СПОСОБ СЕЛЕКТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОНИЛФЕНОЛА В РАСТВОРЕ С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/53 C12Q1/00 C12R1/00 

Описание патента на изобретение RU2287820C1

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для селективного определения нонилфенола в объектах окружающей среды - почве, промышленных сточных и природных водах.

Известен способ определения нонилфенола с применением поляризационного флуо-ресцентного иммуноанализа (Y.N.Yakovleva, A.Yu.Lobanova, E.A.Shutaleva, M.A.Kourkina, A.A.Mart'ianov, А.V.Zherdev, В.В.Dzantiev, S.A.Express detection of nonylphenol in water samples by fluorescence polarization immunoassay // Anal. Bioanal. Chem., 2004. Vol.378. - p.634-641), характеризующийся относительно невысокой чувствительностью (предел обнаружения равен 7 мкг/мл), высокой стоимостью анализа, поскольку предусматривается однократное использование иммунореагентов. Данным способом невозможно осуществлять определение остаточных концентраций нонилфенола в объектах окружающей среды.

Изобретением решается задача снижения предела обнаружения нонилфенола и увеличения чувствительности определения в сложных по составу пробах с последующей регенерацией иммунореагентов.

Для достижения технического результата в предлагаемом способе через проточную ячейку, включающую массочувствительный пьезокварцевый иммуносенсор с рецепторным покрытием на основе аминофенол-белкового конъюгата, с помощью фосфатного буферного раствора (рН 7,1-7,5) со скоростью 60 мкл/мин пропускают предварительно подготовленную пробу и регистрируют аналитический отклик сенсора. В качестве аналитического сигнала сенсора используют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии аминофенол-белкового конъюгата с антителами к нонилфенолу, присутствующими в пробе. Подготовку пробы осуществляют путем прибавления к раствору, содержащему нонилфенол фиксированного количества антител к нему. Аналитический сигнал сенсора обратно пропорционален содержанию нонилфенола в анализируемой пробе. После каждого цикла измерения осуществляют регенерацию рецепторного покрытия, пропуская через ячейку 0,02-0,10 мМ раствор тиоцианата калия.

Отличительными признаками предложенного способа являются:

- высокая чувствительность способа, позволяющая осуществлять определение нонилфенола в жидких средах в интервале концентраций 1-20 нг/мл, при этом предел обнаружения равен 0,8 нг/мл;

- проведение измерений в режиме реального времени;

- высокая селективность определения нонилфенола в сложных по составу смесях, в том числе в присутствии родственных соединений;

- многократное (более 20 раз) использование иммуносенсора вследствие регенерации биорецепторного покрытия после каждого цикла измерения.

Это позволяет проводить экспрессное определение нонилфенола в жидких средах в режиме реального времени в диапазоне концентраций 1-20 нг/мл в сложных по составу смесях. Высокая селективность обеспечивается использованием специфичных иммунореагентов (антител к нонилфенолу) и аминофенол-белкового конъюгата (природа белка не влияет на чувствительность и селективность определения нонилфенола). Многократное (более 20 раз) использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия обеспечивает снижение затрат на осуществление анализа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для создания иммуносенсора используется пьезокварцевый массочувствительный резонатор АТ-среза с серебряными электродами диаметром 5 мм и собственной частотой колебания 10 МГц±1 Гц. На одном из электродов сенсора после тщательной очистки и обезжиривания предварительно формировали силиконовую подложку на основе γ-аминопропилтриэтоксисилана, нанося его микрошприцем в виде тонкого слоя. Гаптен-белковый конъюгат ковалентно закрепляли на поверхности силиконового слоя с помощью глутарового альдегида.

Пьезокварцевый иммуносенсор закрепляли в проточной ячейке объемом 15-20 мкл таким образом, чтобы он контактировал только одной стороной с анализируемым раствором.

Перед началом измерений через ячейку пропускали фосфатный буферный раствор (рН 7,1-7,5) до стабилизации сигнала сенсора. Затем в поток буферного раствора вводили предварительно подготовленную пробу (0,2 мл), что вызывало снижение частоты колебания сенсора вследствие образования на поверхности электрода иммунокомплекса аминофенол-белкового конъюгата с антителами к нонилфенолу. Далее ячейку промывали буферным раствором до стабилизации сигнала сенсора и вводили регенерирующий раствор, разрушающий образовавшийся иммунный комплекс. Частота колебаний сенсора при этом возвращалась к исходному значению.

В качестве аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора использовали изменение частоты колебания сенсора (Δf) вследствие увеличения массы рецепторного покрытия в результате взаимодействия антител с аминофенол-белковым конъюгатом. Сигнал рассчитывается по следующему уравнению:

Δf=fm-f,

где fm - частота колебаний иммуносенсора до начала измерения с предварительно нанесенным биорецепторным слоем; f - минимальная частота колебаний сенсора, соответствующая образованию гетерогенного иммунокомплекса.

Для предварительной подготовки пробы к образцу, содержащему нонилфенол, прибавляли 50 мкл 0,1%-ного раствора антител к нонилфенолу, соответствующих 50%-ному связыванию их с аминофенол-белковым коньюгатом. Полученную смесь доводили фосфатным буферным раствором до 1 мл и выдерживали до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С. Концентрацию нонилфенола в пробе определяли по предварительно построенному градуировочному графику.

Для построения градуировочного графика к 50 мкл анализируемого раствора с концентрацией нонилфенола 1, 5, 10, 15, 20, 25 нг/мл прибавляли 50 мкл 0,1%-ного раствора антител, смесь доводили фосфатным буферным раствором до 1 мл и выдерживали до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С.

Значение аналитического сигнала обратно пропорционально содержанию нонилфенола в пробе.

Градуировочный график для определения нонилфенола в жидких средах линеен в диапазоне концентраций 1-20 нг/мл: Δf=-2,5·с+48,6, где Δf - аналитический сигнал; с - концентрация нонилфенола в пробе.

Пример 1. Исследуемый образец объемом 200 мкл с концентрацией нонилфенола 1 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин, включающей серийно выпускаемый отечественный пьезокварцевый резонатор АТ-среза с собственной частотой колебаний 10 МГц ± 1 Гц, на поверхности серебряных электродов (диаметр 5 мм) которого предварительно сформировали биорецепторный слой на основе гаптен-белкового конъюгата. Сенсор контактировал одной стороной с анализируемой жидкой фазой. Предварительно к анализируемой пробе добавляли фиксированное количество антител к нонилфенолу и выдерживали в течение 15 минут до образования комплекса. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию нонилфенола в растворе.

Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли пропусканием через ячейку детектирования раствора KCNS 0,02-0,10 мМ. Определение концентрации нонилфенола осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:1,0 нг/мл1,0±0,2 нг/мл

Аналитический сигнал Δf=46 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг, предел обнаружения нонилфенола - 0,8 нг/мл.

Пример 2. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 2 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:2,0 нг/мл2,0±0,2 нг/мл

Δf=44 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Предел обнаружения нонилфенола - 0,80 нг/мл.

Пример 3. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Предел обнаружения нонилфенола - 0,80 нг/мл.

Пример 4. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 8 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:8,0 нг/мл8,0±0,2 нг/мл

Δf=29 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Предел обнаружения нонилфенола - 0,80 нг/мл.

Пример 5. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,0) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл10,6±0,2 нг/мл

Δf=22 Гц; чувствительность определения нонилфенола 0,9 Гц/нг. Предел обнаружения - 1,5 нг/мл.

Пример 6. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,6) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл9,4±0,2 нг/мл

Δf=25 Гц; чувствительность определения нонилфенола 0,8 Гц/нг. Предел обнаружения нонилфенола - 1,3 нг/мл.

Пример 7. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли пропусканием через ячейку детектирования раствора KCNS 0,11 мМ. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл13,4±0,2 нг/мл

Δf=15 Гц; происходит разрушение биорецепторного покрытия иммуносенсора, снижается воспроизводимость результатов, невозможно многократное применение сенсора.

Пример 8. Исследуемый образец 200 мкл с концентрацией нонилфенола 5 нг/мл вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли пропусканием через ячейку детектирования раствора KCNS 0,01 мМ. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; существенно увеличивается время анализа.

Пример 9. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 5 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Присутствие 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) не влияет на результаты определения нонилфенола.

Пример 10. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 10 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Присутствие 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) не влияет на результаты определения нонилфенола.

Пример 11. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 20 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Присутствие 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) не влияет на результаты определения нонилфенола.

Пример 12. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 40 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Присутствие 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) не влияет на результаты определения нонилфенола.

Пример 13. Исследуемый образец 200 мкл, содержащий 5 нг/мл нонилфенола и 50 нг/мл 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) вводили в поток фосфатного буфера (рН 7,1-7,5) и пропускали через проточную ячейку со скоростью 60 мл/мин. Далее аналогично примеру 1.

Введено нонилфенола:Найдено нонилфенола:5,0 нг/мл5,0±0,2 нг/мл

Δf=36 Гц; чувствительность определения 2,5 Гц/нг. Присутствие 4-аминофенола (фенола, 4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, 2,4,6-тринитрофенола, 2,4,6-трибромфенола, 2,4,6-трихлорфенола, 4-гидроксифенола) не влияет на результаты определения нонилфенола.

Данный способ позволяет существенно увеличить чувствительность определения нонилфенола в сложных по составу смесях, а также обеспечивает многократное использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия, что снижает затраты на осуществление анализа. Предел обнаружения нонилфенола равен 0,8 нг/мл.

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа определения нонилфенола в жидких средах приведена в таблице.

ТаблицаСравнительная характеристика известного и предлагаемого способа детектированиия нонилфенола в жидких средахПоказателиИзвестный способПредлагаемый способДиапазон определяемых содержаний18-300 мкг/мл1-20 нг/млПредел обнаружения7 мкг/мл0,8 нг/млПрименение дополнительных метокФлуоресцентнаяНе требуетсяОбъем анализируемой пробы500 мкл200 мклВид анализаДискретный/косвенныйНепрерывный/прямойРегенерация иммунореагентовНе осуществляетсяПосле каждого цикла измеренияПродолжительность измерения аналитического сигнала, мин13

Похожие патенты RU2287820C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ СУЛЬФАМЕТОКСАЗОЛА С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА 2004
  • Ермолаева Татьяна Николаевна
  • Калмыкова Елена Николаевна
  • Мелихова Елена Владимировна
RU2271006C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАЦЕТАНИЛИДНЫХ ГЕРБИЦИДОВ (АЦЕТОХЛОР, БУТАХЛОР, АЛАХЛОР) С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА 2007
  • Ермолаева Татьяна Николаевна
  • Нартова Юлия Викторовна
RU2326384C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРЕПТОМИЦИНА С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА 2009
  • Ермолаева Татьяна Николаевна
  • Воронежцева Ольга Вячеславовна
RU2419797C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА 2011
  • Ермолаева Татьяна Николаевна
  • Карасева Надежда Александровна
RU2497123C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕТРАЦИКЛИНОВ С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО СЕНСОРА 2017
  • Ермолаева Татьяна Николаевна
  • Фарафонова Ольга Вячеславовна
RU2687742C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ К ПАТОГЕННЫМ БАКТЕРИЯМ YERSINIA ENTEROCOLITICA СЕРОВАРОВ O:3, O:5 ИЛИ O:6,30 С ПРИМЕНЕНИЕМ ПЬЕЗОГРАВИМЕТРИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА 2005
  • Калмыкова Елена Николаевна
  • Дергунова Елена Сергеевна
  • Горшкова Раиса Петровна
  • Командрова Надежда Алексеевна
  • Ермолаева Татьяна Николаевна
RU2288472C1
СОСТАВ ПОКРЫТИЯ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО РЕЗОНАТОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ YERSINIA ENTEROCOLITICA В ВОДНЫХ СРЕДАХ 2005
  • Калмыкова Елена Николаевна
  • Дергунова Елена Сергеевна
  • Горшкова Раиса Петровна
  • Командрова Надежда Алексеевна
  • Ермолаева Татьяна Николаевна
RU2287585C1
КОМПОЗИЦИЯ ПОКРЫТИЯ ПЬЕЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО СЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФТОРХИНОЛОНОВ В ЖИДКИХ СРЕДАХ 2018
  • Шукшина Евгения Ивановна
  • Фарафонова Ольга Вячеславовна
  • Ермолаева Татьяна Николаевна
RU2706362C1
ПОКРЫТИЕ ПЬЕЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО СЕНСОРА НА ОСНОВЕ МАГНИТНЫХ УГЛЕРОДНЫХ НАНОКОМПОЗИТОВ 2022
  • Бизина Екатерина Вячеславовна
  • Фарафонова Ольга Вячеславовна
  • Ермолаева Татьяна Николаевна
RU2783225C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТЫ ФЕНИЛАЛАНИН В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ ПЬЕЗОСЕНСОРОМ, МОДИФИЦИРОВАННЫМ ПОЛИМЕРОМ С МОЛЕКУЛЯРНЫМ ОТПЕЧАТКОМ 2009
  • Никитская Людмила Михайловна
  • Никитский Александр Сергеевич
  • Калач Андрей Владимирович
  • Селеменев Владимир Федорович
RU2408012C1

Реферат патента 2006 года СПОСОБ СЕЛЕКТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОНИЛФЕНОЛА В РАСТВОРЕ С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА

Изобретение относится к аналитической химии и иммунологии. Селективное определение нонилфенола осуществляют с помощью пьезокварцевого иммуносенсора. Пробу, содержащую нонилфенол и фиксированное количество антител к нему в фосфатном буфере (рН 7,1-7,5), пропускают через проточную ячейку, включающую массочувствительный пьезокварцевый иммуносенсор с рецепторным покрытием на основе аминофенол-белкового конъюгата. Нонилфенол определяют по регистрируемому изменению частоты колебания сенсора при взаимодействии аминофенол-белкового конъюгата с антителами к нонилфенолу, где изменение частоты колебания сенсора обратно пропорционально концентрации нонилфенола в анализируемой пробе. Затем регенерируют рецепторное покрытие для проведения последующих определений, пропуская через ячейку 0,02-0,10 мМ раствор тиоционата калия. Использование изобретения позволяет проводить многоразовый селективный анализ с пределом обнаружения нонилфенола 0,8 нг/мл и определять концентрацию нонилфенола в диапазоне 1-20 нг/мл. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 287 820 C1

Способ селективного определения нонилфенола, отличающийся тем, что селективное определение нонилфенола осуществляют с помощью пьезокварцевого иммуносенсора, где пробу, содержащую нонилфенол и фиксированное количество антител к нему в фосфатном буфере (рН 7,1-7,5), пропускают через проточную ячейку, включающую массочувствительный пьезокварцевый иммуносенсор с рецепторным покрытием на основе аминофенол-белкового конъюгата и регистрируют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии аминофенол-белкового конъюгата с антителами к нонилфенолу, обратно пропорциональное концентрации нонилфенола в анализируемой пробе, а затем регенерируют рецепторное покрытие для проведения последующих определений, пропуская через ячейку 0,02-0,10 мМ раствор тиоционата калия.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2006 года RU2287820C1

SAMSONOVA et al
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
Chemosphere
Способ приготовления мыла 1923
  • Петров Г.С.
  • Таланцев З.М.
SU2004A1
YAKOVLEVA et al
Express detection of nonylphenol in water samples by fluorescense polarization immunoassay
Anal
Bioanal
Chem
Способ приготовления мыла 1923
  • Петров Г.С.
  • Таланцев З.М.
SU2004A1
SAMSONOVA et al
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
Anal
Bioanal
Chem
Способ и приспособление для нагревания хлебопекарных камер 1923
  • Иссерлис И.Л.
SU2003A1

RU 2 287 820 C1

Авторы

Ермолаева Татьяна Николаевна

Дергунова Елена Сергеевна

Калмыкова Елена Николаевна

Даты

2006-11-20Публикация

2005-03-09Подача