Штамм бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ B-13554 - источник кормового белка Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 A23K10/00 C12P21/00 C12R1/01 

Изобретение относится к области промышленной микробиологии, который может быть использован в промышленности для получения белковой кормовой добавки, в частности для балансирования кормов при кормлении сельскохозяйственных животных, птицы и аквакультуры.

Уровень техники

Качество кормов (комбикормов), их сбалансированность по основным питательным веществам является одной из главных проблем современного агропромышленного комплекса. В результате несбалансированности кормов по протеиновому и аминокислотному составу в России на производство животноводческой продукции и искусственное выращивание рыбы затрачивается в 2-3 раза больше кормов по сравнению с нормативами развитых стран.

Еще одна причина снижения качества и повышения цены комбикормов связана с высокой долей зерновых компонентов, которая составляет порядка 70%, тогда как в развитых европейских странах – 40-45%. В этих странах широко используются зернобобовые, жмыхи и шроты, побочные продукты пищевой и перерабатывающей промышленности.

В настоящее время главной задачей является производство полнорационных комбикормов по рецептам, содержащим меньшую долю фуражного зерна.

Другая причина низкого качества кормов и их высокая цена – недостаточно развитая российская биотехнологическая промышленность. Так, большую часть объема российского рынка кормовых аминокислот, ферментов и весь объем российского рынка кормовых витаминов занимает импортная продукция, что ведет к удорожанию российских комбикормов и к зависимости комбикормовой промышленности от поставок из-за рубежа.

Традиционно в состав кормов и комбикормов входят белок, витамины, макро- и микроэлементы, различные неорганические соединения, баланс которых весьма важен для качества кормовых средств.

Известны корма, содержащие следующие компоненты: протеиновые зеленые концентраты; мука рыбная; мука мясокостная; дрожжи; жмых подсолнечный; соевый шрот; мука пшеничная; витамин В-4; премикс; масло подсолнечное (патент РФ №2579767).

Известны корма, содержащие жмых подсолнечный, муку рыбную, рыбий жир, пальмовое масло, дрожжи кормовые, гаммарус измельченный, муку травяную или водорослевую, витаминно-минеральный премикс, пивную дробину, льняную муку при определенном соотношении исходных компонентов (патент РФ №2696545). Также корм может дополнительно содержать муку из зерноотходов пшеничных, муку мясокостную, соевую муку, балласт из очищенного и фракционированного песка или муку мясокостную и витазар, или муку из зерноотходов пшеничных, артемию сушеную, масло подсолнечное, метионин.

Недостатками описанных выше кормов являются высокая их стоимость, вследствие использования в рецептуре значительной доли рыбной муки и соевого шрота. Рыбная мука – традиционная, достаточно дорогостоящая, белковая компонента кормов, изготовляемая с применением современных технологий, не вполне соответствует требованиям к кормам для удовлетворения пищевых потребностей некоторых видов рыб, в частности лососевых. Соевый белок, соевый шрот беден пищевыми волокнами и имеет побочный эффект такой как нарушение репродуктивных функций.

Белки являются существенной частью кормовых рационов. Жизнь животных неразрывно связана с образованием и распадом белков в организме. Для полноценного роста, для репродукции, для набора живой массы, животное должно получать необходимое количество белков в составе рациона. Важнейшим критерием качества кормов является аминокислотный состав белковых компонентов.

По содержанию и соотношению незаменимых аминокислот протеины кормов классифицируют на полноценные и неполноценные. Если в рационе присутствует лишь растительный белок (зерно, жмых, сено и т.п.), то такой рацион вряд ли удастся сбалансировать по аминокислотам. В белках животного происхождения незаменимых аминокислот больше, чем в растительных. Среди незаменимых аминокислот выделяют особо важные – это лизин, метионин, цистин, треонин и триптофан. Недостаток, отсутствие или дисбаланс незаменимых аминокислот в рационах животных сопровождается ухудшением использования протеина, нарушением обмена веществ, снижением продуктивности. Обогащение кормовых смесей микробным белком повысит энергетическую ценность корма и изменит в нужном направлении баланс аминокислот.

Совершенствование кормопроизводства требует биотехнологической оптимизации продуцентов кормового белка и тщательного подбора субстрата и условий для выращивания микроорганизмов для получения сбалансированного аминокислотного состава готовой кормовой смеси.

В качестве продуцента микробного кормового белка используют высокопродуктивные дрожжи рода Candida (авт. св. СССР № 1378373, патент РФ № 2031115, авт. св. СССР № 1744963), рода Saccharomyces (патент РФ № 2478701), также известны дрожжи Metschnikowia pulchemma ВКПМ Y-3151 (патент РФ № 2370527).

Недостатком дрожжевых культур, как микробного источника кормового белка, является недостаточно высокое содержание белка в биомассе (сырой протеин 40-60 %, истинный белок 28-42 %). При этом культивирование дрожжей проводят с применением сложных многокомпонентных малоусвояемых субстратов, для которых требуется специальная предварительная подготовка (углеводороды нефти, гидролизаты древесных и с/х отходов, сульфитные щелока целлюлозно-бумажного производства и пр.).

Перспективным путем получения полноценного белкового кормового продукта является культивирование метанокисляющих бактерий на природном газе. Преимуществом такой технологии является:

– отсутствие необходимости предварительной подготовки или обработки субстрата (природного газа);

– способность метанокисляющих микроорганизмов усваивать метан в широком диапазоне его концентраций в природном газе;

– быстрый рост и высокая продуктивность метанокисляющих микроорганизмов при оптимальных условиях культивирования;

– высокое содержание белка в биомассе (не менее 65-70% сырого протеина).

Известны штаммы метанотрофных бактерий, культивируемых на природном газе и активно размножаясь, наращивая свою биомассу, продуцирующих белок, обогащенный биологически активными соединениями и пригодный для использования в качестве премикса к кормам. Патент РФ №№2613365, 206416; Авт.св. СССР №№770200, 908085, 501681, 1072815, 615871).

Активным продуцентом белковой биомассы на природном газе является вид Methylococcus capsulatus.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм бактерий Methylococcus capsulatus CONCEPT-8 – продуцент белковой биомассы (патент РФ № 2706074). Штамм бактерий Methylococcus capsulatus CONCEPT-8, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ имени Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ В-3289Д. В патенте описан штамм как продуцент белковой биомассы с содержанием белка свыше 79%, обладающий метанокисляющими свойствами, резистентностью к внешним воздействиям в широких пределах параметров культивирования и высокой скоростью роста в оптимальных условиях.

В описании изобретения указана продолжительность процесса культивирования для каждого из примеров 336 часов (14 суток), которая недостаточно велика для оценки стабильности процесса при длительном культивировании в условиях проточного (непрерывного) режима и для оценки продуктивности процесса в целом.

К недостаткам описанного изобретения можно отнести недостаточно высокую продуктивность штамма бактерий Methylococcus capsulatus CONCEPT-8 (концентрация биомассы 11,8-12,3 г/л при скорости протока 0,28 ч ^–1).

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового штамма микроорганизма, который можно использовать в качестве продуцента микробного белка, обладающего:

– высокой продуктивностью в условиях непрерывного культивирования (концентрация биомассы 12,6-13,5 г/л при протоке среды 0,30 ч ^–1);

– стабильными параметрами роста в течение продолжительного времени в процессе непрерывного культивирования (продолжительность культивирования 6 недель);

– высоким содержанием белка (содержание сырого протеина 79,6-80,5 %).

Технический результат обеспечивается за счет использования нового штамма метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ: В-13554 для получения кормового белка. Штамм депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ) РФ, как Methylococcus capsulatus ЛБТИ 029, ВКПМ: B-13554, дата депонирования: 13 декабря 2019 г.

Штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ: В-13554 выделен из почвы Уренгойского нефтегазоконденсатного месторождения (г. Новый Уренгой, Ямало-Ненецкий автономный округ, Россия) методом накопительных культур путем многократных пересевов в метано-воздушной атмосфере. Далее штамм был селекционирован в непрерывном процессе культивирования при скорости протока от 0,25 ч^-1 до 0,35 ч^-1 на минеральной среде в атмосфере метан: воздух в соотношении от 1:1 до 1:3 при температуре 30-45°С и рН среды 5,0-7,0.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Штамм является аэробом. Грам-тип штамма грамотрицательный. Клетки штамма имеют сферическую форму в виде кокка или диплококка, диаметром 1,0-1,5 мкм, неподвижны, образуют микрокапсулу.

Рост на агаризованной минеральной среде: рост очень слабый, колонии развиваются в течение продолжительного времени (до 7-10 суток), колонии круглые не более 1,0 мм в диаметре, форма колоний выпуклая каплевидная с ровным гладким краем, структура однородная плотная, цвет колоний светло-бежевый, водорастворимый пигмент не выделяют. Оптимальные значения температуры для роста 40-42°С, значение рН 6,0-6,5.

Штамм относится к облигатным метанокисляющим бактериям. В качестве единственного источника углерода усваивает метан, в том числе и в составе природного газа. В качестве источника азота усваивает аммонийный азот, нитратный азот. Не растет на органических субстратах.

Генетические манипуляции со штаммом не производились.

В покоящемся состоянии штамм образует цисты типа Azotobacter, может сохранять жизнеспособность в течение 2-3 месяцев в отсутствии метана.

Селекционированный штамм характеризуется следующими промышленными признаками:

– штамм выдерживает температуру до 50°С, оптимальная температура для роста - 40-42°С;

– активность штамма определяется высокой скоростью роста в условиях непрерывного культивирования, устойчивостью к гомологам метана в составе природного газа, высоким содержанием белковых веществ.

Систематическое положение штамма подтверждено генетическим методом с помощью анализа 16S РНК.

Штамм не патогенен и конкурентно способен по отношению к другим видам метанокисляющих бактерий.

Продукт, образуемый штаммом – бактериальная биомасса с содержанием сырого протеина 77-80%.

Область применения штамма – промышленная микробиология, для получения белковой кормовой добавки в кормопроизводстве, для балансирования кормов с/х животных и аквакультуры.

Способ определения активности штамма – активность штамма определяют методом рассева на жидкую питательную среду в метано-воздушной атмосфере.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма:

Длительное хранение в лиофильно высушенном состоянии. Также допускается хранение в виде микробной суспензии в жидкой питательной среде в метано-воздушной атмосфере (или в атмосфере воздуха) в холодильнике в течение 2-3 месяцев.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма – рассева на жидкую минеральную среду в метано-воздушной атмосфере. Культивирование проводят в колбах с отбойниками объемом 750-1000 мл с заполнением минеральной средой не более чем на 10 - 15 %, в метано-воздушной атмосфере 1:2, при постоянном встряхивании с интенсивностью 200 об./мин, при температуре 40-42 °С, в течение 2-4 суток.

Оптимальные условия и состав среды для культивирования для размножения штамма: рН 6,0-6,5, температура 40-42°С.

Состав минеральной среды на 1 л: KNO₃ – 1,0 г; MgSO₄x7H₂O – 1,0 г; СаCl₂ – 0,2 г; Na₂HPO₄x12H₂O – 0,05 г; КH₂PO₄ – 0,05 г; Трилон Б – 5,0 мг; FeSO₄x7H₂O – 2,0 мг; ZnSO₄x7H₂O – 0,1 мг; CoCl₂ – 0,2 мг; MnCl₂x4H₂О – 30 мкг; CuCl₂ – 10 мкг; NiCl₂x6H₂O – 20 мкг; Na₂MoO₄ – 30 мкг.

Генетические особенности штамма:

а) мутации, делеции, инверсии – не выявлены;

б) устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д. – не выявлены;

в) плазмиды – не выявлены;

г) профаги – не выявлены.

Сведения о безопасности использования штамма:

а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов, перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик;

б) штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Культивирование штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ: B-13554 осуществляли в непрерывном режиме в ферментере объемом 50 литров (рабочий объем – 30 литров) с механическим перемешиванием, оснащенном лопастной мешалкой, с непрерывной подачей питательной среды, содержащей минеральные компоненты (на 1 литр водопроводной воды): K₂SO₄ – 0,15 г; MgSO₄x7H₂O – 0,11 г; H₃PO₄ (85%) – 0,31 мл; Трилон Б – 5,0 мг; FeSO₄x7H₂O – 2,0 мг; ZnSO₄x7H₂O – 0,1 мг; CoSO₄x7H₂O – 0,24 мг; MnSO₄x5H₂O – 0,035 мг; CuSO₄x5H₂O – 0,122 мг; NiSO₄x7H₂O – 0,24 мг; Na₂MoO₄ x2H₂O – 0,03 мг.

Ферментационную среду непрерывно аэрировали газовой смесью из природного газа и воздуха в объемном соотношении 1:3, соответственно. Содержание метана в природном газе составляло (95 ± 0,5) %.

Процесс осуществляли при следующих условиях:

– избыточное давление 2,0 бар;

– скорость вращения мешалки 800 об/мин;

– температура 40-42^оС;

– рН среды 6,0-6,5;

– скорость протока питательной среды 0,28 ч^-1;

– продолжительность культивирования 6 недель.

Концентрация биомассы в ферментационной среде составила 12,4-13,3 г/л, содержание сырого протеина в биомассе – 79,2-80,0%.

Пример 2.

Культивирование вели, как описано в примере 1, но при скорости протока питательной среды 0,30 ч^-1 и при скорости вращения мешалки 900 об/мин.

Концентрация биомассы в ферментационной среде составила 12,6-13,5 г/л, содержание сырого протеина в биомассе – 79,6-80,5%.

Таким образом, создан новый штамма микроорганизма, который можно использовать в качестве продуцента микробного белка, что обеспечило расширение арсенала технических средств данного назначения.

Поставленная техническая задача, а именно, достижение высокой продуктивности в условиях непрерывного культивирования (концентрация биомассы 12,6-13,5 г/л при протоке среды 0,30 ч ^–1); получение стабильных параметров роста в течение продолжительного времени в процессе непрерывного культивирования (продолжительность культивирования 6 недель); а также получение биомассы с высоким содержанием белка (содержание сырого протеина 79,6-80,5 %), выполнена.

Приведенные примеры подтверждают промышленную применимость данного изобретения.

Изобретение относится к промышленной микробиологии. Штамм бактерий Methylococcus capsulatus ЛБТИ 029, обладающий способностью продуцировать кормовой белок, депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ), РФ под регистрационным номером ВКПМ В-13554. Штамм бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13554 может быть использован в промышленности для получения белковой кормовой добавки, в частности для балансирования кормов при кормлении сельскохозяйственных животных, птицы и аквакультуры. Изобретение позволяет повысить выход кормового белка. 2 пр.

Штамм бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ B-13554 для получения кормового белка.