Штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 - продуцент микробной белковой массы, устойчивый к агрессивной среде Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, касается новой культуры микроорганизмов, которая может быть использована для получения микробной белковой массы.

Одним из методов получения микробной белковой массы является выращивание метанокисляющих микроорганизмов на природном газе. Метанотрофные бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают природный газ, быстро размножаются и наращивают свою биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными веществами.

Исследования в области микробиологического синтеза белка на метане были начаты почти одновременно с разработкой процессов культивирования микроорганизмов на жидких углеводородах. Однако из-за низких выходов биомассы и трудностей конструктивного оформления технологического процесса разработка методов микробиологического получения белка на природном газе долгое время находилась на стадии лабораторных исследований.

В настоящее время известен штамм дрожжей Candida tropicalis ВСБ-942 - продуцент биомассы, обогащенной белком (Патент РФ №2031115). Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-1987.

Недостатком данного изобретения является способность продуцента расти при невысоких концентрациях н-парафинов (0,8%), невысокая продуктивность ферментационного процесса, необходимость очистки биомассы от остатков непотребленных парафинов, а содержание сырого протеина в биомассе не превышает 60-65%.

Интенсивность ферментационного процесса можно повысить путем применения окислительного стресса. Под окислительным стрессом понимают, в частности, образование активных форм кислорода и свободных радикалов, которые обладают высокой реакционной способностью. Такие формы веществ могут вступать в реакцию с компонентами окружающей среды, окисляя их, что приводит к повреждению клеток микроорганизмов или их гибели.

В качестве фактора окислительного стресса используют воздействие пероксидом водорода. Такое воздействие моделирует реальные условия пребывания культуры микроорганизмов в неблагоприятных условиях среды культивирования, а также выступает фактором отбора, направленного на селекцию и адаптацию более активной популяции микроорганизмов.

Данный подход позволяет мобилизовать адаптивные ресурсы микроорганизмов на уровне стимуляции их метаболизма. В результате стрессорного воздействия микроорганизмы приобретают более мощную окислительную систему, которая может проявляться в способности потреблять тяжело усваиваемый субстрат или в повышении продуктивности клеточной массы и ценных продуктов метаболизма (Патент РФ №2553213, Патент РФ №2268924, Патент РФ №2394098).

Наиболее близким аналогом (прототипом) заявленного изобретения является штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 для получения микробной белковой массы (Патент РФ №2613365). Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ В-12549. Штамм обладает устойчивостью к гомологам метана в природном газе, способностью к гетеротрофной фиксации углекислого газа и к росту при повышенном давлении (до 16 атм), однако недостатком прототипа является недостаточно высокая скорость роста культуры (0,25 ч^-1) в непрерывном режиме культивирования, а также использование для культивирования штамма питательной среды с высоким содержанием минеральных компонентов. Компоненты минерального питания потребляются культурой метанотрофов не полностью, их остаточные концентрации в культуральной жидкости достаточно высоки. Это в свою очередь приводит к необходимости дополнительной очистки биомассы (как продукта) от минеральных солей, а образующиеся стоки оказывают большую нагрузку на очистные сооружения.

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового штамма метанокисляющего микроорганизма с более высоким технологическим потенциалом, а именно с более высокими ростовыми характеристиками.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности вновь полученного штамма для получения микробной белковой массы за счет увеличения скорости роста, уменьшения расхода минеральных компонентов пихания и повышения устойчивости к агрессивной среде.

Технический результат достигается за счет создания нового штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 для получения микробной белковой массы, устойчивого к агрессивной среде, регистрационный номер ВКПМ В-13479 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов. Данный штамм устойчив к агрессивной среде, имеет высокую скорость роста и способен продуцировать большое количество биомассы при культивировании на питательной среде с невысокими концентрациями минеральных компонентов питания.

Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 обладает следующими преимуществами:

- высокая скорость роста (0,27 ч^-1) в условиях непрерывного культивирования в метано-воздушной атмосфере при атмосферном давлении;

- рост на питательных средах с меньшим содержанием минеральных компонентов питания (по сравнению с прототипом) без снижения ростовых характеристик и продуктивности процесса;

- устойчивость к агрессивной среде без снижения скорости роста, что подтверждено лабораторными испытаниями.

Проведение культивирования метанокисляющих микроорганизмов часто происходит в не оптимальных условиях, а зачастую даже в агрессивной среде. Агрессивность среды может проявляться, в частности, в образовании активных форм кислорода и свободных радикалов, которые являются результатом окислительных процессов, происходящих в результате жизнедеятельности микроорганизмов. Агрессивность среды культивирования может быть обусловлена рядом факторов, имеющих как природное, так и техногенное происхождение. Общепризнанной моделью агрессивной среды может выступать внесение в культуральную жидкость пероскида водорода в определенном диапазоне концентраций. В рамках лабораторных испытаний такой прием моделирует реальные условия пребывания культуры микроорганизмов в агрессивных условиях окружающей среды, а также выступает фактором отбора, направленного на селекцию и адаптацию более устойчивых и активных популяций микроорганизмов.

Штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 выделен из почвы НГКМ Бованенково, полуостров Ямал, методом накопительных культур путем многократных пересевов в метано-воздушной среде. Далее штамм был селекционирован в непрерывном процессе культивирования при скорости протока 0,30-0,35 ч^-1 на минеральной среде в атмосфере метан : воздух в соотношении от 1:1 до 1:3 при температуре 41-45°С и рН среды 5,5-5,8.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Штамм является аэробом. Грам-тип штамма грамотрицательный. Клетки штамма имеют сферическую форму в виде кокка или диплококка, диаметром 0,7-1,0 мкм, неподвижны, образуют микрокапсулу. По строению клетки и морфологии относится к I группе Х-типу метанокисляющих микроорганизмов (по классификации Whittenbury R.).

Рост на агаризованной минеральной среде: колонии круглые 1,0-1,5 мм в диаметре, форма колоний выпуклая каплевидная с ровным гладким краем, структура однородная плотная, цвет колоний бежевый, водорастворимый пигмент не выделяют. Оптимальные значения температуры для роста 41-45°С и значении рН 5,5-5,8.

Штамм относится к облигатным метанокисляющим бактериям. В качестве единственного источника углерода усваивает метан, в том числе и в составе природного газа. В качестве источника азота усваивает аммонийный азот нитратный азот. Не растет на органических субстратах. Обладает устойчивостью к пероксиду водорода.

Генетические манипуляции со штаммом не производились.

В покоящемся состоянии штамм образует цисты типа Azotobacter, может сохранять жизнеспособность в течение 5-6 месяцев в отсутствии метана в виде суспензии в охлажденном состоянии.

Селекционированный штамм характеризуется следующими промышленными признаками:

- штамм выдерживает температуру до 50°С, оптимальная температура для роста 41-45°С);

- активность штамма определяется высокой скоростью роста в условиях непрерывного культивирования, устойчивостью к гомологам метана в составе природного газа, устойчивостью к пероксиду водорода.

Систематическое положение штамма подтверждено генетическим методом с помощью анализа 16S РНК.

Штамм не патогенен и конкурентно способен по отношению к другим видам метанокисляющих бактерий.

Продукт, образуемый штаммом - микробная белковая масса.

Область применения штамма - производство белковой кормовой биомассы для балансирования кормов с/х животных и аквакультуры.

Способ определения активности штамма - рассев на минеральные (минеральной-агаризованные) среды в метано-воздушной атмосфере при соотношении метан (природный газ) : воздух от 1:1 до 1:3.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма:

Штамм хранится в течение 4-5 мес. при температуре +4°±+6°С без природного газа на минерально-агаризованной среде.

Допускается хранение в суспензионной культуре в течение 5-6 месяцев.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма - рассева на жидкую минеральную среду в метано-воздушной атмосфере. Культивирование проводят в колбах с отбойниками объемом 750-1000 мл с заполнением минеральной средой не более чем на 15%, в метано-воздушной атмосфере 1:2, при постоянном встряхивании с интенсивностью 200 об./мин, при температуре 41-45°С, в течение 5-7 суток.

Оптимальные условия и состав среды для культивирования

Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 - рН 5,5-5,8, температура 41-45°С.

Состав минеральной среды на 1 л: (NH4)₂SO₄ - 0,56 г; MgSO₄×7H₂O - 0,02 г; KCl - 0,025 г; (NH4)₂HPO₄ - 0,04 г; (NH₄)H₂PO₄ - 0,04 г; ZnSO₄×7H₂O - 0,3 мг; MnSO₄×5H₂O - 0,54 мг; CuSO₄×5H₂O - 0,54 мг; H₃BO₃ - 0,6 мг; FeSO₄×7H₂O - 2,0 мг; Na₂MoO₄×2H₂O - 0,045 мг; CoSO₄×7H₂O - 0,048 мг; Трилон Б - 5,0 мг.

Генетические особенности штамма:

а) мутации, делеции, инверсии - не выявлены;

б) устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д. - не выявлены;

в) плазмиды - не выявлены;

г) профаги - не выявлены.

Сведения о безопасности использования штамма:

а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов, перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик;

б) штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Ниже приводятся примеры, подтверждающие эффективность предлагаемого штамма.

Пример 1.

Осуществляли культивирование штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 в непрерывном режиме в ферментере с механическим перемешиванием объемом 50 литров (рабочий объем - 30 литров) с непрерывной подачей питательной среды, содержащей следующие минеральные компоненты (на 1 литр воды): (NH4)₂SO₄ - 0,56 г; MgSO₄×7H₂O - 0,02 г; KCl - 0,025 г; (NH₄)HPO₄ - 0,04 г; (NH₄)H₂PO₄ - 0,04 г; ZnSO₄×7H₂O - 0,3 мг; MnSO₄×5H₂O - 0,54 мг; CuSO₄×5H₂O - 0,54 мг; H₃BO₃ - 0,6 мг; FeSO₄×7H₂O - 2,0 мг; Na₂MoO₄×2H₂O - 0,045 мг; CoSO₄×7H₂O - 0,048 мг; Трилон Б - 5,0 мг; рН среды 5,6-5,8.

Процесс проводили в нестерильных условиях:

- при температуре 41-42°С;

- при рН среды 5,6-5,8;

- при атмосферном давлении;

- при расходе природного газа и воздуха на 1 литр ферментационной среды 15 и 45 л/ч, соответственно;

- при скорости протока питательной среды 0,27 ч^-1.

При продолжительном исполнении такого режима культивирования при непрерывном протоке питательной среды 0,27 ч^-1, указанного состава, концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 10,2-11,3 г/л. Содержание сырого протеина в биомассе составило 76,0-78,0%.

Полученные данные свидетельствуют, что культивирование штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 на питательной среде, указанного минерального состава, с меньшей концентрацией (по сравнению с прототипом приблизительно в 5 раз) при непрерывном протоке позволяет получать стабильный выход биомассы, сопоставимый с прототипом.

Пример 2.

Осуществляли культивирование штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479, как описано в примере 1, но в среду культивирования вносили пероксид водорода. Пероксид водорода подавали в ферментационный аппарат в количестве необходимом для обеспечения концентрации H₂O₂ в среде культивирования 0,005 г/л (в пересчете на 100% H₂O₂).

При соблюдении таких условий культивирования концентрация биомассы в ферментационной среде составила 10,1-11,5 г/л при скорости протока 0,27 ч^-1. Содержание сырого протеина в биомассе составило 76,5-77,8%.

Пример 3.

Осуществляли непрерывное культивирование штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479, полученного по примеру 2. В ферментационный аппарат вводили пероксид водорода в количестве необходимом для обеспечения концентрации H₂O₂ в среде культивирования 0,01 г/л (в пересчете на 100% H₂O₂).

При соблюдении таких условий культивирования концентрация биомассы в ферментационной среде составила 10,0-11,2 г/л при скорости протока 0,27 ч^-1. Содержание сырого протеина в биомассе составило 76,8-77,9%.

Пример 4.

Осуществляли непрерывное культивирование штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479, полученного по примеру 3. В ферментационный аппарат вводили пероксид водорода в количестве необходимом для обеспечения концентрации Н₂О₂ в среде культивирования 0,015 г/л (в пересчете на 100% H₂O₂).

После введения пероксида водорода в ферментационный аппарат происходило снижение концентрации биомассы до 6,0-6,5 г/л при скорости протока 0,27 ч^-1. При продолжении культивирования с поочередным снижением и увеличением скорости протока питательной среды концентрация биомассы в ферментере достигла 10,0-11,0 г/л и оставалась постоянной при протоке 0,27 ч^-1. Содержание сырого протеина в биомассе составило 77,0-78,0%.

Результаты, полученные при проведении лабораторных исследований по примерам 2-4, свидетельствую о том, что штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 обладает устойчивостью к пероксиду водорода в концентрациях до 0,01 г (в пересчете на 100% H₂O₂) в литре ферментационной среды без снижения скорости роста в условиях непрерывного культивирования при протоке среды 0,27 ч^-1.

Введение пероксида водорода в ферментационную среду моделирует реальные условия пребывания культуры в неблагоприятных условиях окружающей среды. Таким образом, воздействие агрессивной среды не ухудшает свойства предлагаемого штамма и позволяет сохранять стабильный выход биомассы. Устойчивость данного штамма метанокисляющих бактерий к пероксиду водорода может оказаться ценным и определяющим свойством при выборе микроорганизма продуцента и условий его культивирования.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения микробной белковой массы. Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ЛБТИ 028 обладает способностью продуцировать микробную белковую массу. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13479. Изобретение позволяет повысить выход микробной белковой массы. 4 пр.

Штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 для получения микробной белковой массы, устойчивый к агрессивной среде.