Водная эмульсия на основе диметоксинитробензиловых эфиров арахидоновой кислоты Российский патент 2019 года по МПК A61K31/20 A61K41/00 

Изобретение относится к области коллоидной химии и фотохимии и может быть использовано для научных исследований в области оптики, биологии и медицины.

Конъюгаты различных веществ с т.н. фотолабильными защитными группами, которые эффективно отсоединяются под действием видимого или УФ света, хорошо известны и применяются достаточно широко [1]. В том числе для микроскопии применяются модифицированные флуорофоры с возможностью включения флуоресценции. Однако образование флуоресцентных продуктов при фотодиссоциации диметоксибензиловых эфиров жирных кислот ранее не наблюдалось и не использовалось.

В настоящее время большой интерес вызывает использование микрочастиц (мицеллы, липосомы, эмульсия) для адресной доставки лекарств и диагностики. В том числе несколько работ посвящено созданию микрочастиц с возможностью включения флуоресценции (см. напр. [2]) для применений в области background-free imaging.

В работе [2] описан подход создания частиц, флуоресценция которых включается при попадании во внутриклеточную среду.

Соединение, представляющее собой арахидоновую кислоту, соединенную с фотолабильной защитной группой о-нитробензильного типа (вещество 3), было описано в работах [3, 4]. Было показано, что соединения эффективно диссоциируют под действием света с высвобождением арахидоновой кислоты.

Флуоресценция частиц, описанных в работе [2], включается только во внутриклеточной среде благодаря их «разборке». Это сильно ограничивает круг их применений. В силу гидрофильной структуры защитной группы соединение, описанное в [3], было растворимым в воде, что не позволяло получить эмульсию. Соединение, описанное в работе [4], использовалось внутри клеток и также не образовывало эмульсию. Не была изучена флуоресценция продуктов после облучения.

Техническая задача, на решение которой направлено изобретение - создание водной эмульсии, элементы которой (капли) могут быть сделаны флуоресцентными с помощью УФ излучения.

Ожидаемый технический результат состоит в возможности кратного увеличения флуоресценции капель с помощью кратковременного (десятки и сотни миллисекунд) импульса ультрафиолетового излучения.

Раскрытие изобретения

Действием дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) на раствор арахидоновой кислоты и 3,4-диметокси-2-нитробензилового спирта в хлористом метилене получено конъюгат 1 арахидоновой кислоты с фотолабильной защитной группой (вещество 1). Аналогичным образом был получен конъюгат 2 арахидоновой кислоты с 1-(4,5-диметокси-2-нитрофенил)этан-1-олом (вещество 2).

В отличие от ранее опубликованного вещества 3, вещества 1 и 2 являются гидрофобными и не растворимы в воде. При этом они хорошо растворимы в диметилсульфоксиде (ДМСО), а при добавлении такого раствора в воду образуется эмульсия. Нами впервые наблюдался эффект появления флуоресценции дисперсной фазы этой эмульсии под действием УФ излучения. Было показано, что флуоресценция появляется и в исходном растворе в ДМСО без добавления воды, однако эффект на порядки меньше и медленнее. Ранее флуоресценция подобных веществ, возникающая после облучения УФ, не описывалась. С помощью ЯМР-спектроскопии выявить ее природу не удалось, так как в процессе фотораспада образуется множество различных продуктов.

Наблюдаемая флуоресценция хорошо возбуждается на длине волны 470 нм, которая используется в большинстве биомедицинских исследований. Спектр испускания флуоресценции достаточно широкий (500-700 нм). В экспериментах на флуоресцентном микроскопе видимая флуоресценция появлялась уже после 100-300 мс воздействия излучения с длиной волны 365 нм. После УФ облучения интенсивность флуоресценции капель была стабильной в течение долгого времени (часы, сутки). Это позволяет говорить о возможных применениях в исследованиях, таких как: слежение за интернализацией биологическими клетками липофильных частиц в реальном времени; выяснение путей транспорта микрочастиц из определенного участка, в котором их флуоресценция была включена; наблюдение за течением жидкости, проходящей через заданную точку в пространстве.

Описание изобретения

Пример 1. Получение вещества 1. К 26.3 мг (0.12 ммоль/л) твердого 4,5-диметокси-2-нитрофенилметанола добавили раствор 39.5 мг (0.13 ммоль/л) арахидоновой кислоты в 2 мл хлористого метилена. Затем добавили раствор 1.5 мг 4-диметиламинопиридина в 0.5 мл хлористого метилена. Далее при перемешивании по каплям добавили раствор 30.0 мг дициклогексилкарбодиимида в 2 мл хлористого метилена. Перемешивали раствор 2 ч, при этом выпал белый осадок. Осадок отфильтровали, фильтрат упарили на роторном испарителе. Остаток разделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле, элюент - смесь этилацетат-гексан (1:1). Собирали фракцию с R_f=0.35. После упаривания элюента получили вещество 1. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, J Гц): 0.83 (м, 3Н); 1.18-1.33 (м, 6Н); 1.63-1.76 (м, 3Н); 1.84-1.94 (м, 1H); 2.05-2.13 (м, 2Н); 2.36-2.42 (м, 2Н); 2.72-2.81 (м, 6Н); 3.91 (с, 3Н); 3.93 (с, 3Н); 5.24-5.39 (м, 8Н); 5.46 (с, 2Н); 6.96 (с, 1Н); 7.67 (с, 1Н). HRMS (m/z): 499.2936 (эксп), 499.2934 (расч).

Пример 2. Получение вещества 2. К 27.3 мг (0.12 ммоль) твердого 1-(4,5-диметокси-2-нитрофенил)этан-1-ола добавили раствор 39.5 мг (0.13 ммоль) арахидоновой кислоты в 2 мл хлористого метилена. Затем добавили раствор 1.5 мг 4-диметиламинопиридина в 0.5 мл хлористого метилена. Далее при перемешивании по каплям добавили раствор 30.0 мг дициклогексилкарбодиимида в 2 мл хлористого метилена. Перемешивали раствор 2 ч, при этом выпал белый осадок. Осадок отфильтровали, фильтрат упарили на роторном испарителе. Остаток разделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле, элюент - смесь этилацетат-гексан (1:1). Собирали фракцию с R_f=0.35. После упаривания элюента получили вещество 2. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CDCl₃, J Гц): 0.86 (м, 3Н); 1.18-1.36 (м, 6Н); 1.58 (д, 3Н, J=6.5 Гц); 1.63-1.76 (м, 3Н); 1.86-1.94 (м, 1Н); 1.99-2.13 (м, 2Н); 2.28-2.36 (м, 2Н); 2.72-2.81 (м, 6Н); 3.91 (с, 3Н); 3.93 (с, 3Н); 5.24-5.41 (м, 8Н); 6.45 (кв, 1Н, J=6.5 Гц); 6.97 (с, 1H); 7.55 (с, 1Н). HRMS (m/z): 513.6659 (эксп), 513.6655 (расч).

Пример 3: фотолиз вещества в ДМСО. Раствор вещества 1 в концентрации 100 мкМоль/л был помещен в кювету, где происходило его облучение ультрафиолетовыми светодиодами оптической мощностью 1 Вт (максимум в спектре излучения - 365 нм). Флуоресценция образца фиксировалась каждую минуту, а также после первых 30 секунд облучения. На графике Фиг. 1 представлена зависимость интенсивности флуоресценции от времени на длине волны 550±10 нм при возбуждении на 470±10 нм. Вставка -изображение флуоресценции кюветы в конце эксперимента под лучом 470 нм.

Пример 4: На Фиг. 2 - изображение эмульсии вещества в водном растворе под флуоресцентным микроскопом: слева - до фотолиза, справа - после 5 секунд фотолиза. Длина волны возбуждения флуоресценции - 470±20 нм, для фотолиза использовались те же светодиоды, что и в примере 3. В этих условиях появление флуоресценции идет на порядки быстрее, так как концентрация вещества внутри капель примерно в 100 раз больше, чем в примере 1.

Источники информации

1. Goeldner М, Givens R. Dynamic Studies in Biology: Photo triggers, Photoswitches and Caged Biomolecules. John Wiley & Sons; 2006.

2. Niko Y, Arntz Y, Mely Y, Konishi G, Klymchenko AS. Disassembly-Driven Fluorescence Turn-on of Polymerized Micelles by Reductive Stimuli in Living Cells. Chemistry - A European Journal. 2014;20: 16473-16477. doi:10.1002/chem.201405040

3. Jie X, Xupei H, Sreekumar R, Walker JW. PHOTOLABILE 'CAGED' FATTY ACIDS CONTAINING A 1-(2'-NITROPHENYL)-1,2-ETHANEDIOL MOIETY. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 1997;7: 1243-1248. doi: 10.1016/S0960-894X(97)00199-6

4. Nadler A, Reither G, Feng S, Stein F, Reither S, Muller R, et al. The Fatty Acid Composition of Diacylglycerols Determines Local Signaling Patterns. Angewandte Chemie International Edition. 2013;52: 6330-6334. doi:10.1002/anie.201301716

Изобретение относится к области коллоидной химии и фотохимии и может быть использовано для научных исследований в области оптики, биологии и медицины. Водная эмульсия образована гидрофобным веществом (диметоксинитробензиловый эфир арахидоновой кислоты). Данные вещества под воздействием ультрафиолетового излучения быстро диссоциируют с образованием свободной арахидоновой кислоты и флуоресцирующего продукта. Продукты фотораспада накапливаются внутри капель, образуя флуоресцентные микрочастицы. Получена водная эмульсия на основе диметоксинитробензиловых эфиров арахидоновой кислоты в объемном соотношении: 1 часть сантимолярного раствора эфира в диметилсульфоксиде к 19 частям воды. Эмульсия обладает фотоактивируемой флуоресценцией. В качестве диметоксинитробензилового эфира арахидоновой кислоты может быть использован 4,5-диметокси-2-нитробензиловый эфир и эфир 1-(4,5-диметокси-2-нитрофенил)этан-1-ола. Технический результат - увеличение флуоресценции капель с помощью кратковременного импульса ультрафиолетового излучения. 2 з.п. ф-лы, 4 пр., 2 ил.

1. Водная эмульсия на основе диметоксинитробензиловых эфиров арахидоновой кислоты в объемном соотношении: 1 часть сантимолярного раствора эфира в диметилсульфоксиде к 19 частям воды, обладающая фотоактивируемой флуоресценцией.

2. Водная эмульсия по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве диметоксинитробензилового эфира арахидоновой кислоты использован 4,5-диметокси-2-нитробензиловый эфир.

3. Водная эмульсия по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве диметоксинитробензилового эфира арахидоновой кислоты использован эфир 1-(4,5-диметокси-2-нитрофенил)этан-1-ола.