СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ СУЛЬФАМЕТОКСАЗОЛА С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для селективного определения сульфаметоксазола в продуктах питания, таких как яйца, мясо птиц и животных, молоко и молочные продукты, в лекарственных формах и объектах окружающей среды - почве, промышленных сточных и природных водах.

Известен способ определения сульфаметоксазола в молоке и лекарственных формах с применением метода фотохимической флуоресценции (М.С.Mahedero, Т.Galeano Diaz, S.Galan Pascual. Determination of sulfamethoxazole by photochemically induced fluorescence in drugs and milk// Talanta, 2002. Vol.57. - p.1-6), характеризующийся невысокой чувствительностью (предел обнаружения равен 50 нг/мл) и селективностью. Данным способом невозможно осуществлять определение остаточных концентраций сульфаметоксазола в пищевых продуктах и объектах окружающей среды в присутствии родственных соединений.

Изобретением решается задача снижения предела обнаружения сульфаметоксазола и увеличения селективности его определения в сложных по составу пробах.

Для достижения технического результата в предлагаемом способе через проточную ячейку, включающую массчувствительный пьезокварцевый иммукосенсор с рецепторным покрытием на основе сульфаметоксазол-белкового конъюгата, с помощью фосфатного буферного раствора (рН 7,2) со скоростью 60 мкл/мин пропускают предварительно подготовленную пробу и регистрируют аналитический отклик сенсора. В качестве аналитического сигнала сенсора используют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии сульфаметоксазол-белкового конъюгата с антителами, присутствующими в пробе. Подготовку пробы осуществляют путем прибавления к раствору, содержащему сульфаметоксазол, фиксированного количества антител к нему. Аналитический сигнал сенсора обратно пропорционален содержанию сульфаметоксазола в анализируемой пробе. После каждого цикла измерения осуществляют регенерацию рецепторного покрытия, пропуская через ячейку 0,4 мМ раствор тиоцианата калия.

Отличительными признаками предложенного способа являются:

- высокая чувствительность способа, позволяющая осуществлять определение сульфаметоксазола в жидких средах в интервале концентраций 1-50 нг/мл, при этом предел обнаружения равен 0,15 нг/мл;

- проведение измерений в режиме реального времени;

- высокая селективность определения сульфаметоксазола в сложных по составу смесях, в том числе, в присутствии родственных соединений;

- многократное (более 20 раз) использование иммуносенсора вследствие регенерации биорецепторного покрытия после каждого цикла измерения.

Это позволяет проводить экспрессное определение сульфаметоксазола в жидких средах в режиме реального времени в диапазоне концентраций 1-50 нг/мл в сложных по составу смесях. Высокая селективность обеспечивается использованием специфичных иммунореагентов. Многократное (более 20 раз) использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия обеспечивает снижение затрат на осуществление анализа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для создания иммуносенсора используется пьезокварцевый массчувствительный резонатор АТ-среза с серебряньми электродами диаметром 8 мм и собственной частотой колебания 10 МГц±1 Гц. На одном из электродов сенсора после тщательной очистки и обезжиривания предварительно формировали силиконовую подложку на основе γ-аминопропилтриэтоксисилана, нанося его микрошприцем в виде тонкого слоя. Гаптен-белковый конъюгат ковалентно закрепляли на поверхности силиконового слоя с помощью глутарового альдегида.

Пьезокварцевый иммуносенсор закрепляли в проточной ячейке объемом 15-20 мкл таким образом, чтобы он контактировал только одной стороной с анализируемым раствором.

Перед началом измерений через ячейку пропускали фосфатный буферный раствор (рН 7,2) до стабилизации сигнала сенсора. Затем в поток буферного раствора вводили предварительно подготовленную пробу (0,2 мл), что вызывало снижение частоты колебания сенсора вследствие образования на поверхности электрода иммунокомплекса сульфаметоксазол-белкового конъюгата с антителами. Далее ячейку промывали буферным раствором до стабилизации сигнала сенсора и вводили регенерирующий раствор, разрушающий образовавшийся иммунный комплекс. Частота колебаний сенсора при этом возвращалась к исходному значению.

В качестве аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора использовали изменение частоты колебания сенсора (Δf) вследствие увеличения массы рецепторного покрытия в результате взаимодействия антител с сульфаметоксазол-белковым конъюгатом.

Сигнал рассчитывается по следующему уравнению:

Δf=f_m-f,

где f_m - частота колебаний иммуносенсора до начала измерения с предварительно нанесенным биорецепторным слоем; f - минимальная частота колебаний сенсора, соответствующая образованию гетерогенного иммунокомплекса.

Для предварительной подготовки пробы к образцу, содержащему сульфаметоксазол, прибавляли 20 мкл 0,002%-ного раствора антител, соответствующих 50%-му связыванию их с сульфаметоксазол-белковым коньюгатом. Полученную смесь доводили фосфатным буферным раствором до 1 мл и выдерживали до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С. Концентрацию сульфаметоксазола в пробе определяли по предварительно построенному градуировочному графику.

Для построения градуировочного графика к 50 мкл анализируемого раствора с концентрацией сульфаметоксазола 5, 10, 15, 25 и 40 нг/мл прибавляли 20 мкл 0,002%-ного раствора антител, смесь доводили фосфатным буферным раствором до 1 мл и выдерживали до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С.

Значение аналитического сигнала обратно пропорционально содержанию сульфаметоксазола в пробе.

Градуировочный график для определения сульфаметоксазола в жидких средах линеен в диапазоне концентраций 1-50 нг/мл: Δf=-1,7·с+82,4, где Δf - аналитический сигнал; с - концентрация сульфаметоксазола в пробе.

Данный способ позволяет существенно увеличить чувствительность и селективность определения сульфаметоксазола в сложных по составу смесях, а также обеспечивает многократное использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия, что снижает затраты на осуществление анализа. Предел обнаружения сульфаметоксазола равен 0,15 нг/мл.

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа определения сульфаметоксазола в жидких средах приведена в таблице.

Таблица
Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа детектированиия сульфаметоксазола в жидких средахПоказателиИзвестный способПредлагаемый способДиапазон определяемых содержаний, нг/мл500-25001-50Предел обнаружения, нг/мл50,000,15Селективность анализа (определение в присутствии родственных соединений):
сульфаметазиннеселективен
(определение в присутствии сульфаметазина не возможно)селективен
(высокоспецифичное взаимодействие позволяет проводить определение в присутствии сульфаметазина)сульфаметазин гемисукцинатнеселективен
(определение в присутствии сульфаметазин гемисукцината не возможно)селективен
(высокоспецифичное взаимодействие позволяет проводить определение в присутствии сульфаметазин гемисукцината)Продолжительность измерения аналитического сигнала, мин53

Область использования изобретения: определение сульфаметоксазола в продуктах питания (яйца, мясо птиц и животных, молоко и молочные продукты), в лекарственных формах и объектах окружающей среды (почва, промышленные сточные и природные воды). Технический результат: снижение предела обнаружения сульфаметоксазола и увеличение селективности его определения в сложных по составу пробах. Сущность заключается в том, что пьезокварцевый иммуносенсор закрепляли в проточной ячейке объемом 15-20 мкл таким образом, чтобы он контактировал только одной стороной с анализируемым раствором. Полученную смесь доводили фосфатным буферным раствором до 1 мл и выдерживали до завершения реакции в течение 15 мин при 20°С. Перед началом измерений через ячейку пропускали фосфатный буферный раствор (рН 7,2) до стабилизации сигнала сенсора. Затем в поток буферного раствора вводили пробу (0,2 мл), что вызывало снижение частоты колебания сенсора вследствие образования на поверхности электрода иммунокомплекса сульфаметоксазол-белкового конъюгата с антителами. В анализируемый образец вводили антитела с концентрацией, соответствующей их 50%-ному связыванию с сульфаметоксазол-белковым конъюгатом. Регенерацию рецепторного покрытия проводили с помощью 0,4 мМ раствора тиоцианата калия. 1 табл.

Способ определения сульфаметоксазола в пищевых продуктах, объектах окружающей среды и лекарственных формах, отличающийся тем, что через проточную ячейку, включающую массчувствительный пьезокварцевый иммуносенсор с рецепторным покрытием на основе сульфаметоксазол-белкового конъюгата, с помощью фосфатного буферного раствора рН=7,2 пропускают пробу, содержащую сульфаметоксазол и фиксированное количество антител к нему, регистрируют изменение частоты колебания сенсора при взаимодействии сульфаметоксазол-белкового конъюгата с антителами Δf, находят концентрацию сульфаметоксазола в пробе с по градуировочному графику Δf=-1,7·с+82,4, линейному в диапазоне концентраций 1-50 нг/мл, а затем регенерируют рецепторное покрытие, пропуская через ячейку 0,4 mM раствор тиоцианата калия, обеспечивая многократное использование сенсора.