкретных аспектах работа с YAC128-трансгенной мышиной моделью HD показала, что лечение с использованием анти-SEMA4D антитела облегчает некоторые нейропатологические эффекты, включая атрофию полосатого тела, кортикальную атрофию и атрофию мозолистого тела, а также предотвращает тестикулярную дегенерацию. Кроме того, у мышей YAC128, проходивших лечение анти-SEMA4D антителом, улучшается подмножество поведенческих симптомов, включая ослабление тревожного поведения и избавление от когнитивного расстройства. См. Southwell AL, et al Neurobiol Dis. 76:46-56 (2015) и патент США №9249227, выданный 2 февраля 2016 года. Учитывая большую продолжительность времени, необходимого для развития поддающихся измерению симптомов HD и облегчения таких симптомов, сохраняется потребность в способе простого, воспроизводимого определения того, будет ли данный способ лечения, в частности, лечение с использованием анти-SEMA4D, эффективным у индивидуумов, генетически предрасположенных к развитию HD.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[10] В настоящем изобретении предложен способ определения того, может ли антитело-антагонист семафорина 4D (SEMA4D) или его антигенсвязывающий фрагмент быть эффективным при лечении нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения.

[11] В одном аспекте предложенный способ включает введение эффективного количества антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, страдающему, предположительно страдающему или имеющему риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; измерение степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта по сравнению с исходным уровнем усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, измеренным до введения антагониста SEMA4D; и продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или прекращение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня.

[12] В другом аспекте предложенный способ включает измерение исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, страдающего, предположительно страдающего или имеющего риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; введение эффективного количества антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту; повторное измерение степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента; и продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или прекращение введение антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня.

[13] В другом аспекте предложенный способ включает введение начальной дозы антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, страдающему, предположительно страдающему или имеющему риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; измерение степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта по сравнению с исходным уровнем усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, измеренным до введения антагониста SEMA4D; и корректировку дозы антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня, причем корректировку осуществляют по степени такого повышения, или прекращение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня. В соответствии с данным аспектом, предложенный способ может дополнительно включать увеличение дозы антитела-антагониста SEMA4D по сравнению с дозой, исследованной на стадии (b), и повторное измерение изменения степени усвоения глюкозы относительно нового исходного уровня у другого, ранее не подверженного лечению пациента, или у того же пациента после отмены лечения у того же пациента в течение периода времени, установленного для обеспечения накопления исторического дефицита при данном нейродегенеративном или нейровоспалительном заболевании, расстройстве или повреждении, и дополнительную корректировку дозы антитела-антагониста SEMA4D при обнаружении дальнейшего увеличения.

[14] В другом аспекте предложенный способ включает измерение исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, страдающего, предположительно страдающего или имеющего риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; введение начальной дозы антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту; повторное измерение степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента; и корректировку дозы антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня, причем корректировку осуществляют по степени такого повышения, или прекращение введение антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня. В соответствии с данным аспектом, предложенный способ может дополнительно включать увеличение дозы антитела-антагониста SEMA4D по сравнению с дозой, исследованной на стадии (с), и повторное измерение изменения степени усвоения глюкозы относительно нового исходного уровня у другого, ранее не подверженного лечению пациента, или у того же пациента после отмены лечения у того же пациента в течение периода времени, установленного для обеспечения накопления исторического дефицита при данном нейродегенеративном или нейровоспалительном заболевании, расстройстве или повреждении, и дополнительную корректировку дозы антитела-антагониста SEMA4D при обнаружении дальнейшего увеличения.

[15] В другом аспекте предложенный способ включает введение антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, страдающему, предположительно страдающему или имеющему риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; измерение степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта по сравнению с исходным уровнем усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, измеренным до введения антагониста SEMA4D; и продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или прекращение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня.

[16] В другом аспекте предложенный способ включает измерение исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, страдающего, диагностированного или предположительно страдающего нейродегенеративным или нейровоспалительным заболеванием, расстройством или повреждением; введение антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту; повторное измерение степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента; и продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или прекращение введение антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня.

[17] В другом аспекте предложенный способ включает введение антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту, страдающему, предположительно страдающему или имеющему риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; назначение измерения степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта по сравнению с исходным уровнем усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, измеренным до введения антагониста SEMA4D; и продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или прекращение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня.

[18] В другом аспекте предложенный способ включает назначение измерения исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, страдающего, предположительно страдающего или имеющего риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; введение антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту; назначение повторного измерения степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента; и продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или прекращение введение антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня.

[19] В другом аспекте предложенный способ включает измерение исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, страдающего, предположительно страдающего или имеющего риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; и повторное измерение уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения субъекту антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента поставщиком медицинских услуг; и инструктаж поставщика медицинских услуг о продолжении введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или инструктаж поставщика медицинских услуг о прекращении введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня.

[20] В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент для применения в предложенном способе ингибирует взаимодействие SEMA4D с его рецептором, например, плексином В1, плексином В2 или CD72. В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент ингибирует SEMA4D-опосредованную передачу сигналов плексина В1.

[21] В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент для применения в предложенном способе конкурентно ингибирует антитело сравнения, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, от связывания с SEMA4D. В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент для применения в предложенном способе связывается с тем же эпитопом SEMA4D, что и антитело сравнения, которое содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

[22] В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D для применения в предложенном способе имеет VH и VL, причем VH содержит три участка, определяющие комплементарность, (CDR) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, a VL имеет три CDR LCDR1, LCDR2 и LCDR3, при этом указанные CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно, за исключением по меньшей мере одной или двух одиночных консервативных аминокислотных замен в одном или более CDR. В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D для применения в предложенном способе имеет VH и VL, причем VH содержит три участка, определяющие комплементарность, (CDR) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, a VL содержит три CDR LCDR1, LCDR2 и LCDR3, при этом указанные CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно. В некоторых аспектах VH имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 1, и VL имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 5. В некоторых аспектах VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

[23] В некоторых аспектах предложенного способа вводят первую дозу антитела-антагониста SEMA4D, а затем антитело-антагонист SEMA4D вводят по меньшей мере один раз в неделю, по меньшей мере один раз в две недели, по меньшей мере один раз в три недели, по меньшей мере один раз в месяц или по меньшей мере один раз в два месяца.

[24] В некоторых аспектах предложенного способа измерение исходного уровня усвоения глюкозы проводят непосредственно перед введением первой дозы антитела-антагониста SEMA4D. В некоторых аспектах предложенного способа изменение усвоения глюкозы относительно исходного уровня измеряют по меньшей мере через одну неделю после введения первой дозы, по меньшей мере через две недели после введения первой дозы, по меньшей мере через один месяц после введения первой дозы, по меньшей мере через два месяца после введения первой дозы, по меньшей мере через три месяца после введения первой дозы, по меньшей мере через четыре месяца после введения первой дозы, по меньшей мере через пять месяцев после введения первой дозы, по меньшей мере через шесть месяцев после введения первой дозы, или в любой их комбинации.

[25] В некоторых аспектах предложенного способа усвоение глюкозы в головном мозге субъекта измеряют с помощью позитронно-эмиссионной томографии с использованием радиофармпрепарата ¹⁸F-фтордезоксиглюкозы (ФДГ-ПЭТ).

[26] В некоторых аспектах предложенного способа субъектом является человек. В некоторых аспектах предложенного способа нейродегенеративное или нейровоспалительное заболевание, расстройство или повреждение представляет собой болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, синдром Дауна, атаксию, амиотрофический боковой склероз (ALS), рассеянный склероз (MS), эпилепсию, менингит, отек головного мозга, повреждение спинного мозга, травматическое повреждение головного мозга, лобно-височную деменцию (FRD), нарушение когнитивных функций на фоне ВИЧ, волчанку ЦНС, легкое нарушение когнитивных функций или их комбинацию.

[27] В некоторых аспектах предложенного способа нейродегенеративное или нейровоспалительное заболевание, расстройство или повреждение представляет собой болезнь Хантингтона (HD). В некоторых аспектах субъект имеет риск развития HD на основании семейного анамнеза HD или генетического тестирования, например, если генетическое тестирование выявило 36 или более повторов CAG в гене НТТ субъекта. В некоторых аспектах субъект предположительно страдает HD на основании легкой двигательной дисфункции, легкого нарушения когнитивных функций или легких нейропсихиатрических признаков. В некоторых аспектах у субъекта диагностирована HD на основании атрофии головного мозга, повышенной оценки болезни Хантингтона по унифицированной шкале Международного общества расстройств движений (UHDRS), повышенной оценки по комплексному исследованию когнитивных функций при болезни Хантингтона (HD-CAB), повышенной количественной оценки силы мышц при болезни Хантингтона или их комбинации. В некоторых аспектах субъект находится на предсимптоматической, ранней продромальной, поздней продромальной стадии, на стадии раннего проявления, умеренного проявления или прогрессирующего проявления HD.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ/ФИГУР

[28] На фиг.1 представлена схема лечения когорты А в клиническом исследовании SIGNAL.

[29] На фиг.2 представлена схема и график, демонстрирующие различные «группы» пациентов, которые сравнивали в когорте А клинического исследования SIGNAL: VV(7-0) представляет собой группу, которой вводили VX15 в течение первой шестимесячной слепой части исследования; PV(7-0) представляет собой группу, которой вводили плацебо в течение первой шестимесячной слепой части исследования; VV(12-7) представляет собой группу, которой вводили VX15 с начала исследования, оценку проводили в течение периода времени с 7 месяца по 11 месяц; PV(12-7) представляет собой группу, которой вводили плацебо в течение первых 6 месяцев исследования и затем в начале 7 месяца переводили на прием VX15, оценку проводили в течение периода времени с 7 месяца по 11 месяц; VV(12-0) представляет собой группу, которой вводили VX15 в течение всего исследования, оценку проводили с 0 дня по 11 месяц; и PV(12-0) представляет собой группу, которой вводили плацебо в течение первых 6 месяцев исследования, а затем в начале 7 месяца переводили на прием VX15, оценку проводили времени с 0 дня по 11 месяц.

[30] Фиг. 3А-В, Объем по MPT: W(7-0) - PV(7-0): На фиг.3А показана разница между группой, которой вводили VX15, через 6 месяцев (VV(7-0), n=17) и группой, которой вводили плацебо, через 6 месяцев (PV(7-0), n=19) по изменению средних значений, определенных методом наименьших квадратов (LS), объема по МРТ, выраженного в мм³, для каждой рассматриваемой области головного мозга (ROI) в течение 6 месяцев лечения с отдельными измеренными значениями для левого полушария, правого полушария и средним значением для левого и правого полушария рассматриваемой области головного мозга. Отрезки, исходящие из каждой точки, представляют собой 95% доверительный интервал. На фиг.3В показано изменение объема по МРТ для тех же групп и рассматриваемых областей головного мозга, как на фиг.3А, выраженное в % от исходного значения в начале лечения для каждой группы.

[31] Фиг. 4А-В, Объем по МРТ: PV(12-7) - PV(7-0): На фиг.4А показана разница между группой, которой вводили плацебо в течение первых 6 месяцев, а затем вводили VX15 в течение 7-11 месяцев, оценку которой проводили в течение периода времени с 7 месяца по 11 месяц (PV(12-7), n=19), и такой же группой, которой вводили плацебо в течение первых 6 месяцев, оценку которой проводили с нулевого дня до конца 6 месяца (PV(7-0), n=19), по изменению средних значений, определенных методом наименьших квадратов (LS), объема по МРТ, выраженного в мм³, для каждой рассматриваемой области головного мозга (ROD в течение 6 месяцев лечения с отдельными измеренными значениями для левого полушария, правого полушария и средним значением для левого и правого полушария. Отрезки, исходящие из каждой точки, представляют собой 95% доверительный интервал. На фиг.4В показано изменение объема по МРТ для тех же групп и рассматриваемых областей головного мозга, как на фиг.4А, выраженное в % от исходного значения в начале оценивания для каждой группы.

[32] Фиг. 5А-В, Объем по МРТ: W(12-7) - PV(7-0): На фиг.5А показана разница между группой, которой вводили VX15, оценку которой проводили с 7 месяца по 11 месяц (VV(12-7), n=17), и группой, которой вводили плацебо, через 6 месяцев, оценку которой проводили с нулевого дня до конца 6 месяца (PV(7-0), n=19), по изменению средних значений, определенных методом наименьших квадратов (LS), объема по МРТ, выраженного в мм³, для каждой рассматриваемой области головного мозга (ROI). Отрезки, исходящие из каждой точки, представляют собой 95% доверительный интервал. На фиг.5 В показано изменение объема по МРТ для тех же групп и рассматриваемых областей головного мозга, как на фиг.5А, выраженное в % от исходного значения в начале оценивания для каждой группы.

[33] Фиг. 6А-В, Объем по МРТ: VV(12-0) - PV(12-0): На фиг.6А показана разница между группой, которой вводили VX15, оценку которой проводили с 0 дня по 11 месяц (VV(12-0), n=17), и группой, которой вводили плацебо/перекрестное лечение, оценку которой проводили с 0 дня по 11 месяц (PV(12-0), n=19), по изменению средних значений, определенных методом наименьших квадратов (LS), объема по МРТ, выраженного в мм³, для каждой рассматриваемой области головного мозга (ROI), для всех 11 месяцев лечения. Отрезки, исходящие из каждой точки, представляют собой 95% доверительный интервал. На фиг.6 В показано изменение объема по МРТ для тех же групп и рассматриваемых областей головного мозга, как на фиг.6А, выраженное в % от исходного значения в начале лечения для каждой группы.

[34] На фиг.7 представлено схематическое изображение взаимосвязи между усвоением глутамата и метаболизмом и транспортом глюкозы и гликолизом в астроцитах. Транспорт глутамина в нейроны для синтеза глутамата завершает цикл.

[35] Фиг. 8А-В, изменение сигнала ФДГ-ПЭТ между VV(7-0) - PV(7-0): На фиг.8А показана разница между группой, которой вводили VX15, через 6 месяцев (VV(7-0), n=11), и группой, которой вводили плацебо, через 6 месяцев (PV(7-0), n=8), по изменению средних значений, определенных методом наименьших квадратов (LS), сигнала ФДГ-ПЭТ, выраженная в STJV (стандартизированный уровень накопления) для каждой рассматриваемой области головного мозга (ROI) в течение 6 месяцев лечения. ROI определяли совместной регистрацией МРТ для данного субъекта и калибровали сигнал ФДГ-ПЭТ по области сравнения (ствол головного мозга). Для кортикальной ROI проводили отдельные измерения для левого полушария, правого полушария и среднего значения для левого и правого полушария. Отрезки, исходящие из каждой точки, представляют собой 95% доверительный интервал. На фиг.8 В показано изменение сигнала ФДГ-ПЭТ для тех же групп и рассматриваемых областей головного мозга, как на фиг.8А, выраженное в % от исходного значения в начале лечения для каждой группы.

[36] Фиг. 9А-В, изменение сигнала ФДГ-ПЭТ между PV(12-7) - PV(7-0): На фиг.9А показана разница между группой, которой вводили плацебо в течение первых 6 месяцев, а затем вводили VX15 в течение 7-11 месяцев, оценку которой проводили в течение периода времени с 7 месяца по 11 месяц (PV(12-7), n=8), и такой же группой, которой вводили плацебо в течение первых 6 месяцев, оценку которой проводили с нулевого дня до конца 6 месяца (PV(7-0), n=8), по изменению средних значений, определенных методом наименьших квадратов (LS), сигнала ФДГ-ПЭТ для каждой рассматриваемой области головного мозга (ROI). Отрезки, исходящие из каждой точки, представляют собой 95% доверительный интервал. На фиг.9 В показано изменение сигнала ФДГ-ПЭТ для тех же групп и рассматриваемых областей головного мозга, как на фиг.9А, выраженное в % от исходного значения в начале оценивания для каждой группы.

[37] Фиг. 10А-В, изменение сигнала ФДГ-ПЭТ между W(12-7) - PV(7-0): На фиг. 10А показана разница между группой, которой вводили VX15, оценку которой проводили с 7 месяца по 11 месяц (VV(12-7), n=11), и группой, которой вводили плацебо, через 6 месяцев, оценку которой проводили с нулевого дня до конца 6 месяца (PV(7-0), n=8), по изменению средних значений, определенных методом наименьших квадратов (LS), сигнала ФДГ-ПЭТ для каждой рассматриваемой области головного мозга (ROI). Отрезки, исходящие из каждой точки, представляют собой 95% доверительный интервал. На фиг. 10В показано изменение сигнала ФДГ-ПЭТ для тех же групп и рассматриваемых областей головного мозга, как на фиг.10А, выраженное в % от исходного значения в начале оценивания для каждой группы.

[38] Фиг. 11А-В, изменение сигнала ФДГ-ПЭТ между VV(12-0) - PV(12-0): На фиг. 12А показана разница между группой, которой вводили VX15, оценку которой проводили с 0 дня по 11 месяц (VV(12-0), n=11), и группой, которой вводили плацебо/перекрестное лечение, оценку которой проводили с 0 дня по 11 месяц (PV(12-0), n=8), по изменению средних значений, определенных методом наименьших квадратов (LS), сигнала ФДГ-ПЭТ для каждой рассматриваемой области головного мозга (ROI), для всех 11 месяцев лечения. Отрезки, исходящие из каждой точки, представляют собой 95% доверительный интервал. На фиг.12В показано изменение сигнала ФДГ-ПЭТ для тех же групп и рассматриваемых областей головного мозга, как на фиг.12А, выраженное в % от исходного значения в начале лечения для каждой группы.

[39] На фиг.12 представлено схематическое изображение различных лечебных эффектов VX15, наблюдаемых по данным МРТ и ФДГ-ПЭТ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

[40] Следует отметить, что термины, обозначающие объект в единственном числе, относятся к одному или более таким объектам; например, следует понимать, что «связывающая молекула» означает одну или более связывающих молекул. Так, термины «один», «один или более» и «по меньшей мере один» могут быть использованы в данном контексте взаимозаменяемо.

[41] Кроме того, в данном контексте «и/или» следует понимать как конкретное описание каждого из двух указанных признаков или компонентов вместе с другим или отдельно от другого. Так, термин «и/или», используемый в таком выражении, как «А и/или В», в данном контексте включает «А и В», «А или В», (только) «А» и (только) «В». Аналогично, термин «и/или», используемый в таком выражении, как «А, В и/или С», включает каждый из следующих вариантов реализации: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; (только) А; (только) В; и (только) С.

[42] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном контексте, имеют то же значение, которое обычно подразумевается специалистом в той области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2e изд., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3е изд., 1999, Academic Press; и The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, представляют собой общие словари, где для специалистов описаны многие термины, использованные в настоящем изобретении.

[43] Единицы измерения, приставки и символы указаны в форме, принятой Международной системой единиц (СИ). Числовые диапазоны включают значения, определяющие диапазон. Если не указано иное, аминокислотные последовательности записаны слева направо в ориентации от амино до карбокси. Заголовки, приведенные в настоящем документе, не являются ограничением различных аспектов или аспектов настоящего изобретения, которые могут быть получены со ссылкой на описание в целом. Соответственно, термины, определение которых приведено непосредственно ниже, более полно определены со ссылкой на настоящее описание во всей его полноте.

[44] Если варианты реализации описаны с использованием выражения «содержит», предусмотрены также аналогичные варианты реализации, описанные с использованием терминов «состоит из» и/или «состоит по существу из».

[45] Аминокислоты упомянуты в данном контексте с помощью их обычных трехбуквенных обозначений или однобуквенных обозначений, рекомендованных Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогично, нуклеотиды описаны с помощью их общепринятых однобуквенных кодов.

[46] В данном контексте термин «полипептид» включает единственное число «полипептид», а также множественное число «полипептиды» и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин «полипептид» относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не относится к определенной длине продукта. Так, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, «белок», «аминокислотная цепь» или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, включены в определение «полипептида», и термин «полипептид» может быть использован вместо или взаимозаменяемо с любым из указанных терминов. Термин «полипептид» также относится к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, включая, без ограничения, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование и дериватизацию с использованием известных защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепление или модификацию с использованием неприродных аминокислот. Полипептид может быть получен из биологического источника или синтезирован рекомбинантной технологией, но не обязательно транслирован из обозначенной аминокислотной последовательности. Он может быть получен любым способом, включая химический синтез.

[47] Полипептид, описанный в настоящем документе, может иметь размер примерно 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более, или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они не обязательно имеют такую структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой упомянуты как свернутые, а полипептиды, которые не имеют определенной трехмерной структуры, а, напротив, принимают большое количество различных конформаций, упомянуты как несвернутые. В данном контексте термин «гликопротеин» относится к белку, связанному с по меньшей мере одним углеводным фрагментом, который присоединен к белку через кислородсодержащую или азотсодержащую боковую цепь аминокислоты, например, серина или аспарагина.

[48] Под «выделенным» полипептидом или его фрагментом, вариантом или производным понимают полипептид, который находится не в своей природной микросреде. Не требуется какая-либо конкретная степень очистки. Например, выделенный полипептид может быть выделен из его нативной или природной среды. Рекомбинантно полученные полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, считают выделенными, как описано в настоящем документе, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были выделены, фракционированы или частично или по существу очищены с помощью любой подходящей технологии.

[49] В данном контексте термин «неприродный полипептид» или любые его грамматические варианты, представляет собой условное определение, которое в явной форме исключает, но только исключает те формы полипептида, которые определены или интерпретированы, или могут быть определены или интерпретированы судьей или административным или судебным органом как «природные».

[50] Другие полипептиды, описанные в настоящем документе, представляют собой фрагменты, производные, аналоги или варианты вышеописанных полипептидов, а также любые их комбинации. Термины «фрагмент», «вариант», «производное» и «аналог» в данном контексте включают любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые свойства соответствующего нативного антитела или полипептида, например, специфическое связывание с антигеном. Фрагменты полипептидов включают, например, протеолитические фрагменты, а также фрагменты, полученные после делеции, в дополнение к фрагментам специфических антител, описанным в иных местах настоящего документа. Варианты, например, полипептида включают фрагменты, описанные выше, а также полипептиды и аминокислотными последовательностями, измененными вследствие аминокислотных замен, делеций или вставок. В некоторых аспектах варианты могут быть неприродными. Неприродные варианты могут быть получены известными технологиями мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеции или вставки. Производные представляют собой полипептиды, измененные так, что они демонстрируют дополнительные признаки, не характерные для исходного полипептида. Примеры включают гибридные белки. Вариантные полипептиды также могут быть упомянуты в данном контексте как «полипептидные аналоги». В данном контексте «производное» полипептида также может относиться к рассматриваемому полипептиду, содержащему одну или более аминокислот, химически дериватизованных в результате реакции функциональной боковой группы. В «производные» включены также пептиды, которые содержат одно или более производных двадцати стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролин может заменять пролин; 5-гидроксилизин может заменять лизин; 3-метилгистидин может заменять гистидин; гомосерин может заменять серии; и орнитин может заменять лизин.

[51] «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, в которой одна аминокислота заменена другой аминокислотой, имеющей такую же боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислот, имеющих подобные боковые цепи, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена фенилаланина на тирозин является консервативной заменой. В некоторых вариантах реализации консервативные замены в последовательностях полипептидов и антител согласно настоящему изобретению не аннулируют связывание полипептида или антитела, содержащего такую аминокислотную последовательность, с антигеном, с которым связывается связывающая молекула. В данной области техники известны способы идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, которые не исключают связывание с антигеном (см., например, Brummell et al, Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al, Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).

[52] Термин «полинуклеотид» включает одиночную нуклеиновую кислоту, а также множество нуклеиновых кислот и относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты или конструкту, например, к матричной РНК (мРНК), кДНК или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или нестандартную связь (например, амидную связь, такую как связь в пептидно-нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термины «нуклеиновая кислота» или «последовательность нуклеиновой кислоты» относятся к любому одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например, к фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.

[53] Под «выделенной» нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом понимают любую форму нуклеиновой кислоты или полинуклеотид а, которая выделена из ее естественного микроокружения. Например, «выделенным» можно считать очищенный в геле полинуклеотид или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, который содержится в векторе. «Выделенным» считают также полинуклеотидный сегмент, например, продукт ПЦР, который сконструирован так, что он имеет рестрикционные сайты для клонирования. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотид а включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или по существу) полинуклеотиды в неприродном растворе, таком как буферный или солевой раствор. Выделенные молекулы РНК содержат in vivo или in vitro РНК транскрипты полинуклеотидов, при этом транскрипт не является транскриптом, встречающимся в природе. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты дополнительно содержат такие молекулы, полученные синтетически. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может представлять собой или может содержать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосом или терминатор транскрипции.

[54] В данном контексте термин «неприродный полинуклеотид» или любые его грамматические варианты, представляет собой условное определение, которое в явной форме исключает, но только исключает те формы нуклеиновой кислоты или полипептида, которые определены или интерпретированы, или могут быть определены или интерпретированы судьей или административным или судебным органом как «природные».

[55] В данном контексте «кодирующая область» представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслированных в аминокислоты. Хотя «стоп-кодон» (TAG, TGA или ТАА) не транслирован в аминокислоту, его можно рассматривать как часть кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующей области. В одном полинуклеотидном конструкте, например, на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструктах, например, на отдельных (разных) векторах могут присутствовать две или более кодирующих областей. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или более кодирующих областей, например, один вектор может отдельно кодировать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может содержать гетерологичные кодирующие области, слитые или неслитые с другой кодирующей областью. Гетерологичные кодирующие области включают, без ограничения, области, кодирующие специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.

[56] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В случае ДНК, полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, обычно может содержать промотор и/или другие элементы для регулирования транскрипции или трансляции, функционально связанные с одной или более кодирующими областями. Функциональная связь является такой, что кодирующая область для генного продукта, например, полипептида, связана с одной или более регуляторными последовательностями таким образом, что экспрессия генного продукта находится под влиянием или управлением регуляторной последовательности(-ей). Фрагменты ДНК (такие как область, кодирующая полипептид, и промотор, связанный с ней) являются «функционально связанными», если активация функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей требуемый генный продукт, и если природа связи между двумя фрагментами ДНК не препятствует способности последовательностей, регулирующих экспрессию, направлять экспрессию генного продукта или не препятствует способности матрицы ДНК к транскрипции. Таким образом, промоторная область является функционально связанной с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен к эффективной транскрипции данной нуклеиновой кислоты. Промотор может быть клеточноспецифическим промотором, который направляет существенную транскрипцию ДНК в заданных клетках. Другие элементы контролирования транскрипции, помимо промотора, например, энхансеры, операторы, супрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связаны с полинуклеотидом для управления клеточноспецифической транскрипцией.

[57] Специалистам в данной области техники известно множество областей регулирования транскрипции. Они включают, без ограничения, области регулирования транскрипции, которые действуют в клетках позвоночных, таких как, но не ограничиваясь ими, сегменты промоторов и энхансеров из цитомегаловирусов (промотор гена немедленного ответа в сочетании с интроном-А), вируса обезьян (ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие области регулирования транскрипции включают области, полученные из генов позвоночных, таких как актин, белок теплового шока, бычий гормон роста и р-глобин кроликов, а также другие последовательности, способные регулировать генную экспрессию в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие области регулирования транскрипции включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также лимфокин-индуцибельные промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).

[58] Таким же образом, специалистам в данной области техники известно множество элементов управления трансляцией. Они включают, но не ограничиваются этим, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции, а также элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы или IRES, также упоминаемый как последовательность CITE).

[59] В других вариантах реализации полинуклеотид может представлять собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК), транспортной РНК или рибосомной РНК.

[60] Области кодирования полинуклеотидов и нуклеиновых кислот могут быть связаны с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, направляющие секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом, описанным в настоящем документе. В соответствии с гипотезой о сигналах, белки, секретируемые клетками млекопитающих, содержат сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которая отщепляется от зрелого белка, когда начинается экспорт растущей цепи белка через гранулярную эндоплазматическую сеть. Специалистам в данной области техники известно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, могут содержать сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, отщепленного от полного или «полноразмерного» полипептида, с образованием секретированной или «зрелой» формы полипептида. В некоторых вариантах реализации использован нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, или функциональное производное такой последовательности, которое сохраняет способность направлять секрецию полипептида, функционально связанного с ним. Альтернативно, можно использовать гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например, лидерная последовательность дикого типа может быть заменена лидерной последовательностью человеческого тканевого активатора плазминогена (ТРА) или мышиной (3-глюкуронидазой.

[61] В настоящем документе описаны некоторые связывающие молекулы или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные. За исключением специального описания полноразмерных антител, термин «связывающая молекула» включает полноразмерные антитела, а также антигенсвязывающие субъединицы, фрагменты, варианты, аналоги или производные таких антител, например, сконструированные молекулы антител или фрагменты, которые связывают антиген так же, как молекулы антитела, но имеют иную структуру.

[62] В данном контексте термин «связывающая молекула» в самом широком смысле относится к молекуле, которая специфически связывается с рецептором, например, с эпитопом или антигенной детерминантой. Как дополнительно описано в настоящем документе, связывающая молекула может содержать один или более «антигенсвязывающих доменов», описанных в настоящем документе. Неограничивающим примером связывающей молекулы является антитело или его фрагмент, вариант или производное, которое сохраняет антигенспецифическое связывание.

[63] В данном контексте термины «связывающий домен» или «антигенсвязывающий домен» относятся к области связывающей молекулы, для которой необходимым и достаточным условием является специфическое связывание с эпитопом. Например, «связывающим доменом» считают «Fv», например, вариабельную тяжелую цепь и вариабельную легкую цепь антитела, либо в виде двух отдельных полипептидных субъединиц, либо в виде одной цепи. Другие связывающие домены включают, без ограничения, вариабельную тяжелую цепь (VHH) антитела, полученного из животных семейства верблюдовых, или шесть участков, определяющих комплементарность (CDR) иммуноглобулина, экспрессируемых в структуре фибронектина. «Связывающая молекула», описанная в настоящем документе, может содержать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или более «антигенсвязывающих доменов».

[64] Термины «антитело» и «иммуноглобулин» в данном контексте могут быть использованы взаимозаменяемо. Антитело (или его фрагмент, вариант или производное, описанное в настоящем документе) содержит по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи (для животных семейства верблюдовых) или по меньшей мере вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Основные структуры иммуноглобулина в позвоночных системах известны относительно хорошо. См., например, Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2e изд. 1988). Если не указано иное, термин «антитело» включает все от небольшого антигенсвязывающего фрагмента антитела до полноразмерного антитела, например, антитело IgG, которое содержит две полные тяжелые цепи и две полные легкие цепи, антитело IgA, которое содержит четыре полные тяжелые цепи и четыре полные легкие цепи и необязательно содержит цепь J и/или секреторный компонент, или антитело IgM, которое содержит десять или двенадцать полных тяжелых цепей и десять или двенадцать полных легких цепей и необязательно содержит цепь J.

[65] Как подробнее описано ниже, термин «иммуноглобулин» включает различные широкие классы полипептидов, которые можно распознавать биохимически. Специалистам в данной области техники понятно, что тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или ипсилон (γ, μ, α, δ, ε), и они содержат несколько подклассов (например, γ1-γ4 или α1-α2)). Природа цепи определяет «класс» антитела, такой как IgG, IgM, IgA IgG или IgE, соответственно. Подклассы иммуноглобулина (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁, IgA₂ и т.д., хорошо изучены и, как известно, обусловливают функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из указанных классов и изотипов очевидны для специалистов в данной области техники с учетом настоящего изобретения и, соответственно, они входят в объем настоящего изобретения.

[66] Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда (κ, λ). Тяжелая цепь каждого класса может быть связана с каппа или лямбда-легкой цепью. В целом, легкие и тяжелые цепи ковалентно связаны друг с другом, и «хвостовые» части двух тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями, если иммуноглобулины получены с помощью гибридом, В-клеток или генетически сконструированных клеток-хозяев. В тяжелой цепи аминокислотные последовательности идут от N-конца на раздвоенных концах Y-образной конфигурации к С-концу в нижней части каждой цепи. Основная структура некоторых антител, например, антител IgG, содержит две субъединицы тяжелой цепи и две субъединицы легкой цепи, ковалентно связанные дисульфидными связями с образованием «Y-образной» структуры, также называемой в данном контексте как структура «H2L2».

[67] И легкие, и тяжелые цепи делятся на области структурной и функциональной гомологии. Функционально используют термины «константная» и «вариабельная». В этом отношении следует понимать, что вариабельные домены вариабельной легкой (VL) и вариабельной тяжелой (VH) частей цепи определяют распознавание и специфичность антигена. Напротив, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (CH1, СН2 или СН3) обусловливают биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, связывание рецептора Fc, связывание комплемента и т.п. По соглашению, нумерация доменов константной области увеличивается по мере их удаления от антигенсвязывающего сайта или амино-конца антитела. N-концевая часть представляет собой вариабельную область, а С-концевая часть представляет собой константную область; домены СН3 (или СН4 в случае IgM) и CL в действительности содержат карбокси-конец тяжелой и легкой цепи, соответственно.

[68] Как указано выше, вариабельная область (т.е. «связывающий домен») обеспечивает возможность селективного распознавания и специфического связывания связывающей молекулы с эпитопами на антигенах. То есть домен VL и домен VH, или подмножество определяющих комплементарность участков (CDR) связывающей молекулы, например, антитела, объединяются с образованием вариабельной области, которая определяет трехмерный антигенсвязывающий сайт. Более конкретно, антигенсвязывающий сайт определяется тремя CDR на каждой из VH и VL цепей. Некоторые антитела образуют более крупные структуры. Например, IgA может образовывать молекулу, которая содержит две единицы H2L2, цепь J и секреторный компонент, и все они ковалентно связаны дисульфидными связями, a IgM может образовывать пентамерную или гексамерную молекулу, которая содержит пять или шесть единиц H2L2 и необязательно цепь J, ковалентно связанные дисульфидными связями.

[69] Шесть «участков, определяющих комплементарность» или «CDR», присутствующих в антигенсвязывающем домене антитела, представляют собой короткие несмежные последовательности аминокислот, которые расположены особым образом с образованием связывающего домена, поскольку в водной среде антитело принимает свою трехмерную конфигурацию. Остальные аминокислоты в связывающем домене, называемые «каркасными» областями, демонстрируют меньшую внутримолекулярную вариабельность. Каркасные области, по большей части, принимают конформацию р-складчатого слоя, и CDR образуют петли, которые соединяются и в некоторых случаях образуют часть структуры р-складчатого слоя. Таким образом, каркасные области действуют для образования структуры, которая обеспечивает размещение CDR в правильной ориентации посредством межцепочечных нековалентных взаимодействий. Связывающий домен, образованный размещенными таким образом CDR, определяет поверхность, комплементарную к эпитопу на иммунореактивном антигене. Такая комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с его когнатным эпитопом. Аминокислоты, которые образуют CDR и каркасные области, соответственно, могут быть без труда определены специалистом в данной области техники для любой данной вариабельной области тяжелой или легкой цепи, поскольку они идентифицированы многими различными способами (см. "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); и Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки).

[70] В том случае, если существует два или более определений термина, используемого и/или принятого в данной области техники, определение такого термина в данном контексте включает все такие значения, если специально не указано иное. Конкретным примером является термин «участок, определяющий комплементарность» («CDR»), используемый для описания несмежных сайтов связывания антигена, встречающихся в вариабельной области тяжелой и легкой цепи полипептидов. Такие конкретные области описаны, например, в публикации Kabat et at, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983), и в публикации Chothia et at, J. Mot Biol. 196:901-917 (1987), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Определения Кабата и Чотиа включают перекрывающиеся аминокислоты или подмножества аминокислот, сравниваемые друг с другом. Тем не менее, использование любого определения (или других определений, известных специалистам в данной области техники) в отношении CDR антитела или его варианта считается входящим в объем данного термина, описанного и использованного в данном контексте, если не указано иное. Соответствующие аминокислоты, которые содержат CDR, определение которых приведено в каждом из приведенных выше литературных источников, представлены в качестве сравнения в таблице 1. Точные номера аминокислот, определяющих конкретный CDR, варьируются в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области техники могут обычным путем определить, какие аминокислоты составляют конкретный CDR, исходя из аминокислотной последовательности вариабельной области антитела.

[71] Kabat et al. также определили систему нумерации для последовательностей вариабельного домена, которая применима к любому антителу. Специалисты в данной области техники могут однозначно использовать систему «нумерации Кабата» для любой последовательности вариабельного домена, не используя никакие экспериментальные данные, помимо самой последовательности. В данном контексте «нумерация Кабата» относится к системе нумерации, описанной в публикации Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Если явно не указано использование системы нумерации Кабата, то в настоящем изобретении для всех аминокислотных последовательностей использована последовательная нумерация.

[72] Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, включают, но не ограничиваются этим, поликлональные, моноклональные, человеческие, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитоп-связывающие фрагменты, например, Fab, Fab' и F(ab')₂, Fd, Fvs, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные Fv (sdFv), фрагменты, содержащие домен VL или VH, фрагменты, полученные с помощью экспрессионной библиотеки Fab. Молекулы ScFv известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США 5892019. Молекулы иммуноглобулина или антитела, входящие в объем настоящего изобретения, могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекул иммуноглобулина.

[73] «Специфическое связывание» обычно означает, что связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное связывается с эпитопом через его антигенсвязывающий домен, и что связывание предполагает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. В соответствии с данным определением, говорят, что связывающая молекула «специфически связывается» с эпитопом, если она связывается с указанным эпитопом через антигенсвязывающий домен легче, чем она связывается со случайным, неродственным эпитопом. Термин «специфичность» в данном контексте использован для качественного описания относительной аффинности, с которой определенная связывающая молекула связывается с определенным эпитопом. Например, связывающая молекула «А» предположительно может иметь более высокую специфичность в отношении данного эпитопа, чем связывающая молекула «В», или может быть указано, что связывающая молекула «А» связывается с эпитопом «С» с более высокой специфичностью, чем с родственным эпитопом «D».

[74] Может быть указано, что связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, описанное в настоящем документе, связывается с антигеном-мишенью со скоростью диссоциации (k(off)) менее или ровно 5 × 10^-2 с^-1, 10-² с^-1, 5× 10^-3 с^-1, 10^-3 с^-1, 5 × 10^-4 с^-1, 10^-4 с^-1, 5 × 10^-5 с^-1 или 10^-5 с^-1, 5 × 10^-6 с^-1, 10^-6 с^-1, 5 × 10^-7 с^-1 или 10^-7 с^-1.

[75] Может быть указано, что связывающая молекула, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, описанное в настоящем документе, связывается с антигеном-мишенью со скоростью ассоциации (k(on)) более или ровно 10³ М^-1 с^-1, 5 × 10³ М^-1 с^-1, 10⁴ М^-1 с^-1, 5 × 10⁴ М^-1 с^-1, 10⁵ М^-1 с^-1, 5 × 10⁵ М^-1 с^-1, 10⁶ М^-1 с^-1 или 5 × 10⁶ М^-1 с^-1 или 10⁷ М^-1 c^-1.

[76] Говорят, что связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное конкурентно ингибирует связывание антитела сравнения или антигенсвязывающего фрагмента с данным эпитопом, если оно предпочтительно связывается с данным эпитопом в такой степени, что в некоторой степени блокирует связывание антигена сравнения или антигенсвязывающего фрагмента с эпитопом. Конкурентное ингибирование можно определить любым способом, известным в данной области техники, например, твердофазным ИФА анализом конкуренции. Может быть указано, что связывающая молекула конкурентно ингибирует связывание антитела сравнения или антигенсвязывающего фрагмента с данным эпитопом на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 50%.

[77] В данном контексте термин «аффинность» относится к степени прочности связывания отдельного эпитопа с одним или более связывающими доменами, например, молекулы иммуноглобулина. См., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2e изд. 1988) на cc. 27-28. В данном контексте термин «авидность» относится к общей стабильности комплекса между группой связывающих доменов и антигена. См., например, Harlow на сс.29-34. Авидность относится и к аффинности отдельных связывающих доменов в группе со специфическими эпитопами, и также к валентности иммуноглобулинов и антигена. Например, взаимодействие между двухвалентным моноклональным антителом и антигеном со структурой эпитопа с большим количеством повторов, такой как полимер, является взаимодействием с высокой авидностью. Взаимодействие между двухвалентным моноклональным антителом и рецептором, в высокой плотности содержащимся на поверхности клетки, также представляет собой взаимодействие с высокой авидностью.

[78] Связывающие молекулы или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, описанные в настоящем документе, также могут быть описаны или определены с точки зрения их перекрестной реактивности. В данном контексте термин «перекрестная реактивность» относится к способности связывающей молекулы, например, антитела или его фрагмента, варианта или производного, специфического в отношении одного антигена, взаимодействовать со вторым антигеном; к степени родства между двумя различными антигенными веществами. Так, связывающая молекула является перекрестно реактивной, если она связывается с эпитопом, отличным от того, который вызывает ее образование. Перекрестно реактивный эпитоп обычно содержит множество таких же комплементарных структурных признаков, как индуцирующий эпитоп, и в некоторых случаях может в действительности подходить лучше, чем оригинал.

[79] Связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, также может быть описано или определено с точки зрения его связывающей аффинности с антигеном. Например, связывающая молекула может связываться с антигеном с константой диссоциации или K_D не более 5×10^-2 М, 10^-2 М, 5×10^-3 М, 10^-3 М, 5×10^-4 М, 10^-4М, 5×10^-5М, 10^-5М, 5×10^-6М, 10^бМ, 5×10^-7М, 10^-7М, 5×10^-8М, 10^-8М, 5×10^-9М, 10^-9М, 5×10^-10М, 10^-10М, 5×10^-11М, 10^-11М, 5×10^-12М, 10^-12М, 5×10^-13М, 10^-13М, 5×10^-14 М, 10^-14 М, 5×10^-15 М или 10^-15 М.

[80] Фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела или другие связывающие домены, могут существовать отдельно или в комбинации с одним или более из следующих: шарнирная область, домены CH1, СН2, СН3 или СН4, цепь J или секреторный компонент. Также включены антигенсвязывающие фрагменты, которые могут содержать любую комбинацию вариабельной области(-ей) с одной или более шарнирными областями, доменами CH1, СН2, СН3 или СН4, цепью J или секреторным компонентом. Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены из любого животного, включая птиц и млекопитающих. Антитела могут быть антителами человека, мышей, ослов, кроликов, коз, морских свинок, верблюдов, лам, лошадей или кур. В другом варианте реализации вариабельная область может быть получена из хрящевых рыб (например, из акул). В данном контексте «человеческие» антитела включают антитела, имеющие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и включают антитела, выделенные из библиотек человеческого иммуноглобулина или из животных, трансгенных по одному или более человеческим иммуноглобулинам, и могут в некоторых случаях экспрессировать эндогенные иммуноглобулины, а в некоторых нет, как описано infra и, например, в патенте США №5939598, Kucherlapati et al.

[81] В данном контексте термин «субъединица тяжелой цепи» включает аминокислотные последовательности, полученные из тяжелой цепи иммуноглобулина; связывающая молекула, например, антитело, содержащее субъединицу тяжелой цепи, содержит по меньшей мере одно из следующих: домен VH, домен СН1, шарнирный домен (например, верхняя, средняя и/или нижняя шарнирная область), домен СН2, домен СН3, домен СН4 или их вариант или фрагмент. Например, связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное может содержать, помимо домена VH, домен СН1; домен СН1, шарнирную область и домен СН2; домен СН1 и домен СН3; домен СН1, шарнирную область и домен СН3; или домен СН1, шарнирный домен, домен СН2 и домен СН3. В некоторых аспектах связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное может содержать, помимо домена VH, домен СН3 и домен СН4; или домен СН3, домен СН4 и цепь J. Кроме того, в связывающей молекуле для применения согласно настоящему изобретению могут отсутствовать некоторые части константной области, например, весь или часть домена СН2. Специалистам в данной области техники следует понимать, что указанные домены (например, субъединица тяжелой цепи) могут быть модифицированы так, что они имеют другую аминокислотную последовательность относительно исходной молекулы иммуноглобулина.

[82] Субъединицы тяжелой цепи связывающей молекулы, например, антитела или его фрагмента, варианта или производного могут содержать домены, полученные из других молекул иммуноглобулина. Например, субъединица тяжелой цепи полипептида может содержать домен СН1, полученный из молекулы IgG1, и шарнирную область, полученную из молекулы IgG3. В другом примере субъединица тяжелой цепи может содержать шарнирную область, полученную частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG3. В другом примере субъединица тяжелой цепи может содержать химерную шарнирную область, полученную частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG4.

[83] В данном контексте «субъединица легкой цепи» содержит аминокислотные последовательности, полученные из легкой цепи иммуноглобулина. Субъединица легкой цепи содержит по меньшей мере один из доменов VL или CL (например, Сκ или Сλ).

[84] Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные могут быть описаны или определены с точки зрения эпитопа(-ов) или части(-ей) антигена, который они распознают или специфически связывают. Часть антигена-мишени, которая специфически взаимодействует с антигенсвязывающим доменом антитела, представляет собой «эпитоп» или «антигенную детерминанту». Антиген-мишень может содержать один эпитоп или по меньшей мере два эпитопа и может содержать любое количество эпитопов, в зависимости от размера, конформации и типа антигена.

[85] Как указано ранее, структуры субъединиц и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулина являются общеизвестными. В данном контексте термин «домен VH» включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, а термин «домен СН1» включает первый (самый аминоконцевой) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Домен СН1 является смежным с доменом VH и является аминоконцевым для шарнирной области типичной молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина.

[86] В данном контексте термин «домен СН2» включает часть молекулы тяжелой цепи, которая продолжается, например, с примерно 244 аминокислоты до 360 аминокислоты антитела IgG при использовании обычных схем нумерации (аминокислоты 244-360 по системе нумерации Кабата; аминокислоты 231-340 по системе нумерации ЕС; см. Kabat ЕА et al. op.cit. Домен СН3 продолжается от домена СН2 до С-конца молекулы IgG и содержит примерно 108 аминокислот. Некоторые классы иммуноглобулина, например, IgM, дополнительно содержат область СН4.

[87] В данном контексте термин «шарнирная область» включает часть молекулы тяжелой цепи, которая соединяет домен СН1 с доменом СН2. Шарнирная область содержит примерно 25 аминокислот и является гибкой, что позволяет двум N-концевым связывающим областям антигена двигаться независимо.

[88] В данном контексте термин «дисульфидная связь» включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В некоторых молекулах IgG области СН1 и CL связаны дисульфидной связью, и две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242 по системе нумерации Кабата (положение 226 или 229 по системе нумерации ЕС).

[89] В данном контексте термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором иммунореактивная область или сайт получен или происходит из первого биологического вида, а константная область (которая может быть интактной, неполной или модифицированной) получена из второго биологического вида. В некоторых вариантах реализации целевая связывающая область или сайт получен из нечеловеческого источника (например, мыши или примата), а константная область является человеческой.

[90] Термины «мультиспецифическое антитело» или «биспецифическое антитело» относятся к антителу, которое содержит связывающие домены для двух или более различных эпитопов в одной молекуле антитела. Могут быть сконструированы другие связывающие молекулы, помимо канонической структуры антитела, с двумя связывающими специфичностями. Связывание эпитопа биспецифическими или мультиспецифическими антителами может быть одновременным или последовательным. Триомы и гибридные гибридомы представляют собой два примера клеточных линий, которые могут секретировать биспецифические антитела. Биспецифические антитела также могут быть сконструированы рекомбинантными способами. (Strohlein and Heiss, Future Oncol. 6:1387-94 (2010); Mabry and Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)). Биспецифическое антитело также может представлять собой диатело.

[91] В данном контексте термин «сконструированное антитело» относится к антителу, в котором вариабельный домен в любой из тяжелой и легкой цепи или в обеих цепях изменен посредством по меньшей мере частичной замены одной или более аминокислот в CDR или каркасных областях. В некоторых аспектах все CDR из антитела с известной специфичностью могут быть привиты в каркасные области гетерологичного антитела. Хотя альтернативные CDR могут быть получены из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого получены каркасные области, CDR также могут быть получены из антитела другого класса, например, из антитела, полученного от другого биологического вида. Сконструированное антитело, в котором один или более «донорных» CDR из нечеловеческого антитела с известной специфичностью привиты в каркасную область тяжелой или легкой цепи человека, в данном контексте называют «гуманизированным антителом». В некоторых аспектах не все CDR заменены полными CDR из донорной вариабельной области, и связывающая способность антигена донора может быть перенесена в вариабельные домены реципиента. С учетом пояснений, изложенных, например, в патентах США №5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, специалисты в данной области техники, посредством осуществления обычных экспериментов или работы методом проб и ошибок, могут получить функциональное сконструированное или гуманизированное антитело.

[92] В данном контексте термин «сконструированное» включает манипуляции с молекулами нуклеиновых кислот или полипептидов синтетическими способами (например, с использованием рекомбинантных технологий, in vitro синтеза пептидов, ферментативного или химического связывания пептидов или какой-либо комбинации таких технологий).

[93] В данном контексте термины «связанный», «гибридный» или «слияние», или другие грамматические эквиваленты могут быть использованы взаимозаменяемо. Указанные термины относятся к объединению двух или более элементов или компонентов любыми способами, включая химическую конъюгацию или рекомбинантные технологии. «Слияние с сохранением рамки считывания» относится к объединению двух или более открытых рамок считывания (ORF) полинуклеотида с образованием непрерывной ORF большей длины таким образом, что сохраняется трансляционная рамка считывания исходных ORF. Таким образом, рекомбинантный белок слияния представляет собой один белок, содержащей два или более сегментов, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходными ORF (причем указанные сегменты в естественном виде не объединены указанным образом). Несмотря на то, что рамка считывания, таким образом, является непрерывной по всем слитым сегментам, указанные сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, последовательностью внутрирамочного линкера. Например, полинуклеотиды, кодирующие CDR вариабельной области иммуноглобулина могут быть лигированы с сохранением рамки считывания, но разделены полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну каркасную область иммуноглобулина или дополнительные участки CDR, при условии, что «слитые» CDR транслируются вместе как часть непрерывного полипептида.

[94] В контексте полипептидов, «линейная последовательность» или «последовательность» представляет собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении от аминоконца к карбоксильному концу, причем аминокислоты, смежные друг с другом в данной последовательности, являются непрерывными в первичной структуре полипептида. Часть полипептида, которая является «аминоконцевой» или «N-концевой» для другой части полипептида, представляет собой ту часть, которая находится раньше в последовательной цепи полипептида. Аналогично, часть полипептида, которая является «карбокси-концевой» или «С-концевой» для другой части полипептида, представляет собой ту часть, которая стоит позже в последовательной цепи полипептида. Например, в обычном антителе вариабельный домен является «N-концевым» для константной области, а константная область является «С-концевой» для вариабельного домена.

[95] Термин «экспрессия» в данном контексте относится к процессу, в ходе которого ген создает биохимическое соединение, например, полипептид. Указанный процесс включает любое проявление функционального присутствия гена в клетке, включая, без ограничения, нокдаун гена, а также временную экспрессию и стабильную экспрессию. Он включает, без ограничения, транскрипцию гена в матричную РНК (мРНК) и трансляцию такой мРНК в полипептид(-ы). Если конечный требуемый продукт представляет собой биохимическое соединение, то экспрессия включает создание такого биохимического соединения и любых предшественников. В результате экспрессии гена образуется «генный продукт». В данном контексте генный продукт может представлять собой нуклеиновую кислоту, например, матричную РНК, получаемую транскрипцией гена, или полипептид, транслированный из транскрипта. Генные продукты, описанные в настоящем документе, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттрансляционными модификациями, например, полиаденилированием, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, присоединением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами, протеолитическим расщеплением и т.п.

[96] В данном контексте термин «нейровоспаление» относится к воспалению, возникающему в центральной нервной системе (ЦНС), которое характеризуется активацией астроцитов и микроглиальных клеток, образованием активных форм кислорода и экспрессией, например, сверхэкспрессией провоспалительных цитокинов в головном мозге. Типичные провоспалительные цитокины включают, но не ограничиваются этим, интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-1-бета (IL- 1β) и фактор некроза опухоли альфа (TNF-α). Нейровоспаление может быть вызвано заболеванием, расстройством или повреждением, таким как рассеянный склероз (MS), менингит, отек головного мозга, повреждение спинного мозга, травматическое повреждение головного мозга, вирусная или бактериальная инфекция, воздействие окружающей среды, такое как загрязнение или токсины, старение, или их комбинацией. В некоторых случаях нейровоспаление может быть причиной последующей нейродегенерации головного мозга, в других случаях нейровоспаление может быть результатом нейродегенерации.

[97] В данном контексте термин «нейродегенерация» относится к фактическому разрушению, повреждению или гибели клеток в ЦНС и головном мозге, например, к утрате структуры и/или нейронов или других клеток головного мозга. Нейродегенерация может быть результатом нейровоспаления и/или причиной нейровоспаления.

[98] В данном контексте термин «нейродегенеративное или нейровоспалительное заболевание, расстройство или повреждение» относится к полному объему заболеваний, расстройств или повреждений, которые в конечном итоге приводят к нейровоспалению или нейродегенерации. Примеры включают, без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, синдром Дауна, атаксию, амиотрофический боковой склероз (ALS), рассеянный склероз (MS), эпилепсию, менингит, отек головного мозга, повреждение спинного мозга, травматическое повреждение головного мозга, лобно-височную деменцию (FRD), нарушение когнитивных функций на фоне ВИЧ, волчанку ЦНС, легкое нарушение когнитивных функций или их комбинацию.

[99] Такие термины, как «лечит» или «лечение», или «лечить», или «облегчение», или «облегчать», относятся к терапевтическим мерам, которые обеспечивают исцеление, замедление, ослабление симптомов и/или предотвращение или замедление прогрессирования существующего диагностированного патологического состояния или расстройства. Такие термины, как «предупреждает», «предупреждение», «предотвращает», «сдерживание» и т.п., относятся к профилактическим или превентивным мерам, которые предотвращают развитие недиагностированного целевого патологического состояния или расстройства. Таким образом, «нуждающиеся в лечении» могут включать тех, которые уже страдают от расстройства; тех, которые предрасположены к приобретению расстройства; и тех, у которых необходимо предупредить расстройство.

[100] Термин «терапевтически эффективное количество» относится к такому количеству антитела, полипептида, полинуклеотида, низкомолекулярного органического соединения или другого лекарственного средства, которое является эффективным для «лечения» заболевания, расстройства или повреждения у субъекта или млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может обеспечивать уменьшение количества раковых клеток; замедление или остановку деления раковых клеток, снижение или замедление роста размера опухоли; ингибирование, например, подавление, замедление, предотвращение, остановку, отсрочку или реверсирование инфильтрации раковых клеток в периферические органы, включая, например, распространение рака в мягкие ткани и кости; ингибирование, например, подавление, замедление, предотвращение, сокращение, остановку, отсрочку или реверсирование метастазов опухоли; ингибирование, например, подавление, замедление, предотвращение, остановку, отсрочку или реверсирование роста опухоли; облегчение до некоторой степени одного или более симптомов, связанных с раком, снижение заболеваемости и смертности; улучшение качества жизни; или комбинацию указанных эффектов. В той степени, в которой лекарственное средство предотвращает рост и/или уничтожает существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим.

[101] Под «субъектом» или «индивидуумом», или «животным», или «пациентом», или «млекопитающим» понимают любого субъекта, в частности, млекопитающего субъекта, для которого необходим диагноз, прогноз или терапия. Млекопитающие субъекты включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных и животных в зоопарках, спортивных животных или домашних питомцев, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, свиньи, коровы, медведи и т.д.

[102] В данном контексте такие выражения, как «субъект, имеющий пользу от терапии» и «животное, нуждающееся в лечении», включают субъектов, таких как млекопитающие субъекты, которые будут иметь пользу от введения терапии, описанной в настоящем документе.

[103] В данном контексте термин «поставщик медицинских услуг» относится к индивидуумам или учреждениям, которые напрямую взаимодействуют и/или вводят терапевтические препараты живым субъектам, например, людям-пациентам. Неограничивающие примеры поставщиков медицинских услуг включают врачей, медсестер, техников, терапевтов, фармацевтов, консультантов, практиков альтернативной медицины, медицинские пункты, кабинеты врачей, больницы, отделения неотложной помощи, клиники, центры скорой помощи, клиники/учреждения альтернативной медицины и любые другие учреждения, обеспечивающие общее и/или специализированное лечение, оценку, поддержку, терапию, медицинский уход и/или консультации, связанные с общим состоянием здоровья или с любой частью состояния здоровья пациента, включая, но не ограничиваясь ими, общее медицинское, специализированное медицинское, хирургическое лечение и/или любой другой тип лечения, оценку, поддержание, терапию, медицинский уход и/или консультацию.

[104] В данном контексте термин «клиническая лаборатория» относится к пункту получения данных и/или проведения исследований, и/или обработки данных, полученных от живого субъекта, и/или материалов, полученных от живого субъекта, например, человека. Неограничивающие примеры обработки включают радиографическую (например, рентгеновскую), флюорографическую, томографическую (например, позитронно-эмиссионную томографию или ПЭТ-сканирование) или магнитно-резонанстную (МРТ) визуализацию субъекта, биологическое, биохимическое, серологическое, химическое, иммуногематологическое, гематологическое, биофизическое, цитологическое, патологическое, генетическое или иное изучение материалов, полученных из организма человека, с целою получения данных или информации, например, для постановки диагноза, предупреждения или лечения любого заболевания или нарушения, или для оценки состояния здоровья живых субъектов, например, людей. Такие исследования могут включать процедуры получения визуальных данных о субъекте, сбора или иного получения образца, препарирования, определения, измерения или иного описания наличия или отсутствия различных веществ в организме живого субъекта, например, человека, или в образце, полученном из организма живого субъекта, например, человека.

[105] В данном контексте термин «поставщик медицинского обеспечения» включает отдельные стороны, организации или группы, обеспечивающие, представляющие, предлагающие, оплачивающие полностью или частично, или иным образом связанные с предоставлением пациенту доступа к одной или более медицинским услугам, социальным пакетам, медицинским страховкам и/или учетным программам расходов на здравоохранение.

[106] В некоторых аспектах поставщик медицинских услуг может вводить или инструктировать другого поставщика медицинских услуг о введении терапевтического средства для лечения конкретного заболевания, расстройства или повреждения. Поставщик медицинских услуг может осуществлять или инструктировать другого поставщика медицинских услуг или пациента, которые оба находятся под руководством первого поставщика медицинских услуг, об осуществлении следующих действий: принятие участия в визуализирующем исследовании или осуществление визуализирующего исследования пациента, получение образца, обработка образца, отправка образца, прием образца, передача образца, анализ или измерение образца, количественное измерение образца, отправка результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки образца, прием результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки образца, сравнение/оценка результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки одного или более образцов, обеспечение сравнения/оценки одного или более образцов, получение сравнения/оценки одного или более образцов, введение терапии (например, посредством сравнения результатов визуализации в исходном состоянии с результатами, полученными после осуществления схемы лечения), начало введения терапии, прекращение введения терапии, продолжение введения терапии, временная приостановка введения терапии, увеличение количества вводимого терапевтического агента, уменьшение количества вводимого терапевтического агента, продолжение введения определенного количества терапевтического агента, увеличение частоты введения терапевтического агента, уменьшение частоты введения терапевтического агента, сохранение той же частоты введения доз терапевтического агента, замена терапии или терапевтического агента на по меньшей мере другую терапию или терапевтический агент, объединение терапии или терапевтического агента с по меньшей мере другой терапией или дополнительным терапевтическим агентом.

[107] В некоторых аспектах поставщик медицинского обеспечения может утверждать или отклонять, например, визуализирующие исследования, сбор образца, обработку образца, отправку образца, получение образца, передачу образца, анализ или измерение образца, количественное измерение образца, отправку результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки образца, передачу результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки образца, сравнение/оценку результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки одного или более образцов, передачу сравнения/оценки одного или более образцов, введение терапии или терапевтического агента, начало введения терапии или терапевтического агента, отмену введения терапии или терапевтического агента, продолжение введения терапии или терапевтического агента, временную приостановку введения терапии или терапевтического агента, увеличение количества вводимого терапевтического агента, уменьшение количества вводимого терапевтического агента, продолжение введения определенного количества терапевтического агента, увеличение частоты введения терапевтического агента, уменьшение частоты введения терапевтического агента, сохранение той же частоты введения доз терапевтического агента, замену терапии или терапевтического агента по меньшей мере другой терапией или терапевтическим агентом или объединение терапии или терапевтического агента с по меньшей мере другой терапией или дополнительным терапевтическим агентом. В некоторых аспектах поставщик медицинского обеспечения может утверждать или отклонять лечение на основании результатов дополнительного диагностического анализа, например, визуализирующих исследований, которые показывают, является ли определенная терапия эффективной у данного конкретного пациента.

[108] В некоторых аспектах клиническая лаборатория может, например, осуществлять визуализирующие исследования у пациента по назначению поставщика медицинских услуг, сравнивать исходные и последующие визуализирующие исследования после введения данной терапии, собирать или брать образец, обрабатывать образец, отправлять образец, принимать образец, передавать образец, анализировать или измерять образец, количественно оценивать образец, подавать результаты, полученные после анализа/измерения/количественной оценки образца, принимать результаты, полученные после анализа/измерения/количественной оценки образца, сравнивать/оценивать результаты, полученные после анализа/измерения/количественной оценки одного или более образцов, подавать сравнение/оценку одного или более образцов, получать сравнение/оценку одного или более образцов или родственные действия. Клиническая лаборатория обычно проводит тесты по назначению поставщика медицинских услуг или поставщика медицинского обеспечения и обычно работает под управлением поставщика медицинских услуг и/или поставщика медицинского обеспечения или в совместном предприятии с поставщиком медицинских услуг и/или с поставщиком медицинского обеспечения.

Описание целевого полипептида - SEMA4D

[109] В данном контексте термины «семафорин-4 В», «SEMA4D» и «полипептид SEMA4D» использованы взаимозаменяемо, как и «SEMA4D» и «Sema4D». В некоторых вариантах реализации SEMA4D экспрессируется на поверхности или секретируется клеткой. В другом варианте реализации SEMA4D связан с мембраной. В другом варианте реализации SEMA4D является растворимым, например, sSEMA4D. В другом варианте реализации SEMA4D может включать полноразмерный SEMA4D или его фрагмент, или полипептидный вариант SEMA4D, причем фрагмент SEMA4D или полипептидный вариант SEMA4D сохраняет некоторые или все функциональные свойства полноразмерного SEMA4D.

[110] Полноразмерный белок SEMA4D человека представляет собой гомодимерный трансмембранный белок, состоящий из двух полипептидных звеньев размером 150 кДа. SEMA4D принадлежит к семафориновому семейству рецепторов клеточной поверхности, и его также называют CD 100. И человеческий, и мышиный SEMA4D/Sema4D протеолитически расщепляются из их трансмембранной формы с образованием растворимых форм размером 120 кДа, в результате чего образуются две изоформы Sema4D (Kumanogoh et al., J. Cell Science 116(7):3464 (2003)). Семафорины состоят из растворимых и связанных с мембраной белков, которые были изначально описаны как факторы аксонального поиска пути, которые играют важную роль в установлении точных связей между нейронами и их соответствующей мишенью. Структурно относящийся к семафорину IV класса, SEMA4D состоит из аминоконцевой сигнальной последовательности, за которой следует характеристический домен «Sema», который содержит 17 консервативных цистеиновых остатков, Ig-подобный домен, богатое лизином удлинение, гидрофобная трансмембранную область и цитоплазматический концевой сегмент.

[111] Полипептид SEMA4D содержит сигнальную последовательность из примерно 13 аминокислот, за которой следует семафориновый домен из примерно 512 аминокислот, иммуноглобулин-подобный (Ig-подобный) домен из примерно 65 аминокислот, богатое лизином удлинение из 104 аминокислот, гидрофобная трансмембранная область из примерно 19 аминокислот и цитоплазматический концевой сегмент из 110 аминокислот. Сайт комплементарного считывания для фосфорилирования тирозина в цитоплазматическом концевом сегменте подтверждает предполагаемую связь SEMA4D с тирозинкиназой (Schlossman et al., ред. (1995) Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Оксфорд).

[112] Известно, что SEMA4D имеет по меньшей мере три функциональных рецептора, плексин В1, плексин В2 и CD72. Плексин В1 экспрессируется в нелимфоидных тканях, и было показано, что он является высокоаффинным (1 нМ) рецептором для SEMA4D (Tamagnone et al, Cell 99:71-80 (1999)). Показано, что стимулирование передачи сигналов плексина В1 под действием SEMA4D вызывает исчезновение конусов роста в нейронах и вызывает остановку удлинения отростков и апоптоз олигодендроцитов (Giraudon et al., J. Immunol. 7 72:1246-1255 (2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216 (2005)). После связывания с SEMA4D передача сигналов плексина В1 опосредует инактивацию R-Ras, что приводит к снижению опосредуемого интегрином присоединения к внеклеточному матриксу, а также к активации RhoA, приводящей к остановке реорганизации цитоскелета. См. Kruger et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:789-800 (2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61-64 (2005)). Плексин B2 имеет промежуточную аффинность к SEMA4D, и в недавнем отчете указано, что PLXNB2 экспрессируется на кератиноцитах и активирует 8ЕМА40-положительные Т-клетки γδ, способствуя восстановлению эпителия (Witherden et at, Immunity. 2012 Aug 24;37(2):314-25).

[113] В лимфоидных тканях CD72 используется в качестве низкоаффинного (300 нМ) рецептора SEMA4D (Kumanogoh et al, Immunity 13:621-631 (2000)). В-клетки и антиген-презентирующие клетки (АРС) экспрессируют CD72, и анти-CD72 антитела обладают многими из тех же эффектов, что и SSEMA4D, такими как усиление индуцируемых CD40 В-клеточных ответов и слущивания CD23 с В-клеток. Полагают, что CD72 действует в качестве отрицательного регулятора В-клеточных ответов посредством привлечения тирозинфосфатазы SHP-1, которая может связываться со многими ингибирующими рецепторами. Взаимодействие SEMA4D с CD72 приводит к диссоциации SHP-1 и утрате этого отрицательного сигнала активации. Было показано, что SEMA4D ускоряет стимуляцию Т-клеток и агрегацию и выживание В-клеток in vitro. Добавление клеток, экспрессирующих SEMA4D, или sSEMA4D усиливает индуцируемую CD40 пролиферацию В-клеток и выработку иммуноглобулинов in vitro, а также ускоряет ответы антител in vivo(Ishidaef al., Inter. Immunol. 15:1027-1034(2003); Kumanogoh and H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676 (2001)). sSEMA4D усиливает индуцируемое CD40 созревание DC, включая активацию костимуляторных молекул и увеличенную секрецию IL-12. Кроме того, sSEMA4D может ингибировать миграцию иммунных клеток, которую можно реверсировать посредством добавления блокирующих мышиных анти-SEMA4D антител (Elhabazief al, J. Immunol. 166:4341-4347(2001); Delaire et al, J. Immunol. 166:4348-4354(2001)).

[114] Sema4D в большом количестве экспрессируется в лимфоидных органах, включая селезенку, вилочковую железу и лимфатические узлы, а также в нелимфоидных органах, таких как головной мозг, сердце и почки. В лимфоидных органах Sema4D в большом количестве экспрессируется на покоящихся Т-клетках, но лишь слабо экспрессируется на покоящихся В-клетках и антиген-презентирующих клетках (АРС), таких как дендритные клетки (DC).

[115] Клеточная активация увеличивает поверхностную экспрессию SEMA4D, а также образование растворимого SEMA4D (sSEMA4D). Паттерн экспрессии SEMA4D указывает на то, что он играет важную физиологическую, а также патологическую роль в иммунной системе. Было показано, что SEMA4D стимулирует активацию, агрегацию и выживание В-клеток; усиливает индуцируемую CD40 пролиферацию и выработку антител; усиливает ответ антител на зависимые от Т-клеток антигены; усиливает пролиферацию Т-клеток; усиливает созревание дендритных клеток и способность стимулировать Т-клетки; и непосредственно участвует в демиелинизации и аксональной дегенерации (Shi et al, Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al, J Immunol 169:1175-1181 (2002); и Watanabe etal, J Immunol 167:4321-4328 (2001)).

Анти-SEMA4D антитела

[116] Антитела, которые связывают SEMA4D, описаны в данной области техники. См., например, публикации США №2008/0219971 A1, US 2010/0285036 A1 и US 2006/0233793 A1, международные патентные заявки WO 93/14125, WO 2008/100995 и WO 2010/129917, и Herold et al, Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995), все из которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых аспектах антитела, предложенные в настоящем документе, представляют собой антитела-антагонисты SEMA4D в том смысле, что они могут препятствовать, подавлять, блокировать или ликвидировать одну или более активностей или функций SEMA4D.

[117] В некоторых вариантах реализации антитело-антагонист SEMA4D блокирует взаимодействие SEMA4D с одним или более из его рецепторов, например, с плексином В1, плексином В2 и/или CD72. Анти-SEMA4D антитела, обладающие такими свойствами, можно использовать в способах, предложенных в настоящем документе. Антитела, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются этим, MAb VX15/2503, 67, 76, 2282 и их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, которые подробно описаны в US 2010/0285036 A1 и US 2008/0219971 A1. Mab VX 15/2503 в данном контексте также называют «VX15», и указанные термины могут быть использованы взаимозаменяемо. VX15 содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5. Дополнительные антитела, которые можно использовать в способах, предложенных в настоящем документе, включают антитело BD16, описанное в US 2006/0233793 A1, а также его антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные; или любые из MAb 301, MAb 1893, MAb 657, MAb 1807, MAb 1656, MAb 1808, Mab 59, MAb 2191, MAb 2274, MAb 2275, MAb 2276, MAb 2277, MAb 2278, MAb 2279, MAb 2280, MAb 2281, MAb 2282, MAb 2283, MAb 2284 и MAb 2285, а также любые из их фрагментов, вариантов или производных, описанных в US 2008/0219971 A1. В некоторых вариантах реализации анти-SEMA4D антитело для применения в способах, предложенных в настоящем документе, связывает человеческий, мышиный или человеческий и мышиный SEMA4D. Также пригодны антитела, которые связывают тот же эпитоп, что и любое из вышеупомянутых антител, и/или антитела, которые конкурентно ингибируют связывание или активность любого из вышеупомянутых антител.

[118] В некоторых вариантах реализации анти-SEMA4D антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, подходящие для способов, предложенных в настоящем документе, содержат аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, примерно 85%, примерно 88%, примерно 89%, примерно 90%, примерно 91%, примерно 92%, примерно 93%, примерно 94% или примерно 95% идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью молекулы сравнения анти-SEMA4D антитела, например, описанной выше. В дополнительном варианте реализации связывающая молекула имеет по меньшей мере примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или 100% идентичность последовательностей с антителом сравнения.

[119] В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное может ингибировать взаимодействие SEMA4D с его рецептором, например, плексином В1, плексином В2 или CD72. В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное может ингибировать SEMA4D-опосредованную передачу сигналов плексина В1.

[120] В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное конкурентно ингибирует антитело сравнения, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, от связывания с SEMA4D. В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное связывается с тем же эпитопом SEMA4D, что и антитело сравнения, которое содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых аспектах VH антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного содержит три участка, определяющих комплементарность, (CDR): HCDR1, HCDR2 и HCDR3, a VL содержит три cCDR: LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и указанные CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно, за исключением по меньшей мере одной, двух, трех, четырех, пяти или шести одиночных консервативных аминокислотных замен в одном или более CDR. В некоторых аспектах указанные CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно.

[121] В некоторых аспектах VH антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична SEQ ID NO: 1, и VL антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична SEQ ID NO: 5; или VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична SEQ ID NO: 9, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична SEQ ID NO: 10. В некоторых аспектах VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; или VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

[122] Способы, предложенные в настоящем документе, включают также применение полипептидов, кодирующих анти-SEMA4D антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, описанные в настоящем документе, полинуклеотидов, кодирующих такие полипептиды, векторов, содержащих такие полинуклеотиды, и клеток-хозяев, содержащих такие векторы или полинуклеотиды, при этом все они предназначены для выработки анти-SEMA4D антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных для применения в способах, описанных в настоящем документе.

[123] В способах настоящего изобретения можно использовать подходящие биологически активные варианта антител-антагонистов SEMA4D согласно настоящему изобретению. Такие варианты сохраняют требуемые связывающие свойства исходного анти-SEMA4D антитела. Способы получения вариантов антител общедоступны в данной области техники.

[124] Способы мутагенеза и изменений нуклеотидной последовательности хорошо известны в данной области техники. См., например, Walker and Gaastra, ред. (1983), Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al, Methods Enzymol. 154:367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Нью-Йорк); патент США №4873192; и ссылки, цитированные в них; которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Руководство в отношении надлежащих аминокислотных замен, которые не влияют на биологическую активность представляющего интерес полипептида, представлено в модели Dayhoff et al. (1978) в Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Вашингтон, округ Колумбия), cc. 345-352, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылки. В модели Dayhoff et al. использована матрица сходства аминокислот точковых общепринятых мутаций (РАМ) (матрица РАМ 250) для определения пригодных консервативных аминокислотных замен. В некоторых аспектах используют консервативные замены, такие как замена одной аминокислоты другой, имеющей сходные свойства. Примеры консервативных аминокислотных замен в соответствии с матрицей РАМ 250, описанной в модели Dayhoff et al, включают, но не ограничиваются этим, Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln и Phe↔Trp↔Tyr.

[125] При конструировании вариантов связывающей молекулы-антагониста SEMA4D, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представляющих интерес полипептидов, модификации вносят таким образом, что варианты продолжают обладать требуемыми свойствами, например, являются способными специфически связываться с SEMA4D, например, человеческим, мышиным или человеческим и мышиным SEMA4D, например, экспрессированным на поверхности или секретированным клеткой и обладающим активностью блокирования SEMA4D, как описано в настоящем документе. В некоторых аспектах мутации, внесенные в ДНК, кодирующую вариантный полипептид, сохраняют рамку считывания и не создают комплементарные участки, которые могут образовывать вторичную структуру мРНК. См. публикацию заявки на патент ЕР №75444.

[126] Способы измерения специфичности связывания связывающей молекулы анти-SEMA4D, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, включают, но не ограничиваются этим, стандартные конкурентные анализы связывания, анализы для мониторинга секреции иммуноглобулинов Т-клетками или В-клетками, анализы пролиферации Т-клеток, анализы апоптоза, иммуноферментные твердофазные анализы и т.п. См., например, такие анализы, описанные в WO 93/14125; Shi et al, Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al, J Immunol 769:1175-1181 (2002); Watanabe et al, J Immunol 767:4321-4328 (2001); Wang et al, Blood 97:3498-3504 (2001); и Giraudon et al, J Immunol 172(2): 1246-1255 (2004), все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

[127] Способы измерения анти-ангиогенной способности анти-SEMA4D антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного хорошо известны в данной области техники.

[128] При обсуждении в настоящем документе того, является ли какой-либо конкретный полипептид, включая константные области, CDR, VH-домены или VL-домены, описанные в настоящем документе, по меньшей мере примерно на 65%, примерно на 70%, примерно на 75%, примерно на 80%, примерно на 85%, примерно на 90%, примерно на 91%, примерно на 92%, примерно на 93%, примерно на 94%, примерно на 95%, примерно на 96%, примерно на 97%, примерно на 98%, примерно на 99% или даже примерно на 100% идентичными другому полипептиду, % идентичность можно определять с использованием способов и компьютерных программ/программного обеспечения, известных в данной области техники, таких как, но не ограничиваясь этим, программа BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, версии 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Мэдисон, штат Висконсин, 53711). BESTFIT использует алгоритм локальной гомологии Smith and Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2:482-489, для поиска наилучшего сегмента гомологии между двумя последовательностями. При использовании BESTFIT или любой другой программы выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной последовательности сравнения согласно настоящему изобретению, параметры устанавливают, безусловно, так, чтобы процент идентичности рассчитывался по всей длине полипептидной последовательности сравнения и чтобы в гомологии были допустимы пропуски вплоть до 5% от общего количества нуклеотидов в последовательности сравнения.

[129] Для целей настоящего изобретения, процентную идентичность последовательностей можно определять с использованием алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman с использованием аффинного поиска пропусков со штрафом за внесение делеции 12 и штрафом за продолжение делеции 2, матрицей BLOSUM 62. Алгоритм поиска гомологии Smith-Waterman описан в публикации Smith and Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2:482-489. Вариант может, например, отличаться от анти-SEMA4D антитела сравнения (например, MAb VX15/2503, 67, 76 или 2282) на 1-15 аминокислотных остатков, на 1-10 аминокислотных остатков, например, на 6-10, на 5, на 4, 3, 2 или даже на 1 аминокислотный остаток.

[130] Константная область анти-SEMA4D может быть подвержена мутагенезу различными способами для изменения эффекторной функции. Например, см. патент США №6737056 В1 и публикацию заявки на патент США №2004/0132101 А1, где описаны мутации Fc, которые оптимизируют связывание антитела с рецепторами Fc.

[131] В некоторых анти-SEMA4D антителах или их фрагментах, вариантах или производных, применимых в способах, предложенных в настоящем документе, Fc-часть может быть подвержена мутагенезу для снижения эффекторной функции с использованием способов, известных в данной области техники. Например, делеция или инактивация (посредством точковых мутаций или другими способами) домена константной области может снизить связывание Fc-рецептора циркулирующего модифицированного антитела, увеличивая локализацию в опухоли. В других случаях модификации константной области в соответствии с настоящим изобретением ослабляют связывание комплемента и, таким образом, сокращают период полувыведения из сыворотки. Другие модификации константной области можно использовать для модификации дисульфидных связей или олигосахаридных фрагментов, которые обеспечивают увеличенную локализацию вследствие повышенной специфичности к антигену или универсальности антитела. Полученный в результате физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты таких модификаций, такие как локализация в опухоли, биораспределение и период полувыведения из сыворотки, можно легко измерять и количественно определять с использованием хороо известных иммунологических способов, без лишних экспериментов.

[132] Анти-SEMA4D антитела для применения в способах, предложенных в настоящем документе, включают производные, которые модифицированы, например, посредством ковалентного присоединения любого типа молекулы к антителу, так чтобы ковалентное присоединение не препятствовало специфическому связыванию антитела с его когнатным эпитопом. Например, но не в качестве ограничения, производные антител включают антитела, модифицированные, например, посредством гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации с использованием известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любые из многочисленных химических модификаций можно проводить известными способами, включая, но не ограничиваясь этим, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование и т.д. Кроме того, производное может содержать одну или более неклассических аминокислот.

[133] «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь со сходным зарядом. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, известны в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветв ленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фелиналанин, триптофан, гистидин). Альтернативно, мутации можно вносить случайным образом вдоль всей кодирующей последовательности или ее части, например, посредством мутагенеза с насыщением, и полученные мутанты можно подвергать скринингу в отношении биологической активности для идентификации мутантов, которые сохраняют активность (например, способность связывать анти-SEMA4D полипептид или блокировать взаимодействие SEMA4D с его рецептором).

[134] Например, можно вносить мутации только в каркасные области или только в CDR-участки молекулы антитела. Внесенные мутации могут представлять собой молчащие или нейтральные миссенс-мутации, т.е. могут не иметь или иметь небольшой эффект на способность антитела связывать антиген. Эти типы мутаций могут быть подходящими для оптимизации использования кодона или для повышения выработки антител гибридомой. Альтернативно, не являющиеся нейтральными миссенс-мутации могут изменять способность антитела связывать антиген. Специалисты в данной области техники могут сконструировать и испытать мутантные молекулы с требуемыми свойствами, такими как отсутствие изменения антигенсвязывающей активности или изменение связывающей активности (например, улучшение антигенсвязывающей активности или изменение специфичности антитела). После мутагенеза кодируемый белок можно экспрессировать общепринятыми способами, а функциональную и/или биологическую активность кодируемого белка (например, способность иммуноспецифически связывать по меньшей мере один эпитоп полипептида SEMA4D) можно определять с использованием способов, описанных в настоящем документе, или посредством стандартной модификации способов, известных в данной области техники.

[135] В некоторых вариантах реализации антитела-антагонисты SEMA4D для применения в способах, предложенных в настоящем документе, содержат по меньшей мере один оптимизированный участок, определяющий комплементарность (CDR). Под «оптимизированным CDR» понимают, что CDR является модифицированным и оптимизированным для улучшения связывающей аффинности и/или анти-SEMA4D активности, которая сообщается анти-SEMA4D антителу, содержащему оптимизированный CDR. «Анти-SEMA4D активность» или «активность блокирования SEMA4D» может включать активность, которая модулирует один или несколько из следующих видов активности, связанных с SEMA4D: активация, агрегация и выживание В-клеток; индуцируемая CD40 пролиферация и выработка антител; ответ антител на зависимые от Т-клеток антигены; пролиферация Т-клеток или других иммунных клеток; созревание дендритных клеток; демиелинизация и аксональная дегенерация; апоптоз плюрипотентных предшественников нейронов и/или олигодендроцитов; индукция миграции эндотелиальных клеток; ингибирование самопроизвольной миграции моноцитов; ингибирование, отсрочка или снижение клеточного роста в опухоли или метастаза; связывание с плексином В1 клеточной поверхности или любая другая активность, связанная с растворимым SEMA4D или SEMA4D, который экспрессируется на поверхности клеток SEMA4D+. В конкретном варианте реализации анти-SEMA4D активность включает способность подавлять, задерживать возникновение или уменьшать метастазы опухоли, в комбинации с ингибированием, задержкой возникновения или уменьшением роста клеток первичной опухоли и метастазов опухоли или независимо от роста клеток первичной опухоли и метастазов опухоли. Ahth-SEMA4D активность также может быть объяснена снижением встречаемости или тяжести заболеваний, связанных с экспрессией SEMA4D, включая, но не ограничиваясь этим, определенные типы рака, включая лимфомы, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, включая воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС), отторжение трансплантата и инвазивный ангиогенез. Примеры оптимизированных антител на основе мышиного анти-SEMA4D MAb BD16 описаны в публикации США №2008/0219971 А1, в международной патентной заявке WO 93/14125 и в Herold et al., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995), все из которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Модификации могут затрагивать замену аминокислотных остатков в CDR, так чтобы анти-SEMA4D антитело сохраняло специфичность в отношении антигена SEMA4D и обладало улучшенной аффинностью связывания и/или усиленной активностью против SEMA4D.

Астроциты и активация астроцитов

[136] Астроциты представляют собой специализированные глиальные клетки, которые осуществляют многие важнейшие комплексные функции в здоровой ЦНС, включая регуляцию кровяного потока, жидкостный/ионный/рН/нейротрансмиттерный гомеостаз, образование/функцию синапсов, энергию и метаболизм, а также поддержание гематоэнцефалического барьера (Barres ВА, Neuron 60:430-440 (2008). Важно, что астроциты отвечают на повреждение ЦНС в ходе процесса, называемого реактивным астроглиозом, приводящим к образованию «реактивных астроцитов» или к «активации астроцитов», и указанные термины в данном контексте использованы взаимозаменяемо. Реактивный астроглиоз может служить в качестве главного патологического признака нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний. Растет количество данных о том, что реактивный астроглиоз может играть первичную или вспомогательную роль в расстройствах ЦНС вследствие утраты нормальных функций астроцитов или увеличения патологической активности. Учитывая их центральную роль во многих расстройствах ЦНС, существует значительная потребность в идентификации и точном испытании новых молекулярных мишеней, которые восстанавливают нормальную функцию астроцитов для эффективного замедления или даже реверсирования развития заболевания. Существует несколько потенциальных путей возможного влияния астроцитов на заболевания ЦНС.

[137] Астроциты могут играть центральную роль в функционировании головного мозга посредством нарушения активности нейронов вследствие распределения энергетических веществ из кровотока (например, усвоения глюкозы из капилляров) к нейронам. См. публикацию P. Lecca, Technical Report CoSBi 07/2007, University of Trento Centre for Computational and Systems Biology, доступную по адресу www.cosbi.eu/research/publications?pdf=5041 (последнее посещение 30 января 2017 года). В публикации Lecca описано, что вклад нейронов в церебро-кортикальный объем составляет не более 50%, и что астроциты численно превосходят нейроны (Id.). Один астроцит может контактировать со многими клетками. Астроциты представляют собой клетки звездчатой формы с многочисленными отростками, которые покрывают всю поверхность капилляров, питающих головной мозг. Таким образом, астроциты образуют первый клеточный барьер, с которым сталкивается глюкоза, поступающая в мозговую паренхиму. Следовательно, астроциты являются основным местом усвоения глюкозы в ЦНС (Id.).

[138] Усвоение глюкозы в астроцитах инициируется глутаматом (см. фиг.7, взятую из Raichle ME and Mintun MA, Ann. Rev. Neurosci. 29:449-76 (2006)). В публикации Raichle and Mintun указано, что усвоение глутамата запускает не окислительный расход глюкозы в астроцитах (аэробный гликолиз) и усвоение глюкозы из кровотока посредством транспортера глюкозы GLUT1. Глутамат является основным возбуждающим нейротрансмиттером коры головного мозга (фиг.7). См. также Hertz, L et at, J. Cerebr. Blood Flow Metab. 27:219-249 (2007), и Kasiscke, HD, et al, Science 305:99-103 (2004). Отростки астроцитов поддерживают синапсы между нейронами и могут усваивать свободный глутамат и превращать его в глутамин (Maragakis, NJ and JD Rothstein Nature Clinical Practice/Neurology 2:679-689 (2006)). Такое усвоение и превращение обусловливает расход энергии, и на одну молекулу усвоенного глутамата необходимо две молекулы АТФ. Регуляция уровней глутамата на синапсах является важной, поскольку избыточный возбуждающий трансмиттер может иниицировать эксайтотоксичность и нейродегенерацию.

[139] Однако в процессе реактивного астроглиоза астроциты могут втягивать свои отростки и уже не поддерживать синапсы или не усваивать избыточный глутамат. Соответственно, может быть снижен метаболизм глюкозы в астроцитах и, в частности, усвоение глюкозы из капилляров. Реактивные астроциты понижающе регулируют глутаматный рецептор и соответствующий гликолиз и транспорт глюкозы, что можно обнаружить по сниженному сигналу ФДГ-ПЭТ. Реактивный астроглиоз является основным патологическим признаком нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний. Растет количество данных о том, что реактивный астроглиоз может играть первичную или вспомогательную роль в расстройствах ЦНС вследствие утраты нормальных функций астроцитов или увеличения патологической активности. Учитывая их центральную роль во многих расстройствах ЦНС, существует значительная потребность в идентификации и точном испытании новых молекулярных мишеней, которые восстанавливают нормальную функцию астроцитов для эффективного замедления или даже реверсирования развития заболевания. Существует несколько потенциальных путей возможного влияния астроцитов на заболевания ЦНС.

[140] Астроциты и поддержка клеток-предшественников олигодендроцитов (ОРС). Демиелинизация, которая возникает при нейровоспалительных заболеваниях, таких как рассеянный склероз, связана с заметным разрушением и потерей клеток, содержащих клеточную линию олигодендроцитов (Ozawa K, et al. Brain 117:1311-1322 (1994)). Механизмы эндогенной ремиелинизации во время восстановительной фазы не работают, отчасти вследствие неспособности ОРС полностью дифференцироваться в зрелые миелинизирующие олигодендроциты (Wolswijk G. Brain 723:105-115 (2000)). Данные, полученные из других экспериментально индуцированных моделей демиелинизации, свидетельствуют о том, что вновь созревающие ОРС, в отличие от выживающих зрелых олигодендроцитов, необходимы для ремиелинизации во время восстановительной фазы (Levine JM, Reynolds R. Exp Neurol. 760:333-347 (1999)). Показано, что астроциты играют важную роль в поддержании функции и жизнеспособности клеточной линии олигодендроцитов. Например, Talbott и его коллеги показали, что в повреждениях, демиелинизированных под действием бромида этидия, астроциты необходимы для полной дифференцировки ОРС Nkx2.2+/Oli2+ в олигодендроциты и осуществления ремиелинизации (Talbott, JF, et al., Exp Neurol. 192:11-24 (2005)). Учеными Arai and Lo показано in vitro, что астроциты обеспечивают поддержку ОРС благодаря растворимому трофическому фактору, который защищает указанные клетки от повышенного окислительного стресса (Arai, K. and Lo, Е. Н. J. Neurosci. Res. 88: 758-763 (2010)). Другими показано, что ингибирование активации астроцитов в условиях экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, экспериментального неврита зрительного нерва и повреждения спинного мозга приводит к улучшению профилей ремиелинизации и параметров функционального исхода болезни (Brambilla R, et at, J Immunol 752:2628-2640 (2009); Brambilla R, et al, J Neuroinflammation 9:213; Brambilla R, et al, J Exp Med 202:145-156 (2005)).

[141] Учитывая роль, которую астроциты играют в облегчении выживания и функции ОРС, непосредственную близость SEMA4D-экспрессирующих ОРС и астроцитов, экспрессирующих рецептор SEMA4D, можно предположить, что связанная с болезнью активация астроцитов с сопутствующей активацией рецепторов плексина В и передачи сигналов SEMA4D могут влиять на функцию ОРС.

[142] Астроциты и нейроналъная поддержка. Растущее количество данных свидетельствует о том, что астроциты играют роль в синаптической трансмиссии посредством регулируемого высвобождения синаптически активных молекул, включая глутамат, пурины (АТФ и аденозин), GABA и D-серин (см. обзор Halassa MM et al, Trends Mol Med 73:54-63 (2007); Nedergaard M et al Trends Neurosci 26:523-530 (2003)). Высвобождение таких глиотрансмиттеров происходит в ответ на изменение нейрональной синаптической активности, затрагивает возбудимость астроцитов, что отражается в усилении кальциевой сигнализации астроцитов, и может изменять нейрональную возбудимость (Id.). Помимо оказания непосредственного влияния на синаптическую активность посредством высвобождения глиотрансмиттеров, астроциты могут оказывать мощное и долгосрочное действие на синаптическую функцию посредством высвобождения факторов роста и родственных молекул (Barres ВА Neuron 60:430-440 (2008)).

[143] Астроциты и целостность гематоэнцефалического барьера (ВВВ). Астроциты играют важнейшую роль в образовании гематоэнцефалического барьера (blood-brain barrier, ВВВ) и в регуляции транспорта через ВВВ, гомеостатичекого процесса, критичного для правильной нейрональной функции. ВВВ представляет собой весьма сложную эндотелиальную структуру головного мозга дифференцированной нейрососудистой системы, состоящую из перицитов, астроцитов и эндотелиальных клеток. Нарушение ВВВ участвует во многих нейродегенеративных заболеваниях, включая менингит, отек головного мозга, эпилепсию, болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), инсульт, амиотрофический боковой склероз (ALS) и рассеянный склероз (MS) (см. обзор Zlokovic BV Nat Rev Neurosci. 12:723-73% (2011)).

[144] Астроциты представляют собой «поляризованные» клетки, поскольку они распространяют специализированные мембранные процессы, состоящие из уникальных клеточных механизмов и компонентов мембраны, которые взаимодействуют с определенными типами клеток. Например, астроцитарные процессы вблизи церебральных микрососудов или мягкой оболочки мозга характеризуются высокой плотностью водного канала, аквапорина 4 (Aqp4) (Neely JD, et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95:14108-14113 (2001); Amiry-Moghaddam M, et al, Proc Natl Acad Sci USA 700:2106-2111 (2003)). Напротив, астроцитарные процессы, сталкивающиеся с синаптическими областями, обогащены транспортерами глутамата, при этом плотность Aqp4 является сравнительно низкой (Nielsen S et al, (1997) J Neurosci 77:171-180 (1997); Chaudhry FA et al, Neuron 75:711-720 (1995)). Астроцитарная поляризация в головном мозге, подверженном нейродегенерации, нарушена. Например, при болезни Альцгеймера интенсивность окрашивания Aqp4 существенно снижается в областях с существенным содержанием амилоидных бляшек. Действительно, автором Yang и его коллегами показано, что нарастание амилоидной патологии у мышей tg-ArcSwe AD временным и пространственным образом связано с потерей поляризации астроцитов (Yang JL, et al, J Alzheimer's Dis. 27:711-22 (2011)).

[145] Роль передачи сигналов SEMA4D в ускорении активации астроцитов и реактивного астроглиоза. Учитывая взаимосвязь экспрессии рецептора SEMA4D и маркера активации астроцитов GFAP, существует возможность, что передача сигналов SEMA4D может усиливать активацию астроцитов, обеспечивая «упреждающий» механизм во время болезненного состояния. См., например, патент США №9249227, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[146] Усиленное усвоение глюкозы в областях головного мозга как ранний показатель эффективности лечения антитело м-антагонистом SEMA4D

[147] В настоящем изобретении предложен тест раннего биомаркера для определения того, будет ли лечение антитело м-антагонистом SEMA4D эффективным при лечении нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения у субъекта. Тест предусматривает измерение исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге пациента, например, с помощью позитронно-эмиссионной томографии с использованием радиофармпрепарата ¹⁸F-фтордезоксиглюкозы (ФДГ-ПЭТ), введение субъекту одной или более первоначальных доз антитела-антагониста SEMA4D и затем повторное измерение усвоения глюкозы в головном мозге субъекта. Пациенты, страдающие от накопленного дефицита усвоения глюкозы в головном мозге, в данном контексте иногда упоминаемого как исторический дефицит, например, вследствие накопления реактивных астроцитов при болезненной патологии, описанной в иных местах настоящего документа, будут представлены как восприимчивые к лечению антителом-антагонистом SEMA4D, если повторное измерение усвоения глюкозы, например, с помощью ФДГ-ПЭТ, демонстрирует увеличение по сравнению с измерением исходного уровня. Это будет означать, что дефицит усвоения глюкозы связан с патогенным механизмом, который можно реверсировать с помощью антагониста SEMA4D. Дефицит усвоения глюкозы может развиваться в течение нескольких недель, месяцев или лет до начала лечения. При отсутствии наблюдаемого усиления сигнала ФДГ-ПЭТ можно сделать вывод, что пациент не восприимчив к лечению антителом-антагонистом SEMA4D либо вследствие того, что у пациента нет дефицита усвоения глюкозы в головном мозге, либо вследствие того, что патогенная причина такого дефицита при данном заболевании или у данного пациента не может быть реверсирована посредством лечения антагонистом SEMA4D. В любом случае, затем можно скорректировать или прекратить лечение антителом-антагонистом SEMA4D.

[148] В некоторых аспектах настоящего изобретения предложен способ определения того, будет ли эффективным антитело-антагонист семафорина 4D (SEMA4D) или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное при лечении определенного или конкретного нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения, и указанный способ включает: введение эффективного количества антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного субъекту, страдающему, предположительно страдающему или имеющему риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; измерение степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта по сравнению с исходным уровнем усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, измеренным до введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, варианта или производного; и продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, варианта или производного, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или прекращение или корректирование введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, варианта или производного, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня.

[149] В некоторых аспектах измерение усвоения глюкозы в головном мозге можно осуществлять, например, в клинической лаборатории, под четким руководством и контролем поставщика медицинских услуг. В некоторых аспектах поставщик медицинских услуг может назначить проведение измерения усвоения глюкозы в головном мозге. В некоторых аспектах измерение усвоения глюкозы в головном мозге можно осуществлять в клинической лаборатории, и затем клиническая лаборатория может инструктировать или давать рекомендации поставщику медицинских услуг относительно наилучшего лечения данного субъекта или пациента. Например, предложенный способ может включать измерение, например, в клинической лаборатории, исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, страдающего, предположительно страдающего или имеющего риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; и затем повторное измерение уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения субъекту антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного поставщиком медицинских услуг; и затем инструктаж поставщика медицинских услуг о продолжении введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, варианта или производного, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или инструктаж поставщика медицинских услуг о прекращении введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, варианта или производного, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня. В некоторых аспектах введение антитела-антагониста SEMA4D и измерение усвоения глюкозы в головном мозге субъекта может осуществлять один и тот же человек или учреждение. В некоторых аспектах способы, предложенные в настоящем изобретении, могут быть назначены поставщиком медицинского обеспечения до утверждения оплаты дальнейшего лечения антителом-антагонистом SEMA4D.

[150] Специалистам в данной области техники понятно, что «эффективная доза» антитела-антагониста SEMA4D может варьироваться между отдельными субъектами или пациентами. В настоящем изобретении дополнительно предложен способ, в котором осуществляют определение эффективной дозы для конкретного субъекта. Измеряя изменение усвоения глюкозы в головном мозге конкретного субъекта, поставщик медицинских услуг может применять способ, предложенный в настоящем изобретении, для изменения доз с целью подбора наиболее эффективной дозы для данного субъекта. Например, если после введения антитела-антагониста SEMA4D наблюдается отсутствие изменения или лишь небольшое изменение усвоения глюкозы относительно исходного значения, то дозу антитела можно увеличить, с последующим повторным измерением усвоения глюкозы в головном мозге субъекта. Если наблюдается изменение, то поставщик медицинских услуг может продолжать лечение субъекта с применением данной дозы. В некоторых аспектах можно проводить многократные измерения усвоения глюкозы для «точного подбора» оптимальной дозы антитела-антагониста SEMA4D для данного субъекта или пациента. Однако следует соблюдать осторожность, чтобы прошло достаточно времени для накопления исторического или актуального дефицита, который можно реверсировать посредством лечения субъекта антагонистом SEMA4D. Для каждого рассматриваемого заболевания его можно установить посредством отсрочки возобновления лечения от нескольких месяцев до нескольких лет в случае чрезвычайно медленно прогрессирующего заболевания.

[151] В настоящем изобретении дополнительно предложен способ лечения субъекта, страдающего, предположительно страдающего или имеющего риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения, и указанный способ включает: введение антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного субъекту, страдающему, предположительно страдающему или имеющему риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения; измерение степени усвоения глюкозы в головном мозге субъекта по сравнению с исходным уровнем усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, измеренным, например, с помощью ФДГ-ПЭТ, до указанного введения; и продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, варианта или производного, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня; или прекращение или корректирование введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, варианта или производного, если обнаружено отсутствие изменения или снижение усвоения глюкозы относительно исходного уровня. Способ лечения может дополнительно включать измерение исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, или в некоторых аспектах такое измерение исходного значения можно осуществлять предварительно.

[152] Как указано выше, предложенный способ лечения можно дополнительно «точно регулировать» посредством дополнительных измерений усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения определенных доз антитела-антагониста SEMA4D. Кроме того, измерение усвоения глюкозы в процессе лечения можно осуществлять, например, в клинической лаборатории, под четким руководством и контролем поставщика медицинских услуг. В некоторых аспектах поставщик медицинских услуг может назначить проведение измерения усвоения как часть лечебной схемы. В некоторых аспектах измерение усвоения глюкозы можно осуществлять в клинической лаборатории, и затем клиническая лаборатория может инструктировать или давать рекомендации поставщику медицинских услуг относительно лечения данного субъекта или пациента. В некоторых аспектах введение антитела-антагониста SEMA4D и измерение усвоения глюкозы в головном мозге субъекта может осуществлять один и тот же человек или учреждение. В некоторых аспектах способы, предложенные в настоящем изобретении, могут быть назначены поставщиком медицинского обеспечения до утверждения оплаты дальнейшего лечения антителом-антагонистом SEMA4D.

[153] В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент, вариант или производное для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, может ингибировать взаимодействие SEMA4D с его рецептором, например, плексином В1, плексином В2 или CD72. В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент, вариант или производное может ингибировать SEMA4D-опосредованную передачу сигналов плексина В1. В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент, вариант или производное относится к антителу-антагонисту SEMA4D VX15. Например, в некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент, вариант или производное может конкурентно ингибировать или связывать тот же эпитоп, что и VX15, т.е. антитело сравнения, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, от связывания с SEMA4D. В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D содержит VH с тремя участками, определяющими комплементарность, (CDR): HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VLc тремя CDR: LCDR1, LCDR2 и LCDR3, причем указанные CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно, за исключением по меньшей мере одной, двух, трех, четырех, пяти или шести одиночных консервативных аминокислотных замен в одной или более CDR. В некоторых аспектах антитело-антагонист SEMA4D содержит VH с тремя участками, определяющими комплементарность, (CDR): HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VL с тремя CDR: LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и при этом указанные CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно. В некоторых аспектах VH антитела-антагониста SEMA4D имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентична SEQ ID NO: 1, и VL антитела-антагониста SEMA4D имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентична SEQ ID NO: 5; или VH имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентична SEQ ID NO: 9; и VL имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% идентична SEQ ID NO: 10. В некоторых аспектах VH антитела-антагониста SEMA4D имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL антитела-антагониста SEMA4D имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; или VH антитела-антагониста SEMA4D имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и VL антитела-антагониста SEMA4D имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

[154] В соответствии со способами, предложенными в настоящем изобретении, можно вводить первую дозу антитела-антагониста SEMA4D, а затем можно вводить дополнительные дозы антитела-антагониста SEMA4D, например, по меньшей мере один раз в неделю, по меньшей мере один раз в две недели, по меньшей мере один раз в три недели, по меньшей мере один раз в месяц или по меньшей мере один раз в два месяца и т.д. Если обнаружено, что лечение является эффективным в соответствии со способами, предложенными в настоящем документе, то введение антитела SEMA4D можно продолжать столько, сколько это необходимо, в некоторых случаях на протяжении всей жизни субъекта или пациента, или в других случаях в течение ограниченного периода времени до достижения сдерживания развития, исцеления или устранения симптомов нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения субъекта или пациента.

[155] В соответствии со способами, предложенными в настоящем изобретении, измерение исходного усвоения глюкозы в головном мозге субъекта обычно проводят непосредственно перед введением первой дозы антитела-антигониста SEMA4D, но в некоторых случаях его можно проводить раньше, или в некоторых случаях его можно проводить сразу после введения первой дозы антитела-антагониста SEMA4D. В тех способах, в которых оценивают коррекцию доз, измерение нового «исходного значения» можно проводить спустя некоторое время после введения первой дозы, от нескольких месяцев до нескольких лет, в зависимости от скорости прогрессирования заболевания. Относительно измерения исходного уровня, восстановление накопленного или «исторического» дефицита усвоения глюкозы, который является маркером эффективного лечения антителом-антагонистом SEMA4D, может происходить вскоре после введения первой дозы антитела-антагониста SEMA4D, или через некоторое время, или необходимо наблюдать несколько доз антитела-антагониста SEMA4D с применением доступной технологии, например, ФДГ-ПЭТ. Соответственно, повторное измерение усвоения глюкозы в головном мозге субъекта относительно исходного уровня можно проводить, например, по меньшей мере через одну неделю после введения первой дозы, по меньшей мере через две недели после введения первой дозы, по меньшей мере через один месяц после введения первой дозы, по меньшей мере через два месяца после введения первой дозы, по меньшей мере через три месяца после введения первой дозы, по меньшей мере через четыре месяца после введения первой дозы, по меньшей мере через пять месяцев после введения первой дозы, по меньшей мере через шесть месяцев после введения первой дозы, или в любой их комбинации.

[156] В некоторых аспектах пациент или субъект, проходящий лечение в соответствии со способами, предложенными в настоящем изобретении, является млекопитающим субъектом, например, грызуном, низшим приматом или человеком.

[157] Нейродегенеративное или нейровоспалительное заболевание, расстройство или повреждение, при котором может быть эффективно введение антитела-антагониста SEMA4D в соответствии со способами, предложенными в настоящем изобретением, может представлять собой, например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, синдром Дауна, атаксию, амиотрофический боковой склероз (ALS), рассеянный склероз (MS), эпилепсию, менингит, отек головного мозга, повреждение спинного мозга, травматическое повреждение головного мозга, лобно-височную деменцию (FTD), нарушение когнитивных функций на фоне ВИЧ, волчанку ЦНС, легкое нарушение когнитивных функций или их комбинацию.

[158] В некоторых аспектах заболевание представляет собой болезнь Хантингтона (HD), как описано в иных местах настоящего документа. В некоторых аспектах субъект имеет риск развития HD вследствие семейного анамнеза HD или генетического тестирования, например, если тест показал, что ген НТТ субъекта содержит 36 или более повторов CAG. Преимущество способов, предложенных в настоящем изобретении, заключается в том, что такие субъекты зачастую не проявляют внешние симптомы HD, но явно имеют риск. Как показано в разделе «Примеры», раннее лечение может обеспечивать преимущество по сравнению с более поздним лечением, и для таких индивидуумов можно определить, будет ли для них эффективным лечение антитело м-антагонистом SEMA4D в соответствии со способами, предложенными в настоящем изобретении, задолго до того, как они начнут проявлять какие-либо внешние симптомы. В некоторых аспектах субъект предположительно страдает HD на основании, например, легкой двигательной дисфункции, легкого нарушения когнитивных функций или легких нейропсихиатрических признаков. Тесты для определения таких легких дисфункций хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны в литературных источниках, например, Bates, GP, et al., Nature Reviews/Disease Primers 7:1-21 (2015). В некоторых аспектах у субъекта уже диагностирована HD на основании, например, повышенной оценки болезни Хантингтона по унифицированной шкале Международного общества расстройств движений (UHDRS), повышенной оценки по комплексному исследованию когнитивных функций при болезни Хантингтона (HD-CAB), количественной оценки силы мышц или их комбинации. Те субъекты, для которых установлен риск HD, могут находиться на предсимптоматической стадии HD, на ранней продромальной стадии HD, на поздней продромальной стадии HD и, после постановки диагноза, на стадии раннего проявления HD, на стадии умеренного проявления HD или на стадии прогрессирующего проявления HD. Признаки и симптомы различных стадий HD представлены, например, в публикации Bates, GP, et at, Nature Reviews/Disease Primers 7:1-21 (2015).

Способы лечения с применением антител-антагонистов SEMA4D

[159] Диагностические способы согласно настоящему изобретению относятся к применению антител-антагонистов SEMA4D, включая их антигенсвязывающие фрагменты, варианты и производные, для лечения субъекта, страдающего от нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения, или для оценки того, будет ли лечение с применением антитела-антагониста SEMA4D эффективным для лечения данного субъекта. Несмотря на то, что следующее описание относится к введению антитела-антагониста SEMA4D, способы, описанные в настоящем изобретении, также применимы к антигенсвязывающим фрагментам, вариантами и производным антитела-антагониста SEMA4D или к другим биологическим или низкомолекулярным соединениям, которые сохраняют требуемые свойства антитела-антагониста SEMA4D согласно настоящему изобретению, например, могут специфически связывать SEMA4D, например, человеческий, мышиный или человеческий и мышиный SEMA4D, обладают активностью нейтрализации SEMA4D и/или блокируют взаимодействие SEMA4D с его рецептором, например, плексином В1.

[160] В одном аспекте настоящего изобретения предложено введение пациенту антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, или другого биологического или низкомолекулярного соединения, которое связывается и нейтрализует SEMA4D, как описано в настоящем изобретении, причем указанный пациент страдает или предположительно страдает, или имеет риск развития нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения. В другом аспекте лечение также предусматривает введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей антитело-антагонист SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанный пациент страдает или предположительно страдает, или имеет риск развития нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения.

[161] Антитела-антагонисты SEMA4D или их связывающие фрагменты, описанные в настоящем изобретении, пригодны для лечения различных нейровоспалительных или нейродегенеративных заболеваний, расстройств или повреждений. В некоторых аспектах лечение предназначено для улучшения симптомов, связанных с заболеванием, расстройством или повреждением. В других вариантах реализации лечение предназначено для ослабления, замедления или остановки усиления проявления симптомов. В других аспектах лечение предназначено для ингибирования, например, подавления, замедления, предупреждения, остановки или реверсирования проявления симптомов. В других аспектах лечение предназначено для облегчения до некоторой степени одного или более симптомов, связанных с расстройством. В таких случаях симптомы могут быть, например, нейропсихиатрическими симптомами, когнитивными симптомами и/или двигательной дисфункцией. В других аспектах лечение предназначено для снижения заболеваемости и смертности. В других аспектах лечение предназначено для улучшения качества жизни.

[162] В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению антител-антагонистов SEMA4D или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных в качестве лекарственного средства, в частности, для применения при лечении различных нейровоспалительных или нейродегенеративных заболеваний, расстройств или повреждений для улучшения симптомов, связанных с расстройством.

[163] В соответствии со способами согласно настоящему изобретению, по меньшей мере одно антитело-антагонист SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, или другое биологическое или низкомолекулярное соединение, определение которого приведено в иных местах настоящего описания, можно использовать для ускорения положительного терапевтического ответа в отношении нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения. «Положительный терапевтический ответ» в отношении нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения включает улучшение симптомов, связанных с расстройством. Такие положительные терапевтические ответы не ограничены способом введения и могут включать введение донору, в донорную ткань (такое как, например, органная перфузия), реципиенту или любой их комбинации и т.п. В частности, способы, предложенные в настоящем изобретении, направлены на ингибирование, предупреждение, снижение, облегчение или ослабление прогрессирования нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения у пациента. Так, например, улучшение расстройства может характеризоваться отсутствием клинически заметных симптомов, снижением частоты возникновения клинически заметных симптомов или изменением клинически заметных симптомов.

[164] Антитела-антагонисты SEMA4D или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, или другие биологические или низкомолекулярные соединения можно использовать в комбинации с по меньшей мере одним или более другими способами лечения нейровоспалительных или нейродегенеративных заболеваний, расстройств или повреждений; при этом дополнительную терапию вводят до, во время или после терапии с применением антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного. Таким образом, если комбинированная терапия включает введение антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного в комбинации с введением другого терапевтического агента, то способы согласно настоящему изобретению включают совместное введение, применение отдельных лекарственных форм или одной фармацевтической формы с одновременным или последовательным введением в любом порядке.

[165] В некоторых аспектах нейровоспалительное или нейродегенеративное заболевание, расстройство или повреждение может представлять собой, например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, синдром Дауна, атаксию, амиотрофический боковой склероз (ALS), лобно-височную деменцию (FRD), нарушение когнитивных функций на фоне ВИЧ, волчанку ЦНС, легкое нарушение когнитивных функций, рассеянный склероз, эпилепсию, менингит или их комбинацию. В некоторых аспектах любого из вышеуказанных способов нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Хантингтона.

[166] В некоторых аспектах поставщик медицинских услуг может обеспечивать введение или инструктаж другого поставщика медицинских услуг о введении терапии, содержащей эффективное количество антитела-антагониста SEMA4D, причем субъект страдает, предположительно страдает или имеет риск приобретения нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения. Поставщик медицинских услуг может осуществлять или инструктировать другого поставщика медицинских услуг или пациента об осуществлении следующих действий: получение образца или изображения, обработка образца или изображение, отправка образца или изображения, прием образца или изображения, передача образца или изображения, анализ или измерение образца или изображения, количественное измерение образца или изображения, отправка результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки образца или изображения, прием результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки образца или изображения, сравнение/оценка результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки одного или более образцов или изображений, обеспечение сравнения/оценки одного или более образцов, получение сравнения/оценки одного или более образцов или изображений, введение терапии, например, эффективного количества антитела-антагониста SEMA4D, начало введения терапии, прекращение введения терапии, продолжение введения терапии, временная приостановка введения терапии, увеличение количества вводимого терапевтического агента, уменьшение количества вводимого терапевтического агента, продолжение введения определенного количества терапевтического агента, увеличение частоты введения терапевтического агента, уменьшение частоты введения терапевтического агента, сохранение той же частоты введения доз терапевтического агента, замена терапии или терапевтического агента на по меньшей мере другую терапию или терапевтический агент, объединение терапии или терапевтического агента с по меньшей мере другой терапией или дополнительным терапевтическим агентом.

[167] В некоторых аспектах поставщик медицинского обеспечения может утверждать или отклонять, например, проведение визуализации, получение образца или изображения, обработку образца или изображения, отправку образца или изображения, получение образца или изображения, передачу образца или изображения, анализ или измерение образца или изображения, количественное измерение образца или изображения, отправку результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки образца или изображения, передачу результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки образца или изображения, сравнение/оценку результатов, полученных после анализа/измерения/количественной оценки одного или более образцов или изображений, передачу сравнения/оценки одного или более образцов или изображений, введение терапии или терапевтического агента, начало введения терапии или терапевтического агента, отмену введения терапии или терапевтического агента, продолжение введения терапии или терапевтического агента, временную приостановку введения терапии или терапевтического агента, увеличение количества вводимого терапевтического агента, уменьшение количества вводимого терапевтического агента, продолжение введения определенного количества терапевтического агента, увеличение частоты введения терапевтического агента, уменьшение частоты введения терапевтического агента, сохранение той же частоты введения доз терапевтического агента, замену терапии или терапевтического агента по меньшей мере другой терапией или терапевтическим агентом или объединение терапии или терапевтического агента с по меньшей мере другой терапией или дополнительным терапевтическим агентом.

[168] Кроме того, поставщик медицинского обеспечения может, например, утверждать или отклонять предписание терапии, утверждать или отклонять охват терапии, утверждать или отклонять возмещение стоимости терапии, определять или отклонять право на терапию и т.д.

[169] В некоторых аспектах клиническая лаборатория может, например, брать или получать образец или изображение, обрабатывать образец или изображение, отправлять образец или изображение, принимать образец или изображение, передавать образец или изображение, анализировать или измерять образец или изображение, количественно измерять образец или изображение, обеспечивать результаты, полученные после анализа/измерения/количественного измерения образца или изображения, принимать результаты, полученные после анализа/измерения/количественного измерения образца или изображения, сравнивать/оценивать результаты, полученные после анализа/измерения/количественного измерения одного или более образцов или изображений, обеспечивать сравнение/оценку одного или более образцов или изображений, получать сравнение/оценку одного или более образцов или изображений или осуществлять аналогичные действия.

[170] В некоторых аспектах любую из вышеуказанных процедур можно применять для определения того, страдает ли субъект от нейровоспалительного или нейродегенеративного заболевания, расстройства или повреждения, при котором изменение усвоения глюкозы может быть патогенным фактором, подлежащим лечению антагонистом SEMA4D.

[171] В некоторых аспектах поставщик медицинских услуг, клиническая лаборатория или иное учреждение может, например, собирать или получать изображение, обрабатывать изображение, отправлять изображение, принимать изображение, передавать изображение, анализировать или измерять изображение, количественно измерять изображение, обеспечивать результаты, полученные после

анализа/измерения/количественного измерения изображения, принимать результаты, полученные после анализа/измерения/количественного измерения изображения, сравнивать/оценивать результаты, полученные после анализа/измерения/количественного измерения одного или более изображений, обеспечивать сравнение/оценку одного или более изображений, получать сравнение/оценку одного или более изображений или осуществлять аналогичные действия. Изображения, которые можно использовать в таких аспектах, включают, но не ограничиваются ими, изображения, полученные с помощью ангиографии, ультразвука, компьютерной томографии (КТ), магнитно-резонанс ной томографии (МРТ), позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), например, ФДГ-ПЭТ, оптической когерентной томографии (ОКТ), спектроскопии в ближнем инфракрасном диапазоне (NIRS) и NIR флуоресценции. В некоторых вариантах реализации можно использовать технологии визуализации, описанные в литературных источниках (Tardif et al. Circ Cardiovasc Imaging 4:319-333 (2011)).

Фармацевтические композиции и способы введения

[172] Способы получения и введения субъекту, нуждающемуся в этом, антител-антагонистов SEMA4D или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных хорошо известны или могут быть легко установлены специалистом в данной области техники. Способ введения антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного может быть, например, пероральным, парентеральным, ингаляционным или местным. Термин «парентеральный» в данном контексте включает, например, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Несмотря на то, что все эти формы введения в явном виде предусмотрены как входящие в объем настоящего изобретения, примером формы введения является раствор для инъекций, в частности, для внутривенной или интраартериальной инъекции или капельницы. Подходящая фармацевтическая композиция для инъекции может содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизирующий агент (например, человеческий альбумин) и т.д. Однако в других способах, соответствующих идее настоящего изобретения, антитела-антагонисты SEMA4D или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные можно доставлять непосредственно в очаг неблагоприятной клеточной популяции, усиливая воздействие терапевтического агента на пораженную ткань.

[173] Как описано в настоящем изобретении, антитела-антагонисты SEMA4D или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для in vivo лечения нейровоспалительных или нейродегенеративных заболеваний, расстройств или повреждений. В этом отношении следует понимать, что описанные антитела-антагонисты SEMA4D можно составлять в лекарственные формы для облегчения введения и повышения стабильности активного агента. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат фармацевтически приемлемый, нетоксичный, стерильный носитель, такой как физиологический солевой раствор, нетоксичные буферные растворы, консерванты и т.п. Для целей настоящей заявки, фармацевтически эффективное количество антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного следует понимать как означающее такое количество, которого достаточно для достижения эффективного связывания с мишенью и для достижения положительного эффекта, например, улучшения симптомов, связанных с нейродегенеративным расстройством. Диагностические способы, предложенные в настоящем изобретению, позволяют специалистам в данной области техники определять и/или «точно корректировать» эффективное количество антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента для любого конкретного субъекта или пациента.

[174] Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, содержат фармацевтически приемлемые носители, включая, например, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как альбумин сыворотки человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат динатрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, цинковые соли, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на целлюлозной основе, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу натрия, поликарилаты, воски, блок-сополимеры полиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

[175] Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат.Водные носители включают, например, воду, водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и буферные среды. В настоящем изобретении фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, 0,01-0,1 М, например, примерно 0,05М фосфатный буферный раствор или 0,8% солевой раствор. Другие общепринятые парентеральные жидкие носители включают растворы фосфата натрия, раствор Рингера с декстрозой, раствор декстрозы и хлорида натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Внутривенные жидкие носители включают жидкости и пополнители питательных веществ, пополнители электролитов, такие как жидкие носители на основе раствора Рингера с декстрозой и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные добавки, антиоксид анты, хелатообразующие агенты и инертные газы, и т.п.

[176] Более конкретно, фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (в случае водорастворимых композиций) или дисперсии и стерильные порошки для незамедлительного получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед применением. В таких случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой настолько, чтобы обеспечивать простое введение через шприц. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения, и может быть защищена от заражения микроорганизмами, такими как бактерии и грибки. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и т.п.), и их подходящие смеси. Необходимую текучесть можно поддерживать, например, с помощью покрытий, таких как лецитин, посредством сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсий, а также с помощью поверхностно-активных веществ. Подходящие лекарственные формы для применения в терапевтических способах, описанных в настоящем изобретении, описаны в книге Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16e изд. (1980).

[177] Предотвращение заражения микроорганизмами может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях могут быть включены изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Пролонгированное усвоение инъецируемых композиций может быть осуществлено посредством включения в композицию агента, замедляющего усвоение, например, моностеарата алюминия и желатина.

[178] В любом случае стерильные растворы для инъекций можно получать посредством введения активного соединения (например, антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, отдельно или в комбинации с другими активными агентами) в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных в настоящем документе, по обстоятельствам, с последующей стерилизующей фильтрацией. Как правило, дисперсии получают введением активного соединения в стерильный жидкий носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций, способы получения включают вакуумную сушку и сушку замораживанием, в результате которых из предварительно стерильно отфильтрованного раствора получают порошок активного ингредиента и любого дополнительного требуемого ингредиента. Препараты для инъекций перерабатывают, наполняют ими контейнеры, такие как ампулы, пакеты, бутылки, шприцы или флаконы, и закрывают в асептических условиях в соответствии со способами, известными в данной области техники. Затем препараты можно упаковывать и продавать в форме набора. Такие изделия промышленного производства могут иметь этикетки или вкладыши, где указано, что соответствующие композиции подходят для лечения субъекта, страдающего или предрасположенного к заболеванию или расстройству.

[179] Парентеральные лекарственные формы могут представлять собой одну болюсную дозу, инфузию или насыщающую болюсную дозу с последующей поддерживающей дозой. Такие композиции можно вводить с определенными фиксированными или переменными интервалами, например, один раз в сутки или «по мере необходимости».

[180] Некоторые фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, можно вводить перорально в приемлемой лекарственной форме, включая, например, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. Некоторые фармацевтические композиции также можно вводить в форме назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции можно получать в виде растворов в солевом растворе с применением бензилового спирта или других подходящих консервантов, усилителей абсорбции для повышения биодоступности и/или других стандартных солюбилизаторов или диспергаторов.

[181] Количество антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, варианта или производного, которое необходимо объединить с материалами-носителями для получения единичной лекарственной формы, варьируется в зависимости от реципиента, подлежащего лечению, и от конкретного способа введения, и его можно без труда определить в соответствии со способами, предложенными в настоящем изобретении. Композицию можно вводить в виде однократной дозы, нескольких доз или в течение определенной продолжительности инфузии. Схемы введения доз также можно регулировать для обеспечения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа).

[182] В соответствии с объемом настоящего изобретения, антитела-антагонисты SEMA4D или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные можно вводить человеку или другому животному в соответствии с вышеуказанными способами лечения, в количестве, достаточном для достижения терапевтического эффекта. Антитела-антагонисты SEMA4D или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные можно вводить такому человеку или другому животному в обычной лекарственной форме, полученной посредством объединения антитела согласно настоящему изобретению с традиционным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в соответствии с известными технологиями. Специалистам в данной области техники понятно, что форма и природа фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя продиктованы количеством активного ингредиента, с которым он будет объединен, способом введения и другими общеизвестными переменными. Кроме того, специалистам в данной области техники понятно, что можно применять коктейль, содержащий один или более видов антител-антагонистов SEMA4D или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных согласно настоящему изобретению

[183] Количество антитела-антагониста SEMA4D или его связывающего фрагмента, варианта или производного, подлежащее введению, может быть без труда определено специалистом в данной области техники в соответствии с настоящим изобретением. Факторы, влияющие на способ введения и соответствующее количество антитела-антагониста SEMA4D, его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, включают, но не ограничиваются ими, тяжесть заболевания, анамнез заболевания и возраст, рост, вес, состояние здоровья и физическое состояние индивидуума, проходящего лечение. Аналогично, количество антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, варианта или производного, подлежащее введению, зависит от способа введения и от того, будет ли субъекту введена однократная доза или несколько доз данного агента.

[184] При практическом осуществлении настоящего изобретения используют, если не указано иное, стандартные способы клеточной биологии, клеточных культур, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК, иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие способы подробно описаны в литературных источниках. См., например, Sambrook et al., ред. (1989), Molecular Cloning A Laboratory Manual (2e изд.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, Нью-Йорк); D. N. Glover ред., (1985), DNA Cloning, тома I и II; Gait, ред. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al., патент США №4683195; Hames and Higgins, ред. (1984), Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, ред. (1984), Transcription And Translation; Freshney (1987), Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984), A Practical Guide To Molecular Cloning; трактат Methods hi Enzymology (Academic Press, Inc., Нью-Йорк); Miller and Calos ред. (1987), Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et at, ред., Methods In Enzymology, тома 154 и 155; Mayer and Walker, ред. (1987), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, ред., (1986), Handbook Of Experimental Immunology, тома I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, штат Нью-Йорк, (1986); и Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Балтимор, штат Мэриленд).

[185] Общие принципы конструирования антител описаны в публикации Borrebaeck, ред. (1995), Antibody Engineering (2е изд.; Oxford Univ. Press). Общие принципы конструирования белков описаны в публикации Rickwood et al., ред. (1995), Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Оксфорд, Англия). Общие принципы антител и связывания антител с гаптенами описаны в следующих публикациях: Nisonoff (1984), Molecular Immunology (2е изд.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); и Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк). Кроме того, стандартные способы, применяемые в иммунологии, которые известны в данной области техники и специально не описаны в настоящем документе, представлены, в целом, в публикациях Current Protocols in hnmunology, John Wiley & Sons, Нью-Йорк; Stites etal., ред. (1994), Basic and Clinical Immunology (8e изд; Appleton & Lange, Норуолк, штат Коннектикут), и Mishell and Shiigi (ред.) (1980), Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., Нью-Йорк).

[186] Стандартные справочные работы, где изложены общие принципы иммунологии, включают Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Нью-Йорк; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., ред. (1980), Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, Нью-Йорк); Campbell (1984), "Monoclonal Antibody Technology" в Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ред. Burden et at, (Elsevier, Амстердам); Goldsby et al., ред. (2000), Kuby Immunology (4e изд.; H. Freeman and & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (бе изд.; Лондон: Mosby); Abbas et al. (2005), Cellular and Molecular Immunology (5e изд.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001), Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003), PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

[187] Все ссылки, цитированные выше, а также ссылки, цитированные в них, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

[188] Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации, но не ограничения.

Примеры

Пример 1: Клинический протокол

[189] Протокол сигнального клинического исследования в когорте А представлен на фиг.1. Тридцать шесть (36) индивидуумов возрастом 21 год или старше на поздней продромальной стадии (с CAG-возрастной оценкой продукта (оценкой САР) более 200 и диагностическим уровнем достоверности (DCL) 2 или 3) или на стадии раннего проявления HD (общая функциональная способность (TFC) более или ровно 11) принимали участие в сигнальной когорте А. Все участвующие субъекты также проходили генетическое тестирование с известным количеством повторов CAG более или ровно 36. Все субъекты могла дать и дали информированное согласие на участие в исследование. Субъектов случайным образом разделяли на 17 пациентов в группе лечения с VX15 и 19 пациентов в группе лечения с плацебо. В исследовании принимал участие 21 субъект с продромальным статусом и 15 субъектов со статусом раннего проявления. Обобщенная информация о пациентах, участвующих в исследовании, представлена в таблице 2.

[190] Как показано на фиг.1, субъектов из когорты А лечили в течение 6 месяцев препаратом VX15 или плацебо, а затем всех субъектов лечили препаратом VX15 еще 5 месяцев, затем наблюдали в течение 3 месяцев.

[191] Пациентам из когорты А в течение 6 месяцев вводили внутривенные дозы VX15 (n=17) по 20 мг/кг или плацебо (n=19). Эта часть исследования была слепой. После первых 6 месяцев все субъекты, принимавшие участие в когорте А, продолжали исследование с открытым лечением препаратом VX15/2503 в течение еще 5 месяцев. Различные экспериментальные группы и временной график лечения представлены на фиг.2, где указана также номенклатура, использованная ниже, для описания различных схем и временных диапазонов лечения, например, PV(7-0) означает группу, которой вводили плацебо (Р) в течение первых 6 месяцев и VX15 (V) в течение следующих 5 месяцев, и описывает изменение объема по МРТ или сигнала ФДГ-ПЭТ между исходным значением в начале исследования, при 0 визите, и при 7 визите по окончании 6 месяцев (7-0). Данное значение является контрольным значением, которое использовали для сравнения со всеми остальными 5- или 6-месячными периодами лечения препаратом VX15. При каждом ежемесячном визите оценивали безопасность, переносимость и эффективность лечения пациентов. Образцы крови тестировали на общее содержание растворимого SEMA4D (sSEMA4D) в сыворотке. В ходе ежемесячных визитов с равными интервалами проводили оценку эффективности. Оценку проводили с помощью комплексного исследования когнитивных функций при болезни Хантингтона (HD-CAB) и количественной оценки силы мышц (Q-Motor). HD-CAB позволяет дифференцировать контрольных, npe-HD и субъектов на ранней стадии HD. Указанное комплексное исследование является высокочувствительным к статусу заболевания, имеет большой эффект и высокую надежность, а также хорошо изученные психометрические и практические эффекты (Stout JC, et al., Mov Disord. 29:1281-1288 (2014). Двигательные симптомы при HD можно объективно оценить с помощью исследований Q-Motor. Исследование Q-Motor включает оценку различных двигательных задач, связанных с функционально релевантными повседневными задачами (см., например, Tabrizi SJ, et al., Lancet Neurol. 8:791-801 (2009). В исходном состоянии, t=0, и во время ежемесячного визита 7 (v7) по окончании 6 месяцев лечения, а также во время визита 12 (v12) по окончании 11 месяцев лечения все пациенты проходили МРТ-визуализацию, а часть пациентов проходила визуализацию ФДГ-ПЭТ. Анализировали несколько областей головного мозга на наличие изменений сигналов МРТ и ФДГ-ПЭТ. Основные области головного мозга, представляющие собой интерес (ROI) для МРТ, представлены в таблицах 3 и 4, и для ФДГ-ПЭТ в таблице 5. Если это применимо, делали отдельные измерения для левого и правого полушарий, и также рассчитывали их среднее значение.

[192] После того, как все субъекты из когорты А в течение 6 месяцев принимали слепое лечение, проводили анализ первичных данных двойной слепой части когорты А. После того, как все субъекты из когорты А завершили 11 месяцев лечения, проводили анализ данных визуализации.

[193] Лечение хорошо переносилось, и пациенты превосходно соблюдали схему лечения. На обнаружено никаких сигналов, касающихся безопасности.

[194] Статистические методы анализа проводили по принципу «намерения лечить» (ITT) и использовали стандартные статистические методы, точный критерий Фишера, хи-квадрат и логистическую регрессию для категориальных данных, t-критерии с двумя выборками, анализ ковариации и модель смешанного эффекта с повторными измерениями (MMRM) для непрерывных данных.

[195] Результаты МРТ для когорты А представлены на фиг.3-6. Полученные результаты демонстрируют среднее изменение обнаруженного с помощью МРТ объема различных ROI головного мозга между различными моментами времени сопоставимой продолжительности у субъектов, которых лечили препаратом VX15, по сравнению с плацебо, как подробно описано ниже. Объем по МРТ выражен в мм³, по результатам определения способами, известными специалистам в данной области техники. По сравнению с уменьшением объема по МРТ, которое наблюдали в течение первых 6 месяцев введения плацебо, PV(7-0), лечение препаратом VX15 в каждом другом 5-6-месячном временном интервале, VV(7-0), PV(12-7) и VV(12-7), обеспечивало предупреждение или минимизацию такого уменьшения, связанного с заболеванием, в объеме головного мозга в большинстве ROI. Для каждого такого сравнения может быть отклонена нулевая гипотеза случайного распределения вокруг нулевой разности с достоверностью Р<0,001, по результатам определения с помощью статистического критерия хи-квадрата. На фиг.6 результаты сравнения объема МРТ изменений в группе с плацебо (PV (12-0)), которая впервые была переведена на лечение препаратом VX15 через 6 месяцев, при 7 визите, и в группе, которая принимала препарат VX15 в течение всего периода (VV (12-0)), демонстрируют, что по сравнению с группой, принимавшей препарат VX15 в течение всех 11 месяцев, запоздалое начало лечения в группе плацебо через 6 месяцев не компенсировало уменьшение МРТ объема за первые 6 месяцев лечения с использованием только плацебо. Это свидетельствует о превентивном преимуществе раннего начала лечения и позволяет предположить, что VX15 является препаратом, модифицирующим заболевание. Это схематически показано в верхней половине фиг.12.

[196] Результаты, наблюдаемые при ФДГ-ПЭТ визуализации, представлены на фиг.8-11. Сигнал ФДГ-ПЭТ представлен в SUV (стандартизированный уровень накопления) для каждой ROI головного мозга относительно эталонной области, ствола головного мозга, (SUVR), для каждой схемы лечения и наблюдаемого временного интервала. В первой половине исследования наблюдали усиленное увеличение усвоения глюкозы в группе лечения SEMA4D (VV (7-0)), по сравнению с контрольной группой лечения плацебо (PV (7-0)) (фиг.8). То есть среднее усиление сигнала ФДГ-ПЭТ в большинстве ROI головного мозга в группе лечения VX15 VV(7-0) было больше, чем среднее снижение, наблюдаемое в группе плацебо PV(7-0) для той же ROI в течение того же периода времени. Аналогично, сравнение ФДГ-ПЭТ визуализации пациентов, которых лечили плацебо, в течение первых шести месяцев лечения (PV (7-0)), и таких же пациентов, которых лечили препаратом VX15 в течение последних 5 месяцев исследования (PV (12-7)), показало усиленное относительное повышение усвоения глюкозы (фиг.9). В обоих случаях может быть отклонена нулевая гипотеза случайного распределения вокруг нулевой разности со значением р<0,001, с использованием статистического критерия хи-квадрата. Напротив, сравнение среднего сигнала ФДГ-ПЭТ, полученного в течение последних пяти месяцев для пациентов, которых ранее лечили препаратом VX15 в течение первых 6 месяцев, (VV (12-7)), с группой плацебо во время первой части исследования (PV (7-0)) демонстрирует отсутствие существенного отличия от случайного распределения вокруг нуля, с использованием того же критерия хи-квадрата (фиг.10). Такое же отсутствие отличия наблюдали между группой введения VX15 (VV (12-0)) и группой введения плацебо (PV (12-0)) в течение всех 11 месяцев лечения (фиг.11).

[197] Лечение препаратом VX15 явно приводит к усиленному увеличению сигнала ФДГ-ПЭТ по сравнению с уменьшением, наблюдаемым в группе с плацебо, в течение первых 6 месяцев периода лечения, при сравнении между VV(7-0) и PV(7-0) или PV(12-7) и PV(7-0). Однако непрерывное лечение препаратом VX15 в течение следующих 5 месяцев, VV(12-7), не приводило к повторению такого же высокого лечебного эффекта, но, по-видимому, обеспечивало лишь предупреждение или минимизацию дальнейшего снижения сигнала ФДГ-ПЭТ. Не ограничиваясь конкретной теорией, разумное объяснение усиленного преимущества первоначального лечения препаратом VX15 заключается в том, что он реверсирует исторический дефицит усвоения глюкозы, накопленный до начала лечения. Возможно, что это отражает возвращение накопленных реактивных астроцитов к нормальной функции астроцитов, включая повышенный транспорт глутамата и усвоение и гликолиз глюкозы. Однако после достижения такого преимущества при лечении препаратом VX15, VV(7-0), оно уже не повторяется при непрерывном лечении, VV(12-7). Описанный эффект схематически изображен в нижней половине фиг.12. Наблюдение такой корректировки исторического дефицита усвоения глюкозы может обеспечивать ранний биомаркер эффекта лечения.

[198] Широта и объем настоящего изобретения не следует ограничивать ни одним из описанных выше иллюстративных вариантов реализации, а следует определять только в соответствии со следующей формулой изобретения и ее эквивалентами.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Vaccinex, Inc.

ZAUDERER, Maurice

<120> РАННЕЕ ОБНАРУЖЕНИЕ АКТИВАЦИИ ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ

ИЛИ НЕЙРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

<130> 58008-172847

<150> 62/461,945

<151> 2017-02-22

<160> 10

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VX15/2503 VH

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VX15/2503 HCDR1

<400> 2

Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Tyr Met His

1 5 10

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VX15/2503 HCDR2

<400> 3

Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VX15/2503 HCDR3

<400> 4

Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val

1 5

<210> 5

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VX15/2503 VL

<400> 5

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VX15/2503 LCDR1

<400> 6

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VX15/2503 LCDR2

<400> 7

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VX15/2503 LCDR3

<400> 8

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Mab 67 VH

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Mab 67 VL

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения того, будет ли антитело-антагонист семафорина 4D (SEMA4D) или его антигенсвязывающий фрагмент эффективным при лечении нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания. Раскрыты способ определения эффективной дозы указанного антитела, способ лечения заболевания, ассоциированного с семафорином 4D (SEMA4D). Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с семафорином 4D (SEMA4D). 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 табл., 1 пр.

1. Способ определения того, будет ли антитело-антагонист семафорина 4D (SEMA4D) или его антигенсвязывающий фрагмент эффективным при лечении нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения, включающий:

(a) измерение исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, страдающего, предположительно страдающего или имеющего риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения;

(b) введение субъекту эффективного количества антитела-антагониста SEMA4D или его антигентсвязывающего фрагмента;

(c) повторное измерение уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента; и

i. продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено увеличение усвоения глюкозы по сравнению с исходным уровнем; или

ii. прекращение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или уменьшение усвоения глюкозы по сравнению с исходным уровнем.

2. Способ определения эффективной дозы антитела-антагониста семафорина 4D (SEMA4D) или его фрагмента для лечения нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения, включающий:

(a) измерение исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, страдающего, предположительно страдающего или имеющего риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения;

(b) введение субъекту начальной дозы антитела-антагониста SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента;

(c) повторное измерение уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента; и

i. корректировку дозы антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено повышение усвоения глюкозы относительно исходного уровня, причем корректировку осуществляют по степени такого повышения, или

ii. прекращение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или уменьшение усвоения глюкозы по сравнению с исходным уровнем.

3. Способ по п. 2, дополнительно включающий увеличение дозы антитела-антагониста SEMA4D по сравнению с дозой, исследованной на стадии (c), и повторное измерение изменения степени усвоения глюкозы относительно нового исходного уровня у другого, ранее не подверженного лечению пациента, или у того же пациента после отмены лечения у того же пациента в течение периода времени, установленного для обеспечения накопления ретроспективного дефицита при данном нейродегенеративном или нейровоспалительном заболевании, расстройстве или повреждении, и дополнительную корректировку дозы антитела-антагониста SEMA4D при обнаружении дальнейшего увеличения.

4. Способ лечения субъекта, страдающего, предположительно страдающего или имеющего риск развития нейродегенеративного или нейровоспалительного заболевания, расстройства или повреждения, включающий:

(a) измерение исходного уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта, страдающего, диагностированного или предположительно имеющего нейродегенеративное или нейровоспалительное заболевание, расстройство или повреждение;

(b) введение субъекту антитела-антагониста SEMA4D или его антигентсвязывающего фрагмента, причем антитело-антагонист SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH и VL, где VH содержит три определяющие комплементарность участка (CDR): HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и где VL содержит три CDR: LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и при этом указанные CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, за исключением по меньшей мере одной или двух одиночных консервативных аминокислотных замен в одном или более CDR;

(c) повторное измерение уровня усвоения глюкозы в головном мозге субъекта после введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента; и

i. продолжение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено увеличение усвоения глюкозы по сравнению с исходным уровнем; или

ii. прекращение введения антитела-антагониста SEMA4D или его фрагмента, если обнаружено отсутствие изменения или уменьшение усвоения глюкозы по сравнению с исходным уровнем.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент ингибирует взаимодействие SEMA4D с его рецептором.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанный рецептор представляет собой плексин B1, плексин B2 или CD72.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент ингибирует SEMA4D-опосредованную передачу сигналов плексина B1.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент конкурентно ингибирует антитело сравнения, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, от связывания с SEMA4D.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что антитело-антагонист SEMA4D или его фрагмент связывается с тем же эпитопом SEMA4D, что и антитело сравнения, которое содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

10. Способ по любому из пп. 1-3 или 5-9, отличающийся тем, что антитело- антагонист SEMA4D содержит VH и VL, причем VH содержит три определяющие комплементарность участка (CDR): HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и где VL содержит три CDR: LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и при этом указанные CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно, за исключением по меньшей мере одной или двух одиночных консервативных аминокислотных замен в одном или более CDR.

11. Способ по п. 8 или 9, отличающийся тем, что антитело-антагонист SEMA4D содержит VH и VL, где VH содержит три определяющие комплементарность участка (CDR): HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и где VL содержит три CDR: LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и при этом указанные CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно.

12. Способ по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1, и VL содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 5.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

14. Способ по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что вводят первую дозу антитела-антагониста SEMA4D, а затем антитело-антагонист SEMA4D вводят по меньшей мере один раз в неделю, по меньшей мере один раз в две недели, по меньшей мере один раз в три недели, по меньшей мере один раз в месяц или по меньшей мере один раз в два месяца.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что измерение исходного уровня усвоения глюкозы проводят непосредственно перед введением первой дозы антитела-антагониста SEMA4D.

16. Способ по п. 14 или 15, отличающийся тем, что изменение усвоения глюкозы относительно исходного уровня измеряют по меньшей мере через одну неделю после введения первой дозы, по меньшей мере через две недели после введения первой дозы, по меньшей мере через один месяц после введения первой дозы, по меньшей мере через два месяца после введения первой дозы, по меньшей мере через три месяца после введения первой дозы, по меньшей мере через четыре месяца после введения первой дозы, по меньшей мере через пять месяцев после введения первой дозы, по меньшей мере через шесть месяцев после введения первой дозы, или в любой их комбинации.

17. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что усвоение глюкозы в головном мозге субъекта измеряют с помощью позитронно-эмиссионной томографии с использованием радиофармпрепарата 18F-фтордезоксиглюкозы (ФДГ-ПЭТ).

18. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что субъектом является человек.

19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что нейродегенеративное или нейровоспалительное заболевание, расстройство или повреждение представляет собой болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, синдром Дауна, атаксию, амиотрофический боковой склероз (ALS), рассеянный склероз (MS), эпилепсию, менингит, отек головного мозга, повреждение спинного мозга, травматическое повреждение головного мозга, лобно-височную деменцию (FTD), нарушение когнитивных функций на фоне ВИЧ, волчанку ЦНС, легкое нарушение когнитивных функций или их комбинацию.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что нейродегенеративное или нейровоспалительное заболевание, расстройство или повреждение представляет собой болезнь Хантингтона (HD).

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что субъект имеет риск развития HD на основании семейного анамнеза HD или генетического тестирования.

22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что генетическое тестирование выявило 36 или более повторов CAG в гене HTT субъекта.

23. Способ по любому из пп. 20-22, отличающийся тем, что субъект предположительно имеет HD на основании легкой двигательной дисфункции, легкого нарушения когнитивных функций или легких нейропсихиатрических признаков.

24. Способ по любому из пп. 20-23, отличающийся тем, что у субъекта диагностирована HD на основании атрофии головного мозга, повышенной оценки болезни Хантингтона по унифицированной шкале Международного общества расстройств движений (UHDRS), повышенной оценки по комплексному исследованию когнитивных функций при болезни Хантингтона (HD-CAB), повышенной количественной оценки силы мышц при болезни Хантингтона или их комбинации.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что субъект находится на предсимптоматической, ранней продромальной, поздней продромальной стадии, на стадии раннего проявления, умеренного проявления или прогрессирующего проявления HD.