МЕТОДИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Российский патент 2019 года по МПК C12N5/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к среде для культивирования клеток, содержащей тирозин в концентрации по меньшей мере 3 мМ и поливиниловый спирт (PVA). Изобретение также относится к способу культивирования клеток с использованием среды для культивирования клеток, содержащей тирозин в концентрации по меньшей мере 3 мМ и поливиниловый спирт (PVA).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Белки становятся все более важными диагностическими и терапевтическими агентами. В большинстве случаев белки для коммерческого использования получают культивированием клеток, прошедших конструирование и/или отбор для получения необычно высоких уровней конкретного интересующего белка. Для успешного коммерческого получения белков важна оптимизация условий культивирования клеток, включая среды для культивирования клеток. Как и большинство аминокислот в средах для культивирования клеток, тирозин (Tyr) нужен для наращивания клеточной массы и получения антител или белков. Уменьшение количества тирозина в культуре-продуценте может привести к уменьшению роста клеток, снижению их жизнеспособности и/или белковой продуктивности. Ввиду усовершенствования методик культивирования клеток и потребности в методиках, обеспечивающих высокую плотность и высокий титр, среды для культивирования клеток должны содержать высокие концентрации аминокислот для обеспечения роста клеток и получения рекомбинантного полипептида. Тем не менее, растворимость тирозина в концентрации, желательной для максимального роста клеток или получения белка, ограничена, и он имеет тенденцию к осаждению из раствора во время хранения при низких температурах. Один способ избежания проблемы осаждения состоит в отдельном добавлении концентрированного раствора тирозина. Тем не менее, это приводит к усложнению методики, особенно в случае крупномасштабных производственных процессов. Кроме того, концентрированный раствор тирозина имеет высокий рН и будет приводить к изменениям рН во время его добавления.

Таким образом, существует потребность в разработке улучшенных сред для культивирования клеток с повышенной растворимостью тирозина для культивирования клеток млекопитающих в высокой плотности и для оптимального получения белков.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к среде для культивирования клеток, содержащей тирозин в концентрации по меньшей мере 3 мМ и поливиниловый спирт (PVA). В некоторых воплощениях концентрация тирозина составляет по меньшей мере 5 мМ. В некоторых воплощениях концентрация PVA составляет по меньшей мере 0,5 г/л. В некоторых воплощениях среда представляет собой среду, не содержащую сыворотку, и/или среду, не содержащую белок.

Изобретение также относится к способу культивирования клеток, включающему приведение клеток млекопитающего, предпочтительно клеток СНО, в контакт со средой для культивирования клеток, содержащей тирозин в концентрации по меньшей мере 3 мМ и поливиниловый спирт (PVA). В некоторых воплощениях культура клеток представляет собой подпитываемую культуру и среду для культивирования клеток по изобретению используют в качестве основной среды и/или подпитывающей среды. В некоторых воплощениях максимальная плотность жизнеспособных клеток при культивировании клеток составляет более 1×10⁶ клеток/мл. В некоторых воплощениях клетки экспрессируют рекомбинантный белок.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и средам для культивирования клеток и получения полипептидов. Настоящее изобретение относится к средам для культивирования клеток, содержащим высокие концентрации тирозина и поливинилового спирта (PVA).

В некоторых воплощениях концентрация тирозина в среде для культивирования клеток по изобретению составляет по меньшей мере 3 мМ, по меньшей мере 4 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 6 мМ, по меньшей мере 7 мМ, по меньшей мере 8 мМ, по меньшей мере 9 мМ или по меньшей мере 10 мМ. В некоторых воплощениях концентрация тирозина в среде для культивирования клеток по изобретению составляет по меньшей мере 4,5 мМ. В некоторых воплощениях концентрация тирозина в среде для культивирования клеток по изобретению составляет по меньшей мере 5 мМ. В некоторых воплощениях концентрация тирозина в среде для культивирования клеток по изобретению составляет по меньшей мере 6 мМ.

В некоторых воплощениях концентрация тирозина в среде для культивирования клеток по изобретению составляет от 3 мМ до 50 мМ.

В некоторых воплощениях концентрация тирозина в среде для культивирования клеток по изобретению составляет от 5 мМ до 20 мМ.

В некоторых воплощениях термин «тирозин» включает любую форму тирозина, подходящую для использования в качестве питательного вещества при культивировании клеток, предпочтительно при культивировании клеток животного, предпочтительно при культивировании клеток млекопитающего. В некоторых воплощениях тирозин представляет собой L-тирозин. В некоторых воплощениях тирозин представляет собой тирозин в форме свободного основания или соль тирозина. В некоторых воплощениях тирозин представляет собой соль тирозина, выбранную из двунатриевой соли или дигидрата двунатриевой соли. В предпочтительном воплощении тирозин представляет собой L-тирозин, двунатриевую соль L-тирозина или дигидрат двунатриевой соли L-тирозина.

PVA представляет собой полимер формулы [-СН₂СН(ОН)-]_n, где n представляет собой целое число и указывает на степень полимеризации. В некоторых воплощениях PVA, используемый в среде для культивирования клеток по изобретению, представляет собой полимер формулы [-СН₂СН(ОН)-]_n, где n представляет собой целое число, составляющее от 100 до 10000, от 300 до 8000 или от 500 до 5000. В некоторых воплощениях PVA, используемый в среде для культивирования клеток по изобретению, имеет степень гидролиза от приблизительно 85% до приблизительно 89%. В некоторых воплощениях PVA, используемый в среде для культивирования клеток по изобретению, имеет молекулярную массу от 10000 до 100000 Да. В некоторых воплощениях PVA, используемый в среде по изобретению, имеет молекулярную массу от 10000 до 50000 Да, предпочтительно от 13000 до 23000 Да. В некоторых воплощениях PVA, используемый в среде по изобретению, имеет вязкость от 1 до 10 сантипуаз (сП), предпочтительно от 3,0 до 4,5 сП. В качестве вязкости PVA указана вязкость 4%-го водного раствора поливинилового спирта при температуре 20°С.

В некоторых воплощениях PVA, используемый в среде для культивирования клеток по настоящему изобретению, представляет собой Selvol™ PVA 203 (Sekisui).

Специалист в данной области может легко определить концентрацию PVA, подходящую для предотвращения осаждения из среды для культивирования клеток, содержащей определенную концентрацию тирозина (по меньшей мере 3 мМ), например, с применением методики, сходной с раскрытой в Примере 1. В некоторых воплощениях концентрация PVA в среде для культивирования клеток по изобретению составляет по меньшей мере 0,5 г/л, по меньшей мере 1 г/л, по меньшей мере 2 г/л, по меньшей мере 3 г/л, по меньшей мере 4 г/л или по меньшей мере 5 г/л. В некоторых воплощениях концентрация PVA в среде для культивирования клеток по изобретению составляет 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 г/л. В некоторых воплощениях концентрация PVA в среде для культивирования клеток по изобретению составляет 2,5 г/л.

В некоторых воплощениях концентрация PVA в среде для культивирования клеток по изобретению составляет от 0,5 г/л до 5 г/л. В некоторых воплощениях концентрация PVA в среде для культивирования клеток по изобретению составляет от 1 г/л до 3 г/л.

В некоторых воплощениях среда для культивирования клеток по изобретению имеет мутность менее 5 NTU (нефелометрические единицы мутности) после 1, 2, 3 или 4 недель хранения при 4°С в отсутствие света. В некоторых воплощениях среда для культивирования клеток по изобретению имеет мутность менее 5 NTU после 2 недель хранения при 4°С в отсутствие света. В некоторых воплощениях мутность измеряют, как раскрыто в примерах. В некоторых воплощениях мутность измеряют с использованием турбидиметра 2100P (HACH).

В некоторых воплощениях среда для культивирования клеток по изобретению, где по существу не наблюдается осадка после 1, 2, 3 или 4 недель хранения при 4°С в отсутствие света. В некоторых воплощениях среда для культивирования клеток по изобретению, где по существу не наблюдается осадка после 2 недель хранения при 4°С в отсутствие света.

При использовании здесь термины «среда», «среда для культивирования клеток» и «культуральная среда» относятся к раствору, содержащему питательные вещества для растущих клеток млекопитающего. Обычно такие растворы обеспечивают незаменимые и заменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и микроэлементы, необходимые клеткам для минимального роста и/или выживания. В одном воплощении среда может содержать Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, цистин и/или Cys.

Такой раствор может также содержать дополнительные компоненты, усиливающие рост и/или выживание выше минимального уровня, включая, без ограничения, гормоны и/или другие факторы роста, определенные ионы (такие как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы (неорганические соединения, обычно присутствующие в очень низких конечных концентрациях), неорганические соединения, присутствующие в высоких конечных концентрациях (например, железо), аминокислоты, липиды и/или глюкозу или другой источник энергии. В некоторых воплощениях рН и концентрация солей в среде предпочтительно оптимизированы для выживания и пролиферации клеток. Например, рН среды может составлять приблизительно от 7,1 до 7,3, а конечная осмоляльность - от 1000 до 1300 мОсм.

В некоторых воплощениях среда представляет собой подпитывающую среду, добавляемую после начала культивирования клеток. В одном воплощении среда представляет собой среду, предпочтительно подпитывающую среду, содержащую от 4 до 10 мМ Ala, от 30 до 60 мМ Arg, от 50 до 90 мМ Asn, от 10 до 30 мМ Asp, от 2 до 40 мМ Glu, от 2 до 15 мМ Gly, от 8 до 20 мМ His, от 25 до 32 мМ Ile, от 35 до 60 мМ Leu, от 28 до 60 мМ Lys, от 9 до 25 мМ Met, от 10 до 30 мМ Phe, от 15 до 40 мМ Pro, от 44 до 80 мМ Ser, от 20 до 45 мМ Thr, от 2 до 10 мМ Trp и от 20 до 50 мМ Val.

Существует широкий спектр питательных сред для клеток млекопитающих, которые могут быть модифицированы для использования согласно настоящему изобретению корректировкой уровней тирозина и PVA. Например, среда по изобретению может быть получена модификацей количества тирозина и PVA в известных средах для культивирования клеток, таких как среды, раскрытые в WO 06026445, ЕР 2243827, WO 02066603 или WO 06050050.

В некоторых воплощениях среда представляет собой среду с определенным химическим составом, компоненты которой известны и контролируются. В некоторых воплощениях среда представляет собой сложную среду, где известны и/или контролируются не все компоненты среды.

За последние несколько десятков лет было много разработок и публикаций, посвященных питательным средам с определенным химическим составом для культивирования клеток млекопитающих. Все компоненты сред с определенным составом хорошо охарактеризованы, и, таким образом, среды с определенным составом не содержат сложных добавок, таких как сыворотка или гидролизаты. Сначала среды разрабатывались для обеспечения роста клеток и поддержания их жизнеспособности, без учета или при недостаточном учете продукции белка. В последнее время разработку сред проводят именно с целью поддержания высокой продуктивности в культурах клеток-продуцентов рекомбинантных белков. Такие среды предпочтительны для использования в способе по изобретению. Такие среды обычно содержат большое количество питательных веществ, в частности аминокислот, для поддержания роста и/или высокой плотности клеток. По необходимости, специалист в данной области может модифицировать эти среды для использования в способе по изобретению. Например, специалист может добавить PVA и увеличить количество тирозина в этих средах для их использования в качестве основных сред или подпитывающих сред в способе, раскрытом здесь.

Не все компоненты сложных сред хорошо охарактеризованы, и, таким образом, сложные среды могут содержать добавки, такие как простые и/или сложные источники углерода, простые и/или сложные источники азота и, среди прочего, сыворотку. В некоторых воплощениях сложные среды, подходящие для настоящего изобретения, содержат такие добавки, как гидролизаты, помимо других компонентов среды с определенным составом, описанных здесь.

В некоторых воплощениях среды с определенным составом обычно содержат примерно пятьдесят химических веществ в известных концентрациях в воде. Большинство из них также содержат один или более чем один хорошо охарактеризованный белок, такой как инсулин, инсулиноподобный фактор роста 1-го типа (IGF-1), трансферрин или бычий сывороточный альбумин (BSA), но для других необходимо отсутствие белковых компонентов, и поэтому их называют средами с определенным составом, не содержащими белок. Типичные химические компоненты сред можно отнести к одной из пяти широкий категорий: аминокислотам, витаминам, неорганическим солям, микроэлементам и категории прочих компонентов, не поддающихся четкой классификации.

Среда для культивирования клеток может, возможно, быть дополнена дополнительными компонентами. При использовании здесь термин «дополнительные компоненты» относится к компонентам, усиливающим рост и/или выживание выше минимального уровня, включая, без ограничения, гормоны и/или другие факторы роста, определенные ионы (такие как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы (неорганические соединения, обычно присутствующие в очень низких конечных концентрациях), аминокислоты, липиды и/или глюкозу или другой источник энергии. В некоторых воплощениях дополнительные компоненты могут быть добавлены в исходную культуру клеток. В некоторых воплощениях дополнительные компоненты могут быть добавлены после начала культивирования клеток.

Обычно микроэлементы относятся к множеству неорганических солей, присутствующих в микромолярных или еще более низких концентрациях. Например, в качестве микроэлементов обычно присутствуют цинк, селен, медь и другие. В некоторых воплощениях в качестве микроэлемента в исходной среде для культивирования клеток может присутствовать железо (соли двухвалентного или трехвалентного железа) в микромолярных концентрациях. Кроме того, в качестве микроэлемента часто присутствует марганец в форме двухвалентного катиона (MnCl₂ или MnSO₄) в наномолярных или микромолярных концентрациях. Множество менее распространенных микроэлементов обычно добавляют в наномолярных концентрациях.

В некоторых воплощениях среда по изобретению представляет собой среду, подходящую для поддержания высокой плотности жизнеспособных клеток, такой как, например, 1×10⁶ клеток/мл, 5×10⁶ клеток/мл, 1×10⁷ клеток/мл, 5×10⁷ клеток/мл, 1×10⁸ клеток/мл или 5×10⁸ клеток/мл, в культуре клеток. В некоторых воплощениях культура клеток представляет собой подпитываемую культуру клеток млекопитающего, предпочтительно подпитываемую культуру клеток СНО.

При использовании здесь термин «плотность жизнеспособных клеток» относится к числу клеток, присутствующих в заданном объеме среды. Плотность жизнеспособных клеток может быть измерена любым способом, известным специалисту в данной области. Предпочтительно, плотность жизнеспособных клеток измеряют с использованием автоматического счетчика клеток, такого как Bioprofile Flex®. При использовании здесь термин «максимальная плотность клеток» относится к максимальной плотности клеток, достигаемой во время культивирования клеток. При использовании здесь термин «жизнеспособность клеток» относится к способности клеток в культуре выживать при определенном наборе условий культивирования или их экспериментальных вариантах. Специалистам в данной области будет ясно, что данное изобретение включает множество способов определения жизнеспособности клеток. Например, для определения жизнеспособности клеток можно использовать краситель (например, трипановый синий), который не проходит через мембрану живой клетки, но может проходить через поврежденную мембрану погибшей или погибающей клетки.

Способы культивирования клеток

При использовании здесь термины «культура/культивирование» и «культура/культивирование клеток» относятся к популяции клеток, взвешенных в среде, в условиях, подходящих для выживания и/или роста этой популяции клеток. Как будет ясно специалистам в данной области, в некоторых воплощениях при использовании здесь эти термины относятся к комбинации, включающей популяцию клеток и среду, в которой взвешена эта популяция. В некоторых воплощениях клетки в культуре клеток представляют собой клетки млекопитающего.

Среда по изобретению может быть использована любым способом культивирования клеток, соответствующим желаемому процессу (например, получению рекомбинантного белка (например, антитела)). В качестве неограничивающего примера клетки можно выращивать в периодических или подпитываемых культурах, где культивирование прекращают после экспрессии достаточного количества рекомбинантного белка (например, антитела) и затем проводят сбор экспрессированного белка (например, антитела). Альтернативно, в качестве еще одного неограничивающего примера клетки можно выращивать с многократными подпитками, когда культивирование не прекращают и проводят периодическое или непрерывное добавление новых питательных веществ и других компонентов с периодическим или непрерывным сбором экспрессированного рекомбинантного белка (например, антитела). В данной области известны другие подходящие способы (например, культивирование в центрифужных пробирках), которые могут быть применены для практического осуществления настоящего изобретения.

В некоторых воплощениях культура клеток, подходящая для использования среды по изобретению, представляет собой подпитываемую культуру. При использовании здесь термин «подпитываемая культура» относится к способу культивирования клеток с добавлением в культуру дополнительных компонентов в один или несколько моментов времени после начала процесса культивирования. Такие добавляемые компоненты обычно включают питательные компоненты для клеток, содержание которых ранее уменьшилось в процессе культивирования. В определенный момент времени культивирование с подпиткой обычно прекращают, проводя сбор и, возможно, очистку клеток и/или их компонентов из среды. В некоторых воплощениях подпитываемая культура содержит основную среду, дополненную подпитывающей средой. Среда по изобретению может быть использована в качестве основной среды и/или в качестве подпитывающей среды.

Клетки можно выращивать в любом удобном объеме, выбранном практикующим специалистом. Например, клетки можно выращивать в небольших реакционных емкостях, объем которых варьирует от нескольких миллилитров до нескольких литров. Альтернативно, клетки можно выращивать в больших коммерческих биореакторах, объем которых составляет по меньшей мере приблизительно 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000, 15000, 20000 или 25000 литров или более, включая любые промежуточные объемы. В некоторых воплощениях объем среды для культивирования клеток составляет по меньшей мере 500 л. В некоторых воплощениях объем среды для культивирования клеток составляет по меньшей мере 5000 л.

Температуру культуры клеток будут выбирать, исходя, главным образом, из диапазона температур, при которых культура клеток остается жизнеспособной, и диапазона, позволяющего получить высокий уровень желаемого продукта (например, рекомбинантного белка). Обычно большинство клеток млекопитающих хорошо растут и позволяют получать желаемые продукты (например, рекомбинантные белки) в диапазоне приблизительно от 25°С до 42°С, однако способы по настоящему изобретению не ограничены этими температурами. Определенные клетки млекопитающих хорошо растут и позволяют получать желаемые продукты (например, рекомбинантные белки или антитела) в диапазоне приблизительно от 35°С до 40°С. В определенных воплощениях за время культивирования клеток культуру клеток выращивают один или несколько раз при температуре 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45°С. Специалисты в данной области смогут выбрать подходящую температуру или температуры для выращивания клеток, в зависимости от конкретных потребностей клеток и конкретных требований практикующего специалиста к получению продукта. Продолжительность выращивания клеток может быть любой, в зависимости от требований практикующего специалиста и потребностей самих клеток. В некоторых воплощениях клетки выращивают при температуре от 35°С до 40°С. В некоторых воплощениях клетки выращивают при 37°С. В некоторых воплощениях клетки выращивают при 36,5°С.

В некоторых воплощениях в начальной фазе роста (или фазе роста) клетки можно выращивать на протяжении большего или меньшего периода времени, в зависимости от требований практикующего специалиста и потребностей самих клеток. В некоторых воплощениях клетки выращивают на протяжении периода времени, достаточного для достижения предварительно заданной плотности клеток. В некоторых воплощениях клетки выращивают на протяжении периода времени, достаточного для достижения предварительно заданной плотности клеток, составляющей приблизительно 1×10⁶ клеток/мл, приблизительно 5×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1×10⁷ клеток/мл, приблизительно 5×10⁷ клеток/мл, приблизительно 1×10⁸ клеток/мл или приблизительно 5×10⁸ клеток/мл. В некоторых воплощениях клетки выращивают на протяжении периода времени, достаточного для достижения плотности клеток, составляющей определенный процент от максимальной плотности клеток, которой клетки в конечном счете достигли бы при самостоятельном росте без постороннего вмешательства. Например, клетки можно выращивать на протяжении периода времени, достаточного для достижения желаемой плотности жизнеспособных клеток, составляющей 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99 процентов от максимальной плотности клеток. В некоторых воплощениях клетки выращивают до снижения скорости роста плотности клеток до или ниже 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% за одни сутки культивирования. В некоторых воплощениях клетки выращивают до снижения скорости роста плотности клеток до или ниже 5% за сутки культивирования.

В некоторых воплощениях клеткам дают расти на протяжении определенного периода времени. Например, в зависимости от начальной концентрации культуры клеток, температуры выращивания клеток и собственной скорости роста клеток, их можно выращивать на протяжении 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 суток или более, предпочтительно на протяжении 4-10 суток. В некоторых случаях клеткам можно давать расти на протяжении месяца или более. Специалист, практически осуществляющий настоящее изобретение, сможет выбрать продолжительность начальной фазы роста в зависимости от требований по получению белка и потребностей самих клеток.

В начальной фазе культивирования культуру клеток можно перемешивать или покачивать для усиления оксигенации и проникновения питательных веществ в клетки. Применительно к настоящему изобретению, специалисту в данной области будет ясно, что может быть полезным контролировать или регулировать определенные внутренние условия биореактора в начальной фазе роста, включая, без ограничения, рН, температуру, оксигенацию и так далее.

В конце начальной фазы роста по меньшей мере одно из условий культивирования может быть изменено, что приводит ко второму набору условий культивирования и метаболическому сдвигу в культуре. Метаболический сдвиг может быть осуществлен, например, изменением температуры, рН, осмоляльности или уровня химического индуктора в культуре клеток. В одном неограничивающем воплощении условия культивирования изменяют, снижая температуру культуры. Тем не менее, как известно в данной области, изменение температуры не является единственным механизмом, позволяющим осуществить нужный метаболический сдвиг. Например, такой метаболический сдвиг может также быть осуществлен изменением других условий культивирования, включая, без ограничения, уровни рН, осмоляльности и бутирата натрия. Специалист, практически осуществляющий настоящее изобретение, будет определять время сдвига культуры, исходя из требований по получению белка или потребностей самих клеток.

При изменении температуры культуры, температуру можно менять относительно постепенно. Например, изменение температуры может занять несколько часов или суток. Альтернативно, температуру можно менять относительно резко. Например, температуру можно изменить менее чем за несколько часов. При наличии подходящего производственного и контрольного оборудования, стандартного для крупномасштабного коммерческого получения полипептидов или белков, изменение температуры может быть проведено менее чем за один час.

В некоторых воплощениях после изменения условий культивирования клеток, обсуждаемого выше, культуру поддерживают на протяжении последующей фазы образования продукта, применяя второй набор условий культивирования, обеспечивающий выживание и жизнеспособность культуры клеток и подходящий для экспрессии желаемого полипептида или белка на коммерчески адекватных уровнях.

Как обсуждено выше, сдвиг культуры может быть осуществлен изменением одного или более чем одного из ряда условий культивирования, включая, без ограничения, уровни температуры, рН, осмоляльности и бутирата натрия. В некоторых воплощениях изменяют температуру культуры. Согласно этому воплощению в последующей фазе образования продукта культуру поддерживают при температуре или в диапазоне температур, ниже температуры или диапазона температур в начальной фазе роста. Как обсуждено выше, для повышения плотности или жизнеспособности клеток или для усиления экспрессии рекомбинантного белка могут быть применены несколько отдельных изменений температуры.

В некоторых воплощениях клетки можно поддерживать в последующей фазе образования продукта до достижения желаемой плотности клеток или титра продукта. В еще одном воплощении настоящего изобретения в последующей фазе образования продукта клеткам дают расти на протяжении определенного периода времени. Например, в зависимости от концентрации культуры клеток в начале последующей фазы роста, температуры выращивания клеток и собственной скорости роста клеток, их можно выращивать на протяжении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 суток или более. В некоторых случаях клеткам можно давать расти на протяжении месяца или более. Специалист, практически осуществляющий настоящее изобретение, сможет выбрать продолжительность последующей фазы образования продукта в зависимости от требований по получению полипептида или белка и потребностей самих клеток.

В последующей фазе образования продукта культуру клеток можно перемешивать или покачивать для усиления оксигенации и проникновения питательных веществ в клетки. Применительно к настоящему изобретению, специалисту в данной области будет ясно, что может быть полезным контролировать или регулировать определенные внутренние условия биореактора в последующей фазе роста, включая, без ограничения, рН, температуру, оксигенацию и так далее.

В некоторых воплощениях клетки экспрессируют рекомбинантный белок, и способ культивирования клеток по изобретению включает фазу роста и фазу образования продукта.

Клетки

Согласно настоящему изобретению могут быть использованы любые клетки млекопитающих, поддающиеся культивированию. Неограничивающие примеры клеток млекопитающих, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению, включают линию миеломы мышей BALB/c (NSO/1, ЕСАСС No: 85110503); человеческие ретинобласты (PER.C6, CruCell, Лейден, Нидерланды); линию почки обезьяны CV1, трансформированную SV40 (COS-7, АТСС CRL1651); линию эмбриональной почки человека (клетки 293 или 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977); клетки почки новорожденного хомячка (ВНК, ATCCCCL10); клетки яичника китайского хомячка плюс/минус DHFR (СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); клетки почки обезьяны (CV1, АТСС CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТСС CRL-1 587); клетки рака шейки матки человека (HeLa, АТСС CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клетки легкого человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL 51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); клетки MRC 5; клетки FS4; и линию клеток гепатомы человека (Hep G2). В некоторых предпочтительных воплощениях клетки представляют собой клетки СНО. В некоторых предпочтительных воплощениях клетки представляют собой клетки GS-CHO.

Кроме того, согласно настоящему изобретению может быть использовано любое число гибридомных клеточных линий, имеющихся в продаже и доступных из некоммерческих источников. При использовании здесь термин «гибридома» относится к клетке или потомству клетки, являющейся результатом слияния иммортализованной клетки и клетки-продуцента антител. В результате, такая гибридома представляет собой иммортализованную клетку, продуцирующую антитела. Отдельные клетки, используемые для получения гибридомы, могут иметь происхождение от любого млекопитающего, включая, без ограничения, крысу, свинью, кролика, овцу, свинью, козу и человека. В некоторых воплощениях гибридома представляет собой линию клеток «триомы» («trioma»), получаемой при слиянии плазматических клеток с потомством миеломных гетерогибридов, являющихся продуктом слияния человеческих клеток с линией клеток миеломы мыши. В некоторых воплощениях гибридома представляет собой любую линию иммортализованных гибридных клеток, продуцирующих антитела, такую как, например, «квадрома» («quadroma») (см., например, Milstein et al., Nature, 537:3053, 1983). Специалисту в данной области будет ясно, что линии гибридомных клеток могут иметь разные потребности в питательных веществах и/или могут требовать разных условий культивирования для оптимального роста, и он сможет, по необходимости, изменять эти условия.

Экспрессия белков

Как указано выше, во многих случаях клетки будут проходить отбор или конструирование для получения высоких уровней желаемых продуктов (например, рекомбинантного белка или антитела). Часто клетки будут проходить манипуляции, проводимые «рукой человека», для получения высоких уровней рекомбинантного белка, например, посредством введения гена, кодирующего интересующий белок, и/или введением генетических контрольных элементов, регулирующих экспрессию такого гена (эндогенного или введенного).

Определенные белки могут оказывать отрицательные эффекты на рост клеток, жизнеспособность клеток или некоторые другие характеристики клеток, что, в конечном счете, тем или иным образом ограничивает продукцию интересующего белка. Даже популяция клеток одного определенного типа, конструированных для экспрессии определенного белка, вариабельна в том смысле, что определенные отдельные клетки будут расти лучше, продуцировать больше интересующего белка или продуцировать белок с более высокими уровнями активности (например, ферментативной активности). В определенных воплощениях практикующий специалист эмпирически выбирает линию клеток для быстрого роста в определенных условиях, выбранных для культивирования клеток. В некоторых воплощениях отдельные клетки, конструированные для экспрессии определенного белка, выбраны для его крупномасштабного получения, исходя из роста клеток, конечной плотности клеток, процента жизнеспособности клеток, титра экспрессируемого белка или любой комбинации этих или любых других условий, важных с точки зрения практикующего специалиста.

Согласно настоящему изобретению можно получать любой белок, поддающийся экспрессии в клетке-хозяине. При использовании здесь термин «клетка-хозяин» относится к клетке, с которой проводят манипуляции по настоящему изобретению для получения интересующего белка, как описано здесь. Белок может быть экспрессирован с гена, являющегося эндогенным для клетки, или с гетерологичного гена, вводимого в клетку. Белок может представлять собой белок, встречающийся в природе, или может, альтернативно, иметь последовательность, конструированную или выбранную «рукой человека».

Выбор белков, которые могут желательным образом быть экспрессированы согласно настоящему изобретению, будет часто основан на интересной или полезной биологической или химической активности. Например, настоящее изобретение может быть применено для экспрессии любого фермента, рецептора, антитела, гормона, регуляторного фактора, антигена, связывающего агента и так далее, имеющего фармацевтическое или коммерческое значение. В некоторых воплощениях белок, экспрессированный клетками в культуре, выбран из антител или их фрагментов, нанотел, однодоменных антител, гликопротеинов, терапевтических белков, факторов роста, факторов свертывания крови, цитокинов, слитых белков, фармацевтических лекарственных веществ, вакцин, ферментов или малых модульных иммунофармацевтических средств (Small Modular ImmunoPharmaceuticals™, SMIP). Специалисту в данной области будет ясно, что согласно настоящему изобретению может быть экспрессирован любой белок, и он сможет выбрать конкретный белок, подлежащий получению, исходя из своих конкретных потребностей.

Антитела

Ввиду большого числа антител, используемых или исследуемых в настоящее время в качестве фармацевтических или иных коммерческих агентов, получение антител согласно настоящему изобретению представляет особый интерес. Антитела представляют собой белки, обладающие способностью связываться с определенным антигеном. Согласно настоящему изобретению можно получать любое антитело, поддающееся экспрессии в клетке-хозяине. В некоторых воплощениях антитело, подлежащее экспрессии, представляет собой моноклональное антитело.

В некоторых воплощениях моноклональное антитело представляет собой химерное антитело. Химерное антитело содержит аминокислотные фрагменты, имеющие происхождение более чем от одного организма. Молекулы химерных антител могут содержать, например, антигенсвязывающий домен антитела мыши, крысы или другого вида с человеческими константными областями. Описано множество способов получения химерных антител. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., патент США №4816567; Boss et al., патент США №4816397; Tanaguchi et al., публикация европейского патента ЕР 171496; публикация европейского патента 0173494, патент Великобритании GB 2177096 В.

В некоторых воплощениях моноклональное антитело представляет собой человеческое антитело, полученное, например, с использованием библиотек для рибосомного дисплея или фагового дисплея (см., например, Winter et al., патент США №6291159, и Kawasaki, патент США №5658754) или с применением ксенотрансплантации, когда гены нативных антител инактивированы и функционально заменены генами человеческого антитела с сохранением интактности других компонентов нативной иммунной системы (см., например, Kucherlapati et al., патент США №6657103).

В некоторых воплощениях моноклональное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Гуманизированное антитело представляет собой химерное антитело, где подавляющее большинство аминокислотных остатков имеют происхождение от человеческих антител, что минимизирует любые возможные иммунные реакции при введении субъекту-человеку. В гуманизированных антителах аминокислотные остатки гипервариабельных участков заменены, по меньшей мере частично, остатками от вида, не являющегося человеком, придающими специфичность или аффинность в отношении желаемого антигена. Такие измененные молекулы иммуноглобулинов могут быть получены любыми из некоторых методик, известных в данной области (например, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., I mMunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol, 92, 3-16 (1982)), и, предпочтительно, их получают согласно РСТ-публикации WO 92/06193 или ЕР 0239400, включенным сюда посредством ссылки. Гуманизированные антитела могут быть получены из коммерческих источников, например, Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain. См. также Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2:593-596 (1992), включенные сюда посредством ссылки.

В некоторых воплощениях моноклональные, химерные или гуманизированные антитела, описанные выше, могут содержать аминокислотные остатки, не встречающиеся естественным образом ни в одном антителе ни у одного вида в природе. Эти неестественные остатки могут быть использованы, например, для придания моноклональному, химерному или гуманизированному антителу новой или измененной специфичности, аффинности или эффекторной функции. В некоторых воплощениях антитела, описанные выше, могут быть конъюгированы с лекарственными средствами для системной фармакотерапии, такими как токсины, низкомолекулярные цитотоксические лекарственные средства, модификаторы биологического ответа и радионуклиды (см., например, Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates, US 20040082764 A1).

Обычно специалисты, практически осуществляющие настоящее изобретение, будут выбирать интересующий белок и будут знать его точную аминокислотную последовательность. Любой белок, подлежащий экспрессии согласно настоящему изобретению, может обладать собственными индивидуальными характеристиками и может влиять на плотность клеток или жизнеспособность культивируемых клеток, может приводить к меньшим уровням экспрессии, чем другой белок при идентичных условиях культивирования, и может иметь разную биологическую активность в зависимости от конкретных условий культивирования и проводимых стадий. Специалист в данной области сможет подходящим образом модифицировать стадии и композиции, используемые для получения определенного белка согласно настоящему изобретению, в целях оптимизации роста клеток и продукции и/или уровня активности любого экспрессируемого белка.

Введение генов для экспрессии белков в клетки-хозяева

Обычно молекула нуклеиновой кислоты, вводимая в клетку, кодирует желаемый белок, подлежащий экспрессии согласно настоящему изобретению. Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты может кодировать продукт гена, индуцирующий экспрессию желаемого белка клеткой. Например, вводимый генетический материал может кодировать транскрипционный фактор, активирующий транскрипцию эндогенного или гетерологичного белка. Альтернативно или дополнительно, вводимая молекула нуклеиновой кислоты может усиливать трансляцию или повышать стабильность белка, экспрессируемого клеткой.

Способы, подходящие для введения нуклеиновых кислот, достаточных для достижения экспрессии интересующего белка, в клетки-хозяева, являющиеся клетками млекопитающих, известны в данной области. См., например, Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson et al., EP 117060; и ЕР 117058, включенные сюда посредством ссылки. Для клеток млекопитающих обычные способы введения генетического материала в клетки включают метод преципитации с фосфатом кальция по Грэхему и ван дер Эрбу {Virology, 52:456-457, 1978) или метод с использованием липофектамина™ (Gibco BRL) по Хоули-Нэльсону (Hawley-Nelson) {Focus 15:73, 1993). Общие аспекты трансформации в системах с клетками-хозяевами, представляющими собой клетки млекопитающих, описаны Axel в патенте США №4399216 от 16 августа 1983 г. См. различные методики введения генетического материала в клетки млекопитающих в Keown et al., Methods in Enzymology, 1989, Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990, и Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, подлежащая введению, имеет форму выделенной молекулы нуклеиновой кислоты. Например, молекула нуклеиновой кислоты, вводимая в клетку, может состоять только из нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, и необходимых генетических контрольных элементов. Альтернативно, нуклеиновая кислота, кодирующая белок (включая необходимые регуляторные элементы), может быть включена в плазмидный вектор. Неограничивающие типичные примеры подходящих векторов для экспрессии белков в клетках млекопитающих включают pCDNA1; pCD, см. Okayama, et al. Mol. Cell Biol. 5:1136-1142, 1985; pMClneo Poly-A, см. Thomas, et al. Cell 51:503-512, 1987; бакуловирусный вектор, такой как рАС 373 или рАС 610; CDM8, см. Seed, В. Nature 329:840, 1987; и рМТ2РС, см. Kaufman, et al. EMBO J. 6:187-195, 1987, включенные сюда посредством ссылки. В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты, подлежащая введению в клетку, включена в вирусный вектор. Например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, может быть введена в вирусный геном (или частичный вирусный геном). Регуляторные элементы, управляющие экспрессией белка, могут быть включены в нуклеиновую кислоту, введенную в вирусный геном (то есть, они могут быть связаны с геном, введенным в вирусный геном), или могут быть обеспечены самим вирусным геномом.

Выделенная ДНК может быть введена в клетки посредством получения преципитата, содержащего ДНК и фосфат кальция. Альтернативно, выделенная ДНК может также быть введена в клетки посредством получения смеси ДНК и DEAE-декстрана и инкубации этой смеси с клетками или посредством инкубации клеток и ДНК вместе с подходящим буфером и воздействия на клетки электрическим импульсом высокого напряжения (например, электропорацией). Другой способ введения выделенной ДНК в клетки состоит в смешивании ДНК с суспензией липосом, содержащих катионные липиды. Затем комплекс «ДНК/липосомы» инкубируют с клетками. Выделенная ДНК может также быть введена в клетки напрямую, например, микроинъекцией.

Альтернативно, выделенная ДНК может также быть введена в клетки посредством образования комплекса ДНК с катионом, таким как полилизин, связанным с лигандом рецептора клеточной поверхности (см., например, Wu, G. and Wu, С.Н. J. Biol. Chem. 263:14621, 1988; Wilson et al. J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; и патент США №5166320, полностью включенные сюда посредством ссылки). Связывание комплекса «ДНК-лиганд» с рецептором приводит к проникновению ДНК в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Использование вирусных векторов, содержащих определенные последовательности нуклеиновых кислот, например, кДНК, кодирующую белок, является распространенным способом введения последовательностей нуклеиновых кислот в клетку. Инфицирование клеток вирусным вектором обладает тем преимуществом, что нуклеиновая кислота проникает в большинство клеток, и это позволяет избавиться от необходимости проводить отбор клеток, содержащих нуклеиновую кислоту. Кроме того, молекулы, кодируемые вирусным вектором, например, кДНК, включенной в вирусный вектор, обычно эффективно экспрессируются в клетках, в которые проникла нуклеиновая кислота вирусного вектора.

Хорошо охарактеризовано применение дефектных ретровирусов при переносе генов в целях генной терапии (см. обзор Miller, A.D. Blood 76:271, 1990). Может быть сконструирован рекомбинантный ретровирус, имеющий нуклеиновую кислоту, кодирующую интересующий белок, введенную в ретровирусный геном. Кроме того, некоторые части ретровирусного генома могут быть удалены для обеспечения дефекта репликации ретровируса. Затем происходит упаковка такого дефектного по репликации ретровируса в вирионы, которые могут быть использованы для инфицирования клетки-мишени с применением стандартных методик с вирусом-помощником.

Возможны манипуляции с геномом аденовируса, приводящие к тому, что он будет кодировать и экспрессировать интересующий белок, но будет инактивирован применительно к его способности к репликации в виде нормального литического вирусного жизненного цикла. См., например, Berkner et al. BioTechniques 6:616, 1988; Rosenfeld et al. Science 252:431-434, 1991; и Rosenfeld et al. Cell 68:143-155, 1992. Подходящие аденовирусные векторы, имеющие происхождение от аденовирусного штамма Ad типа 5 dl324 или других штаммов аденовирусов (например, Ad2, Ad3, Ad7 и так далее) известны специалистам в данной области. Рекомбинантные аденовирусы предпочтительны в том смысле, что они не требуют деления клеток для эффективной доставки генов и могут быть использованы для инфицирования широкого спектра типов клеток, включая эпителий дыхательных путей (Rosenfeld et al., 1992, процитированная выше), эндотелиальные клетки (Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486, 1992), гепатоциты (Herz and Gerard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816, 1993) и мышечные клетки (Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584, 1992). Кроме того, введенная аденовирусная ДНК (и включенная в нее сторонняя ДНК) не интегрируется в геном клетки-хозяина, а остается эписомной, что позволяет избежать возможных проблем, которые могут возникать в результате инсерционного мутагенеза в тех ситуациях, когда происходит интеграция ДНК в геном хозяина (например, в случае ретровирусной ДНК). Кроме того, аденовирусный геном обладает большой емкостью для переноса сторонней ДНК (до 8 тысяч пар оснований), в сравнении с другими векторами для доставки генов (Berkner et al. процитированная выше; Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57:267, 1986). У большинства аденовирусных векторов с дефектной репликацией, используемых в настоящее время, вирусные гены Е1 и Е3 полностью или частично удалены, но сохранено до 80% аденовирусного генетического материала

Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой встречающийся в природе дефектный вирус, для эффективной репликации и продуктивного жизненного цикла которого необходим другой вирус, такой как аденовирус или герпесвирус, в качестве вируса-помощника. (См. обзор Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro, and Immunol, 158:97-129, 1992.) Он также является одним из немногих вирусов, которые могут интегрировать свою ДНК в неделящиеся клетки, и демонстрирует высокую частоту стабильной интеграции (см., например, Flotte et al, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356, 1992; Samulski et al, J. Virol. 63:3822-3828, 1989; и McLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973, 1989). Возможна упаковка и интеграция векторов, содержащих всего 300 пар оснований AAV. Пространство для сторонней ДНК ограничено приблизительно 4,5 т.п.о. (тысячи пар оснований). Для введения ДНК в клетки может быть использован такой AAV-вектор, как описан в Tratschin etal (Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, 1985). AAV-векторы были использованы для введения множества нуклеиновых кислот в клетки различных типов (см., например, Hermonat et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470, 1984; Tratschin et al., Mol. Cell Biol. 4:2072-2081, 1985; Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39, 1988; Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619, 1984; и Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1993).

В тех случаях, когда способ, применяемый для введения молекул нуклеиновых кислот в популяцию клеток, приводит к модификации большинства клеток и эффективной экспрессии белка этими клетками, модифицированную популяцию клеток можно использовать без дополнительного выделения или субклонирования отдельных клеток популяции. То есть, продукция белка популяцией клеток может быть достаточной для того, чтобы в дополнительном выделении клеток не было необходимости популяцию можно было сразу использовать для засева культуры клеток, предназначенной для получения белка. Альтернативно, может быть желательным выделить и размножить однородную популяцию клеток из нескольких клеток или одной клетки, эффективно продуцирующих (продуцирующей) белок.

В качестве альтернативы введению молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий белок, в клетку, вводимая нуклеиновая кислота может кодировать другой полипептид или белок, индуцирующий или повышающий уровень экспрессии белка, продуцируемого клеткой эндогенно. Например, клетка может быть способна экспрессировать определенный белок, но может не проявлять эту способность без дополнительной обработки клетки. Сходным образом, клетка может экспрессировать белок в количестве, не достаточном для желаемой цели. Поэтому для индукции или повышения экспрессии интересующего белка клеткой можно использовать агент, стимулирующий экспрессию этого белка. Например, вводимая молекула нуклеиновой кислоты может кодировать транскрипционный фактор, приводящий к активации или повышающей регуляции транскрипции интересующего белка. Экспрессия такого транскрипционного фактора, в свою очередь, приводит к экспрессии или усилению экспрессии интересующего белка.

В определенных воплощениях проводят стабильное введение нуклеиновой кислоты, управляющей экспрессией белка, в клетку-хозяина. В определенных воплощениях проводят транзиторное введение нуклеиновой кислоты, управляющей экспрессией белка, в клетку-хозяина. Специалист в данной области сможет выбрать нужный вариант введения нуклеиновой кислоты в клетку (стабильное или транзиторное), исходя из своих экспериментальных потребностей.

Возможно, ген, кодирующий интересующий белок, может быть связан с одним или более чем одним регуляторным генетическим контрольным элементом. В определенных воплощениях генетический контрольный элемент управляет конститутивной экспрессией белка. В определенных воплощениях может быть использован генетический контрольный элемент, обеспечивающий индуцируемую экспрессию гена, кодирующего интересующий белок. Использование индуцируемого генетического контрольного элемента (например, индуцируемого промотора) позволяет модулировать продукцию белка клеткой. Неограничивающие примеры потенциально полезных индуцируемых генетических контрольных элементов для использования в эукариотических клетках включают элементы, регулируемые гормонами (например, см. Mader, S. and White, J.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607, 1993), элементы, регулируемые синтетическими лигандами (см., например, Spencer, D.M. et al., Science 262:1019-1024, 1993), и элементы, регулируемые ионизирующим излучением (например, см. Manome, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10149-10153, 1992). Согласно изобретению могут быть использованы дополнительные клеточно-специфичные или другие регуляторные системы, известные в данной области.

Специалист в данной области сможет выбрать и, возможно, подходящим образом модифицировать способ введения генов, приводящий к экспрессии интересующего белка клеткой, согласно настоящему изобретению.

Выделение экспрессированного белка

В целом, обычно будет желательным проводить выделение и/или очистку белков, экспрессированных согласно настоящему изобретению. В определенных воплощениях экспрессированный белок секретирован в среду, и поэтому в качестве первой стадии очистки может быть проведено удаление клеток и других твердых частиц, например, центрифугированием или фильтрацией.

Альтернативно, экспрессированный белок может быть связан с поверхностью клетки-хозяина. В качестве первой стадии очистки могут быть проведены, например, удаление среды и лизис клеток-хозяев, экспрессирующих белок. Лизис клеток-хозяев, являющихся клетками млекопитающих, может быть осуществлен любым числом способов, хорошо известных специалистам в данной области, включая физическое разрушение стеклянными гранулами и воздействие высокого рН.

Экспрессированный белок может быть выделен и очищен стандартными способами, включая, без ограничения, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, эксклюзионную и гидроксиапатитовую хроматографию), гель-фильтрацию, центрифугирование или дифференциальную растворимость, осаждение этанолом и/или любую другую доступную методику очистки белков (см., например, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; и Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol.182), Academic Press, 1997, включенные сюда посредством ссылки). В частности, при иммуноаффинной хроматографии белок может быть выделен посредством его связывания с аффинной колонкой, содержащей антитела, полученные против этого белка и иммобилизованные на неподвижной подложке. Альтернативно, с применением стандартных рекомбинантных методик к белку могут быть присоединены аффинные метки, такие как последовательность оболочки вируса гриппа, полигистидин или глутатион-8-трансфераза для облегчения очистки при прохождении через подходящую аффинную колонку. На любой или на всех стадиях могут быть добавлены ингибиторы протеаз, такие как фенилметилсульфонилфторид (PMSF), леупептин, пепстатин или апротинин, для уменьшения или предотвращения распада белка в процессе очистки. Ингибиторы протеаз особенно полезны, когда клетки необходимо лизировать для выделения и очистки экспрессированного белка.

Специалисту в данной области будет ясно, что конкретная методика очистки будет варьировать в зависимости от свойств белка, подлежащего очистке, свойств клеток, экспрессирующих этот белок, и/или состава среды, в которой выращены эти клетки.

Фармацевтические композиции

В определенных воплощениях изобретения полученные полипептиды или белки будут обладать фармакологической активностью и будут полезны при изготовлении фармацевтических средств. Такой полученный полипептид или белок может быть введен субъекту или может сначала быть включен в композицию для доставки любым доступным способом введения, включая, без ограничения, парентеральный (например, внутривенный), внутрикожный, подкожный, пероральный, назальный, бронхиальный, глазной, чрескожный (местный), трансмукозальный, ректальный и вагинальный способ введения. Фармацевтические композиции обычно содержат очищенный полипептид или белок, экспрессированный линией клеток млекопитающего, агент для доставки (то есть, катионный полимер, пептидный молекулярный переносчик, поверхностно-активное вещество и так далее, как описано выше) в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. При использовании здесь фраза «фармацевтически приемлемый носитель» включает растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, задерживающие всасывание, и тому подобное, совместимые с фармацевтическим введением. В композиции могут также быть включены дополнительные активные соединения.

Фармацевтическую композицию изготавливают совместимой с предполагаемым путем ее введения. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут содержать следующие компоненты: стерильный растворитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для коррекции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно корректировать кислотами или основаниями, такими как соляная кислота или гидроксид натрия. Препарат для парентерального применения может быть помещен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы, изготовленные из стекла или пластика.

Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, обычно содержат стерильные водные растворы (если препарат растворим в воде) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций непосредственно перед введением. Носители, подходящие для внутривенного введения, включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). В любом случае, композиция должна быть стерильной и достаточно жидкой, чтобы ее можно было легко ввести шприцем. Предпочтительные фармацевтические композиции стабильны в условиях их изготовления и хранения и должны быть защищены от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Обычно соответствующий носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол, (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, используя покрытие, такое как лецитин, поддерживая необходимый размер частиц в случае дисперсии и используя поверхностно-активные вещества. Действие микроорганизмов можно предотвращать, используя различные антибактериальные и противогрибковые агенты, например, парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту, тимеросал и тому подобное. Во многих случаях предпочтительно включение в композицию изотонических агентов, таких как, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Продолжительное всасывание композиций для инъекций может быть обеспечено включением в композицию агента, задерживающего всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные растворы для инъекций могут быть получены включением очищенного полипептида или белка в необходимом количестве в подходящий растворитель, по необходимости с одним из или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизующей фильтрацией. Обычно дисперсии получают включением очищенного полипептида или белка, экспрессированного линией клеток млекопитающего, в стерильный наполнитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофильная сушка, приводящие к получению порошка активного ингредиента и любого дополнительного желаемого ингредиента из их растворов, предварительно простерилизованных фильтрацией.

Композиции для перорального приема обычно содержат инертный разбавитель или съедобный носитель. В целях перорального терапевтического приема очищенный полипептид или белок может быть смешан с эксципиентами и использован в форме таблеток, пастилок или капсул, например, желатиновых капсул. Композиции для перорального приема могут также быть изготовлены с использованием жидкого носителя для применения в качестве жидкости для полоскания рта. Как часть композиции могут быть включены фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъювантные вещества. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и тому подобное могут содержать любые из следующих ингредиентов или соединения со сходными свойствами: связывающий агент, такой как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза; разрыхлитель, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающий агент, такой как стеарат магния или Sterotes; скользящий агент, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или корригент, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый корригент. Композиции для пероральной доставки могут предпочтительно содержать агенты для повышения стабильности в желудочно-кишечном тракте и/или усиления всасывания.

Для ингаляционного введения доставку композиций по изобретению, содержащих очищенный полипептид или белок, экспрессированный линией клеток млекопитающего, и агент для доставки, предпочтительно осуществляют в форме аэрозольного спрея из контейнера или дозатора под давлением, содержащего подходящий вытеснитель, например, газ, такой как диоксид углерода, или из небулайзера. В частности, настоящее изобретение предполагает доставку композиций с использованием назального спрея, ингалятора или другую прямую доставку в верхние и/или нижние дыхательные пути. Было показано, что интраназальная доставка ДНК-вакцин, направленных против вирусов гриппа индуцирует CD8 Т-клеточные ответы, демонстрируя возможность проникновения ДНК по меньшей мере в некоторые клетки дыхательной системы при таком пути доставки, а агенты для доставки по изобретению будут усиливать проникновение ДНК в клетки. Согласно определенным воплощениям изобретения композиции, содержащие очищенный полипептид, экспрессированный линией клеток млекопитающего, и агент для доставки, изготавливают в форме крупных пористых частиц для аэрозольного введения.

Системное введение может также быть проведено трансмукозально или чрескожно. Для трансмукозального или чрескожного введения в композиции используют вещества, обеспечивающие проникновение через соответствующий барьер. Такие вещества, обеспечивающие проникновение, общеизвестны в данной области и включают, например, для трансмукозального введения, детергенты, соли желчных кислот и производные фузидиевой кислоты. Трансмукозальное введение может быть осуществлено с использованием назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения очищенный полипептид или белок и агенты для доставки включают в мази, бальзамы, гели или кремы, общеизвестные в данной области.

Композиции могут также быть изготовлены в форме суппозиториев (например, с обычными суппозиторными основами, такими как масло какао и другие триглицериды) или ретенционных клизм для ректальной доставки.

В некоторых воплощениях изготавливают композиции с носителями, которые будут защищать полипептид или белок от быстрого выведения из организма, такие как композиция с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы изготовления таких композиций будут очевидны специалистам в данной области. Указанные вещества могут также быть приобретены у Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. В качестве фармацевтически приемлемых носителей могут также быть использованы суспензии липосом (включая липосомы с моноклональными антителами к вирусным антигенам, направленно действующие на инфицированные клетки). Они могут быть получены способами, известными специалистам в данной области, например, как описано в патенте США №4522811.

Для простоты введения и единообразия доз предпочтительно изготавливать композиции для перорального или парентерального применения в единичной дозированной форме. При использовании здесь единичная дозированная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим для использования в качестве единичных доз у субъекта, для которого предназначено лечение, где каждая единица содержит предопределенное количество активного полипептида или белка, рассчитанное для оказания желаемого терапевтического эффекта, вместе с необходимым фармацевтическим носителем.

По необходимости, полипептид или белок, экспрессированный согласно настоящему изобретению, можно вводить через различные интервалы и на протяжении различных периодов времени, например, один раз в неделю на протяжении приблизительно 1-10 недель, 2-8 недель, 3-7 недель, приблизительно 4, 5 или 6 недель и так далее. Специалисту в данной области будет ясно, что на дозу и время, необходимые для эффективного лечения субъекта, могут влиять определенные факторы, включая, без ограничения, тяжесть заболевания или расстройства, предшествующее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и наличие других заболеваний. Обычно введение полипептида или белка субъекту, как описано здесь, может включать однократное введение или, во многих случаях, может включать серию введений. Кроме того, следует понимать, что подходящие дозы могут зависеть от активности полипептида или белка и могут, возможно, быть скорректированы для конкретного реципиента, например, посредством введения возрастающих доз до достижения предварительно выбранного желаемого ответа. Следует понимать, что конкретный уровень дозы для любого конкретного субъекта-животного может зависеть от множества факторов, включая активность конкретного используемого полипептида или белка, возраст, массу тела, общее состояние, пол и питание субъекта, время введения, путь введения, скорость выведения, любые комбинации лекарственных средств и степень выраженности или активность, которые следует модулировать.

Настоящее изобретение включает применение композиций для лечения животных, не являющихся людьми. Соответственно, дозы и способы введения могут выбраны, исходя из известных принципов ветеринарной фармакологии и медицины. Например, см. руководство Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8^th edition, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001.

Фармацевтические композиции могут быть помещены в контейнер, упаковку или дозатор вместе с инструкциями по применению.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Используя подпитывающую среду А в качестве исходного материала, получали среды, содержащие различные концентрации L-тирозина (тирозин 2Na2H₂O)), PVA (Sekisui Chemical Со, Selvol™ 203) и Pluronic F68 (Kolliphor PI88, Sigma) и фиксированные концентрации Ala, Arg, Asn, Asp, цистина, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val. Среды получали, следуя методике, описанной в Таблице 1 для среды, содержащей 5 г/л PVA и 3 или 12 мМ Tyr, в Таблице 2 для среды, содержащей 5 г/л Pluronic F68 и 3 или 12 мМ Туг без PVA, и в Таблице 3 для среды, содержащей 3 или 12 мМ Туг без PVA и Pluronic F68. Остальные среды получали смешиванием 6 указанных выше сред с получением соответствующих концентраций PVA, Pluronic F68 и Tyr. Все среды имели конечную осмолярность 1000-1300 мОсм и рН 7,1-7,3. Все среды стерилизовали фильтрацией через 0,2 мкм фильтр и хранили во флаконах Nalgen с 0,2 мкм фильтрами при пониженной температуре (2-8°С) в темноте.

В дни, указанные в Таблице 4, отбирали образцы и измеряли мутность с использованием турбидиметра 2100P (НАСН), следуя инструкциям изготовителя. День 0 (D0) представляет собой дату начала хранения сред для всех условий. При выпадении осадка в среде отбор образцов данной среды для определения мутности прекращали, но продолжали хранить среду при пониженной температуре (2-8°С) в темноте. Осадок становится виден при мутности среды 50 NTU и выше.

М - мутность (NTU); О - осадок; >Lim - выше предела

Мутность ниже 5 NTU является нормальной.

В средах без PVA с концентрацией тирозина выше 6 мМ осадок выпадал за 4 дня (см. образцы 3 и 4). Во всех средах с Pluronic F68 за время хранения (4 недели) выпадал осадок, при этом в средах с более высокими концентрациями тирозина осадок выпадал раньше, чем в средах с менее высокими концентрациями тирозина. В присутствии PVA мутность оставалась низкой без выпадения осадка даже после 27 дней хранения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой среду для культивирования клеток, содержащую тирозин в концентрации от 4 до 50 мМ и поливиниловый спирт (PVA) в концентрации от 0,5 до 10 г/л и способ культивирования клеток, включающий приведение клеток млекопитающего в контакт со средой для культивирования клеток эмбриональной почки человека (293), клеток почки новорожденного хомячка (BHK), клеток яичника китайского хомячка (CHO), мышиных клеток Сертоли, клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO-76), клеток рака шейки матки человека (HeLa), клеток почки собаки, клеток печени крысы линии Buffalo, клеток легкого человека, клеток печени человека, клеток опухоли молочной железы мыши, клеток TRI, клеток MRC 5, клеток FS4 или линии гепатомы человека (Hep G2). Таким образом, разработана улучшенная среда для культивирования клеток с повышенной растворимостью тирозина для культивирования клеток млекопитающих в высокой плотности и для оптимального получения белков. 2 н. и 26 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 пр.

1. Среда для культивирования клеток, содержащая тирозин в концентрации от 4 до 50 мМ и поливиниловый спирт (PVA) в концентрации от 0,5 до 10 г/л.

2. Среда для культивирования клеток по п. 1, где концентрация тирозина составляет по меньшей мере 5 мМ.

3. Среда для культивирования клеток по п. 1, где концентрация тирозина составляет по меньшей мере 10 мМ.

4. Среда для культивирования клеток по п. 1, где концентрация тирозина составляет от 5 до 20 мМ.

5. Среда для культивирования клеток по любому из пп. 1-4, где концентрация PVA составляет от 0,5 до 5 г/л.

6. Среда для культивирования клеток по любому из пп. 1-4, где концентрация PVA составляет 2,5 г/л.

7. Среда для культивирования клеток по любому из пп. 1-6, не содержащая сыворотку.

8. Среда для культивирования клеток по любому из пп. 1-7, не содержащая белок.

9. Среда для культивирования клеток по любому из пп. 1-8, где мутность составляет менее 5 NTU (нефелометрические единицы мутности) после двух недель хранения при 4°C в отсутствие света.

10. Среда для культивирования клеток по любому из пп. 1-8, где по существу не наблюдается осадка после двух недель хранения при 4°C в отсутствие света.

11. Среда для культивирования клеток по любому из пп. 1-10, содержащая от 4 до 10 мМ Ala, от 30 до 60 мМ Arg, от 50 до 90 мМ Asn, от 10 до 30 мМ Asp, от 2 до 40 мМ Glu, от 2 до 15 мМ Gly, от 8 до 20 мМ His, от 25 до 32 мМ Ile, от 35 до 60 мМ Leu, от 28 до 60 мМ Lys, от 9 до 25 мМ Met, от 10 до 30 мМ Phe, от 15 до 40 мМ Pro, от 44 до 80 мМ Ser, от 20 до 45 мМ Thr, от 2 до 10 мМ Trp и от 20 до 50 мМ Val.

12. Способ культивирования клеток, включающий приведение клеток млекопитающего в контакт со средой для культивирования клеток по любому из пп. 1-11.

13. Способ по п. 12, где клетки млекопитающего выбраны из линии миеломы мышей BALB/c, человеческих ретинобластов (PER.C6), клеток почки обезьяны, линии эмбриональной почки человека (293), клеток почки новорожденного хомячка (BHK), клеток яичника китайского хомячка (CHO), мышиных клеток Сертоли, клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO-76), клеток рака шейки матки человека (HeLa), клеток почки собаки, клеток печени крысы линии Buffalo, клеток легкого человека, клеток печени человека, клеток опухоли молочной железы мыши, клеток TRI, клеток MRC 5, клеток FS4 или линии гепатомы человека (Hep G2).

14. Способ по п. 13, где клетки млекопитающего представляют собой клетки CHO.

15. Способ по п. 14, где клетки млекопитающего представляют собой клетки GS-CHO.

16. Способ по любому из пп. 12-15, где культура клеток представляет собой подпитываемую культуру.

17. Способ по п. 16, где подпитываемая культура содержит основную среду, дополненную подпитывающей средой.

18. Способ по п. 17, где только основная среда представляет собой среду по любому из пп. 1-11.

19. Способ по п. 17, где только подпитывающая среда представляет собой среду по любому из пп. 1-11.

20. Способ по п. 17, где основная среда и подпитывающая среда представляют собой среды по любому из пп. 1-11.

21. Способ по любому из пп. 12-20, где максимальная плотность жизнеспособных клеток при культивировании клеток составляет более 1 × 10⁶ клеток/мл.

22. Способ по п. 21, где максимальная плотность жизнеспособных клеток составляет более 5 × 10⁶ клеток/мл, 1 × 10⁷ клеток/мл, 5 × 10⁷ клеток/мл, 1 × 10⁸ клеток/мл или 5 × 10⁸ клеток/мл.

23. Способ по любому из пп. 12-22, где объем среды для культивирования клеток составляет по меньшей мере 500 л.

24. Способ по п. 23, где объем среды для культивирования клеток составляет по меньшей мере 5000 л.

25. Способ по любому из пп. 12-24, где клетки экспрессируют рекомбинантный белок.

26. Способ по п. 25, где рекомбинантный белок выбран из группы, состоящей из антител или их фрагментов, нанотел, однодоменных антител, малых модульных иммунофармацевтических средств (Small Modular ImmunoPharmaceuticals™, SMIP), VHH-антител, антител представителей семейства верблюдовых, однодоменных полипептидов акулы (IgNAR), однодоменных каркасов (например, фибронектиновых каркасов), терапевтических средств SCORPION™ (одноцепочечные полипептиды, содержащие N-концевой связывающий домен, эффекторный домен и C-концевой связывающий домен), факторов роста, факторов свертывания крови, цитокинов, слитых белков, фармацевтических лекарственных веществ, вакцин, ферментов и их комбинаций.

27. Способ по п. 25 или 26, дополнительно включающий получение рекомбинантного белка, продуцируемого клетками.

28. Способ по п. 27, дополнительно включающий очистку рекомбинантного белка.