СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСШИХ СПИРТОВ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12P7/02 C12P7/06 C12P7/18 C12R1/145 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к биотехнологическому способу получения высших спиртов из источника углерода. В частности, смесь и способ относятся к биотехнологическому получению по меньшей мере одного высшего спирта в присутствии монооксида углерода.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Высшие спирты имеют несколько применений, в том числе используются в качестве топлива и в парфюмерно-косметической промышленности. Например, гексанол обычно используется в парфюмерной промышленности.

Гептанол, например, используется в экспериментах по электрофизиологии сердца для блокирования щелевых соединений и увеличения осевого сопротивления между миоцитами. Увеличение осевого сопротивления будет уменьшать скорость проведения и увеличивать чувствительность сердца к возвратному возбуждению и стойким аритмиям. Кроме того, 1-гептанол имеет приятный запах и используется в косметике из-за его аромата.

Эти высшие спирты также могут быть использованы в качестве топлива в будущем и могут заменить бензин в долгосрочной перспективе. По этим и другим причинам уже существует потенциальный рынок для высших спиртов. Высшие спирты также используются в качестве промышленных растворителей.

В настоящее время высшие спирты прежде всего изготавливают из нефтепродуктов. Эти соединения получают путем крекинга бензина или нефтепродуктов, что неблагоприятно для окружающей среды. Кроме того, поскольку расходы на эти исходные материалы будут связаны с ценой на нефть, с ожидаемым повышением цен на нефтепродукты в будущем цены на высшие спирты также могут увеличиться относительно роста цен на нефтепродукты.

Спиртовой процесс Alfol® представляет собой способ, применяемый для получения высших спиртов из этилена с помощью алюминийорганического катализатора. В реакции получают линейные первичные спирты (C₂-C₂₈) с длинной цепью. В способе используют алюминиевый катализатор для олигомеризации этилена и обеспечения окисления полученной алкильной группы. Однако данный способ дает широкий спектр спиртов и модель распределения сохраняется. Эта постоянная модель ограничивает способность производителя получать только определенный диапазон спиртов, который пользуется наибольшим спросом или имеет большее экономическое значение. Кроме того, газы, необходимые в реакции, должны быть очень чистыми, и для успешного проведения реакции необходима особая композиция газов.

В WO 2009100434 также описывается непрямой способ получения бутанола и гексанола из углевода. Способ включает гомоацетогенную ферментацию с получением промежуточного продукта уксусной кислоты, который затем химически превращают в этанол. Затем этанол и оставшуюся часть промежуточного продукта уксусной кислоты используют в качестве субстрата при кислотообразующей ферментации с получением промежуточных продуктов масляной и капроновой кислоты, которые затем химически превращают в бутанол и гексанол. Однако в этом способе используют дорогое углеводное сырье, и присутствуют два дополнительных этапа способа, образование сложных эфиров и химическое гидрирование сложных эфиров, что делает способ не только более длительным, но и также попутно приводит к потере полезного материала.

Perez J.M. (2012) раскрывает способ превращения карбоновых кислот с короткой цепью в соответствующие им спирты в присутствии синтез-газа с применением Clostridium ljungdahlii. Однако карбоновые кислоты с короткой цепью необходимо добавлять в качестве субстрата для превращения в соответствующий высший спирт.

Доступные в настоящее время способы получения высших спиртов, таким образом, имеют ограничения переноса массы газообразных субстратов в ферментационный бульон, низкую производительность и более низкие концентрации конечных продуктов, что приводит к повышению энергозатрат для очистки продукта.

Соответственно, требуется найти более экологически рациональные сырьевые материалы помимо чистых источников, основанных на нефтепродуктах или кукурузе, в качестве исходных материалов для получения высших спиртов с помощью биотехнологических средств, которые также наносят меньший вред окружающей среде. В частности, существует необходимость в простом и эффективном биотехнологическом производстве с одним реактором высших спиртов из экологически рационального сырья.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает реакционную смесь из по меньшей мере двух микроорганизмов в присутствии монооксида углерода (CO), где первый микроорганизм может быть способен превращать CO в ацетат и/или этанол и второй микроорганизм может быть способен превращать ацетат и/или этанол в по меньшей мере одну кислоту, и первый микроорганизм может затем быть способен превращать эту кислоту в соответствующий высший спирт, где все этапы можно провести в присутствии CO, и высший спирт содержит по меньшей мере 6 атомов углерода или более. В частности, CO присутствует в реакционной смеси в виде газообразного субстрата и CO присутствует в газообразном субстрате в концентрации 2% и/или более.

В одном аспекте настоящего изобретения обеспечена реакционная смесь, содержащая смешанную культуру первого и второго микроорганизмов в водной среде, содержащей газообразный монооксид углерода, где

- первый микроорганизм представляет собой ацетогенный микроорганизм, способный превращать источник углерода в ацетат и/или этанол, и

- второй микроорганизм, способный превращать ацетат и/или этанол с образованием кислоты, выбран из группы, состоящей из Clostridium kluyveri и C. carboxidivorans,

где первый микроорганизм дополнительно способен превращать кислоту в соответствующий высший спирт, где высший спирт содержит по меньшей мере 6 атомов углерода.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предоставлен способ получения по меньшей мере одного высшего спирта в водной среде, содержащей культуру первого и второго микроорганизма, где

- первый микроорганизм представляет собой ацетогенный микроорганизм, способный превращать источник углерода, содержащий монооксид углерода, в ацетат и/или этанол, и

- второй микроорганизм, способный превращать ацетат и/или этанол с образованием кислоты, выбран из группы, состоящей из Clostridium kluyveri и C. carboxidivorans,

где первый микроорганизм дополнительно способен превращать кислоту в соответствующий высший спирт, и высший спирт содержит по меньшей мере 6 атомов углерода.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения способ получения по меньшей мере одного высшего спирта в водной среде включает этапы, на которых:

(a) добавляют первый ацетогенный микроорганизм, способный превращать источник углерода, содержащий монооксид углерода, в ацетат и/или этанол в водной среде, и

(b) добавляют второй микроорганизм, способный превращать ацетат и/или этанол с образованием кислоты, выбранный из группы, состоящей из Clostridium kluyveri и C. carboxidivorans,

где первый микроорганизм дополнительно способен превращать кислоту в соответствующий высший спирт, и высший спирт содержит по меньшей мере 6 атомов углерода.

В одном примере этапы (a) и (b) проводят одновременно. В другом примере этапы (a) и (b) проводят последовательно. Концентрация первого и второго микроорганизма может постоянно поддерживаться для сохранения прохождения реакции. В одном примере перед тем, как проводят этап (b), измеряют концентрацию этанола и/или ацетата для обеспечения достижения оптимальной концентрации для второго микроорганизма. В частности, концентрация ацетата и/или этанола может находиться на оптимальном уровне, чтобы было достаточно субстрата в водной среде для того, чтобы второй организм образовал по меньшей мере одну высшую кислоту. Специалист в данной области сможет легко определить подходящее время для включения второго организма в водную среду.

В другом примере этапы (a) и (b) проводят одновременно. В этом примере второй микроорганизм может быть неактивным (т.е. может оставаться латентным) до того, как достаточное количество ацетата и/или этанола сделается доступным посредством активности первого микроорганизма. Присутствие одного из микроорганизмов в водной среде не нарушает или не препятствует активности и/или эффективности другого.

Преимуществом настоящего изобретения может быть то, что могут использоваться намного более благоприятные смеси CO₂/CO сырья. Эти различные источники включают природный газ, биогаз, уголь, нефть, растительные остатки и тому подобное. Другим преимуществом способа может быть высокий выход углерода. Это стало возможным за счет возвращения образованного CO₂. А именно, CO₂ может прореагировать на первой стадии обратно до уксусной кислоты.

Еще одно преимущество может заключаться в большей гибкости в отношении используемых условий ферментации, поскольку любой ацетогенный микроорганизм и любой микроорганизм, способный осуществлять этанол-карбоксилатный ферментационный путь, можно использовать в комбинации для фактического получения высших спиртов. Еще одним преимуществом настоящего изобретения может быть то, что поскольку второй микроорганизм может функционировать и/или продуцировать кислоту из ацетата и/или этанола в присутствии СО, одновременно первый и второй микроорганизмы могут присутствовать в гомогенной смеси для получения высших спиртов из источника углерода, содержащего СО. Эта особенность второго микроорганизма позволяет, чтобы получение высших спиртов из источника углерода, такого как CO, было одноэтапным процессом, делая этот процесс более эффективным, а выход больше. Из-за этого преимущества второго микроорганизма одноэтапную процедуру изготовления высших спиртов можно осуществить в одном ферментере без промежуточного этапа отделения. Также возможно повышение концентрации конечного продукта с использованием этой одноэтапной процедуры. Неожиданно оказалось, что Baffert C., 2011 и Thauer R.K., 1973 оба сообщили, что гидрогеназы ингибировались в присутствии CO. По этой и другим причинам WO2013/167663 включает этап отделения между (a) этапом образования ацетата и/или этанола из CO и/или CO₂ в присутствии ацетогенного организма и (b) этапом образования углеводорода, содержащего по меньшей мере один атом кислорода (например, гексановая кислота), в присутствии второго микроорганизма. Возможность получения высшего спирта, в частности такого, который содержит по меньшей мере 6 атомов углерода, в одном реакторе синтеза из СО согласно любому из аспектов настоящего изобретения, является, таким образом, удивительным результатом. В любом случае, даже если этапы (a) и (b) осуществляют в два отдельных этапа (т.e. в двух отдельных контейнерах), может отсутствовать необходимость в специфическом способе выделения для удаления всех следовых количеств CO для функционирования как первого, так и второго микроорганизмов.

Как можно видеть в примерах, присутствие СО позволяет получить гексанол в способе согласно любому из аспектов настоящего изобретения, где источник углерода содержит по меньшей мере CO.

Источник углерода, содержащий CO, можно превратить по меньшей мере в одну кислоту в присутствии по меньшей мере одного ацетогенного микроорганизма и второго микроорганизма, способного осуществлять этанол-карбоксилатный ферментационный путь. В частности, кислота может содержать 6 или более атомов углерода. Более конкретно, образованную кислоту можно выбрать из группы, состоящей из гексановой кислоты, гептановой кислоты, октановой кислоты, нонановой кислоты декановой кислоты и тому подобного. В частности, источник углерода, содержащий СО, в присутствии по меньшей мере одной ацетогенной бактерии может привести к получению этанола и/или уксусной кислоты.

Выражение "ацетогенные бактерии", используемое в настоящем документе, относится к микроорганизму, который способен выполнять путь Вуда-Льюнгдаля и таким образом способен превращать CO, CO₂ и/или водород в ацетат. Эти микроорганизмы включают микроорганизмы, которые в своей форме дикого типа не осуществляют путь Вуда-Льюнгдаля, но приобрели этот признак в результате генетической модификации. Такие микроорганизмы включают, но без ограничения, клетки E. coli. Эти микроорганизмы могут также быть известны как карбоксидотрофные бактерии. В настоящее время из уровня техники известен 21 род различных ацетогенных бактерий (Drake et al., 2006), и они также могут включать некоторые Clostridia (Drake & Kusel, 2005). Эти бактерии способны использовать диоксид углерода или монооксид углерода в качестве источника углерода с водородом в качестве источника энергии (Wood, 1991). Кроме того, спирты, альдегиды, карбоновые кислоты, а также многочисленные гексозы также могут быть использованы в качестве источника углерода (Drake et al., 2004). Восстановительный путь, который ведет к образованию ацетата, называется путь ацетил-CoA или Вуда-Льюнгдаля.

В частности, ацетогенные бактерии могут быть выбраны из группы, состоящей из Acetoanaerobium notera (ATCC 35199), Acetonema longum (DSM 6540), Acetobacterium carbinolicum (DSM 2925), Acetobacterium malicum (DSM 4132), вида Acetobacterium № 446 (Morinaga et al., 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194), Acetobacterium wieringae (DSM 1911), Acetobacterium woodii (DSM 1030), Alkalibaculum bacchi (DSM 22112), Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304), Blautia producta (DSM 2950, ранее Ruminococcus productus, ранее Peptostreptococcus productus), Butyribacterium methylotrophicum (DSM 3468), Clostridium aceticum (DSM 1496), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061, DSM 19630 и DSM 23693), Clostridium carboxidivorans (DSM 15243), Clostridium coskatii (ATCC № PTA-10522), Clostridium drakei (ATCC BA-623), Clostridium formicoaceticum (DSM 92), Clostridium glycolicum (DSM 1288), Clostridium ljungdahlii (DSM 13528), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55989), Clostridium mayombei (DSM 6539), Clostridium methoxybenzovorans (DSM 12182), Clostridium ragsdalei (DSM 15248), Clostridium scatologenes (DSM 757), вида Clostridium ATCC 29797 (Schmidt et al., 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73), Desulfotomaculum kuznetsovii (DSM 6115), Desulfotomaculum thermobezoicum подвида thermosyntrophicum (DSM 14055), Eubacterium limosum (DSM 20543), Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834), вида Moorella HUC22-1 (Sakai et al., 2004, Biotechnol. Let., Vol. 29, p. 1607-1612), Moorella thermoacetica (DSM 521, ранее Clostridium thermoaceticum), Moorella thermoautotrophica (DSM 1974), Oxobacter pfennigii (DSM 322), Sporomusa aerivorans (DSM 13326), Sporomusa ovata (DSM 2662), Sporomusa silvacetica (DSM 10669), Sporomusa sphaeroides (DSM 2875), Sporomusa termitida (DSM 4440) и Thermoanaerobacter kivui (DSM 2030, ранее Acetogenium kivui). Более конкретно, может быть использован штамм ATCC BAA-624 вида Clostridium carboxidivorans. Еще более конкретно, может быть использован бактериальный штамм Clostridium carboxidivorans, помеченный "P7" и "P11", как описано, например, в заявке на патент США № 2007/0275447 и в заявке на патент США № 2008/0057554.

Другой особенно подходящей бактерией может быть Clostridium ljungdahlii. В частности, штаммы, выбранные из группы, состоящей из Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ljungdahlii ERI2, Clostridium ljungdahlii COL и Clostridium ljungdahlii O-52, могут быть использованы при превращении синтез-газа в гексановую кислоту. Эти штаммы, например, описаны в WO 98/00558, WO 00/68407, ATCC 49587, ATCC 55988 и ATCC 55989. В другом примере ацетогенной бактерией, выбранной для первого организма, может быть Clostridium autoethanogenum.

Ацетогенные бактерии могут использоваться в сочетании со вторым микроорганизмом, который способен осуществлять этанол-карбоксилатный ферментационный путь. В одном примере одновременно ацетогенная бактерия и второй микроорганизм, который способен осуществлять этанол-карбоксилатный ферментационный путь, могут быть использованы для получения высшего спирта из источника углерода, содержащего CO. Кислоту затем можно превратить в соответствующий высший спирт, выбранный из группы, состоящей из гексанола, октанола, нонанола, деканола и тому подобного. В одном примере высший спирт может быть выбран из группы, состоящей из 1-гексанола, 2-гексанола, 3-гексанола, 1-гептанола, 2-гептанола, 3-гептанола, 4-гептанола, октанола, нонанола, деканола и тому подобного.

В одном примере этанол и/или ацетат может быть превращен в соответствующую высшую кислоту в присутствии второго микроорганизма, способного осуществлять этанол-карбоксилатный ферментационный путь. Этанол-карбоксилатный ферментационный путь подробно описан по меньшей мере в Seedorf H. et al., 2008. В частности, второй микроорганизм может быть выбран из группы, состоящей из Clostridium kluyveri, C.Carboxidivorans и тому подобного. Эти вторые микроорганизмы включают микроорганизмы, которые в своей форме дикого типа не осуществляют этанол-карбоксилатный ферментационный путь, но приобрели этот признак в результате генетической модификации. В частности, вторым микроорганизмом может быть Clostridium kluyveri.

В другом примере второй микроорганизм может представлять собой организм дикого типа, который экспрессирует по меньшей мере один фермент, выбранный из группы, состоящей из E₁ - E₁₁, где E₁ представляет собой алкогольдегидрогеназу (adh), E₂ представляет собой ацетальдегиддегидрогеназу (ald), E₃ представляет собой ацетоацетил-СoA-тиолазу (thl), E₄ представляет собой 3-гидроксибутирил-СoA-дегидрогеназу (hbd), E₅ представляет собой 3-гидроксибутирил-СoA-дегидратазу (crt), E₆ представляет собой бутирил-СoA-дегидрогеназу (bcd), E₇ представляет собой субъединицу электронпереносящего флавопротеина (etf), E₈ представляет собой кофермент A трансферазу (cat), E₉ представляет собой ацетаткиназу (ack), E₁₀ представляет собой фосфотрансацетилазу (pta) и E₁₁ представляет собой трансгидрогеназу. В частности, второй микроорганизм дикого типа согласно любому из аспектов настоящего изобретения может экспрессировать по меньшей мере E₂, E₃ и E₄. Еще более конкретно, второй микроорганизм дикого типа согласно любому из аспектов настоящего изобретения может экспрессировать по меньшей мере E₄.

В другом примере второй микроорганизм согласно любому из аспектов настоящего изобретения может быть генетически модифицированным организмом, который имеет повышенную экспрессию по сравнению с микроорганизмом дикого типа по меньшей мере одного фермента, выбранного из E₁-E₁₁, где E₁ представляет собой алкогольдегидрогеназу (adh), E₂ представляет собой ацетальдегиддегидрогеназу (ald), E₃ представляет собой ацетоацетил-СoA-тиолазу (thl), E₄ представляет собой-3-гидроксибутирил-СoA-дегидрогеназу (hbd), E₅ представляет собой 3-гидроксибутирил-СoA-дегидратазу (crt), E₆ представляет собой бутирил-СoA-дегидрогеназу (bcd), E₇ представляет собой субъединицу электронпереносящего флавопротеина (etf), E₈ представляет собой кофермент A трансферазу (cat), E₉ представляет собой ацетаткиназу (ack), E₁₀ представляет собой фосфотрансацетилазу (pta) и E₁₁ представляет собой трансгидрогеназу. В частности, генетически модифицированный второй микроорганизм согласно любому из аспектов настоящего изобретения может экспрессировать по меньшей мере ферменты E₂, E₃ и E₄. Еще более конкретно, генетически модифицированный второй микроорганизм согласно любому из аспектов настоящего изобретения может экспрессировать по меньшей мере E₄. Ферменты E₁ - E₁₁ могут быть выделены из Clostridium kluyveri. Специалист в данной области способен измерить активность каждого из этих ферментов с помощью способов, известных из уровня техники. В частности, активность ферментов E₁ и E₂ можно измерить с помощью анализов, сообщенных по меньшей мере в Hillmer P., 1972, Lurz R., 1979; активность фермента E₂ также можно измерить с помощью анализа, сообщенного в Smith L.T., 1980; активность ферментов E₃ и E₄ можно измерить с помощью анализов, сообщенных по меньшей мере в Sliwkowski M.X., 1984; активность E₄ также можно измерить с помощью анализа, сообщенного в Madan V.K., 1972; активность E₅ также можно измерить с помощью анализа, сообщенного в Bartsch R.G., 1961; активность ферментов E₆ и E₇ можно измерить с помощью анализа, сообщенного в Li F., 2008; активность E₇ также можно измерить с помощью анализа, сообщенного в Chowdhury, 2013; активность E₈ можно измерить с помощью анализа, сообщенного в Stadman, 1953; активность E₉ можно измерить с помощью анализа, сообщенного в Winzer K., 1997; активность E₁₀ можно измерить с помощью анализа, сообщенного в Smith L.T., 1976; и активность E₁₁ можно измерить с помощью анализа, сообщенного в Wang S., 2010.

Согласно любому из аспектов настоящего изобретения первый и/или второй микроорганизм может быть генетически модифицированным микроорганизмом. Генетически модифицированная клетка или микроорганизм может генетически отличаться от клетки или микроорганизма дикого типа. Генетическое различие между генетически модифицированным микроорганизмом согласно любому из аспектов настоящего изобретения и микроорганизмом дикого типа может состоять в присутствии полного гена, аминокислоты, нуклеотида и т.д. в генетически модифицированном микроорганизме, которые могут отсутствовать в микроорганизме дикого типа. В одном примере генетически модифицированный микроорганизм согласно любому из аспектов настоящего изобретения может содержать ферменты, которые позволяют микроорганизму продуцировать по меньшей мере одну карбоновую кислоту. Микроорганизм дикого типа по сравнению с генетически модифицированным микроорганизмом согласно любому из аспектов настоящего изобретения может не иметь совсем или иметь необнаруживаемую активность ферментов, которые позволяют генетически модифицированному микроорганизму продуцировать по меньшей мере одну карбоновую кислоту. Выражение ‘генетически модифицированный микроорганизм’, используемое в настоящем документе, может использоваться взаимозаменяемо с выражением ‘генетически модифицированная клетка’. Генетическая модификация согласно любому из аспектов настоящего изобретения может быть проведена в клетке микроорганизма.

Фраза “дикого типа”, используемая в настоящем документе в сочетании с клеткой или микроорганизмом, может обозначать клетку со структурой генома, которая находится в форме, встречающейся естественным образом в дикой природе. Выражение может применяться как к целой клетке, так и к индивидуальным генам. Выражение “дикий тип”, следовательно, не включает такие клетки или такие гены, где последовательности генов были изменены, по меньшей мере частично, человеком с использованием рекомбинантных способов.

Специалист в данной области сможет применить любой способ, известный из уровня техники, для генетической модификации клетки или микроорганизма. Согласно любому из аспектов настоящего изобретения генетически модифицированная клетка может быть генетически модифицирована таким образом, что в определенном интервале времени, в течение 2 часов, в частности, в течение 8 часов или 24 часов, она образует по меньшей мере в два раза, предпочтительно, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 1000 раз или по меньшей мере в 10000 раз больше карбоновой кислоты и/или соответствующего сложного эфира карбоновой кислоты, чем клетка дикого типа. Увеличение образования продукта можно определить, например, путем культивирования клетки согласно любому из аспектов настоящего изобретения и клетки дикого типа, каждой отдельно, в одинаковых условиях (одинаковая плотность клеток, одинаковая питательная среда, одинаковые условия культивирования) в течение определенного интервала времени в подходящей питательной среде, и затем определения количества целевого продукта (карбоновой кислоты) в питательной среде.

В другом примере кислоту можно получить из источника углерода, содержащего СО, любым способом, раскрытым в Steinbusch, 2011, Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen M. C. A. A, 2013, Ding H. et al., 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B. T. et al., 1948 и т. п. Еще более конкретно, кислоту можно получить из источника углерода, содержащего СО, в присутствии по меньшей мере Clostridium kluyveri.

Еще более конкретно, согласно любому из аспектов настоящего изобретения кислоту получают в присутствии по меньшей мере одного ацетогенного микроорганизма и Clostridium kluyveri. В одном примере ацетогенный микроорганизм может представлять собой Clostridium ljungdahlii или Clostridium ragsdahlei.

При получении кислоты из источника углерода, содержащего СО, можно использовать комбинацию бактерий. Более чем одна ацетогенная бактерия может присутствовать в комбинации с одним или более вторыми микроорганизмами. В другом примере может присутствовать ацетогенная бактерия более чем одной разновидности и второй микроорганизм только одной разновидности. В еще одном примере может присутствовать более чем один второй микроорганизм в комбинации только с одной ацетогенной бактерией.

Реакционная смесь может содержать два микроорганизма в гомогенной смеси. Выражение ‘гомогенная смесь’, используемое в настоящем документе, относится к смеси микроорганизмов, равномерно пространственно распределенных в среде. В частности, смесь может содержать по меньшей мере два микроорганизма, при этом ацетогенный и второй микроорганизм равномерно распределены в водной среде. В одном примере может быть примерно равное количество ацетогенного и второго микроорганизма в смеси. В другом примере в смеси может находиться больше ацетогенного микроорганизма по сравнению со вторым микроорганизмом. В еще одном примере в смеси может находиться больше второго микроорганизма по сравнению с ацетогенным микроорганизмом. Во всех возможных примерах микроорганизмы находятся в одной гомогенной смеси, где они равномерно распределены по всей смеси. Выражение ‘водная среда’, используемое в настоящем документе, можно использовать взаимозаменяемо с выражением ‘реакционная смесь’.

Выражение "ацетат", используемый в настоящем документе, относится как к уксусной кислоте, так и к ее солям, что возникает неизбежно, поскольку, как известно из уровня техники, микроорганизмы осуществляют жизнедеятельность в водной среде, и там всегда присутствует баланс между солью и кислотой.

Выражение "второй микроорганизм" относится к микроорганизму, который отличается от "первого микроорганизма" согласно любому из аспектов настоящего изобретения.

В другом примере этап (a) и этап (b) можно проводить в двух разных контейнерах. В одном примере этап (a) можно проводить в ферментере 1, где первый микроорганизм вступает в контакт с источником углерода, содержащим CO, с получением ацетата и/или этанола. Этанол и/или ацетат можно затем привести в контакт со вторым микроорганизмом в ферментере 2 с получением по меньшей мере одной кислоты. Затем кислоту можно подавать обратно в ферментер 1 для превращения кислоты в требуемый высший спирт. Можно создать цикл, где ацетат и/или этанол, полученный в ферментере 1, можно постоянно подавать в ферментер 2, ацетат и/или этанол в ферментере 2 можно превращать в по меньшей мере одну кислоту и кислоту из ферментера 2 подавать обратно в ферментер 1. CO, подаваемый в ферментер 1, можно перенести в ферментер 2 вместе с ацетатом и/или этанолом. Никакого специального способа выделения не нужно, поскольку второй микроорганизм, как было обнаружено, превращает ацетат и/или этанол в по меньшей мере одну кислоту в присутствии CO.

В другом примере среда рециркулирует между ферментерами 1 и 2. Таким образом, этанол и/или ацетат, полученный в ферментере 1, можно подать в ферментер 2, и кислоту, полученную в ферментере 2, можно подавать обратно в ферментер 1. В процессе рециркуляции среды CO из ферментера 1 можно ввести в ферментер 2. Кроме того, кислоты, полученные в ферментере 2, можно в результате повторно ввести в ферментер 1. Второй микроорганизм в ферментере 2 может быть способен продолжать получение кислот из ацетата и этанола в присутствии CO, рециркулирующего из ферментера 1 в ферментер 2. Спирты, накопленные в ферментерах 1 и 2, можно затем выделять с помощью средств, известных из уровня техники.

В дополнительном примере могут присутствовать три контейнера для осуществления способа согласно любому из аспектов настоящего изобретения. Первый микроорганизм может присутствовать в первом ферментере, второй микроорганизм - во втором ферментере и третий ферментер опять с первым микроорганизмом. В ферментере 1 первый микроорганизм вступает в контакт с источником углерода с получением ацетата и/или этанола. Этанол и/или ацетат можно затем привести в контакт со вторым микроорганизмом в ферментере 2 с получением по меньшей мере одной кислоты. Затем кислоту можно подать в ферментер 3 с получением по меньшей мере одного спирта.

В частности, СО можно подать в водную среду в непрерывном газовом потоке. Концентрация CO в газовом потоке может составлять по меньшей мере 2% по объему от объема общего количества газа в газовом потоке. В частности, CO может присутствовать в диапазоне концентраций от 2 до 99% по объему, в диапазоне от 2 до 95 % по объему, от 5 до 95% по объему, от 10 до 90% по объему, от 15 до 85% по объему, в частности, в диапазоне от 20 до 80% по объему. Более конкретно, концентрация CO может составлять приблизительно 7%, 24% по объему. Концентрацию газовой фазы монооксида углерода в источнике углерода можно измерить с помощью по меньшей мере газового хроматографа GC 6890N от Agilent Technologies Inc. с детектором по теплопроводности.

Выражение ‘приблизительно’, используемое в настоящем документе, относится к изменениям в пределах 20 процентов. В частности, выражение "приблизительно", используемое в настоящем документе, относится к +/- 20%, более конкретно, +/-10%, еще более конкретно, +/- 5% от данного измерения или значения.

Все процентные содержания (%) представляют собой, если не указано иное, объемный процент.

Источник углерода, используемый согласно любому из аспектов настоящего изобретения, содержит диоксид углерода и/или монооксид углерода. Специалист в данной области поймет, что существует множество возможных источников для обеспечения СО и/или CO₂ в качестве источника углерода. Можно увидеть, что на практике в качестве источника углерода согласно любому из аспектов настоящего изобретения можно использовать любой газ или любую газовую смесь, которая способна предоставить микроорганизмам достаточное количество углерода, так чтобы мог быть образован ацетат и/или этанол из источника CO и/или СО₂.

Как правило, для смешанной культуры согласно любому из аспектов настоящего изобретения источник углерода содержит по меньшей мере 50% по объему, по меньшей мере 70% по объему, предпочтительно по меньшей мере 90% по объему CO и/или CO₂, где проценты по объему -% относятся ко всем источникам углерода, которые доступны для первого микроорганизма в смешанной культуре.

В смешанной культуре согласно любому из аспектов настоящего изобретения может быть обеспечен источник углеродного материала. Примеры источников углерода в газообразной форме включают отработанные газы, такие как синтез-газ, топочный газ и газы от переработки нефтепродуктов, полученные при дрожжевой ферментации или ферментации с клостридиями. Эти отработанные газы образуются при газификации содержащих целлюлозу материалов или газификации угля. В одном примере эти отработанные газы не обязательно получают в виде побочных продуктов других процессов, но могут специально получить для применения со смешанной культурой согласно любому из аспектов настоящего изобретения.

Согласно любому из аспектов настоящего изобретения источник углерода может представлять собой синтез-газ. Синтез-газ можно, например, получить в виде побочного продукта газификации угля. Соответственно, микроорганизм смешанной культуры согласно любому из аспектов настоящего изобретения способен превращать вещество, которое представляет собой отходы производства, в ценный ресурс. В другом примере синтез-газ может быть побочным продуктом газификации широко доступного, недорогого сельскохозяйственного сырья для применения со смешанной культурой по настоящему изобретению для получения по меньшей мере одного высшего спирта.

Есть многочисленные примеры сырья, которое можно превратить в синтез-газ, поскольку почти все формы растительности могут быть использованы для этой цели. В частности, сырье выбирают из группы, состоящей из многолетних трав, таких как мискантус, остатков кукурузы, отходов переработки, таких как опилки, и тому подобного.

В целом, синтез-газ можно получить в устройстве для газификации сухой биомассы в основном за счет пиролиза, частичного окисления и парового риформинга, где первичными продуктами синтез-газа являются CO, H₂ и CO₂. Синтез-газ также может быть продуктом электролиза CO₂. Специалист в данной области узнает подходящие условия для проведения электролиза CO₂ для получения синтез-газа, содержащего СО в требуемом количестве.

Как правило, часть синтез-газа, полученного в процессе газификации, сначала обрабатывают, чтобы оптимизировать выход продукта и предотвратить образование смол. Крекинг нежелательных смолы и CO в синтез-газе можно выполнить с использованием извести и/или доломита. Эти процессы подробно описаны, например, в Reed, 1981.

Смеси источников можно использовать в качестве источника углерода.

Согласно любому из аспектов настоящего изобретения восстановитель, например водород, можно подавать вместе с источником углерода. В частности, этот водород можно подавать, когда подают и/или используют С и/или CO₂. В одном примере газообразный водород является частью синтез-газа, присутствующего согласно любому из аспектов настоящего изобретения. В другом примере, где газообразного водорода в синтез-газе недостаточно для способа по настоящему изобретению, можно подавать дополнительный газообразный водород.

Специалист в данной области узнает другие условия, необходимые для осуществления способа согласно любому из аспектов настоящего изобретения. В частности, условия в контейнере (например, ферментере) могут изменяться в зависимости от используемых первого и второго микроорганизмов. Изменение условий таким образом, чтобы они подходили для оптимального функционирования микроорганизмов, находится в пределах знаний специалиста в данной области.

В одном примере способ согласно любому из аспектов настоящего изобретения может осуществляться в водной среде с рН между 5 и 8, 5,5 и 7. Давление может находиться между 1 и 10 бар.

В частности, водная среда может содержать источник углерода, содержащий CO и/или CO₂. Более конкретно, источник углерода, содержащий CO и/или CO₂, подают в водную среду в непрерывном газовом потоке. Еще более конкретно, непрерывный газовый поток содержит синтез-газ. В одном примере газы являются частью одного потока/струи. В другом примере каждый газ представляет собой отдельный поток/струю, подаваемый в водную среду. Эти газы могут быть разделены, например, с использованием отдельных сопел, которые открываются в водную среду, фритт, мембран внутри трубы подачи газа в водную среду и тому подобного.

В частности, реакционную смесь согласно любому из аспектов настоящего изобретения (т.е. смесь первого микроорганизма - ацетогенного организма, второго микроорганизма и источника углерода, содержащего монооксид углерода) можно использовать в любом известном биореакторе или ферментере для осуществления любого из аспектов настоящего изобретения.

Выражение ‘высшие спирты’, используемое в настоящем документе, относится к спиртам, которые содержат от 6 до 10 атомов углерода и могут быть несколько вязкими или маслянистыми и характеризуются более тяжелыми фруктовыми ароматами. Высшие спирты могут включать, но без ограничения, гексанол, гептанол, октанол, нонанол, деканол и тому подобное. Более конкретно, высший спирт можно выбрать из группы, состоящей из 1-гексанола, 1-октанола, 1-гептанола, 3-метил-1-пентанола, 4-метил-1-гексанола, 5-метил-1-гептанола, 4-метил-1-пентанола, 5-метил-1-гексанола, 6-метил-1-гептанола и их комбинаций.

Согласно любому из аспектов настоящего изобретения 'соответствующий высший спирт’ относится к спирту с тем же числом атомов углерода, что и кислота, из которой образуется соответствующий высший спирт. Например, гексановую кислоту можно превратить в соответствующий спирт - гексанол; гептановую кислоту можно превратить в соответствующий спирт - гептанол; октановую кислоту можно превратить в соответствующий спирт - октанол; нонановую кислоту можно превратить в соответствующий спирт - нонанол; декановую кислоту можно превратить в соответствующий спирт - деканол и тому подобное.

В одном примере способ согласно любому из аспектов настоящего изобретения может приводить к образованию смеси из кислот и/или высших спиртов. В другом примере параметры способа согласно любому из аспектов настоящего изобретения могут быть скорректированы для получения более одной кислоты и/или высшего спирта по сравнению с остальными. Например, со следующими параметрами выращивания смешанной культуры на комплексной среде (0,25 г/л NH₄Cl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,31 г/л K₂HPO₄, 0,23 г/л KH₂PO₄, 2,5 г/л NaHCO₃, 1 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л K-ацетата, 20 г/л этанола, 0,25 г/л L-цистеин-HCl, 1,5 мг/л FeCl₂ x 4 H₂O, 70 мкг/л ZnCl₂ x 7 H₂O, 100 мкг/л MnCl₂ x 4 H₂O, 6 мкг/л борной кислоты, 190 мкг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мкг/л CuCl₂ x 6 H₂O, 24 мкг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 36 мкг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 3 мкг/л Na₂SeOO₃ x 5 H₂O, 4 мкг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 300 мкг/л пиридоксин-HCl, 200 мкг/л тиамин-HCl x H₂O) при 37°C с pH приблизительно 6,5 в течение приблизительно 240 часов концентрацию бутанола и/или получение гексанола можно контролировать.

В реакционной смеси согласно любому из аспектов настоящего изобретения может присутствовать кислород. Соответственно, первый и второй микроорганизмы согласно любому из аспектов настоящего изобретения могут быть выращены аэробно. В частности, кислород можно подавать в водную среду согласно любому из аспектов настоящего изобретения в непрерывном газовом потоке. Более конкретно, концентрация O₂ в газовом потоке может быть представлена менее чем 1% по объему от общего количества газа в газовом потоке. В частности, кислород может присутствовать в диапазоне концентраций от 0,000005 до 2% по объему, в диапазоне от 0,00005 до 2% по объему, от 0,0005 до 2% по объему, от 0,005 до 2% по объему, от 0,05 до 2% по объему, от 0,00005 до 1,5% по объему, от 0,0005 до 1,5% по объему, от 0,005 до 1,5% по объему, от 0,05 до 1,5% по объему, от 0,5 до 1,5% по объему, от 0,00005 до 1% по объему, от 0,0005 до 1% по объему, от 0,005 до 1% по объему, от 0,05 до 1% по объему, от 0,5 до 1% по объему, от 0,55 до 1% по объему, от 0,60 до 1% по объему, в частности, в диапазоне от 0,60 до 1,5%, от 0,65 до 1% и от 0,70 до 1% по объему. В частности, ацетогенный микроорганизм является особенно пригодным, когда доля О₂ в газовой фазе/потоке составляет приблизительно 0,00005, 0,0005, 0,005, 0,05, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2% по объему по отношению к объему газа в газовом потоке. Специалист в данной области сможет применить любой из способов, известных из уровня техники, для измерения объемной концентрации кислорода в газовом потоке. В частности, объем кислорода можно измерить с помощью любого способа, известного из уровня техники. В одном примере концентрацию кислорода в газовой фазе можно измерить с помощью погружного зонда для следовых количеств кислорода PreSens Precision Sensing GmbH. Концентрацию кислорода можно измерить с помощью тушения флуоресценции, где степень тушения коррелирует с парциальным давлением кислорода в газовой фазе. Еще более конкретно, первый и второй микроорганизмы согласно любому из аспектов настоящего изобретения, способны оптимально осуществлять жизнедеятельность в водной среде, когда кислород подают с газовым потоком с концентрацией кислорода менее чем 1% по объему от общего газа, приблизительно 0,015% по объему от общего объема газа в газовом потоке, подаваемом в реакционную смесь.

Водная среда согласно любому из аспектов настоящего изобретения может содержать кислород. Кислород может быть растворен в среде любым способом, известным из уровня техники. В частности, кислород может присутствовать в концентрации 0,5 мг/л. В частности, концентрация растворенного свободного кислорода в водной среде может составлять по меньшей мере 0,01 мг/л. В другом примере растворенный кислород может составлять приблизительно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 мг/л. В частности, концентрация растворенного кислорода может составлять 0,01-0,5 мг/л, 0,01-0,4 мг/л, 0,01-0,3 мг/л, 0,01-0,1 мг/л. В частности, кислород можно подавать в водную среду в непрерывном газовом потоке. Более конкретно, водная среда может содержать кислород и источник углерода, содержащий CO и/или CO₂. Более конкретно, кислород и источник углерода, содержащий CO и/или CO₂, подают в водную среду в непрерывном газовом потоке. Еще более конкретно, непрерывный газовый поток содержит синтез-газ и кислород. В одном примере оба газа являются частью одного потока/струи. В другом примере каждый газ представляет собой отдельный поток/струю, подаваемый в водную среду. Эти газы могут быть разделены, например, с использованием отдельных сопел, которые открываются в водную среду, фритт, мембран внутри трубы подачи газа в водную среду и тому подобного. Кислород может быть свободным кислородом. Согласно любому из аспектов настоящего изобретения выражение "реакционная смесь, содержащая свободный кислород" относится к реакционной смеси, содержащей элементарный кислород в форме O₂. O₂ может быть растворенным кислородом в реакционной смеси. В частности, растворенный кислород может находиться в концентрации ≥ 5 ppm (0,000005% об.; 5x10^-6). Специалист в данной области способен использовать любой метод, известный из уровня техники, для измерения концентрации растворенного кислорода. В одном примере растворенный кислород может быть измерен с помощью кислородных погружных зондов (тип PSt6 от PreSens Precision Sensing GmbH, Регенсбург, Германия).

В одном примере согласно любому из аспектов настоящего изобретения источник углерода представляет собой синтез-газ и источник углерода может быть смешан с газообразным кислородом перед подачей в водную среду. Этот этап смешивания может повысить эффективность и получение высших спиртов в реакции. Общая эффективность, производительность спирта и/или общий захват углерода в способе по настоящему изобретению может зависеть от стехиометрии CO₂, CO, H₂ и O₂ в непрерывном газовом потоке. Подводимый непрерывный газовый поток может быть композицией O₂, CO₂ и H₂. В частности, в непрерывном газовом потоке диапазон концентраций O₂ может быть в пределах от 0,000005% до 1% по объему, CO/CO₂ приблизительно 10–50%, в частности 33% по объему, и H₂ будет в пределах от 44% до 84%, в частности от 64 до 66,04% по объему. Более конкретно, концентрация газов в непрерывном газовом потоке может быть 0,15% по объему для O₂, 32% по объему для СО/СО₂ и 64% по объему для H₂. В другом примере непрерывный газовый поток может также содержать инертные газы, подобные N₂, вплоть до концентрации N₂ 50% по объему.

Специалист в данной области поймет, что может быть необходимо контролировать композицию и скорости потока струй через определенные промежутки времени. Контроль композиции потока может быть достигнут путем изменения пропорций составляющих его струй для достижения целевой или требуемой композиции. Композицию и скорость потока смешанного потока можно контролировать любыми средствами, известными из уровня техники. В одном примере систему адаптируют для непрерывного контроля скоростей потока и композиций по меньшей мере двух струй и комбинирования их для получения единого смешанного потока субстрата в непрерывном газовом потоке оптимальной композиции и средств для прохождения оптимизированного потока субстрата в смешанную культуру согласно любому из аспектов настоящего изобретения.

Целесообразно включить O₂ в реакционную смесь и/или газовый поток, подаваемый в реакционную смесь, поскольку большинство отходящих газов, в том числе синтез-газ, содержат кислород в небольших или больших количествах. Сложно и дорого удалить этот кислород перед использованием синтез-газа в качестве источника углерода для получения высших спиртов. Способ согласно любому из аспектов настоящего изобретения позволяет получить по меньшей мере один высший спирт без необходимости предварительного удаления любых следовых количеств кислорода из источника углерода. Это позволяет сохранить время и деньги.

В одном примере, когда O₂ присутствует в реакционной смеси согласно любому из аспектов настоящего изобретения, первый микроорганизм, ацетогенная бактерия, может присутствовать в двух фазах роста. В примере по меньшей мере одни ацетогенные бактерии могут находиться в экспоненциальной фазе роста и другие ацетогенные бактерии могут находиться в любой другой фазе роста в жизненном цикле ацетогенного микроорганизма. В частности, согласно любому из аспектов настоящего изобретения, ацетогенные бактерии в водной среде могут содержать одни ацетогенные бактерии в экспоненциальной фазе роста и другие - в стационарной фазе. В присутствии кислорода без наличия ацетогенных бактерий в экспоненциальном росте ацетогенные бактерии в стационарной фазе могут быть не способны продуцировать ацетат и/или этанол. Это явление подтверждено по меньшей мере в Brioukhanov, 2006, Imlay, 2006, Lan, 2013 и т.п. Авторы настоящего изобретения, таким образом, обнаружили, что в присутствии ацетогенных бактерий в экспоненциальном росте ацетогенные бактерии в любой фазе роста могут аэробно дышать и продуцировать ацетат и/или этанол в большем или равном количестве относительно полученного, когда в реакционной смеси отсутствовал кислород. В одном примере ацетогенные бактерии в экспоненциальной фазе роста могут быть способны к удалению свободного кислорода из реакционной смеси, обеспечивая подходящие условия (отсутствие свободного кислорода) ацетогенным бактериям в любой фазе роста для метаболизма углеродного субстрата, содержащего СО, и получения ацетата и/или этанола.

В другом примере водная среда уже может содержать ацетогенные бактерии в любой фазе роста, в частности, в стационарной фазе, в присутствии источника углерода, содержащего СО. В этом примере кислород может присутствовать в источнике углерода, подаваемом в водную среду, или в самой водной среде. В присутствии кислорода ацетогенные бактерии могут быть неактивными и не продуцировать ацетат и/или этанол до добавления ацетогенных бактерий в экспоненциальной фазе роста. В этом самом примере ацетогенные бактерии в экспоненциальной фазе роста могут быть добавлены в водную среду. Неактивные ацетогенные бактерии, уже находящиеся в водной среде, затем могут активироваться и начать продуцировать ацетат и/или этанол.

В дополнительном примере ацетогенные бактерии в любой фазе роста можно сначала смешать с ацетогенными бактериями в экспоненциальной фазе роста и затем добавить источник углерода и/или кислород.

Согласно любому из аспектов настоящего изобретения микроорганизм в экспоненциальной фазе роста, растущий в присутствии кислорода, может приводить к образованию микроорганизма, адаптирующегося к росту и метаболизму в присутствии кислорода. В частности, микроорганизм может быть способен удалять кислород из среды, окружающей микроорганизм. Эта вновь приобретенная адаптация позволяет ацетогенным бактериям в экспоненциальной фазе роста освобождать среду от кислорода и таким образом продуцировать ацетат и этанол из источника углерода. В частности, ацетогенная бактерия с недавно приобретенной адаптацией позволяет бактериям превращать источник углерода, содержащий СО, в ацетат и/или этанол и вновь образованную кислоту в соответствующий высший спирт в присутствии спирта. Второй микроорганизм, выбранный из группы, состоящей из Clostridium kluyveri и C.Carboxidivorans, может превращать ацетат и/или этанол с образованием вновь образованной кислоты. Как упомянуто ранее, предпочтительно, чтобы данный процесс выполнялся в присутствии O₂ (т.e. с включением O₂ в реакционную смесь), поскольку большинство отходящих газов, в том числе синтез-газ, содержат кислород в небольших или больших количествах. Эта реакционная смесь делает возможным способ получения высших спиртов из отходящих газов без необходимости проходить через дополнительный и дорогостоящий этап первоначальной выделения кислорода.

Реакционная смесь согласно любому из аспектов настоящего изобретения, таким образом, может содержать CO, свободный кислород и ацетогенные бактерии в экспоненциальной фазе роста.

Специалисту в данной области будут понятны различные фазы роста микроорганизмов и способы их измерения и идентификации. В частности, большинство микроорганизмов в периодической культуре могут находиться по меньшей мере в четырех различных фазах роста, а именно латентная фаза (A), логарифмическая фаза или экспоненциальная фаза (B), стационарная фаза (C) и фаза гибели (D). Логарифмическая фаза может дополнительно разделяться на раннюю логарифмическую фазу и среднюю - позднюю логарифмическую/экспоненциальную фазу. Стационарная фаза может также дополнительно разграничиваться на раннюю стационарную фазу и стационарную фазу. Например, Cotter J.L., 2009 г., Najafpour G., 2006 г., Younesi H., 2005 г. и Köpke M., 2009 г. раскрывают различные фазы роста ацетогенных бактерий. В частности, фазу роста клеток можно измерить с помощью способов, изложенных по меньшей мере в Shuler M.L., 1992 и Fuchs G., 2007.

Латентная фаза представляет собой фазу сразу после инокуляции клеток в свежую среду, при этом популяция остается временно без изменений. Хотя не происходит видимого деления клеток, клетки могут расти в объеме или массе, синтезировать ферменты, белки, РНК и т. д. и увеличивать метаболическую активность. Длительность латентной фазы может зависеть от множества различных факторов, включая размер инокулята; время, необходимое для восстановления от физического повреждения или шока при переносе; время, необходимое для синтеза важнейших коферментов или факторов деления; и время, необходимое для синтеза новых (индуцибельных) ферментов, которые необходимы для метаболизма субстратов, присутствующих в среде.

Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста представляет собой модель сбалансированного роста, где все клетки регулярно делятся путем бинарного деления и растут в геометрической прогрессии. Клетки делятся с постоянной скоростью в зависимости от состава питательной среды и условий инкубации. Скорость экспоненциального роста бактериальной культуры выражается как время генерации, а также как время удвоения популяции бактерий. Время генерации (G) определяется как время (t) на поколение (n = количество поколений). Следовательно, G = t/n представляет собой уравнение, с помощью которого получают расчеты времени генерации. Экспоненциальная фаза может разделяться на (i) раннюю логарифмическую фазу и (ii) среднюю - позднюю логарифмическую/экспоненциальную фазу. Специалист в данной области может легко определить, когда микроорганизм, в частности ацетогенная бактерия, входит в логарифмическую фазу. Например, способ расчета скорости роста ацетогенных бактерий с определением того, находятся ли они в логарифмической фазе, можно выполнить с применением способа, изложенного по меньшей мере в Henstra A.M., 2007. В частности, микроорганизм в экспоненциальной фазе роста согласно любому из аспектов настоящего изобретения может включать клетки в ранней логарифмической фазе и в средней - поздней логарифмической/экспоненциальной фазе.

Стационарная фаза представляет собой фазу, когда заканчивается экспоненциальный рост, поскольку экспоненциальный рост не может постоянно продолжаться в периодической культуре (например, в закрытой системе, такой как пробирка или колба). Рост популяции ограничен одним из трех факторов: 1. исчерпание доступных питательных веществ; 2. накопление ингибирующих метаболитов или конечных продуктов; 3. исчерпание пространства, в данном случае названное нехваткой "биологического пространства". Во время стационарной фазы, если подсчитываются жизнеспособные клетки, нельзя определить, то ли несколько клеток погибает и равное количество клеток делится, или популяция клеток просто перестала расти и делиться. Стационарная фаза, подобно латентной фазе, не обязательно является периодом покоя. Бактерии, которые продуцируют вторичные метаболиты, такие как антибиотики, делают это во время стационарной фазы цикла роста (вторичные метаболиты определяются как метаболиты, производимые после активной стадии роста).

Фаза гибели идет вслед за стационарной фазой. Во время фазы гибели количество жизнеспособных клеток снижается геометрически (экспоненциально), по существу, обратно росту во время логарифмической фазы.

В одном примере ацетогенные бактерии в способе согласно любому из аспектов настоящего представления могут содержать комбинацию клеток: клетки в логарифмической фазе и клетки в стационарной фазе. В способе согласно любому из аспектов настоящего изобретения ацетогенные клетки в логарифмической фазе могут содержать скорость роста, выбранную из группы, состоящей из 0,01 - 2 ч^-1, 0,01 - 1 ч^-1, 0,05 - 1 ч^-1, 0,05 - 2 ч^-1, 0,05 - 0,5 ч^-1 и т.п. В одном примере OD₆₀₀ клеток у ацетогенных клеток в логарифмической фазе в реакционной смеси может быть выбрана из диапазона, состоящего из 0,001 - 2, 0,01 - 2, 0,1 - 1, 0,1 - 0,5 и т.п. Специалист в данной области сможет применить любой способ, известный из уровня техники для измерения OD₆₀₀ и определения скорости роста клеток в реакционной смеси и/или подлежащих добавлению в реакционную смесь. Например, можно использовать Koch (1994). В частности, бактериальный рост можно определить и контролировать с использованием различных способов. Одним из наиболее распространенных является измерение мутности, в котором опираются на оптическую плотность (OD) бактерий в суспензии и используют спектрофотометр. OD может быть измерено при 600 нм с использованием UV-спектрофотометра.

В одном примере способ согласно любому из аспектов настоящего изобретения включает смешивание (i) свободного кислорода, (ii) группы ацетогенных клеток в логарифмической фазе, (iii) группы ацетогенных клеток в стационарной фазе, (iii) группы Clostridium kluyveri и (iv) источника углерода, содержащего CO, вместе. Ацетогенные клетки в логарифмической фазе позволяют любым другим ацетогенным клеткам в водной среде продуцировать ацетат и/или этанол в присутствии кислорода. Концентрация ацетогенных клеток в логарифмической фазе может поддерживаться в реакционной смеси. Таким образом, в любой момент времени в реакции реакционная смесь содержит ацетогенные клетки в логарифмической фазе и ацетогенные клетки в другой фазе роста, например, в стационарной фазе.

Способ согласно любому из аспектов настоящего изобретения может дополнительно включать этап выделения полученного высшего спирта. Специалист в данной области будет знать средства для выполнения этого на основе способов, известных из уровня техники.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения обеспечено применение реакционной смеси согласно любому из аспектов настоящего изобретения для получения по меньшей мере одного высшего спирта, содержащего по меньшей мере 6 атомов углерода. В частности, высший спирт получают из по меньшей мере источника углерода, содержащего CO.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигуры отсутствуют

ПРИМЕРЫ

Вышеизложенное описывает предпочтительные варианты осуществления, которые, как будет понятно специалистам в данной области, могут подвергаться изменениям или модификациям в проектировании, построении и эксплуатации без отклонения от объема формулы изобретения. Эти изменения, например, предназначены для охвата объемом формулы изобретения.

Пример 1

Совместное культивирование Clostridium ljungdahlii и Clostridium kluyveri в среде определенного состава на водороде и диоксиде углерода

В этом примере C. ljungdahlii в качестве первого организма автотрофно культивировали в среде определенного состава для того, чтобы продуцировать ацетат и этанол. Затем через заданное время C. kluyveri в качестве второго организма инокулировали в тот же реактор для превращения ацетата и этанола в бутират и гексаноат. Затем в дальнейшем C. ljungdahlii превращал бутират в бутанол.

Использовали среду определенного состава для совместного культивирования обоих микроорганизмов, состоящую из 2 г/л (NH₄)₂HPO₄, 0,2 г/л NaCl, 0,15 г/л KCl, 1 г/л KOH, 0,5 г/л MgCl₂ x 6 H₂O, 0,2 г/л CaCl₂ x 2 H₂O, 15 мг/л FeCl₂ x 4 H₂O, 0,4 г/л L-цистеин-HCl, 0,4 г/л Na₂S x 9 H₂O, 3 мг/л борной кислоты, 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 1 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O, 0,3 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0,3 мг/л MnSO₄ x H₂O, 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 0,1 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O, 0,1 мг/л Na₂SeO₃, 106 мкг/л биотина, 5 мкг/л фолиевой кислоты, 2,5 мкг/л пиридоксин-HCl, 266 мкг/л тиамин-HCl x H₂O, 12,5 мкг/л рибофлавина, 12,5 мкг/л никотиновой кислоты, 413 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 12,5 мкг/л витамина B₁₂, 12,5 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 15 мкг/л липоевой кислоты.

Автотрофное культивирование проводили в 250 мл среды в бутылях для сыворотки объемом 500 мл, которые непрерывно газировали синтез-газом, состоящим из 67% H₂ и 33% CO₂ со скоростью 1 л/ч. Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 150 мин^-1. Значение pH поддерживали в диапазоне pH 5,0 – 6,5 путем непрерывного добавления анаэробного исходного раствора KOH (40 г/л).

В начале эксперимента C. ljungdahlii инокулировали с OD₆₀₀ 0,1 автотрофно выращенными клетками. Таким образом, C. ljungdahlii выращивали в комплексной среде при непрерывном газировании синтез-газом, состоящим из 67% H₂ и 33% CO₂ со скоростью 3 л/ч в бутылях для сыворотки объемом 1 л с 500 мл комплексной среды. Использовали комплексную среду, состоящую из 1 г/л NH₄Cl, 0,1 г/л KCl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,8 г/л NaCl, 0,1 г/л KH₂PO₄, 20 мг/л CaCl₂ x 2 H₂O, 20 г/л MES, 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,4 г/л L-цистеин-HCl, 0,4 г/л Na₂S x 9 H₂O, 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O, 8 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O, 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O, 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 0,2 мг/л Na₂SeO₄, 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 20 мкг/л биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 мкг/л пиридоксин-HCl, 50 мкг/л тиамин-HCl x H₂O, 50 мкг/л рибофлавина, 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 1 мкг/л витамина B₁₂, 50 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 50 мкг/л липоевой кислоты. Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 150 мин^-1. Клетки собирали в поздней логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,67 и pH 4,69 с помощью анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл вышеописанной среды определенного состава. Эту суспензию клеток затем использовали для инокуляции в эксперименте по совместному культивированию.

Параллельно с этим C. kluyveri выращивали гетеротрофно в 200 мл комплексной среды в бутылях для сыворотки объемом 500 мл на ацетате и этаноле. Использовали комплексную среду, состоящую из 0,25 г/л NH₄Cl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,31 г/л K₂HPO₄, 0,23 г/л KH₂PO₄, 2,5 г/л NaHCO₃, 1 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л K-ацетата, 20 г/л этанола, 0,25 г/л L-цистеин-HCl, 1,5 мг/л FeCl₂ x 4 H₂O, 70 мкг/л ZnCl₂ x 7 H₂O, 100 мкг/л MnCl₂ x 4 H₂O, 6 мкг/л борной кислоты, 190 мкг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мкг/л CuCl₂ x 6 H₂O, 24 мкг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 36 мкг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 3 мкг/л Na₂SeOO₃ x 5 H2O, 4 мкг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 100 мкг/л витамина B₁₂, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 300 мкг/л пиридоксин-HCl, 200 мкг/л тиамин-HCl x H₂O. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 100 мин^-1. Клетки собирали в поздней логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,81 и pH 5,96 с помощью анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл вышеописанной среды определенного состава. Эту суспензию клеток затем использовали для инокуляции в эксперименте по совместному культивированию с OD₆₀₀ 0,2 через 96 часов прохождения эксперимента.

Во время эксперимента брали образцы по 5 мл для определения OD₆₀₀, pH и концентрации продуктов. Последнее определяли с помощью количественного анализа с применением ¹H-ЯМР-спектроскопии.

После инокуляции C. ljungdahlii клетки начинали расти и непрерывно продуцировали ацетат. Одновременно с получением ацетата получали этанол с более низкой скоростью по сравнению с получением ацетата. Затем через 96 часов C. kluyveri инокулировали в реактор и снижение концентрации этанола измеряли в следующем эксперименте. Затем получение бутирата (макс. 1163 мг/л) и гексаноата (макс. 136 мг/л) одновременно измеряли в следующие 113 часов эксперимента. Параллельно с получением с помощью C. kluyveri бутирата C. ljungdahlii превращала бутират в бутанол до максимальной концентрации 20 мг/л бутанола в конце эксперимента.

Пример 2.

Совместное культивирование Clostridium ljungdahlii и Clostridium kluyveri в комплексной среде с CO-содержащим газом (25% CO)

C. ljungdahlii в качестве первого организма автотрофно культивировали в комплексной среде для продуцирования ацетата и этанола. Затем через заданное время C. kluyveri в качестве второго организма инокулировали в тот же реактор для превращения ацетата и этанола в бутират и гексаноат. Затем в дальнейшем C. ljungdahlii превращал бутират в бутанол и гексаноат в гексанол.

Использовали комплексную среду для совместного культивирования обоих микроорганизмов, состоящую из 1 г/л NH₄Cl, 0,1 г/л KCl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,8 г/л NaCl, 0,1 г/л KH₂PO₄, 20 мг/л CaCl₂ x 2 H₂O, 20 г/л MES, 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,4 г/л L-цистеин-HCl, 0,4 г/л Na₂S x 9 H₂O, 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O, 8 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O, 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O, 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 0,2 мг/л Na₂SeO₄, 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 20 мкг/л биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 мкг/л пиридоксин-HCl, 50 мкг/л тиамин-HCl x H₂O, 50 мкг/л рибофлавина, 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 1 мкг/л витамина B₁₂, 50 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 50 мкг/л липоевой кислоты.

Автотрофное культивирование выполняли в 500 мл комплексной среды в бутыли для сыворотки объемом 1 л, которую непрерывно газировали синтез-газом, состоящим из 5 % H₂, 25 % CO₂, 25 % CO и 45% N₂, при скорости ~3,6 л/ч (≥0,5 ppm газообразного кислорода). Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 120 мин^-1. Значение pH во время этого эксперимента не контролировали.

В начале эксперимента C. ljungdahlii инокулировали с OD₆₀₀ 0,1 автотрофно выращенными клетками. Таким образом, C. ljungdahlii выращивали в описанной выше комплексной среде при непрерывном газировании синтез-газом, состоящим из 67% H₂ и 33% CO₂ со скоростью 3 л/ч в бутылях для сыворотки объемом 1 л с 500 мл комплексной среды. Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 150 мин^-1. Клетки собирали в поздней логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,51 и pH 5,04 с помощью анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл вышеописанной комплексной среды. Эту суспензию клеток затем использовали для инокуляции в эксперименте по совместному культивированию.

Параллельно с этим C. kluyveri выращивали гетеротрофно в 200 мл комплексной среды в бутылях для сыворотки объемом 500 мл на ацетате и этаноле. Использовали комплексную среду, состоящую из 0,25 г/л NH₄Cl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,31 г/л K₂HPO₄, 0,23 г/л KH₂PO₄, 2,5 г/л NaHCO₃, 1 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л K-ацетата, 20 г/л этанола, 0,25 г/л L-цистеин-HCl, 1,5 мг/л FeCl₂ x 4 H₂O, 70 мкг/л ZnCl₂ x 7 H₂O, 100 мкг/л MnCl₂ x 4 H₂O, 6 мкг/л борной кислоты, 190 мкг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мкг/л CuCl₂ x 6 H₂O, 24 мкг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 36 мкг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 3 мкг/л Na₂MoO₄ x 5 H₂O, 4 мкг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 100 мкг/л витамина B₁₂, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 300 мкг/л пиридоксин-HCl, 200 мкг/л тиамин-HCl x H₂O. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 100 мин^-1. Клетки собирали в поздней логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,54 и pH 6,60 с помощью анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл вышеописанной комплексной среды. Эту суспензию клеток затем использовали для инокуляции в эксперименте по совместному культивированию через 240 часов прохождения эксперимента.

Во время эксперимента брали образцы по 5 мл для определения OD₆₀₀, pH и концентрации продуктов. Последнее определяли с помощью количественного анализа с применением ¹H-ЯМР-спектроскопии.

После инокуляции C. ljungdahlii клетки начинали расти и непрерывно продуцировали ацетат до концентрации ~ 3 г/л и этанол до концентрации ~0,5 г/л через 71 часов. В дальнейшей динамике эксперимента ацетат полностью превращался в этанол до концентрации 4,8 г/л через 240 часов. Затем в момент процесса 240 часов C. kluyveri инокулировали в реактор. Поскольку этот организм помимо этанола нуждался в ацетате в качестве субстрата, одновременно с инокуляцией C. kluyveri примерно 3 г/л ацетата (в форме Na-ацетата) анаэробно вводили в реактор. В дальнейшей динамике эксперимента измеряли получение бутирата и гексаноата до концентрации каждого 1,6 г/л. Параллельно с получением с помощью C. kluyveri бутирата и гексаноата C. ljungdahlii превращала бутират в бутанол до максимальной концентрации 690 мг/л бутанола и превращала гексаноат в гексанол до максимальной концентрации 1478 мг/л гексанола.

Пример 3.

Получение ацетата и этанола с помощью Clostridium ljungdahlii из синтез-газа без кислорода

В этом примере C. ljungdahlii анаэробно культивировали в комплексной среде с синтез-газом, состоящим из H₂ и CO₂, в отсутствие кислорода для того, чтобы получить ацетат и этанол. Для культуры клеток C. ljungdahlii 2 мл криокультуры культивировали анаэробно в 200 мл среды (среда ATCC1754: pH 6,0; 20 г/л MES; 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,8 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 0,1 г/л KCl, 0,1 г/л KH₂PO₄, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O; 0,02 г/л CaCl₂ × 2H₂O; 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O; 8 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O; 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O; 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O; 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O; 0,2 мг/л Na₂SeO₄; 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 мкг/л d-биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 г/л пиридоксин-HCl; 50 мкг/л тиамин-HCl x H₂O; 50 мкг/л рибофлавина; 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотената; 1 мкг/л витамина B12 ; 50 мкг/л п-аминобензоата; 50 мкг/л липоевой кислоты, примерно 67,5 мг/л NaOH) с приблизительно 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и 400 мг/л Na₂S x 9 H₂O. Культивирование проводили хемолитоавтотрофно в огнестойкой стеклянной бутыли объемом 1 л с предварительно смешанной смесью газов, состоящей из 67% H₂, 33% CO₂, во встряхивателе на открытой водяной бане при 37°C, 150 об./мин. и фумигации 1-3 л/ч в течение 161 ч. Введение газа в среду выполняли с помощью фильтра с размером пор 10 микрон, установленного в средней части реактора в газовыделительной трубе. Клетки центрифугировали, промывали с 10 мл среды ATCC и снова центрифугировали.

Для прекультуры множество промытых клеток из выращенной культуры C. ljungdahlii переносили в 200 мл среды ATCC с приблизительно 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и выращивали до OD₆₀₀ 0,12. Культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной бутыли объемом 500 мл с предварительно смешанной смесью газов, состоящей из 67% H₂, 33% CO₂, во встряхивателе на открытой водяной бане при 37°C, 150 об./мин. и аэрацией 3 л/ч в течение 65 ч. Введение газа в среду выполнили с помощью фильтра с размером пор 10 микрон, который поместили в средней части реакторов. Клетки центрифугировали, промывали с 10 мл производственного буфера (pH 6,2; 0,5 г/л KOH, аэрированного в течение 1 ч предварительно смешанной смесью газов из 67% H₂, 33% CO₂ при 1 л/ч ), снова промывали и центрифугировали.

Для продуцирующей культуры множество промытых клеток из прекультуры C. ljungdahlii переносили в 200 мл среды ATCC с приблизительно 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и выращивали до OD₆₀₀ 0,2. Культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной бутыли объемом 500 мл с предварительно смешанной смесью газов, состоящей из 67% H₂, 33% CO₂, во встряхивателе на открытой водяной бане при 37°C, 150 об./мин. и аэрацией 3 л/ч в течение 118 ч. Введение газа в среду выполняли с помощью фильтра с размером пор 10 микрон, который поместили в средней части реакторов. Когда значение pH опустилось ниже 5,0, добавляли 1 мл раствора 140 г/л KOH. При взятии образцов каждый образец объемом 5 мл удаляли для определения OD_600, pH и диапазона продуктов. Определение концентрации продукта выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта служил триметилсилилпропионат натрия (T (M) SP).

За период культивирования 118 ч плотность клеток в продуцирующей культуре оставалась постоянной, узнаваемой по стандартной OD₆₀₀ 0,2, что соответствует скорости роста μ = 0 ч^-1. Концентрация ацетата значительно повышалась за этот период времени с 4 мг/л до 3194 мг/л и концентрация этанола повышалась с 17 мг/л до 108 мг/л.

Пример 4.

Отсутствие продуцирования ацетата и этанола с помощью Clostridium ljungdahlii из синтез-газа, содержащего CO₂ и H₂ с кислородом

C. ljungdahlii культивировали в комплексной среде с синтез-газом и кислородом. C. ljungdahlii первоначально культивировали в присутствии синтез-газа, состоящего из H₂ и CO₂, в отсутствие кислорода для получения ацетата и этанола. Для культивирования клетки выращивали в устойчивых к давлению стеклянных бутылях, которые можно герметично закрывать с помощью пробки из бутилкаучука. Все этапы, в которых использовали клетки C. ljungdahlii, проводили в анаэробных условиях.

Для культуры клеток C. ljungdahlii 2 мл криокультуры культивировали анаэробно в 200 мл среды (среда ATCC1754: pH 6,0; 20 г/л MES; 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,8 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 0,1 г/л KCl, 0,1 г/л KH₂PO₄, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O; 0,02 г/л CaCl₂ × 2H₂O; 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O; 8 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O; 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O; 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O; 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O; 0,2 мг/л Na₂SeO₄; 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 мкг/л d-биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 г/л пиридоксин-HCl; 50 мкг/л тиамин-HCl x H₂O; 50 мкг/л рибофлавина; 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотената; 1 мкг/л витамина B12 ; 50 мкг/л п-аминобензоата; 50 мкг/л липоевой кислоты, примерно 67,5 мг/л NaOH) с приблизительно 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и 400 мг/л Na₂S x 9 H₂O. Культивирование проводили хемолитоавтотрофно в огнестойкой стеклянной бутыли объемом 1 л с предварительно смешанной смесью газов, состоящей из 67% H₂, 33% CO₂, во встряхивателе на открытой водяной бане при 37°C, 150 об./мин. и фумигации 1-3 л/ч в течение 161 ч. Введение газа в среду выполняли с помощью фильтра с размером пор 10 микрон, установленного в средней части реактора в газовыделительной трубе. Клетки центрифугировали, промывали с 10 мл среды ATCC и снова центрифугировали.

Для прекультуры множество промытых клеток из выращенной культуры C. ljungdahlii переносили в 200 мл среды ATCC с приблизительно 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и выращивали до OD₆₀₀ 0,12. Культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной бутыли объемом 500 мл с предварительно смешанной смесью газов, состоящей из 67% H₂, 33% CO₂, во встряхивателе на открытой водяной бане при 37°C, 150 об./мин. и с аэрацией 3 л/ч в течение 24 ч. Впоследствии смесь газов заменяли на смесь с композицией из 66,85% H₂, 33% CO₂ и 0,15% O₂ и клетки дополнительно газировали в течение 67 ч при 3 л/ч. Ввод газа в среду осуществляли с помощью газирующей фритты с размером пор 10 микрон, которую поместили в средней части реакторов на барботер. Клетки центрифугировали, промывали с 10 мл среды ATCC и снова центрифугировали. Ввод газа в среду осуществили с помощью фильтра с размером пор 10 микрон, который поместили в средней части реакторов. Клетки центрифугировали, промывали с 10 мл среды ATCC и снова центрифугировали.

Для продуцирующей культуры множество промытых клеток из прекультуры C. ljungdahlii переносили в 200 мл среды ATCC с приблизительно 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и выращивали до OD₆₀₀ 0,1. Культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной бутыли объемом 500 мл с предварительно смешанной смесью газов, состоящей из 66,85% H₂, 33% CO₂ и 0,15% O₂, во встряхивателе на открытой водяной бане при 37°C, 150 об/мин и с аэрацией 3 л/ч в течение 113 ч. Ввод газа в среду проводили с помощью фильтра с размером пор 10 микрон, который поместили в средней части реакторов. При взятии образцов каждый образец объемом 5 мл удаляли для определения OD_600, pH и диапазона продуктов. Определение концентрации продукта выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта служил триметилсилилпропионат натрия (T (M) SP).

За период с 89 ч по 113 ч не показано распознаваемого роста клеток. OD₆₀₀ остановилась на 0,29, что соответствует скорости роста μ = 0 ч^-1. Концентрация ацетата слегка повышалась за это время с 89,4 мг/л до 86,9 мг/л и концентрация этанола снижалась с 16,2 мг/л до 11,9 мг/л.

Пример 5.

Культивирование Clostridium ljungdahlii в логарифмической фазе в присутствии синтез-газа, содержащего CO₂ и кислород

C. ljungdahlii питались H₂ и CO₂ из проникающей газовой фазы и образовывали ацетат и этанол. Для культивирования применяли устойчивую к давлению стеклянную бутыль, которую можно герметично закрывать с помощью пробки из бутилкаучука. Все этапы культивирования, в которых использовали клетки C. ljungdahlii, проводили в анаэробных условиях.

Для культуры клеток C. ljungdahlii 5 мл криокультуры культивировали анаэробно в 500 мл среды (среда ATCC1754: pH 6,0; 20 г/л MES; 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,8 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 0,1 г/л KCl, 0,1 г/л KH₂PO4, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O; 0,02 г/л CaCl₂ × 2H₂O; 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O; 8 мг/л (NH₄)2Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O; 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O; 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O; 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O; 0,2 мг/л Na₂SeO₄; 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 мкг/л d-биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 г/л пиридоксин-HCl; 50 мкг/л тиамин-HCl x H2O; 50 мкг/л рибофлавина; 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотената; 1 мкг/л витамина B12 ; 50 мкг/л п-аминобензоата; 50 мкг/л липоевой кислоты, примерно 67,5 мг/л NaOH) с приблизительно 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и 400 мг/л Na₂S x 9 H₂O. Культивирование проводили хемолитоавтотрофно в огнестойкой стеклянной бутыли объемом 1 л с предварительно смешанной смесью газов, состоящей из 67% H₂, 33% CO₂, во встряхивателе на открытой водяной бане при 37°C, 100 об./мин. и фумигации 3 л/ч в течение 72 ч. Введение газа в среду выполняли с помощью фильтра с размером пор 10 микрон, установленного в средней части реактора в газовыделительной трубе. Клетки центрифугировали, промывали с 10 мл среды ATCC и снова центрифугировали.

Для основной культуры множество промытых клеток из выращенной культуры C. ljungdahlii переносили в 500 мл среды ATCC с приблизительно 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и выращивали до OD₆₀₀ 0,1. Культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной бутыли объемом 1 л с предварительно смешанной смесью газов, состоящей из 66,85% H₂, 33% CO₂, 0,15% O₂, во встряхивателе на открытой водяной бане при 37°C, 150 об./мин. и с аэрацией 1 л/ч в течение 45 ч. Ввод газа в среду осуществляли с помощью фильтра с размером пор 10 микрон, который поместили в средней части реакторов. При взятии образцов каждый образец объемом 5 мл удаляли для определения OD_600нм, pH и диапазона продуктов. Определение концентрации продукта выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта служил триметилсилилпропионат натрия (T (M) SP).

Показан значительный рост клеток в течение периода культивирования, о чем свидетельствовало увеличение OD_600нм с 0,10 до 0,54, что соответствовало скорости роста μ = 0,037 ч ^-1. Концентрация ацетата повышалась за этот период времени с 9,6 мг/л до 3304 мг/л и концентрация этанола повышалась с 2,2 мг/л до 399 мг/л.

Пример 6.

Культивирование Clostridium ljungdahlii в логарифмической фазе в присутствии синтез-газа, содержащего CO и кислород (65% CO)

C. ljungdahlii автотрофно культивировали в комплексной среде с синтез-газом, состоящим из СО, H₂ и CO₂, в присутствии кислорода, для получения ацетата и этанола.

Использовали комплексную среду, состоящую из 1 г/л NH₄Cl, 0,1 г/л KCl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,8 г/л NaCl, 0,1 г/л KH₂PO₄, 20 мг/л CaCl₂ x 2 H₂O, 20 г/л MES, 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,4 г/л L-цистеин-HCl, 0,4 г/л Na₂S x 9 H₂O, 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O, 8 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O, 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O, 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 0,2 мг/л Na₂SeO₄, 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 20 мкг/л биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 мкг/л пиридоксин-HCl, 50 мкг/л тиамин-HCl x H₂O, 50 мкг/л рибофлавина, 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 1 мкг/л витамина B₁₂, 50 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 50 мкг/л липоевой кислоты.

Автотрофное культивирование проводили в 500 мл среды в бутылях для сыворотки объемом 1 л, которые непрерывно газировали синтез-газом, состоящим из 65% CO, 4% H₂ и 15% CO₂ со скоростью 3,6 л/ч. Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 120 мин^-1. Значение pH не контролировали.

В начале эксперимента C. ljungdahlii инокулировали с OD₆₀₀ 0,1 автотрофно выращенными на H₂/CO₂ клетками. Таким образом, C. ljungdahlii выращивали в комплексной среде при непрерывном газировании синтез-газом, состоящим из 67% H₂ и 33% CO₂ со скоростью 3 л/ч в бутылях для сыворотки объемом 1 л с 500 мл комплексной среды. Описанную выше среду также использовали для данного культивирования. Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 150 мин^-1. Клетки собирали в логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,49 и pH 5,03 путем анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл вышеописанной среды. Эту суспензию клеток затем использовали для инокуляции в эксперименте по культивированию. Концентрацию газовой фазы монооксида углерода измеряли путем сбора образцов газовой фазы и автономного анализа с помощью газового хроматографа GC 6890N от Agilent Technologies Inc. с детектором по теплопроводности Концентрацию газовой фазы кислорода измеряли с помощью погружного зонда для следовых количеств кислорода от PreSens Precision Sensing GmbH. Концентрацию кислорода измеряли с помощью тушения флуоресценции, где степень тушения коррелирует с парциальным давлением кислорода в газовой фазе. Измерения кислорода указывали концентрацию 0,1 об.% O₂ в используемом синтез-газе.

Во время эксперимента брали образцы по 5 мл для определения OD₆₀₀, pH и концентрации продуктов. Последнее определяли с помощью количественного анализа с применением ¹H-ЯМР-спектроскопии.

После инокуляции C. ljungdahlii клетки начинали расти со скоростью роста µ = 0,062 ч^-1 и непрерывно продуцировали ацетат до концентрации 6,2 г/л через 94,5 часа. Одновременно с продуцированием ацетата получали этанол с более низкой скоростью по сравнению с получением ацетата до концентрации 1 г/л через 94,5 часа.

      Применение метода ЯМР-анализа Время процесса, ч pH OD600 Ацетат,
мг/л Этанол,
мг/л 0,0 6,15 0,10 18 н.о. 18,0 5,97 0,69 973 97 42,5 5,20 1,50     66,0 4,67 1,95 5368 966 94,5 4,54 1,77 6187 1070

Таблица 3. Результаты Примера 6 (н.о. = не обнаружено)

Пример 7.

Рост и получение ацетата у Clostridium ljungdahlii на синтез-газе с кислородом

Для биотрансформации водорода и диоксида углерода в уксусную кислоту культивировали гомоацетогенную бактерию Clostridium ljungdahlii на синтез-газе с кислородом. Все этапы культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных бутылях, которые можно герметично закрыть пробкой из бутилкаучука.

Для прекультуры в 500 мл среды (ATCC1754-среда: pH = 6,0; 20 г/л MES; 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,8 г/л NaCl; 1 г/л NH₄Cl; 0,1 г/л KCl; 0,1 г/л KH₂PO4; 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O; 0,02 г/л CaCl₂ x 2 H₂O; 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O; 8 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O; 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O; 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O; 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O; 0,2 мг/л Na₂SeO₄; 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 мкг/л d-биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 мкг/л пиридоксин-HCl; 50 мкг/л тиамин-HCl x H₂O; 50 мкг/л рибофлавина; 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотената; 1 мкг/л витамина B₁₂; 50 мкг/л п-аминобензоата; 50 мкг/л липоевой кислоты, примерно 67,5 мг/л NaOH) с дополнительными 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и 400 мг/л Na₂S x 9 H₂O инокулировали 5 мл замороженного исходного криоштамма C. ljungdahlii. Хемолитоавтотрофное культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной бутыли объемом 1 л при 37°C, 100 об./мин. и скорости вентиляции 3 л/ч предварительно смешанным газом с 67% H₂, 33% CO₂ во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 72 ч. Газ высвобождали в среду через барботер с размером пор 10 мкм, который был установлен в центральной части реакторов. Культивирование проводили без контроля значения pH.

После предварительного культивирования суспензию клеток центрифугировали (10 мин, 4200 об./мин.) и осадок промывали с 10 мл среды и снова центрифугировали. Для основной культуры необходимое количество промытых клеток из прекультуры, для OD_600нм 0,1, переносили в 200 мл среды с дополнительными 400 мг/л L-цистеингидрохлорида. Хемолитоавтотрофное культивирование проводили в устойчивых к давлению стеклянных бутылях объемом 250 мл при 37°C, 150 об./мин. и скорости вентиляции 1 л/ч предварительно смешанным газом с 65% H₂, 33% CO₂, 2%O₂ во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 47 ч. Газ высвобождали в среду через барботер с размером пор 10 мкм, который был установлен в центральной части реакторов. Культивирование проводили без контроля значения pH. Во время культивирования несколько образцов по 5 мл брали для определения OD_600нм, рН и образования продукта. Определение концентрации продуктов выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта использовали триметилсилилпропионат натрия (T (M) SP). Также растворенный кислород в культивационной среде измеряли в режиме реального времени с помощью кислородных погружных зондов (PSt6 с Oxy4Trace, Presens, Германия).

Во время периода культивирования клеточный рост наблюдали по увеличению OD_600нм с 0,11 до 0,32, которое коррелировало со скоростью роста µ = 0,022 ч ^-1. Концентрация ацетата увеличивалась с 8 мг/л до 91 мг/л, увеличение концентрации этанола не наблюдалось. За период культивирования концентрация растворенного кислорода варьировала от 0,06 до 0,15 мг/л.

В аналогичной технической обстановке с теми же параметрами (композиция среды, объем, бутыль, газ, скорость вентиляции, температура, частота встряхивания), но без клеток в среде измеряли концентрацию растворенного кислорода 0,50 мг/л.

Пример 8.

Рост и продуцирование ацетата у Clostridium ljungdahlii на синтез-газе с кислородом

Для биотрансформации водорода и диоксида углерода в уксусную кислоту культивировали гомоацетогенную бактерию Clostridium ljungdahlii на синтез-газе с кислородом. Все этапы культивирования проводили в анаэробных условиях в устойчивых к давлению стеклянных бутылях, которые можно герметично закрыть пробкой из бутилкаучука.

Для прекультуры в 500 мл среды (ATCC1754-среда: pH = 6,0; 20 г/л MES; 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,8 г/л NaCl; 1 г/л NH₄Cl; 0,1 г/л KCl; 0,1 г/л KH₂PO4; 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O; 0,02 г/л CaCl₂ x 2 H₂O; 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O; 8 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O; 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O; 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O; 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O; 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O; 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O; 0,2 мг/л Na₂SeO₄; 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O; 20 мкг/л d-биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 мкг/л пиридоксин-HCl; 50 мкг/л тиамин-HCl x H₂O; 50 мкг/л рибофлавина; 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотената; 1 мкг/л витамина B₁₂; 50 мкг/л п-аминобензоата; 50 мкг/л липоевой кислоты, примерно 67,5 мг/л NaOH) с дополнительными 400 мг/л L-цистеингидрохлорида и 400 мг/л Na₂S x 9 H₂O инокулировали 5 мл замороженного исходного криоштамма C. ljungdahlii. Хемолитоавтотрофное культивирование проводили в устойчивой к давлению стеклянной бутыли объемом 1 л при 37°C, 100 об./мин. и скорости вентиляции 3 л/ч предварительно смешанным газом с 67% H₂, 33% CO₂ во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 72 ч. Газ высвобождали в среду через барботер с размером пор 10 мкм, который был установлен в центральной части реакторов. Культивирование проводили без контроля значения pH.

После предварительного культивирования суспензию клеток центрифугировали (10 мин, 4200 об./мин.) и осадок промывали с 10 мл среды и снова центрифугировали. Для основной культуры необходимое количество промытых клеток из прекультуры, для OD_600нм 0,1, переносили в 200 мл среды с дополнительными 400 мг/л L-цистеингидрохлорида. Хемолитоавтотрофное культивирование проводили в устойчивых к давлению стеклянных бутылях объемом 250 мл при 37°C, 150 об./мин. и скорости вентиляции 1 л/ч предварительно смешанным газом с 66,85% H₂, 33% CO₂, 0,15%O₂ во встряхивателе на открытой водяной бане в течение 47 ч. Газ высвобождали в среду через барботер с размером пор 10 мкм, который был установлен в центральной части реакторов. Культивирование проводили без контроля значения pH. Во время культивирования несколько образцов по 5 мл взяли для определения OD_600нм, рН и образования продукта. Определение концентрации продуктов выполняли с помощью полуколичественного анализа с применением 1H-ЯМР-спектроскопии. В качестве внутреннего количественного стандарта использовали триметилсилилпропионат натрия (T (M) SP). Также растворенный кислород в культивационной среде измеряли в режиме реального времени с помощью кислородных погружных зондов (PSt6 с Oxy4Trace, Presens, Германия).

Во время периода культивирования клеточный рост наблюдали по увеличению OD_600нм с 0,10 до 0,45, которое коррелировало со скоростью роста µ = 0,032 ч ^-1. Концентрация ацетата повышалась с 7 мг/л до 2347 мг/л и концентрация этанола повышалась с 2 мг/л до 319 мг/л. За весь период культивирования концентрация растворенного кислорода составила 0,00 мг/л.

В аналогичной технической обстановке с теми же параметрами (композиция среды, объем, бутыль, газ, скорость вентиляции, температура, частота встряхивания), но без клеток в среде измеряли концентрацию растворенного кислорода 0,03 мг/л.

Пример 9.

Совместное культивирование Clostridium ljungdahlii и Clostridium kluyveri в комплексной среде с CO-содержащим газом (7 % CO)

C. ljungdahlii в качестве первого организма автотрофно культивировали в комплексной среде для получения ацетата и этанола. Затем через заданное время C. kluyveri в качестве второго организма инокулировали в тот же реактор для превращения ацетата и этанола в бутират и гексаноат. Затем в дальнейшем C. ljungdahlii превращал бутират в бутанол и гексаноат в гексанол.

Использовали комплексную среду для совместного культивирования обоих микроорганизмов, состоящую из 1 г/л NH₄Cl, 0,1 г/л KCl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,8 г/л NaCl, 0,1 г/л KH₂PO₄, 20 мг/л CaCl₂ x 2 H₂O, 20 г/л MES, 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,4 г/л L-цистеин-HCl, 0,4 г/л Na₂S x 9 H₂O, 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O, 8 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O, 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O, 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 0,2 мг/л Na₂SeO₄, 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 20 мкг/л биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 мкг/л пиридоксин-HCl, 50 мкг/л тиамин-HCl x H₂O, 50 мкг/л рибофлавина, 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 1 мкг/л витамина B₁₂, 50 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 50 мкг/л липоевой кислоты.

Автотрофное культивирование выполняли в 500 мл комплексной среды в бутыли для сыворотки объемом 1 л, которую непрерывно газировали синтез-газом, состоящим из 63 % H₂, 7 % CO₂ и 2 % CO, при скорости ~3,6 л/ч (≥0,5 ppm кислорода). Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 120 мин^-1. Значение pH во время этого эксперимента не контролировали.

В начале эксперимента C. ljungdahlii инокулировали с OD₆₀₀ 0,1 автотрофно выращенными клетками. Таким образом, C. ljungdahlii выращивали в описанной выше комплексной среде при непрерывном газировании синтез-газом, состоящим из 67% H₂ и 33% CO₂ со скоростью 3 л/ч в бутылях для сыворотки объемом 1 л с 500 мл комплексной среды. Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 150 мин^-1. Клетки собирали в стационарной фазе с OD₆₀₀ 0,89 и pH 4,52 с помощью анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл вышеописанной комплексной среды. Эту суспензию клеток затем использовали для инокуляции в эксперименте по совместному культивированию.

Параллельно с этим C. kluyveri выращивали гетеротрофно в 200 мл комплексной среды в бутылях для сыворотки объемом 500 мл на ацетате и этаноле. Использовали комплексную среду, состоящую из 0,25 г/л NH₄Cl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,31 г/л K₂HPO₄, 0,23 г/л KH₂PO₄, 2,5 г/л NaHCO₃, 1 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л K-ацетата, 20 г/л этанола, 0,25 г/л L-цистеин-HCl, 1,5 мг/л FeCl₂ x 4 H₂O, 70 мкг/л ZnCl₂ x 7 H₂O, 100 мкг/л MnCl₂ x 4 H₂O, 6 мкг/л борной кислоты, 190 мкг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мкг/л CuCl₂ x 6 H₂O, 24 мкг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 36 мкг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 3 мкг/л Na₂SeOO₃ x 5 H₂O, 4 мкг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 300 мкг/л пиридоксин-HCl, 200 мкг/л тиамин-HCl x H₂O. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 100 мин^-1. Клетки собирали в поздней логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,86 и pH 6,01 с помощью анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл вышеописанной комплексной среды. Эту суспензию клеток затем использовали для инокуляции в эксперименте по совместному культивированию через 49 часов прохождения эксперимента.

Во время эксперимента брали образцы по 5 мл для определения OD₆₀₀, pH и концентрации продуктов. Последнее определяли с помощью количественного анализа с применением ¹H-ЯМР-спектроскопии.

После инокуляции C. ljungdahlii клетки начинали расти и непрерывно продуцировали ацетат до концентрации ~ 1,3 г/л и этанол до концентрации ~0,8 г/л через 49 часов. Затем во время процесса 49 часов C. kluyveri инокулировали в реактор. В дальнейшей динамике эксперимента измеряли производство бутирата и гексаноата до концентрации каждого 0,6 г/л. Параллельно с продуцированием с помощью C. kluyveri бутирата и гексаноата C. ljungdahlii превращала бутират в бутанол до максимальной концентрации 472 мг/л бутанола и превращала гексаноат в гексанол до максимальной концентрации 630 мг/л гексанола.

Пример 10.

Совместное культивирование Clostridium autoethanogenum и Clostridium kluyveri в комплексной среде с CO-содержащим газом для получения высших спиртов, таких как гексанол и октанол (10% CO)

В этом примере C. autoethanogenum в качестве первого организма автотрофно культивировали в комплексной среде для получения ацетатя и этанола. Через заданное время C. kluyveri в качестве второго организма инокулировали в тот же реактор для превращения ацетата и этанола в бутират и гексаноат. Затем на следующем этапе C. autoethanogenum превращает бутират в бутанол и гексаноат в гексанол. Также наблюдали продуцирование октанола.

Использовали комплексную среду для совместного культивирования обоих микроорганизмов, состоящую из 1 г/л NH₄Cl, 0,1 г/л KCl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,8 г/л NaCl, 0,1 г/л KH₂PO₄, 20 мг/л CaCl₂ x 2 H₂O, 20 г/л MES, 1 г/л дрожжевого экстракта, 0,4 г/л L-цистеин-HCl, 0,4 г/л Na₂S x 9 H₂O, 20 мг/л нитрилотриуксусной кислоты, 10 мг/л MnSO₄ x H₂O, 8 мг/л (NH₄)₂Fe(SO₄)₂ x 6 H₂O, 2 мг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мг/л ZnSO₄ x 7 H₂O, 0,2 мг/л CuCl₂ x 2 H₂O, 0,2 мг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 0,2 мг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 0,2 мг/л Na₂SeO₄, 0,2 мг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 20 мкг/л биотина, 20 мкг/л фолиевой кислоты, 100 мкг/л пиридоксин-HCl, 50 мкг/л тиамин-HCl x H₂O, 50 мкг/л рибофлавина, 50 мкг/л никотиновой кислоты, 50 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 1 мкг/л витамина B₁₂, 50 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 50 мкг/л липоевой кислоты.

Автотрофное культивирование выполняли в 500 мл комплексной среды в бутыли для сыворотки объемом 1 л, которую непрерывно газировали синтез-газом, состоящим из 60 % H2, 30 % CO2 и 10 % CO, при скорости ~1,0 л/ч. Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 150 мин^-1. Значение pH довели один раз в течение эксперимента путем добавления анаэробного KOH.

В начале эксперимента C. autethanogenum инокулировали с OD₆₀₀ 0,1 автотрофно выращенными клетками. Таким образом, C. autethanogenum выращивали в описанной выше комплексной среде при непрерывном газировании синтез-газом, состоящим из 67% H₂ и 33% CO2 со скоростью 1 л/ч в бутылях для сыворотки объемом 1 л с 500 мл комплексной среды. Газ вводили в жидкую фазу с помощью диспергатора микропузырьков с диаметром пор 10 мкм. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 150 мин^-1. Клетки собирали в поздней логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,62 и pH 5,15 с помощью анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл вышеописанной комплексной среды. Эту суспензию клеток затем использовали для инокуляции в эксперименте по совместному культивированию. В поздней фазе эксперимента C. autethanogenum снова инокулировали в проходящий эксперимент с OD₆₀₀ 0,2 из предварительной культуры, выращенной в таких же условиях, как описано выше. Клетки собирали в поздней логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,55 и pH 5,12 с помощью анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл среды, анаэробно взятой из проходящего эксперимента. Эту суспензию клеток затем использовали, чтобы снова перенести клетки в эксперимент по совместному культивированию через 74 часа прохождения эксперимента.

Параллельно с этим C. kluyveri выращивали гетеротрофно в 200 мл комплексной среды в бутылях для сыворотки объемом 500 мл на ацетате и этаноле. Использовали комплексную среду, состоящую из 0,25 г/л NH₄Cl, 0,2 г/л MgSO₄ x 7 H₂O, 0,31 г/л K₂HPO₄, 0,23 г/л KH₂PO₄, 2,5 г/л NaHCO₃, 1 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л K-ацетата, 20 г/л этанола, 0,25 г/л L-цистеин-HCl, 1,5 мг/л FeCl₂ x 4 H₂O, 70 мкг/л ZnCl₂ x 7 H₂O, 100 мкг/л MnCl₂ x 4 H₂O, 6 мкг/л борной кислоты, 190 мкг/л CoCl₂ x 6 H₂O, 2 мкг/л CuCl₂ x 6 H₂O, 24 мкг/л NiCl₂ x 6 H₂O, 36 мкг/л Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 3 мкг/л Na₂SeOO₃ x 5 H₂O, 4 мкг/л Na₂WO₄ x 2 H₂O, 100 мкг/л витамина B12, 80 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 20 мкг/л биотина, 200 мкг/л никотиновой кислоты, 100 мкг/л Ca-пантотеновой кислоты, 300 мкг/л пиридоксин-HCl, 200 мкг/л тиамин-HCl x H₂O. Бутыль для сыворотки непрерывно встряхивали на открытой водяной бане Innova 3100 от New Brunswick Scientific при 37 °C и скорости встряхивания 100 мин^-1. Клетки собирали в поздней логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,86 и pH 6,01 с помощью анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл среды, анаэробно взятой их проходящего эксперимента. Эту суспензию клеток затем использовали, чтобы перенести клетки в эксперимент по совместному культивированию через 74 часа прохождения эксперимента. В поздней фазе эксперимента C. kluyveri снова инокулировали в проходящий эксперимент с OD₆₀₀ 0,15 из предварительной культуры, выращенной в таких же условиях, как описано выше. Клетки собирали в логарифмической фазе с OD₆₀₀ 0,38 и pH 6,67 путем анаэробного центрифугирования (4500 мин^-1, 4300 g, 20°C, 10 мин). Удаляли надосадочную жидкость, а осадок снова суспендировали в 10 мл среды, анаэробно взятой из проходящего эксперимента. Эту суспензию клеток затем использовали, чтобы снова перенести клетки в эксперимент по совместному культивированию через 74 часа прохождения эксперимента.

Во время эксперимента брали образцы по 5 мл для определения OD₆₀₀, pH и концентрации продуктов. Последнее определяли с помощью количественного анализа с применением ¹H-ЯМР-спектроскопии.

После инокуляции C. autoethanogenum клетки начинали расти и продуцировали ацетат до концентрации ~ 2,2 г/л до концентрации ~0,5 г/л через 23 часа. В этот момент времени С. kluyveri инокулировали в проходящий эксперимент и в дальнейшем получали бутират и гексаноат. Бутират и гексаноат затем восстановили до соответствующих спиртов с помощью C. autoethanogenum. Через 69 часов прохождения эксперимента pH повышали с pH 4,74 до pH 6,01 путем добавления анаэробного KOH. После чего 50 мг/л L-цистеин HCl добавляли в среду и клетки как C. autoethanogenum, так и C. kluyveri инокулировали в проходящие эксперименты. Через 140 часов культивирования получали 650 мг/л бутанола, 220 мг/л гексанола и 4,5 мг/л октанола.

ССЫЛКИ

Baffert C. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 2096–2099

Barker H.A., 1949, J. Biol. Chem. 180. 1085-1093

Bartsch R.G., 1961, Archives of Biochemistry and biophysics, 92: 122-132

Bornstein B.T. et al., 1948 J Bact, 55:223

Bornstein B.T. et al., 1948 J Biol Chem, 172: 659

Brioukhanov, 2007, Applied Biochemistry and Microbiology, 43 (6): 567-582

Chowdhury N.P., 2014, J.Biol.Chem, 289(8):5145-57

Cotter J.L. (2009) Enzyme and Microbial Technology 44 281–288,

Ding H. et al., 2010, Bioresour Technol, 101(24):9550-9

Drake et al., 2004. Strict and Facultative Anaerobes: Medical and Environmental Aspects. pp. 251-281, Horizon Scientific Press, United Kingdom

Drake & Kusel, 2005 Acetogenic clostridia. В: Dürre P. (ed.), Handbook on Clostridia, pp. 719-746. CRC Press, Boca Raton, Florida.

Drake et al., 2006, Acetogenic prokaryotes. В: Balows A., Trüper H.G., Dworkin M., Harder W. and

Gerhardt P. et al. (ed) American Society for Microbiology, Washington, DC. p. 248-277

Fuchs G., Schlegel H.-G. (2007) Allgemeine Mikrobiologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart.

Henstra A.M., 2007 Current Opinion in Biotechnology, 18:200–206

Hillmer P., 1972; FEBS Letters; 21(3):351-354

Imlay 2006, Molecular Microbiology, 59(4);1073-1082

Koch A.L. 1994. “Growth Measurement” В: Methods for General and Molecular Bacteriology

Köpke Michael 2009, Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Ulm

Lan E.I., Energy Environ. Sci., 6:2672

Li F., 2008, Journal of Bacteriology, 190 (3): 843-850

Lurz R., 1979; Arch Microbiol; 120: 255-262

Madan V.K., 1972, Eur. J. Biochem.,32;51-56

Najafpour G., 2006 Enzyme and Microbial Technology 38 (2006) 223–228

Perez J.M. et al., Biotechnology and Bioengineering, 2012, Vol. xxx, No. xxx

Schleifer KH (eds). The Prokaryotes, 3rd edn. Springer: New York, pp 354–420.

Shuler M.L., Kargi F. 1992. Bioprocess Engineering. Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ.

Sliwkowski M.X., 1984, Analytical Biochemistry, 141:344-347

Smith L.T., 1976, Analytical biochemistry, 95:2-7

Smith L.T., 1980, Archives of biochemistry and biophysics, 203 (2): 663-675

Stadtman E.R., 1950, Fed. Proc., 9, 233

Stadtman E.R., 1953, J. Biol. Chem.;202(2):873-90

Steinbusch, 2011, Energy Environ. Sci., 4, 216-224

Thauer R.K. et al., Eur.K.Biochem., 1974, 42, 447-452

Van Eerten-Jansen M. C. A. A., 2013, ACS Sustainable Chemistry & Engineering 1 (5), 513-518

Wang S., 2010, Journal of Bacteriology, 192 (19): 5115-5123

Winzer K. et al., 1997 Micrоbiology 143:3279-3286

Wood, 1991 Life with CO or CO2 and H2 as a source of carbon and energy. FASEB J. 5:156-163

Younesi H. et al. Biochemical Engineering Journal 27 (2005) 110–119

Zhang Y., 2013, Bioprocess. Biosyst. Eng.; 36(12):1897-1904

Заявка на патент США № 2007/0275447, заявка на патент США № 2008/0057554, WO 98/00558, WO 00/68407

Изобретения относятся к биотехнологии. Предложены реакционная смесь для получения по меньшей мере одного высшего спирта в водной среде, способ получения по меньшей мере одного высшего спирта в водной среде, применение указанной реакционной среды для получения по меньшей мере одного высшего спирта. Реакционная смесь содержит смешанную культуру ацетогенного микроорганизма, выбранного из Clostridium ljungdahlii и Clostridium autoethanogenum, и Clostridium kluyveri в водной среде, содержащей газообразный монооксид углерода. Способ предусматривает получение по меньшей мере одного высшего спирта в водной среде, содержащей указанную реакционную смесь. Изобретения обеспечивают одноэтапное получение высших спиртов в присутствии монооксида углерода. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 табл., 10 пр.

1. Реакционная смесь для получения по меньшей мере одного высшего спирта в водной среде, содержащая смешанную культуру первого и второго микроорганизма в водной среде, содержащей газообразный монооксид углерода, где

- первый микроорганизм представляет собой ацетогенный микроорганизм, способный превращать источник углерода в ацетат и/или этанол, и выбран из Clostridium ljungdahlii и Clostridium autoethanogenum, и

- второй микроорганизм, способный превращать ацетат и/или этанол с образованием кислоты, представляет собой Clostridium kluyveri,

где первый микроорганизм дополнительно способен превращать кислоту в соответствующий высший спирт, и высший спирт содержит по меньшей мере 6 атомов углерода.

2. Смесь по п. 1, где первый микроорганизм представляет собой Clostridium ljungdahlii.

3. Смесь по п. 1, где высший спирт представляет собой С₆-С₈спирт.

4. Смесь по п. 1, где источник углерода содержит по меньшей мере 2% по объему газообразного монооксида углерода относительно объема источника углерода.

5. Смесь по п. 1, где источник углерода содержит 7%-65% по объему газообразного монооксида углерода.

6. Смесь по п. 1, где водная среда дополнительно содержит свободный кислород.

7. Смесь по п. 6, где смесь содержит ацетогенные бактерии в логарифмической фазе и ацетогенные бактерии в стационарной фазе.

8. Смесь по п. 7, где первый ацетогенный микроорганизм в экспоненциальной фазе роста характеризуется скоростью роста не более 0,062 ч^-1.

9. Смесь по п. 7, где первый ацетогенный микроорганизм в экспоненциальной фазе роста характеризуется OD₆₀₀ от 0,01 до 1,95.

10. Способ получения по меньшей мере одного высшего спирта в водной среде, содержащей реакционную смесь, содержащую первый и второй микроорганизм, где

- первый микроорганизм представляет собой ацетогенный микроорганизм, способный превращать источник углерода, содержащий СО, в ацетат и/или этанол, и выбран из Clostridium ljungdahlii и Clostridium autoethanogenum, и

- второй микроорганизм, способный превращать ацетат и/или этанол с образованием кислоты, представляет собой Clostridium kluyveri,

где первый микроорганизм дополнительно способен превращать кислоту в соответствующий высший спирт, содержащий по меньшей мере 6 атомов углерода.

11. Способ по п. 10, где источник углерода содержит 7%-65% по объему газообразного монооксида углерода.

12. Способ по п. 10, где высший спирт выбран из группы, состоящей из 1-гексанола, 1-октанола и 1-гептанола.

13. Способ по п. 10, где реакционная смесь соответствует п. 1.

14. Применение реакционной смеси по п. 1 для получения по меньшей мере одного высшего спирта, содержащего по меньшей мере 6 атомов углерода.