Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus SL1 - продуцент микробного белка из природного газа Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 

Изобретение относится к области промышленной микробиологии и представляет собой штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus SL1, предназначенный для получения микробного белка из природного газа для использования в качестве кормовой добавки в аквакультуре и птицеводстве.

Микробный белок, или иначе белок одноклеточных организмов, был предложен в качестве альтернативы продуктам животного происхождения для удовлетворения растущего мирового спроса. Среди общего разнообразия возможных способов производства микробного белка технология на основе использования природного газа является в настоящее время одной из самых передовых и доступных и находится на пороге масштабной коммерциализации. В основе этой технологии лежит применение метанотрофных бактерий, которые обладают уникальной способностью эффективно синтезировать биомассу на метане - основном компоненте природного газа. Экономически целесообразно применение быстрорастущих представителей метанотрофных бактерий, к которым относят бактерий рода Methylococcus.

Известны следующие штаммы-продуценты микробного белка из природного газа: Methylococcus capsulatus CONCEPT-8, ВКМ В-3289Д (патент РФ №2706074); Methylococcus capsulatus ГБС-15, ВКПМ В-12549 (патент РФ №2717991); Methylococcus capsulatus VS1, ВКМ B-3482Д (патент РФ №2765994); Methylococcus capsulatus BF19-07, ВКПМ В-13764 (патент РФ №2745093); Methylococcus capsulatus ЛБТИ 028, ВКПМ В-13479 (патент РФ №2728345). Эти штаммы характеризуются устойчивым ростом на природном газе с высокой скоростью роста до 0,3 ч^-1 и содержанием белка в биомассе не менее 70%. Максимизация продукции биомассы достигается в проточном режиме культивирования, которому предшествует этап накопительного роста. Одним из способов повышения эффективности производства микробного белка из природного газа является сокращение продолжительности технологического цикла за счет сокращения этапа накопительного роста культуры.

Задачей предлагаемого изобретения является получение нового штамма метанокисляющих бактерий с уменьшенной продолжительностью лаг-фазы (первой фазы роста культуры), что проявляется в сокращении накопительного этапа технологического цикла получения микробного белка.

Техническим результатом заявленного изобретения является сокращение накопительного этапа технологического цикла получения микробного белка из природного газа при сохранении общей продуктивности и содержания белка в биомассе.

Технический результат достигнут при использовании штамма метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus SL1, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-3849D, в качестве продуцента для получения микробного белка. Обозначение штамма, присвоенное депозитором - SL1.

Для получения штамма Methylococcus capsulatus SL1 полную последовательность кодирующего глюкокиназу гена glk (M3M30_07505, 1011 п.н.) амплифицировали на основе геномной ДНК Mc. capsulatus MIR с помощью праймеров GLK_MIR-F (TTGGATCCTGATCGGCGGCTATCGCAT) и GLK_MIR-R (TTCGATCGTCCTGCGGCTTTTCGTAGT) и клонировали в суицидальный вектор pK18mob. Внутренний фрагмент гена размером 652 п.н. вырезали с использованием рестриктаз BshTI (AgeI) и PstI и вставляли гентамициновую кассету, вырезанную из плазмиды p34S-Gm по сайту SacI, предварительно затупив все липкие концы с помощью Т4 ДНК полимеразы. Полученный вектор, содержащий инсерцию кассеты в гене glk, конъюгировали в клетки метанотрофа с использованием штамма E. coli S-17-1. Биомассу метанотрофа наращивали на чашках с агаризованной средой П следующего состава (г/л): KNO₃ (1), MgSO₄ (0.2), CaCl₂ (0.02), Na₂-EDTA (0.005), FeSO₄×7H₂O (0.002), ZnSO₄×7H₂O (0.0001), MnCl₂×4H₂O (0.00003), CuSO₄×5H₂O (0.0001), CoCl₂×6H₂O (0.0002), NiCl₂×6H₂O (0.00002), Na₂MoO₄ (0.00003), H₃BO₃ (0.0003) с раствором фосфатов, состоящим из 14 г/л KH₂PO₄ и 28 г/л Na₂HPO₄. Клетки E. coli S-17-1 выращивали на агаризованной среде LB (дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 10 г/л, триптон - 10 г/л). Биомассу метанотрофа и E. coli S-17-1 смешивали на чашках со средой П, содержащей 3% (об/об) среды LB, инкубировали при 37°С в течение 2 сут в атмосфере метан:воздух 1:1, затем высевали на чашки со средой П, содержащей 10 мкг/мл гентамицина и инкубировали при 42°С в атмосфере метан:воздух 1:1 7-10 сут до появления колоний. Колонии отбирали на основе устойчивости к гентамицину и чувствительности к канамицину. Генотип также дополнительно проверяли с помощью ПЦР. Ранее этот способ был апробирован для получения мутантного штамма по гену glk на основе галоалкалофильного метанотрофа Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z (Mustakhimov et al., 2017). В мутантных клетках M. alcaliphilum было обнаружено лишь незначительное содержание гликогена (1,5 против 76,1 мкг/мг сырой биомассы) и сниженный уровень сахарозы (4 против 8 мкг/мг СБ), а также появление трегалозы (0,07 мкг/мг СБ).

Культурально-морфологические особенности штамма с указанием среды:

При культивировании на агаризованной минеральной среде с 20% (об/об) метана в газовой фазе штамм SL1 образует круглые колонии кремового оттенка. Культура представлена неподвижными грамотрицательными кокками диаметром 1,4 мкм. Ростовыми субстратами являются метан и метанол. Использует нитрат, аммоний и атмосферный азот в качестве источника азота. Не нуждается в факторах роста. Культура строго аэробна. Рост наблюдается в диапазоне температур 25-50°С (оптимум 42°С) и рН 5,5-7,5 (оптимум 6,0-6,3).

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: криоконсервация при -80°С, в качестве криопротектора применяется 10% раствор диметилсульфоксида (ДМСО).

Способ, условия и состав сред для культивирования штамма:

Вариант 1

Культуру мутантного штамма SL1 выращивали в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл среды П следующего состава (г/л): KNO₃ (1), MgSO₄ (0.2), CaCl₂ (0.02), Na₂-EDTA (0.005), FeSO₄×7H₂O (0.002), ZnSO₄×7H₂O (0.0001), MnCl₂×4H₂O (0.00003), CuSO₄×5H₂O (0.0001), CoCl₂×6H₂O (0.0002), NiCl₂×6H₂O (0.00002), Na₂MoO₄ (0.00003), H₃BO₃ (0.0003). Отдельно готовили и стерилизовали раствор фосфатов, состоящий из 14 г/л KH₂PO₄ и 28 г/л Na₂HPO₄. Перед засевом добавляли по 10 мл раствора фосфатов в каждую колбу. Культуры выращивали при 42°С на качалке при 120 об/мин в течение 4 сут, 1 раз в сутки заполняя колбу 300 мл природного газа.

Вариант 2

Оптимальные условия и состав среды для выращивания в биореакторе:

H₃PO₄ (85%) - 0,5 мл;

(NH₄)₂SO₄ - 200 мг/л;

KCl - 250 мг/л;

MgSO₄×7H₂O - 250 мг/л;

FeSO₄×7H₂O - 4,2 мг/л;

CuSO₄×5H₂O - 4,4 мг/л;

MnSO₄×5H₂O - 1,2 мг/л;

NiSO₄×7H₂O - 0,5 мг/л;

ZnSO₄×7H₂O - 1,8 мг/л;

Н₃ВО₃ - 0,6 мг/л;

CoSO₄×6Н₂О - 0,6 мг/л;

Na₂MoO₄×2Н₂О - 0,7 мг/л.

Генетические особенности штамма: а) делеция по гену глюкокиназы (glk); б) фагоустойчив; в) плазмиды не обнаружены; г) профаги не обнаружены. Сведения о безопасности использования штамма: а) штамм не содержит генов других организмов; б) штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным; не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Для заявляемого штамма характерны:

- высокопродуктивный рост на минеральных средах с добавлением природного газа в качестве ростового субстрата с высокой удельной скоростью роста до 0,3 ч^-1;

- сокращенная лаг-фаза (первая стадия роста) в накопительном этапе культивирования;

- отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность.

Выращивание осуществляют преимущественно непрерывным способом в биореакторах с минеральными средами и природным газом. Содержащийся в природном газе метан используется в качестве субстрата.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Культивирование штамма Methylococcus capsulatus SL1 и дикого штамма Methylococcus capsulatus MIR проводили во флаконах объемом 0,5 л при коэффициенте заполнения 0,2 на термостатируемой качалке при 42°С. Культивирование проводили в течение 48 ч. Ежедневно осуществляли обновление газовой фазы. По окончании культивирования концентрация сухих веществ в исследованных культурах составила 0.5-0,7 г при содержании белка в сухой биомассе 70-71%. Продолжительность лаг-фазы для дикого штамма Methylococcus capsulatus MIR составила 4 ч. Аналогичный показатель для штамма Methylococcus capsulatus SL1 был равен 2 ч. Таким образом, общее сокращение продолжительности фазы накопительного роста составило 2 ч.

Полученную культуру использовали в качестве посевного материала для последующего культивирования бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 1,5 л (рабочий объем 1,0 л).

Пример 2

Осуществляли выращивание культуры Methylococcus capsulatus SL1 в непрерывном режиме в ферментере объемом 1,5 л (рабочий объем - 1,0 л) с непрерывной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (на 1 л среды):

H₃PO₄ (85%) - 0,25 мл;

(NH₄)₂SO₄ - 200 мг;

KCl - 125 мг;

MgSO₄×7H₂O - 125 мг;

FeSO₄×7H₂O - 4,2 мг;

CuSO₄×5H₂O - 4,4 мг;

MnSO₄×5H₂O - 1,2 мг;

NiSO₄×7H₂O - 0,5 мг;

ZnSO₄×7H₂O - 1,8 мг;

Н₃ВО₃ - 0,6 мг;

CoSO₄×6Н₂О - 0,58 мг;

Na₂MoO₄×2Н₂О - 0,7 мг.

Процесс выращивания проводили в асептических условиях при скорости протока 0,25 ч^-1. Значение рН поддерживали титрованием 0,5% раствором аммиачной воды, которая также служила дополнительным источником азота. Температуру в ферментере регулировали подачей воды в теплообменник аппарата.

Расход природного газа и воздуха составлял 6 и 18 л/час на 1 л культуральной среды, соответственно.

В качестве контрольного эксперимента в аналогичных условиях проводили культивирование дикого штамма Methylococcus capsulatus MIR в целях сравнения продукционных характеристик и продолжительности накопительного этапа технологического цикла.

При выдерживании такого режима культивирования в течение длительного времени концентрация биомассы в ферментере для обоих штаммов составляла 3,5 г/л. Показатели содержания белка в сухой биомассе также были близки (≈73%). Лаг-фаза для дикого штамма Methylococcus capsulatus MIR составила 13 ч, в то время как для штамма Methylococcus capsulatus SL1 она была снижена до 5 ч. Таким образом, общее сокращение продолжительности накопительного этапа технологического цикла составило 8 ч.

Пример 3

Осуществляли выращивание культуры Methylococcus capsulatus SL1 в непрерывном режиме в ферментере объемом 1,5 л (рабочий объем - 1,0 л) с непрерывной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (на 1 л среды):

H₃PO₄ (85%) - 0,5 мл;

KNO₃ - 200 мг;

KCl - 250 мг;

MgSO₄×7H₂O - 250 мг;

FeSO₄×7H₂O - 4,2 мг;

CuSO₄×5H₂O - 4,4 мг;

MnSO₄×5H₂O - 1,2 мг;

NiSO₄×7H₂O - 0,5 мг;

ZnSO₄×7H₂O - 1,8 мг;

Н₃ВО₃ - 0,6 мг;

CoSO₄×6Н₂О - 0,58 мг;

Na₂MoO₄×2Н₂О - 0,7 мг.

Процесс выращивания проводили в асептических условиях при скорости протока 0,25 ч^-1. Значение рН поддерживали титрованием 0,5% раствором аммиачной воды, которая также служила дополнительным источником азота. Температуру в ферментере регулировали подачей воды в теплообменник аппарата.

Расход природного газа и воздуха составлял 6 и 18 л/час на 1 л культуральной среды, соответственно.

В качестве контрольного эксперимента в аналогичных условиях проводили культивирование дикого штамма Methylococcus capsulatus MIR в целях сравнения продукционных характеристик и продолжительности накопительного этапа технологического цикла.

При выдерживании такого режима культивирования в течение длительного времени концентрация биомассы в ферментере для обоих штаммов составляла 3,3 г/л. Показатели содержания белка в сухой биомассе также были близки (≈72%). Лаг-фаза для дикого штамма Methylococcus capsulatus MIR составила 14 ч, в то время как для штамма Methylococcus capsulatus SL1 она была снижена до 7 ч. Таким образом, общее сокращение продолжительности накопительного этапа технологического цикла составило 7 ч.

Полученные данные свидетельствуют о том, что использование штамма Methylococcus capsulatus SL1 для получения микробного белка из природного газа позволяет более чем вдвое сократить продолжительность накопительного этапа технологического цикла при сохранении высокой продуктивности процесса (выхода биомассы в единицу времени) и высокой доли белка в сухой биомассе (>70%).

Изобретение относится к области промышленной микробиологии. Предложен штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus SL1, депонированный в Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-3849D, в качестве продуцента для получения микробного белка из природного газа. Изобретение обеспечивает сокращение накопительного этапа технологического цикла получения микробного белка из природного газа при сохранении общей продуктивности и содержания белка в биомассе. 3 пр.

Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus SL1, депонированный в Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-3849D в качестве продуцента для получения микробного белка из природного газа.