Композиция, подавляющая экспрессию генов интерлейкина-4 и интерлейкина-13, для терапии аллергического ринита Российский патент 2020 года по МПК A61K38/00 A61P11/06 A61K47/65 

Описание патента на изобретение RU2710895C1

Изобретение относится к области генной инженерии и биохимии, а также к медицине и фармацевтике. Изобретение может быть использовано для лечения и профилактики аллергического ринита с использованием композиции, которая содержит комплекс молекул миРНК, подавляющих экспрессию генов IL-4 и IL-13 и пептида b-LTP в основной форме.

Аллергический ринит (АР) - в широком смысле определяется как воспаление слизистой оболочки носовой полости. АР проявляется следующими основными симптомами [Kakli, Riley, 2016]: ринорея, чихание, зуд, заложенность носа, характерное дыхание ртом, сопение, храп, изменение голоса, снижение обоняния (на поздних стадиях ринита) и т.д. Основными этиологическими факторами АР являются: пыльца растений, бытовые аллергены, эпидермальные, аллергены тараканов и споры плесневых грибов, обитающих внутри помещений, пищевые аллергены. АР - это достаточно распространенное заболевание, затрагивающее в разных странах до 40% населения. Распространенность аллергического ринита среди населения России в настоящее время оценивается в 10-30% [Hosoya и др., 2011]. АР является фактором риска развития бронхиальной астмы (БА). По данным АР наносит экономический ущерб экономикам стран мира. Европе прямые затраты, связанные с АР, ежегодно составляют 1-1,5 млрд. евро, а непрямые затраты - 1,5-2 млрд. евро. При оценке социально-экономического значения болезни необходимо учитывать ассоциации АР с другими заболеваниями, в том числе бронхиальной астмой, синуситами, средним отитом, инфекциями дыхательных путей [6].

В последние годы стало очевидным, что в патогенезе АР ключевую роль играют Th2-клетки; они индуцируют и поддерживают аллергическое воспаление. Патофизиологические аспекты аллергических расстройств, таких, как продукция IgE-антител; рекрутирование и активация тучных клеток; базофилов и эозинофилов; гиперсекреция слизи; субэпителиальный фиброз; и ремоделирование тканей напрямую связаны с Th2-клетками, продуцирующими ряд провоспалительных цитокинов: IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13 [9]. Эти цитокины опосредуют несколько эффекторных функций. В частности IL-4 и IL-13 инициируют дифференциацию В-клеток в IgE-продуцирующие плазматические клетки, осуществляют рекрутирование эозинофилов, способствуют гиперчувствительности дыхательных путей и гиперсекреции слизи [7, 8].

Сходства биологических свойств IL-4 и IL-13 также обусловлены тем, что они имеют общую цепь в индивидуальных рецепторных комплексах. Мембраносвязанный IL-13Rα1 обладает низким сродством к IL-13, но при димеризации с IL-4Rα приобретает высокую аффинность к IL-13. Второй рецептор - IL-13Rα2 - обладает высоким сродством к IL-13 и легко с ним связывается, но механизм передачи сигнала до конца не выяснен. В противоположность этому, IL-4 связывается с двумя различными типами рецепторных комплексов: первый тип состоит из цепи IL-4Rα и γс-цепи, а второй - из цепей IL-4Rα и IL-13Rα1 [Gour, Wills-Karp, 2015; Ranasinghe и др., 2014]. Таким образом, продукция цитокинов IL-4 и IL-13 важна как при ранней, так и при поздней фазе аллергического ответа, что делает их перспективными мишенями для разработки новых способов лечения аллергических заболевания и АР в частности.

Подходы к терапии АР включают, в основном, мероприятия по элиминации причинно-значимого аллергена, фармакотерапию [Greiwe, Bernstein, 2016; Juel-Berg и др., 2017] и аллерген-специфическую иммунотерапию [Juel-Berg и др., 2017; Kim и др., 2014; Passalacqua, Canonica, Bagnasco, 2016]. В большинстве случаев полностью исключить контакт с аллергеном невозможно. АСИТ применяется для лечения респираторной аллергии с 1911 г [Ring, Gutermuth, 2011]. На современном этапе развития аллергологии, АСИТ признана лечением первой линии для пациентов с IgE-зависимыми атопическими [ и др., 2013]. По данным многочисленных исследований, положительный терапевтический эффект АСИТ достигается в 80-90% случаев и более [Bidad, Nicknam, Farid, 2011; Narkus и др., 2013]. Однако проведение АСИТ сопряжено с определенным риском развития побочных реакций. В ходе терапии в ответ на введение аллергена могут возникнуть нежелательные побочные эффекты в виде местных или системных реакций. В случае проведения инъекционных методов АСИТ местные реакции отмечаются у большинства больных (80%) [Focke-Tejkl, Valenta, 2012]. Фармакотерапия АР располагает в настоящее время несколькими группами противоаллергических лекарственных препаратов, которыми можно эффективно контролировать симптомы заболевания: антигистаминные препараты, интраназальные глюкокортикостероиды, стабилизаторы мембран тучных клеток (препараты кромоглициевой кислоты), сосудосуживающие препараты (деконгестанты), антихолинергические средства, антилейкотриеновые препараты [Melvin, Patel, 2011; Simoens, Laekeman, 2009]. Тем не менее вышеописанных способе лечение АР недостаточно, о чем свидетельствует продолжающийся рост заболеваемости.

С учетом ведущей роль IL-4 и IL-13 в патогенезе АР появляются разработки т.н. таргетных препаратов, которые специфически блокируют активность выбранных биомишеней. Первоначально для подавления экспрессии IL-4 и IL-13 использовались моноклональные антитела, которые связываются с данными цитокинами и тем самым блокируют их активность, также используются т.н. мутеины (мутантные белки указанных цитокинов), которые связываются с рецептором, но не индуцирует передачу сигнала. Кроме того, используются растворимые рецепторы для IL-4 и IL-13, которые связываются со своими лигандами и предотвращют взаимодействие с полноценным рецептором на поверхности клетки. Все эти походы регулируют экспрессию IL-4 и IL-13 на белковом уровне, а большинство из них не оправдали ожиданий в клинических исследованиях.

Альтернативой использованию моноклональных антител служит стратегия применения антисмысловых технологий. Под антисмысловыми технологиями понимают способы регуляции активности генов-мишеней на посттранскрипционном уровне. Недавнее открытие механизма РНК-интерференции (РНКи; RNAi) дало новые возможности для регуляции экспрессии генов, в том числе и генов, участвующих в патогенезе АР. РНКи - это РНК-зависимый механизм регуляции экспрессии генов, в котором двухцепочечные молекулы миРНК ингибируют экспрессию генов с комплементарной нуклеотидной последовательностью. Таким образом, введение в клетки и ткани искусственных миРНК необходимого размера (21 пн) и с необходимой последовательностью позволяет осуществить специфическое подавление экспрессии гена-мишени. При этом экспрессия других генов с иной нуклеотидной последовательностью остается неизменной [Joo и др., 2014].

Одна из ключевых проблем, препятствующих внедрению метода РНК-интерференции в клиническую практику - эффективная доставка молекул миРНК в клетки. Из имеющихся способов, вирусные векторные системы являются наиболее эффективными транспортными средствами доставки нуклеиновых кислот. Однако, в этой сфере за последние 15 лет, реализация их в клинической практике осложняется, что связано с опасениями насчет возможности мутагенеза вирусного генома, активации онкогенов и высокой иммуногенности таких векторов.

В качестве альтернативных невирусных векторов предложено применять разнообразные поликатионные соединения, способные образовывать комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами (НК) и конденсировать их в компактные наноструктуры. Комплексование, с одной стороны, обеспечивает защиту НК от.действия нуклеаз, а с другой, способствует их транслокации через клеточные мембраны, обычно, путем эндоцитоза. В качестве НК-связывающих агентов могут выступать катионные синтетические полимеры (например, полиэтиленимины), основные полиаминокислоты (полилизины, полиаргинины), хитозаны, катионные пептиды различного состава (например, пептид из белка ТАТ-ВИЧ), и липосомы. В настоящее время липосомы, используемые в качестве носителей для трансфекции клеток высоко токсичны и обладают плохой стабильностью, все это делает их малоприменимыми в практическом плане в медицине (in vivo). Всех этих недостатков лишены позитивно заряженные пептиды, которые также проявляют высокую транспортную активность, при этом малотоксичны и стабильны при хранении.

Основываясь на знании о ведущей роли IL-4/IL-13 в запуске синтеза IgE и развитии аллергического воспаления при АР представляется целесообразным осуществить блокаду генов, ответственных за синтез этих интерлейкинов, с помощью новейшей методологии интерференции РНК. Была создана композиция для терапии аллергического ринита, которая в своем составе содержит комплекс катионного дендримерного пептида b-LTP в основной форме и молекул миРНК (siIL4-153 и siIL13-395) в массовом соотношении 12,5/1. Молекулы миРНК состава 5- AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt -3 (для siIL4-153) и 5- GGACCUGCUCUUACAUUUAtt -3 (для siIL 13-395). Катионный дендримерный пептид b-LTP в основной форме, отвечающий химическому строению (Arg)8 (Lys)4 (Lys)2 Lys-Ala-Cys-NH2.

В патенте № US 20160207995 A1 описаны антитела против IL-4 и биспецифические антитела и способы их использования. Использование антител против IL-4 уступает применению композиции для терапии аллергического ринита потому, что последний нацелен не только против IL-4, но и против IL-13 одновременно.

В патенте № WO 2018011405 A1 описывается применение неагонистического полипептидного лиганда, специфически реагирующего на IL-13Ral, при лечении или профилактике состояния, выбранного из нейтропении, аллергического воспаления, бактериемии и сепсиса. Композиция выгодно отличается от пептидного лиганда первый направлен не на рецептор к данному интерлейкину, а на мРНК самого цитокина, т.е. на более ранний этап активации провоспалительного каскада.

В патенте № US 20160075777 A1 описаны биспецифические антитела против IL-4 / IL-13 и систему буферизации, в которой рН составляет около 7, с низкой концентрацией соли в составе, чтобы уменьшить ионную силу препарата. Авторы патента указывают, что препарат может использоваться для лечения различных заболеваний, в том числе и аллергической природы. В отличие от данного изобретения разрабатываемая композиция направлена не на белковые продукты IL-4 / IL-13, а на молекулы мРНК, кодирующие эти белки. Блокировка мРНК позволяет достигать более выраженного эффекта, поскольку с одной молекулы мРНК может синтезироваться до 100 белков.

В патенте № US 20150225479 A1 описаны стабильные фармацевтические композиции антител, включая жидкие составы и лиофилизированные препараты, в частности биспецифические анти-IL-4 / анти-IL-13 антитела, полиаминокислоту, состоящую из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты или обеих кислот сразу, с добавлением витамина Е. также, в составе имеется криопротектор и буферизующая система, в которой рН композиции составляет около 7, с концентрацией соли 50 мМ или менее. Данный патент, также, включает способы получения таких композиций. По предположению заявителя эти пептиды могут быть использованы в медицине в качестве антагонистов для IL-4/IL-13 при терапии аллергопатологий. Как и в предыдущем изобретении биспецифические анти-IL-4 / анти-IL-13 антитела уступают композиции, так как молекулы миРНК (присутствующие в составе МРК-4-13) инициируют деградацию мРНК генов-мишеней, а не нейтрализуют их белковые продукты. Кроме того, синтетические молекул миРНК дешевле в получении, чем антитела, которые продуцируются гибрид омами.

В патенте № US 20170218376 A1 представлены асимметричные комплексы РНК, такие как asiRNAs и проникающие в клетку asiRNAs, которые ингибируют экспрессию IL4Rα, TRPA1 и/или F2RL1. Заявители патента утверждают о возможности применять данные препараты для лечения заболеваний аллергической природы, приводя в пример атопический дерматит и астму.

В патенте № WO 2005085443 A2 описаны композиции, содержащие один или несколько агентов RNAi (например, siRNAs, shRNAs или RNAi-векторы) для лечения состояний и заболеваний с IgE-опосредованной гиперчувствительностью, а также систем для определения эффективных агентов RNAi. Композиции подходят для лечения аллергического ринита и/или астмы. Агент RNAi нацелен на транскрипт, который кодирует белок, выбранный из: FC, RIα, цепи FC & epsiv; RIβ, c-Kit, Lyn, Syk, ICOS, OX40L, CD40, CD80, CD86, RelA, RelB, лиганд 4-IBB, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, CD83, SLAM, обычную цепь F и COX-2. Некоторые варианты запатентованного препарата, содержащие агент RNAi, доставляются аэрозольным путем.

Композиции, содержащие агенты RNAi, указанные в патентах № US 20170218376 A1 и № WO 2005085443 A2 уступают заявленному препарату МРК-4-13 по причинам: а) вводящие в состав композиции молекулы миРНК имеют иную, уникальную нуклеотидную последовательность, позволяющую подавлять активность целевых генов до 80%; б) в составе композиции помимо молекул миРНК присутствует носитель -катионный дендримерный пептид b-LTP, способствующий проникновению молекул миРНК внутрь клеток-мишеней, что усиливает эффект in vivo.

В патенте № US 15335408 представлен блочный сополимер хитозана и полиэтиленгликоля, модифицированный транс-активатором транскриптазы ВИЧ 1 («Тат»); предполагается, что сформированные из этого материала наночастицы могут выступать в качестве невирусной системы доставки нуклеиновых кислот в клетки. Перечисленные в данном изобретении высокомолекулярные системы доставки уступают носителю b-LTP (используемый в составе композиции) в сложности изготовления: включают стадию N-ацилирования хитозана в среде ДМФА, что, однако, требует дополнительных процедур (растворение хитозана в кислоте, смешение с ДМФА, удаление кислоты); ацилирование ангидридом в присутствии органического основания может затрагивать гидроксильные группы хитозана, что также отрицательно сказывается на стандартности полуфабриката - блочного сополимера хитозана и ПЭГ. Высокая молекулярная масса и результирующая нестандартность модифицированного пептидами сополимера очевидным образом затрудняет его дозирование при приготовлении растворов комплексов переносчика с нуклеиновыми кислотами. Носитель b-LTP лишен этих недостатков по причинам: а) обладает постоянной относительно низкой молекулярной массой (2 338 у.е.); б) в получении используется меньшее число стадий, химическая модификация аминокислот или результирующего пептида в нем отсутствуют.

В патенте № US 15840933 описаны липиды, которые могут содержать варьирующее число лекарственных молекул. В частности, в изобретении представлен комплекс нуклеиновая кислота-липиды. Предполагается, что такие частицы могут выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот. Перечисленные в данном изобретении липиды уступают b-LTP, так как: а) если из сложных эфиров ВЖК получают везикулы, то стабильность такой системы доставки будет значительно ниже, чем у b-LTP, который не формирует везикулярных структур при смешивании с миРНК; б) если сложные эфиры ВЖК используются для получения мицелл, связывание с нуклеиновой кислотой будет затрудненным по сравнению с b-LTP, а ее доступность также будет снижена.

В патенте № WO 2010142660 А2 представлены микрочастицы, которые содержат PLGA и катионный липид. Липид выступает в роли эмульгатора. Предполагается, что такие микрочастицы могут выступать в качестве системы доставки миРНК и использоваться для лечения заболеваний легких. Указанные микрочастицы уступают Ь-LTP, так как: а) высвобождение действующего вещества из микрокапсул будет происходить медленнее, чем из комплексов нуклеотида с b-LTP, в связи с чем терапевтический эффект изобретения будет развиваться дольше; б) в получении b-LTP используется меньшее число стадий, технологическая схема не предполагает получения эмульсий и малостабильных при хранении веществ, как PLGA (разрушается в водной среде); в) использование органических растворителей (хлористый метилен) для растворения PLGA повышает риск развития токсического действия, несмотря на стадию упаривания органического растворителя.

В патенте № US 20140134260 A1 представлены композиции на основе катионного липида и частиц нуклеиновая кислота/липиды, которые могут инкапсулировать нуклеиновые кислоты. Предполагается, что такие частицы могут выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот. Описанные здесь липиды уступают b-LTP, так как: а) если из сложных эфиров ВЖК получают везикулы, стабильность такой системы доставки будет значительно ниже, чем у b-LTP; б) если сложные эфиры ВЖК используются для получения мицелл, связывание с нуклеиновой кислотой будет затрудненным по сравнению с b-LTP, а ее доступность также будет снижена.

В патенте № US 20130281658 A1 представлены композиции для направленной доставки нуклеиновых кислот. В качестве системы доставки используются пептиды, способные к проникновению в клетки. Предполагается, что пептиды, описанные в изобретении № US 20130281658 A1 могут выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот. Перечисленные в изобретении № US 20130281658 А1 липиды уступают b-LTP, так как: а) линейные пептиды являются биодеградируемыми, обладают коротким периодом полураспада, вследствие чего такая структура может распасться, не достигнув органа-мишени, комплекс b-LTP обладает повышенной устойчивостью к ферментативному гидролизу, т.к. он не является линейным, а имеет разветвленную структуру.

В патенте № US 7879813 B2 представлены линейный полиаргининовый клеточно-проникающий пептид. Предполагается, что этот пептид может выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот.Однако описанный пептид уступают b-LTP, так как: а) линейные пептиды в целом являются легко биодеградируемыми, обладают коротким периодом полураспада, вследствие чего такая структура может распасться, не достигнув органа-мишени, в то же время b-LTP обладает повышенной устойчивостью к ферментативному гидролизу за счет разветвленной структуры; б) линейные пептиды обладают повышенной токсичностью по сравнению с разветвленным b-LTP.

В изобретении RU 2609857 C1 представлена композиция катионного дендримерного пептида (LTP) и молекул миРНК, где структурная формула дендримерного пептида соответствует b-LTP. Предполагается, что комплекс LTP-миРНК может быть использован для лечения респираторных инфекций. Описанная композиция уступает пептиду b-LTP т.к.: а) массовое соотношение комплекса LTP/миРНК составляет 25/1, в то время как массовое соотношение комплекса b-LTP/миРНК составляет 12,5/1, что является экономически более целесообразным; б) пептид LTP является солью трифторуксусной кислоты, что может увеличивать риск развития токсического действия, в то же время b-LTP является основанием и не содержит потенциально токсичных противоионов.

В изобретении RU 2572575 C1 представлен катионный дендримерный пептид (LTP), структурная формула которого соответствует b-LTP. Предполагается, что катионный дендримерный пептид LTP может выступать в качестве системы доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Описанный пептид LTP уступает b-LTP, т.к. первый является солью трифторуксусной кислоты, что может увеличивать риск развития токсического действия, в то же время b-LTP является основанием и не содержит потенциально токсичных противоионов.

В изобретении RU 2563989 C1 представлена композиция, состоящая из катионного дендримерного пептида LTP с двумя молекулами РНК. LTP в солевой форме выступает в качестве носителя РНК, где структурная формула пептида соответствует b-LTP в щелочной форме. Предполагается использование данной композиции для подавления экспрессии гена интерлейкина-4.

Поэтому задачей данного изобретения является разработка композиции для лечения аллергического ринита на основе малых интерферирующий РНК (миРНК), подавляющих одновременно экспрессию гена IL-13 и гена IL-4, и катионного дендримерного пептида, находящегося в основной не солевой форме (b-LTP) с последовательностью (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2, выступающего в качестве носителя.

Для решения данной задачи были разработаны молекулы миРНК, подавляющие экспрессию гена IL-13 и гена IL-4, а также разработано средство, содержащее эффективное количество указанной смеси миРНК в сочетании с носителем для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот b-LTP и его использование на мышиной модели аллергического ринита.

Интраназальная композиция для лечения аллергического ринита содержит эффективное количество катионного дендримерного пептида с формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2, находящегося в основной не солевой форме (b-LTP), выступающего в качестве носителя, и смесь молекул миРНК, подавляющих экспрессию гена IL-13 и IL-4, представленных последовательностями GGACCUGCUCUUACAUUUAtt и AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt, соотвественно.

Техническими результатами предлагаемого способа является получение интраназальной композиции для лечения аллергического ринита на основе молекул миРНК, представленных последовательностями AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt и GGACCUGCUCUUACAUUUAtt, что обеспечивает одновременное воздействие на два провоспалительных цитокина IL-4 и IL-13. Полученное массовое соотношение комплекса b-LTP/миРНК 12,5/1 в заявленной композиции является более целесообразным, поскольку необходимо в 2 раза меньше белка-носителя для равной по эффективности доставки одинакового количества молекул миРНК по сравнению с известным соотношением LTP/миРНК составляющим 25/1. Кроме того, использование катионного дендримерного пептида b-LTP в основной не солевой форме не содержит потенциально токсичных противоионов, что снижает риск токсического действия.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Подавление активности IL-4 и IL-13 молекулами siIL4-153 и siIL 13-395.

Фиг. 2. Определение оптимального массового соотношения bLTP и нуклеиновых кислот.

Фиг. 3. Структура катионного дендримерного пептида LTP в двух видах: А - аминокислоты представлены в трех-буквенном обозначении, Б - аминокислоты представлены в одно-буквенном обозначении, где А - аланин, К - лизин, R - аргинин, С - цистеин.

Фиг. 4. Продукция IL-4 клетками подчелюстных лимфоузлов.

Фиг. 5. Продукция IL-13 клетками подчелюстных лимфоузлов.

Фиг. 6. Уровни специфических IgE в сыворотке крови мышей. Фиг. 7. Уровни специфических IgG1 в сыворотке крови мышей.

Фиг. 8. Уровни специфических IgG2a в сыворотке крови мышей. Фиг. 9. Соотношение уровней специфических IgE/IgG2a.

Фиг. 10. Соотношение уровней специфических IgGl/IgG2a.

Фиг. 11. Частота чиханий мышей в разных группах в течение 5 минут после введения аллергена.

Фиг. 12. Количество эозинофилов в слизистой оболочке носа мышей разных групп.

Список сокращений

АР - аллергический ринит

АСИТ - аллерген-специфическая иммунная терапия

АП - антигистаминные препараты

БА - бронхиальная астма

БАЛ - бронхо-альвеолярный лаваж

ВЖК - высшие жирные кислоты

ГКС - глюкокортикостероиды / препараты на основе глюкокортикостероидов

ДМФА - N,N-Диметилформамид

ЛУ - лимфоузлы

миРНК - малые интерферирующие РНК

НК - нуклеиновые кислоты

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНКи (RNAi) - РНК-интерференция

ТД - терапевтическая доза

AGO-белок - белок Аргонавт, каталитический компонент RISC

ARIA - Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma - международный согласительный

CysLT1-рецепторы- лейкотриеновые рецепторы 1 типа

c-Kit - белковая тирозинкиназа

СОХ-2 - циклооксигеназа 2

ICOS - индуцибельные костимулирующие рецепторы

IgG1 - иммуноглобулин класса G, подкласс G1

IgG2a - иммуноглобулин класса G, подкласс G2a

IgE - иммуноглобулин класса Е

GM-CSF - гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор

IL (4, 5, 6, 9, 10, 11, 13) - интерлейкины

IL-4Rα - рецептор к IL-4

IL-13Rα (1, 2) - рецепторы к IL-13

Lyn - тирозиновая протеинкиназа человека

MDC - цитокины макрофагального происхождения

NK-клетки - натуральные киллеры

OX40L - цитокин семейства факторов некроза опухоли, лиганд рецептора CD 134

OVA - овальбумин

PLGA - поли альфа-гидроксикислота

Rel (А, В) - транскрипционные факторы

REM фаза - фаза сна, характеризующаяся быстрым движением глаз

RISC - RNA-induced silencing complex - сайленсинговый комплекс, индуцируемый молекулами РНК

RIβ - субъединица АМФ-зависимой протеинкиназы

siGFP - миРНК против гена GFP

SLAM - сигнальнаямолекула активации лимфоцитов

STAT6 - сигнальный трансдуктер и активатор транскрипции 6 документ «Аллергический ринит и его влияние на астму»

Syk - тирозиновая киназа человека

Th1 - Т-хелперы 1 типа

Th2 - Т-хелперы 2 типа

TLR (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) - Toll-подобные рецепторы

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1. Молекулы миРНК подавляют экспрессию IL-4 и IL-13 человека.

Проектирование молекул миРНК было осуществлено с помощью специального программного обеспечения OligoWalk, которое рассчитывает термодинамические параметры гибридизации РНК-олигонуклеотидов, предсказывает их свободную энергию связывания с мРНК-мишенью. С использованием программы OligoWalk было спрогнозировано более 50 различных вариантов молекул миРНК, из которых были выбраны наиболее оптимальные варианты миРНК. Выбор осуществлялся в соответствии со следующими критериями: положение участка отжига на мРНК гена-мишени (не должен находиться ближе 50 пн относительно Start-кодона гена, т.к. в данном участке мРНК-мишени инициируется трансляция, которая сопряжена с привлечением различных инициирующих белковых факторов, что снижает пространственную доступность данного участка для молекул миРНК, и как следствие понижает их активность. Кроме того, следовало избегать повторяющихся более 4 раз нуклеотидов таких как «АААА» и «GGGG». Последовательность миРНК не должна быть идентичной последовательностям других генов в геноме человека. В итоге были спроектированы следующие варианты миРНК против гена IL-4 (siIL4-153 состава SEQUENCE 1: AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt) и IL-13 (siIL13-395 состава SEQUENCE 2: GGACCUGCUCUUACAUUUAtt).

Для тестирования спроектированных молекул миРНК, в экспериментах in vitro была создана экзогенная модель экспрессии этого гена в хорошо трансфецируемых клетках 293Т. Эффективность спроектированных молекул миРНК была оценена с использованием данной модели различными методами. Для этого 1×105 клеток 293Т трансфецировали смесью, состоящей из 0,5 мкг плазмиды pUCHR IL13 IRES GFP или pUCHR IL4 IRES GFP, экспрессирующей IL-13 или IL-4 и 1 мкг соответствующей миРНК. В качестве отрицательного контроля ко-трасфецировали неспецифическую молекулу миРНК (siP4), не имеющую сходства с генами IL-4 и IL-13. Сутки после ко-трансфекции методом ИФА определяли концентрацию IL-4 и IL-13 супернатантах. Концентрацию IL-4 и IL-13 в супернатантах клеток, трасфецированных siP4 принимали за 100% и относительно этого значения выражали активность IL-4 и IL-13. Как оказалось, созданные варианты приводили к заметному активности IL-4 и IL-13 (Фиг. 1).

Пример 2. Обоснование состава композиции.

В качестве носителя для молекул миРНК был использован пептид b-LTP со структурной формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2LysAlaCys-NH2. Для установления оптимального количества b-LTP в составе композиции проведены исследования. Для этого культуру клеток HEK293T засевали в 48-луночный плейт в полной среде DMEM, которая содержит 10% эмбриональной телячий сыворотки (ЭТС), 300 мг/л Глутамина-L и 60 мг/мл Гентамицина в количестве 80 тыс.клеток на лунку в объеме 300 мкл полной среды DMEM и культивируют при 37С в 5% атмосфере СО2 до образования монослоя 75% конфлуентности (1 сутки).

Комплекс pGL3 (несет репортерный ген люциферазы) и b-LTP готовился среде optiMEM (Gibco) не содержащей ЭТС и антибиотиков. Для этого b-LTP в различных массовый соотношениях по отношению к плазмиде pGL3 смешивали в 80 мкл optiMEM, смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 25-30 минут и вносили к клеткам в лунки 48-луночного плейта по каплям и инкубировали при 37С в 5% атмосфере CO2 в течение 2 суток. После инкубации клеток с комплексом надосадочную среду удаляли из лунок плейта, а монослой клеток лизировали в 60 мкл специального буфера Luciferase Cell Culture Lysis Reagent (Promega). Лизат клеток переносили в отдельные пробирки на 1,5 мл и центрифугировали, и осуществляли цикл замораживания оттаивания для лучшего лизиса клеток; замораживание проводили в течение ночи при -70С, а оттаивание в течение 10-15 мин при 37С в твердотельном термостате/ Далее лизаты клеток вортексировали и центрифугировали при 10000 об/мин при 4С в течение 2 минут для удаления клеточного дебриза. Надосадок переносили в отдельные пробирки на 1,5 мл и проводили измерение люциферазной активности каждого образца путем смешивания 50 мкл лизата с 50 мкл люциферина - субстрата для люфиферазы. При наличии в образце фермента люциферазы происходит излучение света, интенсивность которого детектировалось люминометром (Promega). Оптимальное соотношение Rm (массовое соотношение b-LTP и плазмиды pGL3) при трансфекции клеток HEK293T составило 12,5/1 по массе (Фиг. 2 Условные обозначения рисунка: Rm - массовое соотношение b-LTP и плазмиды pGL3; pGL3 - плазмида кодирующая ген люциферазы luc; RLU - относительные световые единицы (relative light units)).

Таким образом, оптимальная композиция для подавление экспрессии генов IL-4 и IL-13 состоит из двух компонентов: 1) молекулы малых интерферирующих РНК (миРНК), направленных против генов IL-4 и IL-13 (siIL4-153 и siIL13-395); 2) Средство для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих - катионный дендримерный пептид b-LTP в основной (не солевой) форме, при этом он содержит 8 остатков аргинина, 7 остатков лизина, аланин и цистеин со структурной формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2LysAlaCys-NH2. (Фиг. 3 Условные обозначения рисунка: А - аланин, К - лизин, R - аргинин, С - цистеин). Массовое соотношение b-LTP/миРНК (смесь из siIL4-153 и siIL13-395)=12,5/1 (0,5 siIL4-153 и 0,5 siIL13-395, соответственно). Растворы обоих компонентов приготовлены в фосфатно-солевом буфере (1 мг/мл).

Пример 3. Композиция из пептида b-LTP и миРНК против IL-4 и IL-13 является малотоксичным соединением

В данном исследовании в качестве тест-системы были использованы мыши (CBA*C57B1)F1, которые являются стандартным объектом для исследований токсичности лекарственных средств. Композиция из пептида и миРНК против IL-4 и IL-13 вводилась мышам внутрибрюшинно в трех дозах: 250, 125 и 62,5 мг/кг, т.е. 5, 2,5 и 1,25 мг/мышь. Композицию вводили внутрибрюшинно мышам, т.к. данный способ обеспечивает максимальную биодоступность. Максимальная доза (5 мг/мышь) лимитирована растворимостью тестируемого объекта (10 мг/мл) и максимально допустимым объемом для подкожного введения мышам (0,5 мл/особь). Тестируемый препарат и носитель в заданных дозах были введены животным внутрибрюшинно однократно в соответствии со схемой эксперимента, представленной в таблице 1 (* - с учетом коэффициента пересчета доз). Период наблюдения после введения препарата составлял 14 суток. Некропсия и патоморфологический анализ проводились на 15-е сутки. В дни 0, 1, 2, 3, 4, 7 и 14 оценивали массу животных.

В первые часы после введения композиции у мышей наблюдалось снижение активности, взъерошенность шерстного покрова, но при этом гибели животных не было. В течение первых суток отмечена гибель 5-ти из 6-ти животных в группе с максимальной дозой у самцов и по 2 и 1 животному в группах 125 и 250 мг/кг (табл. 2). С учетом полученных данных о выживаемости, максимальной переносимой дозой для самцов является 125 мг/кг, а для самок 62,5 мкг/кг. Посчитаны летальные дозы; для самцов ЛД83 составила 250 мг/кг, а для самок ЛД34 составила 150 мг/кг.

Изучена динамика относительной массы тела у экспериментальных животных. Масса тела мышей в день 0 принята за 100%. Мыши, получавшие буфер, демонстрировали прирост массы тела на 3-10%. Было выявлено статистически значимое снижение относительной массы тела у самцов и самок, в группе получавшей 250 мг/кг в 1-й и 3-й дни эксперимента (таб. 3 * - статистически значимо отличается от группы животных, получавших буфер). В последующие дни наблюдений (с 4 по 14 дни) масса тела подопытных животных, получавших ЛС, восстанавливалась до значений сопоставимых с мышами, получавшими буфер (таб. 3). Это свидетельствует о процессе интоксикации первые 4 дня после введения препарата и об обратимости этой интоксикации. В группе самцов, получавших максимальную дозу, происходила гибель 5-ти мышей из 6-ти, ввиду чего статистический анализ был невозможен; стоит отметить, что выжившее животное к дню 4 потеряло до 20% массы тела, а к дню 14 произошло восстановление массы тела на 9%, что свидетельствует о интоксикации организма. Животные, получавшие минимальную дозу, не демонстрировали статистически значимых изменений массы тела. При этом животные, получавшие композицию в дозе 125 мг/кг, демонстрировали признаки интоксикации в первые 3 дня после введения композиции, которые были обратимы.

Таким образом, установлено, что максимальной переносимой дозой для самцов является 125 мг/кг, для самок - 62,5 мкг/кг, а значения ЛД50 препарата для мышей (CBA*C57B1)F1 обоего пола находится в диапазоне доз 125 мг/кг - 250 мг/кг; для самцов ЛД83 составила 250 мг/кг, а для самок ЛД34 составила 150 мг/кг, что позволяет отнести композицию, состоящую из пептида b-LTP и миРНК против IL-4 и IL-13 к классу малотоксичных веществ (классификация по К.К. Сидорову 1977). У мышей (как самок, так и самцов), получавших композицию в минимальной дозе 62,5 мг/кг, не отмечалось признаков интоксикации, выражавшихся в падении массы тела.

Пример 4. Композиция подавляет признаки аллергического ринита у мышей

Для изучения биологической активности композиции использовали модель АР у мышей-самок линии BALB/c, которых трехкратно подкожно сенсибилизировали OVA 20 мкг/мышь, 0,2 мл/мышь на 0, 14 и 28 дни после начала эксперимента. Далее произвели (начиная с 42 дня с начала эксперимента) недельную провокацию OVA 25 мкг/мышь, 10 мг/мл для проявления признаков развившейся у мышей патологии. Затем в течение недели проводили терапию композицией по следующей схеме: двукратно интраназально (и.н.) вводили препарат за 0,5-1 час до и после и.н. введения аллергена (25 мкл из р-ра 50 мг/мл OVA). В качестве отрицательного контроля использовали комплекс неспецифических молекул миРНК (siGFP) и носителя - b-LTP. В качестве положительного контроля использовали коммерческий препарат Тафен Назаль на основе глюкокортикостеройдов. Дозы и режимы введения представлены в таблице 4.

Поскольку композиция направлена против генов IL-4 и IL-13 было исследовано изменение продукции данных цитокинов клетками подчелюстных ЛУ, стимулированных OVA. Композиция оказывала эффект снижения уровней IL-4 и IL-13, сопоставимо эффекту Тафен Назаль (Фиг. 4, 5).

По данным научной литературы известно, что IL-4 и -13 ответственны за синтез IgE и IgG1, которые являются проаллергическими иммуноглобулинами, a IgG2a -протективным субклассом, поэтому были проанализированы уровни специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови мышей после курса терапии. Композиция статистически значимо снижала IgE и IgG1-ответ по сравнению с группой, отрицательного контроля при этом не влияя на IgG2a. (Фиг. 6, 7, 8) Расчет индекса показал, что он снижался, а это говорит о профилировании ответа в сторону Th-1-типа после курса терапии композицией (Фиг. 9, 10).

Полученные нами данные говорят, что частота чиханий в группе, которой вводили композицию, в 3 раза ниже, чем в группе с АР, и в 2 раза ниже, чем в группе, получавшей неспецифические миРНК. Значения для группы «Композиция» сопоставимы с таковыми в положительном контроле (Тафен Назаль) (Фиг. И).

В результате терапии сенсибилизированных мышей происходила инфильтрация слизистой оболочки носа эозинофилами. Количество данных иммунных клеток в псевдо-леченой группе сопоставимо с количеством их в группе с АР. В группах, получавших терапию композицией и Тафен Назалем, количество эозинофилов снижалось в среднем на 30%. При этом степень инфильтрации эозинофилов у мышей после курса композиции и Тафен Назаль была сопоставима (Фиг. 12).

Таким образом, полученная интраназальной композиции для лечения аллергического ринита на основе молекул миРНК, представленных последовательностями AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt и GGACCUGCUCUUACAUUUAtt, обеспечивает одновременное воздействие на два провоспалительных цитокина IL-4 и IL-13. Полученное массовое соотношение комплекса b-LTP/миРНК 12,5/1 в заявленной композиции является более целесообразным, поскольку необходимо в 2 раза меньше белка-носителя для равной по эффективности доставки одинакового количества молекул миРНК по сравнению с известным соотношением LTP/миРНК составляющим 25/1. Кроме того, показано, что использование катионного дендримерного пептида b-LTP в основной не солевой форме не содержит потенциально токсичных противоионов, снижая риск токсического действия.

Список литературы

1. М. и др. Allergen-specific immunotherapy: Update on immunological mechanisms // Allergol. Immunopathol. (Madr). 2013. T. 41. №4. C. 265-272.

2. Bidad K., Nicknam M.H., Farid R. A review of allergy and allergen specific immunotherapy // Iran. J. Allergy, Asthma Immunol. 2011. T. 10. №1. C. 1-9.

3. Focke-Tejkl M., Valenta R. Safety of engineered allergen-specific immunotherapy vaccines. // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2012. T. 12. №5. C. 555-63.

4. Gour N., Wills-Karp M. IL-4 and IL-13 signaling in allergic airway disease // Cytokine. 2015. T. 75. №1. C. 68-78.

5. Greiwe J.C., Bernstein J.A. Combination therapy in allergic rhinitis: What works and what does not work // Am. J. Rhinol. Allergy. 2016. T. 30. №6. C. 391-396.

6. Hosoya K. и др. Gene silencing of STAT6 with siRNA ameliorates contact hypersensitivity and allergic rhinitis. // Allergy. 2011. T. 66. №1. C. 124-31.

7. Joo M.K. и др. The potential and advances in RNAi therapy: Chemical and structural modifications of siRNA molecules and use of biocompatible nanocarriers // J. Control. Release. 2014. T. 193. C. 113-121.

8. Juel-Berg N. и др. Intranasal corticosteroids compared with oral antihistamines in allergic rhinitis: A systematic review and metaanalysis // Am. J. Rhinol. Allergy. 2017. T. 31. №1. C. e19-e28.

9. Kakli H.A., Riley T.D. Allergic Rhinitis // Prim. Care - Clin. Off. Pract. 2016. T. 43. №3. C. 465-475.

10. Kim S.H. и др. Long-term Effects of Specific Allergen Immunotherapy Against House Dust Mites in Polysensitized Patients With Allergic Rhinitis // Allergy Asthma Immunol Res. 2014. T. 6. №6. C. 535-540.

11. Melvin T.A.N., Patel A.A. Pharmacotherapy for Allergic Rhinitis // Otolaryngol. Clin. North Am. 2011. T. 44. №3. C. 727-739.

12. Narkus А. и др. The placebo effect in allergen-specific immunotherapy trials. // Clin. Transl. Allergy. 2013. T. 3. №1. C. 42.

13. Passalacqua G., Canonica G.W., Bagnasco D. Benefit of SLIT and SCIT for Allergic Rhinitis and Asthma // Curr. Allergy Asthma Rep.2016. T. 16. №12.

14. Protudjer J.L.P. и др. Household costs associated with objectively diagnosed allergy to staple foods in children and adolescents // J. Allergy Clin. Immunol. Pract. 2015. T. 3. №1. C. 68-75.

15. Ranasinghe С. и др. Cytokine & Growth Factor Reviews IL-4 and IL-13 receptors: Roles in immunity and powerful vaccine adjuvants // Cytokine Growth Factor Rev. 2014. T. 25. №4. C. 437-442.

16. Ring J., Gutermuth J. 100 years of hyposensitization: History of allergen-specific immunotherapy (ASIT) // Allergy. 2011. T. 66. №6. C. 713-724.

17. Simoens S., Laekeman G. Pharmacotherapy of allergic rhinitis: A pharmaco-economic approach // Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol. 2009. T. 64. №1. C. 85-95.

18. Stelmaszczyk-Emmel А. и др. Th1, Th2, Th17, and regulatory cytokines in children with different clinical forms of allergy // Adv. Exp. Med. Biol. 2013. T. 788. C. 321-328.

19. Tjota M.Y., Sperling A.I. Distinct dendritic cell subsets actively induce Th2 polarization // Curr. Opin. Immunol. 2014. T. 31. C. 44-50.

20. Хаитов M.P. Биобезопасность и интерференция РНК. Москва:, 2012. Вып. ОП ПИК "ВИ. 328 с.

Похожие патенты RU2710895C1

название год авторы номер документа
КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ЦИТОКИНА ИНТЕРЛЕЙКИНА-4 2014
  • Хаитов Муса Рахимович
  • Смирнов Валерий Валерьевич
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Сергеев Илья Викторович
  • Маерле Артем Владимирович
  • Лобанова Софья Борисовна
  • Калинина Елена Владимировна
  • Шиловский Игорь Петрович
RU2563989C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 2014
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Чупина Нина Анатольевна
  • Шиловский Игорь Петрович
  • Хаитов Муса Рахимович
RU2572575C1
Использование композиции, состоящей из катионного пептида LTP и молекул РНК против респираторных вирусов 2015
  • Хаитов Муса Рахимович
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Сергеев Илья Викторович
  • Маерле Артем Владимирович
  • Лобанова Софья Борисовна
  • Калинина Елена Владимировна
  • Ерошкина Дарья Владимировна
  • Шиловский Игорь Петрович
RU2609857C1
Пептиды для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот 2020
  • Хаитов Муса Рахимович
  • Кожихова Ксения Вадимовна
  • Колоскова Олеся Олеговна
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Тимофеева Анастасия Витальевна
  • Шатилов Артем Андреевич
  • Шиловский Игорь Петрович
  • Кофиади Илья Андреевич
  • Смирнов Валерий Валерьевич
  • Никонова Александра Александровна
RU2771605C2
Комбинированное лекарственное средство, обладающее противовирусным эффектом в отношении нового коронавируса SARS-CoV-2 2021
  • Хаитов Муса Рахимович
  • Шиловский Игорь Петрович
  • Кожихова Ксения Вадимовна
  • Кофиади Илья Андреевич
  • Смирнов Валерий Валерьевич
  • Колоскова Олеся Олеговна
  • Сергеев Илья Владимирович
  • Трофимов Дмитрий Юрьевич
  • Трухин Виктор Павлович
  • Скворцова Вероника Игоревна
RU2746362C1
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ, ОСЛОЖНЯЮЩИХ ЕЕ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ДРУГИХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ 2012
  • Хаитов Муса Рахимович
  • Шиловский Игорь Петрович
  • Никонова Александра Александровна
  • Мазуров Дмитрий Вячеславович
RU2526146C2
Способ лечения аллергической бронхиальной астмы, основанный на подавлении экспрессии генов цитокинов IL-4 и IL-13 с использованием молекул миРНК 2016
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Шиловский Игорь Петрович
  • Сундукова Мария Сергеевна
  • Маерле Артем Владимирович
  • Сергеев Илья Викторович
RU2615463C1
Способ оценки эффективности проведения аллерген-специфической иммунотерапии при аллергическом рините 2019
  • Донецкова Альмира Дмитриевна
  • Смирнов Дмитрий Сергеевич
  • Курбачева Оксана Михайловна
  • Литвина Марина Михайловна
  • Никонова Маргарита Федоровна
  • Митин Александр Николаевич
RU2700788C1
миРНК И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В СПОСОБАХ И КОМПОЗИЦИЯХ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ORAI1 2014
  • Хименес Ана Изабель
  • Паньеда Ковадонга
  • Мартинес Тамара
RU2689607C2
Меченые дендримерные пептиды 2016
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Шиловский Игорь Петрович
  • Сундукова Мария Сергеевна
  • Маерле Артем Владимирович
  • Сергеев Илья Викторович
RU2611399C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 710 895 C1

Реферат патента 2020 года Композиция, подавляющая экспрессию генов интерлейкина-4 и интерлейкина-13, для терапии аллергического ринита

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, а именно к интраназальной композиции для лечения аллергического ринита. Представлена интраназальная композиция для лечения аллергического ринита, содержащая эффективное количество катионного дендримерного пептида с формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2, находящегося в основной не солевой форме (b-LTP), выступающего в качестве носителя, и смесь молекул миРНК, подавляющих экспрессию гена IL-13 и IL-4, представленных последовательностями GGACCUGCUCUUACAUUUAtt и AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt, соответственно, где массовое соотношение b-LTP к смеси молекул миРНК равно 12,5:1, и количество молекул миРНК в смеси является одинаковым. Предложенная композиция является эффективной при подавлении экспрессии гена – мишени. 12 ил., 4 табл., 4 пр.

Формула изобретения RU 2 710 895 C1

Интраназальная композиция для лечения аллергического ринита, содержащая эффективное количество катионного дендримерного пептида с формулой (Arg)8(Lys)4(Lys)2Lys-Ala-Cys-NH2, находящегося в основной не солевой форме (b-LTP), выступающего в качестве носителя, и смесь молекул миРНК, подавляющих экспрессию гена IL-13 и IL-4, представленных последовательностями GGACCUGCUCUUACAUUUAtt и AAAGAUGUCUGUUACGGUCtt, соответственно, где массовое соотношение b-LTP к смеси молекул миРНК равно 12,5:1, и количество молекул миРНК в смеси является одинаковым.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2710895C1

Способ лечения аллергической бронхиальной астмы, основанный на подавлении экспрессии генов цитокинов IL-4 и IL-13 с использованием молекул миРНК 2016
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Шиловский Игорь Петрович
  • Сундукова Мария Сергеевна
  • Маерле Артем Владимирович
  • Сергеев Илья Викторович
RU2615463C1
Использование композиции, состоящей из катионного пептида LTP и молекул РНК против респираторных вирусов 2015
  • Хаитов Муса Рахимович
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Сергеев Илья Викторович
  • Маерле Артем Владимирович
  • Лобанова Софья Борисовна
  • Калинина Елена Владимировна
  • Ерошкина Дарья Владимировна
  • Шиловский Игорь Петрович
RU2609857C1
КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ЦИТОКИНА ИНТЕРЛЕЙКИНА-4 2014
  • Хаитов Муса Рахимович
  • Смирнов Валерий Валерьевич
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Сергеев Илья Викторович
  • Маерле Артем Владимирович
  • Лобанова Софья Борисовна
  • Калинина Елена Владимировна
  • Шиловский Игорь Петрович
RU2563989C1
СРЕДСТВО ДЛЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 2014
  • Андреев Сергей Михайлович
  • Чупина Нина Анатольевна
  • Шиловский Игорь Петрович
  • Хаитов Муса Рахимович
RU2572575C1

RU 2 710 895 C1

Авторы

Хаитов Муса Рахимович

Шиловский Игорь Петрович

Андреев Сергей Михайлович

Смирнов Валерий Валерьевич

Барвинская Екатерина Драгановна

Кожихова Ксения Вадимовна

Маерле Артем Владимирович

Сергеев Илья Викторович

Тимофеева Анастасия Витальевна

Даты

2020-01-14Публикация

2018-11-21Подача