КОМПОЗИЦИЯ ПОКРЫТИЯ ПЬЕЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО СЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФТОРХИНОЛОНОВ В ЖИДКИХ СРЕДАХ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/53 C12Q1/04 

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для селективного определения фторхинолонов (левофлоксацина, ципрофлоксацина) в пищевых продуктах и биологических жидкостях с помощью пьезоэлектрического иммуносенсора.

В настоящее время для определения группы фторхинолонов применяют методы: хроматографические [ R.C. Determination of Fluoroquinolones in Milk Samples by Postcolumn Derivatization Liquid Chromatography with Luminescence Detection / R.C. , J.M. , M.P. Aguilar-Caballos, A. // J. Agric. Food Chem. - 2006. - V. 54 (26). - P. 9670-9676; Takeda N. Rapid screening method for quinolone residues in livestock and fishery products using immobilised metal chelate affinity chromatographic clean-up and liquid chromatography-fluorescence detection / N. Takeda, M. Gotoh, T. Matsuoka // Food Additives & Contaminants: Part A. - 2011. - V. 28:9. - P. 1168-1174; Ziarrusta H. Determination of fluoroquinolones in fish tissues, biological fluids, and environmental waters by liquid chromatography tandem mass spectrometry / H. Ziarrusta, N. Val, H. Dominguez, L. Mijangos, A. Prieto, A. Usobiaga, N. Etxebarria, O. Zuloaga, M. Olivares // Anal. Bioanal. Chem. - 2017. - V. 409(27). - P. 6359-6370; Pearce J.N. Determination of fluoroquinolones in aquaculture products by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry / J.N. Pearce, B.G. Burns, J.M. van de Riet, M.D. Casey, R.A. Potter // Food Additives & Contaminants: Part A. - 2009. - V. 26:1. - P. 39-46], недостатком таких методов является необходимость дорогостоящего оборудования и присутствия высококвалифицированных специалистов; иммунохимические [Wen. K. Improved fluoroquinolone detection in ELISA through engineering of a broad-specific single-chain variable fragment binding simultaneously to 20 fluoroquinolones / K. Wen, G. , S. Schillberg, Z. Wang // Anal Bioanal Chem. - 2012. - V. 403. - P. 2771-2783; Yu. X. A one-step chemiluminescence immunoassay for 20 fluoroquinolone residues in fish and shrimp based on a single chain Fv-alkaline phosphatase fusion protein / X. Yu, X. Tao, J. Shen, S. Zhang, X. Cao, M. Chen, W. Wang, Z. Wang, K. Wen // Anal. Methods. - 2015. - V. - 7. - P. 9032-9039], данные методы обладают невысокой чувствительностью (0,23-2,1 мкг/кг), а также требуют применения дополнительных меток.

Наиболее близким является метод [Tsekenis. G. Detection of Fluoroquinolone Antibiotics in Milk via a Labeless Immunoassay Based upon an Alternating Current Impedance Protocol / G. Tsekenis, F. Davis, P.A. Millner, D. G. Pinacho, F. Sanchez-Baeza, M.-Pilar Marco, T.D. Gibson // Anal. Chem. - 2008. - V. 80. - P. 9233-9239], обладающий довольно широким диапазоном определяемых содержаний (0,1-100 нг/мл), однако требующий применения дополнительных меток и обладающий большой продолжительности анализа.

Задачами настоящего изобретения являются расширение диапазона определяемых содержаний фторхинолонов (левофлоксацина, ципрофлоксацина), уменьшение времени продолжительности анализа, возможность регенерации покрытия.

Поставленные задачи решаются тем, что в качестве покрытия пьезоэлектрического сенсора для определения фторхинолонов применяют композицию следующего состава: самоорганизующийся монослой 2-амино-3-меркаптопропановой кислоты с пришитыми к ней углеродными нанотрубками и иммобилизованным фторхинолон-белковым конъюгатом.

Для высокочувствительного определения фторхинолонов (левофлоксацин, ципрофлоксацин) на поверхности электрода сенсора формировали композицию на основе 2-амино-3-меркаптопропановой кислоты, выдерживали ее 90 минут, затем пришивали УНТ к сформированной цистеиновой подложке и инкубировали в течение 24 часов в темном месте, после чего проводилась активация поверхностных карбоксильных групп УНТ с помощью EDAC и NHS в течение 90 минут. Затем осуществляли иммобилизацию гаптен-белковых конъюгатов и иммуносенсор помещали во влажную камеру. В пробу, содержащую определяемый фторхинолон, вводили заранее установленное количество антител, соответствующее 50%-ному связыванию и выдерживали в течение 5 мин до завершения образования гомогенного иммунного комплекса определяемого соединения (фторхинолна) с антителами. Затем пробу наносили на заранее подготовленную поверхность сенсора и измеряли аналитический сигнал в результате взаимодействия несвязавшихся антител с фторхинолон-белковым конъюгатом на поверхности электродов сенсора. Аналитический сигнал сенсора обратно пропорционален содержанию фторхинолона в анализируемой пробе. После каждого измерения осуществляют регенерацию покрытия рецепторного покрытия, нанося на поверхность 0,003 М раствор роданида калия.

Отличительными признаками предложенного способа являются:

- Высокая чувствительность способа, позволяющая осуществить определение количества левофлоксацина и циплофлоксацина в пищевых продуктах в интервале концентраций 10-350 и 10-370 нг/мл, соответственно, при этом предел обнаружения равен 5 и 7 нг/мл, соответственно;

- Многократное (28 раз) использование иммуносенсора вследствие устойчивого покрытия, образованного методом самоорганизованных монослоев, а также регенерации биорецепторного покрытия после каждого цикла измерения;

- Высокая селективность определения фторхинолонов в сложных по составу смесях (ПР%<1%);

- Относительно невысокая продолжительность анализа (15-20 мин).

Предложенная композиция состава покрытия пьезоэлектрического сенсора позволяет проводить определение левофлоксацина и циплофлоксацина в пищевых продуктах в интервале концентраций 10-350 и 10-370 нг/мл, соответственно. Высокая селективность обеспечивается использованием групп-специфичных иммунореагентов - поликлональных антител к определяемым фторхинолонам (ПР%<1%). Многократное (28 раз) использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия обеспечивает снижение затрат на осуществление анализа.

Формирование композиции состава сенсора осуществляется следующим образом:

В качестве физического преобразователя использовали пьезокварцевые резонаторы АТ-среза с собственной частотой колебаний 10 МГц ± 1 Гц с золотыми электродами (диаметр 4 мм), полученные магнетронным напылением. Формирование подложки на основе УНТ: очищение поверхности с помощью 0,1 М раствора HCl и этилового спирта; высушивание до постоянной массы в токе воздуха ~70°C (5 мин); промывание поверхности сенсора фосфатным буферным раствором (рН=7,2); закрепление цистеиновой подложки на Au-поверхности сенсора (2 мкл цистеина (1 мМ) наносили на очищенную поверхность резонатора и выдерживали 90 минут при комнатной температуре); пришивание функционализированных УНТ к сформированной цистеиновой подложке за счет аминогрупп (наносили 2 мкл УНТ (100 мг/л) и инкубировали в течение 24 часов в темном месте); активация поверхностных карбоксильных групп УНТ с помощью EDAC и NHS в течение 90 минут. Иммобилизацию гаптен-белковых конъюгатов осуществляли следующим образом: на поверхность активированных УНТ наносили 5 мкл 5% раствора глутарового альдегида, спустя 15-20 минут сенсор промывали в фосфатном буферном растворе (рН=7,2) и наносили 5 мкл 0,05%-го раствора гептен-белкового конъюгата. Иммуносенсор помещали во влажную камеру и выдерживали 10-12 часов при +4°C. В пробу, содержащую определяемый фторхинолон, вводили заранее установленное количество антител, соответствующее 50%-ному связыванию и выдерживали в течение 5 мин до завершения образования гомогенного иммунного комплекса определяемого соединения (фторхинолна) с антителами. Затем пробу наносили на заранее подготовленную поверхность сенсора, выжидали 3 мин и измеряли аналитический сигнал в результате взаимодействия несвязавшихся антител с фторхинолон-белковым конъюгатом на поверхности электродов сенсора.

После измерения аналитического сигнала сенсора осуществляли разрушение образовавшегося иммунокомплекса и регенерацию биослоя. Частота колебаний сенсора при этом возвращается к исходному значению. После предварительной проподготовки, описанной выше, определяли концентрацию определяемого фторхинолона в пробе по предварительно построенному градуировочному графику.

Для построения градуировочной зависимости используют стандартные растворы фторхинолонов, содержащие 5, 10, 50, 100, 200, 300, 350, 380 нг/мл определяемого компонента (ципрофлоксацина, левофлоксацина) в количестве 5 мкл и добавляли 5 мкл раствора антител, соответствующего 50%-ному связыванию и выдерживают 5 мин до завершения реакции.

Значение аналитического сигнала обратно пропорционально содержанию аналита в пробе.

Градуировочный график для определения фторхинолонов линеен в диапазоне концентраций 10-350 нг/мл для левофлоксацина: Δf=-2,76 с + 1065, и 10-370 нг/мл для ципрофлоксацина: Δf=-2,78 с + 1181, где Δf - аналитический сигнал, Гц; с - концентрация фторхинолона в пробе, нг/мл.

Примеры применения предлагаемой композиции покрытия пьезоэлектрического сенсора:

Пример 1. Пробу, содержащую раствор определяемого фторхинолона с концентрацией 5 нг/мл, определяемого компонента (ципрофлоксацина, левофлоксацина) в количестве 5 мкл и добавляли 5 мкл раствора антител, соответствующего 50%-ному связыванию и выдерживают 5 мин до завершения реакции. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию фторхинолона в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезоэлектрического сенсора осуществляли нанесением на поверхность 0,003 М раствор роданида калия. Определение концентрации анализируемого фторхинолона осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал для левофлоксацина Δf=1051,2 Гц, для ципрофлоксацина - Δf=1167,1 Гц.

Пример 2. Пробу, содержащую раствор определяемого фторхинолона с концентрацией 10 нг/мл, определяемого компонента (ципрофлоксацина, левофлоксацина) в количестве 5 мкл и добавляли 5 мкл раствора антител, соответствующего 50%-ному связыванию и выдерживают 5 мин до завершения реакции. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию фторхинолона в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезоэлектрического сенсора осуществляли нанесением на поверхность 0,003 М раствор роданида калия. Определение концентрации анализируемого фторхинолона осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал для левофлоксацина Δf=1037,4 Гц, для ципрофлоксацина - Δf=1153,2 Гц.

Пример 3. Пробу, содержащую раствор определяемого фторхинолона с концентрацией 50 нг/мл, определяемого компонента (ципрофлоксацина, левофлоксацина) в количестве 5 мкл и добавляли 5 мкл раствора антител, соответствующего 50%-ному связыванию и выдерживают 5 мин до завершения реакции. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию фторхинолона в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезоэлектрического сенсора осуществляли нанесением на поверхность 0,003 М раствор роданида калия. Определение концентрации анализируемого фторхинолона осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал для левофлоксацина Δf=927 Гц, для ципрофлоксацина - Δf=1128,2 Гц.

Пример 4. Пробу, содержащую раствор определяемого фторхинолона с концентрацией 100 нг/мл, определяемого компонента (ципрофлоксацина, левофлоксацина) в количестве 5 мкл и добавляли 5 мкл раствора антител, соответствующего 50%-ному связыванию и выдерживают 5 мин до завершения реакции. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию фторхинолона в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезоэлектрического сенсора осуществляли нанесением на поверхность 0,003 М раствор роданида калия. Определение концентрации анализируемого фторхинолона осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал для левофлоксацина Δf=789,0 Гц, для ципрофлоксацина - Δf=903,0 Гц.

Пример 5. Пробу, содержащую раствор определяемого фторхинолона с концентрацией 200 нг/мл, определяемого компонента (ципрофлоксацина, левофлоксацина) в количестве 5 мкл и добавляли 5 мкл раствора антител, соответствующего 50%-ному связыванию и выдерживают 5 мин до завершения реакции. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию фторхинолона в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезоэлектрического сенсора осуществляли нанесением на поверхность 0,003 М раствор роданида калия. Определение концентрации анализируемого фторхинолона осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал для левофлоксацина Δf=513,0 Гц, для ципрофлоксацина - Δf=625,0 Гц.

Пример 6. Пробу, содержащую раствор определяемого фторхинолона с концентрацией 300 нг/мл, определяемого компонента (ципрофлоксацина, левофлоксацина) в количестве 5 мкл и добавляли 5 мкл раствора антител, соответствующего 50%-ному связыванию и выдерживают 5 мин до завершения реакции. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию фторхинолона в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезоэлектрического сенсора осуществляли нанесением на поверхность 0,003 М раствор роданида калия. Определение концентрации анализируемого фторхинолона осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал для левофлоксацина Δf=237,0 Гц, для ципрофлоксацина - Δf=347,0 Гц.

Пример 7. Пробу, содержащую раствор определяемого фторхинолона с концентрацией 350 нг/мл, определяемого компонента (ципрофлоксацина, левофлоксацина) в количестве 5 мкл и добавляли 5 мкл раствора антител, соответствующего 50%-ному связыванию и выдерживают 5 мин до завершения реакции. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию фторхинолона в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезоэлектрического сенсора осуществляли нанесением на поверхность 0,003 М раствор роданида калия. Определение концентрации анализируемого фторхинолона осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал для левофлоксацина Δf=99,0 Гц, для ципрофлоксацина - Δf=208,0 Гц.

Пример 8. Пробу, содержащую раствор определяемого фторхинолона с концентрацией 380 нг/мл, определяемого компонента (ципрофлоксацина, левофлоксацина) в количестве 5 мкл и добавляли 5 мкл раствора антител, соответствующего 50%-ному связыванию и выдерживают 5 мин до завершения реакции. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию фторхинолона в пробе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезоэлектрического сенсора осуществляли нанесением на поверхность 0,003 М раствор роданида калия. Определение концентрации анализируемого фторхинолона осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Аналитический сигнал для левофлоксацина Δf=16,2 Гц, для ципрофлоксацина - Δf=124,6 Гц.

Предложенная композиция состава покрытия пьезоэлектрического сенсора позволяет расширить диапазон определяемых содержаний при анализе фторхинолонов в жидких средах, а также обеспечивает многократное использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия, что снижает затраты на осуществление анализа. Сравнительная характеристика известного способа определения фторхинолонов и способа с применением предлагаемой композицей покрытия пьезоэлектрического сенсора приведена в таблице.

Изобретение относится к области аналитической химии и заключается в создании пьезоэлектрического сенсора для определения лекарственных веществ фторхинолонового ряда – левофлоксацина и ципрофлоксацина. Для этого на поверхность сенсора нанесена подложка на основе самоорганизующегося монослоя 2-амино-3-меркаптопропановой кислоты (цистеина), на которую закреплены активированные углеродные нанотрубки (УНТ) и иммобилизован фторхинолон-белковый конъюгат. Изобретение позволяет расширить диапазон определяемых содержаний при анализе фторхинолонов в жидких средах, а также обеспечивает многократное использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия, что снижает затраты на осуществление анализа. 1 табл., 8 пр.

Пьезоэлектрический сенсор для определения лекарственных веществ фторхинолонового ряда – левофлоксацина и ципрофлоксацина, отличающийся тем, что на поверхность сенсора нанесена подложка на основе самоорганизующегося монослоя 2-амино-3-меркаптопропановой кислоты (цистеина), на которую закреплены активированные углеродные нанотрубки (УНТ) и иммобилизован фторхинолон-белковый конъюгат.