СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИЙ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Российский патент 2019 года по МПК G01N33/92 G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии и инфекционным болезням и может быть использовано для диагностики стадий ВИЧ-инфекции.

В настоящее время существует Российская и Международная классификации ВИЧ-инфекции. Российская утверждена приказом Минздравсоцразвития РФ от 17.03.2006 №166 «Об утверждении Инструкции по заполнению годовой формы федерального государственного статистического наблюдения №61 «Сведения о контингентах больных ВИЧ-инфекцией» (https://studfiles. net/preview/1818585/page:3/). В ней представлена диагностика стадий ВИЧ-инфекции по клиническим признакам, которые многообразны и могут «переходить» из одной стадии в другую. Например, характерный признак 3-й стадии болезни генерализованная лимфоаденопатия может «отмечаться и на более поздних стадиях ВИЧ-инфекции» (https://studfiles. net/preview/1818585/page:3/).

В методическом письме «Правила постановки диагноза ВИЧ-инфекция», утвержденном Заместителем Министра здравоохранения и социального развития Российской Федерации Р.А. Хальфиным от 10 августа 2007 года №5922-РХ (http://docs.cntd.ru/document/420261061) помимо клинических признаков стадий ВИЧ-инфекции указывается, что в третьей стадии «отмечается постепенное снижение уровня CD4-лимфоцитов в среднем со скоростью 0,05-0,07×10⁹ / в год. Обычно стадия 4А развивается у пациентов с уровнем CD4-лимфоцитов ниже 0,5×10⁹/л. Стадия 4Б развивается у пациентов с уровнем CD4-лимфоцитов менее 0,35×10⁹/л. Стадия 4В развивается у пациентов с уровнем CD4 лимфоцитов менее 0,2×10⁹/л. Для стадии 5 типично снижение количества CD4-клеток ниже 0,05×10⁹/л». Методика определения CD4-лимфоцитов описана В.В. Покровским и соавт. в книге «Клиническая диагностика и лечение ВИЧ-инфекции». - М.: ГОУ ВУНМЦ РФ, 2001. - С. 11 (аналог).

К недостаткам данного способа можно отнести сложность его реализации. В частности, результаты данного теста могут быть объективными лишь в специализированных центрах регионального масштаба, что значительно усложняет возможность оценки стадий ВИЧ-инфекции. В первую очередь из-за того, что анализ основан на характеристике рецепторов жизнеспособных клеток крови, поэтому исследование ограничено временными рамками - интервал между забором крови и ее тестированием не должен превышать 3-4 часов. Методику усложняют и дополнительные анализы - определение формулы крови и общего числа лейкоцитов с целью подсчета основного критерия - абсолютного числа CD4-лимфоцитов периферической крови. Для аналога характерна недостаточная информативность из-за лабильности показателей, не связанной непосредственно с фактором инфицирования ВИЧ. Изменения числа CD4-лимфоцитов весьма неспецифичны и могут наблюдаться при других заболеваниях.

Существуют и другие лабораторные способы диагностики ВИЧ-инфекции.

Способ лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции (патент №2123187 опубликован в БИ №34) предусматривает -ионобменную хромотографию сыворотки с последующим ИФА определением уровня "скрытых" антител. Данный метод, имеющий значение в прогнозе течения ВИЧ-инфекции, не ориентирован на определение ее стадий.

Способ определения антител к вирусу иммунодефицита человека (пат. №2032907 опубликован в БИ №10) может быть использован при установлении факта инфицирования ВИЧ, но не связан с определением стадии инфекции.

Способ твердофазного иммуноферментного определения антител к вирусу иммунодефицита человека (пат. 53296/30-13, БИ №45) имеет целью повышение чувствительности способа определения антител к ВИЧ, но также не может быть использован для диагностики стадии инфекционного процесса.

Известен способ оценки стадий ВИЧ-инфекции (Клиническая иммунология и аллергология под ред. Г. Лолора-младшего. - М., Практика, 2000. - С. 585-587), заключающийся в определении уровня сывороточного (β2-микроглобулина. Увеличение концентрации этого белка, определяемого с помощью диагностических наборов иммуноферментного анализа, соответствует прогрессии ВИЧ-инфекции. Между тем, данные изменения неспецифичны, поскольку подобная динамика β2-микроглобулина возможна не только при ВИЧ-инфекции, но и при опухолевых процессах, циррозе печени, лимфопролиферативных заболеваниях. Таким образом, этот метод недостаточно информативен для оценки стадий ВИЧ-инфекции ввиду своей неспецифичности (А. Ройт, Дж. Бристофф Иммунология. Мир, 2000. - с. 411).

Наиболее близким по технической сущности к заявленному способу является способ диагностики стадий ВИЧ-инфекции путем исследования крови, отличающейся тем, что тестируют сыворотку крови методом иммуноферментного анализа, определяют оптическую плотность - ОП исходного образца сыворотки и оптическую плотность исходного образца сыворотки, инкубированного в течение 10 минут со 100 мкл 3.5 М раствора изотиоционата натрия - NaSCN и при снижении ОП на 40% и менее диагностируют стадию А - генерализованной лимфаденопатии, при снижении ОП в интервале 40-60% диагностируют стадию В - пре-СПИД, а при снижении ОП на 60% и более диагностируют стадию С - СПИД (Патент РФ №2251701 (прототип)).

Недостаток данного способа заключается в том, что диагностика стадий ВИЧ-инфекции представлена по международной классификации CDC (ru/wikipedia.org/wiki/ВИЧ-инфекция), где «пациенту диагностируют ВИЧ- инфекцию, либо терминальную стадию СПИД, лица, которые подпадают под критерии категорий A3, В3, С2 и С3 подлежат учету, как больные СПИД». Данная классификация создана в 1993 году, т.е. значительно устарела. По сравнению с Российской классификацией стадий ВИЧ-инфекции данная международная классификация лишена необходимой детализации патологического процесса, что весьма затрудняет ее применение в практическом здравоохранении. Имеет всего три стадии, а Российская - 5 с подразделами А, Б и В. Это позволяет врачу лучше ориентироваться в определении прогрессирования заболевания и оценки результатов лечения. Кроме того, способ требует дорогостоящих реактивов и аппаратуры.

При проведении анализа имеющейся научной и патентной информации не обнаружено сведений, относящихся к использованию данных по содержанию общего холестерина и триглицеридов сыворотки крови для разграничения стадий ВИЧ-инфекции.

При создании изобретения решалась задача расширения арсенала способов диагностики стадий ВИЧ-инфекции.

Техническим результатом предлагаемого способа является диагностика стадий ВИЧ-инфекции согласно Российской классификации с меньшими материальными затратами, упрощение, удешевление и более широкая доступность для мониторинга инфекционного процесса.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики стадий ВИЧ-инфекции, включающим исследования крови, определяют соотношение содержания общего холестерина (ОХ) к триглицеридам (ТГ) и при его цифровых значениях ниже 5,7, диагностируют третью стадию болезни, в пределах 6,5-8,5 - 4А стадию, в пределах 9,0-11,0 - 4Б стадию и более 11 - 4В стадию.

Новыми, ранее неизвестными признаками заявленного способа диагностики стадий ВИЧ-инфекции являются:

1. выбор простого, доступного объективного лабораторного теста для диагностики стадий ВИЧ-инфекции;

2. использование дешевого оборудования;

3. разработка установление предельных значений коэффициента (ОХ/ТГ) для пациентов с разными стадиями ВИЧ-инфекции;

4. установление цифровых значений коэффициента (ОХ/ТГ) для стадий ВИЧ-инфекции в соответствии с Российской классификацией.

Нами были исследованы показатели общего холестерина и триглицеридов плазмы или сыворотки крови с последующим определением коэффициента ОХ/ТГ у 50 больных в третьей, 30 больных в стадии 4А, 30 больных в стадии 4Б и 30 больных в стадии 4В ВИЧ-инфекции.

Было установлено, что у больных ВИЧ-инфекцией с третьей стадии болезни коэффициент ОХ/ТГ не превышает 5,7, со стадией 4А находится в пределах 6,5-8,5, со стадией 4Б находится в пределах 9,0-11,0 и со стадий 4В - более 11.

Предлагаемый СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИЙ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ осуществляют в следующей последовательности. Уровень холестерина и триглицеридов определяют унифицированным методом (http://studopedia.ru/13_95023_unifitsirovanniy-metod-opredeleniya-obshchego-holesterina-po-reaktsii-s-hlornim-zhelezom-metod-zlatkis-zaka.html) и определяют соотношение содержания общего холестерина к триглицеридам и при его цифровых значениях ниже 5,7, диагностируют третью стадию болезни, в пределах 6,5-8,5 - 4А стадию, в пределах 9,0-11,0 - 4Б стадию и более 11 - 4В стадию.

Определение общего холестерина по Ильку.

Ход определения: К 1,3 мл уксусной кислоты осторожно добавляют 0,05 мл плазмы или сыворотки крови без гемолиза, перемешивают, а затем добавляют 1 мл цветного реактива, хорошо перемешивают встряхиванием и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, после чего фотометрируют при длине волны 530 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостого опыта, в который берут 1,3 мл уксусной кислоты, 0,05 мл исследуемой сыворотки или плазмы и 1 мл концентрированной серной кислоты.

Для приготовления калибровочного графика вместо исследуемого материала берут 0,05-0,2 мл калибровочного раствора, к которому добавляют уксусную кислоту до суммарного объема 1,35 мл, а затем добавляют 1 мл цветного реактива. Проба, в которую взяли 0,05 мл калибровочного реактива по окраске соответствует опытной пробе с содержанием холестерина в исследуемом материале 3 ммоль/л; проба, в которую взяли 0,1 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина 6 ммоль/л и т.д. Расчет проводят по калибровочному графику.

Принцип метода: Содержащийся в плазме или сыворотке крови свободный и эфирносвязанный холестерин окисляется хлорным железом в присутствии уксусной, серной и фосфорной кислот с образованием ненасыщенных продуктов, окрашенных в красно-фиолетовый цвет. Фосфорная кислота повышает стойкость реактива, содержащего хлорное железо.

Унифицированный метод определения триглицеридов.

Ход определения: К 0,5 мл сыворотки или плазмы добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл изопропилового спирта и 1 мл 0,08Н серной кислоты, перемешивают и через 5 мин центрифугируют. Из верхнего (гептанового) слоя отбирают 0,4 мл, добавляют 2 мл изопропилового спирта и 1 каплю 6,25Н КОН. Перемешивают, нагревают на водяной бане 10 мин при 70°С. После охлаждения добавляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл ацетил ацетонового реактива, после перемешивания вновь нагревают 10 мин при 70°С. Развивается желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против холостой пробы, которую ставят так же, как и опытную, но вместо исследуемого материала берут 0,5 мл воды.

Калибровочную пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки или плазмы берут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл воды: развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы, в которую взята плазма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л.

Нормальные величины триглицеридов в плазме крови считают 0,55-1,65 ммоль/л (50-150 мг в 100 мл).

Принцип метода: триглицериды экстрагируются смесью гептана и изопропилового спирта, в которую переходят только неполярные липиды, а более полярные фосфолипиды остаются в водной фазе. Триглицериды омыляются (гидролизуются) щелочью, глицерин окисляется йодной кислотой до формальдегида, который определяется по цветной реакции с ацетил ацетоном.

Пример 1. Больной А., 28 лет, наблюдается в ГБУЗ Тверской области «Областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» с диагнозом: ВИЧ инфекция, стадия 3.

Уровень общего холестерина составил 3,5 ммоль/л, триглицеридов 0,74 ммоль/л. Коэффициент ОХ/ТГ=4,7.

Значение коэффициента ОХ/ТГ менее 5,7, что позволило диагностировать 3-ю стадию ВИЧ-инфекции.

Пример 2. Больной Б., 56 лет, наблюдается в ГБУЗ Тверской области «Областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» с диагнозом: ВИЧ инфекция, стадия 4А. Уровень общего холестерина составил 8,2 ммоль/л, триглицеридов 1,2 ммоль/л. Коэффициент ОХ/ТГ=6,8.

Значение коэффициента ОХ/ТГ находится в пределах менее 6,5-8,5, что позволило диагностировать 4А стадию ВИЧ-инфекции.

Пример 3. Больной И., 40 лет, наблюдается в ГБУЗ Тверской области «Областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» с диагнозом: ВИЧ инфекция, стадия 4Б.

Уровень общего холестерина составил 9,8 ммоль/л, триглицеридов 1,0 ммоль/л. Коэффициент ОХ/ТГ=9,8.

Значение коэффициента ОХ/ТГ находится в пределах 9-11, что позволило диагностировать 4Б стадию ВИЧ-инфекции.

Пример 4. Больной С, 38 лет, наблюдается в ГБУЗ Тверской области «Областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» с диагнозом: ВИЧ инфекция, стадия 4В.

Уровень общего холестерина составил 9,2 ммоль/л, триглицеридов 0,8 ммоль/л. Коэффициент ОХ/ТГ=11,5.

Значение коэффициента ОХ/ТГ больше 11,0, что позволило диагностировать 4В стадию ВИЧ-инфекции.

Использование заявленного способа диагностики стадий ВИЧ-инфекции позволяет врачу проводить мониторинг инфекционного процесса, определиться с вопросом необходимости или коррекции антиретровирусной терапии. Способ прост в исполнении, дешев, не требует дорогостоящего оборудования, дает прямой экономический эффект. В рамках обязательного медицинского страхования, может быть применен для пациентов в центральных районных больницах, а не только в областных СПИД центрах.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано для диагностики стадий ВИЧ-инфекции. В плазме или сыворотке крови определяют соотношение содержания общего холестерина к триглицеридам (ОХ/ТГ). При его цифровых значениях ниже 5,7 диагностируют третью стадию болезни, в пределах 6,5-8,5 - 4А стадию, в пределах 9,0-11,0 - 4Б стадию и более 11 - 4В стадию. Способ обеспечивает диагностику стадий ВИЧ-инфекции согласно Российской классификации с меньшими материальными затратами за счет упрощения, удешевления и более широкой доступности для мониторинга инфекционного процесса. 4 пр.

Способ диагностики стадий ВИЧ-инфекции, заключающийся в исследовании крови, отличающийся тем, что в плазме или сыворотке крови определяют соотношение содержания общего холестерина к триглицеридам (ОХ/ТГ) и при его цифровых значениях ниже 5,7 диагностируют третью стадию болезни, в пределах 6,5-8,5 - 4А стадию, в пределах 9,0-11,0 - 4Б стадию и более 11 - 4В стадию.