Штамм бактерий Methylococcus capsulatus CONCEPT-8 - продуцент белковой биомассы Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для биосинтеза высокобелкового премикса к кормам сельскохозяйственных, домашних и содержащихся в неволе животных. Заявленный штамм бактерий Methylococcus capsulatus CONCEPT-8, обладающий метанокисляющими свойствами, резистентностью к внешним воздействиям в широких пределах параметров культивирования, высокой скоростью роста в оптимальных условиях, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-3289Д

Метанокисляющие бактерии, использующие метан и его производные в качестве источника углерода и энергии, находят применение для снижения концентрации метана в угольных шахтных газах, в биосинтезе богатой белком биомассы, нашедшей применение в качестве премикса к животным кормам.

Метанокисляющие бактерии, использующие метан и его производные в качестве источника углерода и энергии, широко распространены в природе, являясь биофильтром, снижающим вероятность попадания метана в тропосферу планеты и нарушения озонового слоя.

Особый интерес представляет собой использование бактерий Methylococcus capsulatus, как биосинтетической системы, активно перерабатывающей содержащийся в природном, в том числе, шахтном газе метан, и быстро наращивающей свою биомассу, отличающуюся высоким содержанием ценного белка, а также биологически активных веществ, в том числе витаминов. Биомасса Methylococcus capsulatus характеризуется высоким уровнем сырого протеина (не менее 70%), а также похожим на рыбную муку соотношением аминокислот, что позволяет использовать ее как белковый премикс к кормам.

Испытания кормов с включением биомассы метанокисляющих бактерий, проведенные на сельскохозяйственных животных, птицах и рыбе подтвердили высокую биологическую ценность этой биомассы как источника протеина, витаминов и других питательных веществ. Давно доказана безвредность применения биомассы метанокисляющих бактерий (1-5). Ветеринарными и санитарно-гигиеническими исследованиями установлена доброкачественность и безвредность продуктов животноводства, птицеводства и рыбоводства, полученных при использовании кормов с биомассой метанокисляющих бактерий. (6-8).

Несмотря на то, что по ряду показателей бактериальная биомасса отличается от традиционных белковых премиксов, в частности, высоким содержанием нуклеиновых кислот, отсутствием полиненасыщенных жирных кислот и наличием жирных кислот (9), применение биомассы метанокисляющих бактерий не оказывают отрицательного влияния на рост и развитие животных, в частности мальков и товарной рыбы. (10, 11).

Различные виды микроорганизмов являются продуцентами полноценного белка и витаминов. Многие из них нашли применение в кормопроизводстве благодаря разработанным и испытанным технологиям (12).

В ряде технологий, в качестве продуцентов белка используются высоко продуктивные грибы рода Candida. (13-16). (Патент РФ №2042713, №2090610, Авт.Св. СССР №№3221059, 1817471). В других успешно используются дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Авт. св. СССР №1575570; Патент РФ №2650689), отличающиеся, однако, невысокой продуктивностью и способные развиваться только при низкой концентрации субстрата в среде, что снижает экономическую эффективность их применения (17-18).

Известны штаммы молочнокислых и пропионовывокислых бактерий, используемые в качестве продуцентов белка (патенты РФ №2244000; 2390554; №2244001; №2250258 и ряд других). (19- 22). Общим недостатком данных штаммов является недостаточно высокая концентрация биомассы, биосинтез которой подавляется образующейся молочной или пропионовой кислотами.

Известены шляпочные грибы Flammulina velutipes НБК F-112 (А.С. №727687) и Pleurotus ostreatus Kummer (А.С. №427993) продуценты белка, биомасса которого может быть использована как полноценный белковый премикс (23-24). Однако использование для их выращивания сложных сред с высоким содержанием глюкозы и отходов пищевой промышленности, непосредственно используемых в качестве добавок в корм сельскохозяйственных животных, делает их использование практически бессмысленным.

Известен штамм ацидофильных метилотрофных бактерий Acetobacter methylicum ВСБ-867 - продуцент белково-витаминной биомассы (А.С. №925112), характеризующийся, однако, недостаточно высокой продуктивностью и нестабильным выходом конечного продукта (25)

Известны штаммы метанотрофных бактерий, культивируемых на природном газе и активно размножаясь, наращивая свою биомассу, продуцирующих белок, обогащенный биологически активными соединениями и пригодный для использования в качестве премикса к кормам (26-32). (Патент РФ №№2613365, 206416; Авт.св. СССР №№770200, 908085, 501681, 1072815, 615871).

Наиболее активным продуцентом белковой биомассы на природном газе является вид Methylococcus capsulatus. К недостаткам данного вида метанотрофа можно отнести нестабильность его роста на природном газе при длительном культивировании в условиях проточного режима, что снижает продуктивность процесса и выход готового продукта.

Наиболее близким к заявленному изобретению является штамм метаноокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, описанный в патенте РФ №2613365 (33). Полученный штамм Methylococcus capsulatus ГБС-15 обладает рядом свойств, обеспечивающих ему более стабильный рост в процессе культивирования. Авторами патента показана фагоустойчивость штамма при выращивании его в атмосфере природного газа разного состава (с содержанием метана от 85% об. до 99,9%. об.) и на различной воде, которые являются потенциальными источниками поступления в систему внешних фагов, а также могут спровоцировать активность профагов самой культуры. Авторами была показана также устойчивость штамма Methylococcus capsulatus ГБС-15 к гомологам метана, поступающим в среду культивирования вместе с метаном в составе природного газа, в частности этану (2-4%), пропану (1,5-3%) и бутану (0,1-0,8%). В патенте также отмечается рост штамма Methylococcus capsulatus ГБС-15 в условиях повышенного давления до 6 атм. При этом достигается концентрация биомассы 32 г/л и скорость протока 0,25 час^-1.

Однако следует отметить, что в примере №1 авторами не указывается продолжительность процесса культивирования, что затрудняет оценку фагоустойчивости штамма. Кроме того, в зависимости от месторождения природного газа (особенно газоконденсатных месторождений) в его составе содержится более высокие количества гомологов метана, а также обнаруживается пентан. В попутных газах в небольших количествах могут встречаться высшие углеводороды. В шахтных газах помимо прочего содержится СО₂, концентрация которого составляет 3-6%. Следует отметить, что в процессе культивирования метанокисляющих микроорганизмов в среде могут накапливаться продукты неполного окисления метана (метанол, формальдегид, формиат), органические кислоты, углеводы и др., которые также могут оказывать ингибирующее действие на рост бактерий.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение нового штамма метанокисляющих бактерий с более широким потенциалом устойчивости, сохраняющего стабильный рост и высокую продуктивность в процессе длительного культивирования на природном газе.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение продуктивности штамма метанокисляющих микроорганизмов Methylococcus capsulatus, достижение стабильного выхода конечного продукта, а также обеспечение резистентности к вариациям внешних условий, в том числе:

- механорезистентности, что позволяет интенсифицировать потоки в культуральной среде, снизить диффузионные ограничения и увеличить концентрацию метана активизировать аэрацию;

- барорезистентности, что позволяет, при необходимости, регулировать растворимость газов в культуральной жидкости и увеличивать выход биомассы, варьируя давление;

- резистентности к повышенным концентрациям гомологов метана содержащихся в природном газе, в том числе, шахтном газе, что позволяет снизить его концентрацию в шахтном газе, а также использовать сырье для биосинтеза белка метанокисляющими микроорганизмами Methylococcus capsulatus из различных источников и уменьшить вариабельность выхода конечного продукта;

- повышенной резистентности к ингибирующему эффекту продуктов метаболизма в возвращаемой в процесс культивирования отработанной культуральной жидкости, что позволяет снизить потери составляющих минерального питания и, соответственно, увеличить эффективность процесса.

Для достижения указанного технического результата штамм Methylococcus capsulatus CONCEPT-8 был получен из коллекционного штамма Methylococcus capsulatus ВКМ В - 2116. Предварительную адаптацию штамма к потенциальным ингибиторам проводили в условиях качалочных колб при последовательном многократном пассировании штамма в заданных условиях. Дальнейший отбор штамма вели путем последовательной многоступенчатой селекции в условиях проточного культивирования штамма на природном газе в условиях незащищенной ферментации в присутствии выбранных потенциальных ингибиторов при постепенном увеличении скорости протока от 0,05 час-1 до 0,35 час-1. Критериями отбора служили технологические параметры: скорость роста и содержание белка в биомассе.

В результате проведенной селекции, выделен штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus (CONCEPT-8) ВКМ В -3289Д, который может найти применение в технологиях получения биомассы с высоким содержанием белка, при культивировании на метане,

содержащимся как в природном газе, так и в шахтном газе.

Штамм Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д хранят на жидкой минеральной среде при температуре 4°С, пересев 1 раз в 3 месяца на минеральной среде в атмосфере метана.

Культурально-морфологические признаки штамма.

Клетки штамма имеют форму кокка и диплококка, диаметром 0,8-1,0 мкм, неподвижные. На агаризованной среде образует мелкие прозрачные колонии (d - 1 мм на 2-ые сутки культивирования), выпуклые, блестящие, гладкие с ровным краем. Штамм сохраняет жизнеспособность в широком диапазоне температур (20-б0°С) и рН (4,5-8,0). Оптимальные значения температуры 40-42°С и рН 6,6-6,7. Штамм является облигатным метанотрофом, использует метан в качестве единственного источника углерода и энергии. Не нуждается в факторах роста. Устойчив к примесям гомологов метана и CO₂, содержащихся в природном газе. Штамм способен образовывать покоящиеся формы типа незрелых цист Azotobacter.

Штамм непатогенен.

Генетические манипуляции со штаммом не производились Полученный в результате селекционных работ штамм Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д характеризуется:

- механорезистентно.стью, в результате чего число целых, способных к нормальной жизнедеятельности клеток, практически не уменьшается в поле акустических микропотоков с высокими градиентами скростей, что позволяет интенсифицировать перемешивание в культуралной среде, снизить диффузионные ограничения, ускорить процесс растворения и увеличить концентрацию растворенных в культуральной среде газов;

- барорезистентностью, что позволяет увеличить концентрацию растворенных в культуральной среде газов;

- резистентностью к повышенным концентрациям гомологов метана содержащихся в природном газе, в том числе, шахтном газе, что позволяет снизить его концентрацию в шахтном газе, а также использовать сырье для биосинтеза белка метанокисляющими микроорганизмами Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д из различных источников и уменьшить вариабельность выхода конечного продукта;

- повышенной резистентностью к ингибирующему эффекту продуктов метаболизма в возвращаемой в процесс культивирования отработанной культуральной жидкости, что позволяет снизить потери составляющих минерального питания и, соответственно, увеличить эффективность процесса.

Конечный продукт, получаемый при культивировании штамма Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д - микробная биомасса с

высоким содержанием белка.

Область применения штамма -промышленный биосинтез биомассы с высоким содержанием белка.

Изобретение поясняется примерами, не носящими, однако, ограничительного характера.

Пример 1. Штамм Methylococcus capsulatus (CONCEPT-8) ВКМ В -3289Д выращивали на ферментере с рабочим объемом 1,7 л на минеральной среде следующего состава г/л: KNO₃ - l,0; MgSO₄⋅7Н₂О-0,2; CaCl₂ - 0,02;

Na₂HPO₄⋅12H₂O -1,5; KH₂PO₄ - 0,7;

FeSO₄⋅7H₂O-2,0 мг; ZnSO₄ ⋅ 7H₂O - 0, 1 мг;

MnCl₂⋅4H₂O - 0,03 мг; CuCl₂⋅5H₂O - 0,1 мг; CoCl₂⋅6H₂O - 0,2 мг; NiCl₂⋅6H₂O - 0, 02 мг; Na₂MoO₄ - 0,03 мг; H₃BO₃ - 0,03 мг; ЭДТА-Na₂ - 5,0.

рН среды 6,7

Процесс вели при давлении 0,2 МПа, газовая фаза содержала смесь метан:воздух в соотношении 1:3.

Метан -99,9%

Температура культивирования 42°С

Продолжительность процесса - 336 часов

Скорость протока Д=0,28 час^-1

Концентрация биомассы составила 11,8-12,3 г/л, содержание сырого протеина в биомассе - 79,4%

Пример 2.

Культивирование вели как описано в примере 1.

Газовая смесь содержала метан: этан в %-ом соотношении 94: 6. Скорость протока Д=0,28 час -1

Концентрация биомассы составила 11,7-12,0 г/л, содержание сырого протеина 78,1%

Пример 3.

Культивирование вели как описано в примере 1.

Газовая смесь содержала метан: этан: пентан в %-ом соотношении 92: 6:2. Скорость протока Д=0,28 час -1

Концентрация биомассы составила 11, 5-11, 7. г/л, содержание сырого протеина 78%

Пример 4.

Культивирование вели как описано в примере 1. Процесс вели при давлении 0,2 МПа, газовая фаза содержала смесь метан: воздух в соотношении 1:3.

Метан - 99,9%

В среду культивирования добавляли отработанную культуральную жидкость (ОКЖ), полученную после отделения клеток метанотрофа.

ОКЖ содержит весь комплекс продуктов метаболизма метанотрофа, которые образуются в процессе выращивания метанотрофа на природном газе

, включая метанол, формальдегид, формиат, полисахариды, органические кислоты и др. (33-38).

Суммарной количественной характеристикой всех органических веществ, образующихся в процессе культивирования являются показатели ХПК(мгО₂/л) и БПК(мгО₂/л).

В среду культивирования добавляли ОКЖ со следующими показателями:

ХПК = 1650 мгО₂/л

БПК = 1100 мгО₂/л

ОКЖ в среду культивирования добавляли в количестве 1-10 об.%.

Пример 5

Культивировании штамма Methylococcus capsulatus (CONCEPT-8) ВКМ В -3289Д вели на ферментере с рабочим объемом 1,7 л на минеральной среде как и в примере 1.

рН среды 6,7

Процесс вели при давлении 0,1 МПа, газовая фаза на входе в ферментер содержала смесь: метан -6%, кислород - 19%, углекислый газ - 1,5%, остальное - азот.

Метан -99,9%

Температура культивирования 42°С

Продолжительность процесса - 336 часов

Скорость протока Д=0,25 час -1

Концентрация биомассы составила 0,7-0,8 г/л, содержание сырого протеина в биомассе - 78,0%.

Газовая фаза на выходе из ферментера содержала смесь: метан -3,7%, кислород - 17%, углекислый газ - 4,3%, остальное - азот.

Представленные примеры характеризуют штамм Methylococcus capsulatus ВКМ В -3289Д, как продуцент высокого содержания белка в микробной биомассе, способный обеспечивать высокие его показатели в широком диапазоне концентрации метана (от 6 до 99,9%) при его культивировании и повышенной резистентности к ингибирующему эффекту продуктов метаболизма.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы. Предлагается штамм бактерий Methylococcus capsulatus, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ В-3289Д. Штамм продуцирует белковую биомассу с содержанием белка свыше 79%, обладает метанокисляющими свойствами, резистентностью к внешним воздействиям в широких пределах параметров культивирования, высокой скоростью роста в оптимальных условиях. 1 табл., 5 пр.

Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКМ В-3289Д для биосинтеза белковой биомассы.