Способ получения обогащенной каротиноидами белковой биомассы на природном газе с использованием штамма метанокисляющих бактерий Methylomonas koyamae В-3802D Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12P23/00 A23K10/10 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и представляет собой штамм метанокисляющих бактерий Methylomonas koyamae В-3802D, предназначенный для получения обогащенной каротиноидами белковой биомассы на метане или природном газе для использования в составе кормов для аквакультуры, птицы и сельскохозяйственных животных.

В числе наиболее перспективных направлений технологий производства кормов считается применение белка одноклеточных микроорганизмов в качестве альтернативных источников протеина. В качестве продуцентов белка одноклеточных используют микроорганизмы различных таксономических групп. Особое место в получении биопротеина занимают метанотрофные бактерии - метаболически уникальная группа прокариот, способных использовать метан (СН₄) в качестве единственного источника углерода и энергии. Применение метанотрофных бактерий в качестве продуцентов белковой биомассы на метане или природном газе является эффективным, так как на их основе удается получить продукт, содержащий до 75% белка.

В качестве продуцентов белковой биомассы используют штаммы быстрорастущих термотолерантных метанотрофных бактерий, относящихся к роду Methylococcus: Methylococcus capsulatus ЛБТИ 028, ВКПМ В-13479 (патент РФ № 2728345);
Methylococcus capsulatus ГБС-15, ВКПМ В-12549 (патент РФ №2717991); Methylococcus capsulatus CONCEPT-8, ВКМ В-3289Д (патент РФ №2706074); Methylococcus capsulatus VS1, ВКМ B-3482Д (патент РФ №2765994); Methylococcus capsulatus BF19-07, ВКПМ В-13764 (патент РФ №2745093). Все вышеперечисленные штаммы обладают высокой скоростью роста до 0,25-0,28 ч^-1, устойчивостью к культивированию в присутствии гомологов метана без снижения скорости роста и содержанием белка в биомассе 70-79%. Высокое содержание белка является одним из основных показателей при составлении сбалансированных кормов. Другими обязательными компонентами кормов являются биологически активные добавки природного происхождения - каротиноиды, выполняющие ряд физиологически важных функций, таких как стимуляция работы иммунной системы, провитаминная активность, антиоксидантные и радиопротекторные свойства, антиканцерогенное действие, повышение переносимости низкой концентрации кислорода, стимулирование процесса роста, ускорение полового созревания.

Одним из очевидных недостатков штаммов-продуцентов рода Methylococcus является их неспособность продуцировать каротиноиды. Кормовой белок, полученный на основе использования метанотрофных продуцентов этого рода, нуждается в дополнительном обогащении каротиноидами, синтезируемыми другими микроорганизмами.

Известен способ получения каротиноидов с использованием пары мутантных штаммов мицелиального гриба Blakeslea trispora 185Б (+) и 185Б (-) (патент РФ №2053301). При совместном глубинном культивировании штаммов в лабораторных условиях в течение 114 ч уровень накопления каротиноидов составляет в среднем 300 мг/100 мл культуральной жидкости. Недостатками штамма являются потребность в дорогостоящих компонентах питательной среды (соевая и кукурузная мука, растительное масло, тиамин, антиокислитель, бета-ионон) и низкая скорость роста. Помимо этого, культивирование мицелиальных микроорганизмов в биореакторах существенно затруднено ввиду высокой степени агрегированности биомассы.

Другой известный способ биосинтеза каротиноидов предполагает использование штамма дрожжей Paffia rhodozyma К-16-43-34, ВКПМ Y-2982 (патент РФ №2385925). Штамм продуцирует каротиноиды в количестве до 5,5 мг/г сухой биомассы. Выход сухой биомассы составляет 80 г/л. При этом выращивание штамма производится на богатых органических средах с добавлением факторов роста, а синтез каротиноидов осуществляется в условиях дополнительного освещения.

Наиболее близким аналогом является штамм дрожжей Rhodotorula mucilaginosa 5-e, ВКПМ Y-4282 (патент РФ №2662964), продуцент микробного белка и каротиноидов. При продуктивности штамма до 30 г/л белка, содержание каротиноидов в биомассе составляет 650 мкг/г. Содержание белка в биомассе, однако, не превышает 30%. Помимо ограниченной питательной ценности к недостаткам штамма относится прочная клеточная стенка, что требует дополнительной обработки получаемого продукта. Кроме того, дрожжи не способны использовать метан в качестве источника углерода, использование сахаров в качестве субстрата делает процесс менее экономически выгодным.

Задачей предлагаемого изобретения является изыскание нового штамма метанокисляющих бактерий для биосинтеза микробного белка, обогащенного каротиноидами, расширение ассортимента биологического сырья для получения микробной белковой массы.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности культивирования нового штамма для получения белковой биомассы, обогащенной каротиноидами, при сохранении высокой продуктивности.

Технический результат достигнут при использовании штамма метанокисляющих бактерий Methylomonas koyamae MY1, депонированного в Всероссийской коллекции микроорганизмов - ВКМ под регистрационным номером ВКМ В-3802D, в качестве продуцента для получения микробной белковой массы, обогащенной каротиноидами. Обозначение штамма, присвоенное депозитором - MY1.

Штамм Methylomonas koyamae В-3802D выделен из образца донных осадков безымянного озера (Краснодарский край, Россия). Образец отобран из горизонта поверхностных осадков 0-2 см. Штамм выделен с помощью культивирования на минеральной среде без добавления факторов роста и органических соединений при температуре 30°С и рН среды 6,5-7,0 в атмосфере метан-воздух (1:3). Очистка культуры от бактерий-спутников выполнена методом предельных разведений накопительной культуры, с последующим рассевом на минеральную агаризованную среду и инкубацией в эксикаторах с 20% (об./об.) метана в газовой фазе.

Идентификация штамма проведена с использованием сравнительного анализа последовательности гена 16S рРНК и полного генома, а также по результатам исследования физиологических и биохимических признаков. Систематическое положение штамма MY1 следующее: филум Pseudomonadota, класс Gammaproteobacteria, порядок Methylococcales, семейство Methylococcaceae, род Methylomonas, вид Methylomonas koyamae. Работы проводились ФИЦ Биотехнологии РАН, ЦКП «Биоинженерия». Полученные последовательности гена 16S рРНК и генома штамма MY1 депонированы в NCBI под номерами OR234855 и CP133985.1, соответственно.

Культурально-морфологические особенности штамма с указанием среды:

При культивировании на агаризованной минеральной среде с 20 % (об./об.) метана в газовой фазе штамм MY1 образует круглые, слизистые, пигментированные (ярко-желтые) колонии. При культивировании в жидкой минеральной среде с метаном в газовой фазе образует клеточные суспензии желтого цвета. Культура представлена подвижными палочками шириной 1,0-1,5 мкм и длиной 1,5–2,0 мкм с одним полярным жгутиком. Тип строения клеточной стенки - грамотрицательный. Клетки содержат характерные для метанотрофных бактерий стопки плотно упакованных внутрицитоплазматических мембран, расположенных перпендикулярно клеточной стенке.

Ростовыми субстратами являются метан и метанол.

Усваивает в качестве источника азота: азотнокислый калий, сернокислый аммоний, мочевину, дрожжевой экстракт, атмосферный азот.

Металлы: повышенная требовательность к ионам меди.

Не нуждается в факторах роста.

Культура строго аэробна.

Рост наблюдается в диапазоне температур 8-37°С (оптимум 30°С) и рН 5,5-7,5 (оптимум 6,5-7,0). Активность (продуктивность) штамма составляет до 3,5 кг×м³/час. Способ определения активности штамма с указанием метода: непрерывное культивирование в ферментере с использованием жидкой минеральной среды при поддержании соотношения метан : воздух = 1:3 в газовоздушной смеси.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: криоконсервация при - 80°С, в качестве криопротектора применяется 10% раствор диметилсульфоксида (ДМСО).

Способ, условия и состав сред для культивирования штамма:

Вариант 1

Состав минеральной среды для выращивания культуры на колбах (г/л): KNO₃, 0,5; MgSO₄×7H₂O, 0,5; CaCl₂×2H₂O, 0,1; 100 мM фосфатный буфер, pH 6,5, 1 % (об./об.); раствор микроэлементов 0,1 % (об./об.), содержащий (г/л): EDTA, 5; FeSO₄×7H₂O, 2; ZnSO₄×7H₂O, 0,1; MnCl₂×4H₂O, 0,03; CoCl₂×6H₂O, 0,2; CuSO₄×5H₂O, 0,1; NiCl₂×6H₂O, 0,02; Na₂MoO₄, 0,03. Содержание метана в газовой фазе доводили до 30 об. %. Культивирование проводили на шейкере-инкубаторе при 150 об/мин и температуре культивирования 30°С. Значение рН 6,5.

Вариант 2

Оптимальные условия и состав среды для выращивания в биореакторе:

H₃PO₄ (87%) – 0,75 мл;

(NH₄)₂SO₄– 0,9 г;

KCl – 0,25 г;

MgSO₄ × 7H₂O – 0,25 г;

FeSO₄×7H₂O – 0,02 г;

CuSO₄×5H₂O – 0,016 г;

MnSO₄×5H₂O – 0,021 г;

NiSO₄×7H₂O – 0,001 г;

ZnSO₄ × 7H₂O – 0,003 г;

Н₃ВО₃ –0,008 мг;

CoSO₄×7Н₂О - 0,0004 мг;

Na₂МоO₄×2Н₂О - 0,0004 мг.

Генетические особенности штамма: а) мутации, делеции, инверсии нет; б) фагоустойчив; в) плазмиды не обнаружены; г) профаги не обнаружены. Сведения о безопасности использования штамма: а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик; б) штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным; не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Для заявляемого штамма характерны:

- устойчивый продуктивный рост на минеральных средах с метаном в качестве ростового субстрата, в широких пределах рН и температуры, с высокой удельной скоростью роста до 0,29 ч^-1;

- способность синтезировать каротиноиды (производные ликопина);

- отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность.

Выращивание осуществляют преимущественно непрерывным способом, в биореакторах с минеральными средами и метаном (или природным газом) в качестве субстрата.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Культивирование штамма Methylomonas koyamae MY1 проводили в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 0,75 л при коэффициенте заполнения 0,3 на термостатируемой качалке при 30°С. Культивирование проводили в течение 48 ч. По окончании культивирования концентрация сухих веществ составляла 0,8 г. Содержание каротиноидов составляло 86 мкг/г сухой массы. Полученную культуру использовали в качестве посевного материала для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 1,5 л (рабочий объем 1,0 л).

Пример 2.

Осуществляли выращивание культуры Methylomonas koyamae MY1 в непрерывном режиме в ферментере объемом 1,5 л (рабочий объем – 1,0 л) с непрерывной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (на 1 л среды):

Н₃РО₄(87%) – 0,75 мл;

(NH₄)₂SO₄– 0,9 г;

KCl – 0,25 г;

MgSO₄ × 7H₂O – 0,25 г;

FeSO₄×7Н₂О - 0,02 г;

CuSO₄×5Н₂О – 0,016 г;

MnSO₄×5Н₂О – 0,021 г;

ZnSO₄ × 7H₂O – 0,003 г;

Н₃ВО₃ - 0,008 мг;

CoSO₄×7Н₂О - 0,0004 мг;

NiSO₄×7H2O – 0,001 г;

Na₂МоO₄×2Н₂О - 0,0004 мг.

Процесс выращивания осуществляли в асептических условиях, при скорости протока 0,22 ч^-1. Значение рН регулировали титрованием 1% раствором аммиачной воды, которая также служила дополнительным источником азота. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата.

Расход природного газа и воздуха на 1 л культуральной среды составлял 6 и 18 л/час, соответственно.

При выдерживании такого режима культивирования в течение длительного времени, концентрация биомассы в ферментере составляла 3,2 г/л. Содержание белка - 68,25 %, каротиноидов - 48,55 мкг/г сухой биомассы.

Пример 3.

Осуществляли выращивание культуры Methylomonas koyamae MY1 в непрерывном режиме в ферментере объемом 1,5 л (рабочий объем – 1,0 л) с непрерывной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (на 1 л среды):

Н₃РО₄(87%) – 0,75 мл;

(NH₄)₂SO₄– 0,9 г;

Мочевина – 0,1 г;

KCl– 0,25 г;

MgSO₄ × 7H₂O – 0,25 г;

FeSO₄×7Н₂О - 0,02 г;

CuSO₄×5Н₂О - 0,16 г;

MnSO₄×5Н₂О - 0,21 г;

NiSO₄×7H2O – 0,001 г;

ZnSO₄ × 7H₂O – 0,003 г;

Н₃ВО₃ - 0,012-0,008 мг;

CoSO₄×7Н₂О - 0,0004 мг;

Na₂МоO₄×2Н₂О - 0,0004 мг.

Процесс выращивания осуществляли в асептических условиях, при скорости протока 0,22 ч^-1. Значение рН регулировали титрованием 1% раствором аммиачной воды, которая также служила дополнительным источником азота. Для стимуляции биосинтеза каротиноидов использовали включение мочевины в состав среды. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата.

Расход природного газа и воздуха на 1 л культуральной среды составлял 6 и 18 л/час, соответственно.

При поддержании непрерывного режима культивирования в течение 30 сут., концентрация биомассы в ферментере составляла 3,5 г/л. Содержание белка - 75,82 %, каротиноидов - 111,93 мкг/г сухой массы.

Полученные данные свидетельствуют о том, что непрерывное культивирование штамма Methylomonas koyamae MY1 в минеральной среде указанного состава позволяет достигать высокой продуктивности процесса (выхода биомассы в единицу времени). Способность штамма Methylomonas koyamae MY1 продуцировать каротиноиды позволяет получать белковую биомассу, обогащённую каротиноидами.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения обогащенной каротиноидами белковой биомассы на природном газе для использования в составе кормов для аквакультуры, птицы и сельскохозяйственных животных с использованием штамма метанокисляющих бактерий Methylomonas koyamae ВKM В-3802D. Изобретение обеспечивает повышение эффективности культивирования нового штамма для получения белковой биомассы, обогащенной каротиноидами, при сохранении высокой продуктивности. 1 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ получения обогащенной каротиноидами белковой биомассы на природном газе с использованием штамма метанокисляющих бактерий Methylomonas koyamae В-3802D при культивировании в ферментере с геометрическим объемом 1,5 л в непрерывном режиме в асептических условиях с непрерывной подачей минеральной среды со скоростью разбавления 0,22 ч^-1, титрованием 1 % раствором аммиачной воды при расходе природного газа и воздуха на 1 л культуры в соотношении 6:18 л/ч с обеспечением концентрации биомассы - 3,2 г/л, содержания белка - 68,3 %, каротиноидов - 48,6 мкг/г сухой биомассы.

2. Способ получения обогащенной каротиноидами белковой биомассы на природном газе с использованием штамма метанокисляющих бактерий Methylomonas koyamae В-3802D по п. 1, характеризующийся тем, что в состав среды для культивирования дополнительно вносится мочевина в количестве 0,1 г/л, что обеспечивает получение биомассы с концентрацией 3,5 г/л, содержанием белка - 75,82 %, каротиноидов - 111,93 мкг/г сухой массы.