Способ получения обогащенной тромбоцитами плазмы методом двукратного центрифугирования Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к травматологии и ортопедии и может быть использовано для лечения различных заболеваний и травм костной и хрящевой ткани при помощи обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП).

Тромбоциты человека содержат большое количество различных факторов роста, факторы ангиогенеза, цитокины, принимающие непосредственное участие в репаративных и регенеративных процессах организма. Методика получения обогащенной тромбоцитами плазмы является инструментально и технически простой, использование аутологичной ОТП в клинической практике практически не имеет абсолютных противопоказаний. По мнению многих исследователей, для достижения клинического эффекта концентрация тромбоцитов в готовой ОТП должна составлять не меньше 1000 тыс./мкл [1, 2, 3]. Существуют различные протоколы получения ОТП, которые позволяют получить необходимую концентрацию тромбоцитов, однако, при этом не учитываются структурные и функциональные характеристики полученного концентрата. Центрифугирование может нарушать нативную структуру тромбоцитов, вызывать их спонтанную агрегацию, что в конечном итоге может приводить к потере биологического потенциала тромбоцитов. Кроме того центрифугирование влияет на объем полученной плазмы, количество которой также напрямую зависит от физиологических данных пациента.

Известен способ получения обогащенной тромбоцитами плазмы при помощи системы Artrex АСР с двойным шприцем, представляющий из себя проведение однократного центрифугирования 15 мл цельной крови при 1500 оборотах в минуту, на протяжении 5 минут [4]. Данная система имеет, ряд весомых преимуществ:

- короткое время приготовления обогащенной тромбоцитами плазмы равное 5 минутам;

- снижение риска инфекционных осложнений за счет наличия закрытой системы состоящей из двух шприцев;

- отсутствие необходимости повторного центрифугирования.

Однако данный способ, несмотря на все свои преимущества, имеет ряд существенных недостатков:

- высокая цена;

- малое общее количество цельной крови (15 мл.), используемое для получения ОТП;

- малое количество плазмы(4-5 мл.) получаемое из 15 мл цельной крови;

- наличие в полученной плазме как фракции плазмы богатой тромбоцитами, так и бедной тромбоцитами;

- низкая концентрация тромбоцитов в полученной плазме, за счет отсутствия возможности дополнительного концентрирования тромбоцитов в плазме за счет повторного центрифугирования;

- наличие лейкоцитов в полученной плазме;

- конструктивные особенности системы, не позволяющие работать с центрифугами различных производителей;

- предлагаемый режим центрифугирования, ориентированный на скорость вращения выраженное в оборотах в минуту, а не на центробежное ускорение (g).

Известен способ получения обогащенной тромбоцитами плазмы путем двукратного центрифугирования, при котором первое центрифугирование цельной крови необходимое для получения первичной плазмы проходит при центробежном ускорении в 300g, на протяжении 5 минут. Второе центрифугирование, после забора первичной плазмы и удаления слоя эритроцитов с лейкоцитами, необходимое для концентрирования тромбоцитов проходит при 700g на протяжении 17 мин [5].

Данный способ имеет ряд весомых преимуществ:

- низкая цена;

- возможность получения плазмы с высокой концентрацией тромбоцитов за счет проведения повторного центрифугирования;

- возможность регулировать концентрацию тромбоцитов в плазме;

- возможность получения плазмы с более низкими концентрациями тромбоцитов;

- возможность проведения гематологического анализа полученной плазмы непосредственно перед введением пациенту;

- конструктивные особенности пробирок позволяющие работать с большинством из использующихся центрифуг в лечебных учреждениях.

Этот способ принят за прототип.

Однако и этот способ, имеет ряд недостатков:

- длительное общее время центрифугирования, составляющее 22 минуты;

- в виду наличия открытой системы необходимость работы в жестких условиях асептики и антисептики;

- необходимость в использовании дополнительного инструментария для забора и переноса первичной плазмы в дополнительные пробирки с повторным центрифугированием последних;

- малое количество времени центрифугирования на первом этапе необходимого для получения большего объема первичной плазмы;

- наличие некоторого количества лейкоцитов в плазме.

Задачей изобретения является повышение эффективности получения обогащенной тромбоцитами плазмы за счет оригинального способа двукратного центрифугирования.

Это достигается за счет применения следующего протокола центрифугирование. Первое центрифугирование проводится при 300g до полного оседания эритроцитов на дно пробирки с образованием видимого слоя лейкоцитов по верхней границе эритроцитарной фракции (в среднем 10 мин). Затем после забора первичной плазмы с тромбоцитами, избегая забор лейкоцитов, и переноса ее в стерильную пробирку последняя подвергается повторному центрифугированию при 700g в течение времени (в среднем 10 мин.) за которое осуществится плотное прижатие тромбоцитов ко дну пробирки. Надосадок, содержащий плазму без тромбоцитов, и с низким их содержанием удаляется. Находящаяся на дне пробирки плазма с высоким содержанием тромбоцитов собирается в шприц, подвергается ресуспендированию и используется по назначению.

Технический результат состоит в:

- возможности получения большего объема плазмы за счет увеличения времени первичного центрифугирования;

- меньшего количества лейкоцитов в плазме.

Необходимо отметить, что при использовании данного протокола центрифугирования количество тромбоцитов находящихся на стадии покоя (не подвергшихся агрегации в результате центрифугирования) и их общее количество остается в пределах эффективности.

Способ осуществляется следующим образом. Венозную кровь забирают из кубитальной вены в 4 вакуумные пробирки объемом 9 мл с антикоагулянтом цитратом натрия. Пробирки подвергают первому центрифугированию при 300g в течение 10 минут. После первого центрифугирования весь объем супернатантной плазмы с тромбоцитами (около 15-16 мл в зависимости от физиологических данных пациента) без лейкоцитарного венчика по верхнему краю эритроцитарной массы, из всех пробирок при помощи стерильного шприца со спинальной иглой 20G переносят в 4 новые стерильные пробирки без наполнителя. Проводят второе центрифугирование пробирок с плазмой при 700g в течение 10 минут. При помощи новой стерильной спинальной иглы удаляют из пробирок верхний слой плазмы с низким содержанием тромбоцитов в отдельные стерильные шприцы, оставляя плазму с высоким содержанием тромбоцитов - ОТП объемом 1 мл с каждой пробирки. В результате из 36 мл цельной крови получаем 4 мл ОТП. Производится забор ОТП из каждой пробирки в новый стерильный шприц. Проводится тщательное ресуспендирование плазмы с тромбоцитами в шприце. При необходимости забирается аликвота плазмы для проведения качественного анализа методом оценки морфофункционального статуса тромбоцитов и гематологического анализа. У шприца содержащего ОТП производится замена иглы на новую стерильную. Непосредственно выполняется введение ОТП в область применения. При необходимости, возможно, использовать плазму с низким содержанием тромбоцитов забранную в стерильные шприцы, с целью обкалывания места повреждения по периферии.

Преимуществом данного метода является возможность увеличить объем первичной плазмы за счет более продолжительного времени первичного центрифугирования и соответственно увеличить количество как плазмы с высоким содержанием тромбоцитов, так и с низким. Повышенная вязкость крови и плазмы отмечается у пациентов с артериальной гипертензией, с массивной кровопотерей, обширными ожогами, отравлениями, при многих патологиях, сопровождающихся диспротеинемией. Кроме того, даже у здоровых людей время выделения плазмы может быть увеличено из-за низких значений СОЭ. Несмотря на, сокращение времени повторного центрифугирования возможно получить плазму с тромбоцитами не уступающую по своему составу плазме полученной при другом известном режиме 300g-5 мин/700g-l7 мин. Кроме того увеличенное время первичного центрифугирования позволяет плотнее прижать лейкоциты к границе эритроцитарной фракции, что при правильном заборе первичной плазмы обеспечивает отсутствие их в последней. Лейкоциты содержат большое число провоспалительных цитокинов, которые в комбинации с тромбоцитарными компонентами могут усиливать многие патофизиологические реакции, в связи, с чем большинство исследователей рекомендуют получать ОТП без лейкоцитов [6].

Литература

1. Etulain, J., Mena, НА., Meiss, R.P. An optimised protocol for platelet-rich plasma preparation to improve its angiogenic and regenerative properties. Sci Rep.2018;8(1):1513. PMID: 29367608 https://doi: 10.1038/s41598-018-19419-6

2. Degen RM, Bernard JA, Oliver KS, Dines JS. Commercial Separation Systems Designed for Preparation of Platelet-Rich Plasma Yield Differences in Cellular Composition. HSS J. 2017;13(l):75-80. PMID: 28167878 https://doi: 10.1007/s11420-016-9519-3

3. Joly A, Louisy A, Laure B, Goga D. Optimized centrifugation preparation of the platelet rich plasma: Literature review. J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 2020; 121 (2): 150-154. PMID: 31299341 https://doi:10.1016/j.jormas.2019.07.001

4. Borowski A, Synder M, Grzegorzewski A, Marciniak M, Sibinski M. Comparison Analysis of Autologous Conditioned Plasma. Ortop Traumatol Rehabil. 2016;18(6):563-568. doi: 10.5604/15093492.1230542

5. Amable, P. R., Carias, R. В., Teixeira, M. V., Cruz Pacheco, I., do Amaral, R. J., Granjeiro, J. M, et al. Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine: optimization and quantification of cytokines and growth factors. Stem Cell Res Ther. 2013;4(3):67. PMID: 23759113 https://doi.10.1186/scrt218

6. Patel S, Dhillon MS, Aggarwal S, Marwaha N, Jain A. Treatment with platelet-rich plasma is more effective than placebo for knee osteoarthritis: a prospective, double-blind, randomized trial. Am J Sports Med. 2013;41(2):356-364. PMID: 23299850 https://doi:10.1177/0363546512471299.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть применено для получения обогащенной тромбоцитами плазмы с целью лечения различных патологий костной и хрящевой ткани. Способ осуществляют путем двукратного центрифугирования при центробежном ускорении в 300 g при первом и 700 g при втором. При этом первое центрифугирование проводят 10 мин до прижатия лейкоцитов к эритроцитам на дне пробирки, второе – 10 минут до получения концентрата тромбоцитов на дне пробирки. Способ позволяет получить большее количество плазмы по объему за счет более длительного времени центрифугирования, при этом снижается количество лейкоцитов в конечном продукте за счет их более плотного прижатия к фракции эритроцитов в момент первичного центрифугирования.

Способ получения обогащенной тромбоцитами плазмы путем двукратного центрифугирования при центробежном ускорении в 300 g при первом и 700 g при втором, отличающийся тем, что первое центрифугирование проводят 10 минут до прижатия лейкоцитов к эритроцитам на дне пробирки, второе - 10 минут до получения концентрата тромбоцитов на дне пробирки.