Штамм Methylococcus capsulatus - продуцент высокобелковой биомассы Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 A23K10/10 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и может быть использовано для приготовления бактериальных препаратов, кормовых добавок, белковых изолятов, продуктов, содержащих нуклеиновые кислоты, витамины, специфические ферменты для использования в пищевом производстве, медицине, ветеринарии, косметологии.

Поиск доступных субстратов является одной из проблем современной биотехнологии. Высокие издержки на компоненты питательных сред закладываются в структуре себестоимости продуктов биотехнологии. Переход на непищевой С₁-субстрат - метан для производства целого ряда продуктов возможен только при использовании высокоэффективных продуцентов или сообществ микроорганизмов. В последнее время метан рассматривают как основу биоэкономики будущего. Метан-потребляющие микроорганизмы могут использоваться в производстве кормового белка, отдельных аминокислот, нуклеиновых кислот, биопластика, полисахаридов, каротиноидов, витаминов и многих других соединений с высокой добавочной стоимостью. Процессы биоконверсии метана могут в перспективе изменить существующие биотехнологии, в которых используются комплексные субстраты, содержащие белковые гидролизаты, сахара и ростовые факторы. Однако, на пути разработки таких технологий встают проблемы, среди которых низкая эффективность массопереноса метана и кислорода из газовой фазы в жидкую и далее к клеткам микроорганизмов, высокое удельное потребление кислорода клетками, а также низкая устойчивость микроорганизмов к высоким концентрациям источников азота, фосфора в питательной среде и собственным метаболитам.

В то же время у микроорганизмов-продуцентов существует высокая требовательность к чистоте метана, а особенности реализации и неустойчивость культивирования, низкий выход продуктов влияют на экономическую эффективность. Создание новых эффективных штаммов микроорганизмов, потребляющих метан из природного газа, является актуальной задачей.

Стабильное непрерывное культивирование на природном газе возможно при использовании ассоциативной культуры метанокисляющих микроорганизмов и гетеротрофных микроорганизмов - спутников, использующих продукты неполного окисления гомологов метана, и, возможно, продуктов автолиза клеток микроорганизмов.

В патенте SU 603348 предлагается для повышения выхода биомассы использовать смешанную культуру, содержащую бактерии, способные усваивать метан, в частности, Methylococcus capsulatus, и бактерии, которые способны усваивать метанол. В патенте приведены примеры смешанных культур.

В патенте WO 2020/076191 А1 (п. RU 2687137 С1) предлагается использовать смешанную культуру, содержащую бактерии, способные усваивать метан Methylococcus capsulatus, и гетеротрофные бактерии Klebsiella pneumonia 1-17, которые способны усваивать продукты соокисления гомологов метана. При концентрации биомассы 18,5 г АСВ/л доминирование метанокисляющих бактерий составляет 93%.

В патенте RU 2687135 С1-ассоциативную культуру, состоящую из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 и гетеротрофные бактерии Cupriavidus gilardii GBS-15-1 предлагается выращивать в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 10 л при температуре 40-45°С, рН 5,0-6,0 и непрерывной подаче газовой смеси, содержащей метан и кислород. При концентрации биомассы 15 г АСВ/л доминирование метанокисляющих бактерий составляет 90%.

В патенте SU 676177 для повышения выхода биомассы микроорганизмов, способных усваивать метан, предлагается использовать либо чистую культуру штамма Methylococcus 999 N CIB 011083, либо смешанные культуры, в которых культивирование штамма Methylococcus 999 N CIB №11083 ведут в присутствии штамма Pseudomonas N CIB №11112 и/или по меньшей мере одного из неметилотрофных микроорганизмов: штаммов Pseudomonas N CIB №11062, №11063 или №11065 и Micobacterium N CIB №11061.

В авторском свидетельстве SU 460745 предлагается для увеличения выхода биомассы и увеличении содержания белка в микробной биомассе использовать симбиотическую культуру, содержащую виды Methylococcus capsulatus штамм 2, Methylosinus sporium var. incoloratus штамм 4, Methylosinus trichosporium var. rosaceus штамм 5, Flavobacterium gasotypicus штамм 1. При скорости протока равной 0,13 ч^-1 концентрация биомассы достигает 11 г/л.

В патентах US 2004/0265431 А1, ЕР 1497409 В1, предлагается для повышения выхода биомассы и увеличении содержания белка в микробной биомассе использовать смешанную культуру, содержащую Methylococcus capsulatus (Bath) (штамм NCIMB 11132), Ralstonia sp.DB3 (штамм NCIMB 13287), Brevibacillus agri DB5 (штамм NCIMB 13289) и дополнительно возможно включение Aneurinibacillus sp.DB4 (штамм NCIMB 13288). В патенте RU 2343192 С2 предлагается использовать данную смешанную культуру для дальнейшего получения субстрата для роста гетеротрофных водорослей или гетеротрофных бактерий.

Общими недостатками культивирования подобных ассоциаций являются сбои непрерывного культивирования из-за спонтанных изменений в сообществе микроорганизмов, неустойчивости отдельных микроорганизмов сообщества к изменениям параметров культивирования.

Известны патенты, касающиеся получения новых штаммов метанотрофных бактерий Methylococcus capsulatus - продуцентов белка и других биологически активных веществ. Штаммы вида Methylococcus capsulatus являются одними из наиболее известных и распространенных метанокисляющих микроорганизмов. Их предлагают использовать для получения белоксодержащей биомассы как в российских, так и в зарубежных патентах. Некоторые из них при оптимальных условиях роста (см. SU 770200 А) и скорости протока 0,18 ч^-1, показывают выход биомассы 14 г/л и продуктивности 2,5 г/л ч.

В патенте RU 2728345 С1 предложен новый устойчивый к агрессивной среде штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479, обладающий способностью продуцировать белковую массу. Производство биомассы проводилось в непрерывном режиме при скорости протока питательной среды 0,27 ч^-1 и концентрация биомассы на выходе около 10,2-11,3 г/л. Данный штамм обладает устойчивостью к пероксиду водорода в концентрациях 0,01 г в литре ферментационной среды без снижения скорости роста в условиях непрерывного культивирования.

Штамм Methyllococcus capsulatus ВСБ-874 описан в авторском свидетельстве SU 770200 А. Штамм обладает способностью расти при повышенном давлении, устойчив к примесям гомологов метана и сернистых соединений. Данный штамм выращивали в ферментере турбо-эжекционного типа, в качестве источника азота и регулятора рН использовали аммиачную воду. Выращивание проводили при атмосферном давлении, температуре 45°С, величине рН 5,0 и скорости протока 0,25 ч^-1. При этом концентрация биомассы составляла 11 г/л. Этот же штамм выращивали под давлением 7 ата, при расходе природного газа и воздуха 25 и 100 м³/ч на 1 м³ соответственно. При скорости протока 0,27 ч^-1 была получена концентрация биомассы 23 кг/м³. Следует отметить, что степень инфицированности посторонней микрофлорой была 10%.

В патенте RU 2706074 С1 предложен штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКМ В-3289Д (CONCEPT-8) с высоким содержанием белка. Производство биомассы проводится в ферментере с рабочим объемом 1,7 л при давлении 0,2 МПа, температуре 42°С, рН среды 6,7, при скорости протока питательной среды 0,28 ч^-1. Концентрация биомассы составляет 11,4-12,3 г/л, содержание сырого протеина в биомассе - 79,4%.

В патенте RU 2720121 С1 предложен процесс выращивания культуры штамма Methyllococcus capsulatus ГБС-15 в непрерывном процессе и ферментере эжекционного типа с непрерывной подачей раствора солей, подготовленной воды и отработанной культуральной жидкости, возвращаемой в процесс ферментации, в количестве от 10 до 95%. Процесс осуществляется при температуре 41-43°С, рН среды 5,6-5,8 и атмосферном давлении, скорость протока 0,25 ч^-1, концентрация биомассы в ферментере составляет 10-11 г/л. Коррекция минеральных компонентов, подаваемых в ферментер в составе отработанной культуральной жидкости, позволяет повысить продуктивность процесса получения микробного белка на 10-30%.

В патенте RU 2032737 С1 указано, что при культивировании микроорганизмов в условиях аэрации на водной минеральной питательной среде, содержащей источники азота, фосфора и других макро- и микроэлементов, а также метан в качестве источника углерода, в культуральной среде поддерживается концентрация фосфора на уровне 20-60 мг/л, а отношение концентраций калия, магния, железа, меди, марганца и цинка к концентрации фосфора соответственно на уровне 1:2, 1:4, 1:40, 1:60, 1:80 и 1:100.

В патенте RU 2745093 С1 указано, что еще одним вариантом использования метанокисляющих бактерий для получения микробной биомассы является штамм Methylococcus capsulatus BF19-07 - продуцент для получения микробной белковой массы, регистрационный номер ВКПМ В-13764. Особенностями данного штамма являются минимальная минеральная среда, фагоустойчивость, высокая скорость роста (D=0,34 ч^-1), определенная устойчивость к перепадам температуры, рН, изменениям в концентрациях солей, устойчивость к примесям гомологов метана и сернистых соединений. Недостатками штамма являются: высокая концентрация сопутствующей микрофлоры при нестерильном культивировании (35%), низкая концентрация биомассы на выходе в метано-кислородном варианте (17,6 г/л), высокая потребность в кислороде, неустойчивость к повышенным концентрациям азота и фосфора в среде.

Обычно процесс культивирования ведут, используя в качестве источника азотного питания аммиачную воду, которая одновременно служит регулятором рН, при этом содержание аммонийного азота в биореакторе может варьироваться в очень широких пределах. Чувствительность штаммов к источнику фосфора в среде культивирования может быть даже больше, чем к источнику азота. Отклонение содержания азота или фосфора от оптимума приводит к голоданию или ингибированию избытком компонента питания, снижению продуктивности или полной остановке процесса.

Общими недостатками штаммов, описанных выше является низкая скорость роста, малый экономический коэффициент, высокая удельная потребность в кислороде, нестабильность при непрерывном длительном культивировании, чувствительность к гомологам метана, фаголизис или автолиз штаммов при сбоях оборудования и смещении параметров культивирования в неоптимальную сторону, чувствительность к повышенным концентрациям источников азота и фосфора в среде, что определяет возможность применения штамма в крупнотоннажных производственных процессах.

Задачей настоящего изобретения является получение нового более технологичного штамма для использования в биотехнологическом производстве с повышенным выходом биомассы и продуктивностью, обладающего способностью усваивать метанол как дополнительный субстрат, стимулирующий рост, при культивировании в метано-воздушной или метано-кислородной атмосфере, устойчивостью к фаголизису; устойчивого к изменениям в составе микробного сообщества при нестерильном культивировании, к изменениям в составе природного газа, к повышенным концентрациям азота и фосфора в среде, повышенным концентрациям метанола и других спиртов, обладающего минимальным потреблением кислорода.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является увеличение продуктивности до 15,75 г/лхч по биомассе с высоким - до 80% (по Кьельдалю) содержанием белка у штамма Methylococcus capsulatus ACR-22, регистрационный номер ВКПМ В-14282 за счет способности усваивать метанол как дополнительный субстрат, пониженного потребления кислорода, способности стабильно расти при непрерывном культивировании с высокой скоростью протока до 0,35 час^-1, в том числе, в составе ассоциации микроорганизмов, доля которых не превышала 5%, способности расти при высоких концентрациях азота и фосфора в среде: концентрации азота - до 400-500 мг/л, концентрации фосфора - до 500-600 мг/л.

Для достижения указанного технического результата штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 был получен из коллекционного штамма Methylococcus capsulatus ВСБ-874. Заявляемый штамм получен в процессе длительной автоселекции штамма Methylococcus capsulatus ВСБ-874 при непрерывном культивировании в нестерильных условиях с использованием метано-воздушной газовой смеси и специфических сред с содержанием метанола, этанола, пропанола, бутанола, повышенным содержанием ионов аммония, фосфатов и совместно с различными микроорганизмами-спутниками. Штамм получен без использования генно-инженерных методов, применения химических мутагенов и воздействия жесткого ультрафиолета

Штамм хранится в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт», коллекционный номер ВКПМ В-14282. Адрес БРЦ ВКПМ: 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1. БРЦ ВКПМ приняло штамм Methylococcus capsulatus ACR-22, регистрационный номер В-14282 на национальное патентное депонирование 21 июля 2022 года. Депозитер: ООО «НПЦ «Акрон инжиниринг».

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма.

Морфологические признаки: клетки штамма в оптимальных условиях имеют форму кокка или диплококка, окружены микрокапсулой, не подвижны, грам-отрицательны. В зависимости от условий культивирования диаметр кокков варьируется от 0,7 до 1,4 мкм. В условиях не оптимальных для роста клетки имеют форму тетракокка, диаметром до 2 мкм, могут образовывать макрокапсулу.

Культуральные признаки: на минеральной агаризованной среде в метано-воздушной атмосфере образуют колонии округлые с ровным краем, слегка выпуклые, кремовые, гладкие, блестящие, диаметр 1 мм, в среду не врастают. Водорастворимого пигмента не выделяется.

Физиологические свойства: облигатный метанотроф. Использует в качестве источника углерода чистый метан, метан из природного газа и метанол. Метан ассимилирует гексулозофосфатным путем. На органических средах (сусло-агар, картофельный и мясо-пептонный агар) не растет. Способен использовать в качестве источника углерода природный газ, содержащий помимо метана его гомологи: этан - до 3%, пропан - до 1%, бутан - до 1%. Аэроб. Оптимальные параметры культивирования: температура 40-42°С и рН=5,6-5,8 ед. Способен расти при рН=4,4 и повышенных температурах (42-47°С). Штамм баротолерантен, способен развиваться при высоком давлении (до 12 атм), устойчив к примесям гомологов метана (С₂, С₃, С₄) в природном газе. Может использовать метанол в концентрации до 0,3% (v/v) как дополнительный субстрат, стимулирующий рост, при культивировании в метано-воздушной или метано-кислородной атмосфере. Устойчив к концентрациям этанола, н-пропанола, н-бутанола до 0,1% (v/v). Отношение к источникам азота: использует аммонийную, нитратную формы азота, способен фиксировать азот атмосферы. Способен расти при высоких концентрациях азота и фосфора в среде: концентрации азота - до 400-500 мг/л, концентрации фосфора - до 500-600 мг/л. Штамм не нуждается в витаминах и других стимуляторах роста, конкурентоспособен по отношению к метанокисляющим микроорганизмам других видов. Штамм характеризуется стабильностью роста при непрерывном культивировании с высокой скоростью протока до 0,35 час^-1, обеспечивает высокую продуктивность в метано-кислородном варианте-до 15,75 г/л×ч по биомассе с высоким содержанием белка - до 80% (по Кьельдалю) и нуклеиновых кислот - до 12% (по Спирину), а также экономичность процесса. Methylococcus capsulatus ACR-22 потребляет около 2,3-2,5 г O₂/г биомассы, тогда как исходный Methylococcus capsulatus ВСБ-874 тратит 3,2-3,4 г О₂/г биомассы. Штамм непатогенен.

Состав минимальной среды для поддержания чистой культуры и культивирования на чашках Петри и в колбах (на 1 л):

Основные компоненты, г: (NH₄)₂SO₄, - 0,1; MgSO₄×7H₂O - 0,22; CaCl₂ - 0,055; Na₂HPO₄ - 0,092; KH₂PO₄ - 0,07.

Метанол - 0,5 мл; H₃PO₄ (85%) - 0,01 мл.

Микроэлементы, мг: CuSO₄×5H₂O - 2,2; FeSO₄×7H₂O - 6,15; MnSO₄×5H₂O - 1,97; Н_{3 В}О₃ - 1,25; ZnSO₄×7H₂O - 0,5; Na₂MoO₄×2H₂O - 0,11; CoSO₄×7H₂O - 0,52; NiSO₄×7H₂O - 0,25; Na₂EDTA - 5,00. Готовят концентрированный (в 500-1000 раз) раствор микроэлементов, куда добавляют H₃PO₄.

рН готовой среды 6-6,3. Для агаризованной среды используют агар в концентрации 1,6-1,7%, желательно, очищенный. Фосфаты и микроэлементы стерилизуются отдельно. Метанол и микроэлементы можно стерилизовать фильтрацией. В автоклаве стерилизацию проводят 30 минут при 1 ати.

Область применения штамма: получаемая микробная биомасса с высоким содержанием белка, нуклеиновых кислот может использоваться как кормовая белково-витаминная добавка для животных и рыбы, а также при комплексной переработке микробной биомассы для получения биологически активных препаратов в ветеринарии, пищевой, медицинской промышленности и др.

Пример 1. Культивирование Methylococcus capsulatus ACR-22 в непрерывном режиме при атмосферном давлении (метано-воздушный вариант).

Процесс проводили в ферментере с турбинными мешалками рабочим объемом 35 л в непрерывном режиме с нарастающим до D=0,35 час^-1 протоком питательной среды, поддерживали температуру 40-42°С, рН 5,6-5,8 (автоматическая подтитровка аммиачной водой), и осуществляли непрерывную подачу смеси метана и воздуха в соотношении 1:4 с поддержанием уровня растворенного кислорода не ниже 5% по датчику регулированием оборотов мешалки и расхода газовой фазы.

Использовали среду следующего состава:

Микроэлементы из списка готовили на основе Н₃РО₄ в виде концентрата. При стерильном культивировании микроэлементы стерилизовали отдельно от остальных компонентов 30 минут при 1 ати.

Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 использовал метанол в концентрации 0,3% (v/v) как дополнительный субстрат, стимулирующий рост и накопление биомассы, что отличает его от Methylococcus capsulatus ВСБ-874, штамм-прототипа и других штаммов, не обладающих устойчивостью к высоким концентрациям метанола.

Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 культивировали и в стерильных условиях, и в составе ассоциации. В процессах культивирования на природном газе с разным содержанием гомологов метана штамм также хорошо рос в составе ассоциативной культуры. Содержание гетеротрофных сопутствующих микроорганизмов в стабильном процессе культивирования составляло не более 5% по отношению к общей массе микробных клеток.

В непрерывном режиме культивирования при атмосферном давлении и высокой скорости протока D=0,35 час^-1 Methylococcus capsulatus ACR-22 накапливал до 11 г/л биомассы с содержанием сырого протеина 77-80% (по Кьельдалю), нуклеиновых кислот - до 12% (по Спирину).

Пример 2. Культивирование Methylococcus capsulatus ACR-22 в нестерильных условиях в составе ассоциации микроорганизмов.

В течение длительного стабильного непрерывного культивирования состав ассоциации микроорганизмов в части доминирующих сопутствующих микроорганизмов практически не изменяется. Однако, при непредвиденных остановках оборудования, сбоях в приготовлении питательной среды, изменении качества солей, воды может происходить смена состава сопутствующих микроорганизмов. Для Methylococcus capsulatus ВСБ-874 это приводило к падению содержания сырого протеина в биомассе и длительному процессу реактивации, адаптации основной культуры к новым условиям, а иногда и к полному угнетению основной культуры. У штамма Methylococcus capsulatus ACR-22 при культивировании на среде из примера 1 при тех же параметрах культивирования в длительном непрерывном процессе с описанными выше сбоями в технологическом процессе происходила смена доминирующих сопутствующих микроорганизмов: обычно одни виды микроорганизмы родов Pseudomonas и Cupriviadus заменялись на другие виды тех же родов, что подтверждалось данными 16S рРНК-анализа. Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 быстрее чем Methylococcus capsulatus ВСБ-874 реактивируется после восстановления работы оборудования для ферментации и других сбоев, и устойчив к смене состава сообщества сопутствующих микроорганизмов, а также к фаголизису, показывая те же уровни активности, что и в примере 1, а именно: в непрерывном режиме культивирования при атмосферном давлении и высокой скорости протока D=0,35 час^-1 Methylococcus capsulatus ACR-22 накапливал до 11 г/л биомассы с содержанием сырого протеина 77-80% (по Кьельдалю), нуклеиновых кислот - до 12% (по Спирину).

Пример 3. Высокоплотностное культивирование Methylococcus capsulatus ACR-22 в непрерывном режиме (метано-кислородный вариант).

Процесс проводили в ферментере с турбинными мешалками рабочим объемом 35 л под давлением 6 ати в непрерывном режиме с нарастающим до D=0,35 час^-1 протоком питательной среды, поддерживали температуру 40-42°С, рН 5,6-5,8 (автоматическая подтитровка аммиачной водой), и осуществляли непрерывную раздельную подачу природного газа и кислорода с поддержанием уровня растворенного кислорода на грани лимита по датчику регулированием оборотов мешалки, расхода газовой фазы и показаниям датчиков на метан и кислород на входе и выходе ферментера.

Питательная среда в системе высокоплотностного культивирования содержит повышенные концентрации источников азота и фосфора, т.к. концентрации компонентов повышаются практически пропорционально накоплению биомассы, и любой сбой процесса может привести к остановке роста из-за повышения концентраций этих элементов. Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22 устойчив к высоким концентрациям азота и фосфора в среде, способен расти и не подавляется при концентрации азота - 400-500 мг/л, концентрации фосфора 500-600 мг/л. Таким образом, полученный штамм более стабилен при высокоплотностном культивировании, и достигает концентрации биомассы 43-45 г/л с содержанием сырого протеина 77-80%, нуклеиновых кислот - до 12% при протоке питательной среды D=0,35 час^-1. Продуктивность процесса культивирования по биомассе составляла до 15,75 г/л×ч.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22, обладающий при культивировании в метано-воздушной или метано-кислородной атмосфере устойчивостью к фаголизису, к изменениям в составе микроорганизмов-спутников при нестерильном культивировании, к повышенным концентрациям азота и фосфора в среде и обладающий минимальным потреблением кислорода, депонирован под номером ВКПМ В-14282. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств для получения микробной белковой биомассы в биотехнологическом производстве с повышенным выходом биомассы и продуктивностью. 3 пр.

Штамм Methylococcus capsulatus ACR-22, депонированный в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» под регистрационным номером В-14282, как продуцент высокобелковой биомассы.