КОНЪЮГАТ АНТИ-HER3 АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2020 года по МПК A61K47/64 A61K39/395 A61K31/535 C07K16/28 A61P35/00 

Область изобретения

[0001]

Настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему анти-HER3 антитело и противоопухолевое лекарственное средство, конъюгированные друг с другом через линкерную структуру, при этом такой конъюгат является полезным в качестве противоопухолевого лекарственного средства.

Предпосылки изобретения

[0002]

Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), содержащий лекарственное средство с цитотоксичностью, конъюгированное с антителом, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на поверхности раковых клеток и способным к интернализации клетками (антитело, которое связывается с антигеном, также способно к интернализации клетками), может доставлять лекарственное средство селективно к раковым клеткам и, как ожидают, будет вызывать аккумуляцию лекарственного средства в раковых клетках и убивать раковые клетки (см. не-патентную литературу 1-3). В качестве ADC, Милотарг (зарегистрированная торговая марка; Гемтузумаб озогамицин), в котором калихеамицин конъюгирован с анти-CD33 антителом, одобрен в качестве терапевтического средства для лечения острого миелоидного лейкоза. Кроме того, Адцетрис (зарегистрированная торговая марка; Брентуксимаб ведотин), в котором ауристатин E конъюгирован с анти-CD30 антителом, недавно был одобрен в качестве терапевтического средства для лечения лимфомы Ходжкина и анапластической крупноклеточной лимфомы (см. не-патентную литературу 4). Лекарственные средства, содержащиеся в ADC, одобренных к настоящему времени, таргетируют ДНК или тубулин.

[0003]

Что касается противоопухолевых низкомолекулярных соединений, известны камптотециновые производные - соединения, которые ингибируют топоизомеразу I для проявления противоопухолевого эффекта. Среди них, противоопухолевое соединение, представленное формулой, показанной ниже (экзатекан, химическое название: (1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-10,13(9H,15H)-дион), представляет собой водорастворимое производное камптотецина (Патентная литература 1 и 2).

[0004]

[Химическая формула 1]

[0005]

В отличие от иринотекана, используемого в настоящее время в клинических условиях, это соединение не требует активации ферментом для проявления противоопухолевого эффекта. Кроме того, по сравнению с SN-38 в качестве основного фармацевтически активного вещества иринотекана и топотекана, также используемго в клинических условиях, оно обладает более сильным ингибирующим действием на топоизомеразу I и более высокой убивающей клетки активностью in vitro против различных раковых клеток. В частности, оно демонстрирует эффект против раковых клеток, которые обладают резистентностью к SN-38 или т.п. в результате экспрессии P-гликопротеина. Кроме того, в мышиной модели с подкожно трансплантированной человеческой опухолью, оно продемонстрировало сильный противоопухолевый эффект и, таким образом, прошло клинические испытания, но еще не поставляется на рынок (см. не-патентную литературу 5-10). Остается неясным действует или нет экзатекан эффективно в качестве ADC.

[0006]

DE-310 представляет собой комплекс, в котором экзатекан конъюгирован с биоразлагаемым карбоксиметилдекстран-полиспирт полимером через GGFG пептидный спейсер (Патентная литература 3). Путем преобразования экзатекана в форму полимерного пролекарства свойство удержания его высоких уровней в крови может сохраняться, и также высокая способность проникновения в область опухоли пассивно увеличивается путем использования повышенной проницаемости новых образованных кровеносных сосудов в опухоли и свойства удерживания в опухолевых тканях. Что касается DE-310, через расщепление пептидного спейсера ферментом, экзатекан и экзатекан с глицином, связанным с амино группой, непрерывно высвобождаются в качестве основного активного вещества, и, как результат, фармакокинетикие свойства улучшаются. В соответствии с различными моделями оценки опухоли в не-клинических исследованиях было обнаружено, что DE-310 обладает более высокой эффективностью, чем экзатекан, вводимый отдельно, даже при том, что общее количество экзатекана, содержащегося в нем, меньше, чем в случае введения экзатекана отдельно. Было проведено клиническое испытание для DE-310, и были подтверждены эффективные случаи. Существует также сообщение, в котором предполагается, что основной активный ингредиент аккумулируется в опухоли, а не в нормальных тканях. Однако существует также сообщение, указывающее, что аккумуляция DE-310 и основного активного ингредиента в опухоли не намного отличается от аккумуляции в нормальных тканях, и, таким образом, никакого пассивного таргетирования у человека не наблюдали (см. не-патентную литературу 11-14). Как результат, DE-310 также не был запущен в серийное производство, и остается неясным, действует или нет экзатекан эффективно в качестве лекарственного средства, предназначенного для такого таргетирования.

[0007]

В качестве соединения, относящегося к DE-310, также известен комплекс, в котором структурный элемент, представленный как -NH-(CH₂)₄-C(=O)-, встроен между -GGFG-спейсером и экзатеканом с образованием -GGFG-NH-(CH₂)₄-C(=O)-, используемого в качестве спейсерной структуры (Патентная литература 4). Однако противоопухолевый эффект указанного комплекса вообще неизвестен.

[0008]

Рецептор человеческого эпидермального фактора роста 3 (также известный как HER3 и ErbB3) представляет собой рецепторную тирозиновую протеинкиназу и относится к субсемейству рецепторных тирозиновых протеинкиназ рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), которое также включает HER1 (также известный как EGFR), HER2 и HER4 (см. не-патентную литературу 15-17). Также как в случае прототипного рецептора эпидермального фактора роста, трансмембранный рецептор HER3 состоит из внеклеточного лиганд-связывающего домена (ECD), домена димеризации в ECD, трансмембранного домена и карбокси-концевого домена фосфорилирования. HER1, HER2 и HER4 включают внутриклеточный протеинтирозинкиназный домен (TKD) в дополнение к этим доменам, тогда как HER3 не содержит такой домен и, таким образом, не способен к автофосфорилированию.

Лиганд Герегулин (HRG) связывается с внеклеточным доменом HER3 и активирует рецептор-опосредованный сигнальный путь, промотируя димеризацию с другими членами семейства рецепторов эпидермального фактора роста человека (HER) и трансфосфорилирование его внутриклеточного домена. Образование димера HER3 с другими членами семейства HER расширяет сигнальный потенциал HER3 и служит в качестве средства не только для диверсификации сигнала, но также для амплификации сигнала. Например, HER2/HER3 гетеродимер индуцирует один из наиболее важных митогенных сигналов среди членов HER семейства. HER3 чрезмерно экспрессируется в некоторых типах рака, таких как рак молочной железы, желудочно-кишечный и панкреатический рак. Интересно то, что была показана взаимосвязь между экспрессией HER2/HER3 и прогрессированием от не-инвазивной стадии к инвазивной стадии (см. не-патентную литературу 18-20). Следовательно, желательны средства, которые вмешиваются в HER3-опосредованную передачу сигналов. Анти-HER3 антитела и их иммуноконъюгаты были описаны, например, в Патентной литературе 5-10, соответственно.

Перечень ссылочных документов

Патентная литература

[0009]

[Патентная литература 1] Выложенный патент Японии № 5-59061

[Патентная литература 2] Выложенный патент Японии № 8-337584

[Патентная литература 3] Международная публикация № WO 1997/46260

[Патентная литература 4] Международная публикация № WO 2000/25825

[Патентная литература 5] Патент США № 5968511

[Патентная литература 6] Патент США № 5480968

[Патентная литература 7] Международная публикация № WO 2003/013602

[Патентная литература 8] Международная публикация № WO 2007/077028

[Патентная литература 9] Международная публикация № WO 2008/100624

[Патентная литература 10] Международная публикация № WO 2012/019024

Не-патентная литература

[0010]

[Не-патентная литература 1] Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.

[Не-патентная литература 2] Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.

[Не-патентная литература 3] Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.

[Не-патентная литература 4] Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.

[Не-патентная литература 5] Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.

[Не-патентная литература 6] Mitsui, I., et al., Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-786.

[Не-патентная литература 7] Takiguchi, S., et al., Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769.

[Не-патентная литература 8] Joto, N. et al., Int J Cancer (1997) 72, 680-686.

[Не-патентная литература 9] Kumazawa, E. et al., Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.

[Не-патентная литература 10] De Jager, R., et al., Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.

[Не-патентная литература 11] Inoue, K. et al. Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al., (2003) 145-153.

[Не-патентная литература 12] Kumazawa, E. et al., Cancer Sci (2004) 95, 168-175.

[Не-патентная литература 13] Soepenberg, O. et al., Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.

[Не-патентная литература 14] Wente M. N. et al., Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.

[Не-патентная литература 15] Plowman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1990) 87, 4905-4909.

[Не-патентная литература 16] Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 9193-9197.

[Не-патентная литература 17] Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993) 90, 2900-2094.

[Не-патентная литература 18] Alimandi et al., Oncogene (1995) 10, 1813-1821.

[Не-патентная литература 19] DeFazio et al., Int. J. Cancer (2000) 87, 487-498.

[Не-патентная литература 20] Nadiu et al., Br. J. Cancer (1998) 78, 1385-1390.

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0011]

Что касается лечения опухоли антителом, недостаточный противоопухолевый эффект можно наблюдать, даже когда антитело распознает антиген c связывается с опухолевыми клетками, и, таким образом, иногда необходимо более эффективное противоопухолевое антитело. Кроме того, многие противоопухолевые низкомолекулярные соединения имеют проблему безопасности, такую как побочный эффект и токсичность, даже если соединения обладают отличным противоопухолевым эффектом. Следовательно, остается проблема достижения более высокого терапевтического эффекта при большем усилении безопасности. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение противоопухолевого лекарственного средства, обладающего отличным терапевтическим эффектом, которое является отличным в том, что касается противоопухолевого эффекта и безопасности.

Решение проблемы

[0012]

Авторы настоящего изобретения полагали, что, поскольку анти-HER3 антитело представляет собой антитело, которое способно таргетировать опухолевые клетки, то есть это антитело, которое обладает свойством распознавания опухолевых клеток, свойством связывания с опухолевыми клетками, свойством интернализации в опухолевых клетках, разрушительной активностью против опухолевых клеток или подобными свойствами, когда экзатекан в качестве противоопухолевого соединения преобразовывают в конъюгат антитело-лекарственное средство путем конъюгации с антителом через линкерную структурную группу, противоопухолевое соединение более надежно может доставляться к опухолевым клеткам для специфического проявления противоопухолевого эффекта соединения в опухолевых клетках, и, таким образом, противоопухолевый эффект наверняка может проявиться, а также ожидается усиленный цитотоксический эффект анти-HER3 антитела, и дозу противоопухолевого соединения можно уменьшить по сравнению со случаем введения соединения отдельно, и, таким образом, влияние противоопухолевого соединения на нормальные клетки можно ослабить для достижения большей безопасности.

В этой связи, авторы настоящего изобретения создали линкер со специфической структурой, и им удалось получить конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором анти-HER3 антитело и экзатекан конъюгированы друг с другом через линкер, и подтвердить отличный противоопухолевый эффект, демонстрируемый конъюгатом, создав, таким образом, настоящее изобретение.

[0013]

В частности, настоящее изобретение относится к следующему.

[1] Конъюгат антитело-лекарственное средство, где противоопухолевое соединение, представленное следующей формулой

[Химическая формула 2]

конъюгировано с анти-HER3 антителом посредством тиоэфирной связи, которая образуется на участке дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части анти-HER3 антитела, через линкер, имеющий структуру, представленную следующей формулой:

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- или -L¹-L²-L^P-.

[0014]

Здесь, анти-HER3 антитело связано с концом L¹, противоопухолевое соединение связано с карбонильной группой -(CH₂)n²-C(=O)- фрагмента или C концом L^P, с атомом азота амино группы в положении 1 в качестве положения связывания.

В этой формуле, n¹ представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 6,

n² представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 5,

L¹ представляет собой -(Сукцинимид-3-ил-N)-(CH₂)n³-C(=O)-,

где n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 8,

L² представляет собой -NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)- или простую связь,

где n⁴ представляет собой целое число, имеющее значение от 1 до 6,

L^P представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот,

L^a представляет собой -O- или простую связь,

-(Сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:

[Химическая формула 3]

которая связана с анти-HER3 антителом в положении 3 и связана по атому азота в положении 1 с метиленовой группой в линкерной структуре, содержащей эту структуру.

[0015]

Настоящее изобретение, кроме того, относится к каждому из следующих.

[2] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [1], где пептидный остаток L^P представляет собой пептидный остаток, включающий аминокислоту, выбранную из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты.

[3] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [1] или [2], где L^P представляет собой пептидный остаток, выбранный из следующей группы

-GGF-,

-DGGF-,

-(D-)D-GGF-,

-EGGF-,

-GGFG-,

-SGGF-,

-KGGF-,

-DGGFG-,

-GGFGG-,

-DDGGFG-,

-KDGGFG-, и

-GGFGGGF-;

(где "(D-)D" представляет собой D-аспарагиновую кислоту).

[4] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [1] или [2], где L^P представляет собой пептидный остаток, включающий 4 или 5 аминокислот.

[5] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[4], где L^P представляет собой -GGFG- или -DGGFG-.

[6] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[4], где L^P представляет собой -GGFG-.

[0016]

[7] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[6], где n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 5, и L² представляет собой простую связь.

[8] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[7], где линкер представляет собой -L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-.

[9] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [8], где n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 5, L² представляет собой -NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)-, и n⁴ имеет значение 2 или 4.

[10] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [8] или [9], где -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- представляет собой частичную структуру, имеющую длину цепи от 4 или 7 атомов.

[11] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [8] или [9], где -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- представляет собой частичную структуру, имеющую длину цепи от 5 или 6 атомов.

[12] Конъюгат антитело-лекарственное средство, описанный в пункте [10] или [11], где -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- представляет собой

-NH-CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)- или

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-.

[13] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [12], где -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- представляет собой любой из следующих:

-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)- или

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-.

[14] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[5], где линкер представляет собой -L¹-L²-L^P-.

[15] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [14], где L^P представляет собой -DGGFG-.

[16] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [15], где n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 5, и L² представляет собой простую связь.

[0017]

[17] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [1], где структурный фрагмент лекарственное средство-линкер, в котор лекарственное средство связано с -L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- или -L¹-L²-L^P-, представляет собой одну лекарственное средство-линкер структуру, выбранную из следующей группы:

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).

[0018]

В представленных выше структурах -(Сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:

[Химическая формула 4]

которая связана с анти-HER3 антителом в положении 3 и связана с метиленовой группой в линкерной структуре, содержащей ее, по атому азота в положении 1,

-(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой, где атом азота амино группы в положении 1 представляет собой положение связывания,

[Химическая формула 5]

-GGFG- представляет собой тетрапептидный остаток -Gly-Gly-Phe-Gly-, и -DGGFG- представляет собой пентапептидный остаток -Asp-Gly-Gly-Phe-Gly-.

[0019]

[18] Конъюгат антитело-лекарственное средство, описанный в пункте [1], где структурный фрагмент лекарственное средство-линкер, содержащий лекарственное средство, связанное с -L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-, представляет собой одну лекарственное средство-линкер структуру, выбранную из следующей группы:

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).

[0020]

Здесь, -(Сукцинимид-3-ил-N)-, -(NH-DX), -GGFG- и -DGGFG- являются такимим, как описано выше.

[0021]

[19] Конъюгат антитело-лекарственное средство, включающий противоопухолевое соединение, представленное следующей формулой:

[Химическая формула 6]

конъюгированное с анти-HER3 антителом посредством тиоэфирной связи, которая образуется на участке дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части анти-HER3 антитела, через линкер, имеющий структуру, представленную следующей формулой:

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-.

Здесь, анти-HER3 антитело связано с концом L¹, и противоопухолевое соединение связано с карбонильной группой -(CH₂)n²-C(=O)- фрагмента.

В формуле, n¹ представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 6,

n² представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 5,

L¹ представляет собой -(Сукцинимид-3-ил-N)-(CH₂)n³-C(=O)-,

где n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 8,

L² представляет собой -NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)- или простую связь,

где n⁴ представляет собой целое число, имеющее значение от 1 до 6,

L^P представляет собой тетрапептидный остаток -GGFG-,

L^a представляет собой -O- или простую связь,

-(Сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:

[Химическая формула 7]

которая связана с анти-HER3 антителом в положении 3 и связывается по атому азота в положении 1 с метиленовой группой в линкерной структуре, содержащей эту структуру.

[0022]

[20] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [19], где n¹ имеет значение 3, n² имеет значение 0, n³ имеет значение 2, L² представляет собой -NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)-, n⁴ имеет значение 2, и L^a представляет собой простую связь, или

n¹ имеет значение 1, n² имеет значение 1, n³ имеет значение 5, L² представляет собой простую связь, и L^a представляет собой -O-, или

n¹ имеет значение 2, n² имеет значение 1, n³ имеет значение 5, L² представляет собой простую связь, и L^a представляет собой -O-.

[21] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [19] или [20], где n³ имеет значение 2 или 5, и L² представляет собой простую связь.

[22] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [19] или [20], где n³ имеет значение 2 или 5, L² представляет собой -NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)-, и n⁴ имеет значение 2 или 4.

[23] Конъюгат антитело-лекарственное средство, описанн в любом из пунктов [19]-[22], где -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- представляет собой

-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)- или

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-.

[0023]

[24] Конъюгат антитело-лекарственное средство, описанный в любом из пунктов [19]-[23], где структурный фрагмент лекарственное средство-линкер, содержащий лекарственное средство, связанное с -L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-, представляет собой одну лекарственное средство-линкер структуру, выбранную из следующей группы:

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX);

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

[0024]

В представленных выше, -(Сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:

[Химическая формула 8]

которая связана с анти-HER3 антителом в положении 3 и связана по атому азота в положении 1 с метиленовой группой в линкерной структуре, содержащей эту структуру.

-(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой, где атом азота амино группы в положении 1 представляет собой положение связывания:

[Химическая формула 9]

-GGFG- представляет собой тетрапептидный остаток -Gly-Gly-Phe-Gly-.

[0025]

[25] Конъюгат антитело-лекарственное средство, описанный в любом из пунктов [19]-[23], где структурный фрагмент лекарственное средство-линкер, содержащий лекарственное средство, связанное с -L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-, представляет собой одну лекарственное средство-линкер структуру, выбранную из следующей группы:

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX).

В представленных выше, -(Сукцинимид-3-ил-N)-, -(NH-DX) и -GGFG- являются такими, как определено выше.

[0026]

[26] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[25], где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 1 до 10.

[27] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[25], где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 2 до 8.

[28] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[25], где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 3 до 8.

[0027]

[29] Лекарственное средство, включающее конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[28], его соль или его гидрат.

[30] Противоопухолевое лекарственное средство и/или противораковое лекарственное средство, включающее конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[28], его соль или его гидрат.

[31] Противоопухолевое лекарственное средство и/или противораковое лекарственное средство в соответствии с пунктом [30], которое применяют для лечения рака легкого, рака почки, уротелиального рака, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичника, панкреатическ рака, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, рака желудка, желудочно-кишечной стромальной опухоли, цервикального рака, рака головы и шеи, эзофагеального рака, эпидермоидного рака, перитонеального рака, мультиформной глиобластомы взрослых, гепатического рака, гепатоклеточной карциномы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака толстой кишки и прямой кишки, эндометриального рака, рака матки, рака слюнной железы, ренального рака, рака вульвы, рака щитовидной железы, гепатической карциномы, анальной карциномы или рака полового члена.

[32] Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[28], его соль или его гидрат в качестве активного компонента и фармацевтически приемлемый компонент для формулирования композиции.

[33] Фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом [32], которую применяют для лечения рака легкого, рака почки, уротелиального рака, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичника, панкреатическ рака, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, рака желудка, желудочно-кишечной стромальной опухоли, цервикального рака, рака головы и шеи, эзофагеального рака, эпидермоидного рака, перитонеального рака, мультиформной глиобластомы взрослых, гепатического рака, гепатоклеточной карциномы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака толстой кишки и прямой кишки, эндометриального рака, рака матки, рака слюнной железы, ренального рака, рака вульвы, рака щитовидной железы, гепатической карциномы, анальной карциномы или рака полового члена.

[34] Способ лечения опухоли и/или рака, включающий введение конъюгата антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [1]-[28], его соли или его гидрата.

[35] Лекарственное средство в соответствии с пунктом [29], противоопухолевое лекарственное средство и/или противораковое лекарственное средство в соответствии с пунктом [30] или [31], фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом [32] или [33] или способ лечения в соответствии с пунктом [34], которые используют для введения в комбинации с дополнительным лекарственным средством.

[36] Фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом [32] или [33], дополнительно включающая еще одно дополнительное лекарственное средство в качестве активного ингредиента.

[0028]

[35] Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, включающий взаимодействие соединения, представленного следующей формулой:

(малеимид-N-ил)-(CH₂)n³-C(=O)-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-(NH-DX) или (малеимид-N-ил)-(CH₂)n³-C(=O)-L²-L^P-(NH-DX)

с анти-HER3 антителом или его реакционноспособным производным и конъюгирование лекарственное средство-линкер фрагмента с антителом способом для образования тиоэфирной связи на участке дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части антитела.

[0029]

В представленной формуле, n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 8,

L² представляет собой -NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)- или простую связь, где n⁴ представляет собой целое число, имеющее значение от 1 до 6,

L^P представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, выбранных из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты,

n¹ представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 6,

n² представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 5,

L^a представляет собой -O- или простую связь,

(малеимид-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой, и содержит атом азота в качестве положения связывания.

[Химическая формула 10]

-(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой, где атом азота амино группы в положении 1 представляет собой положение связывания:

[Химическая формула 11]

[0030]

[36] Способ получения, описанный в пункте [35], где способ конъюгирование лекарственное средство-линкер фрагмента с анти-HER3 антителом представляет собой способ восстановления антитела для преобразования в реакционноспособное производное.

[0031]

[37] Способ получения, описанный в пункте [35] или [36], где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 1 до 10.

[38] Способ получения, описанный в пункте [35] или [36], где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 2 до 8.

[39] Способ получения, описанный в пункте [35] или [36], где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 3 до 8.

[40] Конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный способом получения в соответствии с любым из пунктов [35]-[39].

[0032]

[41] Конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный путем образования тиоэфирной связи на участке дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части анти-HER3 антитела, где анти-HER3 антитело обрабатывают в восстановительных условиях и затем подвергают взаимодействию с соединением, выбранным из группы соединений, представленной ниже:

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX), (малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX) или

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).

[0033]

В представленных выше соединениях (малеимид-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:

[Химическая формула 12]

которая содержит атом азота в качестве положения связывания.

-(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой, при этом атом азота амино группы в положении 1 представляет собой положение связывания.

[Химическая формула 13]

-GGFG- представляет собой тетрапептидный остаток -Gly-Gly-Phe-Gly-, и -DGGFG- представляет собой пентапептидный остаток -Asp-Gly-Gly-Phe-Gly-.

[0034]

[42] Конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный путем образования тиоэфирной связи на участке дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части анти-HER3 антитела, и отличающийся тем, что анти-HER3 антитело обрабатывают в восстановительных условиях и затем подвергают взаимодействию с соединением, выбранным из группы соединений, представленной ниже:

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX) или

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX).

В представленных выше соединениях (малеимид-N-ил)-, -(NH-DX) и -GGFG- такие, как определено выше.

[0035]

[43] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [41] или [42], где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 1 до 10.

[44] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [41] или [42], где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 2 до 8.

[45] Конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с пунктом [41] или [42], где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 3 до 8.

[46] Лекарственное средство, включающее конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [40]-[45], его соль или его гидрат.

[47] Противоопухолевое лекарственное средство и/или противораковое лекарственное средство, включающее конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [40]-[45], его соль или его гидрат.

[48] Противоопухолевое лекарственное средство и/или противораковое лекарственное средство в соответствии с пунктом [47], которое применяют для лечения рака легкого, рака почки, уротелиального рака, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичника, панкреатическ рака, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, рака желудка, желудочно-кишечной стромальной опухоли, цервикального рака, рака головы и шеи, эзофагеального рака, эпидермоидного рака, перитонеального рака, мультиформной глиобластомы взрослых, гепатического рака, гепатоклеточной карциномы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака толстой кишки и прямой кишки, эндометриального рака, рака матки, рака слюнной железы, ренального рака, рака вульвы, рака щитовидной железы, гепатической карциномы, анальной карциномы или рака полового члена.

[49] Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [40]-[45], его соль или его гидрат в качестве активного компонента и фармацевтически приемлемый компонент для формулирования композиции.

[50] Фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом [49], которую применяют для лечения рака легкого, рака почки, уротелиального рака, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичника, панкреатическ рака, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, рака желудка, желудочно-кишечной стромальной опухоли, цервикального рака, рака головы и шеи, эзофагеального рака, эпидермоидного рака, перитонеального рака, мультиформной глиобластомы взрослых, гепатического рака, гепатоклеточной карциномы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака толстой кишки и прямой кишки, эндометриального рака, рака матки, рака слюнной железы, ренального рака, рака вульвы, рака щитовидной железы, гепатической карциномы, анальной карциномы или рака полового члена.

[51] Способ лечения опухоли и/или рака, включающий введение конъюгата антитело-лекарственное средство в соответствии с любым из пунктов [40]-[45], его соли или его гидрата.

[52] Лекарственное средство в соответствии с пунктом [46], противоопухолевое лекарственное средство и/или противораковое лекарственное средство в соответствии с пунктом [47] или [48], фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом [49] или [50] или способ лечения в соответствии с пунктом [51], которые используют для введения в комбинации с дополнительным лекарственным средством.

[53] Фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом [49] или [50], дополнительно включающая еще одно дополнительное лекарственное средство в качестве активного ингредиента.

Полезные эффекты изобретения

[0036]

С использованием конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство, содержащего противоопухолевое соединение экзатекан, конъюгированное через линкер со специфической структурой, может достигаться отличный противоопухолевый эффект и безопасность.

Краткое описание рисунков

[0037]

[Фиг. 1]

Фиг. 1 показывает полноразмерную аминокислотную последовательность тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59 (SEQ ID NO: 583).

[Фиг. 2]

Фиг. 2 показывает полноразмерную аминокислотную последовательность легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59 (SEQ ID NO: 584).

[Фиг. 3]

Фиг. 3 показывает среднюю интенсивность флуоресценции HCC1569, обработанных серийными разведениями U1-59 или каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. KD и Bmax значения рассчитывали с использованием программы GraphPad Prism.

[Фиг. 4]

A549 клетки культивировали в течение 2 дней с U1-59 или разными конъюгатами антитело-лекарственное средство. HER3 или фосфорилированный HER3 анализировали методом вестерн-блоттинга. pan-Актин определяли в качестве контроля для электрофореза.

[Фиг. 5]

Фиг. 5 показывает среднее значение снижения экспрессии HER3 на поверхности HCC1569 клеток, обработанных U1-59 или каждым конъюгатом антитело-лекарственное средство (37C ("C" означает "градусы Цельсия"), 1 час).

[Фиг. 6]

Фиг. 6 показывает результаты испытания ингибирования митогенных сигналов или сигналов выживания каждым конъюгатом HER3 антитело-лекарственное средство в человеческой клеточной линии рака молочной железы (HCC1569). Фиг. 6A показывает данные клеточного роста или выживания, полученные для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS. Данные представлены как среднее значение +/- стандартное отклонение от трех повторов. Ось ординат представляет значение люминесценции, показывающее АТФ активность каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Фиг. 6B показывает процент уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство, когда люминесценция необработанной группы была определена как 100%.

[Фиг. 7]

Фиг. 7 показывает результаты испытания ингибирования митогенных сигналов или сигналов выживания каждым конъюгатом HER3 антитело-лекарственное средство в человеческой клеточной линии рака молочной железы (MDA-MB 453). Фиг. 7A показывает данные клеточного роста или выживания, полученные для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS. Ось ординат представляет значение люминесценции, показывающее АТФ активность каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Данные представлены как среднее значение +/- стандартное отклонение от трех повторов. Фиг. 7B показывает процент уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство, когда люминесценция необработанной группы была определена как 100%.

[Фиг. 8]

Фиг. 8 показывает результаты испытания ингибирования митогенных сигналов или сигналов выживания каждым конъюгатом HER3 антитело-лекарственное средство в человеческой клеточной линии меланомы (A375). Фиг. 8A показывает данные клеточного роста или выживания, полученные для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS. Ось ординат представляет значение люминесценции, показывающее АТФ активность каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Данные представлены как среднее значение +/- стандартное отклонение от трех повторов. Фиг. 8B показывает процент уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство, когда люминесценция необработанной группы была определена как 100%.

[Фиг. 9]

Фиг. 9 показывает результаты испытания ингибирования митогенных сигналов или сигналов выживания каждым конъюгатом HER3 антитело-лекарственное средство в человеческой клеточной линии колоректального рака (HT29). Фиг. 9A показывает данные клеточного роста или выживания, полученные для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS. Ось ординат представляет значение люминесценции, показывающее АТФ активность каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Данные представлены как среднее значение +/- стандартное отклонение от трех повторов. Фиг. 9B показывает процент уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство, когда люминесценция необработанной группы была определена как 100%.

[Фиг. 10]

Фиг. 10 показывает результаты испытания ингибирования митогенных сигналов или сигналов выживания каждым конъюгатом HER3 антитело-лекарственное средство в человеческой клеточной линии рака легкого (A549). Фиг. 10A показывает данные клеточного роста или выживания, полученные для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS. Ось ординат представляет значение люминесценции, показывающее АТФ активность каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Данные представлены как среднее значение +/- стандартное отклонение от трех повторов. Фиг. 10B показывает процент уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство, когда люминесценция необработанной группы была определена как 100%.

[Фиг. 11]

Фиг. 11 показывает результаты сравнения процента ингибирования клеточного роста или выживания между конъюгатом антитело-лекарственное средство (3) и конъюгатом антитело-лекарственное средство (4). Левая диаграмма показывает процент ингибирования клеточного роста или выживания, полученный для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS. Ось ординат представляет люминесценцию, показывающую АТФ активность каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Данные представлены как среднее значение +/- стандартное отклонение от трех повторов. Правая диаграмма показывает сравнение уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство, между высокой нагрузкой лекарственного средства (HDL) и средней нагрузкой лекарственного средства (MDL), когда люминесценция необработанной группы была определена как 100%.

[Фиг. 12]

Фиг. 12 показывает результаты сравнения процента ингибирования клеточного роста или выживания между конъюгатом антитело-лекарственное средство (10) и конъюгатом антитело-лекарственное средство (11). Левая диаграмма показывает процент ингибирования клеточного роста или выживания, полученный для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS. Ось ординат представляет люминесценцию, показывающую АТФ активность каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Данные представлены как среднее значение +/- стандартное отклонение от трех повторов. Правая диаграмма показывает сравнение уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство между высокой нагрузкой лекарственного средства (HDL) и средней нагрузкой лекарственного средства (MDL), когда люминесценция необработанной группы была определена как 100%.

[Фиг. 13]

Фиг. 13 показывает результаты сравнения процента ингибирования клеточного роста или выживания между конъюгатом антитело-лекарственное средство (13) и конъюгатом антитело-лекарственное средство (14). Левая диаграмма показывает процент ингибирования клеточного роста или выживания, полученный для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS. Ось ординат представляет люминесценцию, показывающую АТФ активность каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Данные представлены как среднее значение +/- стандартное отклонение от трех повторов. Правая диаграмма показывает сравнение уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство между высокой нагрузкой лекарственного средства (HDL) и средней нагрузкой лекарственного средства (MDL), когда люминесценция необработанной группы была определена как 100%.

[Фиг. 14]

Фиг. 14 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против рака молочной железы человека (HCC1569), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 15]

Фиг. 15 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против меланомы человек (HT-144), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 16]

Фиг. 16 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против рака молочной железы человека (MDA-MB-453), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней from введени. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 17]

Фиг. 17 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии колоректального рака (HT-29), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после введения. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 18]

Фиг. 18 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии рака легкого человека (A549), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 19]

Фиг. 19 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии тройного негативного рака молочной железы (MDA-MB-468), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (13). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 20]

Фиг. 20 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии люминального рака молочной железы человека (MCF-7), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 21]

Фиг. 21 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии меланомы человека (WM-266-4), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 22]

Фиг. 22 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии рака яичника человека (OVCAR-8), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 23]

Фиг. 23 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии рака мочевого пузыря человека (SW-780), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 24]

Фиг. 24 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии рака молочной железы человека (MDA-MB-453), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 25]

Фиг. 25 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии рака молочной железы человека (MDA-MB-453), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 26]

Фиг. 26 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии рака молочной железы человека (JIMT-1), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (15). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 27]

Фиг. 27 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии рака легкого человека (PC9), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 28]

Фиг. 28 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии тройного негативного рака молочной железы человека (MDA-MB-468), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 29]

Фиг. 29 показывает результаты испытания противоопухолевой активности, направленной против клеточной линии рака головы и шеи человека (Fadu), с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

[Фиг. 30]

Фиг. 30 показывает результаты испытания противоопухолевой активности с использованием полученной от пациента части опухоли рака желудка человека (NIBIO-G016) и конъюгата антитело-лекарственное средство (16a). Ось ординат представляет средний объем опухоли. Ось абсцисс представляет количество дней после трансплантации клеток. Все значения указаны как среднее значение +/- стандартное отклонение. Исходный объем опухоли и исходную массу тела мыши анализировали на основании описательных данных (среднее значение и стандартное отклонение) с использованием программы Microsoft Excel 2009.

Описание вариантов осуществления

[0038]

Далее предпочтительные способы осуществления настоящего изобретения будут описаны со ссылкой на рисунки. При этом, варианты осуществления, описанные ниже, представлены как репрезентативные примеры вариантов осуществления настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не следует интерпретировать в узком смысле на основании этих вариантов осуществления.

[0039]

Настоящее изобретение обеспечивает конъюгат HER3 связывающий белок-лекарственное средство. Предпочтительно, HER3 связывающий белок по настоящему изобретению представляет собой каркасный белок, обладающий антитело-подобной связывающей активностью, или антитело, т.е. анти-HER3 антитело.

[0040]

Конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению представляет собой противоопухолевое лекарственное средство, в котором анти-HER3 антитело конъюгировано с противоопухолевым соединением через линкерную структуру, и подробно описан ниже.

В контексте настоящего изобретения, термин "каркасный белок", как он используется в настоящем изобретении, означает полипептид или белок с экспонированными участками поверхности, где аминокислотные вставки, замены или делеции являются в высокой степени переносимыми. Примерами каркасных белков, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, являются белок A из Staphylococcus aureus, билин- связывающий белок из Pieris brassicae или другие липокалины, белки с анкириновым повтором и человеческий фибронектин (см. обзор Binz and Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-69). Конструирование каркасного белка можно рассматривать как прививку или интеграцию функции аффинности на или в структурный каркас имеющего стабильную укладку белка. Функция аффинности означает аффинность связывания с белком в соответствии с настоящим изобретением. Каркас может быть структурно отделяемым от аминокислотных последовательностей, сообщающих специфичность связывания. Как правило, белки, которые могут быть подходящими для разработки таких искусственных аффинных реагентов, можно получить с использованием рациональных, или наиболее часто, комбинаторных методов конструирования белков, таких как пэннинг против HER3, либо очищенного белка либо белка, присутствующего на клеточной поверхности, для определения связывающих агентов в библиотеке искусственных каркасов in vitro, технических приемов, которые известны в данной области (Skerra, J. Mol. Recog., 2000; Binz and Pluckthun, 2005). Кроме того, каркасный белок, обладающий антитело-подобной связывающей активностью, можно получить из акцепторного полипептида, содержащего каркасный домен, который может иметь привитые связывающие домены донорного полипептида для придания специфичности связывания донорного полипептида каркасному домену, содержащему акцепторный полипептид. Указанные встроенные связывающие домены могут представлять собой, например, определяющую комплементарность область (CDR) антитела, в частности, анти-HER3 антитела. Вставку можно осуществить различными способами, известными специалистам в данной области, включающими, например, полипептидный синтез, нуклеиновокислотный синтез кодируемой аминокислоты, а также различными рекомбинантными методами, хорошо известными специалистам в данной области.

[0041]

{Антитело}

Кроме того, термин "антитело" или "анти-HER3 антитело", как он используется в настоящем изобретении, означает моноклональное антитело, поликлональное антитело, рекомбинантное антитело, гуманизированное антитело (Jones et al., Nature 321 (1986), 522-525; Riechmann et al., Nature 332 (1988), 323-329; и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992), 593-596), химерное антитело (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 6851-6855), человеческое антитело и полностью человеческое антитело, (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143,; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727, Международная публикация № WO 2007/077028 и т.д.), мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело), образованное из по меньшей мере двух антител, или фрагмент такого антитела. Термин "фрагмент антитела" включает любую часть указанных выше антител, предпочтительно их антиген- связывающую область или вариабельные области. Примеры фрагментов антител включают Fab фрагменты, Fab' фрагменты, F(ab')₂ фрагменты, Fv фрагменты, диатела (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), одноцепочечные молекулы антител (Pluckthun in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) и другие фрагменты, при условии, что они демонстрируют желаемую способность связывания с HER3.

[0042]

Кроме того, термин "антитело" или "анти-HER3 антитело", как он используется в настоящем изобретении, может включать антитело-подобные молекулы, которые содержат сконструированные суб-домены антител или природные варианты антител. Эти антитело-подобные молекулы могут представлять собой одно-доменные антитела, такие как VH-только или VL-только домены, происходящие либо из природных источников, таких как верблюдовые (Muyldermans et al., Reviews in Molecular Biotechnology 74, 277-302), или через in vitro дисплей библиотек из человеческих, верблюдовых или других видов (Holt et al., Trends Biotechnol., 21, 484-90).

[0043]

В соответствии с настоящим изобретением, "Fv фрагмент" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антиген-распознающий и -связывающий сайт. Эта область состоит из димера вариабельного домена с одной тяжелой и одной легкой цепью в тесной не-ковалентной ассоциации. Именно в этой конфигурации три CDR^'s каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антиген-связывающего сайта на поверхности V_H-V_L димера. Все вмести эти шесть CDR^'s сообщают антиген-связывающую специфичность антителу. Однако даже один единстенный вариабельный домен (или половина Fv, включающая только три CDR^'s, специфических для антигена) обладает способностью распознавать и связываться с антигеном, хотя обычно с меньшей аффинностью, чем весь связывающий сайт.

"Fab фрагмент" также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. "Fab фрагмент" отличается от "Fab¹ фрагмента" добавлением нескольких остатов на карбокси-конце CH1 домена тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. "F(ab')₂ фрагмент" изначально образуется в виде пары "Fab' фрагментов" с шарнирными цистеинами между ними. Способы получения таких фрагментов антитела, такие как расщепление папаином или пепсином, известны специалистам в данной области.

[0044]

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анти-HER3 антитело по настоящему изобретению представляет собой анти-HER3 антитело, направленное против внеклеточного домена (ECD) HER3.

[0045]

Анти-HER3 антитело, используемое в конъюгате анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, может происходить из любых видов. Предпочтительные примеры видов могут включать человека, крыс, мышей и кроликов. Анти-HER3 антитело, происходящее из вида, отличного от человека, предпочтительно подвергают химеризации или гуманизации с использованием хорошо известного метода. Антитело по настоящему изобретению может быть поликлональным антителом или моноклональным антителом, и предпочтительно оно является моноклональным антителом.

Анти-HER3 антитело может представлять собой такое антитело, которое способно таргетировать опухолевые клетки, то есть обладает способностью распознавания опухолевых клеток, способностью связывания с опухолевыми клетками, свойством интернализации в опухолевых клетках и цитотоксической активностью против опухолевых клеток и т.п. Анти-HER3 антитело может быть конъюгировано с соединением, обладающим противоопухолевой активностью, через линкер с образованием конъюгата антитело-лекарственное средство.

Связывающую активность антитела против опухолевых клеток можно подтвердить методом проточной цитометрии. Интернализацию антитела в опухолевых клетках можно подтвердить с использованием (1) анализа визуализации антитела, инкорпорированного в клетки, под флуоресцентным микроскопом с использованием вторичного антитела (флуоресцентно меченного), связывающегося с терапевтическим антителом (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) анализа измерения количества флуоресценции, инкорпорированной в клетки, с использованием вторичного антитела (флуоресцентно меченного), связывающегося с терапевтическим антителом (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004), или (3) Mab-ZAP анализа с использованием иммунотоксина, связывающегося с терапевтическим антителом, где токсин высвобождается при инкорпорировании в клетки для ингибирования клеточного роста (Bio Techniques 28: 162-165, January 2000). Рекомбинантный комплексный белок на основе каталитической области дифтерийного токсина и G-белка можно использовать в качестве иммунотоксина.

Противоопухолевая активность антитела может быть подтверждена in vitro путем определения ингибиторной активности против клеточного роста. Например, раковую клеточную линию, чрезмерно экспрессирующую целевой белок для антитела, культивируют и добавляют антитело при разных концентрациях в систему культивирования для определения ингибиторной активности против образования очага, колониеобразования и роста сфероидов. Противоопухолевая активность может быть подтверждена in vivo, например, путем введения антитела ʺголойʺ мыши с трансплантированной опухолевой клеточной линией, сильно экспрессирующей целевой белок, и определения изменения раковых (опухолевых) клеток.

Поскольку соединение, конъюгированное в конъюгате антитело-лекарственное средство, проявляет противоопухолевый эффект, предпочтительно, но необязательно, чтобы антитело само обладало противоопухолевым эффектом. Для специфического и селективного проявления цитотоксической активности противоопухолевым соединением, специфически и селективно действующим на опухолевые клетки, важно и также предпочтительно, чтобы антитело обладало свойством интернализации для миграции в опухолевые клетки.

[0046]

Анти-HER3 антитело можно получить с использованием способа, обычно используемого в данной области техники, который включает иммунизацию животных антигенным полипептидом и сбор и очистку антител, продуцируемых in vivo. Происхождение антигена не ограничивается человеческим происхождением, и животных можно иммунизировать антигеном, происходящим из отличного от человека животного, такого как мышь, крыса и т.п. В этом случае перекрестная реактивность антител, связывающихся с полученным гетерологичным антигеном и человеческими антигенами, может быть испытана для скрининга антитела, применимого для заболевания человека.

Альтернативно, антитело-продуцирующие клетки, которые продуцируют антитела против антигена, сливают с клетками миеломы в соответствии со способом, известным в данной области техники (например, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; и Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies,, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)), для создания гибридом, из которых, в свою очередь, могут быть получены моноклональные антитела.

Антиген можно получить с использованием генноинженерных методов для получения клеток хозяина, продуцирующих ген, кодирующий антигенный белок. В частности, получают векторы, которые позволяют осуществлять экспрессию гена для такого антигена, и переносят в клетки хозяина так, чтобы экспрессировался этот ген. Антиген, экспрессируемый таким образом, может быть очищен. Антитело также можно получить с использованием способа иммунизации животных описанными выше генноинженерными антиген-экспрессирующими клетками или клеточной линией с экспрессированным антигеном.

Анти-HER3 антитело можно получить с использованием процедуры, известной в данной области техники.

[0047]

Анти-HER3 антитело, которое можно использовать в настоящем изобретении, конкретно не ограничивается, и желательно, например, любое из антител, обладающих свойствами, описанными ниже.

(1) Анти-HER3 антитело, обладающее следующими свойствами:

(a) специфически связывается с HER3, и/или

(b) обладает активностью интернализации в HER3-экспрессирующих клетках через связывание с HER3.

(2) Антитело в соответствии с пунктом (1), где антитело связывается с внеклеточным доменом HER3.

(3) Антитело в соответствии с пунктом (1) или (2), где антитело представляет собой моноклональное антитело.

(4) Антитело в соответствии с любым из пунктов (1)-(3), где антитело обладает антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксической (ADCC) активностью и/или комплемент-зависимой цитотоксической (CDC) активностью.

(5) Антитело в соответствии с любым из пунктов (1)-(4), где антитело представляет собой мышиное моноклональное антитело, химерное моноклональное антитело, гуманизированное моноклональное антитело или человеческое или полностью человеческое (моноклональное) антитело.

(6) Антитело в соответствии с любым из пунктов (1)-(5), где антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, включающее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

(7) Антитело в соответствии с любым из пунктов (1)-(6), где антитело не содержит лизиновый остаток на карбокси-конце тяжелой цепи.

(8) Антитело в соответствии с пунктом (7), где антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70, и вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 72.

(9) Антитело, полученное способом получения антитела в соответствии с любым из пунктов (1)-(8), где способ включает следующие стадии: культивировани клетки хозяина, трансформированной вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, кодирующий антитело; и сбор антитела, представляющего интерес, из культур, полученных на предыдущей стадии.

[0048]

Далее будет описано анти-HER антитело, используемое в изобретении.

В описании настоящего изобретения термины "рак" и "опухоль" используются взаимозаменяемо.

В описании настоящего изобретения термин "ген" включает не только ДНК, но также его мРНК.

В описании настоящего изобретения термин "полинуклеотид" используется взаимозаменяемо с нуклеиновой кислотой, и также включает ДНК, РНК, зонды, олигонуклеотиды и праймеры.

В описании настоящего изобретения термины "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо.

В описании настоящего изобретения термин "клетка" также включает клетки у отдельного животного и культивируемые клетки.

В описании настоящего изобретения термин "HER3" используются взаимозаменяемо с термином "HER3 белок".

В описании настоящего изобретения термин "CDR" относится к определяющей комплементарность области (CDR). Известно, что молекула антитела имеет три определяющие комплементарность области (CDRs) в каждой легкой и тяжелой цепи. CDR, также называемые гипервариабельными доменами, присутствуют в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела. Эти сайты имеют высоко вариабельную первичную структуру, и разделены в трех положениях соответствующих первичных структур тяжелых и легких полипептидных цепей. В настоящем описании, CDRs антитела представлены как CDRH1, CDRH2 и CDRH3 амино-конца аминокислотной последовательности тяжелой цепи, что касается CDRs тяжелой цепи, и представлены как CDRL1, CDRL2 и CDRL3 амино-конца аминокислотной последовательности легкой цепи, что касается CDRs легкой цепи. Эти сайты находятся в непосредственный близости друг к другу в пространственной структуре и определяют специфичность в отношении антигена, с которым будет связываться антитело.

В описании настоящего изобретения, фраза "гибридизация в жестких условиях", относится к гибридизации при 68°C в коммерчески доступном растворе для гибридизации ExpressHyb Hybridization Solution (изготовитель Clontech, Inc.), или к идентифицируемой гибридизации в условиях, включающих гибридизацию при 68°C в присутствии 0,7-1,0 M NaCl с использованием фильтра, содержащего иммобилизованную на нем ДНК, с последующим осуществлением промывки при 68°C с использованием 0,1-2 × SSC раствора (1 × SSC раствор состоит из 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия), или к гибридизации в условиях эквивалетных этим.

[0049]

1. HER3

Рецептор человеческого эпидермального фактора роста 3 (HER3, также известный как ErbB3) представляет собой рецепторную тирозиновую протеинкиназу и относится к субсемейству рецепторных тирозиновых протеинкиназ рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), которое также включает HER1 (также известный как EGFR), HER2 и HER4. HER3 представляет собой трансмембранный рецептор и состоит из внеклеточного лиганд-связывающего домена (ECD), димеризационного домена в ECD, трансмембранного домена, внутриклеточного протеинтирозинкиназного домена (TKD) и C-концевого домена фосфорилирования. Было обнаружено, что HER3 чрезмерно экспрессируется в некоторых типах рака, таких как рак молочной железы, желудочно-кишечный и панкреатический рак. Была показана взаимосвязь между экспрессией HER2/HER3 и прогрессированием от не-инвазивной стадии к инвазивной стадии.

HER3 белок, используемый в настоящем изобретении, можно использовать после непосредственной очистки из HER3-экспрессирующих человеческих клеток или клеток отличного от человека млекопитающего (крыса, мышь и т.д.), или можно использовать путем получения клеточных мембранных фракций клеток. Альтернативно, HER3 можно синтезировать in vitro или можно получить из клеток хозяина методами генетической инженерии. В методах генетической инженерии, например, HER3 кДНК встраивают в векторы, которые обеспечивают его экспрессию, и HER3 затем можно экспрессировать путем синтеза в растворе, содержащем ферменты, необходимые для транскрипции и трансляции, субстраты и энергетические вещества, или путем трансформации других прокариотических клеток хозяина или эукариотических клеток хозяина с получением белка. Альтернативно, полученные методами генетической инженерии HER3-экспрессирующие клетки, описанные выше, или клеточную линию с экспрессируемым HER3 можно использовать в качестве HER3 белка.

РНК последовательность, кДНК последовательность и аминокислотная последовательность HER3 являются доступными в публичной базе данных и могут быть указаны, например, под номерами доступа, такими как AAA35979 (предшественник, включающий сигнальную последовательность, состоящую из амино-концевых 19 аминокислотных остатков), M34309 (NCBI), например.

Указанная выше аминокислотная последовательность HER3 состоит из аминокислотной последовательности, которую подвергают заменам, делециям, добавлениям и/или вставкам по меньшей мере одной аминокислоты, и белки, обладающие биологической активностью, эквивалентной активности этого белка, также включены в HER3.

[0050]

2. Получение анти-HER3 антитела

Антитело против HER3 по настоящему изобретению можно получить с использованием способа, обычно используемого в данной области техники, который включает иммунизацию животного при помощи HER3 или произвольного полипептида, выбранного из аминокислотной последовательности HER3, и сбор и очистку антитела, продуцируемого in vivo. Биологический вид HER3, который можно использовать в качестве антигена, не ограничивается человеком, и животное можно иммунизировать при помощи HER3, происходящим из животного, отличного от человека, такого как мышь или крыса. В этом случае, путем исследования перекрестной реактивности между антителом, связывающимся с полученным гетерологичным HER3 и человеческим HER3, можно выбрать антитело, применимое для заболевания человека.

Кроме того, моноклональное антитело можно получить из гибридомы, полученной путем слияния антитело-продуцирующих клеток, которые продуцируют антитело против HER3, с клетками миеломы в соответствии с известным способом (например, Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antobodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).

HER3, который можно использовать в качестве антигена, можно получить путем экспрессии HER3 гена в клетке хозяина методом генной инженерии.

В частности, получают вектор, способный экспрессировать HER3 ген, и полученным вектором трансфицируют клетку хозяина для экспрессии гена и затем экспрессированный HER3 очищают.

Также генно-инженерные HER3-экспрессирующие клетки или клеточную линию, экспрессирующую HER3, можно использовать в качестве HER3 белка. Далее подробно описан способ получения антитела против HER3.

[0051]

(1) Получение антигена

Примеры антигена, который можно использовать для получения анти-HER3 антитела, включают HER3, полипептид, состоящий из частичной аминокислотной последовательности, включающей по меньшей мере 6 последовательных HER3, и производное, полученное путем добавления определенной аминокислотной последовательности или носителя.

HER3 может быть очищен непосредствено из человеческих опухолевых тканей или опухолевых клеток и затем использоваться. Кроме того, HER3 можно получить путем его синтеза in vitro или путем его продуцирования в клетке хозяина с использованием методов генетической инженерии.

Что касается генетической инженерии, например, после встраивания HER3 кДНК в вектор, способный экспрессировать HER3 кДНК, HER3 можно получить путем его синтеза в растворе, содержащем фермент, субстрат и энергетическое вещество, необходимое для транскрипции и трансляции, или путем экспрессии HER3 в другой прокариотической или эукариотической трансформированной клетке хозяина.

Кроме того, антиген также можно получить в виде секреторного белка путем экспрессии гибридного белка, полученного путем лигирования внеклеточного домена HER3, который представляет собой мембранный белок, с константной областью антитела в подходящей системе хозяин-вектор.

HER3 кДНК можно получить, например, так называемым методом ПЦР, в котором полимеразную цепную реакцию (указываемую как "ПЦР"; см. Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489) осуществляют с использованием библиотеки кДНК, экспрессирующей HER3 кДНК в качестве матрицы, и праймеров, которые специфически амплифицируют HER3 кДНК.

В качестве примера in vitro синтеза полипептида, например, но без ограничения, можно указать, но не ограничиваясь этим, Быструю Систему Трансляции (RTS), изготовитель Roche Diagnostics, Inc.

Примеры прокариотических клеток хозяина включают Escherichia coli и Bacillus subtilis. Для трансформирования клеток хозяина целевым геном клетки хозяина трансформируют плазмидным вектором, включающим репликон, т.е. точку начала репликации, происходящую из вида, совместимого с хозяином, и регуляторную последовательность. Кроме того, вектор предпочтительно содержит последовательность, способную сообщать фенотипическую селективность трансформированной клетке.

Примеры эукариотических клеток хозяина включают клетки позвоночных, клетки насекомых и клетки дрожжей. В качестве клеток позвоночных, например, часто используют COS клетки обезьян (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection), мышиные фибробласты NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) и дигидрофолатредуктаза-дефицитные штаммы (Urlaub, G. And Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) клеток яичников китайского хомячка (CHO клетки; ATCC: CCL-61); и т.п., однако, клетки не ограничиваются этим.

Полученный таким образом трансформант можно культивировать в соответствии со способом, обычно используемым в данной области техники, и путем культивирования трансформанта целевой полипептид продуцируется внутриклеточно или внеклеточно.

Подходящую для культивирования среду можно выбрать из различных традиционно используемых сред для культивирования в зависимости от используемых клеток хозяина. Если используют Escherichia coli, например, можно использовать LB среду, дополненную антибиотиком, таким как ампициллин или IPMG, при необходимости.

Рекомбинантный белок, продуцируемый трансформантом внутриклеточно или внеклеточно путем такого культивирования, может быть выделен и очищен любым из различных известных способов разделения на основании физического или химического свойства белка.

Конкретные примеры способов включают обработку традиционным агентом осаждения белка, ультрафильтрацию, различные типы жидкостной хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, диализ и комбинацию таких способов.

Кроме того, путем присоединения метки из шести гистидиновых остатков к рекомбинантному белку, экспрессию которого осуществляют, белок может быть эффективно очищен на колонке с никелем для аффинной хроматографии. Альтернативно, путем присоединения IgG Fc области к рекомбинантному белку, экспрессию которого осуществляют, белок может быть эффективно очищен на колонке с белком A.

Путем комбинирования описанных выше способов легко можно получить большое количество целевого полипептида с высоким выходом и высокой чистотой.

Описанный выше трансформант как таковой также можно использовать в качестве антигена. Также можно использовать клеточную линию, экспрессирующую HER3 в качестве антигена. Примеры такой клеточной линии включают, однако не ограничивается этими клеточными линиями, при условии, что они экспрессируют HER3.

[0052]

(2) Получение анти-HER3 моноклонального антитела

Примеры антитела, специфически связывающегося с HER3, включают моноклональное антитело, специфически связывающееся с HER3, и способ получения антитела описан ниже.

Для получения моноклонального антитела, как правило, требуются следующие технологичееские стадии:

(a) очистка биополимера, используемого в качестве антигена, или получение клеток, экспрессирующих антиген;

(b) получение антитело-продуцирующих клеток путем иммунизации животного инъекцией антигена, сбор крови, анализ титра антител для определения времени удаления селезенки;

(c) получение клеток миеломы (далее указаны как "миелома");

(d) слияние антитело-продуцирующих клеток с миеломой;

(e) скрининг группы гибридом, продуцирующих желаемое антитело;

(f) разделение гибридом на отдельные клеточные клоны (клонирование);

(g) необязательно, культивирование гибридомы или выращивание животного с имплантированной гибридомой для получения большого количества моноклонального антитела;

(h) исследование полученного таким образом моноклонального антитела на биологическую активность и специфичность связывания или анализ антитела на свойства в качестве меченого реагента; и т.п.

Далее, способ получения моноклонального антитела, следуя описанным выше стадиям, будет описан подробно, однако, способ не ограничивается этим, и, например, можно использовать антитело-продуцирующие клетки, отличные от клеток селезенки и миеломы.

[0053]

(a) Очистка антигена

В качестве антигена можно использовать HER3, полученный способом, описанным выше, или его частичный пептид.

Кроме того, мембранную фракцию, полученную из рекомбинантных клеток, экспрессирующих HER3, или сами рекомбинантные клетки, экспрессирующие HER3, а также частичный пептид белка по настоящему изобретению, химически синтезированный способом, известным специалистам в данной области, также можно использовать в качестве антигена.

Кроме того, клеточную линию, экспрессирующую HER3, также можно использовать в качестве антигена.

[0054]

(b) Получение антитело-продуцирующих клеток

Антиген, полученный на стадии (a), смешивают с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда, или вспомогательным веществом, таким как алюминия-калия сульфат, и полученную смесь используют в качестве иммуногена для иммунизации экспериментального животного. В альтернативном способе, экспериментальное животное иммунизируют антиген-экспрессирующими клетками в качестве иммуногена. В качестве экспериментального животного можно безбоязненно использовать любое животное, используемое в известном способе получения гибридом. В частности, можно использовать, например, мышь, крысу, козу, овцу, корову, лошадь или т.п. Однако, с точки зрения простоты доступности миеломных клеток для слияния с экстрагированными антитело-продуцирующими клетками, предпочтительно используют мышь или крысу в качестве животного для иммунизации.

Кроме того, штамм мыши или крысы, который можно использовать, конкретно не ограничивается, и в случае мыши, например, можно использовать различные штаммы, такие как A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB и 129 и т.п., и в случае крысы, можно использовать, например, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer и т.п.

Эти мыши и крысы коммерчески доступны от компаний-производителей/дистрибьюторов экспериментальных животных, например, CLEA Japan, Inc. и Charles River Laboratories Japan, Inc.

При рассмотрении совместимости слияния с миеломными клетками, описанными ниже, в случае мыши штамм BALB/c, а в случае крысы штаммы Wistar и Low являются особенно предпочтительными в качестве животного для иммунизации.

Кроме того, с учетом антигенной гомологии между человеком и мышью, также предпочтительно использовать мышь, имеющую пониженную биологическую функцию для удаления аутоантител, то есть мышь с аутоиммунным заболеванием.

Возраст такой мыши или крысы на момент иммунизации предпочтительно составляет 5-12 недель, более предпочтительно 6-8 недель.

Для иммунизации животного HER3 или его рекомбинантом, можно использовать, например, известный способ, описанный подробно, например, в Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964), или т.п.

Из этих способов иммунизации конкретный предпочтительный в настоящем изобретении способ представляет собой, например, следующий.

А именно, сначала фракцию мембранного белка, служащего в качестве антигена, или клетки, в которых вызывают экспрессию антигена, внутрикожно или интраперитонеально вводят животному. Однако комбинация обоих путей введения является предпочтительной для повышения эффективности иммунизации, и когда внутрикожное введение осуществляют в первой половине, и интраперитонеальное введение осуществляют в следующей половине или только как последнее введение, эффективность иммунизаци особенно повышается.

Схема введения антигена варьируется в зависимости от типа животного, подлежащего иммунизации, индивидуальных особенностей или т.п. Однако, как правило, схема введения, в которой частота введенияя антигена составляет от 3 до 6 раз и интервал дозирования составляет от 2 до 6 недель, является предпочтительной, и более предпочтительной является схема введения, в которой частота введения антигена составляет от 3 до 4 раз и интервал дозирования составляет от 2 до 4 недель.

Кроме того, доза антигена варьируется в зависимости от типа животного, индивидуальных особенностей или т.п., однако, дозу, как правило, устанавливают на уровне 0,05-5 мг, предпочтительно около 0,1-0,5 мг.

Бустер-иммунизацию осуществляют через 1-6 недель, предпочтительно 1-4 недели, более предпочтительно 1-3 недели после введения антигена, описанного выше. Когда иммуноген представляет собой клетку, используют от 1ʹ10⁶ до 1ʹ10⁷ клеток.

Доза антигена на момент времени осуществления бустер-иммунизации варьируется в зависимости от типа или размера животного или т.п., однако, в случае, например, мыши, дозу, как правило, устанавливают на уровне 0,05-5 мг, предпочтительно 0,1-0,5 мг, более предпочтительно около 0,1-,2 мг. Когда иммуноген представляет собой клеткe, используют от 1ʹ10⁶ до 1ʹ10⁷ клеток.

Клетки селезенки или лимфоциты, включая антитело-продуцирующие клетки, асептически выделяют у иммунизированного животного через 1-10 дней, предпочтительно 2-5 дней, более предпочтительно 2-3 дня после бустер-иммунизации. В это время измеряют титр антител, и, если животное, имеющее достаточно повышенный титр антител, используют в качестве источника антитело-продуцирующих клеток, последующую процедуру можно осуществить более эффективно.

Примеры способа измерения титра антител, который можно использовать в настоящем изобретении, включают RIA метод и ELISA метод, но способ не ограничивается этим. Например, если используют ELISA, измерение титра антител в настоящем изобретении можно осуществить в соответствии с процедурами, описанными ниже.

Сначала очищенный или частично очищенный антиген адсорбируют на поверхности твердой фазы, такой как 96-луночный планшет для ELISA, и поверхность твердой фазы, не содержащую никакого адсорбированного антигена, покрывают белком, никак не связанным с этим антигеном, таким как бычий сывороточный альбумин (BSA). После промывки поверхности, поверхность приводят в контакт с серийно разведенным образцом (например, мышиная сыворотка) в качестве первичного антитела для обеспечения возможности связывания содержащегося в образце антитела с антигеном.

Затем, в качестве вторичного антитела, добавляют меченное ферментом антитело против мышиного антитела и обеспечивают возможность связывания с мышиным антителом. После промывки добавляют субстрат для фермента и измеряют изменение поглощения, которое происходит из-за проявления цвета, индуцируемого разложением субстрата или т.п., и титр антител рассчитывают на основании полученных показателей.

Выделение антитело-продуцирующих клеток из клеток селезенки или лимфоцитов иммунизированного животного можно осуществить в соответствии с известным способом (например, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Например, в случае клеток селезенки, можно использовать общий способ, в котором антитело-продуцирующие клетки выделяют путем гомогенизации селезенки с получением клеток через фильтрацию с использованием сита из нержавеющей стали и суспендирования клеток в минимальной эссенциальной среде Игла (MEM).

[0055]

(c) Получение миеломных клеткок (далее указаны как "миелома")

Миеломные клетки, которые можно использовать для клеточного слияния, конкретно не ограничиваются, и подходящие клетки можно выбрать из известных клеточных линий. Однако, учитывая удобство, когда гибридому выбирают из слитых клеток, предпочтительно использовать HGPRT (гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза)-дефицитный штамм, процедура выбора которого хорошо известна.

Более конкретно, примеры HGPRT-дефицитного штамма включают X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO и BU.1, полученные от мышей; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3), полученный от крысы; и U266AR(SKO-007), GM1500⋅GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) и 8226AR/NIP4-1(NP41), полученные от человека. Эти HGPRT-дефицитные штаммы доступны, например, от ATCC или т.п.

Эти клеточные штаммы субкультивируют в подходящей среде, такой как среда с 8-азагуанином (среда, полученная путем добавления 8-азагуанина к RPMI 1640 среде, дополненной глутамином, 2-меркаптоэтанолом, гентамицином и фетальной телячьей сывороткой (далее указана как "FBS")), модифицированная Исковом среда Дульбекко (IMDM) или среда Дульбекко, модифицированная Иглом (DMEM). В этом случае, за 3-4 дня до осуществляния клеточного слияния клетки субкультивируют в нормальной среде (например, ASF104 среда (изготовитель Ajinomoto Co., Ltd.), содержащая 10% FCS) для обеспечения не менее чем 2 × 10⁷ клеток в день слияния клеток.

[0056]

(d) Клеточное слияние

Слияние между антитело-продуцирующими клетками и миеломными клетками можно подходящим образом осуществить в соответствии с известным способом (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.) в таких условиях, чтобы процент выживания клеток сильно не уменьшался.

В качестве такого способа можно использовать, например, химический способ, в котором антитело-продуцирующие клетки и миеломные клетки смешивают в растворе, содержащем полимер, такой как полиэтиленгликоль, при высокой концентрации, физический способ с использованием электрической стимуляции или т.п. Из этих способов, конкретный пример химического способа описан ниже.

А именно, в случае, когда используют полиэтиленгликоль в растворе, содержащем полимер при высокой концентрации, антитело-продуцирующие клетки и миеломные клетки смешивают в растворе полиэтиленгликоля, имеющего молекулярную массу 1500-6000, более предпочтительно 2000-4000, при температуре от 30 до 40°C, предпочтительно от 35 до 38°C, в течение 1-10 минут, предпочтительно 5-8 минут.

[0057]

(e) Выбор группы гибридом

Способ выбора гибридом, полученных путем описанного выше клеточного слияния, конкретно не ограничивается. Обычно используют HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) способ выбора (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550).

Этот способ эффективен, когда гибридомы получены с использованием миеломных клеток HGPRT-дефицитного штамма, которые не могут выживать в присутствии аминоптерина. То есть, путем культивирования неслитых клеток и гибридом в HAT среде селективно обеспечивают возможность выживания и пролиферации только гибридом, резистентных к аминоптерину.

[0058]

(f) Деление на отдельные клеточные клоны (клонирование)

В качестве метода клонирования для гибридом можно использовать известный метод, такой как метод с использованием метилцеллюлозы, метод с использованием мягкой агарозы или метод серийных разведений (см., например, Barbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Из этих методов особенно предпочтительным является метод трехмерного культивирования, такой какой метод с использованием метилцеллюлозы. Например, группу гибридом, полученных путем клеточного слияния, суспендируют в метилцеллюлозной среде, такой как ClonaCell-HY Selection Medium D (изготовитель StemCell Technologies, Inc., #03804), и культивируют. Затем образовавшиеся колонии гибридом собирают, таким образом, можно получить моноклональные гибридомы. Собранные соответствующие колонии гибридом культивируют, и гибридому, которую подтверждают как имеющую стабильный титр антител в полученном супернатанте культуры гибридом, выбирают в качестве HER3 моноклональное антитело-продуцирующего гибридомного штамма.

[0059]

(g) Получение моноклонального антитела путем культивирования гибридомы

Путем культивирования выбранной таким образом гибридомы можно осуществить эффективное получение моноклонального антитела. Однако предпочтительно до культивирования осуществить скрининг гибридомы, которая продуцирует целевое моноклональное антитело.

Для такого скрининга можно использовать известный способ.

Измерение титра антител в настоящем изобретении можно осуществить, например, методом ELISA, который объясняется в пункте (b), описанном выше.

Гибридому, полученную способом, описанным выше, можно хранить в замороженном состоянии в жидком азоте или в морозильнике при -80°C или ниже.

После завершения клонирования среду HT заменяют нормальной средой и осуществляют культивирование гибридомы.

Крупномасштабное культивирование осуществляют путем ротации культуры с использованием большого культурального сосуда или путем центрифугирования культуры. Из супернатанта, полученного путем крупномасштабного культивирования, можно получить моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком по настоящему изобретению, путем очистки с использованием способа, известного специалистам в данной области, такого как гель-фильтрация.

Затем гибридому вводят путем инъекции в брюшную полость мыши того же штамма, что и гибридома (например, описанного выше BALB/c), или Nu/Nu мыши для пролиферации гибридомы, посредством чего можно получить асциты, содержащие большое количество моноклонального антитела по настоящему изобретению.

В случае, когда гибридому вводят в брюшную полость, если за 3-7 дней до этого вводят минеральное масло, такое как 2,6,10,14-тетраметилпентадекан (пристан), можно получить большее количество асцитов.

Например, предварительно вводят иммуносупрессант путем инъекции в брюшную полость мыши того же штамма, что и гибридома, для инактивации T клеток. Через 20 дней после этого 10^6-10⁷ гибридомных клеток суспендируют в бессывороточной среде (0,5 мл) и суспензию вводят в брюшную полость мыши. Как правило, когда брюшная полость увеличивается и наполняется асцитами, асциты собирают от мыши. Этим способом можно получить моноклональное антитело при концентрации, которая примерно в 100 раз или более выше, чем концентрация в культуральном растворе.

Моноклональное антитело, полученное способом, описанным выше, можно очистить способом, описанным, например, в Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987).

Полученное таким образом моноклональное антитело имеет высокую антиген-специфичность в отношении HER3.

[0060]

(h) Анализ моноклонального антитела

Изотип и подкласс полученного таким образом моноклонального антитела можно определить следующим образом.

Прежде всего, примеры способа идентификации включают метод Оухтерлони, метод ELISA и метод RIA.

Метод Оухтерлони является простым, но когда концентрация моноклонального антитела является низкой, необходима процедура конденсации.

С другой стороны, когда используют метод ELISA или метод RIA, путем непосредственного взаимодействия культурального супернатанта с антиген-адсорбированной твердой фазой и с использованием антител, соответствующих различным изотипам и подклассам иммуноглобулинов, в качестве вторичных антител, можно идентифицировать изотип и подкласс моноклонального антитела.

Кроме того, в качестве более простого способа также можно использовать коммерчески доступный идентификационный набор (например, Mouse Typer Kit, изготовитель Bio-Rad Laboratories, Inc.) или т.п.

Кроме того, количественное определение белка можно осуществить методом Фолина-Лоури и методом расчета на основании поглощения при 280 нм (1,4 (OD 280)=Иммуноглобулин 1 мг/мл).

Кроме того, даже когда моноклональное антитело получают отдельно и независимо путем осуществления снова стадий (a)-(h) в пункте (2), можно получить антитело, обладающее цитотоксической активностью, которая эквивалетна активности анти-HER3 антитела. В качестве одного примера такого антитела можно указать антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-HER3 антитело. Если новое полученное моноклональное антитело связывается с частичным пептидом или частичной третичной структурой, с которой связывается анти-HER3 антитело, можно определить, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, что и анти-HER3 антитело. Кроме того, путем подтверждения, что моноклональное антитело конкурирует с анти-HER3 антителом за связывание с HER3 (то есть моноклональное антитело препятствует связыванию между анти-HER3 антителом и HER3), можно определить, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, что и анти-HER3 антитело, даже если специфическая последовательность или структура эпитопа не определена. Когда подтверждают, что эпитоп является тем же самым, можно с уверенностью ожидать, что моноклональное антитело обладает такой же аффинностью связывания с антигеном и биологической активностью, как анти-HER3 антитело.

[0061]

(3) Другие антитела

Антитело по настоящему изобретению включает не только описанное выше моноклональное антитело против HER3, но также рекомбинантное антитело, полученное путем искусственной модификации в целях снижения гетерологичной антигенности для человека, такое как химерное антитело, гуманизированное антитело и человеческое антитело. Эти антитела можно получить с использованием известного способа.

В качестве химерного антитела, можно указать в качестве примера антитело, в котором вариабельная и константная области антитела происходят из разных видов, например, химерное антитело, в котором происходящая из мыши или крысы вариабельная область антитела связана с имеющей человеческое происхождение константной областью антитела (см. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)).

В качестве гуманизированного антитела, можно указать в качестве примера антитело, полученное путем интегрирования только определяющей комплементарность области (CDR) в антитело человеческого происхождения (см. Nature (1986) 321, pp. 522-525), и антитело, полученное путем прививки части аминокислотных остатков каркаса, а также CDR последовательности к человеческому антителу методом CDR-прививки (Международная публикация № WO 90/07861).

Термин "несколько", как он используется в настоящей заявке, относится к 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 или 1 или 2.

[0062]

В соответствии с настоящим изобретением, должно быть понятно, что аминокислотная последовательность связывающегося белка по настоящему изобретению не ограничивается двадцатью традиционными аминокислотами (см. Immunology - A Synthesis (2^nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), который включен в настоящую заявку посредством ссылки). Например, аминокислоты могут включать стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати традиционных аминокислот, не встречающиеся в природе аминокислоты, такие как альфа-,альфа-дизамещенные аминокислоты, N-алкил аминокислоты, молочную кислоту и другие нетрадиционные аминокислоты. Примеры нетрадиционных аминокислот, которые также могут быть подходящими компонентами для связывающегося белка по настоящему изобретению, включают: 4-гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат, эпсилон-N,N,N-триметиллизин, эпсилон-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, сигма-N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и имино кислоты, например, 4-гидроксипролин.

[0063]

В качестве аминокислотнной замены в настоящем описании, консервативная аминокислотная замена является предпочтительной. Консервативная аминокислотная замена относится к замене, происходящей в группе аминокислот, относящихся к боковым цепям аминокислот. Предпочтительными аминокислотными группами являются следующие: кислотная группа (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); оснóвная группа (лизин, аргинин и гистидин); не-полярная группа (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан); и незаряженное полярное семейство (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин и тирозин). Более предпочтительные аминокислотные группы представляют собой следующие: алифатическая гидрокси группа (серин и треонин); амид-содержащая группа (аспарагин и глутамин); алифатическая группа (аланин, валин, лейцин и изолейцин); и ароматическая группа (фенилаланин, триптофан и тирозин). Такую аминокислотную замену предпочтительно осуществляют в пределах, которые не ухудшают свойства вещества, имеющего исходную аминокислотную последовательность. Когда тяжелая и легкая цепи антитела по настоящему изобретению содержат глутамат в качестве N-концевой аминокислоты, он может быть циклизован (в форме пироглутамата). В настоящем изобретении такой пироглутамат не отличается от нормального глутамина в аминокислотных последовательностях. В тяжелой и легкой цепях антитела по настоящему изобретению цистеин может быть в форме цистеинила. В настоящем изобретении такая цистеинильная форма не отличается от нормального цистеина в аминокислотных последовательностях.

[0064]

Кроме того антитело по настоящему изобретению включает человеческое антитело, которое связывается с HER3. Анти-HER3 человеческое антитело относится к человеческому антителу, имеющему только последовательность гена антитела, происходящую из человеческой хромосомы. Анти-HER3 человеческое антитело можно получить способом с использованием продуцирующей человеческое антитело мыши, имеющей фрагмент человеческой хромосомы, включающий гены тяжелой и легкой цепи человеческого антитела (см. Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, и т.д.).

[0065]

Такую продуцирующую человеческое антитело мышь можно создать, в частности, следующим способом. Создают генетически модифицированное животное, у которого локусы эндогенных генов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина были разорваны и вместо этого были вставлены локусы генов тяжелой и легкой цепи человеческого иммуноглобулина через вектор, представляющий собой искусственную дрожжевую хромосому (YAC) или т.п., путем получения нокаут-животного и трансгенного животного и спаривания этих животных.

Кроме того, в соответствии с методом рекомбинантной ДНК, путем использования кДНК, кодирующих каждую из таких тяжелой цепи и легкой цепи человеческого антитела, и предпочтительно вектора, включающего такие кДНК, эукариотные клетки трансформируют и трансформированную клетку, которая продуцирует рекомбинантное человеческое моноклональное антитело, культивируют, посредством чего антитело также может быть получено из культурального супернатанта.

Здесь, в качестве хозяина можно использовать, например, эукариотные клетки, предпочтительно клетки млекопитающего, такие как CHO клетки, лимфоциты или миеломные клетки.

Что касается получения человеческого антитела, подробное описание представлено в Международной публикации № WO 2007/077028. Содержание Международной публикации № WO 2007/077028 включено в настоящую заявку посредством ссылки.

[0066]

Кроме того, также известен способ получения человеческого антитела с применением фагового дисплея, которое выбирают из библиотеки человеческих антител (см. Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431, etc.).

Например, можно использовать способ с применением фагового дисплея, в котором вариабельная область человеческого антитела экспрессируется на поверхности фага в виде одноцепочечного антитела (scFv), и можно выбрать фаг, который связывается с антигеном (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116).

Путем анализа гена фага, выбранного на основании связывания с антигеном, можно определить последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область человеческого антитела, которое связывается с антигеном.

Если определена ДНК-последовательность scFv, связывающегося с антигеном, человеческое антитело можно получить путем получения вектора экспрессии, включающего эту последовательность, и введения вектора подходящему хозяину для ее экспрессии (Международная публикация № WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, pp. 433-455; Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).

[0067]

Один аспект настоящего изобретения относится к выделенному белку, который связывается с HER3. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенный HER3-связывающий белок по настоящему изобретению включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, включающую: (a) CDRH1, содержащийся в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 или 230, (b) CDRH2, содержащийся в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 или 230, и (c) CDRH3, содержащийся в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 или 230, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, включающую: (d) CDRL1, содержащийся в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 или 232, (e) CDRL2, содержащийся в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 или 232, и (f) CDRL3, содержащийся в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 или 232.

[0068]

Выделенный HER3-связывающий белок по настоящему изобретению предпочтительно включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи, включающую (a) CDRH1, включающий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 236, 251, 252 и 256; (b) CDRH2, включающий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 258, 278, 280 и 282; и (c) CDRH3, включающий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 283, 285, 309, 313 и 315, и аминокислотную последовательность легкой цепи, включающую (d) CDRL1, включающий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 320, 334, 337 и 340; (e) CDRL2, включающий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 343, 356, 351 и 344; и (f) CDRL3, включающий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 360, 381, 385 и 387.

[0069]

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, выделенный связывающийся белок по настоящему изобретению включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID Nos: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 и 230, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 и 232.

[0070]

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенный связывающийся белок по настоящему изобретению включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 2 и 4, 6 и 8, 10 и 12, 14 и 16, 18 и 20, 22 и 24, 26 и 28, 30 и 32, 36 и 38, 42 и 44, 46 и 48, 50 и 52, 54 и 56, 60 и 58, 62 и 64, 66 и 68, 70 и 72, 74 и 76, 78 и 82, 80 и 82, 84 и 86, 88 и 90, 92 и 94, 96 и 98, 100 и 102, 104 и 106, 108 и 110, 112 и 114, 116 и 118, 122 и 124, 126 и 128, 130 и 132, 134 и 136, 138 и 140, 142 и 144, 146 и 148, 150 и 152, 154 и 156, 158 и 160, 162 и 164, 166 и 168, 170 и 172, 174 и 176, 178 и 180, 182 и 184, 186 и 188, 190 и 192, 194 и 196, 198 и 200, 202 и 204, 206 и 208, 210 и 212, 214 и 216, 218 и 220, 222 и 224, 226 и 228 или 230 и 232, или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 34, 40, 60, 62 или 120, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 58 или 64, соответственно.

Выделенный HER3-связывающий белок по настоящему изобретению более предпочтительно включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 42, 54, 70, 92 или 96, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 44, 56, 72, 94 или 98.

[0071]

Антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 2 и 4, обозначается как "U1-39", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 6 и 8, обозначается как "U1-40", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 10 и 12, обозначается как "U1-38", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 14 и 16, обозначается как "U1-41", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 18 и 20, обозначается как "U1-42", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 22 и 24, обозначается как "U1-43", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 26 и 28, обозначается как "U1-44", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 30 и 32, обозначается как "U1-45", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 36 и 38, обозначается как "U1-47", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 42 и 44, обозначается как "U1-49", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 46 и 48, обозначается как "U1-50", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 50 и 52, обозначается как "U1-51", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 54 и 56, обозначается как "U1-53", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 60 и 58, обозначается как "U1-55", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 62 и 64, обозначается как "U1-57", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 66 и 68, обозначается как "U1-58", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 70 и 72, обозначается как "U1-59", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 74 и 76, обозначается как "U1-52", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 78 и 82, обозначается как "U1-61", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 80 и 82, обозначается как "U1-61.1", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 84 и 86, обозначается как "U1-62", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 88 и 90, обозначается как "U1-2", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 92 и 94, обозначается как "U1-7", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 96 и 98, обозначается как "U1-9", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 100 и 102, обозначается как "U1-10", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 104 и 106, обозначается как "U1-12", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 108 и 110, обозначается как "U1-13", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 112 и 114, обозначается как "U1-14", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 116 и 118, обозначается как "U1-15", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 122 и 124, обозначается как "U1-20", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 126 и 128, обозначается как "U1-21", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 130 и 132, обозначается как "U1-22", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 134 и 136, обозначается как "U1-23", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 138 и 140, обозначается как "U1-24", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 142 и 144, обозначается как "U1-25", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 146 и 148, обозначается как "U1-26", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 150 и 152, обозначается как "U1-27", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 154 и 156, обозначается как "U1-28", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 158 и 160, обозначается как "U1-31", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 162 и 164, обозначается как "U1-32", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 166 и 168, обозначается как "U1-35", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 170 и 172, обозначается как "U1-36", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 174 и 176, обозначается как "U1-37", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 178 и 180, обозначается как "U1-34", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 182 и 184, обозначается как "U1-1", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 186 и 188, обозначается как "U1-3", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 190 и 192, обозначается как "U1-4", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 194 и 196, обозначается как "U1-5", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 198 и 200, обозначается как "U1-6", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 202 и 204, обозначается как "U1-8", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 206 и 208, обозначается как "U1-11", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 210 и 212, обозначается как "U1-16", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 214 и 216, обозначается как "U1-17", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 218 и 220, обозначается как "U1-18", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 222 и 224, обозначается как "U1-33", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 226 и 228, обозначается как "U1-29", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 230 и 232, обозначается как "U1-30", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 34, обозначается как "U1-46", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 40, обозначается как "U1-48", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 60 и 58, обозначается как "U1-55.1", антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 120, обозначается как "U1-19", и антитело, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 62 и 64, обозначается как "U1-57.1". Эти антитела подробно описаны в Примерах.

Выделенный HER3-связывающий белок по настоящему изобретению еще более предпочтительно включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 42 и 44, соответственно, аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 54 и 56, соответственно, аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 70 и 72, соответственно, аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 92 и 94, соответственно или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленные в SEQ ID NOs: 96 и 98, соответственно, и даже еще более предпочтительными HER3-связывающими белками являются U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 или U1-9, которые представляют собой анти-HER3 антитело.

[0072]

[Химическая формула 14]

[0073]

[Химическая формула 15]

[0074]

Когда новое образованное моноклональное антитело связывается с частичным пептидом или частичной третичной структурой, с которой связывается U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 или U1-9 антитело, можно определить, что антитело связывается с тем же самым эпитопом, что и U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 или U1-9 антитело. Кроме того, путем подтверждения, что антитело конкурирует с U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 или U1-9 антителом за связывание с HER3 (т.е., антитело ингибирует связывание между U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 или U1-9 антителом и HER3), можно определить, что антитело связывается с тем же самым эпитопом, что и U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 или U1-9 антитело, даже когда специфическая последовательность или структура эпитопа не определена. После подтверждения, что эпитоп является тем же самым, имеются все основания ожидать, что антитело обладает биологической активностью, эквивалентной активности U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 или U1-9 антитела.

[0075]

В соответствии с настоящим изобретением, связывающийся белок по настоящему изобретению взаимодействует с по меньшей мере одним эпитопом в внеклеточной части HER3. Эпитопы предпочтительно расположены в домене L1 (aa 19-184), который представляет собой амино-концевой домен, в домене S1 (aa 185-327) и S2 (aa 500-632), которые представляют собой два Цистеин-обогащенных домена, в домене L2 (328-499), который фланкирован двумя Цистеин-обогащенными доменами, или в комбинации HER3 доменов. Эпитопы также могут быть расположены в комбинациях доменов, например, но не ограничиваясь этим, эпитоп, состоящий из частей L1 и S1. Кроме того, связывающийся белок по настоящему изобретению также отличается тем, что его связывание с HER3 снижает HER3-опосредованную сигнальную трансдукцию. В соответствии с настоящим изобретением, снижение HER3-опосредованной сигнальной трансдукции может быть вызвано, например, даун-регуляцией HER3, приводящей к по меньшей мере частичному исчезновению HER3 молекулы с клеточной поверхности, или путем стабилизаци HER3 на клеточной поверхности в по существу неактивной форме, т.е. в форме, которая демонстрирует более низкую сигнальную трансдукцию по сравнению с нестабилизированной формой. Альтернативно, снижение HER3-опосредованной сигнальной трансдукции также может быть вызвано влиянием, например, уменьшения или ингибирования связывания лиганда или другого члена HER семейства с HER3, GRB2 с HER-2 или GRB2 с SHC, ингибированием фосфорилирования тирозин рецептора, фосфорилирования AKT, фосфорилирования тирозина PYK2 или фосфорилирования ERK2 или уменьшением инвазивности опухоли. Альтернативно, снижение HER3-опосредованной сигнальной трансдукции также может быть вызвано влиянием, например, уменьшения или ингибирования образования HER3-содержащих димеров с другими членами HER семейства. Одним примером, среди прочих, может быть уменьшение или ингибирование образования HER3-EGFR белкового комплекса.

[0076]

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, минорные изменения в аминокислотных последовательностях, представленных в SEQ ID NOs: 1-232, предусматриваются как охватываемые настоящим изобретением, при условии, что даже такие изменения в аминокислотной последовательности все же сохраняют по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, 90%, 95% и наиболее предпочтительно 99% последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 1-232. Изменения могут иметь место в каркасных областях (т.е. вне CDRs), в CDRs или в каркасных областях и в CDRs. Предпочтительные изменения в аминокислотных последовательностях, представленных в SEQ ID NOs: 1-232, т.е. делеции, вставки и/или замены по меньшей мере одной аминокислоты, происходят вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены можно идентифицировать путем сравнения данных нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с публичными или защищенными правом собственности базами данных последовательностей. Компьютеризованные методы сравнения можно использовать для идентификации мотивов последовательности или предсказанных конформационных доменов белков, которые возникают в других связывающих белках известной структуры и/или функции. Способы идентификации последовательностей белков, которые укладываются в известную трехмерную структуру, известны. См., например, Bowie et al, Science 253, 164 (1991); Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at., Nature 354, 105 (1991), которые все включены в настоящую заявку посредством ссылки. Таким образом, специалист в данной области сможет определить мотивы последовательностей и структурные конформации, которые можно использовать для определения структурных и функциональных доменов в соответствии с изобретением. Из антител, полученных комбинированием тяжелых и легких цепей, имеющих изменения в таких аминокислотных последовательностях, можно выбрать антитело, эквивалентное исходному антителу (родительскому антителу) или даже лучше, чем родительское антитело. Как указано выше, HER3-связывающий белок, анти-HER3 антитело и т.п. по настоящему изобретению сохраняют HER3-связывающую активность, даже если включают изменения в их аминокислотных последовательностях.

В настоящем изобретении, термин "гомология" имеет такое же значение, что и "идентичность". Гомологию между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с использованием параметров по умолчанию Blast алгоритма, версия 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Blast алгоритм можно использовать также через интернет с доступом к сайту www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.

[0077]

Химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело, полученное указанным выше способом, можно подвергнуть известному методу для оценки свойства связывания с антигеном для выбора предпочтительных антител.

В анти-HER3 антитело по настоящему изобретению также включены MEHD-7945A (или дилиготузумаб), RG-7116, MM-111, MM-121 (или серибантумаб, MM-141, LJM-716, huHER3-8, три-специфическое анти-EGFR/ErbB3 zy-тело, GSK-2849330, REGN-1400, KTN-3379, AV-203, моноспецифическое сурро-тело (ErbB3), лумретузумаб, MP-EV-20, ZW-9, Димерсепт^TM, анти-Erb3 сурро-тело(SL-175 или SL-176), SYM-013, их варианты, активные фрагменты, модифицированные продукты и т.п.

[0078]

В качестве одного примера другого критерия для использования в сравнении свойств антител, можно указать стабильность антител. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) представляет собой инструмент для быстрого и точного измерения средней температуры термической денатурации (Tm), которую можно использовать в качестве подходящего показателя относительной конформационной стабильности белков. Путем измерения Tm значений с использованием ДСК и сравнения значений можно определить разницу в термостабильности. Известно, что стабильность при хранении антител показывает некоторую корреляцию с термостабильностью антител (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), и предпочтительное антитело можно выбрать с использованием термостабильности в качестве критерия оценки. Примеры других критериев для выбора антитела включают следующие: выход в подходящей клетке хозяина является высоким; и агрегируемость в водном растворе является низкой. Например, антитело, которое показывает самый высокий выход, не всегда демонстрирует самую высокую термостабильность, и поэтому необходимо выбрать антитело, наиболее подходящее для введения человеку, путем осуществления всесторонней оценки на основании описанных выше критериев.

[0079]

Антитело по настоящему изобретению охватывает модифицированный вариант антитела. Модифицированный вариант относится к варианту, который получают, подвергая антитело по настоящему изобретению химической или биологической модификации. Примеры химически модифицированного варианта включают варианты, химически модифицированные путем связывания химической группы с аминокислотным скелетом, варианты, химически модифицированные N-связанной или O-связанной углеводной цепью, и т.д. Примеры биологически модифицированного варианта включают варианты, полученные путем посттрансляционной модификации (такие как N-связанное или O-связанное гликозилирование, N- или C-концевой процессинг, де-амидирование, изомеризация аспарагиновой кислоты или окисление метионина), и варианты, в которых метиониновый остаток был добавлен к N концу путем экспрессии в прокариотической клетке хозяина. Кроме того, антитело, меченное таким образом, чтобы обеспечить детекцию или выделение антитела или антигена по настоящему изобретению, например, фермент-меченное антитело, флуоресцентно-меченное антитело и аффинно-меченное антитело, также включено в значение модифицированного варианта. Такой модифицированный вариант антитела по настоящему изобретению является полезным для улучшения стабильности и удержания в кровотоке антитела, снижения его антигенности, детекции или выделения антитела или антигена и т.д.

[0080]

Кроме того, регулируя модификацию гликана, который связывается с антителом по настоящему изобретению (гликозилирование, дефукозилирование и т.д.), можно повысить антитело-зависимую клеточную цитотоксическую активность. Способ регулирования модификации гликана антител известен из Международной публикации № WO 1999/54342, WO 2000/61739, WO 2002/31140 и т.д. Однако способ не ограничивается этим. Антитело по настоящему изобретению также включает антитело, в котором модификация гликана регулируется.

В случае, когда антитело получают, выделяя сначала ген антитела, и затем вводят этот ген подходящему хозяину, можно использовать комбинацию подходящего хозяина и подходящего экспрессирующего вектора. Конкретные примеры гена антитела включают комбинацию гена, кодирующего последовательность тяжелой цепи антитела, и гена, кодирующего последовательность его легкой цепи, описанных в настоящем описании. Когда трансформируют клетку хозяина, можно вставить последовательность гена тяжелой цепи и последовательность гена легкой цепи в один и тот же экспрессирующий вектор, а также в разные экспрессирующие векторы отдельно.

В случае, когда используют эукариотные клетки в качестве хозяина, можно использовать животные клетки, растительные клетки и эукариотные микроорганизмы. В качестве примера животных клеток можно указать клетки млекопитающих, например, обезьяньи COS клетки (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), мышиные фибробласты NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) и дигидрофолатредуктаза-дефицитные штаммы (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) клеток яичников китайского хомячка (CHO клетки; ATCC: CCL-61).

В случае, когда используют прокариотические клетки, например, Escherichia coli и Bacillus subtilis можно указать в качестве примера.

Путем введения гена желаемого антитела в эти клетки через трансформацию и культивирования трансформированных таким образом клеток in vitro можно получить антитело. В описанном выше способе культивирования, выход может иногда варьироваться в зависимости от последовательности антитела, и поэтому из антител, обладающих эквивалетной активностью связывания, используя выход в качестве критерия оценки, можно выбрать антитело, которое легко можно получить в качестве фармацевтического средства. Поэтому в антитело по настоящему изобретению, также включено антитело, полученное способом получения антитела, отличающимся тем, что он включает стадию культивирования трансформированной клетки хозяина и стадию сбора желаемого антитела из культивированного продукта, полученного на стадии культивирования.

[0081]

Известно, что лизиновый остаток на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела, которое продуцируется в культивированной клетке млекопитающего, может быть делетирован/элиминирован (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), и также известно, что два аминокислотных остатка (глицин и лизин) на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела, которое продуцируется в культивированной клетке млекопитающего, могут быть делетированы/элиминированы, и новый пролиновый остаток на карбоксильном конце может быть амидирован (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Однако такая делеция/элиминирование и модификация последовательности тяжелой цепи не влияют на аффинность связывания с антигеном и эффекторную функцию (активация комплемента, антитело-зависимая клеточная цитотоксичность и т.д.) антитела. Поэтому в антитело в соответствии с настоящим изобретением также включено антитело и функциональный фрагмент антитела, подвергаемые такой модификации, а также охватываются делеционный вариант, в котором одна или две аминокислоты делетированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, вариант, полученный амидированием делеционного варианта (например, тяжелая цепь, в которой карбокси-концевой пролиновый остаток амидирован), и т.п. Тип делеционного варианта, включающий делецию на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела в соответствии с изобретением не ограничивается описанными выше вариантами, при условии, что аффинность связывания с антигеном и эффекторная функция сохраняются. Две тяжелые цепи антитела в соответствии с изобретением могут быть одного типа, выбранного из группы, состоящей из полноразмерной тяжелой цепи и описанного выше делеционного варианта, или могут быть двух типов в комбинации, выбранной из них. На отношение количества каждого делеционного варианта может влиять тип культивируемых клеток млекопитающего, которые продуцируют антитело в соответствии с изобретением, и условия культивирования, однако, в качестве примера можно указать случай, где один аминокислотный остаток на карбоксильном конце делетирован в каждой из двух тяжелых цепей, содержащихся в качестве основных компонентов в антителе в соответствии с изобретением. Объем целого антитела (в настоящем изобретении также просто указано как "антитело") по настоящему изобретению также включает его делеционные варианты, смеси, содержащие один или два или более его делеционных вариантов, и т.д. "Антитело" по настоящему изобретению включает антитело, включающее a тяжелую или легкую цепь, в котор N-концевой глутамат присутствует в форме пироглутамата в результате циклизации, и/или тяжелую или легкую цепь, в которой часть цистеиновых остатков находятся в форме цистеинила.

[0082]

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, анти-HER3 антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело IgA, IgD-, IgE₁ IgG- или IgM-типа, предпочтительно IgG- или IgM-типа, включая, но не ограничиваясь этим, IgGI-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgMI- и IgM2-тип. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления антитело представляет собой антитело IgGI-, IgG2- или IgG4- типа.

[0083]

В качестве биологической активности антитела, как правило, в качестве примера можно привести антиген-связывающую активность, активность интернализации антигена в клетах, экспрессирующих антиген, путем связывания с антигеном, действие по нейтрализации активности антигена, активность, направленную на усиление активности антигена, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) и антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP). Функция антитела в соответствии с изобретением представляет собой активность связывания с HER3, предпочтительно, активность интернализации HER3 в HER3-экспрессирующих клетках путем связывания с HER3. Кроме того, антитело по настоящему изобретению может обладать ADCC активностью, CDC активностью и/или ADCP активностью в дополнение к активности интернализации в клетках.

[0084]

В некоторых аспектах, например, в связи с генерацией антител в качестве терапевтических кандидатов против HER3, может быть желательным, чтобы анти-HER3 антитело по настоящему изобретению было способно фиксировать комплемент и участвовать в комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Существует ряд изотипов антител, которые обладают такой способностью, включая, без ограничений, следующие: мышиное IgM, мышиное IgG2a, мышиное IgG2b, мышиное IgG3, человеческое IgM, человеческое IgGI, человеческое IgG3 и человеческое IgA. Должно быть понятно, что антитела, которые генерируются, необязательно должны изначально иметь такой изотип, скорее генерируемое антитело может иметь любой изотип, и изотип антитела может быть переключен путем добавления молекулярно клонированных генов или кДНК V области к молекулярно клонированным генам или кДНК константной области в подходящих векторах экспрессии с использованием традиционных молекулярных биологических методов, которые хорошо известны в данной области, и затем экспрессии антител в клетах хозяина с использованием методов, известных в данной области. Изотип-переключенное антитело также может содержать Fc область, полученную путем молекулярного конструирования таким образом, чтобы она имела CDC выше, чем у природных вариантов (Idusogie et al., J Immunol., 166, 2571-2575), и рекомбинантно экспрессируемую в клетах хозяина с использованием методов, известных в данной области. Такие методы включают использование прямых рекомбинантных методов (см. например, Патент США № 4816397), методы слияния клеток (см. например, патенты США №№ 5916771 и 6207418), среди прочих. В методе клеточного слияния получают миеломную или другую клеточную линию, такую как CHO, которая имеет тяжелую цепь с любым желаемым изотипом, и получают другую миеломную или другую клеточную линию, такую как CHO, которая имеет легкую цепь. Затем можно осуществить слияние таких клеток, можно выделить клеточную линию, экспрессирующую интактное антитело. В качестве примера, можно легко осуществить переключение изотипа человеческого анти-HER3 IgG4 антитела, которое обладает желаемым связыванием с HER3 антигеном, для генерирования человеческого IgM, человеческого IgGI или человеческого IgG3 изотипа, но при этом оно будет иметь такую же вариабельную область (которая определяет специфичность антитела и некоторую его аффинность). Такая молекула затем может быть способна фиксировать комплемент и участвовать в CDC.

[0085]

Кроме того, также может быть желательным, чтобы анти-HER3 антитело по настоящему изобретению обладало способностью связывания с Fc рецепторами на эффекторных клетках, таких как моноциты и природные киллерные (NK) клетки, и участвовало в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Существует ряд изотипов антител, которые обладают такой способностью, включая, без ограничений, следующие: мышиное IgG2a, мышиное IgG2b, мышиное IgG3, человеческое IgGI и человеческое IgG3. Должно быть понятно, что антитела, которые генерируются, необязательно должны изначально иметь такой изотип, скорее генерируемое антитело может иметь любой изотип, и изотип антитела может быть переключен путем добавления молекулярно клонированных генов или кДНК V области к молекулярно клонированным генам или кДНК константной области в подходящих векторах экспрессии с использованием традиционных молекулярных биологических методов, которые хорошо известны в данной области, и затем экспрессии антител в клетах хозяина с использованием методов, известных в данной области. Изотип-переключенное антитело также может содержать Fc область, полученную путем молекулярного конструирования таким образом, чтобы она имела ADCC выше, чем у природных вариантов (Shields et al. J Biol Chem., 276, 6591-6604), и рекомбинантно экспрессируемую в клетах хозяина с использованием методов, известных в данной области. Такие методы включают использование прямых рекомбинантных методов (см. например, Патент США № 4816397), методы слияния клеток (см. например, патенты США №№ 5916771 и 6207418), среди прочих. В методе клеточного слияния получают миеломную или другую клеточную линию, такую как CHO, которая имеет тяжелую цепь с любым желаемым изотипом, и получают другую миеломную или другую клеточную линию, такую как CHO, которая имеет легкую цепь. Затем можно осуществить слияние таких клеток, можно выделить клеточную линию, экспрессирующую интактное антитело. В качестве примера, можно легко осуществить переключение изотипа человеческого анти-HER3 IgG4 антитела, которое обладает желаемым связыванием с HER3 антигеном, для генерирования человеческого человеческого IgGI или человеческого IgG3 изотипа, но при этом оно будет иметь такую же вариабельную область (которая определяет специфичность антитела и некоторую его аффинность). Такая молекула затем может быть способна связываться с FcyR на эффекторных клетках и участвовать в ADCC.

[0086]

Полученное антитело можно очистить до гомогенности. Выделение и очистку антитела можно осуществить с использованием традиционного метода разделения и очистки белков. Например, антитело можно выделить и очистить путем подходящего выбора и сочетания колоночной хроматографии, фильтрации, ультрафильтраци, осаждения солей, диализа, препаративного электрофореза на полиакриламидном геле, электрофореза с изоэлектрическим фокусированием и т.п. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но способ не ограничивается этим.

Примеры такой хроматографии включают аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, обращеннофазовую хроматографию и адсорбционную хроматографию.

Такую хроматографию можно осуществить с использованием жидкостной хроматографии, такой как высоко-эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или жидкостная хроматография быстрого разрешения.

В качестве примера колонки для использования в аффинной хроматографии, можно указать колонку с Белком A и колонку с Белком G. Например, использование колонки с Белком A, Hyper D, POROS, Сефарозой FF (Pharmacia) и т.п. можно указать в качестве примера.

Кроме того, используя носитель, содержащий иммобилизованный на нем антиген, антитело также можно очистить с использованием свойства связывания антитела с антигеном.

[0087]

[Противоопухолевое соединение]

Раскрывается противоопухолевое соединение, которое используют в конъюгате анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению. Противоопухолевое соединение, используемое в настоящем изобретении, конкретно не ограничивается, если оно представляет собой соединение, обладающее противоопухолевым эффектом и содержащее группу заместителя или частичную структуру, обеспечивающую возможность связывания с линкерной структурой. Когда часть или весь линкер противоопухолевого соединения расщепляется в опухолевых клетках, противоопухолевое соединение высвобождается для проявления противоопухолевого эффекта. Поскольку линкер отщепляется в положении связывания с лекарственным средством, противоопухолевое соединение высвобождается в его немодифицированной структуре для проявления присущего ему противоопухолевого эффекта.

В качестве противоопухолевого соединения, используемого в настоящем изобретении, предпочтительно можно использовать экзатекан, производное камптотецина ((1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-10,13(9H,15H)-дион, показанный в следующей формуле).

[0088]

[Химическая формула 16]

[0089]

Хотя он обладает отличным противоопухолевым эффектом, экзатекан не является коммерческим продуктом, поставляемым на рынок в качестве противоопухолевого лекарственного средства. Соединение легко можно получить известным способом, и амино группу в положении 1 предпочтительно можно использовать в качестве положения связывания с линкерной структурой. Кроме того, экзатекан также может высвобождаться в опухолевых клетках с частью линкера, все еще присоединенной к нему. Однако он представляет собой отличное соединение, демонстрирующее отличный противоопухолевый эффект даже в такой структуре.

Поскольку экзатекан имеет структуру камптотецина, известно, что равновесие сдвигается к структуре с замкнутым лактоновым кольцом (замкнутое кольцо) в кислой водной среде (например, pH 3 или подобный), но оно сдвигается к структуре с открытым лактоновым кольцом (раскрытое кольцо) в водно-щелочной среде (например, pH 10 или подобный). Конъюгат лекарственного средства с введенным экзатекановым остатком, соответствующим структуре с замкнутым кольцом и структуре с раскрытым кольцом, как ожидают, также будет иметь одинаковый противоопухолевый эффект, и, само собой разумеется, что любая такая структура охватывается объемом настоящего изобретения.

[0090]

Другие примеры противоопухолевого соединения могут включать доксорубицин, даунорубицин, митомицин C, блеомицин, циклоцитидин, винкристин, винбластин, метотрексат, противоопухолевое средство на основе платины (цисплатин или его производные), таксол или его производные и другой камптотецин или его производные (противоопухолевое средство, описанное в Японской выложенной патентной заявке № 6-87746).

[0091]

Что касается конъюгата антитело-лекарственное средство, количество конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела является ключевым фактором, влияющим на эффективность и безопасность. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство осуществляют путем определения реакционных условий, включая количество используемого сырья и реагентов для реакции, чтобы иметь постоянное количество конъюгированных молекул лекарственного средства, и, как правило, получают смесь, содержащую разные количества конъюгированных молекул лекарственного средства, в отличие от химической реакции низкомолекулярного соединения. Количество молекул лекарственного средства, конъюгированных в молекуле антитела, выражают или определяют как среднее значение, то есть среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства. Если принципиально не указано иное, количество конъюгированных молекул лекарственного средства означает среднюю величину, за исключением случая конъюгата антитело-лекарственное средство, имеющего определенное количество конъюгированных молекул лекарственного средства, который включен в смесь конъюгатов антитело-лекарственное средство, имеющих разное количество конъюгированных молекул лекарственного средства. Количество молекул экзатекана, конъюгированных с молекулой антитела, является контролируемым, и, в качестве среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства в расчете на антитело, могут быть связаны примерно от 1 до 10 молекул экзатекана. Предпочтительно от 2 до 8, и более предпочтительно от 3 до 8 молекул. В то же время, специалист в данной области сможет рассчитать реакцию для конъюгирования необходимого количества молекул лекарственного средства с молекулой антитела на основании описания Примеров настоящей заявки и сможет получить конъюгат антитело-лекарственное средство с контролируемым количеством конъюгированных молекул экзатекана.

Что касается конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, маловероятны случаи агрегации, нерастворимости, фрагментации или подобные, даже когда количество конъюгированных молекул лекарственного средства в расчете на молекулу антитела увеличивается.

[0092]

{Линкерная структура}

Что касается конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, линкерная структура для конъюгирования противоопухолевого соединения с анти-HER3 антителом объясняется ниже. Линкер имеет следующую структуру:

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- или -L¹-L²-L^P-,

антитело связано с концом L¹ (противоположно концу, с которым связан L²), и противоопухолевое соединение связано с карбонильной группой -L^a-(CH₂)n²-C(=O)- фрагмента или C концом L^P.

n¹ представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 6, предпочтительно, целое число, имеющее значение от 1 до 5, и более предпочтительно от 1 до 3.

[0093]

1. L¹

L¹ представлен структурой, показанной ниже:

-(Сукцинимид-3-ил-N)-(CH₂)n³-C(=O)-

В представленной выше структуре, n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 8, и "-(Сукцинимид-3-ил-N)-" имеет структуру, представленную следующей формулой:

[0094]

[Химическая формула 17]

[0095]

Положение 3 показанной выше частичной структуры представляет собой положение связывания с анти-HER3 антителом. Связывание с антителом в положении 3 характеризуется образованием тиоэфирной связи. Атом азота в положении 1 этого структурного фрагмента связан с атомом углерода метилена, который присутствует в линкере, включающем эту структуру. например, -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH₂)n³-C(=O)-L²- представляет собой структуру, представленную следующей формулой (здесь, "антитело -S-" происходит из антитела).

[0096]

[Химическая формула 18]

[0097]

В формуле, n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 8, и предпочтительно от 2 до 5.

[0098]

Конкретные примеры L¹ включают следующие.

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-

[0099]

2. L²

L² имеет структуру, представленную следующей формулой:

-NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)-

L² может не присутствовать, и в таком случае L² представляет собой простую связь. В структуре лекарственное средство-линкер по настоящему изобретению, в частности, L^P непосредствено связан с лекарственным средством, и в таком случае L² особенно предпочтительно представляет собой простую связь. n⁴ представляет собой целое число, имеющее значение от 1 до 6, и предпочтительно от 2 до 4. L² связан с L¹ по его концевой амино группе и связан с L^P по карбонильной группе противоположного конца.

[0100]

Конкретные примеры L² включают следующие.

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-

[0101]

3. L^P

L^P представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот. Например, он состоит из олигопептидного остатка, в котором 2-7 аминокислот связаны пептидной связью. L^P связан с L² на N конце и связан с амино группой -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- фрагмента линкера на C конце.

[0102]

Аминокислота, являющаяся составной частью L^P, конкретно не ограничивается, и примеры включают L- или D-аминокислоту, предпочтительной является L-аминокислота. Кроме того, это может быть аминокислота, имеющая структуру, такую как бета-аланин, эпсилон-аминокапроновая кислота или гамма-аминомасляная кислота, помимо альфа-аминокислоты, кроме того это может быть не-природного типа аминокислота, такая как N-метилированная аминокислота.

Последовательность аминокислот L^P конкретно не ограничивается, но примеры составляющих его аминокислот включают фенилаланин (Phe; F), тирозин (Tyr; Y), лейцин (Leu; L), глицин (Gly; G), аланин (Ala; A), валин (Val; V), лизин (Lys; K), цитруллин (Cit), серин (Ser; S), глутаминовую кислоту (Glu; E) и аспарагиновую кислоту (Asp; D). Из них, предпочтительные примеры включают фенилаланин, глицин, валин, лизин, цитруллин, серин, глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту. В зависимости от типа аминокислоты, картина высвобождения лекарственного средства может контролироваться. Количество аминокислот может быть от 2 до 7.

[0103]

Конкретные примеры L^P включают следующие:

-GGF-,

-DGGF-,

-(D-)D-GGF-,

-EGGF-,

-GGFG-,

-SGGF-,

-KGGF-,

-DGGFG-,

-GGFGG-,

-DDGGFG-,

-KDGGFG-,

-GGFGGGF-

"(D-)D", описанный выше, означает D-аспарагиновую кислоту. Примеры особенно предпочтительного L^P конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению включают -GGFG- и -DGGFG- пептидный остаток. Кроме того, в структуре лекарственное средство-линкер по настоящему изобретению L^P непосредствено связан с лекарственным средством, и для такого случая предпочтительные примеры L^P включают пентапептидный остаток -DGGFG-.

[0104]

4. L^a-(CH₂)n²-C(=O)-

L^a в L^a-(CH₂)n²-C(=O)- представляет собой структуру -O- или простую связь. n² представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 5, предпочтительно, от 0 до 3, и более предпочтительно 0 или 1.

Примеры L^a-(CH₂)n²-C(=O)- включают следующие:

-O-CH₂-C(=O)-,

-O-CH₂CH₂-C(=O)-,

-O-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-O-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-O-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-CH₂-C(=O)-,

-CH₂CH₂-C(=O)-,

-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

Из них, структуры с

-O-CH₂-C(=O)-,

-O-CH₂CH₂-C(=O)-

или те, в которых L^a представляет собой простую связь и n² имеет значение 0, являются предпочтительными.

[0105]

Конкретные примеры линкерной структуры, представленной как -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-, включают следующие:

-NH-CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂-O-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-

[0106]

Из них, более предпочтительны следующие:

-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-NH-CH₂CH₂-O-C(=O)-

[0107]

Что касается линкера -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-, длина цепи 4-7 атомов является предпочтительной, и более предпочтительны те, которые имеют длину цепи 5 или 6 атомов.

[0108]

Что касается конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, когда он проникает внутрь опухолевых клеток, считают, что линкерная группа отщепляется, и лекарственное производное, имеющее структуру, представленную как NH₂-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-(NH-DX), высвобождается с проявлением противоопухолевого действия. Примеры противоопухолевого производного, проявляющего противоопухолевый эффект при высвобождении из конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, включают противоопухолевое производное, содержащее структурный фрагмент, в котором концевая часть структуры, представленной -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)- линкера, представляет собой амино группу, и особенно предпочтительные включают следующие:

NH₂-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

NH₂-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

NH₂-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

NH₂-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX).

При этом, в случае NH₂-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX), было подтверждено, что, поскольку аминальная структура в молекуле является нестабильной, она снова претерпевает саморазложение с высвобождением следующего HO-CH₂-C(=O)-(NH-DX). Такие соединения также можно предпочтительно использовать в качестве промежуточного продукта способа получения конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению.

Кроме того, что касается структуры лекарственное средство-линкер по настоящему изобретению, возникает случай, когда L^P непосредствено связан с лекарственным средством. В таком случае, когда C конец L^P представляет собой глицин, противоопухолевым лекарственным средством, которое будет высвобождаться, является экзатекан как таковой или соединение, где глицин связан с амино группой экзатекана.

[0109]

Для конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, в котором в качестве лекарственного средства используют экзатекан, структурный фрагмент лекарственное средство-линкер, имеющий следующую структуру

-L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-(NH-DX) или

-L¹-L²-L^P-(NH-DX),

с которым связывается антитело, является предпочтительным. имеющий следующую структуру, был связан с антителом. Количество конъюгируемых указанных структурных фрагментов лекарственное средство-линкер может составлять от 1 до 10 как среднее конъюгируемое количество в расчете на антитело, предпочтительно от 2 до 8, и более предпочтительно от 3 до 8.

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).

Из них, более предпочтительными являются следующие.

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).

Еще более предпочтительными являются следующие.

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).

Особенно предпочтительными являются следующие.

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX).

[0110]

Что касается линкерной структуры, используемой для конъюгирования анти-HER3 антитела и лекарственного средства для получения конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, предпочтительный линкер можно сконструировать путем связывания предпочтительных структур, показанных для каждой части линкера, описанной выше. Что касается структуры линкера, предпочтительно используют линкеры со следующей структурой. При этом, левый конец структуры представляет собой положение связывания с антителом, а правый конец представляет собой положение связывания с лекарственным средством.

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-.

Из них, более предпочтительными являются следующие.

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-.

Еще более предпочтительными являются следующие.

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-.

Особенно предпочтительными являются следующие.

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

[0111]

[Способ получения]

Далее представлены объяснения, касающиеся репрезентативного способа получения конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению или получения его промежуточного соединения. При этом, соединения описаны ниже с номером соединения, показанным в каждой формуле реакции. В частности, они указываются как "соединение формулы (1)", "соединение (1)" или т.п. Соединения с другими номерами также описываются аналогичным образом.

[0112]

1. Способ получения 1

Конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный формулой (1), в котором антитело конъюгировано со структурой лекарственное средство-линкер через тиоэфир, можно получить, например, следующим способом.

[0113]

[Химическая формула 19]

[0114]

[в формуле, AB представляет собой антитело с сульфгидрильной группой, и L^1' соответствует L¹, имеющему структуру, в которой концевая группа линкера преобразована в малеимидильную группу (формула показана ниже).

[0115]

[Химическая формула 20]

[0116]

(в формуле, атом азота представляет собой положение связывания)

Например, он представляет собой линкер, имеющий структуру, которая, в структуре L¹, представлена как -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH₂)n²-C(=O)-, указанная -(сукцинимид-3-ил-N)- группа преобразована малеимидильную группу. Кроме того -(NH-DX) представляет собой структуру, представленную следующей формулой:

[0117]

[Химическая формула 21]

[0118]

и он представляет собой группу, которая образована путем удаления одного атома водорода амино группы в положении 1 экзатекана.]

[0119]

Далее, соединение формулы (1) в представленной выше формуле реакции можно интерпретировать как структуру, в которой один структурный фрагмент от лекарственного средства до конца линкера связан с одним антителом. Однако это только описание, представленное для удобства, и на самом деле существует множество случаев, в которых несколько указанных структурных фрагментов связано с одной молекулой антитела. То же самое относится к объяснению способа получения, описанного ниже.

[0120]

Например, конъюгат антитело-лекарственное средство (1) можно получить путем взаимодействия соединения (2), которое получают способом, описанным ниже, с антителом (3a), содержащим сульфгидрильную группу.

Антитело (3a), содержащее сульфгидрильную группу, можно получить способом, хорошо известным в данной области техники (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Примеры включают: реагент Трота подвергают взаимодействию с амино группой антитела; N-сукцинимидил S-ацетилтиоалканоаты подвергают взаимодействию с амино группой антитела с последующим взаимодействием с гидроксиламином; после взаимодействия с N-сукцинимидил 3-(пиридилдитио)пропионатом антитело подвергают взаимодействию с восстановителем; антитело подвергают взаимодействию с восстановителем, таким как дитиотреитол, 2-меркаптоэтанол и трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP), для восстановления дисульфидной связи в шарнирной части в антителе с образованием сульфгидрильной группы, но не ограничиваются этим. В частности, путем использования 0,3-3 молярных эквивалетов TCEP в качестве восстановителя на дисульфидные связи в шарнирной части в антителе и взаимодействия с антителом в буферном растворе, содержащем хелатообразующий агент, можно получить антитело с частично или полностью восстановленным дисульфидными связями в шарнирной части в антителе. Примеры хелатообразующего агента включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) и диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA). Его можно использовать при концентрации от 1 мМ до 20 мМ. Примеры буферного раствора, который можно использовать, включают раствор фосфата натрия, бората натрия или ацетата натрия. В частности, путем взаимодействия антитела с TCEP при 4°C - 37°C в течение 1-4 часов можно получить антитело (3a), содержащее частично или полностью восстановленные сульфгидрильные группы.

При этом, путем осуществления реакции присоединения сульфгидрильной группы к фрагменту лекарственное средство-линкер, фрагмент лекарственное средство-линкер может быть конъюгирован посредством тиоэфирной связи.

С использованием от 2 до 20 молярных эквивалетов соединения (2) на антитело (3a), содержащее сульфгидрильную группу, можно получить конъюгат антитело-лекарственное средство (1), в котором конъюгированы от 2 до 8 молекул лекарственного средства на антитело. В частности, достаточно добавить раствор, содержащий соединение (2), растворенное в нем, к буферному раствору, содержащему антитело (3a), содержащее сульфгидрильную группу, для реакции. Здесь, примеры буферного раствора, который можно использовать, включают раствор ацетата натрия, фосфата натрия и бората натрия. pH реакции находится на уровне 5-9, и более предпочтительно реакцию осуществляют при около pH 7. Примеры растворителя для растворения соединения (2) включают органический растворитель, такой как диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), диметилацетамид (DMA) и N-метил-2-пиридон (NMP).

Реакцию можно осуществить путем добавления органического растворителя, содержащего соединение (2), растворенное в нем при 1-20% об/об, к буферному раствору, содержащему антитело (3a), содержащее сульфгидрильную группу. Температура реакции составляет 0-37°C, более предпочтительно 10-25°C, и время реакции составляет от 0,5 до 2 часов. Реакцию можно остановить путем дезактивации реактивности непрореагировавшего соединения (2) тиол-содержащим реагентом. Примеры тиол-содержащего реагента включают цистеин и N-ацетил-L-цистеин (NAC). Более конкретно, 1-2 молярных эквивалета NAC добавляют к используемому соединению (2), и реакцию можно остановить путем инкубации при комнатной температуре в течение 10-30 минут.

Полученный конъюгат антитело-лекарственное средство (1) можно подвергнуть, после концентрирования, буферному обмену, очистке и измерению концентрации антитела и среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в соответствии с общими процедурами, описанными ниже, для идентификации конъюгата антитело-лекарственное средство (1).

[0121]

Общая процедура A: Концентрирование водного раствора антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство

В Amicon Ultra (50000 MWCO, Millipore Corporation) контейнер добавляли раствор антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство и раствор антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство концентрировали путем центрифугирования (центрифугирование в течение 5-20 минут при 2000 G - 3800 G) с использованием центрифуги (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.).

[0122]

Общая процедура B: Измерение концентрации антитела

С использованием УФ-детектора (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) осуществляли измерение концентрации антитела в соответствии со способом, указанным изготовителем. Здесь, может быть установлен коэффициент абсорбции при 280 нм из аминокислотной последовательности антитела с использованием известного способа расчета (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423), и использовали коэффициент абсорбции при 280 нм разный для каждого антитела (от 1,3 млмг^-1см^-1 до 1,8 млмг^-1см^-1). В случае U1-59, использовали 280 нм коэффициент абсорбции 1,768 млмг^-1см^-1 как расчетное значение в соответствии с его аминокислотной последовательностью.

[0123]

Общая процедура C-1: Буферный обмен для антитела

NAP-25 колонку (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) с использованием Sephadex G-25 носителя уравновешивали фосфатным буфером (10 мМ, pH 6,0; указывается как PBS6,0/EDTA в описании изобретения), содержащим хлорид натрия (137 мМ) и этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA, 5 мМ), в соответствии со способом, указанным изготовителем. Водный раствор антитела вводили в количестве 2,5 мл в одну NAP-25 колонку и затем фракцию (3,5 мл), которую элюировали при помощи 3,5 мл PBS6,0/EDTA, собирали. Полученную фракцию концентрировали с использованием Общей процедуры A. После измерения концентрации антитела с использованием Общей процедуры B концентрацию антитела доводили до 10 мг/мл с использованием PBS6,0/EDTA.

[0124]

Общая процедура D: Очистка конъюгата антитело-лекарственное средство

NAP-25 колонку уравновешивали ацетатным буфером, содержащим сорбит (5%) (10 мМ, pH 5,5; указывается как ABS в описании изобретения). Водный раствор конъюгата антитело-лекарственное средство (около 2,5 мл) вводили в NAP-25 колонку и затем элюировали при помощи буфера в количестве, указанном изготовителем, для сбора фракции антитела. Собранную фракцию снова наносили на NAP-25 колонку и, повторяя от 2 до 3 раз в целом процесс гель-фильтрационной очистки с элюированием буфером, получали конъюгат антитело-лекарственное средство, не включающий неконъюгированное лекарственное средство-линкер, и низкомолекулярное соединение (трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP), N-ацетил-L-цистеин (NAC) и диметилсульфоксид).

[0125]

Общая процедура E: Измерение концентрации антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство и среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела (1).

Концентрацию конъюгированного лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство можно рассчитать путем измерения УФ-поглощения водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при двух длинах волн 280 нм и 370 нм, с последующим осуществлением расчета, как показано ниже.

Поскольку общее поглощение при любой длине волны равно сумме поглощений каждого поглощающего свет химического вещества, которые присутствуют в системе (аддитивность поглощения), когда молярные коэффициенты поглощения антитела и лекарственного средства остаются такими же до и после конъюгациии между антителом и лекарственным средством, концентрацию антитела и концентрацию лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство выражают следующими уравнениями.

A₂₈₀=A_D.280+A_A.280=Е_D.280C_D+Е_A.280C_A Уравнение (I)

A₃₇₀=A_D.370+ A_A.370=Е_D.370C_D+Е_A.370C_A Уравнение (II)

В представленных выше уравнениях A₂₈₀ представляет собой поглощение водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при 280 нм, A₃₇₀ представляет собой поглощение водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при 370 нм, A_A.280 представляет собой поглощение антитела при 280 нм, A_A.370 представляет собой поглощение антитела при 370 нм, A_D.280 представляет собой поглощение предшественника конъюгата при 280 нм, A_D.370 представляет собой поглощение предшественника конъюгата при 370 нм, Е_A.280 представляет собой молярный коэффициент поглощения антитела при 280 нм, Е_A.370 представляет собой молярный коэффициент поглощения антитела при 370 нм, Е_D.280 представляет собой молярный коэффициент поглощения предшественника конъюгата при 280 нм, Е_D.370 представляет собой молярный коэффициент поглощения предшественника конъюгата при 370 нм, C_A представляет собой концентрацию антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство, и C_D представляет собой концентрацию лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство.

Что касается Е_A.280, Е_A.370, Е_D.280 и Е_D.370 в представленных выше уравнениях, используют предварительно полученные значения (расчетное значение на основании вычисления или измерения значения, полученного УФ-измерением соединения). Например, Е_A.280 можно рассчитать из аминокислотной последовательности антитела с использованием известного метода расчета (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). Е_A.370, как правило, равен нулю. В случае U1-59, использовали Е_А.280, равный 259400, как расчетное значение в соответствии с его аминокислотной последовательностью. Е_D.280 и Е_D.370 можно получить на основании закона Бугера-Ламберта-Бера (Поглощение=молярная концентрация × молярный коэффициент поглощения × длина поглощающего слоя) путем измерения поглощения раствора, в котором предшественник конъюгата, подходящий для использования, растворяют при определенной молярной концентрации. Путем измерения A₂₈₀ и A₃₇₀ водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство и решения параллельных уравнений (I) и (II), и используя полученные значения, можно получить C_A и C_D. Далее, путем деления C_D на C_A можно получить среднее количество лекарственного средства, связывающегося с антителом.

В настоящем изобретении метод определения среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства в расчете на антитело, описанный выше, указывается как ʺУФ методʺ.

[0126]

Общая процедура F: Измерение среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство - (2).

Среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство также можно определить при помощи высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием способа, описанного ниже, в дополнение к описанной выше Общей процедуре E.

[F-1. Получение образца для ВЭЖХ анализа (восстановление конъюгата антитело-лекарственное средство)]

Раствор конъюгата антитело-лекарственное средство (около 1 мг/мл, 60 мкл) смешивают с водным раствором дитиотреитола (DTT) (100 мМ, 15 мкл). Смесь инкубируют при 37°C в течение 30 минут, дисульфидная связь между L цепью и H цепью конъюгата антитело-лекарственное средство расщепляется. Полученный образец используют в ВЭЖХ анализе.

[F-2. ВЭЖХ анализ]

ВЭЖХ анализ осуществляют в следующих условиях измерения:

ВЭЖХ система: ВЭЖХ система Agilent 1290 (Agilent Technologies, Inc.)

Детектор: УФ абсорбционный спектрометр (измерение длины волны: 280 нм)

Колонка: PLRP-S (2,1×50 мм, 8 мкм, 1000 ангстрем; Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)

Температура колонки: 80°C

Подвижная фаза A: 0,04% водный раствор трифторуксусной кислоты (TFA)

Подвижная фаза B: раствор ацетонитрила, содержащий 0,04% TFA

Программа градиента: 29%-36% (0 мин-12,5 мин), 36%-42% (12,5-15 мин), 42%-29% (15 мин-15,1 мин), 29%-29% (15,1 мин-25 мин)

Объем вводимой пробы: 15 мкл

[F-3. Анализ данных]

[F-3-1] По сравнению с L цепью (L₀) и H цепью (H₀) неконъюгированного антитела, конъюгированные с лекарственным средством L (L цепь, связанная с одной молекулой лекарственного средства: L₁) и H (H цепь, связанная с одной молекулой лекарственного средства: H₁, H цепь, связанная с двумя молекулами лекарственного средства: H₂, H цепь, связанная с тремя молекулами лекарственного средства: H₃) цепи демонстрируют более высокую гидрофобность пропорционально количеству конъюгированных молекул лекарственного средства и, таким образом, имеют большее время удерживания. Поэтому эти цепи элюируют в порядке L₀ и L₁ или H₀, H₁, H₂ и H₃. Детектируемые пики могут быть приписаны любой из L₀, L₁, H₀, H₁, H₂ и H₃ путем сравнения времени удерживания с L₀ и H₀.

[F-3-2] Поскольку лекарственное средство-линкер имеет УФ-абсорбцию, значения площади пиков корректируют в ответ на количество конъюгированных молекул лекарственное средство-линкер в соответствии со следующей формулой с использованием молярных коэффициентов поглощения L цепи, H цепи и лекарственного средства-линкера.

[0127]

[Математическая формула 1]

[0128]

[Математическая формула 2]

[0129]

Здесь, в качестве молярного коэффициента поглощения (280 нм) L цепи или H цепи каждого антитела, можно использовать значение, рассчитанное из аминокислотной последовательности L цепи или H цепи каждого антитела известным способом расчета (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). В случае U1-59, молярный коэффициент поглощения 34690 и молярный коэффициент поглощения 95000 использовали в качестве расчетного значения для L цепи или H цепи, соответственно, в соответствии с его аминокислотной последовательностью. Реально измеренный молярный коэффициент поглощения (280 нм) соединения, в котором малеимидная группа была преобразована в сукцинимидный тиоэфир путем взаимодействия каждого лекарственного средства-линкера с меркаптоэтанолом или N-ацетилцистеином, использовали в качестве молярного коэффициента поглощения (280 нм) лекарственного средства-линкера.

[F-3-3] Отношение площадей пиков (%) каждой цепи рассчитывают для всех скорректированных значений площадей пиков в соответствии со следующей формулой.

[0130]

[Математическая формула 3]

Скорректированные значения соответствующих площадей пиков A_Li, A_Hi:L_i, H_i

[0131]

[F-3-4] Среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство рассчитывают в соответствии со следующей формулой.

Среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства=(L₀ отношение площадей пиков × 0+L₀ отношение площадей пиков × 1+H₀ отношение площадей пиков × 0+H₁ отношение площадей пиков × 1+H₂ отношение площадей пиков × 2+H₃ отношение площадей пиков × 3)/100 × 2

[0132]

Далее описаны промежуточные соединения, используемые в Способе получения 1. Соединение, представленное формулой (2) в способе получения 1, представляет собой соединение, представленное следующей формулой:

[0133]

(малеимид-N-ил)-(CH₂)n³-C(=O)-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-C(=O)-(NH-DX) или

(малеимид-N-ил)-(CH₂)n³-C(=O)-L²-L^P-(NH-DX).

В этой формуле,

n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 8,

L² представляет собой -NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)- или простую связь,

где n⁴ представляет собой целое число, имеющее значение от 1 до 6,

L^P представляет собой пептидный остаток, состоящий из 2-7 аминокислот, выбранных из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты,

n¹ представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 6,

n² представляет собой целое число, имеющее значение от 0 до 5,

L^a представляет собой -O- или простую связь,

(малеимид-N-ил)- представляет собой малеимидильную группу (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ильную группу), представленную следующей формулой:

[Химическая формула 22]

[0134]

где атом азота представляет собой положение связывания, и

-(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой:

[Химическая формула 23]

[0135]

где атом азота амино группы в положении 1 представляет собой положение связывания.

[0136]

Что касается пептидного остатка L^P, те, которые включают аминокислоту, выбранную из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, являются предпочтительными в качестве промежуточного продукта способа. Из пептидных остатков L^P, те, которые состоят из 4 или 5 аминокислот, являются предпочтительными в качестве промежуточного соединения. Более конкретно, те, в которых L^P представляет собой тетрапептидный остаток -GGFG- или пентапептид -DGGFG-, являются предпочтительными в качестве промежуточного соединения в способе получения, более предпочтительным является -GGFG-.

[0137]

Кроме того, что касается -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²-, те, которые содержат -NH-CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂-O-CH₂- или -NH-CH₂CH₂-O-CH₂- являются предпочтительными в качестве промежуточного соединения в способе получения. Соединение -NH-CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂-O-CH₂- или -NH-CH₂CH₂-O-CH₂ является более предпочтительным.

Что касается n³, соединения, в которых n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 8, являются предпочтительными в качестве промежуточного соединения в способе получения.

Что касается L², соединения, в которых L² представляет собой простую связь или -NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)-, и n⁴ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 4, являются предпочтительными в качестве промежуточного соединения в способе получения.

[0138]

Кроме того соединения, в которых n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 5, L² представляет собой простую связь, и -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²- представляет собой -NH-CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂-O-CH₂- или -NH-CH₂CH₂-O-CH₂-, являются предпочтительными в качестве промежуточного соединения в способе получения. Кроме того, более предпочтительными из них являются те, в которых -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²- представляет собой -NH-CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂-O-CH₂- или -NH-CH₂CH₂-O-CH₂-. Кроме того, те, в которых n³ представляет собой целое число, имеющее значение 2 или 5, являются предпочтительными.

[0139]

Кроме того, те, в которых n³ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 5, L² представляет собой -NH-(CH₂CH₂-O)n⁴-CH₂CH₂-C(=O)-, n⁴ представляет собой целое число, имеющее значение от 2 до 4, и -NH-(CH₂)n¹-L^a-(CH₂)n²- представляет собой -NH-CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂-O-CH₂- или -NH-CH₂CH₂-O-CH₂-, являются предпочтительными в качестве промежуточного соединения в способе получения. Более предпочтительны из них те, в которых n⁴ представляет собой целое число, имеющее значение 2 или 4. Кроме того, те, в которых -NH-(CH₂)n¹-L^a- представляет собой -NH-CH₂CH₂CH₂-, -NH-CH₂-O-CH₂- или -NH-CH₂CH₂-O-CH₂-, являются предпочтительными.

[0140]

Предпочтительные примеры промежуточных соединений, которые являются полезными для получения соединения по настоящему изобретению, включают соединения, представленные в качестве примера ниже:

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX) или

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).

[0141]

Путем взаимодействия соединения лекарственное средство-линкер, выбранного из указанной выше группы промежуточных соединений, с анти-HER3 антителом или его реакционноспособным производным, может быть образована тиоэфирная связь на участке дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части анти-HER3 антитела, и, как результат, может быть получен конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению. В этом случае, предпочтительно использовать реакционноспособное производное анти-HER3 антитела. Реакционноспособное производное, полученное путем восстановления анти-HER3 антитела, является особенно предпочтительным.

[0142]

Ниже представлены соединения, которые являются более предпочтительными в качестве промежуточного соединения:

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).

[0143]

Кроме того, из представленной выше группы промежуточных соединений, промежуточные соединения, представленные следующими формулами, являются более предпочтительными:

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX) или

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-DGGFG-(NH-DX).

Особенно предпочтительными являются соединения, которые представлены следующей формулой:

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX) или

(малеимид-N-ил)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX).

[0144]

2. Способ получения 2

Соединение, представленное формулой (2), или его фармакологически приемлемую соль, используемые в качестве промежуточного соединения в описанном выше способе получения, можно получить следующим способом, например.

[0145]

[Химическая формула 24]

[0146]

[в формуле, L^1' соответствует L¹, имеющему структуру, в которой концевая группа преобразована в малеимидильную группу, и P¹, P² и P³ представляют собой защитную группу].

[0147]

Соединение (6) можно получить путем дериватизации карбоновой кислоты (5) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и, в присутствии основания, его взаимодействия с NH₂-DX [означающий экзатекан; химическое название: (1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-10,13(9H,15H)-дион] (4) или его фармакологически приемлемой солью.

Реагенты и реакционные условия, которые традиционно используют для пептидного синтеза, можно использовать для этой реакции. Существуют различные типы активного сложного эфира, например, его можно получить путем взаимодействия фенолов, таких как п-нитрофенол, N-гидроксибензотриазол, N-гидроксисукцинимид или т.п., с карбоновой кислотой (5) с использованием агента конденсации, такого как N,N'-дициклогексилкарбодиимид или 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид; кроме того, активный сложный эфир также можно получить путем взаимодействия карбоновой кислоты (5) с пентафторфенилтрифторацетатом или т.п.; взаимодействия карбоновой кислоты (5) с 1-бензотриазолилокситрипирролидинофосфоний гексафторфосфитом; взаимодействия карбоновой кислоты (5) с диэтилцианофосфонатом (метод Шиоири); взаимодействия карбоновой кислоты (5) с трифенилфосфином и 2,2'-дипиридилдисульфидом (метод Мукаяма); взаимодействия карбоновой кислоты (5) с триазиновым производным, таким как 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолинийхлорид (DMTMM); или т.п. Кроме того, реакцию также можно осуществить, например, способом с использованием галогенангидрида кислоты, в котором карбоновую кислоту (5) обрабатывают галогенангидридом кислоты, таким как тионилхлорид и оксалилхлорид, в присутствии основания.

Путем взаимодействия активного сложного эфира, смешанного ангидрида кислоты или галогенангидрида карбоновой кислоты (5), полученного, как описано выше, с соединением (4) в присутствии подходящего основания в инертном растворителе при температуре реакции в пределах от -78C до 15°C можно получить соединение (6). При этом, "инертный растворитель" означает растворитель, который не ингибирует желаемую реакцию, для которой используют такой растворитель.

[0148]

Конкретные примеры основания, используемого для каждой стадии, описанной выше, включают карбонат, алкоксид, гидроксид или гидрид щелочного металла или щелочно-земельного металла, такой как карбонат натрия, карбонат калия, этоксид натрия, бутоксид калия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидрид натрия или гидрид калия; металлоорганическое основание, представленное алкиллитием, таким как н-бутиллитий, или диалкиламинолитием, таким как диизопропиламид лития; металлоорганическое основание, такое как биссилиламин, включая бис(триметилсилил)амид лития; и органическое основание, такое как пиридин, 2,6-лутидин, коллидин, 4-диметиламинопиридин, триэтиламин, N-метилморфолин, диизопропилэтиламин и диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (DBU).

[0149]

Примеры инертного растворителя, который используют для реакции по настоящему изобретению, включают галогенированный углеводородный растворитель, такой как дихлорметан, хлороформ и тетрахлорид углерод; эфирный растворитель, такой как тетрагидрофуран, 1,2-диметоксиэтан и диоксан; ароматический углеводородный растворитель, такой как бензол и толуол; и амидный растворитель, такой как N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид и N-метилпирролидин-2-он. Помимо них, сульфоксидный растворитель, такой как диметилсульфоксид и сульфолан; кетоновый растворитель, такой как ацетон и метилэтилкетон; и спиртовой растворитель, такой как метанол и этанол, можно использовать в некоторых случаях. Альтернативно, эти растворители можно использовать в виде смешанного растворителя.

[0150]

Что касается защитной группы P¹ для концевой амино группы соединения (6), можно использовать защитную группу для амино группы, которую, как правило, используют для пептидного синтеза, например, трет-бутилоксикарбонильную группу, 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу и бензилоксикарбонильную группу. Примеры другой защитной группы для амино группы включают алканоильную группу, такую как ацетильная группа; алкоксикарбонильную группу, такую как метоксикарбонильная группа и этоксикарбонильная группа; арилметоксикарбонильную группу, такую как пара-метоксибензилоксикарбонильная группа и пара(или орто)нитробензилоксикарбонильная группа; арилметильную группу, такую как бензильная группа и трифенилметильная группа; ароильную группу, такую как бензоильная группа; и арилсульфонильную группу, такую как 2,4-динитробензолсульфонильная группа и орто-нитробензолсульфонильная группа. Защитную группу P¹ можно выбрать в зависимости от, например, свойства соединения, содержащего амино группу, которую необходимо защитить.

Путем удаления защитной группы P¹ для концевой амино группы полученного соединения (6) можно получить соединение (7). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (9) можно получить путем дериватизации карбоновой кислоты пептида (8) с N концом, защищенным группой P² в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (7). Реакционные условия, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования пептидной связи между карбоновой кислотой пептида (8) и соединением (7), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитную группу P² можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для защитной группы соединения (6), и выбор можно осуществить на основании, например, свойств соединения, содержащего амино группу, которую необходимо защитить. Как это обычно используют для пептидного синтеза, путем повторения последовательно реакции и удаления защиты аминокислоты или являющейся составной частью пептида карбоновой кислоты (8) для элонгации также можно получить соединение (9).

Путем удаления защитной группы P² в качестве защитной группы для амино группы полученного соединения (9) можно получить соединение (10). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (2) можно получить путем дериватизации карбоновой кислоты (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (10). Реакционные условия, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования пептидной связи между карбоновой кислотой (11) и соединением (10), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0151]

Соединение (9) также можно получить следующим способом, например.

Соединение (13) можно получить путем дериватизации карбоновой кислоты пептида (8) с N концом, защищенным группой P² в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с аминовым соединением (12), содержащим карбокси группу, защищенную группой P³, в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования пептидной связи между карбоновой кислотой пептида (8) и соединением (12) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Защитная группа P² для амино группы соединения (13) конкретно не ограничивается, при условии, что она представляет собой защитную группу, которую традиционно используют. Например, примеры защитной группы для гидроксильной группы включают алкоксиметильную группу, такую как метоксиметильная группа; арилметильную группу, такую как бензильная группа, 4-метоксибензильная группа и трифенилметильная группа; алканоильную группу, такую как ацетильная группа; ароильную группу, такую как бензоильная группа; и силильную группу, такую как трет-бутилдифенилсилильная группа. Карбокси группа может быть защищена сложным эфиром с алкильной группой, такой как метильная группа, этильная группа и трет-бутильная группа, аллильной группой или арилметильной группой, такой как бензильная группа. Что касается амино группы, можно указать алкилоксикарбонильную группу, такую как трет-бутилоксикарбонильная группа, метоксикарбонильная группа и этоксикарбонильная группа; арилметокси карбонильную группу, такую как аллилоксикарбонильная группа, 9-флуоренилметилокси карбонильная группа, бензилоксикарбонильная группа, пара-метоксибензилоксикарбонильная группа и пара(или орто)нитробензилоксикарбонильная группа; алканоильную группу, такую как ацетильная группа; арилметильную группу, такую как бензильная группа и трифенилметильная группа; ароильную группу, такую как бензоильная группа; и арилсульфонильную группу, такую как 2,4-динитробензолсульфонильная группа или орто-нитробензолсульфонильная группа.

Что касается защитной группы P³ для карбокси группы, можно использовать защитную группу, традиционно используемую в качестве защитной группы для карбокси группы в области органического химического синтеза, в частности, пептидного синтеза. Карбоксильная группа может быть защищена в виде сложного эфира алкильной группой, такой как метильная группа, этильная группа или трет-бутил, аллильной группой и арилметильной группой, такой как бензильная группа.

В таком случае, предпочтительно, чтобы защитную группу для амино группы и защитную группу для карбокси группы можно было удалить с использованием разных способов или разных условий. Например, репрезентативный пример включает комбинацию, в которой P² представляет собой трет-бутилоксикарбонильную группу и P³ представляет собой бензильную группу. Защитные группы можно выбрать из указанных выше групп в зависимости от, например, свойств соединения, содержащего амино группу и карбокси группу, подлежащие защите. Для удаления защитных групп можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Путем удаления защитной группы P³ для карбокси группы полученного соединения (13) можно получить соединение (14). Для этой процедуры удаления защиты реагенты и условия выбирают в зависимости от защитной группы.

Соединение (9) можно получить путем дериватизации полученного соединения (14) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и взаимодействия с соединением (4) в присутствии основания. Для этой реакции также можно использовать реагенты и реакционные условия, которые обычно используют для пептидного синтеза, и реакционные условия, реагенты, основание и инертный растворитель для использования в реакции можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0152]

Соединение (2) также можно получить, например, следующим способом.

Путем удаления защитной группы P² для амино группы соединения (13) можно получить соединение (15). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (16) можно получить путем дериватизации карбоновокислотного производного (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (15), полученным в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования амидной связи между карбоновой кислотой пептида (11) и соединением (15) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Путем удаления защитной группы для карбокси группы полученного соединения (16) можно получить соединение (17). Эту процедуру удаления защиты можно осуществить способом, аналогичным способу удаления защиты карбокси группы для получения соединения (14).

Соединение (2) можно получить путем дериватизации соединения (17) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (4) в присутствии основания. Для этой реакции также можно использовать реагенты и реакционные условия, которые обычно используют для пептидного синтеза, и реакционные условия, реагенты, основание и инертный растворитель для использования в реакции можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0153]

3. Способ получения 3

Соединение, представленное формулой (2), используемое в качестве промежуточного соединения, также можно получить следующим способом.

[0154]

[Химическая формула 25]

[0155]

[в этой формуле L^1' соответствует L¹, имеющему структуру, в которой концевая группа преобразована в малеимидильную группу, и P⁴ представляет собой защитную группу].

[0156]

Соединение (19) можно получить путем дериватизации соединения (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с карбоновой кислотой пептида (18) с C-концом, защищенным группой P⁴, в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования пептидной связи между карбоновой кислотой пептида (18) и соединением (11), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитную группу P⁴ для карбокси группы соединения (18) можно подходящим образом выбрать из указанных выше защитных групп.

Путем удаления защитной группы для карбокси группы полученного соединения (19) можно получить соединение (20). Эту процедуру удаления защиты можно осуществить способом, аналогичным способу удаления защиты карбокси группы для получения соединения (14).

Соединение (2) можно получить путем дериватизации полученного соединения (20) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (7). Для этой реакции также можно использовать реагенты и реакционные условия, которые обычно используют для пептидного синтеза, и реакционные условия, реагенты, основание и инертный растворитель для использования в реакции можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0157]

4. Способ получения 4

Ниже, в рамках промежуточного соединения (10), описанного в способе получения 2, подробно описан способ для получения соединения (10b), имеющего n¹=1 и L^a=0. Соединение, представленное формулой (10b), его соль или сольват можно получить в соответствии, например, со следующим способом.

[0158]

[Химическая формула 26]

[0159]

[в формуле, L^P имеет значение, определенное выше, L представляет собой ацильную группу, включая алканоильную группу, такую как ацетильная группа, или ароильную группу, такую как бензоильная группа, или представляет собой атом водорода или т.п., X и Y представляют собой олигопептид, состоящий из 1-3 аминокислот, P⁵ и P⁷ представляют собой защитную группу для амино группы, и P⁶ представляет собой защитную группу для карбокси группы].

[0160]

Соединение, представленное формулой (21), можно получить с использованием или с применением способа, описанного в выложенном патенте Японии № 2002-60351 или в литературе (J. Org. Chem., Vol. 51, page 3196, 1986), и, если необходимо, путем удаления защитных групп или модификации функциональных групп. Альтернативно, оно также может быть получено обработкой аминокислоты с защищенной концевой амино группой или амида кислоты олигопептида с защищенной амино группой альдегидом или кетоном.

Путем взаимодействия соединения (21) с соединением (22), содержащим гидроксильную группу, в температурных условиях от охлаждения до комнатной температуры в инертном растворителе в присутствии кислоты или основания можно получить соединение (23).

Здесь, примеры кислоты, которую можно использовать, могут включать неорганическую кислоту, такую как фтористоводородная кислота, хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и борная кислота; органическую кислоту, такую как уксусная кислота, лимонная кислота, паратолуолсульфоновая кислота и метансульфоновая кислота; и кислоту Льюиса, такую как тетрафторборат, хлорид цинка, хлорид олова, хлорид алюминия и хлорид железа. Из них, сульфоновые кислоты являются предпочтительными, и паратолуолсульфоновая кислота является особенно предпочтительной. Что касается основания, можно подходящим образом выбрать и использовать любое из указанных выше оснований. Предпочтительные примеры включают алкоксид щелочного металла, такой как трет-бутоксид калия, гидроксид щелочного металла или щелочно-земельного металла, такой как гидроксид натрия и гидроксид калия; гидрид щелочного металла, такой как гидрид натрия и гидрид калия; металлоорганическое основание, представленное диалкиламинолитием, таким как диизопропиламид лития; и металлоорганическое основание биссилиламина, такое как бис(триметилсилил)амид лития.

Примеры растворителя, который можно использовать для реакции, включают эфирный растворитель, такой как тетрагидрофуран и 1,4-диоксан; и ароматический углеводородный растворитель, такой как бензол и толуол. Такие растворители могут быть получены в виде смеси с водой.

Кроме того, защитная группа для амино группы, представленная как P⁵, конкретно не ограничивается, при условии, что она представляет собой группу, обычно используемую для защиты амино группы. Репрезентативные примеры могут включать защитные группы для амино группы, которые описаны в Способе получения 2. Однако защитная группа для амино группы, представленная как P⁵, может отщепляться в процессе реакции. В таком случае, защитную группу можно снова ввести путем осуществлени подходящим образом реакции с подходящим реагентом для защиты амино группы, при необходимости.

Соединение (24) можно получить путем удаления защитной группы P⁶ соединения (23). Здесь, хотя репрезентативные примеры защитной группы для карбокси группы, представленной как P⁶, описаны в Способе получения 2, ее можно подходящим образом выбрать из этих примеров. В соединении (23), желательно, чтобы защитная группа P⁵ для амино группы и защитная группа P⁶ для карбокси группы представляли собой такие защитные группы, которые можно удалить с использованием разных способов или разных условий. Например, репрезентативный пример может включать комбинацию, в которой P⁵ представляет собой 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу, а P⁶ представляет собой бензильную группу. Защитные группы можно выбрать в зависимости от, например, свойств соединения, содержащего амино группу и карбокси группу, подлежащие защите. Для удаления защитных групп, реагенты и условия выбирают в зависимости от защитной группы.

Соединение (26) можно получить путем дериватизации соединения (24) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (4) или его фармакологически приемлемой солью в присутствии основания с получением соединения (25), с последующим удалением защитной группы P⁵ полученного соединения (25). Для реакции между соединением (4) и карбоновой кислотой (24) и реакции для удаления защитной группы P⁶ можно использовать те же самые реагенты и реакционные условия, которые описаны для Способа получения 2.

Соединение (10b) можно получить путем взаимодействия соединения (26) с аминокислотой с защищенной концевой амино группой или олигопептидом (27) с защищенной амино группой с получением соединения (9b) и удаления защитной группы P⁷ полученного соединения (9b). Защитная группа для амино группы, представленная как P⁷, конкретно не ограничивается, при условии, что ее обычно используют для защиты амино группы. Репрезентативные примеры включают защитные группы для амино группы, которые описаны в Способе получения 2. Для удаления защитной группы реагенты и условия выбирают в зависимости от защитной группы. Для реакции между соединением (26) и соединением (27) можно использовать реагенты и реакционные условия, которые традиционно используют для пептидного синтеза. Соединение (10b), полученное указанным выше способом, можно преобразовать в соединение (1) по настоящему изобретению в соответствии со способом, описанным выше.

[0161]

5. Способ получения 5

Соединение, представленное формулой (2), в качестве промежуточного соединения также можно получить со способом, показанным ниже.

[0162]

[Химическая формула 27]

[0163]

[в формуле, L^1' соответствует L¹, имеющему структуру, в которой концевая группа преобразована в малеимидильную группу, L^P представляет собой структуру, состоящую из -L^p1-L^p2-, и P³, P⁸, P⁹, P¹⁰, P¹¹ и P¹² представляют собой защитную группу].

[0164]

Поскольку L^P образуется путем связывания L^p1 с L^p2, гидрофильная аминокислота на N-конце L^P происходит из L^p1, и, таким образом, в качестве L^p1 подходящим образом используют такие, которые содержат гидрофильную аминокислоту на N-конце. При этом, могут присутствовать несколько гидрофильных аминокислот. Кроме того, когда используют L^p2 с гидрофильной аминокислотой, L^p, содержащий несколько гидрофильных аминокислот на N-конце L^P или на N-конце и в других положениях, можно получить в зависимости от положения гидрофильной аминокислоты.

[0165]

Соединение (29) можно получить путем дериватизации пептида или аминокислоты (28) с N-концом, защищенным группой P², в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (7). Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования амидной связи между пептидом или аминокислотой (28) и соединением (7), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитную группу P⁸ для амино группы можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для защитной группы соединения (6), и выбор можно осуществить на основании свойства соединения или т.п. Как это обычно используют для пептидного синтеза, путем повторения последовательно реакции и удаления защиты аминокислоты или являющейся составной частью пептида аминокислоты (28) для элонгации также можно получить соединение (29).

Путем удаления P⁸ в качестве защитной группы для амино группы полученного соединения (29) можно получить соединение (23). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (32) можно получить путем дериватизации аминокислоты или пептида (31) с N-концом, защищенным группой P⁸, и защищенной карбокси группой, гидрокси группой или амино группой в боковой цепи в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (30). Реакционные условия, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования пептидной связи между аминокислотой или пептидом (31) и соединением (30), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Что касается защитных групп P⁸ и P⁹, защитные группы можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны как защитные группы для амино группы, карбокси группы или гидрокси группы соединения (6). Однако, в таком случае, необходимо, чтобы защитную группу P⁹ для амино группы и защитную группу P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи можно было удалить с использованием разных способов или разных условий. Например, репрезентативный пример включает комбинацию в случае, когда P⁹ представляет собой 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу и P¹⁰ представляет собой трет-бутильную группу или т.п. в качестве защитной группы для карбокси группы, метоксиметильную группу или т.п. в качестве защитной группы для гидрокси группы или трет-бутилоксикарбонильную группу или т.п. в качестве защитной группы для амино группы. Защитная группа P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи предпочтительно представляет собой защитную группу, которую можно удалить обработкой в кислотных условиях. Однако она не ограничивается этим, и ее можно выбрать из указанных выше групп в зависимости от, например, свойств амино группы, карбокси группы или гидрокси группы соединения, защиту которого необходимо осуществить. Для удаления защитных групп реагенты и условия выбирают в зависимости от защитной группы. Как это обычно используют для пептидного синтеза, путем повторения последовательно реакции и удаления защиты являющейся составной частью аминокислоты или пептида для элонгации также можно получить соединение (32).

Путем удаления P⁹ в качестве защитной группы концевой амино группы полученного соединения (32) можно получить соединение (33). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение можно получить (34) путем дериватизации карбоновокислотного производного (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (33). Здесь, карбоновокислотное производное (11) представляет собой соединение с структурой, в которой концевая часть линкера L^1' содержит малеимидильную группу.

Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между карбоновокислотным производным (11) и соединением (33) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Путем удаления защитной группы P¹⁰ для карбокси группы, гидрокси группы или амино группы в аминокислотной боковой цепи пептидной части полученного соединения (34) можно получить соединение (2). Можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

[0166]

Соединение (29) также можно получить, например, следующим способом.

Соединение (35) можно получить путем дериватизации пептида или аминокислоты (28) с N-концом, защищенным группой P⁸, в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с аминовым соединением (12), содержащим концевую карбокси группу, защищенную группой P³, в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между пептидом или аминокислотой (28) и соединением (12) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитную группу P⁸ для амино группы соединения (35) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны в качестве защитной группы для соединения (6), и использовать. Что касается защитной группы P³ для карбокси группы можно использовать, защитную группу, традиционно используемую в качестве защитной группы для карбокси группы в области органического химического синтеза, в частности, пептидного синтеза. Конкретные примеры включают алкиловый сложный эфир, такой как метильная группа, этильная группа и трет-бутил, аллиловый сложный эфир и бензиловый сложный эфир, и ее можно подходящим образом выбрать из защитных групп, которые описаны для соединения (6), и использовать. В таком случае, необходимо, чтобы защитную группу P⁸ для амино группы и защитную группу P³ для карбокси группы можно было удалить с использованием разных способов или разных условий. Например, репрезентативный пример включает комбинацию, в которой P⁸ представляет собой трет-бутилоксикарбонильную группу, и P³ представляет собой бензильную группу. Защитные группы можно выбрать из указанных выше групп в зависимости от, например, свойств соединения, содержащего амино группу и карбокси группу, подлежащие защите. Для удаления защитных групп реагенты и условия выбирают в зависимости от защитной группы.

Путем удаления защитной группы P³ для карбокси группы полученного соединения (35) можно получить соединение (36). Для этой процедуры удаления защиты реагенты и условия выбирают в зависимости от защитной группы.

Соединение (29) можно получить путем дериватизации полученного соединения (36) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (4) в присутствии основания. Для этой реакции также можно использовать реагенты и реакционные условия, которые обычно используют для пептидного синтеза, и реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для реакции, можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0167]

Соединение (32) также можно получить, например, следующим способом.

Путем удаления защитной группы P⁸ для амино группы соединения (35) можно получить соединение (37). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (38) можно получить путем дериватизации аминокислоты или пептида (31) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (37) в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования амидной связи между аминокислотой или пептидом (31) и соединением (37), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). В таком случае, необходимо, чтобы защитную группу P⁹ и P¹⁰ для аминокислоты или пептида (31) и защитную группу P³ для соединения (37) можно было удалить с использованием разных способов или разных условий. Например, репрезентативный пример включает комбинацию, в которой P⁹ представляет собой 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу, P¹⁰ представляет собой трет-бутилоксикарбонильную группу, трет-бутильную группу или метоксиметильную группу, и P³ представляет собой бензильную группу. Кроме того, защитная группа P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи предпочтительно представляет собой защитную группу, которую можно удалить обработкой в кислотных условиях, как описано выше. Однако, защитная группа не ограничивается этим, и ее можно выбрать из указанных выше групп в зависимости от, например, свойств амино группы, карбокси группы или гидрокси группы соединения, защиту которого необходимо осуществить. Для удаления защитных групп реагенты и условия выбирают в зависимости от защитной группы.

Путем удаления защитной группы P³ для карбокси группы полученного соединения (38) можно получить соединение (39). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (32) можно получить путем дериватизации соединения (39) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (4) в присутствии основания. Для этой реакции также можно использовать реагенты и реакционные условия, которые обычно используют для пептидного синтеза, и реакционные условия, реагенты, основание и растворитель для использования в реакции можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0168]

Соединение (34) также можно получить, например, следующим способом.

Путем удаления защитной группы P⁹ для амино группы соединения (38) можно получить соединение (40). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (41) можно получить путем дериватизации карбоновокислотного производного (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (40) в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования амидной связи между карбоновокислотным производным (11) и соединением (40), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Путем удаления защитной группы P³ для карбокси группы полученного соединения (41) можно получить соединение (42). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (34) можно получить путем дериватизации соединения (42) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (4) в присутствии основания. Для этой реакции также можно использовать реагенты и реакционные условия, которые обычно используют для пептидного синтеза, и реакционные условия, реагенты, основание и растворитель для использования в реакции можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0169]

Соединение (34) также можно получить, например, следующим способом.

Соединение (44) можно получить путем дериватизации карбоновокислотного производного (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с аминокислотой или пептидом (43), содержащим карбокси группу, защищенную группой P¹¹, и карбокси группу, гидрокси группу или амино группу в боковой цепи, защищенную группой P¹⁰, в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования амидной связи между карбоновокислотным производным (11) и соединением (43), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Что касается защитных групп P¹⁰ и P¹¹ соединения (44), защитные группы можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны как защитная группа для карбокси группы, гидрокси группы или амино группы соединения (6). При этом, в таком случае необходимо, чтобы защитную группу P¹¹ для карбокси группы и защитную группу P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи можно было удалить с использованием разных способов или разных условий. Например, репрезентативный пример включает комбинацию, в которой P¹¹ представляет собой бензильную группу и P¹⁰ представляет собой трет-бутильную группу или т.п. в качестве защитной группы для карбокси группы, метоксиметильную группу или т.п. в качестве защитной группы для гидрокси группы или трет-бутилоксикарбонильную группу или т.п. в качестве защитной группы для амино группы. Защитная группа P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи предпочтительно представляет собой защитную группу, которую можно удалить обработкой в кислотных условиях. Однако она не ограничивается этим, и ее можно выбрать из указанных выше групп в зависимости от, например, свойств амино группы, карбокси группы или гидрокси группы соединения, защиту которого необходимо осуществить. Для удаления защитной группы можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Путем удаления защитной группы P¹¹ для карбокси группы полученного соединения (44) можно получить соединение (45). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (34) можно получить путем дериватизации соединения (45) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (30) в присутствии основания. Для этой реакции также можно использовать реагенты и реакционные условия, которые обычно используют для пептидного синтеза, и реакционные условия, реагенты, основание и растворитель для использования в реакции можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Соединение (47) можно получить путем дериватизации соединения (45) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с аминокислотой или пептидом (46), содержащими карбокси группу, защищенную группой P¹², в присутствии основания. Для этой реакции можно использовать реагенты и реакционные условия, обычно используемые для пептидного синтеза, и реакционные условия, реагенты, основание и растворитель можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Что касается защитных групп P¹⁰ и P¹² соединения (47), защитные группы можно подходящим образом выбрать и использовать из тех, которые описаны как защитные группы для карбокси группы, гидрокси группы или амино группы соединения (6). При этом, в таком случае необходимо, чтобы защитную группу P¹² для карбокси группы и защитную группу P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи можно было удалить с использованием разных способов или разных условий. Например, репрезентативный пример включает комбинацию, в которой P¹² представляет собой бензильную группу и P¹⁰ представляет собой трет-бутильную группу или т.п. в качестве защитной группы для карбокси группы, метоксиметильную группу или т.п. в качестве защитной группы для гидрокси группы или трет-бутилоксикарбонильную группу или т.п. в качестве защитной группы для амино группы. Защитная группа P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи предпочтительно представляет собой защитную группу, которую можно удалить обработкой в кислотных условиях. Однако она не ограничивается этим, и ее можно выбрать из указанных выше групп в зависимости от, например, свойств амино группы, карбокси группы или гидрокси группы соединения, защиту которого необходимо осуществить. Для удаления защитной группы можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы. Кроме того соединение (47) также можно получить путем повторения последовательно реакции и удаления защиты составляющей аминокислоты или пептида для элонгации.

Путем удаления защитной группы P¹² для карбокси группы полученного соединения (47) можно получить соединение (48). Можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (34) можно получить путем дериватизации соединения (48) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (7) в присутствии основания. Для этой реакции также можно использовать реагенты и реакционные условия, которые обычно используют для пептидного синтеза, и реакционные условия, реагенты, основание и растворитель для использования в реакции можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Соединение (47) также можно получить, например, следующим способом.

Пептид (49) можно получить путем дериватизации аминокислоты или пептида (46) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с аминокислотой или пептидом (31) с N-концом, защищенным группой P⁹, и карбокси группой, гидрокси группой или амино группой в боковой цепи, защищенной группой P¹⁰, в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между аминокислотой или пептидом (46) и аминокислотой или пептидом (31) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). При этом, в этом случае необходимо, чтобы защитную группу P¹² для карбокси группы аминокислоты или пептида (46) и защитную группу P⁹ и P¹⁰ для аминокислоты или пептида (31) можно удалить так же, как описано выше, но с использованием разных способов или разных условий. Например, репрезентативный пример включает комбинацию, в которой P⁹ представляет собой 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу, P¹⁰ представляет собой трет-бутильную группу или т.п. в качестве защитной группы для карбокси группы, метоксиметильную группу или т.п. в качестве защитной группы для гидрокси группы или трет-бутилоксикарбонильную группу в качестве защитной группы или т.п. для амино группы, и P¹² представляет собой бензильную группу. Защитная группа P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи предпочтительно представляет собой защитную группу, которую можно удалить обработкой в кислотных условиях. Однако она не ограничивается этим, и ее можно выбрать из указанных выше групп в зависимости от, например, свойства амино группы, карбокси групп или гидрокси группы соединения, защиту которого необходимо осуществить. Для удаления защитной группы можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Путем удаления защитной группы P⁹ для N-концевой части полученного пептида (49) можно получить соединение (50). Можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (47) можно получить путем дериватизации карбоновокислотного производного (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным пептидом (50) в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования амидной связи между карбоновокислотным производным (11) и пептидом (50) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0170]

6. Способ получения 6

В рамках промежуточного соединения (2), соединения, в которых линкер имеет структуру, представленную как -L¹-L²-L^P-, и указанный L^P представляет собой пептидный остаток, содержащий гидрофильную аминокислоту на N-конце, и указанная гидрофильная аминокислота, расположенная на N-конце, отлична от глицина, также можно получить следующим способом.

[0171]

[Химическая формула 28]

[0172]

[в этой формуле, L^1' соответствует L¹, имеющему структуру, в которой концевая группа модифицирована с образованием малеимидильной группы, L^P представляет собой структуру, состоящую из -L^p1-L^p2-, и P⁸, P⁹, P¹⁰ и P¹² представляют собой защитную группу].

[0173]

Поскольку L^P образуется путем связывания L^p1 с L^p2, гидрофильная аминокислота на N-конце L^P происходит из L^p1, и, таким образом, в качестве L^p1 подходящим образом используют такие, которые содержат гидрофильную аминокислоту на N-конце. При этом, могут присутствовать несколько гидрофильных аминокислот. Кроме того, когда используют L^p2 с гидрофильной аминокислотой, L^p, содержащий несколько гидрофильных аминокислот на N-конце L^P или на N-конце и в других положениях, можно получить в зависимости от положения гидрофильной аминокислоты.

Соединение (51) можно получить путем дериватизации пептида или аминокислоты (28), описанных в Способе получения 5, с N-концевой группой, защищенной группой P⁸, в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и взаимодействия с соединением (4) и его солью. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между пептидом или аминокислотой (28) и соединением (4) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитную группу P⁸ можно подходящим образом выбрать и использовать из тех, которые описаны в качестве защитной группы для соединения (6), и ее можно выбрать в зависимости от, например, свойства соединения, содержащего амино группу, которую необходимо защитить. Кроме того, как это обычно используют для пептидного синтеза, путем повторения последовательно реакции и удаления защиты аминокислоты или пептида, составляющих пептид или аминокислоту (28), для элонгации, также можно получить соединение (51).

Путем удаления защитной группы P⁸ для амино группы полученного соединения (51) можно получить соединение (52). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (53) можно получить путем дериватизации аминокислоты или пептида (31) с N-концом, защищенным группой P⁹, и карбокси группой, гидрокси группой или амино группой в боковой цепи, защищенной группой P¹⁰, как описано в Способе получения 4, в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (52). Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между аминокислотой или пептидом (31) и соединением (52) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитные группы P⁹ и P¹⁰ являются такими же, которые описаны в Способе получения 5. Кроме того, как это обычно используют для пептидного синтеза, путем повторения последовательно реакции и удаления защиты составляющей аминокислоты или пептида для элонгации также можно получить соединение (53).

Путем удаления группы P⁹ в качестве защитной группы для амино группы полученного соединения (53) можно получить соединение (54). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение можно получить (55) путем дериватизации карбоновокислотного производного (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (54). Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между карбоновокислотным производным (11) и соединением (54) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Путем удаления защитной группы P¹⁰ для карбокси группы, гидрокси группы или амино группы полученного соединения (55) можно получить соединение (2). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

[0174]

Соединение (53) также можно получить, например, следующим способом.

Путем удаления защитной группы P¹² для карбокси группы соединения (49), описанного в Способе получения 5, можно получить пептид (56). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (53) можно получить путем дериватизации полученного пептида (56) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (4) или его солью. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между соединением (56) и соединением (4), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0175]

Соединение (55) также можно получить, например, следующим способом.

Соединение (55) можно получить путем дериватизации соединения (48), описанного в Способе получения 5, в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (4) в присутствии основания, или путем дериватизации аминокислоты или пептида (45), описанного в Способе получения 5, в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (52) в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования каждой пептидной связи, можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0176]

7. Способ получения 7

В рамках промежуточного соединения, представленного формулой (2), соединения, содержащие линкерную структуру -L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-NH-(CH₂)n²-C(=O)-, где указанный L^P представляет собой пептидный остаток, содержащий гидрофильную аминокислоту на N-конце, и указанная гидрофильная аминокислота, расположенная на N-конце, отлична от глицина, также можно получить следующим способом.

[0177]

[Химическая формула 29]

[0178]

[в этой формуле, L^1' соответствует L¹, имеющему структуру, в которой концевая группа модифицирована с образованием малеимидильной группы, L^P представляет собой структуру, состоящую из -L^p1-L^p2-, и P⁹ и P¹³ представляют собой защитную группу].

[0179]

Промежуточное соединение, представленное формулой (2), включает следующие два варианта, то есть структуру, в которой линкер представлен как -L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-NH-(CH₂)n²-C(=O)-, и структуру, в которой линкер представлен как -L¹-L²-L^P-.

Соединение (2) с структурой, в которой линкер представлен как -L¹-L²-L^P-NH-(CH₂)n¹-L^a-NH-(CH₂)n²-C(=O)-, можно получить следующим способом.

Соединение (57) можно синтезировать таким же способом, как соединение (32), описанное в Способе получения 5. Однако, в отличие от соединения (32), необязательно, чтобы для удаления защитной группы P⁹ для амино группы и защитной группы P¹³ для функциональной группы в боковой цепи использовались разные способы или разные условия. Функциональная группа в боковой цепи представляет собой карбокси группу или гидрокси группу, и защитную группу P⁹ для амино группы и защитную группу P¹³ для карбокси группы или гидрокси группы в боковой цепи можно удалить одновременно. Например, репрезентативный пример включает комбинацию, в которой P⁹ представляет собой трет-бутилоксикарбонильную группу и P¹³ представляет собой трет-бутильную группу или тритильную группу, или P³ представляет собой бензилокси карбонильную группу и P¹³ представляет собой бензильную группу. Защитные группы можно подходящим образом выбрать из указанных выше групп, относящихся к защитным группам для соединения (6), в зависимости от, например, свойств амино группы, карбокси группы или гидрокси группы соединения, подлежащих защите. Для удаления защитных групп реагенты и условия выбирают в зависимости от защитной группы. С использованием защищенной аминокислоты или пептида, удовлетворяющих указанным выше свойствам, можно синтезировать соединение (57) таким же способом, как Способ получения 5.

Путем последовательного или одновременного удаления защитных групп P⁹ и P¹³ соединения (57) можно получить соединение (51). Можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Функциональная группа в гидрофильной боковой цепи L^P в соединении (58) особым образом не защищена, однако путем взаимодействия с соединением (11), дериватизированным в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п., в присутствии основания можно получить соединение (2). Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования каждой пептидной связи, можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Соединение (2) с структурой, в которой линкер представлен как -L¹-L²-L^P-, можно получить следующим способом.

Соединение (59) также можно синтезировать таким же способом, как соединение (53), описанное в Способе получения 6. Однако, в отличие от соединение (53), необязательно, чтобы для удаления защитной группы P³ для амино группы и защитной группы P⁸ для функциональной группы в боковой цепи использовались разные способы или разные условия. Функциональная группа в боковой цепи представляет собой карбокси группу или гидрокси группу, и защитную группу P⁹ для амино группы и защитную группу P¹³ для карбокси группы или гидрокси группы в боковой цепи можно удалить одновременно. Например, репрезентативный пример включает комбинацию, в которой P⁹ представляет собой трет-бутилоксикарбонильную группу и P¹³ представляет собой трет-бутильную группу или тритильную группу, или P³ представляет собой бензилокси карбонильную группу и P¹³ представляет собой бензильную группу. Защитные группы можно подходящим образом выбрать из указанных выше групп, относящихся к защитным группам для соединения (6), в зависимости от, например, свойств амино группы, карбокси группы или гидрокси группы соединения, защиту которых осуществляют. Для удаления защитных групп реагенты и условия выбирают в зависимости от защитной группы. С использованием защищенной аминокислоты или пептида, удовлетворяющих указанным выше свойствам, можно синтезировать соединение (59) таким же способом, как Способ получения 6.

Путем последовательного или одновременного удаления защитных групп P⁹ и P¹³ соединения (59) можно получить соединение (53). Можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Функциональная группа в гидрофильной боковой цепи L^P в соединении (60) особым образом не защищена. Однако путем взаимодействия с соединением (11), дериватизированным в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п., в присутствии основания можно получить соединение (2 Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования каждой пептидной связи, можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0180]

8. Способ получения 8

Соединение (43), показанное в Способе получения 5, в котором линкер -L^P- имеет структуру -L^p1-Gly-Gly-Phe-Gly-, также можно получить следующим способом.

[0181]

[Химическая формула 30]

[0182]

[в этой формуле, P⁹ и P¹⁰ представляют собой защитную группу].

[0183]

Соединение (62) можно получить путем дериватизации аминокислоты или пептида (31), описанных в Способе получения 5, в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]глицинамидом (то есть свободной формой фармацевтического соединения, раскрытого в Международной публикации № WO 1997/46260) (61) или его солью в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между аминокислотой или пептидом (31) и соединением (61) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитная группа P³ для N-концевой группы и защитная группа P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи являются такими же, которые описаны в Способе получения 5. При этом, защитная группа P¹⁰ для функциональной группы в боковой цепи может не присутствовать, и путем осуществления реакции с использованием аминокислоты или пептида (31) с защищенной только N-концевой группой можно получить соединение (62).

[0184]

9. Способ получения 9

Из соединений, представленных формулой (2), соединение, в котором линкер имеет структуру, представленную как -L¹-L²-L^P-, и указанный L^P представляет собой олигопептид, в котором C-конец состоит из 2 или 3 или более глицинов и связан с лекарственным средством, и N-конец указанного пептидного остатка представляет собой глицин в случае, когда гидрофильная аминокислота присутствует на N-конце, также можно получить в соответствии со следующим способом.

[0185]

[Химическая формула 31]

[0186]

[в этой формуле, L^1' соответствует L¹, имеющему структуру, в которой концевая группа преобразована в малеимидильную группу, L^P представляет собой структуру, состоящую из L^p1-L^p2, и P¹² и P¹⁴ представляют собой защитную группу].

[0187]

Поскольку L^P образуется путем связывания L^p1 с L^p2, количество глицинов для образования C-конца L^P, содержихся в нем, можно рассчитать с учетом количества глицинов на C-концев L^P и количества их повторного использования в процессе реакции.

Пептид (63) представляет собой олигопептид, в котором C-конец состоит из 2 или 3 или более глицинов, и N-конец представляет собой глицин в случае, когда N-конец указанного пептидного остатка представляет собой гидрофильную аминокислоту и, кроме того, указанный N-конец защищен группой P¹⁴. Как обычно используют для пептидного синтеза, пептид (63) можно синтезировать путем повторения последовательно реакции конденсации составляющей аминокислоты или пептида и удаления защиты.

Соединение (64) можно получить путем дериватизации пептида (63) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (4) или его солью. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между пептидом (63) и соединением (4), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитную группу P¹⁴ можно подходящим образом выбрать и использовать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Соединение (64) также можно получить путем дериватизации аминокислоты или пептида (65) с N-концевой группой, защищенной группой P¹⁴, в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (52), описанным в Способе получения 6. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между аминокислотой или пептидом (65) и соединением (52), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитную группу P¹⁴ можно подходящим образом выбрать и использовать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Путем удаления защитной группы P¹⁴ для амино группы полученного соединения (64 можно получить) соединение (66). Можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (2) можно получить путем дериватизации карбоновокислотного производного (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с полученным соединением (66). Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования амидной связи между карбоновокислотоным производным (11) и соединением (66), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Соединение (2) также можно получить следующим способом.

В соединении (67) глицин на N-конце L^p1 связан с L², и его можно получить таким же способом, как соединение (45) описанное в Способе получения 5. Соединение (68) можно получить путем дериватизации аминокислоты или пептида (46), описанных в Способе получения 5, в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид кислоты или т.п. и взаимодействия с соединением (67). Здесь, аминокислота или пептид (46) представляет собой олигопептид, состоящий из глицина или содержащий C-конец, состоящий из 2 или 3 или более глицинов, в котором C-конец защищен группой P¹². Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования амидной связи между аминокислотой или пептидом (46) и соединением (67), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Соединение (68) также можно получить путем дериватизации соединения (11) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с пептидом (69), содержащим C-конец, защищенный группой P¹². Здесь, пептид (69) представляет собой олигопептид, в котором the C-конец состоит из 2 или 3 или более глицинов, и N-конец представляет собой глицин в случае, когда N-конец указанного пептидного остатка представляет собой гидрофильную аминокислоту. Как обычно используют для пептидного синтеза, пептид (69) можно получить путем повторения последовательно реакции конденсации составляющей аминокислоты или пептида и удаления защиты. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между пептидом (69) и соединением (11), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6). Защитная группа P¹² предпочтительно представляет собой защитную группу, которую можно удалить в кислотных условиях, но не ограничивается этим, и ее можно подходящим образом выбрать и использовать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

Путем удаления защитной группы P¹² для карбокси группы полученного соединения (68) можно получить соединение (70). Для этой процедуры удаления защиты можно выбрать реагенты и условия в зависимости от защитной группы.

Соединение (2) можно получить путем дериватизации соединения (70) в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (4) или его солью. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между соединением (70) и соединением (4), можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

В дополнение к описанному выше, соединение (2) также можно получить в соответствии со следующим способом.

Соединение (2) можно получить путем дериватизации соединения (52), описанного в Способе получения 6, в активный сложный эфир, смешанный ангидрид кислоты или т.п. и его взаимодействия с соединением (67) в присутствии основания. Реакционные условия, реагенты, основание и растворитель, используемые для образования пептидной связи между соединением (67) и соединением (52) можно подходящим образом выбрать из тех, которые описаны для синтеза соединения (6).

[0188]

При этом, все из промежуточных соединений Способов 1-9 могут присутствовать в форме соли и/или гидрата.

[0189]

Конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, когда его оставляют на воздухе или подвергают процедурам очистки, таким как перекристаллизация, может например, абсорбировать влагу и содержать адсорбированную воду или превращаться в гидрат. Такое соединение и соль, содержащие воду, также включены в настоящее изобретение.

Соединение, меченное различными радиоактивными или не-радиоактивными изотопами, также включено в настоящее изобретение. Один или несколько атомов, содержащихся в конъюгате антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, могут содержать атомный изотоп в не существующем в природе отношении. Примеры атомного изотопа включают дейтерий (²H), тритий (³H), иод-125 (¹²⁵I) и углерод-14 (¹⁴C). Кроме того, соединение по настоящему изобретению может быть мечено радиоактивным изотопом, таким как тритий (³H), иод-125 (¹²⁵I), углерод-14 (¹⁴C), медь-64 (⁶⁴Cu), цирконий-89 (⁸⁹Zr), иод-124 (¹²⁴I), фтор-18 (¹⁸F), индий-111 (¹¹¹I), углерод-11 (¹¹C) и иод-131 (¹³¹I). Соединение, меченное радиоактивным изотопом, является полезным в качестве терапевтического или профилактического средства, реагента для исследований, такого как реагент для анализа, и средства для диагностики, такого как in vivo диагностического визуализирующего агента. Не будучи связанным с радиоактивностью, любой изотопный вариант конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению охватывается объемом настоящего изобретения.

[0190]

{Фармацевтические/лекарственные средства}

Конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению демонстрирует цитотоксическую активность против раковых клеток, и, таким образом, его можно использовать в качестве лекарственного средства, особенно в качестве терапевтического средства и/или профилактического средства от рака.

А именно, конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению можно селективно использовать в качестве лекарственного средства для химиотерапии, которая представляет собой основной способ для лечения рака, и, как результат, можно отсрочить развитие раковых клеток, ингибировать их рост и затем разрушать раковые клетки. Это может обеспечить для раковых пациентов возможность не иметь симптомы, вызываемые раком, или возможность достижения улучшения QOL раковых пациентов и достижения терапевтического эффекта, поддерживая жизнь раковых пациентов. Даже если конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению не достигает уровня разрушения раковых клеток, он способен достигать более высокого QOL раковых пациентов с достижением их более долгого периода выживания путем ингибирования или контроля роста раковых клеток.

В такой лекарственной терапии конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства отдельно. Кроме того, конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства в комбинации с дополнительной терапией в адъювантной терапии, и можно использовать в сочетании с хирургической операцией, лучевой терапией, гормональной терапией или т.п. Кроме того, конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению также можно использовать в качестве лекарственного средства для лекарственной терапии в неоадъювантной терапии.

Помимо терапевтического применения, описанного выше, также можно ожидать эффект подавления роста минорного количества метастатических раковых клеток и затем их уничтожения. В частности, когда экспрессию HER3 подтверждают в первичных раковых клетках, можно ожидать ингибирования раковых метастазов или профилактический эффект при введении конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению. Например, можно ожидать эффекта ингибирования и уничтожения раковых клеткок в жидкости организма при образовании метастазов или эффекта, например, ингибирования и уничтожения минорных количеств раковых клеток сразу после имплантации в любой ткани. Кроме того, можно ожидать ингибирования раковых метастазов или профилактического эффекта, в частности, после хирургического удаления рака.

Можно ожидать, что конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению будет проявлять терапевтический эффект при введении пациентам в качестве системной терапии, а также при местном введении в раковые ткани.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (1) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого и меланомы in vitro.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (2) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака и меланомы in vitro и более сильный противораковый эффект против рака молочной железы и меланомы in vivo по сравнению с U1-59.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (3) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого, рака яичников, колоректального рака и меланомы in vitro и более сильный противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого, рака желудка и меланомы in vivo по сравнению с U1-59.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (4) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы in vitro.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (5) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого и меланомы in vitro.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (6) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого и меланомы in vitro и более сильный противораковый эффект против рака молочной железы in vivo по сравнению с U1-59.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (7) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого и меланомы in vitro.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (8) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого и меланомы in vitro и более сильный противораковый эффект против рака молочной железы in vivo по сравнению с U1-59.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (9) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого, рака яичника, колоректального рака и меланомы in vitro.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (10) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака и меланомы in vitro и более сильный противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака, рака желудка и меланомы in vivo по сравнению с U1-59.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (11) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы in vitro.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (12) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого, рака яичника, колоректального рака и меланомы in vitro.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы, рака легкого, колоректального рака и меланомы in vitro и более сильный противораковый эффект против рака молочной железы (включая тройной негативный рак молочной железы), рака легкого, рака желудка, панкреатического рака и меланомы in vivo по сравнению с U1-59.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (14) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы in vitro.

Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) обладал отличной противоопухолевой активностью, безопасностью и физическими свойствами и продемонстрировал противораковый эффект против рака молочной железы (включая люминальный и тройной негативный), меланомы, рака яичника, рака мочевого пузыря, рака легкого, рака головы и шеи и гастрального рака in vivo при введении отдельно или в комбинации с трастузумаом, гефинитибом, цетуксимабом, панитумумабом или пертузумабом.

[0191]

Примеры типа рака, для которого применяют конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, включают рак легкого, рак почки, уротелиальный рак, колоректальный рак, рак предстательной железы, мультиформную глиобластому, рак яичников, панкреатический рак, рак молочной железы, метастатический рак молочной железы, люминальный рак молочной железы, меланому, рак печени, рак мочевого пузыря, гастральный рак (рак желудка), желудочно-кишечную стромальную опухоль, цервикальный рак, рак головы и шеи, эзофагеальный рак, эпидермоидный рак, перитонеальный рак, мультиформную глиобластому взрослых, гепатический рак, гепатоклеточную карциному, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак толстой кишки и прямой кишки, эндометриальный рак, рак матки, рак слюнной железы, ренальный рак, рак вульвы, рак щитовидной железы, гепатическую карциному, анальную карциному, рак полового члена. Химиотерапия является единственным существующим лечением, показанным особенно для тройного негативного рака молочной железы (в котором отсутствует экспрессия HER2, эстрогена и рецепторов прогестерона) из типов рака молочной железы, который, как считают, имеет плохой прогноз. Не было почти никаких сообщений, касающихся экспрессии HER3 в тройном негативном раке молочной железы. Однако, если экспрессию HER3 наблюдают у пациентов с тройным негативным раком молочной железы, можно использовать конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению в качестве терапевтического средства и/или профилактического средства. Однако рак не ограничивается этими типами, при условии, что он представляет собой раковую клетку, экспрессирующую, в раковой клетке как объекте лечения, белок, который антитело из конъюгата антитело-лекарственное средство может распознавать.

Лечение с использованием конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению может быть нацелено на раковую клетку, экспрессирующую, в раковой клетке как объекте лечения, HER3 белок, который антитело из конъюгата антитело-лекарственное средство может распознавать. В описании настоящего изобретения "рак, экспрессирующий HER3 белок" означает рак, включающий клетки, содержащие HER3 белок на их поверхности, или рак, секретирующий HER3 белок в кровь. HER3 белок чрезмерно экспрессируется в различных опухолях человека, и его можно определить с использованием способа, который обычно применяют, такого как метод иммуногистохимического окрашивания (IHC) для определения гиперэкспрессии HER3 белка в образцах опухоли (первичной, метастатической), метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для определения амплификации HER3 гена или иммуноферментный анализ (ELISA) для определения гиперэкспрессии HER3 белка в образцах крови.

Конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению демонстрирует противоопухолевый эффект путем распознавания и затем интернализации HER3 белка, экспрессируемого на поверхности раковой клетки. Таким образом, объект лечения конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению не ограничивается "раком, экспрессирующим HER3 белок", и это также может быть, например, лейкоз, злокачественная лимфома, плазмацитома, миелома или саркома.

[0192]

Конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению предпочтительно можно вводить млекопитающему, но более предпочтительно его вводят человеку.

[0193]

Вещества, используемые в фармацевтической композиции, содержащей конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, можно соответствующим образом выбрать и использовать из добавок для формулирования композиций или т.п., которые, как правило, используют в данной области техники, с учетом дозы или используемой для введения концентрации.

[0194]

Конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить в виде фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один фармацевтически подходящий ингредиент. Например, фармацевтическая композиция типично содержит по меньшей мере один фармацевтический носитель (например, стерилизованную жидкость). Как описано в настоящей заявке, примеры жидкости включают воду и масло (минеральное масло и масло животного происхождения, растительного происхождения или синтетического происхождения). Масло может представлять собой, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло или т.п. Вода является более типичным носителем, когда фармацевтическую композициювводят внутривенно. Физиологический солевой раствор, водный раствор декстрозы и водный раствор глицерина также можно использовать в качестве жидкого носителя, в частности, в растворе для инъекций. Подходящий фармацевтический носитель можно подходящим образом выбрать из тех, которые известны в данной области техники. Если желательно, композиция также может содержать следовые количества увлажнителя, эмульгатора или pH буферного агента. Примеры подходящего фармацевтического носителя раскрыты в "Remington's Pharmacetical Sciences" by E. W. Martin. Композиции соответствуют способу введения.

[0195]

Известны различные системы доставки, и их можно использовать для введения конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению. Примеры пути введения включают внутрикожный, внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный и подкожный пути, но не ограничиваются этим. Введение можно осуществить путем инъекции или болюсной инъекции, например. В соответствии со специальным предпочтительным вариантом воплощения, введение конъюгата антитело-лекарственное средство осуществляют путем введения инъекции. Парентеральное введение является предпочтительным путем введения.

[0196]

В соответствии с репрезентативным вариантом воплощения, фармацевтическая композиция предназначена в качестве фармацевтической композиции, подходящей для внутривенного введения человеку в соответствии с традиционными процедурами. Композиция для внутривенного введения типично представляет собой раствор в стерильном и изотоническом водном буферном растворе. Если необходимо, лекарственное средство может содержать солюбилизирующее вещество и местные анестетики для облегчения боли в месте инъекции (например, лигнокаин). Как правило, ингредиент, указанный выше, обеспечивают индивидуально либо в виде лиофилизированного порошка либо безводного концентрата, содержащегося в контейнере, который получают в виде герметично закрытой ампулы или саше, содержащих определенное количество активного вещества, или в виде смеси в стандартной лекарственной форме. Когда лекарственное средство находится в форме для введения путем инъекции, его можно вводить из флакона с инъекционным раствором, который содержит стерильную воду или солевой раствор фармацевтической степени чистоты. Когда лекарственное средство вводят путем инъекции, можно обеспечить ампулу со стерильной водой или солевым раствором для инъекций, чтобы указанные выше ингредиенты смешивать друг с другом перед введением.

[0197]

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать только конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство, раскрытый в настоящей заявке, в качестве активного ингредиента, или может включать конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и по меньшей мере одно лекарственное средство(например, средство для лечения рака) помимо конъюгата. Конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить с другим средством для лечения рака, и противораковый эффект может соответственно усиливаться. Например, другое лекарственное средство, такое как противораковое средство, используемое для этих целей, можно вводить до введения фармацевтической композиции, включающей конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, или после введения фармацевтической композиции, включающей конъюгат антитело-лекарственное средство в качестве активного ингредиента, или можно вводить одновременно с конъюгатом анти-HER3 антитело-лекарственное средство, раздельно (индивидуально) или после введения конъюгата антитело-лекарственное средство, и введение можно осуществлять, варьируя интервал между введениями для каждого. В настоящем изобретении, случай, где конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению вводят одновременно с другим лекарственным средством в виде одного препарата, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство и это лекарственное средство, и случай, где конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению и другое лекарственное средство вводят одновременно или последовательно в виде разных препаратов или вводят, варьируя интервал введения для каждого, оба включены в объем "фармацевтической композиции, включающей конъюгат антитело-лекарственное средство и другое лекарственное средство". Примеры средства для лечения рака включают 5-FU, трастузумаб, трастузумаб эмтансин (T-DM1), цетуксимаб, гефитиниб, панитумумаб, пертузумаб, абраксан, эрлотиниб, карбоплатин, цисплатин, гемцитабин, капецитабин, иринотекан (CPT-11), паклитаксел, доцетаксел, пеметрексед, сорафениб, винбластин, винорелбин, вермурафениб, лекарственные средства, описанные в Международной публикации № WO 2003/038043, LH-RH аналоги (лейпрорелин, госерелин или т.п.), эстрамустин фосфат, антагонист эстрогена (тамоксифен, ралоксифен или т.п.) и ингибитор ароматазы (анастрозол, летрозол, экземестан или т.п.), но этим не ограничиваются, при условии, что это лекарственное средство, которое обладает противоопухолевой активностью. Эти средства для лечени рака можно классифицировать, в соответствии с их мишенями, на: анти-FGER средства, такие как цетуксимаб, гефитиниб и панитумумаб; анти-HER2 средства, такие как трастузумаб, T-DM1 и пертузумаб; анти-HER3 средства, такие как патритумаб, MM-121 и MM-111; анти-VEGF средства, такие как инфликсимаб и адалимумаб; и т.д. Кроме того, их можно классифицировать на: анти-EGFR антитела, такие как цетуксимаб и панитумумаб; анти-HER2 антитела, такие как трастузумаб и пертузумаб; анти-HER3 антитела, такие как патритумаб, MM-121 и MM-111; анти-VEGF антитела, такие как инфликсимаб и адалимумаб; и т.д. Конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению демонстрирует отличный терапевтический эффект при введении в комбинации с анти-HER2 средством или анти-HER2 антителом в i) лечении рака желудка, рака молочной железы, тройного негативного рака молочной железы или т.п. или при введении в комбинации с анти-EGFR средством или анти-EGFR антителом в ii) лечении рака легкого, рака головы и шеи, рака желудка, рака молочной железы, тройного негативного рака молочной железы или т.п. Можно использовать одно или два или более лекарственных средств помимо конъюгата, и эти лекарственные средства могут представлять собой противораковые средства или могут представлять собой лекарственные средства для облегчения побочных эффектов, вызываемых дополнительными лекарственными средствами.

[0198]

В настоящем изобретении, "фармацевтическая композиция, включающая конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другое лекарственное средство" имеет такое же значение, что и "фармацевтическая композиция, в которой конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство должен вводиться в комбинации с другим лекарственным средством". В настоящем изобретении фраза "вводимый в комбинации", используемая для конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другого лекарственного средства, означает, что конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другое лекарственное средство вводят в организм реципиента в пределах определенного периода времени. Можно вводить один препарат, содержащий конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другое лекарственное средство, или конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другое лекарственное средство могут быть отдельно сформулированы, и их можно вводить в виде отдельных препаратов. В случае отдельных препаратов, время их введения конкретно не ограничивается, и эти препараты можно вводить одновременно или можно вводить в разное время или в разные дни поочередно. В случае, когда конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другое лекарственное средство вводят отдельно в разное время или в разные дни, порядок их введения конкретно не ограничивается. Поскольку отдельные препараты обычно вводят с соблюдением соответствующих способов их введения, частота их введения может быть одинаковой или может быть разной. Кроме того, такие отдельные препараты можно вводить одним и тем же способом введения (путем введения) или разными способами введения (путями введения). Необязательно, чтобы конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другое лекарственное средство существовали в организме в одно и то же время, и достаточно, чтобы конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другое лекарственное средство вводили в организм в пределах определенного периода (например, 1 месяц, предпочтительно 1 неделя, более предпочтительно несколько дней, еще более предпочтительно 1 день). Альтернативно, когда вводят один из активных ингредиентов, другой активный ингредиент уже может исчезать из организма.

Примеры лекарственной формы "фармацевтической композиции, в которой конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство вводится в комбинации с другим лекарственным средством", могут включать: 1) введение одного препарата, включающего конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другое лекарственное средство, 2) одновременное введение одним и тем же путем введения двух препаратов, полученных путем отдельного формулирования конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другого лекарственного средства, 3) введение поочередно одним и тем же путем введения двух препаратов, полученных путем отдельного формулирования конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другого лекарственного средства, 4) одновременное введение разными путями введения двух препаратов, полученных путем отдельного формулирования конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другого лекарственного средства, и 5) введение поочередно разными путями введения двух препаратов, полученных путем отдельного формулирования конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другого лекарственного средства. Доза, интервал дозирования, лекарственная форма, препарат и т.д., "фармацевтической композиции, в которой конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство вводится в комбинации с другим лекарственным средством" соответствуют фармацевтической композиции, содержащей конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, но не ограничиваются этим.

Такая фармацевтическая композиция, сформулированная в виде двух разных препаратов, может быть в форме набора, содержащего их.

В настоящем изобретении, "комбинация" конъюгата анти-HER3 антитело-лекарственное средство и другого лекарственного средства означает, что конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство и лекарственное средство "вводят в комбинации".

[0199]

Фармацевтическую композицию можно сформулировать в виде лиофилизированного препарата или жидкого препарата, в виде препарата, содержащего желаемую композицию и имеющего требуемую чистоту. Когда композиция сформулирована в виде лиофилизированного препарата, это может быть препарат, содержащий подходящие для формулирования добавки, которые используют в данной области. Также, что касается жидкой композиции, ее можно сформулировать в виде жидкого препарата, содержащего различные добавки для формулирования, которые используют в данной области.

[0200]

Композиция и концентрация фармацевтической композиции могут варьироваться в зависимости от способа введения. Однако конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может проявлять фармацевтический эффект даже при низкой дозе, когда конъюгат антитело-лекарственное средство имеет более высокую аффинность к антигену, то есть более высокую аффинность (= более низкое Kd значение), выраженную как константа диссоциации (то есть Kd значение) для антигена. Таким образом, что касается определения дозы конъюгата антитело-лекарственное средство, дозу можно определить в свете ситуации, касающейся аффинности между конъюгатом антитело-лекарственное средство и антигеном. Когда конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению вводят человеку, например, около 0,001-100 мг/кг можно вводить один раз или вводить несколько раз с интервалом один раз в течение 1-180 дней.

Примеры

[0201]

Настоящее изобретение более конкретно описывается в свете примеров, представленных ниже. Однако настоящее изобретение не ограничивается ими. Кроме того, это ни в коем случае нельзя рассматривать как ограничение. Кроме того, если специально не указано иное, реагент, растворитель и исходное вещество, описанные в описании изобретения, легко можно получить от коммерческого поставщика.

[0202]

Ссылочный пример 1 Получение U1-59

U1-59 получали в соответствии со способом, описанным в Международной публикации № WO 2007/077028.

[0203]

Пример 1 Конъюгат антитело-лекарственное средство (1)

[Химическая формула 32]

[0204]

Стадия 1: трет-Бутил (4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)карбамат

4-(трет-Бутоксикарбониламино)бутановую кислоту (0,237 г, 1,13 ммоль) растворяли в дихлорметане (10 мл), загружали N-гидроксисукцинимид (0,130 г, 1,13 ммоль) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (0,216 г, 1,13 ммоль) и перемешивали в течение 1 часа. Реакционный раствор добавляли по каплям к раствору N,N-диметилформамида (10 мл), содержащего экзатекан мезилат (0,500 г, 0,94 ммоль), и триэтиламину (0,157 мл, 1,13 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 дня. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=8:2 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения (0,595 г, количественный выход).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,87 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,31 (9H, с), 1,58 (1H, т, J=7,2 Гц), 1,66 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,89-1,82 (2H, м), 2,12-2,21 (3H, м), 2,39 (3H, с), 2,92 (2H, т, J=6,5 Гц), 3,17 (2H, с), 5,16 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,24 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, с), 5,59-5,55 (1H, м), 6,53 (1H, с), 6,78 (1H, т, J=6,3 Гц), 7,30 (1H, с), 7,79 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,40 (1H, д, J=8,6 Гц).

MS (APCI) m/z: 621 (M+H)⁺.

[0205]

Стадия 2: 4-Амино-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]бутанамид трифторацетат

Соединение (0,388 г, 0,61 ммоль), полученное на описанной выше Стадии 1, растворяли в дихлорметане (9 мл). После добавления трифторуксусной кислоты (9 мл) смесь перемешивали в течение 4 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - отделенный органический слой хлороформ:метанол:вода=7:3:1 (об/об/об)] с получением указанного в заголовке соединения (0,343 г, количественный выход).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) 0,87 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,79-1,92 (4H, м), 2,10-2,17 (2H, м), 2,27 (2H, т, J=7,0 Гц), 2,40 (3H, с), 2,80-2,86 (2H, м), 3,15-3,20 (2H, м), 5,15 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,26 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, с), 5,54-5,61 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,32 (1H, с), 7,72 (3H, шир.с), 7,82 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,54 (1H, д, J=8,6 Гц).

MS (APCI) m/z: 521 (M+H)⁺.

[0206]

Стадия 3: N-(трет-бутоксикарбонил)глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамид

N-(трет-бутоксикарбонил)глицилглицил-L-фенилаланилглицин (0,081 г, 0,19 ммоль) растворяли в дихлорметане (3 мл), загружали N-гидроксисукцинимид (0,021 г, 0,19 ммоль) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (0,036 г, 0,19 ммоль) и перемешивали в течение 3,5 часов. Реакционный раствор добавляли по каплям к раствору N,N-диметилформамида (1,5 мл), содержащего соединение (0,080 г, 0,15 ммоль), которое было полученно на описанной выше Стадии 2, и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=8:2 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения (0,106 г, 73%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,36 (9H, с), 1,71 (2H, м), 1,86 (2H, т, J=7,8 Гц), 2,15-2,19 (4H, м), 2,40 (3H, с), 2,77 (1H, дд, J=12,7, 8,8 Гц), 3,02 (1H, дд, J=14,1, 4,7 Гц), 3,08-3,11 (2H, м), 3,16-3,19 (2H, м), 3,54 (2H, д, J=5,9 Гц), 3,57-3,77 (4H, м), 4,46-4,48 (1H, м), 5,16 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, с), 5,55-5,60 (1H, м), 6,53 (1H, с), 7,00 (1H, т, J=6,3 Гц), 7,17-7,26 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,71 (1H, т, J=5,7 Гц), 7,80 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,92 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,15 (1H, д, J=8,2 Гц), 8,27 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,46 (1H, д, J=8,2 Гц).

MS (APCI) m/z: 939 (M+H)⁺.

[0207]

Стадия 4: Глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамид трифторацетат

Соединение (1,97 г, 2,10 ммоль), полученное на описанной выше Стадии 3, растворяли в дихлорметане (7 мл). После добавления трифторуксусной кислоты (7 мл) смесь перемешивали в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении и загружали толуол для азеотропной перегонки. Полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - отделенный органический слой хлороформ:метанол:вода=7:3:1 (об/об/об)] с получением указанного в заголовке соединения (1,97 г, 99%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,71-1,73 (2H, м), 1,82-1,90 (2H, м), 2,12-2,20 (4H, м), 2,40 (3H, с), 2,75 (1H, дд, J=13,7, 9,4 Гц), 3,03-3,09 (3H, м), 3,18-3,19 (2H, м), 3,58-3,60 (2H, м), 3,64 (1H, д, J=5,9 Гц), 3,69 (1H, д, J=5,9 Гц), 3,72 (1H, д, J=5,5 Гц), 3,87 (1H, дд, J=16,8, 5,9 Гц), 4,50-4,56 (1H, м), 5,16 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, с), 5,55-5,60 (1H, м), 7,17-7,27 (5H, м), 7,32 (1H, с), 7,78-7,81 (2H, м), 7,95-7,97 (3H, м), 8,33-8,35 (2H, м), 8,48-8,51 (2H, м).

MS (APCI) m/z: 839 (M+H)⁺.

[0208]

Стадия 5: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамид

К раствору в N,N-диметилформамиде (1,2 мл) соединения (337 мг, 0,353 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 4, добавляли триэтиламин (44,3 мл, 0,318 ммоль) и N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноат (119,7 мг, 0,388 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=5:1 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (278,0 мг, 76%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,87 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,12-1,22 (2H, м), 1,40-1,51 (4H, м), 1,66-1,76 (2H, м), 1,80-1,91 (2H, м), 2,05-2,21 (6H, м), 2,39 (3H, с), 2,79 (1H, дд, J=14,0, 9,8 Гц), 2,98-3,21 (5H, м), 3,55-3,77 (8H, м), 4,41-4,48 (1H, м), 5,15 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,24 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,40 (1H, д, J=17,1 Гц), 5,44 (1H, д, J=17,1 Гц), 5,54-5,60 (1H, м), 6,53 (1H, с), 6,99 (2H, с), 7,20-7,27 (5H, м), 7,30 (1H, с), 7,70 (1H, т, J=5,5 Гц), 7,80 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,03 (1H, т, J=5,8 Гц), 8,08 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,14 (1H, д, J=7,9 Гц), 8,25 (1H, т, J=6,1 Гц), 8,46 (1H, д, J=8,5 Гц).

MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)⁺.

[0209]

Стадия 6: Конъюгат антитело-лекарственное средство (1)

Восстановление антитела: U1-59, полученный в Ссылочном примере 1, получали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6,0/EDTA с использованием Общей процедуры B и Общей процедуры C, описанных в Способе получения 1. Раствор (1,00 мл) добавляли в 2,0-мл полипропиленовую пробирку и загружали водный раствор 10 мМ TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0307 мл; 4,6 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) и 1 M водный раствор дикалий гидрофосфата (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 мл). После подтверждения, что раствор имеет pH 7,4 +/- 0,1, дисульфидную связь в шарнирной части в антителе восстанавливали путем инкубации при 37C в течение 1 часа.

Конъюгация между антителом и компонентом лекарственное средство-линкер: После инкубации раствора на водяной бане при 22C в течение 10 минут добавляли диметилсульфоксид (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,0586 мл) и раствор диметилсульфоксида (0,0615 мл; 9,2 эквивалентов в расчете на молекулу антитела), содержащего 10 мМ соединения, полученного на описанной выше Стадии 5, и инкубировали на водяной бане при 22C в течение 40 минут для конъюгирования компонента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0123 мл) 100 мМ NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) и перемешивали с использованием трубчатого ротатора (MTR-103, изготовитель AS ONE Corporation) при комнатной температуре в течение 20 минут для прекращения реакции лекарственное средство-линкера.

Очистка: Полученный выше раствор подвергали очистке с использованием Общей процедуры D (ABS используют в качестве буферного раствора), описанной в Способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство.

Физико-химическая характеризация: С использованием Общей процедуры E, описанной в Способе получения 1 (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=7280 и E_D.370=23400), были получены следующие характеристические значения.

Концентрация антитела: 1,29 мг/мл, выход антитела: 7,74 мг (77%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E: 4,9.

[0210]

Пример 2 Конъюгат антитело-лекарственное средство (2)

[Химическая формула 33]

[0211]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (2)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 5 Примера 1, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентрация антитела: 12,0 мг/мл, выход антитела: 226,8 мг (91%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E: 4,9.

[0212]

Пример 3 Конъюгат антитело-лекарственное средство (3)

[Химическая формула 34]

[0213]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (3)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на Стадии 5 Примера 1, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентраци антитела: 16,9 мг/мл, выход антитела: 219,7 мг (88%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E: 4,9.

[0214]

Пример 4 Конъюгат антитело-лекарственное средство (4)

[Химическая формула 35]

[0215]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (4)

Восстановление антитела: U1-59, полученный в Ссылочном примере 1, получали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6,0/EDTA с использованием Общей процедуры B и Общей процедуры C, описанных в Способе получения 1. Раствор (1,00 мл) добавляли в 1,5 мл полипропиленовую пробирку и загружали водный раствор 10 мМ TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0187 мл; 2,8 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) и 1 M водный раствор дикалий гидрофосфата (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0170 мл). После подтверждения, что раствор имеет pH 7,0 +/- 0,1, дисульфидную связь в шарнирной части в антителе восстанавливали путем инкубации при 37C в течение 1 часа.

Конъюгация между антителом и компонентом лекарственное средство-линкер: После добавления раствора диметилсульфоксида (0,0314 мл; 4,7 эквивалентов в расчете на молекулу антитела), содержащего 10 мМ соединения, полученного на описанной выше Стадии 5, к этому раствору при комнатной температуре смесь инкубировали при 15C в течение 1 часа для конъюгирования компонента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0123 мл; 18,4 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) 100 мМ NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировалипри комнатной температуре еще в течение 20 минут для прекращения реакции лекарственного средства-линкера.

Очистка: Полученный выше раствор подвергали очистке с использованием Общей процедуры D (ABS используют в качестве буферного раствора), описанной в Способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство. После этого, раствор концентрировали с использованием Общей процедуры A.

Физико-химическая характеризация: С использованием Общей процедуры E, описанной в Способе получения 1 (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5000 и E_D.370=19000), были получены следующие характеристические значения.

Концентраци антитела: 1,02 мг/мл, выход антитела: 6,1 мг (61%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E: 2,9; и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры F (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5000): 3,2.

[0216]

Пример 5 Конъюгат антитело-лекарственное средство (5)

[Химическая формула 36]

[0217]

Стадия 1: трет-Бутил (5S,14S)-5-бензил-1-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-14-{[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}-1,4,7,10,13-пентаоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-оат

При охлаждении льдом, к раствору в N,N-диметилформамиде (10,0 мл) глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]глицинамида (свободная форма фармацевтического соединения, описанного в Международной публикации № WO 1997/46260; 0,250 г, 0,332 ммоль), N-гидроксисукцинимида (57,2 мг, 0,497 ммоль) и 4-трет-бутил N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-аспарагиновой кислоты (0,205 г, 0,497 ммоль) добавляли N,N'-дициклогексилкарбодиимид (0,123 г, 0,497 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=9:1 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,278 г, 73%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,86 (3H, т, J=7,1 Гц), 1,35 (9H, с), 1,79-1,90 (2H, м), 2,03-2,25 (2H, м), 2,40 (3H, с), 2,40-2,51 (2H, м), 2,64-2,82 (2H, м), 2,98 (1H, дд, J=13,7, 4,6 Гц), 3,16 (2H, шир.с), 3,55 (1H, дд, J=16,7, 5,7 Гц), 3,63-3,80 (4H, м), 4,16-4,34 (3H, м), 4,36-4,50 (2H, м), 5,23 (2H, с), 5,37 (1H, д, J=16,5 Гц), 5,43 (1H, д, J=16,5 Гц), 5,51-5,62 (1H, м), 6,52 (1H, с), 7,10-7,25 (5H, м), 7,26-7,33 (3H, м), 7,39 (2H, т, J=7,3 Гц), 7,65-7,72 (3H, м), 7,80 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,86 (2H, д, J=7,3 Гц), 7,98 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,07 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,15 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,31 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,41 (1H, д, J=8,7 Гц).

MS (ESI) m/z: 1147 (M+H)⁺.

[0218]

Стадия 2: трет-Бутил (5S,14S)-14-амино-5-бензил-1-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-1,4,7,10,13-пентаоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-оат

К раствору соединения (0,279 г, 0,242 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 1, в N,N-диметилформамиде (2,00 мл) добавляли пиперидин (0,240 мл, 2,42 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=2:1 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,265 г, количественный выход).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,88 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,39 (9H, с), 1,81-1,94 (1H, м), 2,07-2,28 (2H, м), 2,37 (1H, дд, J=15,8, 8,0 Гц), 2,43 (3H, с), 2,60 (1H, дд, J=15,8, 4,9 Гц), 2,75-2,82 (1H, м), 3,00 (1H, дд, J=13,9, 4,5 Гц), 3,16-3,25 (2H, м), 3,50-3,61 (2H, м), 3,65-3,81 (5H, м), 4,40-4,51 (1H, м), 5,27 (2H, дд, J=24,1, 19,0 Гц), 5,43 (2H, дд, J=21,3, 16,2 Гц), 5,56-5,65 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,15-7,28 (5H, м), 7,33 (1H, с), 7,83 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,04 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,09 (1H, д, J=8,2 Гц), 8,26-8,39 (2H, м), 8,44 (1H, д, J=8,2 Гц).

[0219]

Стадия 3: трет-Бутил (5S,14S)-5-бензил-14-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-1-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-1,4,7,10,13-пентаоксо-3,6,9,12-тетраазагексадекан-16-оат

К раствору соединения (0,100 г, 0,108 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 2, в N,N-диметилформамиде (2,00 мл) добавляли N-сукцинимидил 6-малеимид гексаноат (40,0 мг, 0,130 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=9:1 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (80,0 мг, 66%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,88 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,13-1,23 (2H, м), 1,37 (9H, с), 1,42-1,54 (4H, м), 1,80-1,96 (2H, м), 2,08-2,25 (4H, м), 2,35-3,76 (15H, м), 2,43 (3H, с), 4,39-4,49 (1H, м), 4,55-4,67 (1H, м), 5,21-5,34 (2H, м), 5,43 (2H, дд, J=21,1, 16,4 Гц), 5,56-5,64 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,01 (2H, д, J=0,8 Гц), 7,16-7,26 (5H, м), 7,33 (1H, с), 7,83 (1H, д, J=11,3 Гц), 8,04-8,18 (3H, м), 8,30-8,37 (1H, м), 8,43 (1H, д, J=8,6 Гц).

MS (ESI) m/z: 1118 (M+H)⁺.

[0220]

Стадия 4: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-альфа-аспартилглицилглицил-L-фенилаланил-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]глицинамид

При охлаждении льдом к соединению (70,0 мг, 62,6 мкмоль), полученному на описанной выше Стадии 3, добавляли трифторуксусную кислоту (4,00 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (55,0 мг, 83%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,88 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,14-1,24 (2H, м), 1,41-1,53 (4H, м), 1,79-1,95 (2H, м), 2,08-2,28 (4H, м), 2,37-2,60 (2H, м), 2,42 (3H, с), 2,63-2,82 (2H, м), 2,99 (1H, дд, J=14,1, 5,1 Гц), 3,12-3,25 (2H, м), 3,29-3,44 (1H, м), 3,52-3,80 (6H, м), 4,38-4,48 (1H, м), 4,56 (1H, дд, J=13,7, 7,4 Гц), 5,27 (2H, дд, J=24,3, 18,8 Гц), 5,43 (2H, дд, J=21,5, 16,4 Гц), 5,57-5,62 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,01 (2H, с), 7,15-7,26 (5H, м), 7,33 (1H, с), 7,82 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,98 (1H, шир.с), 8,08 (1H, д, J=6,7 Гц), 8,15 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,34 (1H, шир.с), 8,44 (1H, д, J=8,6 Гц), 12,26 (1H, шир.с).

MS (ESI) m/z: 1062 (M+H)⁺.

[0221]

Стадия 5: Конъюгат антитело-лекарственное средство (5)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 4, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентрация антитела: 1,36 мг/мл, выход антитела: 8,16 мг (82%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=7620, E_D.370=23700): 5,0.

[0222]

Пример 6 Конъюгат антитело-лекарственное средство (6)

[Химическая формула 37]

[0223]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (6)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 4 Примера 5, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентрация антитела: 11,5 мг/мл, выход антитела: 224,2 мг (90%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=7620, E_D.370=23700): 4,6.

[0224]

Пример 7 Конъюгат антитело-лекарственное средство (7)

[Химическая формула 38]

[0225]

Стадия 1: трет-Бутил (3S,12S)-12-бензил-21-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-3-{[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}-4,7,10,13,16,21-гексаоксо-5,8,11,14,17-пентаазагеникозан-1-оат

(2S)-4-трет-Бутокси-2-{[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}-4-оксобутановую кислот (0,625 г, 1,52 ммоль) растворяли в дихлорметане (10,0 мл), загружали N-гидроксисукцинимид (0,175 г, 1,52 mol) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (0,291 г, 1,52 ммоль) и перемешивали в течение 1 часа. Реакционный раствор добавляли по каплям к раствору N,N-диметилформамида (10,0 мл), содержащего соединение (1,00 г, 1,01 ммоль), полученное на описанной выше Стадии 4 Примера 1, и перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=8:2 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,873 г, 70%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,88 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,37 (9H, с), 1,68-1,78 (2H, м), 1,81-1,93 (2H, м), 2,10-2,23 (4H, м), 2,41 (3H, с), 2,68-2,85 (3H, м), 2,99-3,22 (5H, м), 3,58-3,81 (6H, м), 4,19-4,36 (3H, м), 4,38-4,52 (2H, м), 5,17 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,25 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,43 (2H, с), 5,54-5,62 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,15-7,34 (8H, м), 7,41 (2H, т, J=7,2 Гц), 7,66-7,75 (4H, м), 7,81 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,88 (2H, д, J=7,4 Гц), 8,01-8,06 (1H, м), 8,14 (1H, д, J=8,2 Гц), 8,17-8,22 (1H, м), 8,25-8,30 (1H, м), 8,47 (1H, д, J=8,6 Гц).

MS (APCI) m/z: 1232 (M+H)⁺.

[0226]

Стадия 2: трет-Бутил (3S,12S)-12-бензил-3-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-21-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4,7,10,13,16,21-гексаоксо-5,8,11,14,17-пентаазагеникозан-1-оат

Соединение (0,800 г, 0,649 ммоль), полученное на описанной выше Стадии 1, растворяли в N,N-диметилформамиде (3,00 мл), загружали пиперидин (0,643 мл, 6,49 ммоль) и перемешивали в течение 1 часа. Растворитель удаляли досуха при пониженном давлении и полученные остатки растворяли в N,N-диметилформамиде (10 мл). После добавления N-сукцинимидил 6-малеимид гексаноата (0,300 г, 0,974 ммоль) смесь перемешивали в течение 20 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=8:2 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,224 г, 29%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,87 (3H, т, J=7,6 Гц), 1,15-1,22 (2H, м), 1,35 (9H, с), 1,44-1,47 (4H, м), 1,71-1,73 (2H, м), 1,80-1,91 (2H, м), 2,08 (2H, т, J=7,6 Гц), 2,13-2,20 (4H, м), 2,40 (3H, с), 2,67 (1H, дт, J=11,1, 4,8 Гц), 2,78 (1H, дд, J=13,6, 9,4 Гц), 2,99-3,17 (6H, м), 3,31-3,36 (2H, м), 3,57-3,76 (6H, м), 4,45-4,47 (1H, м), 4,57-4,60 (1H, м), 5,16 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,42 (2H, с), 5,55-5,60 (1H, м), 6,53 (1H, с), 6,99 (2H, с), 7,15-7,27 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,70 (1H, т, J=5,4 Гц), 7,80 (1H, д, J=10,9 Гц), 7,99 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,09-8,12 (3H, м), 8,25 (1H, т, J=6,0 Гц), 8,45 (1H, д, J=9,1 Гц).

MS (APCI) m/z: 1203 (M+H)⁺.

[0227]

Стадия 3: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-альфа-аспартилглицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамид

Осуществляли взаимодействие соединения (0,224 г, 0,186 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 2, таким же способом, как Стадия 2 Примера 1, с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (21,2 мг, 10%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,87 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,13-1,21 (2H, м), 1,42-1,45 (6H, м), 1,70-1,72 (2H, м), 1,85-1,88 (2H, м), 2,06-2,20 (6H, м), 2,39 (3H, с), 2,63-2,67 (1H, м), 2,78-2,81 (1H, м), 3,04-3,12 (6H, м), 3,63-3,70 (6H, м), 4,46-4,52 (2H, м), 5,16 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, с), 5,55-5,58 (1H, м), 6,53 (1H, с), 6,99 (2H, с), 7,18-7,23 (6H, м), 7,30 (1H, с), 7,71 (1H, т, J=5,5 Гц), 7,79 (1H, д, J=10,9 Гц), 7,99-8,02 (1H, м), 8,10-8,11 (3H, м), 8,27-8,30 (1H, м), 8,47-8,50 (1H, м).

MS (APCI) m/z: 1147 (M+H)⁺.

[0228]

Стадия 4: Конъюгат антитело-лекарственное средство (7)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 3, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентрация антитела: 1,39 мг/мл, выход антитела: 8,34 мг (83%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=7670, E_D.370=24800): 4,7.

[0229]

Пример 8 Конъюгат антитело-лекарственное средство (8)

[Химическая формула 39]

[0230]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (8)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 3 Примера 7, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентрация антитела: 11,2 мг/мл, выход антитела: 228,5 мг (91%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=7670, E_D.370=24800): 4,7.

[0231]

Пример 9 Конъюгат антитело-лекарственное средство (9)

[0232]

[Химическая формула 40]

[0233]

Стадия 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]пропаноил}глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамид

Осуществляли взаимодействие соединения (100 мг, 0,119 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 4 Примера 1, таким же способом, как Стадия 5 Примера 1, с использованием N-сукцинимидил 3-(2-(2-(3-малеинимидпропанамид)этокси)этокси)пропаноата (50,7 мг, 0,119 ммоль) вместо N-сукцинимидил 6-малеимид гексаноата, с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (66,5 мг, 48%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,85 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,65-1,74 (2H, м), 1,77-1,90 (2H, м), 2,07-2,19 (4H, м), 2,30 (2H, т, J=7,2 Гц), 2,33-2,36 (2H, м), 2,38 (3H, с), 2,76 (1H, дд, J=13,7, 9,8 Гц), 2,96-3,18 (9H, м), 3,42-3,44 (4H, м), 3,53-3,76 (10H, м), 4,43 (1H, тд, J=8,6, 4,7 Гц), 5,14 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,23 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,38 (1H, д, J=17,2 Гц), 5,42 (1H, д, J=17,2 Гц), 5,52-5,58 (1H, м), 6,52 (1H, с), 6,98 (2H, с), 7,12-7,17 (1H, м), 7,18-7,25 (4H, м), 7,29 (1H, с), 7,69 (1H, т, J=5,5 Гц), 7,78 (1H, д, J=11,3 Гц), 7,98-8,03 (2H, м), 8,11 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,16 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,23 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,44 (1H, д, J=9,0 Гц).

MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)⁺.

[0234]

Стадия 2: Конъюгат антитело-лекарственное средство (9)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 1, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентрация антитела: 2,08 мг/мл, выход антитела: 18,7 мг (94%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=4964, E_D.370=18982): 5,6.

[0235]

Пример 10 Конъюгат антитело-лекарственное средство (10)

[Химическая формула 41]

[0236]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (10)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 1 Примера 9, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентрация антитела: 19,7 мг/мл, выход антитела: 236,4 мг (95%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=4964, E_D.370=18982): 6,2; и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры F (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=4964): 6,4.

[0237]

Пример 11 Конъюгат антитело-лекарственное средство (11)

[0238]

[Химическая формула 42]

[0239]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (11)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 1 Примера 9, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 1 Примера 4.

Концентрация антитела: 0,88 мг/мл, выход антитела: 5,28 мг (53%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=4964, E_D.370=18982): 3,0; и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры F (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=4964): 3,3.

[0240]

Пример 12 Конъюгат антитело-лекарственное средство (12)

[Химическая формула 43]

[0241]

Стадия 1: ({N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицил}амино)метил ацетат

К смеси, содержащей N-9-флуоренилметоксикарбонилглицилглицин (4,33 г, 12,2 ммоль), тетрагидрофуран (120 мл) и толуол (40,0 мл), добавляли пиридин (1,16 мл, 14,7 ммоль) и тетраацетат свинца (6,84 г, 14,7 ммоль) и нагревали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 5 часов. После охлаждения реакционного раствора до комнатной температуры, нерастворимое вещество удаляли фильтрованием через Целит и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученные остатки растворяли в этилацетате, промывали водой и насыщенным солевым раствором и затем органический слой сушили над безводным сульфатом магния. После удаления растворителя при пониженном давлении полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [гексанe:этилацетат=9:1 (об/об) - этилацетат] с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (3,00 г, 67%).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) дельта: 2,07 (3H, с), 3,90 (2H, д, J=5,1 Гц), 4,23 (1H, т, J=7,0 Гц), 4,46 (2H, д, J=6,6 Гц), 5,26 (2H, д, J=7,0 Гц), 5,32 (1H, шир.с), 6,96 (1H, шир.с), 7,32 (2H, т, J=7,3 Гц), 7,41 (2H, т, J=7,3 Гц), 7,59 (2H, д, J=7,3 Гц), 7,77 (2H, д, J=7,3 Гц).

[0242]

Стадия 2: Бензил [({N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицил}амино)метокси]ацетат

К раствору в тетрагидрофуране (40,0 мл) соединения (3,68 г, 10,0 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 1, и бензилгликолята (4,99 г, 30,0 ммоль) добавляли трет-бутоксид калия (2,24 г, 20,0 ммоль) при°C и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. В реакционный раствор загружали этилацетат и воду при°C и экстрагировали этилацетатом и хлороформом. Полученный органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученные остатки растворяли в диоксане (40,0 мл) и воде (10,0 мл), загружали гидрокарбонат натрия (1,01 г, 12,0 ммоль) и 9-флуоренилметилхлороформиат (2,59 г, 10,0 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. В реакционный раствор загружали воду и экстрагировали этилацетатом. Полученный органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [гексан:этилацетат=100:0 (об/об) - 0:100] с получением указанного в заголовке соединения в бесцветного маслянистого вещества (1,88 г, 40%).

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) дельта: 3,84 (2H, д, J=5,5 Гц), 4,24 (3H, т, J=6,5 Гц), 4,49 (2H, д, J=6,7 Гц), 4,88 (2H, д, J=6,7 Гц), 5,15-5,27 (1H, м), 5,19 (2H, с), 6,74 (1H, шир.с), 7,31-7,39 (7H, м), 7,43 (2H, т, J=7,4 Гц), 7,61 (2H, д, J=7,4 Гц), 7,79 (2H, д, J=7,4 Гц).

[0243]

Стадия 3: [({N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицил}амино)метокси]уксусная кислота

Соединение (1,88 г, 3,96 ммоль), полученное на описанной выше Стадии 2, растворяли в этаноле (40,0 мл) и этилацетате (20,0 мл). После добавления катализатора палладия на углероде (376 мг) смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода в течение 2 часов. Нерастворимое вещество удаляли фильтрованием через Целит и растворитель фильтрата was удаляли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (1,52 г, количественный выход).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 3,62 (2H, д, J=6,3 Гц), 3,97 (2H, с), 4,18-4,32 (3H, м), 4,60 (2H, д, J=6,7 Гц), 7,29-7,46 (4H, м), 7,58 (1H, т, J=5,9 Гц), 7,72 (2H, д, J=7,4 Гц), 7,90 (2H, д, J=7,4 Гц), 8,71 (1H, т, J=6,5 Гц).

[0244]

Стадия 4: 9H-Флуорен-9-илметил(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]амино}-2-оксоэтил)карбамат

При охлаждении льдом, к раствору в N,N-диметилформамиде (10,0 мл) экзатеканмезилата (0,283 г, 0,533 ммоль), N-гидроксисукцинимида (61,4 мг, 0,533 ммоль) и соединения (0,205 г, 0,533 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 3, добавляли N,N-диизопропилэтиламин (92,9 мкл, 0,533 ммоль) и N,N'-дициклогексилкарбодиимид (0,143 г, 0,693 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - отделенный органический слой хлороформ:метанол:вода=7:3:1 (об/об/об)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-коричневого твердого вещества (0,352 г, 82%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,81 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,73-1,87 (2H, м), 2,06-2,20 (2H, м), 2,34 (3H, с), 3,01-3,23 (2H, м), 3,58 (2H, д, J=6,7 Гц), 3,98 (2H, с), 4,13-4,25 (3H, м), 4,60 (2H, д, J=6,7 Гц), 5,09-5,22 (2H, м), 5,32-5,42 (2H, м), 5,50-5,59 (1H, м), 6,49 (1H, с), 7,24-7,30 (3H, м), 7,36 (2H, т, J=7,4 Гц), 7,53 (1H, т, J=6,3 Гц), 7,66 (2H, д, J=7,4 Гц), 7,75 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,84 (2H, д, J=7,4 Гц), 8,47 (1H, д, J=8,6 Гц), 8,77 (1H, т, J=6,7 Гц).

MS (ESI) m/z: 802 (M+H)⁺.

[0245]

Стадия 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамид

К раствору соединения (0,881 г, 1,10 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 4, в N,N-диметилформамиде (11,0 мл) добавляли пиперидин (1,1 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением смеси, содержащей указанное в заголовке соединение. Смес использовали для следующей реакции без дополнительной очистки.

[0246]

Стадия 6: N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамид

При охлаждении льдом, к раствору в N,N-диметилформамиде (50,0 мл) смеси (0,439 ммоль), полученной на описанной выше Стадии 5, N-гидроксисукцинимида (0,101 г, 0,878 ммоль) и N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицилглицил-L-фенилаланина (соединение, описанное в выложенном патенте Японии №2002-60351; 0,440 г, 0,878 ммоль) добавляли N,N'-дициклогексилкарбодиимид (0,181 г, 0,878 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 дней. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=9:1 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-оранжевого твердого вещества (0,269 г, 58%).

MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)⁺.

[0247]

Стадия 7: Глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамид

К раствору соединения (0,269 г, 0,253 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 6, в N,N-диметилформамиде (4,00 мл) добавляли пиперидин (0,251 мл, 2,53 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением смеси, содержащей указанное в заголовке соединение. Смесь использовали для следующей реакции без дополнительной очистки.

[0248]

Стадия 8: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамид

К раствору соединения (0,253 ммоль), полученного на описанной выше Стадии 7, в N,N-диметилформамиде (10,0 мл) добавляли N-сукцинимидил 6-малеимид гексаноат (0,156 г, 0,506 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ - хлороформ:метанол=9:1 (об/об)] с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,100 г, 38%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) дельта: 0,83 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,09-1,21 (2H, м), 1,33-1,47 (4H, м), 1,75-1,90 (2H, м), 2,00-2,23 (4H, м), 2,36 (3H, с), 2,69-2,81 (1H, м), 2,94-3,03 (1H, м), 3,06-3,22 (2H, м), 3,23-3,74 (6H, м), 3,98 (2H, с), 4,39-4,50 (1H, м), 4,60 (2H, д, J=6,7 Гц), 5,17 (2H, с), 5,39 (2H, с), 5,53-5,61 (1H, м), 6,50 (1H, с), 6,96 (2H, с), 7,11-7,24 (5H, м), 7,28 (1H, с), 7,75 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,97 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,03 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,09 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,27 (1H, т, J=6,5 Гц), 8,48 (1H, д, J=9,0 Гц), 8,60 (1H, т, J=6,5 Гц).

MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)⁺.

[0249]

Стадия 9: Конъюгат антитело-лекарственное средство (12)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 8, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентрация антитела: 2,11 мг/мл, выход антитела: 19,0 мг (95%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178, E_D.370=20217): 4,9.

[0250]

Пример 13 Конъюгат антитело-лекарственное средство (13)

[Химическая формула 44]

[0251]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (13)

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 8 Примера 12, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как Стадия 6 Примера 1.

Концентрация антитела: 22,2 мг/мл, выход антитела: 244,2 мг (98%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178, E_D.370=20217): 6,2; и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры F (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178): 7,0.

[0252]

Пример 14 Конъюгат антитело-лекарственное средство (14)

[Химическая формула 45]

[0253]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (14)

Восстановление антитела: U1-59, полученный в Ссылочном примере 1, получали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6,0/EDTA с использованием Общей процедуры B и Общей процедуры C, описанных в Способе получения 1. Раствор (1,00 мл) добавляли в 2,0-мл полипропиленовую пробирку и загружали водный раствор 10 мМ TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0160 мл; 2,4 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) и 1 M водный раствор дикалий гидрофосфата (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0150 мл). После подтверждения, что раствор имеет pH of 7,0 +/- 0,1, дисульфидную связь в шарнирной части в антителе восстанавливали путем инкубации при 37C в течение 1 часа.

Конъюгация между антителом и компонентом лекарственное средство-линкер: После инкубации раствора на водяной бане при 15C в течение 10 минут добавляли диметилсульфоксид (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,0209 мл) и диметилсульфоксидный раствор (0,0315 мл; 5,0 эквивалентов в расчете на молекулу антитела), содержащий 10 мМ соединения, полученного на описанной выше Стадии 8 Примера 12, и инкубировали на водяной бане при 15C в течение 60 минут для конъюгирования компонента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0050 мл) 100 мМ NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) и перемешивали с использованием трубчатого ротатора (MTR-103, изготовитель AS ONE Corporation) при комнатной температуре еще в течение 20 минут для прекращения реакции лекарственного средства-линкера.

В соответствии с такими же процедурами очистки и физико-химической характеризацией, нак на Стадии 6 Примера 1, были получены следующие характеристические значения.

Концентрация антитела: 1,46 мг/мл, выход антитела: 8,76 мг (88%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178, E_D.370=20217): 2,5; и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры F (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178): 2,9.

[0254]

Пример 15 Конъюгат антитело-лекарственное средство (15)

[Химическая формула 46]

[0255]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (15)

Восстановление антитела: U1-59, полученный в Ссылочном примере 1, получали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6,0/EDTA с использованием Общей процедуры B и Общей процедуры C, описанных в Способе получения 1. Раствор (100 мл) добавляли в 250-мл поликарбонатную колбу Эрленмейера и загружали 1 M водный раствор дикалий гидрофосфата (1,70 мл) и затем водный раствор 10 мМ TCEP (4,010 мл; 6,0 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) при комнатной температуре при перемешивании с использованием магнитной мешалки. После подтверждения, что раствор имеет pH 7,0 +/- 0,1, перемешивание прекращали и дисульфидную связь в шарнирной части в антителе восстанавливали путем инкубации при 37C в течение 1 часа.

Конъюгация между антителом и компонентом лекарственное средство-линкер: После охлаждения этого раствора до 15C к нему постепенно добавляли DMSO раствор (6,684 мл; 10,0 эквивалентов в расчете на молекулу антитела), содержащий 10 мМ соединения, полученного на описанной выше Стадии 8 Примера 12, при перемешивании. Смесь перемешивали при 15C в течение первых 30 минут, затем перемешивание останавливали и инкубировали еще в течение 1 часа для конъюгирования компонента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,862 мл; 12,9 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) 100 мМ NAC при перемешивании и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут для остановки реакции непрореагировавшего лекарственного средства-линкера.

Очистка: 20% водный раствор уксусной кислоты (около 0,6 мл) и ABS (100 мл) постепенно добавляли к раствору при перемешивании для доведения pH раствора до 5,5 +/- 0,1. Этот раствор подвергали микрофильтрации (Millipore Corp. Millex-HV фильтр, 0,45 мкм, PVDF мембрана) для удаления беловатого вещества. Этот раствор подвергали ультрафильтрационной очистке с использованием ультрафильтрационного устройства, состоящего из ультрафильтрационной мембраны (Merck Japan, Ltd., Pellicon XL Cassette, Biomax 50 кДа), шлангового насоса (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex насос модель 77521-40, насосная головка модель 7518-00) и шланга (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex шланг L/S16). Например, путем добавления ABS по каплям (общее количество 1600 мл) в виде буферного раствора для очистки к реакционному раствору в процессе осуществления ультрафильтрационной очистки, неконъюгированные лекарственное средство-линкеры и другие низкомолекулярные реагенты удаляли в то время как буферный раствор заменяли на ABS и затем раствор концентрировали. Полученный очищенный раствор подвергали микрофильтрации (0,22 мкм (Millipore Corp. Millex-GV фильтр, PVDF мембрана) с получением 37,5 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство.

Концентрация антитела: 26,5 мг/мл, выход антитела: 993,0 мг (90%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178 и E_D.370=20217): 6,3, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры F (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178): 7,3.

[0256]

Пример 16a Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a)

[Химическая формула 47]

[0257]

Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a)

Восстановление антитела: U1-59, полученный в Ссылочном примере 1, получали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6,0/EDTA с использованием Общей процедуры B и Общей процедуры C, описанных в Способе получения 1. Раствор (15 мл) добавляли в 50-мл контейнер из полиэтилентерефталата и загружали 1 M водный раствор дикалий гидрофосфата (0,255 мл) и затем водный раствор 10 мМ TCEP (0,601 мл; 6,0 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) при комнатной температуре при перемешивании с использованием магнитной мешалки. После подтверждения, что раствор имеет pH 7,0 +/- 0,1, дисульфидную связь в шарнирной части в антителе восстанавливали путем инкубации при 37C в течение 2 часов.

Конъюгация между антителом и компонентом лекарственное средство-линкер: После охлаждения этого раствора до 15C постепенно добавляли при перемешивании DMSO раствор (1,002 мл; 10,0 эквивалентов в расчете на молекулу антитела), содержащий 10 мМ соединения, полученного на описанной выше Стадии 8 Примера 12. Смесь перемешивали при 15C в течение 30 минут для конъюгирования компонента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к смеси добавляли водный раствор (0,129 мл; 12,9 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) 100 мМ NAC при перемешивании и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут для остановки реакции непрореагировавшего лекарственного средства-линкера. В соответствии с такими же процедурами очистки иметодами физико-химической характеризаци, которые описаны для Стадии 6 Примера 1, были получены следующие характеристические значения.

Концентрация антитела: 2,36 мг/мл, выход антитела: 140 мг (59,5 мл) (94%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178 и E_D.370=20217): 6,4, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры F (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178): 7,7.

[0258]

Пример 16b Конъюгат антитело-лекарственное средство (16b)

[Химическая формула 48]

[0259]

Восстановление антитела: U1-59, полученный в Ссылочном примере 1, получали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6,0/EDTA с использованием Общей процедуры B и Общей процедуры C, описанных в Способе получения 1. Раствор (900 мл) добавляли в 2000-мл поликарбонатную колбу Эрленмейера и загружали 1 M водный раствор дикалий гидрофосфата (15,3 мл) и затем водный раствор 10 мМ TCEP (36,1 мл; 6,0 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) при комнатной температуре при перемешивании с использованием магнитной мешалки. После подтверждения, что раствор имеет pH 7,0 +/- 0,1, перемешивание прекращали и дисульфидную связь в шарнирной части в антителе восстанавливали путем инкубации при 37C в течение 2 часов.

Конъюгация между антителом и компонентом лекарственное средство-линкер: После охлаждения этого раствора до 15C постепенно добавляли при перемешивании DMSO раствор (60,16 мл; 10,0 эквивалентов в расчете на молекулу антитела), содержащий 10 мМ соединения, полученноно на Стадии 8 Примера 12. Смесь перемешивали при 15C в течение 30 минут для конъюгирования компонента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к смеси добавляли при перемешивании водный раствор (7,76 мл; 12,9 эквивалентов в расчете на молекулу антитела) 100 мМ NAC и инкубировалипри комнатной температуре в течение 20 минут для остановки реакции непрореагировавшего лекарственного средства-линкера.

Очистка: 20% водный раствор уксусной кислоты (около 5 мл) и ABS (1000 мл) постепенно добавляли к раствору при перемешивании для доведения pH раствора до 5,5 +/- 0,1. Этот раствор подвергали микрофильтрации (Millipore Corp. Stericup, 0,45 мкм, PVDF мембрана) для удаления беловатого вещества. Этот раствор подвергали ультрафильтрационной очистке с использованием ультрафильтрационного устройства, состоящего из ультрафильтрационной мембраны (Merck Japan, Ltd., Pellicon 2 миникассета, Ultracel 30 КДа, 0,1 м²), шлангового насоса (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex насос модель 7528-20, насосная головка модель 77800-62) и шланга (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex шланги L/S24 и 25). Например, путем добавления ABS по каплям (общее количество 16 л) в качестве буферного раствора для очистки к реакционному раствору в процессе осуществления ультрафильтрационной очистки, неконъюгированные компоненты лекарственное средство-линкеры и другие низкомолекулярные реагенты удаляли в процессе замены буферного раствора на ABS и затем раствор концентрировали с получением около 500 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство.

Концентрация антитела: 19,66 мг/мл, выход антитела: 9830 мг (109%), и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178 и E_D.370=20217): 6,5.

[0260]

Пример 16c Конъюгат антитело-лекарственное средство (16c)

[Химическая формула 49]

[0261]

С использованием U1-59, полученного в Ссылочном примере 1, и соединения, полученного на описанной выше Стадии 8 Примера 12, указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство получали таким же способом, как в Примере 16b.

Концентрация антитела: 16,21 мг/мл, выход антитела: 9726 мг (600 мл, 108%), и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178 и E_D.370=20217): 6,5.

[0262]

Пример 16d Конъюгат антитело-лекарственное средство (16d)

[Химическая формула 50]

[0263]

Конъюгаты антитело-лекарственное средство (16a), (16b) и (16c), полученные в Примерах 16a, 16b и 16c, соответственно, смешивали (общее количество около 18 г) и затем подвергали ультрафильтрации таким же способом, как в Примере 16b (использовали 11 л ABS). Полученный очищенный раствор подвергали микрофильтрации (Millipore Corp. Stericup, 0,45 мкм и 0,22 мкм, PVDF мембрана) с получением 745 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство. Затем добавляли 110 мл ABS с получением 855 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство.

Концентрация антитела: 20,0 мг/мл, выход антитела: 17,1 г (94%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры E (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178 и E_D.370=20217): 6,5, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) в расчете на молекулу антитела, измеренное с использованием Общей процедуры F (в качестве молярного коэффициента поглощения лекарственного средства-линкера использовали E_D.280=5178): 7,8.

[0264]

Пример испытания 1 Аффинность связывания с HER3 конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с U1-59

Метод:

Человеческую клеточную линию рака молочной железы HCC1569 (CRL-2330) из ATCC культивировали в RPMI1640 среде (закупленной у Invitrogen Corp., содержащей 10% бычий сывороточный альбумин (изготовитель Invitrogen Corp.) и 2 мМ L-глутамина (изготовитель Invitrogen Corp.)). Клетки отделяли от культурального планшета с использованием ACCUTASE(R) РАСТВОРА (Millipore Corp., SCR005) или EDTA (5 мМ, фосфатно-буферный солевой раствор (PBS, 137 мМ хлорида натрия, 2,7 мМ хлорида калия, 1,47 мМ дигидрофосфата калия и 10,5 мМ динатрий гидрофосфата)) и количество живых клеток измеряли путем обработки трипановым синим. Такое же количество клеток, суспендированных в флуоресцентно-активированном буфере (PBS, содержащий 3% FBS и 0,004% азида натрия) для клеточного сортинга (FACS) использовали для инокуляции 96-луночных U-донных планшетов и клетки осаждали путем центрифугирования и суспендировали в 100 мкл охлажденного льдом разведения антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство или FACS буфера.

Осуществляли серийные разведения антитела или каждого конъюгата антитело-лекарственное средство при отношении 1/3 с использованием FACS буфера и доводили до 30 мкг/мл - 5 нг/мл (200 нМ - 0,03 нМ). Клетки, обработанные FACS буфером без добавления первичного антитела, использовали в качестве контрольной группы.

U1-59, конъюгат антитело-лекарственное средство (3), конъюгат антитело-лекарственное средство (10) или конъюгат антитело-лекарственное средство (13) оценивали в качестве антитела или конъюгатов антитело-лекарственное средств.

Клетки из каждой группы подвергали взаимодействию с разведеним первичного антитела в течение 45 минут на льду и затем промывали с использованием FACS буфера. Затем к смеси добавляли 100 мкл FACS буфера или реакционного раствора вторичного антитела, разведенного 1/100 (фикоэритрин (PE)-связанное античеловеческое антитело, Dianova GmbH #709-116-149). Клетки обрабатывали в течение 45 минут на льду в темноте и затем промывали с использованием FACS буфера и мертвые клетки исключали с использованием FACS буфера или FACS буфера, дополненного 7-аминоактиномицином D (7AAD, Sigma-Aldrich Co. LLC, #A9400, 1,1 мкг/мл).

Сигналы флуоресценции от живых клеток оценивали с использованием Accuri C6 проточного цитометра (BD Biosciences/Accuri(R) Cytometers Inc., серийный номер 1424) и CFlow программы (CFlow sampler Version 1.0.264.13).

Для коррекции PE- и 7-AAD-производимых сигналов, оценивали сигналы флуоресценции U1-59 (30 мкг/мл) и клеток, меченных PE-меченным вторичным антителом или 7-AAD.

Для количественного определения U1-59-специфических сигналов флуоресценции в клетках, использовали значения, полученные путем вычитания FL-2 сигналов клеток, обработанных только вторичным антителом или 7-AAD. Равновесие аффинности связывания (KD) и максимальной силы связывания (Bmax) рассчитывали с использованием GraphPad Prism программы (version 5.04 для Windows(R) (один-сайт-специфическое связывание)).

[0265]

Результаты показаны на Фиг. 3 и в Таблице 1. Фиг. 3 и Таблица 1 показывают среднюю интенсивность флуоресценции HCC1569, обработанных серийными разведениями U1-59 или каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Равновесие аффинности связывания KD и максимальной силы связывания Bmax рассчитывали с использованием GraphPad Prism программы.

[0266]

Таблица 1 U1-59 Конъюгат
Антитело-
лекарственное
средство (3) Конъюгат
Антитело-
лекарственное
средство (10) Конъюгат
Антитело-
лекарственное
средство (13) B_max 31830 28981 28841 28415 Kd (нМ) 1,672 1,653 1,554 2,757

[0267]

Конъюгат антитело-лекарственное средство (3) или конъюгат антитело-лекарственное средство (10) продемонстрировали среднюю аффинность связывания KD для HCC-1569, эквивалентную KD неконъюгированного анти-HER3 антитела U1-59. Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) также продемонстрировал среднюю аффинность связывания KD, эквивалентную KD неконъюгированного анти-HER3 антитела U1-59 (2,7 нМ против 1,6 нМ). KD значения разных конъюгатов антитело-лекарственное средство говорят о том, что процессы конъюгации антитело-лекарственное средство не ухудшают каким-либо значимым образом аффинность связывания U1-59.

[0268]

Пример испытания 2 Ингибирование HER3 сигнала конъюгатом анти-HER3 антитело-лекарственное средство

Метод:

Человеческую клеточную линию рака легкого A549 (CRS-300114) от Cell Lines Service разъединяли путем обработки трипсином и 50000 живых клеток инокулировали в 3 мл DMEM/F12 (Invitrogen Corp., #21331-020)+10% FBS (Invitrogen Corp., #10270-106) в каждой из 6 лунок. После культивирования клеток в течение 3 дней, среду заменяли 2 мл свежей среды.

Антитело или каждый конъюгат антитело-лекарственное средство добавляли непосредствено к 2 мл среды в каждой из 6 лунок так, чтобы конечная концентрация была 10 мкг/мл (добавляли 20 мкл исходного раствора 1 мкг/мкл антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство).

U1-59, конъюгат антитело-лекарственное средство (3), конъюгат антитело-лекарственное средство (10) или конъюгат антитело-лекарственное средство (13) использовали в качестве антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство. Необработанную группу использовали в качестве контроля.

Клетки культивировали в течение 2 дней, промывали один раз при помощи PBS и обрабатывали при помощи 100 мкл охлажденного льдом буфера (50 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), pH 7,5, 150 мМ хлорида натрия, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 12,5% глицерина, 1% Triton X-100 и 10 мМ пирофосфата натрия тетраосновного, дополненного ингибиторами протеиназы (Roche Diagnostics, Inc., #11697 498 001), 10 мМ фторида натрия, 1 мМ ванадата натрия, 1 мМ фенил-метан-сульфонил-фторида (PMSF) и 10 мкг/мл апротинина (Sigma-Aldrich Co. LLC, A1153)) в течение 30 минут при 4C для лизиса. Лизат промывали в течение 20 минут при 13000 об/мин при 4C и супернатант использовали в измерени концентрации белка при помощи анализа Брэдфорда (Sigma-Aldrich Co. LLC, #B6916, BSA стандарт от Thermo Fisher Scientific Inc., #23209). К каждому образцу (количество белков: 120 мкг) добавляли 4-кратную концентрацию LDS буфера (Invitrogen Corp., содержащий DTT (конечная концентрация: 166,67 мМ)) и его объем окончательно доводили до 40 мкл при помощи воды. Образец кипятили в течение 10 минут при 7°C и добавляли в лунки с NuPage Mini Бис-Трис гелем (4%-12%, 1,5 мм толщина, 10 слот/гель, Invitrogen Corp.). В качестве белковых стандартов добавляли 7,5 мкл Novex(R) sharp ladder (Invitrogen Corp., P/N 57318). Образец подвергали электрофорезу в течение 70 минут при 175 В с 1 x MOPS Подвижного буфера (Invitrogen Corp.), содержащего NuPage антиоксидант (Invitrogen Corp., NP0005, Lot 1356629, добавляемый во внутренний объем. Белки, разделенные гель-электрофорезом, переносили на нитроцеллюлозную мембрану (GE Healthcare Life Sciences), имеющую размер пор 0,45 мкм, с использованием NuPage буфера для переноса (Invitrogen Corp.), содержащего 10% метанола и NuPage антиоксидант (Invitrogen Corp., NP0005, Lot 1356629, 1:1000 разведение). Белки переносили в течение 80 минут при постоянном объеме 30 V.

Блоттинг-мембрану разрезали, разделяли на фракции 100 кДа или больше и 30-100 кДа, промывали два раза PBS, содержащим 0,1% Tween-20, и блокировали путем встряхивания в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием блокирующего раствора Odyssey (LI-COR, Inc., #927-40000). Блоттинг-мембрану, блокированную таким образом, обрабатывали в течение ночи при 4C раствором разбавленного первичного антитела (смесь Odyssey блокирующего раствора и PBS в равных количествах).

Анти-HER3 антитело (Santa Cruz Biotechnology, Inc., SC-81455, разведение 1:500) и анти-фосфорилированного HER антитела (Cell Signaling Technology, Inc., #4791, 1:1000) использовали в качестве первичного антитела, и анти-актиновое антитело (Neomarkers, #MS1295, разведение 1:3333) использовали в качестве контроля для электрофореза.

Блоттинг-мембрану промывали три раза (каждый раз по 5 минут) PBS, содержащим 0,1% Tween-20, и подвергали взаимодействию с разведением, содержащим вторичное антитело (смесь Odyssey блокирующего раствора и PBS в равных количествах) в течение 1 часа при комнатной температуре в темном помещении.

Козлиное анти-мышиное IRDye 680RD (LI-COR, Inc., #926-68070, разведение 1:25000) или козлиное анти-кроличье IR Dye 800CW (LI-COR, Inc., #926-32211, разведение 1:10000) использовали в качестве вторичного антитела. Блоттинг-мембрану промывали три раза (каждый раз по 6 минут) PBS, содержащим 0,1% Tween-20, с последующей детекцией сигнала с использованием Odyssey формирователя ИК-видеосигналов (LI-COR, Inc.).

[0269]

Результаты показаны на Фиг. 4. A549 клетки культивировали в течение 2 дней с U1-59 или разными конъюгатами антитело-лекарственное средство. HER3 или фосфорилированный HER3 анализировали методом вестерн-блоттинга. пан-Актин определяли в качестве контроля для электрофореза.

[0270]

Как результат культивирования A549 в течение 2 дней с 10 мкг/мл U1-59 или конъюгатом антитело-лекарственное средство, HER3 фосфорилирование уменьшалось по сравнению с необработанными клетками. Это уменьшение HER3 фосфорилирования было эквивалентым для U1-59 и конъюгата антитело-лекарственное средство, и это говорит о том, что множество процессов конъюгации лекарственного средства не нарушали функцию ингибирования HER3 сигнала, осуществляемую U1-59.

Когда A549 обрабатывали U1-59 или каждым конъюгатом антитело-лекарственное средство в течение 2 дней, также наблюдали уменьшение HER3 экспрессии по сравнению с необработанными клетками. Степень такого уменьшения экспрессии была эквивалента для U1-59 и конъюгата антитело-лекарственное средство. Это говорит о том, что множество процессов конъюгации лекарственного средства не нарушали U1-59-опосредованную интернализацию (см. Пример испытания, касающийся интернализации) и U1-59-индуцированную даун-регуляцию HER (см. Пример испытания, касающийся ингибирования сигнала).

[0271]

Пример испытания 3 Уменьшение экспрессии HER3 на клеточной поверхности при помощи U1-59 и конъюгата антитело-лекарственное средство

Метод:

HER3 интернализацию посредством U1-59 и каждого конъюгата антитело-лекарственное средство оценивали методом проточной цитометрии. 70000 живых клеток HCC1569 (из ATCC) суспендировали в 0,5 мл RPMI1640 (Invitrogen Corp., #31870-025) (содержащей 10% FBS (Invitrogen Corp., #10270-106 или PAN Biotech GmbH, #1505-P131304) и 2 мМ глутамина (Invitrogen Corp., #25030-024)) и инокулировали в каждую лунку 24-луночного планшета. Клетки культивировали в течение 4 дней и среду заменяли на 0,5 мл свежей среды до начала испытания интернализации. 5 мкг антитела или каждого конъюгата антитело-лекарственное средство добавляли к 0,5 мл в каждой лунке 24-луночного планшета так, чтобы конечная концентрация была 10 мкг/мл. Клетки культивировали в течение 1 часа при 37C в присутствии антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство. U1-59, конъюгат антитело-лекарственное средство (3), конъюгат антитело-лекарственное средство (10) или конъюгат антитело-лекарственное средство (13) использовали в качестве антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство. Клеток в качестве положительного контроля или отрицательного контроля были необработанными в некоторых процедурах.

Для анализа методом проточной цитометрии клетки промывали один раз при помощи PBS и отделяли от планшета с использованием 5 мМ EDTA (100 мкл/лунка), растворенного в ACCUTASE(R) РАСТВОРЕ (Millipore Corp., SCR005) или PBS. Клетки суспендировали в 200 мкл охлажденного льдом FACS буфера (PBS, содержащий 3% FBS и 0,004% азида натрия), затем добавляли в каждую лунку 96-луночного U-донного планшета и оставляли на льду. Клетки промывали один раз с использованием FACS буфера. К каждому образцу добавляли 100 мкл U1-59 (10 мкг/мл), разбавленного с использованием FACS буфера, или только FACS буфер. Клетки обрабатывали в течение 45 минут при встряхивании на льду и затем промывали с использованием FACS буфера и в каждую лунку добавляли 100 мкл PE-меченного вторичного антитела анти-человеческого антитела (Dianova GmbH, 709-116-149), растворенного при отношении 1:100 в FACS буфере, или только FACS буфер. Клетки обрабатывали в течение 45 минут в темном помещении при встряхивании на льду. Клетки промывали с использованием FACS буфера и обрабатывали с использованием FACS буфера или FACS буфера, содержащего 7AAD (Sigma-Aldrich Co. LLC, A9400, 1,1 мкг - 1,25 мкг/мл) для окрашивания мертвых клеток. Сигналы флуоресценции от живых клеток измеряли с использованием Accuri C6 проточного цитометра. Для коррекции of PE и 7-AAD сигналов использовали U1-59 (10 мкг/мл) и клетки, окрашенные только PE-меченным вторичным антителом или 7-AAD.

Для количественного определения HER3-специфических сигналов значения, полученные для клеток, окрашенных только вторичным антителом или 7-AAD, вычитали из FL-2 значений для клеток, окрашенных первичным антителои и вторичным антителом и затем 7-AAD.

Когда FL-2 сигналы от клеток, которые не обрабатывали U1-59 или конъюгатом антитело-лекарственное средство (без интернализации), определяли как максимальное значение, рассчитывали уменьшение HER3 (интернализации) на поверхности клеток, обработанных U1-59 или конъюгатом антитело-лекарственное средство при 37C.

Среднее значение, рассчитанное для 2-3 лунок, использовали для положительного контроля (без обработки при 37C) и отрицательного контроля (без добавления первичного антитела), и осуществляли количественное определение интернализации в лунках для каждой группы обработки.

[0272]

Результаты показаны на Фиг. 5. Эта диаграмма показывает среднее значение снижения экспрессии HER3 на поверхности HCC1569 клеток, обработанных U1-59 или каждым конъюгатом антитело-лекарственное средство (37C, 1 час). HER3 экспрессию в группе без добавления U1-59 или конъюгата антитело-лекарственное средство определяли как максимальное значение HER3 экспрессии в клетах. Значения групп обработки только вторичным антителом или 7-AAD использовали как фоновые значения. Группы, обработанные U1-59 или каждым конъюгатом антитело-лекарственное средство в течение 1 часа, использовали в качестве групп обработки. FL-2 значения были почти одинаковыми для U1-59 и конъюгата антитело-лекарственное средство.

[0273]

Уменьшение генерируемой флуоресценции, вызванное обработкой HCC-1569 клеток U1-59 или каждым конъюгатом антитело-лекарственное средство, означает уменьшение экспрессии HER3. По сравнению с примерно 50% уменьшением HER3 экспрессии, вызываемым U1-59, каждым конъюгатом антитело-лекарственное средство было продемонстрировано значение уменьшения HER3 экспрессии такое же или выше, и это говорит о том, что конъюгация лекарственного средства с антителом не ухудшала функцию HER3-интернализации антитела.

[0274]

Пример испытания 4 Ингибирование in vitro митогенного сигнала или сигнала выживания конъюгатом HER3 антитело-лекарственное средство в человеческой раковой клеточной линии

Метод:

Ингибиторную активность каждого конъюгата HER3 антитело-лекарственное средство против митогенных сигналов или сигналов выживания измеряли в присутствии 10% FBS. Рост и развитие клеток оценивали путем измерения активности аденозинтрифосфата (АТФ) в необработанных группах и группах обработки конъюгатом антитело-лекарственное средство. Адгезивные раковые клеточные линии (человеческая клеточная линия рака молочной железы HCC1569 (CRL-2330) из ATCC, человеческая клеточная линия рака молочной железы MDA-MB-453 (CLB-22) из ATCC и человеческая клеточная линия колоректального рака HT-29 (CPQ-57) от ProQinase GmbH) культивировали в 2D культуральных системах и всплывающие (неадгезивные) раковые клеточные линии (человеческая клеточная линия меланомы A375 (CRL-1619) из ATCC и человеческая клеточная линия рака легкого A549 (CRS-300114) от Cell Lines Service) культивировали в 3D культуральных системах.

Обработка адгезивных клеток

Каждую раковую клеточную линию суспендировали в 100 мкл каждой среды при низкой плотности (500 клеток/лунка для HT-29, 800 клеток/лунка для MDA-MB-453 и 1000 клеток/лунка для HCC-1569) и инокулировали в 96-MicroWell Optical Bottom планшет (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, #165306, с белыми стенками и прозрачным дном). Что касается HCC-1569 и MDA-MB-453, клетки культивировали в RPMI1640 среде (Invitrogen Corp., 31870-025), содержащей 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) и 2 мМ глутамина (Invitrogen Corp., 25030-024). Что касается HT-29, клетки культивировали в McCoy's 5A среде (Invitrogen Corp., 26600-023), содержащей 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) и 2 мМ глутамина (Invitrogen Corp., 25030-024). Крайник лунки каждого планшета заполняли 100 мкл среды.

Клетки культивировали в течение 3 дней и среду заменяли на 95 мкл свежей среды перед обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство.

Использовали конъюгат антитело-лекарственное средство (3), конъюгат антитело-лекарственное средство (10) и конъюгат антитело-лекарственное средство (13). Необработанную группу использовали в качестве контроля для измерения нормального клеточного роста.

Путем добавления 5 мкл каждого конъюгата антитело-лекарственное средство, концентрированного до 20-кратной концентрации, к 95 мкл культуральной среды (10% FBS), содержащейся в каждой лунке 96-луночного планшета, была установлена конечная концентрация. Только 5 мкл среды добавляли в каждую контрольную лунку. Испытание осуществляли в трех повторах для каждого образца.

Для расчета концентрации конъюгата антитело-лекарственное средство, при которой рост или выживание клеток уменьшалось на 50%, получали концентрации конъюгата антитело-лекарственное средство путем 4-кратных разведений (10 мкг/мл до 0,15 нг/мл или 40 мкг/мл до 0,15 нг/мл) и клетки обрабатывали этими концентрациями конъюгата антитело-лекарственное средство и сравнивали с необработанной группой по активности АТФ. Оценку осуществляли путем 5-дневного культивирования HT-29 и 7-дневного культивирования HCC-1569 и MDA-MB-453, дополненных таким образом конъюгатом антитело-лекарственное средство. CellTiter-Glo(R) люминесцентный анализ клеточного выживания использовали для оценки активности конъюгата антитело-лекарственное средство. Этот метод включает измерение живых клеток, обладающих метаболической активностью, на основании АТФ активности и, в завершение, определение количества живых клеток, и использовали CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell (Promega K.K., G7573) в виде набора.

100 мкл CellTiter-Glo(R) реагента добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и планшет хранили в течение 25 минут - 65 минут при комнатной температуре в темном помещении перед измерением с использованием счетчика Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (программа измерения люминесценции, время измерения: 0,5 сек). Лунки, содержащие только культуральный раствор без инокуляции клеток, использовали для анализа в качестве контролей. Для измерения уменьшения АТФ активности, среднее значение люминесценции от 3 лунок рассчитывали в каждом из условий (Microsoft Excel 2010). Для удаления клеточно-независимых сигналов среднее значение люминесценции от контрольных лунок вычитали из среднего значения люминесценции клеток, обработанных конъюгатом антитело-лекарственное средство (Microsoft Excel 2010). Процент уменьшения (%) люминесценции рассчитывали путем сравнения с клетками необработанной группы (Microsoft Excel 2010). Это значение интерпретировали как процент ингибирования (%) клеточного роста или выживания.

Обработка всплывающих клеток

Поскольку A375 и A549 имеют более быструю скорость роста по сравнению с другими клеточными линиями, измерение роста осуществляли в неадгезивных 3D культуральных системах.

Каждую раковую клеточную линию суспендировали в 75 мкл каждой среды при низкой плотности (500 клеток/лунка для A375 и 1500 клеток/лунка для A549) и инокулировали в 96-луночный круглодонный не-адгезивный 3D культуральный планшет (Prime Surface 96U; Sumitomo Bakelite Co, Ltd.; order no. MS-9096U). Что касается A375, клетки культивировали в DMEM среде (Invitrogen Corp., 41965-039), содержащей 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) и 2 мМ глутамина (Invitrogen Corp., 25030-024). Что касается A549, клетки культивировали в a DMEM/F12 среде (Invitrogen Corp., 21331-020), содержащей 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) и 2 мМ глутамина (Invitrogen Corp., 25030-024). Крайние лунки каждого планшета заполняли 150 мкл среды. Клетки культивировали в течение 3 дней и конечную дозу доводили до 142,5 мкл или 150 мкл путем добавления 67,5 или 75 мкл свежей среды перед добавлением конъюгата антитело-лекарственное средство. Использовали конъюгат антитело-лекарственное средство (3), конъюгат антитело-лекарственное средство (10) и конъюгат антитело-лекарственное средство (13). Необработанную группу использовали в качестве контроля для измерения нормального клеточного роста.

Путем добавления 7,5 или 8 мкл каждого конъюгата антитело-лекарственное средство, концентрированного до 20-кратной концентрации, к 142,5 или 150 мкл культуральной среды (10% FBS), содержащейся в каждой лунке 96-луночного планшета, была установлена конечная концентрация. Конечную дозу устанавливали на уровне 150 мкл или 158 мкл. Только 7,5 или 8 мкл среды добавляли в каждую контрольную лунку. Испытание осуществляли в трех повторах для каждого образца.

Для расчета концентрации конъюгата антитело-лекарственное средство, при которой рост или выживание клеток уменьшались на 50%, получали концентрации конъюгата антитело-лекарственное средство путем 4-кратных разведений (10 мкг/мл до 0,15 нг/мл или 40 мкг/мл до 0,15 нг/мл) и клетки обрабатывали этими концентрациями конъюгата антитело-лекарственное средство и сравнивали с необработанной группой по активности АТФ. Оценку осуществляли путем 7-дневного культивирования клеток, дополненных таким образом конъюгатом антитело-лекарственное средство. CellTiter-Glo(R) люминесцентный анализ клеточного выживания использовали для оценки активности конъюгата антитело-лекарственное средство. Этот метод включает измерение живых клеток, обладающих метаболической активностью, на основании АТФ активности и, в завершение, определение количества живых клеток, и использовали CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell (Promega K.K., G7573) в виде набора.

Перед измерением, 50 мкл среды удаляли из каждой лунки и 100 мкл CellTiter-Glo(R) реагента добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и планшет хранили в течение от 30 минут до 55 минут при комнатной температуре в темном помещении перед измерением с использованием счетчика Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (программа измерения люминесценции, время измерения: 0,5 сек). Перед измерением 180 мкл собирали из каждой лунки и переносили в измеряемый 96-MicroWell Optical Bottom белый планшет. Лунки, содержащие только культуральный раствор без инокуляции клеток, использовали для анализа в качестве контролей. Способ для расчета концентрации конъюгата антитело-лекарственное средство, при которой получали ингибирование роста или выживания клеток на 50%, описан в способе оценки для адгезивных клеток.

[0275]

Результаты для человеческих линий рака молочной железы HCC1569 и MDA-MB453 показаны на Фиг. 6 и 7, соответственно. Результаты для человеческой линии меланомы A375 показаны на Фиг. 8. Результаты для человеческой линии колоректального рака HT29 показаны на Фиг. 9. Результаты для человеческой линии рака легкого A549 показаны на Фиг. 10. A на каждой Фиг. показывает данные клеточного роста или выживания, полученные для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS. Ось ординат представляет значение люминесценции, показывающее АТФ активность, для каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Данные представлены как среднее значение +/- стандартное отклонение от трех повторов. B на каждой Фиг. показывает процент уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство, когда люминесценция необработанной группы определена как 100%.

[0276]

Три типа конъюгатов антитело-лекарственное средство добавляли к различным человеческим раковым клеточным линиям в присутствии 10% FBS и оценивали на in vitro рост в 2D или 3D системах. Процент ингибирования клеточного роста или развития в необработанной группе или при обработке каждым конъюгатом антитело-лекарственное средство рассчитывали из данных АТФ активности, полученных в CellTiter-Glo(R) анализе. В анализе АТФ активности эти конъюгаты антитело-лекарственное средство сильно ингибировали клеточный рост или выживание двух типов клеточных линий рака молочной железы (HCC-1569 и MDA-MB-453) и один тип человеческой линии меланомы (A375).

Добавление каждого конъюгата антитело-лекарственное средство и культивирование (в присутствии 10% FBS) в течение 7 дней снижало АТФ активность на 55-75% в HCC1569, на 60-83% в MDA-MB-453 и на 60-70% в A375. Ингибиторная активность конъюгата антитело-лекарственное средство против клеточного роста или выживания не была сильной в человеческой линии колоректального рака HT-29 и человеческой линии рака легкого A549 по сравнению с человеческой линией рака молочной железы и человеческой линией меланомы. В HCC-1569 и MDA-MB-453 конъюгат антитело-лекарственное средство (10) продемонстрировал сильную ингибиторную активность, которая существенно не отличалась от ингибиторной активности конъюгата антитело-лекарственное средство (3) in vitro. В отличие от этого, в обеих человеческих линиях рака молочной железы конъюгат антитело-лекарственное средство (13) продемонстрировал низкую активность, и требовалась концентрация 15 нМ для достижения 50% ингибирования клеточного роста или выживания, в то время как с конъюгатом антитело-лекарственное средство (3) или конъюгатом антитело-лекарственное средство (10) такое ингибирование достигалось при 1 нМ или ниже. В человеческой линии меланомы по сравнению с человеческими линиями рака молочной железы активность конъюгата антитело-лекарственное средство (13) была эквивалента активности конъюгата антитело-лекарственное средство (3) или конъюгата антитело-лекарственное средство (10).

Все конъюгаты антитело-лекарственное средство подтвердили максимальный процент ингибирования порядка 61-68%. Конъюгаты антитело-лекарственное средство достигали 50% ингибирования АТФ активности при концентраци от 1 до 4 нМ.

В дополнение к описанному выше испытанию, ингибиторную активность конъюгата антитело-лекарственное средство (13) против клеточного роста или выживания человеческой клеточной линии рака яичника OVCAR-8 также подтверждали in vitro (данные не показаны).

[0277]

Пример испытания 5 Сравнение процента ингибирования in vitro клеточного роста или выживания человеческой раковой клеточной линии в зависимости от количества молекул лекарственного средства (высокое или среднее), нагруженных на конъюгат антитело-лекарственное средство

Метод:

Конъюгаты антитело-лекарственное средство с разным количеством нагруженных молекул лекарственного средства оценивали на in vitro ингибиторную активность против клеточного роста или выживания. Высокая нагрузка лекарственным средством представляет собой состояние, где 5-7 молекул лекарственного средства конъюгированы с антителом, а средняя нагрузка лекарственным средством представляет собой состояние, где около 3 молекул лекарственного средства конъюгированы с антителом. Среднее количество молекул лекарственного средства, конъюгированных с одним антителом, измеряли с использованием УФ метода (описан в других частях настоящего изобретения).

[0278]

Среднее количество молекул лекарственного средства, конъюгированных с одним антителом:

Высокая нагрузка лекарственным средством <HDL>

Конъюгат антитело-лекарственное средство (3): 4,9

Конъюгат антитело-лекарственное средство (10): 6,2

Конъюгат антитело-лекарственное средство (13): 6,2

Средняя нагрузка лекарственным средстваом <MDL>

Конъюгат антитело-лекарственное средство (4): 2,9

Конъюгат антитело-лекарственное средство (11): 3,0

Конъюгат антитело-лекарственное средство (14): 2,5

[0279]

Ингибиторную активность каждого конъюгата HER3 антитело-лекарственное средство против митогенных сигналов или сигналов выживания измеряли в присутствии 10% FBS. Рост и развитие клеток оценивали путем измерения активности аденозинтрифосфата (АТФ) в необработанных группах и группах обработки конъюгатом антитело-лекарственное средство. Раковую клеточную линию суспендировали в 100 мкл каждой среды при низкой плотности (750 клеток/лунка для человеческой клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-453 (CLB-22)) из ATCC) и инокулировали в 96-MicroWell Optical Bottom белый планшет (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc, #165306). Клетки культивировали в RPMI1640 среде (Invitrogen Corp., 31870-025), содержащей 10% FBS (Invitrogen Corp., 10270-106) и 2 мМ глутамина (Invitrogen Corp., 25030-024). Крайние лунки каждого планшета заполняли 100 мкл среды.

Клетки культивировали в течение 3 дней и среду заменяли на 95 мкл свежей среды перед добавлением конъюгата антитело-лекарственное средство. Использовали конъюгат антитело-лекарственное средство (3), конъюгат антитело-лекарственное средство (10), конъюгат антитело-лекарственное средство (13), конъюгат антитело-лекарственное средство (4), конъюгат антитело-лекарственное средство (11) и конъюгат антитело-лекарственное средство (14). Необработанную группу использовали в качестве контроля для измерения нормального клеточного роста.

Путем добавления 5 мкл каждого конъюгата антитело-лекарственное средство, концентрированного до 20-кратной концентрации, к 95 мкл культуральной среды (10% FBS), содержащейся в каждой лунке 96-луночного планшета, была установлена конечная концентрация. Только 5 мкл среды добавляли в каждую контрольную лунку. Испытание осуществляли в трех повторах для каждого образца. Для расчета концентрации конъюгата антитело-лекарственное средство, при которой рост или выживание клеток уменьшалось на 50%, получали концентрации конъюгата антитело-лекарственное средство путем 4-кратных разведений (10 мкг/мл до 0,15 нг/мл) и клетки обрабатывали этими концентрациями конъюгата антитело-лекарственное средство и сравнивали с необработанной группой по активности АТФ. Оценку осуществляли путем 7-дневного культивирования клеток, дополненных таким образом конъюгатом антитело-лекарственное средство. CellTiter-Glo(R) люминесцентный анализ клеточного выживания использовали для оценки активности конъюгата антитело-лекарственное средство. Этот метод включает измерение живых клеток, обладающих метаболической активностью, на основании АТФ активности, и, в завершение, определение количества живых клеток, и использовали CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell (Promega K.K., G7573) в виде набора. 100 мкл CellTiter-Glo(R) реагента добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и планшет хранили в течение времени от 25 минут до 55 минут при комнатной температуре в темном помещении перед измерением с использованием счетчика Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (программа измерения люминесценции, время измерения: 0,5 сек). Лунки, содержащие только культуральный раствор без инокуляции клеток, использовали для анализа в качестве контролей. Для измерения уменьшения АТФ активности рассчитывали среднее значение люминесценции от 3 лунок в каждом из условий (Microsoft Excel 2010). Для удаления клеточно-независимых сигналов среднее значение люминесценции от контрольных лунок вычитали из среднего значения люминесценции клеток, обработанных конъюгатом антитело-лекарственное средство (Microsoft Excel 2010). Процент уменьшения (%)люминесценци рассчитывали путем сравнения с клетками необработанной группы (Microsoft Excel 2010). Это значение интерпретировали как процент ингибирования (%) клеточного роста или выживания.

[0280]

Результаты показаны на Фиг. 11-13. Фиг. 11 показывает результаты сравнения конъюгата антитело-лекарственное средство (3) с конъюгатом антитело-лекарственное средство (4). Фиг. 12 показывает результаты сравнения конъюгата антитело-лекарственное средство (10) с конъюгатом антитело-лекарственное средство (11). Фиг. 13 показывает результаты сравнения конъюгата антитело-лекарственное средство (13) с конъюгатом антитело-лекарственное средство (14). На каждой Фиг. левая диаграмма показывает процент ингибирования клеточного роста или выживания, полученный для конъюгата антитело-лекарственное средство в присутствии 10% FBS в одном из осуществляемых в трех повторах испытаний. Ось ординат представляет люминесценцию, показывающую АТФ активность каждого образца. Ось абсцисс представляет концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство. Правая диаграмма показывает сравнение уменьшения люминесценции, вызываемого обработкой конъюгатом антитело-лекарственное средство, между высокой нагрузкой лекарственным средством (HDL) и средней нагрузкой лекарственным средством (MDL), когда люминесценция необработанной группы была определена как 100%.

[0281]

Конъюгаты антитело-лекарственное средство с высокой нагрузкой лекарственным средством и средней нагрузкой лекарственным средством ингибировали клеточный рост или выживание путем обработки и 7-дневного культивирования MDA-MB-453. Как уже было показано в результатах для высокой нагрузки лекарственным средством, конъюгат антитело-лекарственное средство со средней нагрузкой лекарственным средством (11) продемонстрировал высокую активность на таком же уровне, как конъюгат антитело-лекарственное средство (4). При сравнении между количествами нагруженных молекул лекарственного средства, конъюгаты антитело-лекарственное средство, имеющие высокое количество нагруженных молекул лекарственного средства, показывали большее уменьшение АТФ по сравнению с конъюгатами со средней нагрузкой лекарственным средстваом. Конъюгат антитело-лекарственное средство (3), конъюгат антитело-лекарственное средство (10) и конъюгат антитело-лекарственное средство (13), имеющие большое количество нагруженных молекул лекарственного средства, продемонстрировали проценты ингибирования 68%, 76% и 56%, соответственно, при концентрации 10 мкг/мл, тогда как конъюгат антитело-лекарственное средство (4), конъюгат антитело-лекарственное средство (11) и конъюгат антитело-лекарственное средство (14), имеющие среднее количество нагруженных молекул лекарственного средства, продемонстрировали ингибирование всего лишь 44%, 47% и 27%, соответственно, при этой концентрации. Конъюгаты антитело-лекарственное средство, имеющие большое количество нагруженных молекул лекарственного средства, показали лучшее значение концентрации, вызывающей 50% ингибирование роста или выживания раковых клеток, по сравнению с конъюгатами антитело-лекарственное средство, имеющими среднее количество нагруженных молекул лекарственного средства. Для конъюгата антитело-лекарственное средство (3) или конъюгата антитело-лекарственное средство (10), имеющих большое количество нагруженных молекул лекарственного средства, необходима концентрация 15 нг/мл (1 нМ) конъюгата антитело-лекарственное средство для уменьшения АТФ активности на 50%. Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) уменьшал АТФ активность на 50% по меньшей мере при самой высокой испытываемой концентрации. В отличие от этого, уменьшение АТФ активности, соответствующее этому, не наблюдали при концентрации 1000 нг/мл (67 нМ) или ниже в диапазоне концентраций оцениваемых конъюгатов антитело-лекарственное средство, имеющих среднее количество нагруженных молекул лекарственного средства. Сравнение in vitro между конъюгатами с большим количеством нагруженных молекул лекарственного средства и со средним количеством нагруженных молекул лекарственного средства дает основание предположить, что конъюгат антитело-лекарственное средство, имеющий большое количество нагруженных молекул лекарственного средства, также обладает лучшей in vivo ингибиторной активностью против роста раковых клеток.

[0282]

Пример испытания 6 Конъюгаты антитело-лекарственное средство (3), (10) и (13) продемонстрировали противоопухолевый эффект в in vivo противоопухолевом испытании с использованием человеческой клеточной линии рака молочной железы

Использовали пяти-недельных самок BALB/C «голых» мышей, имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день. 5×10⁶ клеток человеческой клеточной линии рака молочной железы HCC1569 (CRL-2330) из ATCC суспендировали в растворе, полученном из 50 мкл PBS и Matrigel (PBS: PAA #H21-002, Matrigel: BD #354230), смешанных при соотношении 1:1, и подкожно трансплантировали в правый бок каждой BALB/C «голой» мыши с использованием 29 G иглы.

Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L). Большую ось и малую ось опухоли измеряли два раза в неделю с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (ручной циркуль, OMC Fontana) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой (то же относится к Примерам испытаний, описанных ниже).

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 19, когда размер опухоли достигал около 150 мм³, 70 животных рандомизированно делили на 7 групп на основании их размеров опухолей. В этот же день, конъюгат антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13) или PBS для контрольной группы вводили в хвостовую вену каждого животного при следующих дозах.

[0283]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (3) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (10) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

[0284]

Все данные представляли как среднее значение +/- SEM. Размеры опухолей и массу тела животных оценивали по среднему значению +/- SEM. Все данные анализировали с использованием программы Microsoft Excel 2009 (то же относится к Примерам испытаний, описанным ниже).

[0285]

Результаты показаны на Фиг. 14. Группу введения PBS умерщвляли в День 53 после трансплантации, поскольку размеры опухолей превышали приемлемый максимальный уровень. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии рака молочной железы наблюдали во всех группах введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0286]

Пример испытания 7 Конъюгаты антитело-лекарственное средство (3), (10) и (13) продемонстрировал противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании с использованием человеческой меланомы

Использовали 5-6-недельных самок NRMI «голых» мышей, имеющих массу тела от 22 до 26 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

5×10⁶ клеток человеческой клеточной линии меланомы HT-144 (HTB-63) из ATCC суспендировали в растворе, полученном из 50 мкл PBS и Matrigel (PBS: PAA #H21-002, Matrigel: BD #354230), смешанных при соотношении 1:1, и подкожно трансплантировали в правый бок каждой NRMI «голой» мыши с использованием 29 G иглы.

Измерение массы тела и размера опухолей и измерение и расчет объема опухолей осуществляли таким же способом, как в Примере испытания 6.

В День 22, когда размер опухоли достигал около 150 мм³, 80 животных рандомизированно делили на 8 групп на основании их размеров опухолей. В этот же день U1-59 или конъюгат антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13) или PBS для контрольной группы вводили в хвостовую вену каждого животного при следующих дозах.

[0287]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: U1-59 вводили путем подкожной инъекции два раза в неделю при 25 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (3) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (10) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

[0288]

Результаты показаны на Фиг. 15. Группы введения PBS и U1-59 умерщвляли в Дни 48 и 52, соответственно, после трансплантации, поскольку размеры опухолей превышали приемлемый максимальный уровень. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии меланомы наблюдали во всех группах введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой и группой введения U1-59.

[0289]

Пример испытания 8 Конъюгаты антитело-лекарственное средство (3), (10) и (13) продемонстрировали противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании с использованием человеческой клеточной линии рака молочной железы

Использовали шестнадцати-недельных самок SCID «голых» мышей, имеющих массу тела от 17 до 25,5 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки, которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности.

Что касается солидных опухолей, происходящих из человеческой клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-453 (CLB-22) из ATCC, MDA-MB-453 в первом пассаже (Batch 1089) трансплантировали 3 мышам (два участка на мышь: в правую и левую часть тела). Через 13-17 недель, срезы опухолей выделяли и замораживали. Для второго пассажа, срез опухоли (2 × 2 × 2 мм) первого пассажа затем подкожно трансплантировали (10 мышей, два участка на мышь: в правую и левую часть тела) и давали вырасти для образования опухоли в течение 7 недель. Образованную таким образом опухоль подготавливали с получением опухолевых срезов (2×2×2 мм, второй пассаж) и трансплантировали в правый бок каждой SCID «голой» мыши.

Массу тела животных измеряли с использованием весов. Большую ось (длина) и диаметр опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (Pro-Max 150 мм ручные циркули, Fred V. Fowler Co., Inc.) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=pi/6 × Большая ось (мм) × [Диаметр (мм)]²

В День 40, когда размер опухоли достигал около 143 мм³, 72 животных рандомизированно делили на 8 групп на основании их размеров опухолей. В этот же день U1-59 или конъюгат антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13) или PBS для контрольной группы вводили в хвостовую вену каждого животного при следующих дозах.

[0290]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: U1-59 вводили путем подкожной инъекции два раза в неделю при 25 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (3) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (10) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

[0291]

Результаты показаны на Фиг. 16. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии рака молочной железы наблюдали во всех группах введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой и группой группой U1-59. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах. Кроме того, в другом противоопухолевом испытании с использованием человеческой клеточной линии рака молочной железы HCC1954 или JIMT1-PR10 (трастузумаб-, пертузумаб- и T-DM1-резистентной) ингибирование опухолевого роста также наблюдали в группе введения конъюгата антитело-лекарственное средство (16a) по сравнению с контрольной группой.

[0292]

Пример испытания 9 Конъюгаты антитело-лекарственное средство (3), (10) и (13) продемонстрировали противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании с использованием человеческой линии колоректального рака

Использовали 5-6-недельных самок NRMI «голых» мышей, имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

4×10⁶ клеток человеческой клеточной линии колоректального рака HT-29 (CPQ-57) от ProQinase GmbH суспендировали в растворе, полученном из PBS и Matrigel (PBS: PAA #H21-002, Matrigel: BD #354230), смешанных при соотношении 1:1, и подкожно трансплантировали в правый бок каждой NRMI «голой» мыши с использованием 29 G иглы.

Измерение массы тела и размеры опухолей и измерение и расчет объема опухолей осуществляли таким же способом, как в Примере испытания 6.

В День 8, когда размер опухоли достигал около 150 мм³, 70 животных рандомизированно делили на 7 групп на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13) или PBS для контрольной группы вводили в хвостовую вену каждого животного при следующих дозах.

[0293]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (3) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (10) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

[0294]

Результаты показаны на Фиг. 17. Группу введения PBS (6 из 10 мышей), группы, которым вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (3) при 3 мг/кг (3 из 10 мышей) и при 10 мг/кг (4 из 10 мышей), группы, которым вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (10) при 3 мг/кг (2 из 10 мышей) и при 10 мг/кг (2 из 10 мышей), и группу, которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (13) при 3 мг/кг (2 из 10 мышей), умерщвляли в День 50 после трансплантации, поскольку размеры опухолей превышали приемлемый максимальный уровень или образовывалась язва. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии колоректального рака наблюдали во всех группах введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой. Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) продемонстрировал более сильную противоопухолевую активность по сравнению с конъюгатом антитело-лекарственное средство (3) или конъюгатом антитело-лекарственное средство (10). Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0295]

Пример испытания 10 Конъюгаты антитело-лекарственное средство (3), (10) и (13) продемонстрировали противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании с использованием человеческой линии рака легкого

Использовали 5-6-недельных самок CD1 «голых» мышей, имеющих массу тела от 24 до 28 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

5×10⁶ клеток человеческой клеточной линии рака легкого A549 (CRS-300114) от Cell Lines Service суспендировали в растворе, полученном из 200 мкл PBS и Matrigel (PBS: PAA #H21-002, Matrigel: BD #354230), смешанных при соотношении 1:1, и подкожно трансплантировали в правый бок каждой CD1 «голой» мыши с использованием 29 G иглы.

Измерение массы тела и размеров опухолей и измерение и расчет объема опухолей осуществляли таким же способом, как в Примере испытания 6.

В День 38, когда размер опухоли достигал около 200 мм³, 70 животных рандомизированно делили на 7 групп на основании их размеров опухолей. В этот же день, конъюгат антитело-лекарственное средство (3), (10) или (13) или PBS для контрольной группы вводили в хвостовую вену каждого животного при следующих дозах.

[0296]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (3) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (10) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 3 или 10 мг/кг.

[0297]

Результаты показаны на Фиг. 18. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии рака легкого наблюдали во всех группах введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0298]

Пример испытания 11 Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) продемонстрировал противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии тройного негативного рака молочной железы

Тройной негативный рак молочной железы относится к раку молочной железы, который не экспрессирует ни рецепторы гормонов (рецептор эстрогена и рецептор прогестерона) ни HER2. Поскольку эти рецепторы не экспрессируются, гормональное лечение (тамоксифен, и т.д.) или анти-HER2 лечение (трастузумаб, трастузумаб эмтансин или пертузумаб) не могут применяться для лечения этого рака. Этот рак молочной железы поэтому приводит к низкому проценту выживания, и многие терапевтические средства все еще находятся в стадии клинических испытаний. Поскольку экспрессия HER3 была подтверждена в человеческой клеточной линии тройного негативного рака молочной железы MDA-MB-468 (данные не показаны), оценивали противоопухолевую активность конъюгата антитело-лекарственное средство.

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕 ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

5×10⁶ клеток человеческой клеточной линии тройного негативного рака молочной железы MDA-MB-468 (CRL-2322) из ATCC суспендировали в растворе, полученном из 200 мкл of PBS и Matrigel (PBS: PAA #10010-023, Matrigel: BD #354234), смешанных при соотношении 1:1, и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 20, когда размер опухоли достигал около 170 мм³, 18 животных рандомизированно делили на 3 группы на основании их размеров опухолей. В этот же день U1-59 или конъюгат антитело-лекарственное средство (13) или PBS для контрольной группы вводили в хвостовую вену каждого животного при следующих дозах.

[0299]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: U1-59 вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (13) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 10 мг/кг.

[0300]

Результаты показаны на Фиг. 19. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии тройного негативного рака молочной железы наблюдали в группе введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой и группой группой U1-59. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0301]

Пример испытания 12 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии люминального рака молочной железы

Человеческий люминальный рак молочной железы относится к раку молочной железы, котор экспрессирует рецепторы гормонов (рецептор эстрогена), но не экспрессирует HER2. Поскольку эти рецепторы не экспрессируются, анти-HER2 лечение (трастузумаб, трастузумаб эмтансин, пертузумаб) не могут применяться для лечения этого рака. Этот рак молочной железы поэтому приводит к низкому проценту выживания, и многие терапевтические средства все еще находятся в стадии клинических испытаний. Поскольку экспрессия HER3 была подтверждена в человеческой клеточной линии люминального рака молочной железы MCF-7 (данные не показаны), оценивали противоопухолевую активность конъюгата антитело-лекарственное средство.

Использовали 5-6-недельных самок бестимусных «голых» мышей Nude-Foxn1^nu (ProQinase GmbH), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

5×10⁶ клеток человеческой клеточной линии люминального рака молочной железы MCF-7 (CRQ-#327) суспендировали в растворе, полученном из 200 мкл PBS и Matrigel (PBS: PAA #10010-023, Matrigel: BD #354234), смешанных при соотношении 1:1, и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 11, когда размер опухоли достигал около 250 мм³, 20 животных рандомизированно делили на 2 группы на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0302]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили путем инъекции внутривенно при разовой дозе 10 мг/кг.

[0303]

Результаты показаны на Фиг. 20. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии люминального рака молочной железы наблюдали в группе введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0304]

Пример испытания 13 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии меланомы

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

3×10⁶ клеток человеческой клеточной линии меланомы WM-266-4 (CRL-1676) из ATCC смешивали и суспендировали в Matrigel (BD #354234) и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 19, когда размер опухоли достигал около 220 мм³, 8 животных рандомизированно делили на 2 группы на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0305]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили путем инъекции внутривенно при разовой дозе 10 мг/кг.

[0306]

Результаты показаны на Фиг. 21. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии меланомы наблюдали в группе введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах. В другой модели человеческой меланомы C32 ингибирование опухолевого роста также наблюдали в группе введения конъюгата антитело-лекарственное средство (16a) по сравнению с контрольной группой.

[0307]

Пример испытания 14 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии рака яичника

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕 «голых» мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

5×10⁶ клеток человеческой клеточной линии рака яичника OVCAR-8 (HTB-161) из ATCC смешивали и суспендировали в Matrigel (BD #354234) и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 21, когда размер опухоли достигал около 140 мм³, 8 животных рандомизированно делили на 2 группы на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0308]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили путем инъекции внутривенно при разовой дозе 10 мг/кг.

[0309]

Результаты показаны на Фиг. 22. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии рака яичника наблюдали в группе введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0310]

Пример испытания 15 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии рака мочевого пузыря

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

8×10⁶ клеток человеческой клеточной линии рака мочевого пузыря SW-780 (CRL-2169) из ATCC смешивали и суспендировали в Matrigel (BD #354234) и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 7, когда размер опухоли достигал около 190 мм³, 10 животных рандомизированно делили на 2 группы на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0311]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили путем инъекции внутривенно при разовой дозе 10 мг/кг.

[0312]

Результаты показаны на Фиг. 23. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии рака мочевого пузыря наблюдали в группе введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0313]

Пример испытания 16 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал HER3-зависимый противоопухолевый эффект в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии рака молочной железы. Человеческая линия рака молочной железы MDA-MB-453 экспрессирует HER3 и реагирует на конъюгат антитело-лекарственное средство (13), как описано в Примере испытания 8. Однако, поскольку до сих пор не было продемонстрировано, что этот фармацевтический эффект был опосредован HER3, HER3 маскировали путем введения U1-59 заранее и оценивали, снижался или нет фармацевтический эффект.

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

1×10⁷ клеток человеческой клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-453 (CLB-22) из ATCC смешивали и суспендировали в Matrigel (BD #354234) и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 11, когда размер опухоли достигал около 130 мм³, 16 животных рандомизированно делили на 4 группы на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) и/или U1-59 или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0314]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: U1-59 вводили путем инъекции внутривенно при разовой дозе 30 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили путем инъекции внутривенно при разовой дозе 3 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (внутривенная инъекция при разовой дозе) U1-59 вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) путем инъекции внутривенно при разовой дозе 3 мг/кг.

[0315]

Результаты показаны на Фиг. 24. Ингибирование опухолевого роста человеческой клеточной линии рака молочной железы наблюдали в группе введения конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с контрольной группой, тогда как этот эффект ингибирования опухоли ослаблялся при предварительном введении U1-59. Эти результаты продемонстрировали, что эффект ингибирования опухоли конъюгатом антитело-лекарственное средство представляет собой фармацевтический эффект, опосредованный HER3. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0316]

Пример испытания 17 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал противоопухолевый эффект в комбинации с трастузумабом в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии рака молочной железы

Трастузумаб одобрен в качестве терапевтического средства для человеческого HER2-положительного рака молочной железы. Однако известно о резистентности к трастузумабу, и сообщалось о том, что мутация в PIK3CA <H1047R или H420R> участвует в одном из механизмов, лежащих в основе такой резистентности. В этом испытании оценивали, является или нет комбинированное использование трастузумаба и конъюгата антитело-лекарственное средство эффективным для трастузумаб-резистентной клеточной линии рака молочной железы.

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

1×10⁷ клеток человеческой клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-453 (CLB-22, H1047R мутация в PIK3CA) из ATCC смешивали и суспендировали в Matrigel (PBS: PAA #10010-023, Matrigel: BD #354234) и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 11, когда размер опухоли достигал около 130 мм³, 16 животных рандомизированно делили на 4 группы на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a), трастузумаб, используемые в комбинации конъюгат и трастузумаб или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0317]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Трастузумаб (Roche Diagnostics, Inc.) вводили путем инъекции внутривенно при разовой дозе 1 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили путем инъекции внутривенно при разовой дозе 3 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (внутривенная инъекция при разовой дозе) трастузумаба (Roche Diagnostics, Inc.) вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) путем инъекции внутривенно при разовой дозе 3 мг/кг.

[0318]

Результаты показаны на Фиг. 25. Противоопухолевый эффект, достигаемый при комбинированном применении, на человеческую клеточную линию рака молочной железы (PIK3CA H1047R) наблюдали в группе введения трастузумаба и конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с введением каждого лекарственного средства отдельно. Эти результаты продемонстрировали, что фармацевтический эффект конъюгата антитело-лекарственное средство усиливается при его использовании в комбинации с трастузумабом. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах. В другом противоопухолевом испытании с использованием человеческой клеточной линии рака молочной железы HCC1954(PIK3CA H1047R), объединенный противоопухолевый эффект также наблюдали в группе введения трастузумаба и конъюгата антитело-лекарственное средство (16a) по сравнению с введением каждого лекарственного средства отдельно.

[0319]

Пример испытания 18 Конъюгат антитело-лекарственное средство (15) продемонстрировал противоопухолевый эффект в комбинации с трастузумабом в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии рака молочной железы

Трастузумаб одобрен в качестве терапевтического средства для человеческого HER2-положительного рака молочной железы. Однако известно о резистентности к трастузумабу, и сообщалось о том, что мутация в PIK3CA <H1047R или H420R> участвует в одном из механизмов, лежащих в основе такой резистентности. В этом испытании оценивали, является или нет комбинированное использование трастузумаба и конъюгата антитело-лекарственное средство эффективным для трастузумаб-резистентной клеточной линии рака молочной железы.

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

5×10⁶ клеток человеческой клеточной линии рака молочной железы JIMT-1 (ACC-589, H420R мутация в PIK3CA) из ATCC суспендировали в PBS (PAA #10010-023) и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 10, когда размер опухоли достигал около 200 мм³, 24 животных рандомизированно делили на 4 группы на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (15), трастузумаб, используемые в комбинации конъюгат и трастузумаб или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0320]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Трастузумаб (Roche Diagnostics, Inc.) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (15) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 10 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (внутривенная инъекция один раз в неделю) трастузумаба (Roche Diagnostics, Inc.) вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (15) путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 10 мг/кг.

[0321]

Результаты показаны на Фиг. 26. Противоопухолевый эффект, достигаемый при комбинированном применении, на человеческую клеточную линию рака молочной железы (PIK3CA H420R) наблюдали в группе введения трастузумаба и конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с введением каждого лекарственного средства отдельно. Эти результаты продемонстрировали, что фармацевтический эффект конъюгата антитело-лекарственное средство усиливается при его использовании в комбинации с трастузумабом. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0322]

Пример испытания 19 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал противоопухолевый эффект в комбинации с гефитинибом в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой линии рака легкого

Гефитиниб одобрен в качестве терапевтического средства для рак легкого человека. В этом испытании оценивали, является или нет комбинированное использование гефитиниба и конъюгата антитело-лекарственное средство эффективным.

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

3×10⁶ клеток человеческой клеточной линии рака легкого PC-9 (RCB0446) из ATCC суспендировали в PBS (PAA #10010-023) и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 14, когда размер опухоли достигал около 270 мм³, 16 животных рандомизированно делили на 4 группы на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a), гефитиниб, используемые в комбинации конъюгата и гефитиниб или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0323]

Группа введения: PBS вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Гефитиниб (AstraZeneca) вводили перорально один раз в день при 6 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 10 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (пероральное введение один раз в день) гефитиниба (AstraZeneca) вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) путем инъекции внутривенно один раз в неделю при 10 мг/кг.

[0324]

Результаты показаны на Фиг. 27. Противоопухолевый эффект, достигаемый при комбинированном применении, на человеческую клеточную линию рака легкого наблюдали в группе введения гефитиниба и конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с введением каждого лекарственного средства отдельно. Эти результаты продемонстрировали, что фармацевтический эффект конъюгата антитело-лекарственное средство усиливается при его использовании в комбинации с гефитинибом. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0325]

Пример испытания 20 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал противоопухолевый эффект в комбинации с цетуксимабом или панитумумабом в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии тройного негативного рака молочной железы

Анти-EGFR антитело цетуксимаб или панитумумаб находится в стадии клинических испытаний против человеческого тройного негативного рака молочной железы. В этом испытании оценивали, является или нет комбинированное использование цетуксимаба или панитумумаба и конъюгата антитело-лекарственное средство эффективным.

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

5×10⁶ клеток человеческой клеточной линии тройного негативного рака молочной железы MDA-MB-468 (CRL-2322) из ATCC суспендировали в растворе, полученном из 200 мкл PBS и Matrigel (PBS: PAA #10010-023, Matrigel: BD #354234), смешанных при соотношении 1:1, и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 21, когда размер опухоли достигал около 160 мм³, 30 животных рандомизированно делили на 6 групп на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a), цетуксимаб или панитумумаб, используемые в комбинации конъюгат и цетуксимаб или панитумумаб или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0326]

Группа введения: PBS вводили при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Цетуксимаб (Bristol-Myers Squibb Company) вводили при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: Панитумумаб (Amgen Inc.) вводили при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (введение при разовой дозе) цетуксимаба (Bristol-Myers Squibb Company) вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (введение при разовой дозе) панитумумаба (Amgen Inc.) вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) при разовой дозе 10 мг/кг.

[0327]

Результаты показаны на Фиг. 28. Противоопухолевый эффект, достигаемый при комбинированном применении, на человеческую клеточную линию тройного негативного рака молочной железы наблюдали в группе введения цетуксимаба (Фиг. 28A) или панитумумаба (Фиг. 28B) и конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с введением каждого лекарственного средства отдельно. Эти результаты продемонстрировали, что фармацевтический эффект конъюгата антитело-лекарственное средство усиливается при его использовании в комбинации с цетуксимабом или панитумумабом. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах. Противоопухолевый эффект, достигаемый при комбинированном применении, на другую человеческую клеточную линию тройного негативного рака молочной железы MDA-MB-231 также наблюдали в группе введения цетуксимаба или панитумумаба и конъюгата антитело-лекарственное средство (16a) по сравнению с введением каждого лекарственного средства отдельно.

[0328]

Пример испытания 21 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал противоопухолевый эффект в комбинации с цетуксимабом или панитумумабом в противоопухолевом испытании in vivo с использованием человеческой клеточной линии рак головы и шеи

Анти-EGFR антитело цетуксимаб одобрен против рак головы и шеи человека, тогда как панитумумаб находится в стадии клинических испытаний против этого рака. В этом испытании оценивали, является или нет комбинированное использование цетуксимаба или панитумумаба и конъюгата антитело-лекарственное средство эффективным.

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

4×10⁶ клеток человеческой клеточной линии рака головы и шеи Fadu (HTB-43) из ATCC суспендировали в 200 мкл PBS (PAA #10010-023) и подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши с использованием 29 G иглы. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 6, когда размер опухоли достигал около 330 мм³, 30 животных рандомизированно делили на 6 групп на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a), цетуксимаб или панитумумаб, используемые в комбинации конъюгат и цетуксимаб или панитумумаб или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0329]

Группа введения: PBS вводили при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Цетуксимаб (Bristol-Myers Squibb Company) вводили при разовой дозе 5 мг/кг.

Группа введения: Панитумумаб (Amgen Inc.) вводили при разовой дозе 5 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (введение при разовой дозе) цетуксимаба (Bristol-Myers Squibb Company) вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (введение при разовой дозе) панитумумаба (Amgen Inc.) вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) при разовой дозе 10 мг/кг.

[0330]

Результаты показаны на Фиг. 29. Противоопухолевый эффект, достигаемый при комбинированном применении, на человеческую клеточную линию рака головы и шеи наблюдали в группе введения цетуксимаба (Фиг. 29A) или панитумумаба (Фиг. 29B) и конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с введением каждого лекарственного средства отдельно. Эти результаты продемонстрировали, что фармацевтический эффект конъюгата антитело-лекарственное средство усиливается при его использовании в комбинации с цетуксимабом или панитумумабом. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах.

[0331]

Пример испытания 22 Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) продемонстрировал противоопухолевый эффект в комбинации с цетуксимабом или пертузумабом в противоопухолевом испытании in vivo путем трансплантации опухоли от пациента с раком желудка

Анти-EGFR антитело цетуксимаб и анти-HER2 антитело пертузумаб находятся в стадии клинических испытаний против рака желудка человека. В этом испытании оценивали, является или нет комбинированное использование цетуксимаба или пертузумаба и конъюгата антитело-лекарственное средство эффективным. Оценку осуществляли путем проведения противоопухолевого испытания близко к клиническим условиям с использованием стромы пациента, с использованием выделенных у пациента опухолей, трансплантированных мышам, вместо общей системы оценки с использованием человеческой раковой клеточной линии.

Использовали 5-6-недельных самок CAnN.Cg-Foxn1[nu]/CrlCrlj〔Foxn1nu/Foxn1nu〕ʺголыхʺ мышей (Charles River Laboratories Japan, Inc.), имеющих массу тела от 15 до 20 г, после акклиматизации. Мышей помещали в индивидуально проветриваемые клетки (IVC, максимум по 4 мыши на клетку), которые поддерживали при комнатной температуре и постоянной влажности. После рандомизации массу тела мышей измеряли постоянно через день и поведение животных регистрировали каждый день.

Опухоль от пациента с раком желудка NIBIO-G016 от National Institute of Biomedical Innovation подкожно трансплантировали в правый бок каждой «голой» мыши. Массу тела животных измеряли с использованием весов (Mettler Toledo PB602-L).

Большую ось и малую ось опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с электронным цифровым отсчетом (CD-15CX, Mitsutoyo Corp) и рассчитывали объем опухоли (мм³). Расчет осуществляли в соответствии со следующей формулой.

Объем опухоли (мм³)=1/2 × Большая ось (мм) × [Малая ось (мм)]²

В День 56, когда размер опухоли достигал около 220 мм³, 30 животных рандомизированно делили на 6 групп на основании их размеров опухолей. В этот же день конъюгат антитело-лекарственное средство (16a), цетуксимаб или пертузумаб, используемые в комбинации конъюгата и цетуксимаб или пертузумаб или PBS для контрольной группы вводили при следующих дозах.

[0332]

Группа введения: PBS вводили при такой же дозе, при которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство.

Группа введения: Цетуксимаб (Bristol-Myers Squibb Company) вводили при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: Пертузумаб (Roche Diagnostics, Inc.) вводили при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: Конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) вводили при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (введение при разовой дозе) цетуксимаба (Bristol-Myers Squibb Company) вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) при разовой дозе 10 мг/кг.

Группа введения: через 30 минут после введения (введение при разовой дозе) пертузумаба (Roche Diagnostics, Inc.) вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (16a) при разовой дозе 10 мг/кг.

[0333]

Результаты показаны на Фиг. 30. Противоопухолевый эффект, достигаемый при комбинированном применении, на опухолевую модель выделенного у пациента рака желудка наблюдали в группе введения цетуксимаба (Фиг. 30A) или пертузумаба (Фиг. 30B) и конъюгата антитело-лекарственное средство по сравнению с введением каждого лекарственного средства отдельно. Эти результаты продемонстрировали, что фармацевтический эффект конъюгата антитело-лекарственное средство усиливается при его использовании в комбинации с цетуксимабом или панитумумабом в опухолевой модели выделенного у пациента рака. Никакой потери массы тела не наблюдали у мышей в обрабатываемых группах. Кроме того, в противоопухолевом испытании с использованием человеческой панкреатической раковой клеточной линии BxPC3 конъюгат антитело-лекарственное средство (13) продемонстрировал более сильный противоопухолевый эффект по сравнению с группой введения PBS или группой введения U1-59. Конъюгат антитело-лекарственное средство также продемонстрировал сильный противоопухолевый эффект на in vivo противоопухолевую модель с использованием клеточной линии HER2-положительного рака молочной железы JIMT1 с приобретенной резистентностью к комбинированному использованию трастузумаба и пертузумаба или к трастузумабу эмтансину.

[0334]

Пример испытания 23 Безопасность конъюгата антитело-лекарственное средство для животных, отличных от человека

Конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению и фармацевтическая композиция, содержащая такой конъюгат анти-HER3 антитело-лекарственное средство, обладают отличной безопасностью в качестве терапевтического или профилактического средства от определенного заболевания. Например, когда конъюгат антитело-лекарственное средство (5), (10) или (13) вводили при дозе до 30 мг/кг гибридной крысе, в общей сложности два раза с интервалом один раз в неделю, никаких признаков серьезной токсичности не наблюдали ни для какого из конъюгатов антитело-лекарственное средство в результате наблюдений вплоть до Дня 7 после конечного введения. Кроме того, когда конъюгат антитело-лекарственное средство (5), (10) или (13) вводили при дозе до 30 мг/кг гибридной обезьяне, никаких заметных признаков токсичности не наблюдали ни для какого из конъюгатов антитело-лекарственное средство в результате наблюдений в течение 7 дней.

Кроме того, при введении обезьяне конъюгата антитело-лекарственное средство (5), (10) или (13) с использованием нескольких доз (с 3-недельными интервалами) никаких заметных признаков токсичности не наблюдали ни для какого из конъюгатов антитело-лекарственное средство в результате наблюдений. Следовательно, конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению обладает отличной безопасностью в виде фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболевания.

[Свободный текст перечня последовательностей]

[0335]

SEQ ID NO: 1 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 2 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 3 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 4 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 5 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 6 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 7 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 8 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 9 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 10 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 11 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 12 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 13 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 14 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 15 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 16 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 17 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 18 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 19 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 20 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 21 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 22 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 23 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 24 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 25 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 26 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 27 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 28 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 29 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 30 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 31 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 32 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 33 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-46

SEQ ID NO: 34 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-46

SEQ ID NO: 35 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 36 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 37 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 38 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 39 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-48

SEQ ID NO: 40 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-48

SEQ ID NO: 41 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 42 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 43 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 44 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 45 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 46 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 47 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 48 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 49 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 50 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 51 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 52 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 53 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 54 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 55 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 56 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 57 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55

SEQ ID NO: 58 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55

SEQ ID NO: 59 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55.1

SEQ ID NO: 60 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55.1

SEQ ID NO: 61 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57

SEQ ID NO: 62 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57

SEQ ID NO: 63 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57.1

SEQ ID NO: 64 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57.1

SEQ ID NO: 65 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 66 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 67 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 68 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 69 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 70 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 71 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 72 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 73 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 74 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 75 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 76 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 77 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61

SEQ ID NO: 78 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61

SEQ ID NO: 79 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 80 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 81 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 82 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 83 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 84 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 85 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 86 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 87 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 88 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 89 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 90 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 91 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 92 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 93 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 94 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 95 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 96 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 97 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 98 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 99 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 100 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 101 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 102 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 103 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 104 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 105 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 106 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 107 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 108 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 109 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 110 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 111 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 112 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 113 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 114 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 115 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 116 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 117 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 118 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 119 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-19

SEQ ID NO: 120 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-19

SEQ ID NO: 121 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 122 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 123 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 124 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 125 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 126 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 127 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 128 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 129 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 130 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 131 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 132 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 133 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 134 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 135 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 136 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 137 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 138 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 139 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 140 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 141 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 142 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 143 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 144 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 145 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 146 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 147 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 148 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 149 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 150 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 151 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 152 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 153 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 154 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 155 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 156 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 157 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 158 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 159 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 160 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 161 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 162 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 163 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 164 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 165 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 166 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 167 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 168 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 169 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 170 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 171 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 172 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 173 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 174 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 175 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 176 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 177 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 178 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 179 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 180 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 181 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 182 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 183 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 184 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 185 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 186 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 187 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 188 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 189 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 190 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 191 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 192 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 193 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 194 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 195 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 196 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 197 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 198 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 199 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 200 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 201 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 202 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 203 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 204 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 205 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 206 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 207 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 208 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 209 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 210 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 211 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 212 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 213 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 214 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 215 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 216 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 217 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 218 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 219 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 220 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 221 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 222 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 223 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 224 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 225 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 226 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 227 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 228 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 229 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 230 - Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 231 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 232 - Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 233 - Праймер

SEQ ID NO: 234 - Праймер

SEQ ID NO: 235 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 236 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 237 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 238 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 239 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 240 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-1

SEQ ID NO: 241 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 242 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 243 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 244 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 245 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 246 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-2

SEQ ID NO: 247 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 248 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 249 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 250 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 251 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 252 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-3

SEQ ID NO: 253 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 254 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 255 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 256 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 257 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 258 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-4

SEQ ID NO: 259 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 260 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 261 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 262 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 263 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 264 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-5

SEQ ID NO: 265 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 266 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 267 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 268 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 269 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 270 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-6

SEQ ID NO: 271 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 272 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 273 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 274 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 275 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 276 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-7

SEQ ID NO: 277 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 278 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 279 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 280 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 281 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 282 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-8

SEQ ID NO: 283 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 284 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 285 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 286 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 287 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 288 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-9

SEQ ID NO: 289 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 290 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 291 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 292 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 293 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 294 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-10

SEQ ID NO: 295 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 296 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 297 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 298 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 299 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 300 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-11

SEQ ID NO: 301 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 302 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 303 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 304 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 305 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 306 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-12

SEQ ID NO: 307 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 308 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 309 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 310 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 311 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 312 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-13

SEQ ID NO: 313 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 314 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 315 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 316 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 317 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 318 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-14

SEQ ID NO: 319 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 320 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 321 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 322 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 323 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 324 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-15

SEQ ID NO: 325 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 326 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 327 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 328 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 329 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 330 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-16

SEQ ID NO: 331 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 332 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 333 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 334 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 335 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 336 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-17

SEQ ID NO: 337 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 338 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 339 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 340 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 341 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 342 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-18

SEQ ID NO: 343 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-19

SEQ ID NO: 344 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-19

SEQ ID NO: 345 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-19

SEQ ID NO: 346 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 347 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 348 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 349 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 350 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 351 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-20

SEQ ID NO: 352 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 353 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 354 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 355 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 356 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 357 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-21

SEQ ID NO: 358 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 359 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 360 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 361 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 362 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 363 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-22

SEQ ID NO: 364 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 365 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 366 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 367 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 368 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 369 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-23

SEQ ID NO: 370 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 371 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 372 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 373 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 374 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 375 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-24

SEQ ID NO: 376 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 377 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 378 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 379 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 380 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 381 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-25

SEQ ID NO: 382 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 383 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 384 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 385 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 386 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 387 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-26

SEQ ID NO: 388 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 389 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 390 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 391 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 392 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 393 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-27

SEQ ID NO: 394 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 395 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 396 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 397 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 398 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 399 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-28

SEQ ID NO: 400 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 401 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 402 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 403 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 404 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 405 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-29

SEQ ID NO: 406 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 407 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 408 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 409 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 410 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 411 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-30

SEQ ID NO: 412 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 413 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 414 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 415 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 416 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 417 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-31

SEQ ID NO: 418 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 419 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 420 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 421 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 422 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 423 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-32

SEQ ID NO: 424 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 425 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 426 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 427 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 428 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 429 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-33

SEQ ID NO: 430 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 431 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 432 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 433 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 434 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 435 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-34

SEQ ID NO: 436 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 437 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 438 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 439 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 440 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 441 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-35

SEQ ID NO: 442 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 443 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 444 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 445 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 446 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 447 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-36

SEQ ID NO: 448 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 449 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 450 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 451 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 452 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 453 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-37

SEQ ID NO: 454 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 455 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 456 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 457 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 458 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 459 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-38

SEQ ID NO: 460 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 461 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 462 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 463 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 464 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 465 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-39

SEQ ID NO: 466 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 467 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 468 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 469 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 470 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 471 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-40

SEQ ID NO: 472 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 473 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 474 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 475 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 476 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 477 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-41

SEQ ID NO: 478 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 479 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 480 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 481 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 482 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 483 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-42

SEQ ID NO: 484 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 485 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 486 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 487 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 488 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 489 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-43

SEQ ID NO: 490 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 491 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 492 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 493 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 494 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 495 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-44

SEQ ID NO: 496 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 497 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 498 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 499 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 500 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 501 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-45

SEQ ID NO: 502 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-46

SEQ ID NO: 503 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-46

SEQ ID NO: 504 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-46

SEQ ID NO: 505 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 506 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 507 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 508 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 509 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 510 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-47

SEQ ID NO: 511 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-48

SEQ ID NO: 512 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-48

SEQ ID NO: 513 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-48

SEQ ID NO: 514 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 515 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 516 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 517 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 518 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 519 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-49

SEQ ID NO: 520 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 521 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 522 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 523 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 524 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 525 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-50

SEQ ID NO: 526 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 527 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 528 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 529 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 530 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 531 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-51

SEQ ID NO: 532 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 533 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 534 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 535 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 536 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 537 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-52

SEQ ID NO: 538 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 539 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 540 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 541 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 542 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 543 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-53

SEQ ID NO: 544 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55.1

SEQ ID NO: 545 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55.1

SEQ ID NO: 546 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55.1

SEQ ID NO: 547 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55

SEQ ID NO: 548 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55

SEQ ID NO: 549 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-55

SEQ ID NO: 550 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57.1

SEQ ID NO: 551 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57.1

SEQ ID NO: 552 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57.1

SEQ ID NO: 553 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57

SEQ ID NO: 554 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57

SEQ ID NO: 555 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-57

SEQ ID NO: 556 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 557 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 558 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 559 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 560 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 561 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-58

SEQ ID NO: 562 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 563 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 564 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 565 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 566 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 567 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 568 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 569 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 570 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 571 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 572 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 573 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61.1

SEQ ID NO: 574 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61

SEQ ID NO: 575 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61

SEQ ID NO: 576 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-61

SEQ ID NO: 577 - Аминокислотная последовательность CDRH1 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 578 - Аминокислотная последовательность CDRH2 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 579 - Аминокислотная последовательность CDRH3 тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 580 - Аминокислотная последовательность CDRL1 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 581 - Аминокислотная последовательность CDRL2 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 582 - Аминокислотная последовательность CDRL3 легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-62

SEQ ID NO: 583 - Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59

SEQ ID NO: 584 - Полноразмерная аминокислотная последовательность легкой цепи человеческого анти-HER3 антитела U1-59.

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к конъюгатам антитело-лекарственное средство для лечения опухоли и/или рака, а также к фармацевтической композиции и способу лечения опухоли и/или рака. Раскрыт конъюгат антитело-лекарственное средство, представляющее собой

конъюгированное с анти-HER3 антителом в форме структуры лекарственное средство-линкер. Также раскрыт конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения опухоли и/или рака, представленное следующей формулой

где n представляет собой среднее количество конъюгированных единиц структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с анти-HER3 антителом, и где анти-HER3 антитело включает аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID No: 583 и 584 тяжелой и легкой цепей соответственно. Также раскрыты фармацевтические композиции, содержащие указанные конъюгаты антитело-лекарственное средство, и способы лечения опухоли с помощью указанных конъюгатов антитело-лекарственное средство. Группа изобретений обеспечивает расширение арсенала средств противоопухолевого действия. 6 н. и 17 з.п. ф-лы, 30 ил., 1 табл., 23 пр.

1. Конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения опухоли и/или рака, где противоопухолевое соединение, представленное следующей формулой

[Химическая формула 1]

,

конъюгировано с анти-HER3 антителом в форме структуры лекарственное средство-линкер, выбранной из следующей группы:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX),

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX) и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX);

где

указанная структура лекарственное средство-линкер присоединена к анти-HER3 антителу посредством тиоэфирной связи, которая образуется на участке дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части анти-HER3 антитела,

-(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:

[Химическая формула 2]

,

которая связана с анти-HER3 антителом в положении 3 и связана с метиленовой группой в линкерной структуре, содержащей эту структуру, по атому азота в положении 1,

-(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой, с атомом азота аминогруппы в положении 1, которое представляет собой положение связывания,

[Химическая формула 3]

,

-GGFG- представляет собой тетрапептидный остаток -Gly-Gly-Phe-Gly-.

2. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где структура лекарственное средство-линкер представляет собой:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX).

3. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где структура лекарственное средство-линкер представляет собой:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX).

4. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, где структура лекарственное средство-линкер представляет собой:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-(NH-DX).

5. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-4, где антитело включает CDRH1 - CDRH3 и CDRL1 - CDRL3 U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 или U1-9 в тяжелой и легкой цепях соответственно.

6. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-4, где антитело включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи U1-49, U1-53, U1-59, U1-7 или U1-9 в тяжелой и легкой цепях соответственно.

7. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-4, где антитело включает аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID Nos: 42 и 44, SEQ ID Nos: 54 и 56, SEQ ID Nos: 70 и 72, SEQ ID Nos: 92 и 94 или SEQ ID Nos: 96 и 98 в тяжелой и легкой цепях соответственно.

8. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-4, где антитело включает аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID Nos: 583 и 584 в тяжелой и легкой цепях соответственно.

9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 8, где анти-HER3 антитело не содержит остаток лизина на карбоксильном конце тяжелой цепи.

10. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-9, где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 2 до 8.

11. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-9, где среднее количество конъюгированных единиц выбранной одной лекарственное средство-линкер структуры в расчете на антитело находится в пределах от 3 до 8.

12. Фармацевтическая композиция для лечения опухоли и/или рака, включающая конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-11, его соль или его гидрат в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый ингредиент для формулирования.

13. Фармацевтическая композиция по п. 12 для лечения рака легкого, рака почки, уротелиального рака, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичника, панкреатического рака, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, гастрального рака, желудочно-кишечной стромальной опухоли, цервикального рака, рака головы и шеи, эзофагеального рака, эпидермоидного рака, перитонеального рака, мультиформной глиобластомы взрослых, гепатического рака, гепатоклеточной карциномы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака толстой кишки и прямой кишки, эндометриального рака, рака матки, рака слюнной железы, ренального рака, рака вульвы, рака щитовидной железы, гепатической карциномы, анальной карциномы или рака полового члена.

14. Способ лечения опухоли и/или рака, включающий введение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 1-11, его соли или его гидрата.

15. Способ по п. 14 для лечения рака легкого, рака почки, уротелиального рака, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичника, панкреатического рака, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, гастрального рака, желудочно-кишечной стромальной опухоли, цервикального рака, рака головы и шеи, эзофагеального рака, эпидермоидного рака, перитонеального рака, мультиформной глиобластомы взрослых, гепатического рака, гепатоклеточной карциномы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака толстой кишки и прямой кишки, эндометриального рака, рака матки, рака слюнной железы, ренального рака, рака вульвы, рака щитовидной железы, гепатической карциномы, анальной карциномы или рака полового члена.

16. Конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения опухоли и/или рака, представленное следующей формулой

[Химическая формула 4]

,

где n представляет собой среднее количество конъюгированных единиц структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с анти-HER3 антителом, и где анти-HER3 антитело включает аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID No: 583 и 584 тяжелой и легкой цепей соответственно.

17. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 16, где анти-HER3 антитело не содержит остатка лизина в карбоксильном конце тяжелой цепи.

18. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 16 или 17, где n находится в пределах от 2 до 8.

19. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 16 или 17, где n находится в пределах от 3 до 8.

20. Фармацевтическая композиция для лечения опухоли и/или рака, включающая конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 16-19, его соль или его гидрат в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый ингредиент для формулирования.

21. Фармацевтическая композиция по п. 20, которую применяют для лечения рака легкого, рака почки, уротелиального рака, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичника, панкреатического рака, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, гастрального рака, желудочно-кишечной стромальной опухоли, цервикального рака, рака головы и шеи, эзофагеального рака, эпидермоидного рака, перитонеального рака, мультиформной глиобластомы взрослых, гепатического рака, гепатоклеточной карциномы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака толстой кишки и прямой кишки, эндометриального рака, рака матки, рака слюнной железы, ренального рака, рака вульвы, рака щитовидной железы, гепатической карциномы, анальной карциномы или рака полового члена.

22. Способ лечения опухоли и/или рака, включающий введение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 16-19, его соли или его гидрата.

23. Способ по п. 22 для лечения рака легкого, рака почки, уротелиального рака, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичника, панкреатического рака, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, гастрального рака, желудочно-кишечной стромальной опухоли, цервикального рака, рака головы и шеи, эзофагеального рака, эпидермоидного рака, перитонеального рака, мультиформной глиобластомы взрослых, гепатического рака, гепатоклеточной карциномы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака толстой кишки и прямой кишки, эндометриального рака, рака матки, рака слюнной железы, ренального рака, рака вульвы, рака щитовидной железы, гепатической карциномы, анальной карциномы или рака полового члена.