АНТИ-CDH6-АНТИТЕЛО И КОНЪЮГАТ АНТИ-CDH6-АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2023 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N15/63 C07K19/00 A61K39/395 A61P35/00 A61K47/68 

Область техники, к которой относится изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к анти-CDH6-антителу, связывающемуся с CDH6 и обладающему эффектом интернализации, способу получения анти-CDH6-антитела, конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело, противоопухолевому агенту, содержащему конъюгат антитело-лекарственное средство, и тому подобное.

Уровень техники

[0002] Кадгерины представляют собой гликопротеины, находящиеся на поверхности клеточных мембран и функционирующие в качестве молекул межклеточной адгезии посредством зависимого от ионов кальция связывания их N-концевых внеклеточных доменов или в качестве сигнальных молекул, ответственных за межклеточное взаимодействие. Классические кадгерины входят в суперсемейство кадгеринов и представляют собой однопроходные трансмембранные белки, состоящие из пяти внеклеточных доменов (доменов ЕС), одного трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Классические кадгерины подразделяются на семейство типа I, типичными представителями которого являются E-кадгерин и N-кадгерин, и семейство типа II соответственно гомологии их аминокислотных последовательностей.

[0003] Кадгерин-6 (CDH6) представляет однопроходный трансмембранный белок, состоящий из 790 аминокислот, который входит в семейство кадгеринов типа II, и этот белок имеет N-концевой внеклеточный и С-концевой внутриклеточный домены. Ген CDH6 человека впервые был клонирован в 1995 году (непатентный документ 1), и его последовательность может быть указана, например, идентификационными номерами NM_004932 и NP_004923 (NCBI).

[0004] CDH6 специфически экспрессируется в головном мозге или почках на стадии развития и, как сообщается, играет важную роль в формировании цепей центральной нервной системы (непатентные документы 2 и 3) и развитии нефронов в почке (непатентные документы 4 и 5). Экспрессия CDH6 в нормальных тканях взрослых людей локализуется в почечных канальцах, эпителиальных клетках желчных протоков и тому подобное.

[0002] Между тем известно, что CDH6 специфически сверхэкспрессируется в местах локализации опухолей при некоторых типах рака у взрослых. Сообщалось о корреляции экспрессии CDH6 с неблагоприятным прогнозом и его применимости в качестве опухолевого маркера для почечноклеточной карциномы человека, в частности, почечноклеточной светлоклеточной карциномы (непатентные документы 6 и 7). Также сообщалось о высокой экспрессии CDH6 при раке яичника человека (непатентный документ 8). Также сообщалось, что CDH6 участвует в эпителиально-мезенхимальном переходе при раке щитовидной железы человека (непатентный документ 9). Кроме того, сообщалось, что CDH6 также экспрессируется при раке желчных протоков человека и мелкоклеточном раке легкого человека (непатентные документы 12 и 13).

[0006] Рак является частой причиной смерти. Несмотря на то, что ожидается, что число больных раком возрастает по мере старения населения, потребности в лечении еще не были в достаточной степени удовлетворены. Проблемы, связанные с обычными химиотерапевтическими препаратами, заключаются в следующем: за счет их низкой избирательности химиотерапевтические препараты проявляют токсичность не только для опухолевых клеток, но и для нормальных клеток и, следовательно, имеют побочные эффекты; и химиотерапевтические препараты невозможно вводить в достаточных количествах и, таким образом, они не могут обеспечить в достаточной степени их действие. Следовательно, в последние годы были разработаны лекарственные средства с более высокоселективными молекулярными мишенями или лекарственные средства на основе антител, которые нацелены на молекулы, которые проявляют мутации или имеют высокий уровень экспрессии в опухолевых клетках, или специфические молекулы, вовлеченные в злокачественную трансформацию клеток.

[0007] Антитела обладают высокой стабильностью в крови и специфически связываются с их антигенами-мишенями. По этим причинам предполагается снижение побочных эффектов, и было разработано большое количество препаратов на основе антител, нацеленных на молекулы со сверхэкспрессией на поверхности опухолевых клеток. Одним из методов, основанных на специфическом связывании антител с антигенами, является применение конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). ADC представляет собой конъюгат, в котором антитело, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на поверхности опухолевых клеток и может интернализовать антиген в клетку посредством связывания, конъюгированное с лекарственным средством, обладающим цитотоксической активностью. ADC может эффективно доставлять лекарственное средство к опухолевым клеткам и, следовательно, можно ожидать, что он приведет к гибели опухолевых клеток, накапливая препарат в опухолевых клетках (непатентный документ 10 и патентные документы 1 и 2). В отношение ADC, то например, Адцетрис™ (брентуксимаб ведотин), содержащий моноклональное антитело против CD30, конъюгированное с монометилауристатином E, был одобрен для применения в качестве терапевтического лекарственного средства для лимфомы Ходжкина и анапластической крупноклеточной лимфомы. Кроме того, Кадсила™ (трастузумаб эмтанзин), содержащий моноклональное антитело против HER2, конъюгированное с эмтанзином, используется для лечения HER2-позитивного прогрессирующего или рецидивирующего рака молочной железы.

[0008] Особенности антигена-мишени, подходящего для ADC в качестве противоопухолевого лекарственного средства, заключаются в том, что: антиген специфически высоко экспрессируется на поверхности опухолевых клеток, но имеет низкую экспрессию или вообще не экспрессируется в нормальных клетках; антиген может быть интернализован в клетки; антиген не секретируется с поверхности клетки; и т.д. Способность антитела к интернализации зависит как от свойств антигена-мишени, так и антитела. Трудно предсказать антигенсвязывающий сайт, подходящий для интернализации, по молекулярной структуре мишени или предсказать антитело, обладающее высокой способностью к интернализации, исходя из силы связывания, физических свойств антитела и тому подобное. Следовательно, важной проблемой при разработке ADC, имеющего высокую эффективность, является получение антитела, обладающего высокой способностью к интернализации за счет связывания с антигеном-мишенью (непатентный документ 11).

[0009] ADC, включающий DM4, конъюгированный с антителом против CDH6, специфически связывающимся с доменом EC 5 (EC5) CDH6, известен ADC, нацеленный на CDH6, (патентный документ 3).

Перечень ссылок

Патентные документы

[0010]

Патентный документ 1: WO2014/057687

Патентный документ 2: US2016/0297890

Патентный документ 3: WO2016/024195

Непатентные документы

[0011]

Непатентный документ 1: Shimoyama Y. et al., Cancer Research, 2206-2211, 55, May 15, 1995

Непатентный документ 2: Inoue T. et al., Developmental Biology, 183-194, 1997

Непатентный документ 3: Osterhout J. A. et al., Neuron, 632-639, 71, Aug 25, 2011

Непатентный документ 4: Cho E. A. et al., Development, 803-812, 125, 1998

Непатентный документ 5: Mah S. P. et al., Developmental Biology, 38-53, 223, 2000

Непатентный документ 6: Paul R. et al., Cancer Research, 2741-2748, July 1, 57, 1997

Непатентный документ 7: Shimazui T. et al., Cancer, 963-968, 101(5), Sep.1, 2004

Непатентный документ 8: Koebel M. et al., PLoS Medicine, 1749-1760, 5(12), e232, Dec.2008

Непатентный документ 9: Gugnoni M. et al., Oncogene, 667-677, 36, 2017

Непатентный документ 10: Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016

Непатентный документ 11: Peters C. et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015

Непатентный документ 12: Goeppert B. et al., Epigenetics, 780-790, 11(11), 2016

Непатентный документ 13: Yokoi S. et al., American Journal of Pathology, 207-216, 161, 1, 2002.

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0012] Целью настоящего изобретения является обеспечение антитела, специфически связывающегося с CDH6 и обладающего высокой способностью к интернализации, конъюгата антитело-лекарственное средство, содержащего антитело и обладающего высокой противоопухолевой активностью, фармацевтического продукта, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство и обладающего терапевтическим действием на опухоль, способа лечения опухоли с использованием антитела, конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтического продукта и тому подобное.

Решение проблемы

[0013] Заявители настоящего изобретения провели интенсивные исследования, направленные на достижение вышеуказанной цели, и с удивлением обнаружили, что антитело, специфически связывающееся с внеклеточным доменом 3 (в настоящем описании также относящимся ЕС3) CDH6, обладает очень высокой способностью к интернализации в клетки, экспрессирующие CDH6, и пригодно в качестве антитела для ADC. Заявители настоящего изобретения также обнаружили, что конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство, включающий вышеуказанное анти-CDH6-антитело, конъюгированное с лекарственным средством, проявляющим токсичность в клетках, через линкер, имеющий специфическую структуру, проявляет более высокую противоопухолевую активность, чем обычные конъюгаты CDH6-лекарственное средство.

Настоящее изобретение включает следующие аспекты изобретения:

[1] антитело, специфически связывающееся с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4, и обладающее способностью к интернализации, которая обеспечивает поглощение клетками, или функциональный фрагмент антитела;

[2] антитело или функциональный фрагмент антитела по п.[1], которое обладает конкурентной ингибирующей активностью, за связывание с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4, по сравнению, по меньшей мере, с любым антителом, выбранным из группы, включающей следующие антитела (1)-(5):

(1) антитело, имеющее легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 53, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 56,

(2) антитело, имеющее легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 69,

(3) антитело, имеющее легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73,

(4) антитело, имеющее легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 65, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73, и

(5) антитело, имеющее легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 77;

[3] антитело или функциональный фрагмент антитела по пп. [1] или [2], которое включает CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в любой комбинации, выбранной из группы, включающей следующие комбинации (1)-(4):

(1) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 14,

(2) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 22, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 23, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 24,

(3) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 32, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 33, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 34, и

(4) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 42, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 43, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 44, и

CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в любой комбинации, выбранной из группы, включающей следующие комбинации (5)-(9):

(5) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 17, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 18, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 19,

(6) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 27, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 28, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 29,

(7) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 37, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 38, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 39,

(8) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 47, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 48, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 49, и

(9) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 17, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 60, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 19;

[4] антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]-[3], которое включает CDRL1, CDRL2 и CDRL3 и CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в любой комбинации, выбранной из группы, включающей следующие комбинации (1)-(5):

(1) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 14, и CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 17, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 18, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 19,

(2) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 22, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 23, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 24, и CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 27, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 28, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 29,

(3) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 32, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 33, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 34, и CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 37, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 38, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 39,

(4) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 42, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 43, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 44, и CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 47, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 48, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 49, и

(5) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 14, и CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 17, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 60, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 19;

[5] антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]-[4], которое является гуманизированным;

[6] антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]-[5], которое имеет любую вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из следующих вариабельных областей (1)-(4):

(1) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 63,

(2) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 67,

(3) аминокислотная последовательность, имеющая идентичность последовательности, по меньшей мере, 95% или более с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в аминокислотных последовательностях (1) и (2), и

(4) аминокислотная последовательность, содержащая делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательности каркасной области, отличной каждой от последовательности CDR в аминокислотных последовательностях (1)-(3), и

любая вариабельная область тяжелой цепи, выбранная из группы, состоящей из следующих вариабельных областей (5)-(9):

(5) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 71,

(6) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 75,

(7) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 79,

(8) аминокислотная последовательность, имеющая гомологию последовательности, по меньшей мере, 95% или более с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в аминокислотных последовательностях (5)-(7), и

(9) аминокислотная последовательность, содержащая делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательности каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в аминокислотных последовательностях (5)- (8);

[7] антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]-[6], которое содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи в любой из следующих комбинаций (1)-(4):

(1) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 63, и вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 71,

(2) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 63, и вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 75,

(3) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 67, и вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 75, и

(4) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 63, и вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 79;

[8] антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]-[7], которое имеет любую из следующих комбинаций (1)- (4):

(1) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 69,

(2) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73,

(3) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 65, и тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73, и

(4) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 77;

[9] антитело или функциональный фрагмент антитела по п.[8], которое имеет легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 69;

[10] антитело или функциональный фрагмент антитела по п.[8], которое имеет легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73;

[11] антитело или функциональный фрагмент антитела по п.[8], которое имеет легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 65, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73;

[12] антитело или функциональный фрагмент антитела по п.[8], которое имеет легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 77;

[13] функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]- [12], где функциональный фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab')₂, Fab' и Fv;

[14] полинуклеотид, кодирующий антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]-[13];

[15] полинуклеотид по п.[14], который включает полинуклеотиды в любой комбинации, выбранной из группы, включающей следующие комбинации (1)-(5):

(1) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 14, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 17, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 18, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 19,

(2) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 22, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 23, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 24, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 27, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 28, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 29,

(3) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 32, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 33, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 34, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 37, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 38, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 39,

(4) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 42, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 43, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 44, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 47, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 48, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 49, и

(5) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 14, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 17, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 60, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 19;

[16] полинуклеотид по пп.[14] или [15], который включает полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 69;

[17] полинуклеотид по пп.[14] или [15], который включает полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73;

[18] полинуклеотид по пп.[14] или [15], который включает полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 65, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73;

[19] полинуклеотид по пп.[14] или [15], который включает полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 77;

[20] экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.[14]-[19];

[21] клетки-хозяева, трансформированные экспрессионным вектором по п.[20];

[22] клетки-хозяева по п.[21], где клетки-хозяева представляют эукариотические клетки;

[23] способ получения представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела, который включает стадию культивирования клеток-хозяев по пп.[21] или [22] и стадию сбора представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела из культуры, полученной на вышеуказанной стадии;

[24] антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]-[13], где тяжелая цепь или легкая цепь подверглась одной, двум или более модификациям, выбранным из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, О-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, С-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, добавление остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина, превращения N-концевого глутамина или N-концевой глутаминовой кислоты в пироглутаминовую кислоту и делеции одной или двух аминокислот из карбоксильного конца;

[25] антитело по п.[24], где одна или две аминокислоты делецированы из карбоксильного конца его тяжелой цепи;

[26] антитело по п.[25], где одна аминокислота делецирована из каждого карбоксильного конца его обеих тяжелых цепей;

[27] антитело по любому из пп.[24]-[26], где остаток пролина на карбоксильном конце его тяжелой цепи дополнительно амидирован;

[28] антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]-[13] и [24]-[27], где модификация сахарных цепей регулируется с целью усиления антителозависимой клеточной цитотоксической активности;

[29] конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.[1]-[13] и [24]-[28], конъюгированное с лекарственным средством;

[30] конъюгат антитело-лекарственное средство по п.[29], где лекарственное средство представляет противоопухолевое соединение;

[31] конъюгат антитело-лекарственное средство по п.[30], где противоопухолевое соединение представляет собой противоопухолевое соединение, представленное следующей формулой:

[0015]

Формула 1

[0016]

[32] конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[31], где антитело конъюгировано с лекарственным средством через линкер, имеющий любую структуру, выбранную из группы, состоящей из следующих формул (а)-(f):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

(b) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

(d) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

(e) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-, и

(f) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

где антитело связано с концом -(сукцинимид-3-ил-N), противоопухолевое соединение связано с карбонильной группой -CH₂CH₂CH₂-C(=O)- (a), (b), (e) или (f), группа CH₂-O-CH₂-C(=O)- в (c) или группа CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)- в (d) с атомом азота аминогруппы в положении 1 в качестве соединительного положения, GGFG представляет аминокислотную последовательность, состоящую из глицин-глицин-фенилаланин-глицина, связанного через пептидные связи, и

-(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:

[0017]

Формула 2

[0018]

которая связана с антителом в его положении 3 и связана с метиленовой группой в линкерной структуре, содержащей эту структуру в атоме азота в положении 1;

[33] конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[32], где линкер представлен любой формулой, выбранной из группы, состоящей из следующих формул (с), (d) и (е):

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

(d) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-, и

(e) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-;

[34] конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[33], где линкер представлен следующей формулой (с) или (е):

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-, и

(e) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-;

[35] конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[34], который имеет структуру, представленную следующей формулой:

[0019]

Формула 3

[0020]

где AB представляет антитело или функциональный фрагмент антитела, n представляет среднее число звеньев структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, в расчете на антитело, и антитело связано с линкером через сульфгидрильную группу, происходящую из антитела;

[36] конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[34], который имеет структуру, представленную следующей формулой:

[0021]

Формула 4

[0022]

где AB представляет антитело или функциональный фрагмент антитела, n представляет среднее число звеньев структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, в расчете на антитело, и антитело связано с линкером через сульфгидрильную группу, происходящую из антитела;

[37] конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.29]-[36], где антитело представляет антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (1)-(4), или функциональный фрагмент антитела:

(1) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 69,

(2) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73,

(3) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 65, и тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 73, и

(4) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 77;

[38] конъюгат антитело-лекарственное средство по п.[37], где антитело представляет антитело, содержащее легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 69, или функциональный фрагмент антитела;

[39] конъюгат антитело-лекарственное средство по п.[37], где антитело представляет антитело, содержащее легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 61, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO: 77, или функциональный фрагмент антитела;

[40] конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[39], где тяжелая цепь или легкая цепь подверглись одной, двум или более модификациям, выбранным из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, О-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, С-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, добавление остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина, превращения N-концевого глутамина или N-концевой глутаминовой кислоты в пироглутаминовую кислоту и делеции одной или двух аминокислот из карбоксильного конца;

[41] конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[40], где среднее число звеньев выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, находится в диапазоне от 1 до 10;

[42] конъюгат антитело-лекарственное средство по п.[41], где среднее число звеньев выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, находится в диапазоне от 2 до 8;

[43] конъюгат антитело-лекарственное средство по п.[42], где среднее число звеньев выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, находится в диапазоне от 5 до 8;

[44] конъюгат антитело-лекарственное средство по п. [43], где среднее число звеньев выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, находится в диапазоне от 7 до 8;

[45] фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[44], его соль, или гидрат конъюгата или соль;

[46] фармацевтическая композиция по п.[45], которая представляет противоопухолевое лекарственное средство;

[47] фармацевтическая композиция по п.[46], где опухоль представляет опухоль, экспрессирующую CDH6;

[48] фармацевтическая композиция по пп.[46] или [47], где опухоль представляет почечноклеточную карциному, почечно-клеточную светлоклеточную карциному, папиллярную почечно-клеточную карциному, рак яичника, серозную аденокарциному яичника, рак щитовидной железы, рак желчных протоков, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, глиобластому, мезотелиому, рак матки, рак поджелудочной железы, опухоль Вильмса или нейробластому;

[49] способ лечения опухоли, который включает введение любого компонента, выбранного из конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[44], его соли, и гидрата конъюгата или соли, субъекту;

[50] способ лечения по п.[49], где опухоль представляет опухоль, экспрессирующую CDH6;

[51] способ лечения по пп.[49] или [50], где опухоль представляет почечноклеточную карциному, почечноклеточную светлоклеточную карциному, папиллярную почечноклеточную карциному, рак яичника, серозную аденокарциному яичника, рак щитовидной железы, рак желчных протоков, рак легкого, мелкоклеточный рак легких, глиобластому, мезотелиому, рак матки, рак поджелудочной железы, опухоль Вильмса или нейробластому;

[52] способ лечения опухоли, который включает введение фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один компонент, выбранный из конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.[29]-[44], его соли, и гидрата конъюгата или соли и, по меньшей мере, одного противоопухолевого лекарственного средства субъекту одновременно, отдельно или непрерывно;

[53] способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, который включает стадию взаимодействия антитела или функционального фрагмента антитела по любому из пп.[1]-[13] и [24]-[28], или антитела или функционального фрагмента антитела, полученного способом получения по п.[23] с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер; и

[54] способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, который включает стадию культивирования клеток-хозяев по пп.[21] или [22], стадию сбора представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела из культуры, полученной на вышеуказанной стадии, и стадию взаимодействия антитела или функционального фрагмента антитела, полученного на вышеуказанной стадии, с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер.

Преимущественные эффекты изобретения

[0023] Характерные признаки анти-CDH6-антитела по настоящему изобретению заключаются в том, что оно специфически распознает домен EC 3 (EC3) CDH6 и обладает высокой способностью к интернализации. Можно ожидать, что конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство, содержащий анти-CDH6-антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с лекарственным средством, проявляющим токсичность в клетках, через линкер, имеющий специфическую структуру, может достичь превосходного противоопухолевого эффекта и уровня безопасности при введении пациентам, имеющим опухолевые клетки, экспрессирующие CDH6. Конкретно, конъюгат анти-CDH6 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению пригоден в качестве противоопухолевого агента.

Краткое описание фигур

[0024] [Фиг. 1] На фиг. 1 приведены результаты проточной цитометрии исследования связывания четырех крысиных моноклональных анти-CDH6-антител (клоны № rG019, rG055, rG056 и rG061) или контрольного крысиного IgG с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 2-1] На фиг. 2-1 показана активность связывания четырех крысиных моноклональных анти-CDH6-антител (rG019, rG055, rG056 и rG061) или крысиного IgG2b антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными полноразмерным hCDH6. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток.

[Фиг.2-2] На фиг.2-2 показана активность связывания четырех крысиных моноклональных анти-CDH6-антител (rG019, rG055, rG056 и rG061) или контрольного крысиного IgG с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC1. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 2-3] На фиг. 2-3 показана активность связывания четырех крысиных моноклональных анти-CDH6-антител (rG019, rG055, rG056 и rG061) или контрольного крысиного IgG с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC2. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 2-4] На фиг. 2-4 показана активность связывания четырех крысиных моноклональных анти-CDH6-антител (rG019, rG055, rG056 и rG061) или контрольного крысиного IgG с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC3. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 2-5] На фиг. 2-5 показана активность связывания четырех крысиных моноклональных анти-CDH6-антител (rG019, rG055, rG056 и rG061) или контрольного крысиного IgG с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC4. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 2-6] На фиг. 2-6 показана активность связывания четырех крысиных моноклональных анти-CDH6-антител (rG019, rG055, rG056 и rG061) или контрольного крысиного IgG с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC5. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 3] На фиг. 3 показаны результаты проточной цитометрии для оценки экспрессии CDH6 на поверхности клеточной мембраны 4 типов клеточных линий опухолей человека (клеточные линии опухоли яичника человека NIH:OVCAR-3, PA-1 и ES-2 и клеточная линия почечноклеточной опухоли человека (786-O). На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 4] На фиг. 4 представлен график, на котором оценена способность к интернализации 4 типов крысиных анти-CDH6-антител (rG019, rG055, rG056 и rG061) или крысиного контрольного IgG оценивали на клетках NIH:OVCAR-3 и 786-O с использованием реагента Rat-ZAP против крысиного IgG, конъюгированного с токсином (сапорином), ингибирующего синтез белка, или козьего специфического Fc (гамма)-фрагмента против крысиного IgG, неконъюгированного с токсином, который использовали в качестве отрицательного контроля. На оси ординат график показывает активность ATP (RLU). Выживаемость клеток (%), рассчитанная в виде относительной выживаемости, где количество живых клеток в лунке с отрицательным контролем вместо Rat-ZAP было установлено на 100%, показана под каждым графиком.

[Фиг. 5] На фиг. 5 показано связывание химерного человеческого анти-CDH6-антитела chG019 с CDH6 человека и CDH6 обезьяны. На оси абсцисс показана концентрация антител, и на оси ординат показано количество связанных антител на основе средней интенсивности флуоресценции.

[Фиг. 6-1] На каждой фиг. 6-1 и 6-2 показана активность связывания четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02) или человеческого IgG1 антитела против CDH6 человека, CDH6 обезьяны, CDH6 мыши и CDH6 крысы, которое использовали в качестве отрицательного контроля. На оси абсцисс показана концентрация антитела, и на оси ординат показано количество связанного антитела на основе средней интенсивности флуоресценции.

[Фиг. 6-2] На каждой фиг. 6-1 и 6-2 показана активность связывания четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02) или человеческого IgG1 антитела против CDH6 человека, CDH6 обезьяны, CDH6 мыши и CDH6 крысы, которое использовали в качестве отрицательного контроля. На оси абсцисс показана концентрация антитела, и на оси ординат показано количество связанного антитела на основе средней интенсивности флуоресценции.

[Фиг. 7-1] На фиг. 7-1 показана активность связывания четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными полноразмерным hCDH6. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела. На оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 7-2] На фиг. 7-2 показана активность связывания четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC1. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела. На оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 7-3] На фиг. 7-3 показана активность связывания четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC2. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела. На оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 7-4] На фиг. 7-4 показана активность связывания четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC3. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела. На оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 7-5] На фиг. 7-5 показана активность связывания четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC4. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела. На оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 7-6] На фиг. 7-6 показана активность связывания четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, с контрольными клетками или клетками 293α, трансфицированными hCDH6 с делецированным EC5. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела. На оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 8] На фиг. 8 приведены результаты проточной цитометрии исследования экспрессии на клеточной линии 786-O/hCDH6, стабильно экспрессирующей человеческий CDH6, и ее родительской клеточной линиюи 786-O. На оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции Alexa Fluor 647, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток.

[Фиг. 9] На фиг. 9 показан анализ конкурентного связывания четырех немеченых гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, с использованием (а) меченого NOV0712 или (b) меченого H01L02. На оси абсцисс показана конечная концентрация добавленного немеченого антитела, и на оси ординат показано количество связанного антитела на основе средней интенсивности флуоресценции.

[Фиг. 10-1] На фиг. 10-1 представлен график, на котором оценена способность к интернализации четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, в клетки NIH:OVCAR-3 с использованием реагента Hum-ZAP против человеческого IgG, конъюгированного с токсином (сапорином), ингибирующим синтез белка, или F(ab')₂-фрагмента козьих антител против человеческого IgG, Fc (гамма)-специфический фрагмент, неконъюгированный с токсином в качестве отрицательного контроля. На оси ординат график показывает активность ATP (RLU). Выживаемость клеток (%), рассчитанная в виде относительной выживаемости, где количество живых клеток в лунке с отрицательным контролем вместо Hum-ZAP устанавливали на 100%, показана под каждым графиком.

[Фиг. 10-2] На фиг. 10-2 представлен график, на котором оценена способность к интернализации четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, в клетки 786-O с использованием реагента Hum-ZAP против человеческого IgG, конъюгированного с токсином (сапорином), ингибирующим синтез белка, или F(ab')₂-фрагмента козьих антител против человеческого IgG, Fc (гамма)-специфический фрагмент, неконъюгированный с токсином в качестве отрицательного контроля. На оси ординат графика показана активность ATP (RLU). Выживаемость клеток (%), рассчитанная в виде относительной выживаемости, где количество живых клеток в лунке с отрицательным контролем вместо Hum-ZAP установлена на 100%, показана под каждым графиком.

[Фиг. 10-3] На фиг. 10-3 приведен график, на котором оценена способность к интернализации четырех гуманизированных антител hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), анти-CDH6-антитела NOV0712 или hIgG1 антитела, которое использовали в качестве отрицательного контроля, в клетки PA-1 с использованием реагента Hum-ZAP против человеческого IgG, конъюгированного с токсином (сапорином), ингибирующим синтез белка, или F(ab')₂-фрагмента козьих антител против человеческого IgG, Fc (гамма)-специфический фрагмент, неконъюгированный с токсином в качестве отрицательного контроля. На оси ординат графика показана активность ATP (RLU). Выживаемость клеток (%), рассчитанная в виде относительной выживаемости, где количество живых клеток в лунке с отрицательным контролем вместо Hum-ZAP установлена на 100%, показана под каждым графиком.

[Фиг. 11] На фиг. 11 показаны результаты оценки активности ингибирования роста клеток in vitro четырех конъюгатов гуманизированное hG019-лекарственное средство (H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd и H04L02-DXd) или NOV0712-DM4 для клеток PA-1. На оси абсцисс показана концентрация конъюгата антитело-лекарственное средство, и на оси ординат показана выживаемость клеток (%).

[Фиг. 12] На фиг. 12 показаны противоопухолевые эффекты in vivo четырех конъюгатов гуманизированное hG019-лекарственное средство (H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd и H04L02-DXd) или NOV0712-DM4. Оценку проводили с использованием животных моделей, где CDH6-позитивную клеточную линию почечноклеточной опухоли человека 786-O инокулировали иммунодефицитным мышам. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение стандартной ошибки (SE).

[Фиг. 13] На фиг. 13 показаны противоопухолевые эффекты in vivo конъюгата гуманизированное hG019-лекарственное средство H01L02-DXd или NOV0712-DM4 или NOV0712-DXd. Оценку проводили с использованием животных моделей, где CDH6-позитивную клеточную линию опухоли яичника человека PA-1 инокулировали иммунодефицитным мышам. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение стандартной ошибки (SE).

[Фиг. 14] На фиг. 14 показаны противоопухолевые эффекты in vivo конъюгата гуманизированное hG019-лекарственное средство H01L02-DXd или NOV0712-DM4. Оценку проводили с использованием животных моделей, где CDH6-положительную клеточную линию опухоли яичника человека NIH:OVCAR-3 инокулировали иммунодефицитным мышам. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение стандартной ошибки (SE).

[Фиг. 15] На фиг.15 показаны противоопухолевые эффекты in vivo конъюгата гуманизированное hG019-лекарственное средство H01L02-DXd или NOV0712-DM4. Оценку проводили с использованием животных моделей, где CDH6-позитивную клеточную линию почечноклеточной опухоли человека 786-O инокулировали иммунодефицитным мышам. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение стандартной ошибки (SE).

[Фиг. 16] На фиг. 16 показаны противоопухолевые эффекты in vivo конъюгата гуманизированное hG019-лекарственное средство H01L02-DXd или NOV0712-DM4. Оценку проводили с использованием животных моделей, где CDH6-негативную клеточную линию опухоли яичника человека ES-2 инокулировали иммунодефицитным мышам. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение стандартной ошибки (SE).

Описание вариантов осуществления

[0025] Далее будут описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения со ссылкой на фигуры. Следует отметить, что варианты осуществления, описанные ниже, просто иллюстрируют репрезентативные варианты осуществления настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не должен толковаться узко к этим примерам.

[0026] В настоящем описании термин «рак» используется как имеющий тоже значение, что и термин «опухоль».

[0027] В настоящем описании термин «ген» используется для включения не только ДНК, но также ее мРНК и кДНК, и их кРНК.

[0028] В настоящем описании термин «полинуклеотид» или «нуклеотид» используется как имеющий тоже значение, что и нуклеиновая кислота, и также включает ДНК, РНК, зонд, олигонуклеотид и праймер. В настоящем описании термины «полинуклеотид» и «нуклеотид» могут использоваться взаимозаменяемо друг с другом, если не указано иное.

[0029] В настоящем описании термины «полипептид» и «белок» могут использоваться взаимозаменяемо друг с другом.

[0030] В настоящем описании термин «клетка» включает клетки индивидуального животного и культивируемые клетки.

[0031] В настоящем описании термин «CDH6» может использоваться как имеющий тоже значение, что и белок CDH6. В настоящем описании человеческий CDH6 также упоминается как «hCDH6».

[0032] В настоящем описании термин «цитотоксическая активность» используется для обозначения того, что патологическое изменение в клетках вызвано любым данным способом. Термин не только означает прямую травму, но также означает все типы структурных или функциональных повреждений, вызванных в клетках, таких как расщепление ДНК, образование димера оснований, расщепление хромосом, повреждение клеточного митотического аппарата и снижение активности различных типов ферментов.

[0033] В настоящем описании выражение «проявляющаяся токсичность в клетках» используется для обозначения того, что токсичность проявляется в клетках любым конкретным способом. Термин означает не только прямую травму, но также означает все типы структурных, функциональных или метаболических воздействий, вызываемых для клеток, таких как расщепление ДНК, образование димера оснований, расщепление хромосомы, повреждение клеточного митотического аппарата, снижение активности различных типов ферментов и подавление эффектов факторов роста клеток.

[0034] В настоящем описании термин «функциональный фрагмент антитела», также называемый «антигенсвязывающим фрагментом антитела», используется для обозначения частичного фрагмента антитела, обладающего связывающей активностью в отношении антигена, и включает Fab, F(ab')₂, scFv, диатело, линейное антитело и мультиспецифическое антитело, образованное из фрагментов антитела, и тому подобное. Fab', который представляет собой моновалентный фрагмент из вариабельных областей антитела, полученный обработкой F(ab')₂ в восстанавливающих условиях, также включается в термин «антигенсвязывающий фрагмент антитела». Однако антигенсвязывающий фрагмент антитела не ограничивается этими молекулами при условии, что антигенсвязывающий фрагмент обладает антигенсвязывающей способностью. Эти антигенсвязывающие фрагменты включают не только фрагменты, полученные обработкой полноразмерной молекулы белка антитела соответствующим ферментом, но и белки, продуцированные в соответствующих клетках-хозяевах с использованием генно-инженерного гена антитела.

[0035] В настоящем описании термин «эпитоп» используется для обозначения частичного пептида или частичной трехмерной структуры CDH6, с которой связывается специфическое анти-CDH6-антитело. Такой эпитоп, который является вышеописанным частичным пептидом CDH6, можно определить методом, хорошо известным специалистам в данной области, таким как иммуноанализ. Во-первых, создаются различные частичные структуры антигена. В отношении получения таких частичных структур, то можно использовать известный метод синтеза олигопептидов. Например, получают ряд полипептидов, где CDH6 был последовательно усечен на соответствующую длину от его С-конца или N-конца, с помощью метода генетической рекомбинации, хорошо известного специалистам в данной области. Затем оценивают реактивность антитела к таким полипептидам, и грубо определяют сайты узнавания. Затем синтезируют дополнительные более короткие пептиды, и далее можно оценить их реактивность по отношению к этим пептидам, чтобы определить эпитоп. Когда антитело, связывающееся с мембранным белком, имеющим множество внеклеточных доменов, направлено на трехмерную структуру, состоящую из множества доменов в качестве эпитопа, то домен, с которым связывается антитело, можно определить модификацией аминокислотной последовательности специфического внеклеточного домена и тем самым модификацией трехмерной структуры. Эпитоп, который представляет собой частичную трехмерную структуру антигена, который связывается со специфическим антителом, также можно установить путем определения аминокислотных остатков антигена, смежных с антителом, с помощью рентгеноструктурного анализа.

[0036] В настоящем описании выражение «антитела, связывающиеся с одним и тем же эпитопом» используется для обозначения антител, которые связываются с общим эпитопом. Если второе антитело связывается с частичным пептидом или частичной трехмерной структурой, с которой связывается первое антитело, то можно заключить, что первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом. Альтернативно, подтверждая, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание первого антитела с антигеном (т.е. второе антитело препятствует связыванию первого антитела с антигеном), можно заключить, что первое антитело и второе антитело связывается с одним и тем же эпитопом, даже если конкретная последовательность или структура эпитопа не была определена. В настоящем описании выражение «связывание с одним и тем же эпитопом» относится к случаю, когда определено, что первое антитело и второе антитело связываются с общим эпитопом, с использованием любого из указанных двух методов определения или обоих методов. Когда первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом и, кроме того, первое антитело обладает специфическими эффектами, такими как противоопухолевая активность или способность к интернализации, то можно ожидать, что второе антитело будет иметь такую же активность, что и первое антитело.

[0037] В настоящем описании термин «CDR» используется для обозначения определяющего комплементарность участка. Известно, что тяжелая цепь и легкая цепь молекулы антитела каждая имеет три CDR. Такой CDR также называют гипервариабельным участком, и он располагается в вариабельных областях тяжелой цепи и легкой цепи антитела. Эти области имеют особенно высоковариабельную первичную структуру и разделены на три сайта в первичной структуре полипептидной цепи в каждой тяжелой цепи и легкой цепи. В настоящем описании в отношении CDR антитела, то CDR тяжелой цепи обозначаются как CDRH1, CDRH2 и CDRH3 соответственно с аминоконцевой стороны аминокислотной последовательности тяжелой цепи, тогда как CDR легкой цепи обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3 соответственно с аминоконцевой стороны аминокислотной последовательности легкой цепи. Эти сайты располагаются близко друг к другу в трехмерной структуре и определяют специфичность антитела к антигену, с которым антитело связывается.

[0038] В настоящем изобретении выражение «гибридизация в жестких условиях» используется для обозначения того, что гибридизация проводится в коммерчески доступном гибридизационном буфере ExpressHyb Hybridization Solution (производства Clontech Laboratories, Inc.) при 68°C, или что гибридизацию проводят в условиях, в которых гибридизацию проводят с использованием фильтра с иммобилизованной ДНК в присутствии 0,7-1,0 М NaCl при 68°С, и затем полученный продукт промывают при 68°С раствором SSC с 0,1-2-кратной концентрацией (где 1-кратная концентрация SSC представляет 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия) для идентификации, или в условиях, эквивалентных этим.

[0039] В настоящем описании термин «от одного до нескольких» используется для обозначения от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или 1 или 2.

[0040] 1. CDH6

Кадгерины представляют собой гликопротеины, находящиеся на поверхности клеточных мембран и функционирующие в качестве молекул межклеточной адгезии посредством ион-зависимого связывания их N-концевых внеклеточных доменов, или в качестве сигнальных молекул, ответственных за межклеточное взаимодействие. Классические кадгерины входят в суперсемейство кадгеринов и представляют однопроходные трансмембранные белки, состоящие из пяти внеклеточных доменов (доменов ЕС), одной трансмембранной области и внутриклеточного домена.

[0041] CDH6 (кадгерин-6) представляет собой однопроходный трансмембранный белок, состоящий из 790 аминокислот, который относится к семейству кадгеринов типа II, и этот белок имеет N-концевые внеклеточные и С-концевые внутриклеточные домены. Ген CDH6 человека впервые был клонирован в 1995 году (непатентный документ 1), и его последовательность может быть указана, например, идентификационными номерами NM_004932 и NP_004923 (NCBI).

[0042] Белок CDH6, используемый в настоящем изобретении, можно непосредственно выделить из клеток, экспрессирующих CDH6 человека или млекопитающего, отличного от человека (например, крысы, мыши или обезьяны), и затем можно использовать, или можно приготовить фракцию клеточных мембран вышеуказанных клеток и ее можно использовать в качестве белка CDH6. Альтернативно, CDH6 также можно получить его синтезом in vitro или обеспечением клеткам-хозяевам возможности продуцировать CDH6 посредством генетических манипуляций. В соответствии с такими генетическими манипуляциями белок CDH6 можно получить, в частности, включением кДНК CDH6 в вектор, способный экспрессировать кДНК CDH6, и затем синтезом CDH6 в растворе, содержащем ферменты, субстрат и энергетические вещества, необходимые для транскрипции и трансляции, или трансформацией клеток-хозяев других прокариот или эукариот для обеспечения им возможности экспрессировать CDH6. Кроме того, для представления белка CDH6 можно использовать клетки, экспрессирующие CDH6, на основе вышеописанной генетической манипуляции, или клеточную линию, экспрессирующую CDH6. Альтернативно, экспрессионный вектор, в который была встроена кДНК CDH6, можно непосредственно ввести животному, которое должно быть иммунизировано, и CDH6 может быть экспрессирован в организме животного, иммунизированного таким образом.

[0043] Кроме того, белок, который состоит из аминокислотной последовательности, содержащей замену, делецию и/или добавление одной или более аминокислот в вышеописанной аминокислотной последовательности CDH6, и обладает биологической активностью, эквивалентной биологической активности белка CDH6, также включается в термин «CDH6».

[0044] Белок CDH6 человека имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1. Внеклеточная область белка человеческого CDH6 состоит из внеклеточного домена 1 (в настоящем описании также обозначаемого как EC1), имеющего аминокислотную последовательность в положениях 54-159 в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, внеклеточного домена 2 (в настоящем описании также обозначаемого как EC2), имеющего аминокислотную последовательность в положениях 160-268 в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, внеклеточного домена 3 (в настоящем описании также обозначаемого как EC3), имеющего аминокислотную последовательность в положениях 269-383 в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, внеклеточного домена 4 (в настоящем описании также обозначаемого как EC4), имеющего аминокислотную последовательность в положениях 384-486 в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, и внеклеточного домена 5 (в настоящем описании также обозначаемого как EC5), имеющего аминокислотную последовательность в положениях 487-608 в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1. Аминокислотные последовательности EC1-EC5 показаны в SEQ ID NO: 2-6 соответственно (таблица 1).

[0045] 2. Получение анти-CDH6-антитела

Один пример анти-CDH6-антитела по настоящему изобретению может включать анти-CDH6-антитело, которое распознает аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, и обладает способностью к интернализации. Один пример анти-CDH6-антитела по настоящему изобретению может включать анти-CDH6-антитело, которое специфически распознает аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, и обладает способностью к интернализации. Один пример анти-CDH6-антитела по настоящему изобретению может включать анти-CDH6-антитело, которое распознает аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, и обладает способностью к интернализации. Один пример анти-CDH6-антитела по настоящему изобретению может включать анти-CDH6-антитело, которое специфически распознает аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, и обладает способностью к интернализации. Выражение «специфически распознавать аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4» или «специфически распознавать домен EC3» применительно к антителу, используется для обозначения того, что антитело строго распознает или сильно связывается с EC3-доменом CDH6 по сравнению с другими внеклеточными доменами CDH6.

[0046] Анти-CDH6-антитело по настоящему изобретению может быть получено из любого вида. Предпочтительные примеры видов могут включать людей, обезьян, крыс, мышей и кроликов. Когда анти-CDH6-антитело по настоящему изобретению происходит от вида, отличного от человека, то предпочтительно подвергнуть анти-CDH6-антитело химеризации или гуманизации хорошо известным способом. Антитело по настоящему изобретению может представлять собой поликлональное антитело или может быть моноклональным антителом, и моноклональное антитело является предпочтительным.

[0047] Анти-CDH6-антитело по настоящему изобретению представляет антитело, которое может нацеливать на опухолевые клетки. В частности, анти-CDH6-антитело по настоящему изобретению обладает способностью распознавать опухолевые клетки, способностью связываться с опухолевыми клетками и/или способностью к интернализации в опухолевые клетки в результате клеточного поглощения и тому подобное. Следовательно, анти-CDH6-антитело по настоящему изобретению можно конъюгировать с соединением, обладающим противоопухолевой активностью, через линкер с получением конъюгата антитело-лекарственное средство.

[0048] Активность связывания антитела с опухолевыми клетками можно подтвердить проточной цитометрией. Проникновение антитела в опухолевые клетки можно подтверить (1) анализом визуализации поглощенного клеткой антитела под флуоресцентным микроскопом с использованием вторичного антитела (флуоресцентно меченного), связывающегося с антителом (Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761), (2) анализом измерения количества поглощенной клеткой флуоресценции с использованием вторичного антитела (флуоресцентно меченного), связывающегося с антителом (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004) или (3) анализом Mab-ZAP с использованием иммунотоксина, связывающегося с антителом, где токсин высвобождается при поглощении клетками с подавлением роста клеток (Bio Techniques 28: 162-165, January 2000). В качестве иммунотоксина можно использовать рекомбинантный конъюгированный белок каталитической области дифтерийного токсина и протеина G.

[0049] В настоящем описании выражение «высокая способность к интернализации» используется для обозначения того, что выживаемость (показателем которой является относительная выживаемость клеток без добавления антител, которую принимают за 100%) клеток, экспрессирующих CDH6, в которые ввели вышеуказанное антитело и меченное сапорином антитело против крысиного IgG, предпочтительно составляет 70% или ниже, и более предпочтительно 60% или ниже.

[0050] Конъюгат антитело-противоопухолевое лекарственное средство по настоящему изобретению содержит конъюгированное соединение, оказывающее противоопухолевый эффект. Следовательно, предпочтительно, но не обязательно, чтобы само антитело обладало противоопухолевым эффектом. В целях специфического и/или избирательного проявления цитотоксичности противоопухолевого соединения в опухолевых клетках важно и предпочтительно, чтобы антитело обладало способностью к интернализации и переносу в опухолевые клетки.

[0051] Анти-CDH6-антитело можно получить иммунизацией животного полипептидом, служащим в качестве антигена, способом, обычно используемым в этой области, и затем сбором и очисткой антитела, продуцированного в живом организме. В качестве антигена предпочтительно использовать CDH6, сохраняющий трехмерную структуру. Примеры такого способа могут включать метод ДНК-иммунизации.

[0052] Происхождение антигена не ограничивается человеком, и, таким образом, животное также можно иммунизировать антигеном, полученным от животного, отличного от человека, такого как мышь или крыса. В этом случае антитело, которое используется для лечения заболевания человека, может быть выбрано с проведением оценки перекрестной реактивности полученного антитела, связывающегося с гетерологичным антигеном, с человеческим антигеном.

[0053] Кроме того, клетки, продуцирующие антитела, которые продуцируют антитело против антигена, могут быть слиты с миеломными клетками в соответствии с известным способом (например, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497; и Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, NY (1980)) для создания гибридом, чтобы получить моноклональное антитело.

[0054] Далее будет конкретно описан способ получения анти-CDH6-антитела.

[0055] (1) Получение антигена

Антиген можно получить обеспечением клеткам-хозяевам возможности продуцировать ген, кодирующий антигенный белок, в соответствии с генетическими манипуляциями. В частности, получают вектор, способный экспрессировать ген антигена, и затем этот вектор вводят в клетки-хозяева, так что ген экспрессируется в них, и после этого экспрессированный антиген может быть выделен. Антитело также можно получить методом иммунизации животного клетками, экспрессирующими антиген, на основе описанной выше генетической манипуляции, или клеточной линией, экспрессирующей антиген.

[0056] Альтернативно, антитело также можно получить без использования антигенного белка включением кДНК антигенного белка в экспрессионный вектор, затем введением экспрессионного вектора животному, которого следует иммунизировать, и экспрессией антигенного белка в организме животного, которого следует иммунизировать, так что в нем синтезируется антитело против антигенного белка.

[0057] (2) Получение моноклонального анти-CDH6-антитела

Анти-CDH6-антитело, использованное в настоящем изобретении, особым образом не ограничивается. Например, антитело с аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей в настоящей заявке, может быть подходящим образом использовано. Анти-CDH6-антитело, используемое в настоящем изобретении, желательно представляет собой антитело, имеющее следующие свойства:

(1) антитело, имеющее следующие свойства:

(а) специфически связывается с CDH6, и

(b) обладает способностью к интернализации в клетки, экспрессирующие CDH6, посредством связывания с CDH6;

(2) антитело по п.(1) выше, где CDH6 представляет собой человеческий CDH6; или

(3) антитело по п.(1) или (2), где антитело специфически распознает EC3 человеческого CDH6 и обладает способностью к интернализации.

Способ получения анти-CDH6-антитела по настоящему изобретению особым образом не ограничивается при условии, что можно получить анти-CDH6-антитело. В качестве антигена предпочтительно использовать CDH6, сохраняющий его конформацию.

[0058] Один предпочтительный пример способа получения антитела может включать способ ДНК-иммунизации. Способ ДНК-иммунизации представляет собой подход, который включает трансфекцию животного-субъекта (например, мыши или крысы) плазмидой, экспрессирующей антиген, и затем экспрессию антигена у субъекта для индукции иммунитета против антигена. Подход с трансфекцией включает прямое введение плазмиды в мышцу, инъекцию реагента для трансфекции, такого как липосома или полиэтиленимин, в вену, подход с использованием вирусного вектора, подход с введением частиц золота, присоединенных к плазмиде, с использованием генной пушки, гидродинамический метод с быстрым введением раствора плазмиды в большом количестве в вену и тому подобное. В отношение метода трансфекции инъекцией экспрессионной плазмиды в мышцу, то известен способ, называемый электропорацией in vivo, который включает применение электропорации в месте внутримышечной инъекции плазмиды, в качестве подхода для повышения уровней экспрессии (Aihara H., Miyazaki J., Nat. Biotechnol. 1998 Sep.; 16 (9): 867-70 or Mir L.M., Bureau M.F., Gehl J., Rangara R., Rouy D., Caillaud J.M., Delaere P., Branellec D., Schwartz B., Scherman D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999 Apr. 13; 96 (8): 4262-7). В данном подходе уровень экспрессии дополнительно повышается обработкой мышцы гиалуронидазой перед внутримышечной инъекцией плазмиды (McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther. 2001 Aug; 8 (16): 1264-70). Кроме того, получение гибридомы может быть выполнено известным способом, и также может быть осуществлено, например, с использованием системы Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences, Inc.).

[0059] Конкретные примеры получения моноклонального антитела могут включать следующие процедуры:

(a) иммунный ответ можно индуцировать включением кДНК CDH6 в экспрессионный вектор (например, pcDNA3.1; Thermo Fisher Scientific Inc.) и непосредственным введением вектора животному (например, крысе или мыши), подлежащих иммунизации с помощью такого метода, как электропорация или генная пушка, для экспрессии CDH6 в организме животного. Введение вектора электропорацией или тому подобное можно выполнить один или более раз, предпочтительно несколько раз, если это необходимо для повышения титра антител;

(b) сбор ткани (например, лимфатического узла), содержащей клетки, продуцирующие антитела, от вышеуказанного животного, у которого индуцирован иммунный ответ;

(с) получение клеток миеломы (далее по тексту называемых «миеломами») (например, клеток мышиной миеломы SP2/0-ag14);

(d) клеточное слияние клеток, продуцирующих антитела, и миеломы;

(е) отбор группы гибридомы, продуцирующей интересующее антитело;

(е) разделение на отдельные клеточные клоны (клонирование);

(g) необязательно культивирование гибридом для массовой продукции моноклональных антител или разведение животных, которым были инокулированы гибридомы; и/или

(h) изучение физиологической активности (способности к интернализации) и специфичности связывания полученного таким образом моноклонального антитела, или исследование свойств антитела в качестве реагента для мечения.

[0060] Примеры способа измерения титра антител, используемого здесь, могут включать, не ограничиваясь этим, проточную цитометрию и Cell-ELISA.

[0061] Примеры полученного таким образом штамма гибридомы могут включать гибридомы, продуцирующие анти-CDH6-антитела, rG019, rG055, rG056 и rG061. Следует отметить, что в настоящем описании антитело, продуцированное гибридомой rG019, продуцирующей анти-CDH6-антитело, обозначается как «антитело rG019» или просто «rG019», антитело, продуцированное гибридомой rG055, обозначается как «антитело rG055» или просто «rG055», антитело, продуцированное гибридомой rG056, обозначается как «антитело rG056» или просто «rG056», антитело, продуцированное гибридомой rG061, обозначается как «антитело rG061» или просто «rG061».

[0062] Вариабельная область легкой цепи антитела rG019 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rG019 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 11. Вариабельная область легкой цепи антитела rG019 имеет CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности кислоты, показанной в SEQ ID NO: 14. Вариабельная область тяжелой цепи антитела rG019 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rG019 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16. Вариабельная область тяжелой цепи антитела rG019 имеет CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 17, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 18, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 19. Последовательность антитела rG019 показана в таблице 1.

[0063] Вариабельная область легкой цепи антитела rG055 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 20. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rG055 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID. NO: 21. Вариабельная область легкой цепи антитела rG055 имеет CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 22, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 23, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 24. Вариабельная область тяжелой цепи антитела rG055 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 25. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rG055 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 26. Вариабельная область тяжелой цепи антитела rG055 имеет CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 27, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 28, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 29. Последовательность антитела rG055 показана в таблице 1.

[0064] Вариабельная область легкой цепи антитела rG056 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 30. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rG056 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 31. Вариабельная область легкой цепи антитела rG056 имеет CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 32, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 33, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 34. Вариабельная область тяжелой цепи антитела rG056 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 35. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rG056 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 36. Вариабельная область тяжелой цепи антитела rG056 имеет CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 37, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 38, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 39. Последовательность антитела rG056 показана в таблице 1.

[0061] Вариабельная область легкой цепи антитела rG061 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 40. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела rG061 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 41. Вариабельная область легкой цепи антитела rG061 имеет CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 42, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 43, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 44. Вариабельная область тяжелой цепи антитела rG061 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 45. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела rG061 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 46. Вариабельная область тяжелой цепи антитела rG061 имеет CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 47, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 48, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 49. Последовательность антитела rG061 показана в таблице 1.

[0066] Кроме того, в случае, когда стадии (a)-(h) в приведенном выше разделе «2. Получение антит-CDH6-антитела» проводят повторно для получения независимо моноклонального антитела отдельно, и также в случае, когда моноклональное антитело получают отдельно другими способами, то можно получить антитело, обладающее способностью к интернализации, эквивалентной активности антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056 или антитела rG061. Один пример такого антитела может включать антитело, связывающееся с тем же эпитопом, с которым связывается антитело rG019, антитело rG055, антитело rG056 или антитело rG061. Если вновь полученное моноклональное антитело связывается с частичным пептидом или частичной трехмерной структурой, с которой связывается антитело rG019, антитело rG055, антитело rG056 или антитело rG061, то можно заключить, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело rG019, антитело rG055, антитело rG056 или антитело rG061. Кроме того, подтверждая, что моноклональное антитело конкурирует с антителом rG019, антителом rG055, антителом rG056 или антителом rG061 за связывании антитела с CDH6 (т. е. моноклональное антитело препятствует связыванию антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056 или антитела rG061 с CDH6) можно заключить, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, с которым связывается анти-CDH6-антитело, даже если конкретная последовательность или структура эпитопа не была определена. Когда подтверждается, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело rG019, антитело rG055, антитело rG056 или антитело rG061, то тогда настоятельно предполагается, что моноклональное антитело должно обладать антигенсвязывающей способностью, биологической активностью и/или способностью к интернализации, эквивалентной активности антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056 или антитела rG061.

[0067] (3) Другие антитела

Антитело по настоящему изобретению также включает генетически рекомбинантные антитела, которые были искусственно модифицированы с целью снижения гетерогенной антигенности для человека, такие как химерное антитело, гуманизированное антитело и человеческое антитело, а также вышеописанное моноклональное анти-CDH6-антитело. Эти антитела можно получить известными способами.

[0068] Пример химерного антитела может включать антитела, в которых вариабельная область и константная область являются гетерологичными друг для друга, такие как химерное антитело, образованное конъюгированием вариабельной области мышиного или крысиного антитела с константной областью человеческого антитела (см. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)).

[0069] Примеры химерного антитела, полученного из крысиного антитела против человеческого CDH6, включают антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи каждого крысиного антитела против человеческого CDH6, раскрытого в настоящем описании (например, антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056 или антитела rG061), и константную область человеческого происхождения и тяжелую цепь, содержащую его вариабельную область тяжелой цепи и константную область человеческого происхождения.

[0070] Другие примеры химерного антитела, полученного из крысиного антитела против человеческого CDH6, включают антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, имеющую замену от одного до нескольких остатков, 1-3 остатков, 1 или 2 остатков, предпочтительно 1 остатка, аминокислот в вариабельной области легкой цепи каждого крысиного антитела против человеческого CDH6, раскрытого в настоящем описании (например, антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056 или антитела rG061), другими аминокислотными остатками, и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, имеющую замену от одного до нескольких остатков, 1-3 остатков, 1 или 2 остатков, предпочтительно 1 остатка, аминокислот в его вариабельной области тяжелой цепи другими аминокислотными остатками. Это антитело может иметь любую данную человеческую константную область.

[0071] Другие примеры химерного антитела, полученного из крысиного антитела против человеческого CDH6, включают антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, имеющую замену 1 или 2 остатков, предпочтительно 1 остатка, аминокислот в любом 1-3 CDR в вариабельной области легкой цепи каждого крысиного антитела против человеческого CDH6, раскрытого в настоящем описании (например, антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056 или антитела rG061) другими аминокислотными остатками, и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, имеющую замену 1 или 2 остатков, предпочтительно 1 остатка, аминокислот в любых 1-3 CDR в его вариабельной области тяжелой цепи другими аминокислотными остатками. Это антитело может иметь любую данную человеческую константную область.

[0072] Примеры химерного антитела, полученного из антитела rG019, включают антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15. Это антитело может иметь любую данную человеческую константную область.

[0073] Другие примеры химерного антитела, полученного из антитела rG019, включают антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, имеющую замену от одного до нескольких остатков, 1-3 остатков, 1 или 2 остатков, предпочтительно 1 остатка, аминокислот в вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, другими аминокислотными остатками, и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, имеющую замену от одного до нескольких остатков, 1-3 остатков, 1 или 2 остатков, предпочтительно 1 остатка, аминокислот в вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15, другими аминокислотными остатками. Это антитело может иметь любую данную человеческую константную область.

[0074] Другие примеры химерного антитела, полученного из антитела rG019, включают антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, имеющую замену 1 или 2 остатков (предпочтительно 1 остатка) аминокислот в любых 1-3 CDR в вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, другими аминокислотными остатками, и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, имеющую замену 1 или 2 остатков (предпочтительно 1 остатка) аминокислот в любых 1-3 CDR в вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15, другими аминокислотными остатками. Это антитело может иметь любую данную человеческую константную область.

[0075] Другие примеры химерного антитела, полученного из антитела rG019, включают антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 58. Это антитело может иметь любую данную человеческую константную область. Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 58, представляет последовательность с остатком цистеина, замещенным остатком пролина в CDRH2 в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15.

[0076] Конкретные примеры химерного антитела, полученного из антитела rG019, включают антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 53, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 56. В настоящем описании это химерное антитело против человеческого CDH6 обозначается как «химерное антитело G019», «антитело chG019» или «chG019». Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи антитела chG019 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 54, и аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи антитела chG019 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 57.

[0077] Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела chG019 идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи антитела rG019 и состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10. Легкая цепь антитела chG019 имеет CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13, и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 14, которые идентичны CDRL1, CDRL2 и CDRL3 легкой цепи соответственно rG019. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела chG019 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 55.

[0078] Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела chG019 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 58. Тяжелая цепь антитела chG019 имеет CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID. NO: 17, CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 60, и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 19. Аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 58, представляет собой последовательность с остатком цистеина, замещенным остатком пролина в CDRH2 в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15. CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 60, представляет последовательность с остатком цистеина, замещенным остатком пролина в CDRH2 антитела rG019, показанную в SEQ ID NO: 18. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела chG019 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 59.

[0079] Последовательность антитела chG019 показана в таблице 1.

[0080] Примеры химерного антитела, полученного из крысиного антитела против человеческого CDH6, антитела rG055, включают химерное антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 20, и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 25. Это антитело может иметь любую данную человеческую константную область.

[0081] Примеры химерного антитела, полученного из крысиного антитела против человеческого CDH6 антитела rG056, включают химерное антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 30, и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 35. Это антитело может иметь любую данную человеческую константную область.

[0082] Примеры химерного антитела, полученного из крысиного антитела против человеческого CDH6 антитела rG061, включают химерное антитело, состоящее из легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 40, и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 45. Это антитело может иметь любую данную человеческую константную область.

[0083] Примеры гуманизированного антитела могут включать антитело, образованное включением только определяющих комплементарность участков (CDR) в антитело человеческого происхождения (см. Nature (1986) 321, p. 522-525), антитело, образованное включением аминокислотных остатков из некоторых каркасов, а также последовательности CDR, в человеческое антитело с использованием метода CDR-прививки (публикация международной заявки WO90/07861) и антитело, образованное модификацией аминокислотных последовательностей некоторых CDR при сохранении антигенсвязывающей способности.

[0084] В настоящем описании гуманизированное антитело, полученное из антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056, антитела rG061 или антитела chG019, не ограничивается конкретным гуманизированным антителом при условии, что гуманизированное антитело сохраняет последовательности всех 6 CDR, уникальные для антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056, антитела rG061 или антитела chG019 и обладает способностью к интернализации. Аминокислотные последовательности некоторых CDR такого гуманизированного антитела можно дополнительно модифицировать при условии, что оно обладает способностью к интернализации.

[0085] Конкретные примеры гуманизированного антитела chG019 могут включать любую данную комбинацию: легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (1) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 63 или 67, (2) аминокислотной последовательности, имеющей идентичность, по меньшей мере, 95% или более (предпочтительно аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности, по меньшей мере, 95% или более, с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR) с вышеописанной аминокислотной последовательностью (1), и (3) аминокислотной последовательности, включающей делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в вышеуказанной аминокислотной последовательности (1); и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (4) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 71, 75 или 79, (5) аминокислотной последовательности, имеющей идентичность, по меньшей мере, 95% или более (предпочтительно аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности, по меньшей мере, 95% или более с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR) с вышеописанной аминокислотной последовательностью (4), и (6) аминокислотной последовательности, включающей делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в вышеописанной аминокислотной последовательности (4).

[0086] Альтернативно, также можно использовать антитело, имеющее гуманизированную тяжелую цепь или легкую цепь, и другую цепь, полученную из крысиного антитела или химерного антитела. Примеры такого антитела могут включать любую данную комбинацию: легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (1) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 63 или 67 (2) аминокислотной последовательности, имеющей идентичность, по меньшей мере, 95% или более (предпочтительно аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности, по меньшей мере, 95% или более, с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR), вышеописанной аминокислотной последовательности (1), и (3) аминокислотной последовательности, включающей делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в вышеописанной аминокислотной последовательности (1); и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (4) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15, 25, 35, 45 или 58, (5) аминокислотной последовательности, имеющей идентичность, по меньшей мере, 95% или более (предпочтительно аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности, по меньшей мере, 95% или более с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR) с вышеописанной аминокислотной последовательностью (4), и (6) аминокислотной последовательности, включающей делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в вышеописанной аминокислотной последовательности (4). Другие примеры такого антитела могут включать любую данную комбинацию: легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (1) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, 20, 30 или 40, (2) аминокислотной последовательности, имеющей идентичность, по меньшей мере, 95% или более (предпочтительно аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности, по меньшей мере, 95% или более, с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR) с вышеописанной аминокислотной последовательностью (1), и (3) аминокислотной последовательности, включающей делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в вышеописанной аминокислотной последовательности (1); и тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (4) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 71, 75 или 79, (5) аминокислотной последовательности, имеющей идентичность, по меньшей мере, 95% или более (предпочтительно аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности, по меньшей мере, 95% или более с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR) с вышеописанной аминокислотной последовательностью (4), и (6) аминокислотной последовательности, включающей делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в вышеописанной аминокислотной последовательности (4).

[0087] Аминокислотная замена в настоящем описании предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену. Консервативная аминокислотная замена представляет замену, имеющую место в пределах аминокислотной группы, связанной с некоторыми аминокислотными боковыми цепями. Предпочтительными аминокислотными группами являются следующие: кислотная группа=аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; основная группа=лизин, аргинин и гистидин; неполярная группа=аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан; и незаряженное полярное семейство=глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин и тирозин. Другими предпочтительными аминокислотными группами являются следующие: алифатическая гидроксигруппа=серин и треонин; амидсодержащая группа=аспарагин и глутамин; алифатическая группа=аланин, валин, лейцин и изолейцин; и ароматическая группа=фенилаланин, триптофан и тирозин. Такую аминокислотную замену предпочтительно проводят без ухудшения свойств соединения, имеющего исходную аминокислотную последовательность.

[0088] Примеры антител, имеющих предпочтительную комбинацию вышеописанных легких цепей и тяжелых цепей, включают антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 63 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи hL02) или легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 67 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи hL03), и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 71 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи hH01), тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 75 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи hH02), или тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 79 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи hH04). Его предпочтительные примеры включают: антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 63, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 71; антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 63, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 75; антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 63, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 79; антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 67, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 71; антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 67, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 75; и антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 67, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 79. Его более предпочтительные примеры включают: антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 63, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 71; антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 63, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 75; антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 63, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 79; и антитело, состоящее из легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 67, и тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO: 75.

[0089] Другие примеры антитела, имеющего предпочтительную комбинацию вышеописанных легких цепей и тяжелых цепей, включают антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи hL02), или легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 65 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи hL03), и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 69 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи hH01), тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 73 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи hH02), или тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 77 (в настоящем описании также относящуюся к аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи hH04). Его предпочтительные примеры включают: антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 69; антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 73; антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 77; антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 65, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 69; антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 65, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 73; и антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 65, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 77. Его более предпочтительные примеры включают: антитело, состоящее из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 69 (в настоящем описании также относится к «антителу H01L02» или «H01L02»); антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 73 (в настоящем описании также относится к «антителу H02L02» или «H02L02»); антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 77 (в настоящем описании также относится к «антителу H04L02» или «H04L02»); и антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 65, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной SEQ ID NO: 73 (в настоящем описании также относится к «антителу H02L03» или «H02L03»). Последовательности антитела H01L02, антитела H02L02, антитела H02L03 или антитела H04L02 показаны в таблице 1.

[0090] Комбинируя вместе последовательности, демонстрирующие высокую идентичность с вышеописанными аминокислотными последовательностями тяжелой цепи и аминокислотными последовательностями легкой цепи, можно выбрать антитело, обладающее биологической активностью, эквивалентной таковой у каждого из вышеописанных антител. Такая идентичность обычно составляет 80% или выше, предпочтительно 90% или выше, более предпочтительно 95% или выше и наиболее предпочтительно 99% или выше. Кроме того, также посредством комбинирования аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи, содержащих замену, делецию или добавление одного или нескольких их аминокислотных остатков в отношении аминокислотной последовательности тяжелой цепи или легкой цепи, можно выбрать антитело, обладающее биологической активностью, эквивалентной активности каждого из вышеописанных антител.

[0091] Идентичность между двумя типами аминокислотных последовательностей можно определить выравниванием последовательностей с использованием параметров по умолчанию Clustal W версия 2 (Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J. and Higgins D.G. (2007),"Clustal W. and Clustal X. версия 2.0", Bioinformatics. 23 (21): 2947-2948).

[0092] Следует отметить, что в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи hL02, показанной в SEQ ID NO: 61, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-128, является вариабельной областью, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 129-233, является константной областью. В нуклеотидной последовательности полноразмерной легкой цепи hL02, показанной в SEQ ID NO: 62, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60, кодирует сигнальную последовательность, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-384, кодирует вариабельную область, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 385-699, кодирует константную область.

[0093] В аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи hL03, показанной в SEQ ID NO: 65, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-128 представляет вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 129-233, является константной областью. В нуклеотидной последовательности полноразмерной легкой цепи hL03, показанной в SEQ ID NO: 66, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-384, кодирует вариабельную область, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 385-699, кодирует константную область.

[0094] В аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи hH01, показанной в SEQ ID NO: 69, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-141, представляет вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 142-471, представляет константную область. В нуклеотидной последовательности полноразмерной тяжелой цепи hH01, показанной в SEQ ID NO: 70, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-423, кодирует вариабельную область, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 424-1413, кодирует константную область.

[0095] В аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи hH02, показанной в SEQ ID NO: 73, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-141, представляет вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 142-471, представляет константную область. В нуклеотидной последовательности полноразмерной тяжелой цепи hH02, показанной в SEQ ID NO: 74, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-423, кодирует вариабельную область, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 424-1413, кодирует константную область.

[0096] В аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи hH04, показанной в SEQ ID NO: 77, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатки в положениях 20-141 представляет вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 142-471, представляет константную область. В нуклеотидной последовательности полноразмерной тяжелой цепи hH04, показанной в SEQ ID NO: 78, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-423, кодирует вариабельную область, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 424-1413, кодирует константную область.

[0097]

Таблица 1-1

[0098]

Таблица 1-2

[0099]

Таблица 1-3

[0100]

Таблица 1-4

[0101]

Таблица 1-5

[0102]

Таблица 1-6

[0103]

Таблица 1-7

[0104]

Таблица 1-8

[0105]

Таблица 1-9

[0106]

Таблица 1-10

[0107]

Таблица 1-11

[0108]

Таблица 1-12

[0109]

Таблица 1-13

[0110]

Таблица 1-14

[0111]

Таблица 1-15

[0112] В настоящем описании таблицы с 1-1 по 1-15 также в совокупности упоминаются как таблица 1.

[0113] Дополнительные примеры антител по настоящему изобретению могут включать человеческое антитело, связывающееся с CDH6. Человеческое анти-CDH6-антитело означает антитело человека, имеющее только последовательность генов антитела, полученную из хромосом человека. Человеческое анти-CDH6-антитело может быть получено способом с использованием мыши, продуцирующей человеческое антитело, имеющей фрагмент хромосомы человека, содержащий гены тяжелой цепи и легкой цепи человеческого антитела (см. Tomizuka K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143; Kuroiwa Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448; Yoshida H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa Y., Matsuda T. and Iijima S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727 и т. д.).

[0113] Такую мышь, продуцирующую антитело человека, можно специфически получить с использованием генетически модифицированного животного, локусы гена тяжелой цепи и легкой цепи эндогенного иммуноглобулина которого были разрушены, и затем вместо введены локусы гена тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина человека с использованием вектора на основе дрожжевой искусственной хромосомы (YAC) или тому подобное, затем получение нокаутного животного и трансгенного животное из такого генетически модифицированного животного и затем скрещивание таких животных друг с другом.

[0114] Иначе человеческое анти-CDH6-антитело также можно получить трансформацией эукариотических клеток с помощью кДНК, кодирующей каждую из тяжелой цепи и легкой цепи такого человеческого антитела, или предпочтительно с помощью вектора, содержащего кДНК, методами генетической рекомбинации и затем культивированием трансформированных клеток, продуцирующих генетически модифицированное человеческое моноклональное антитело, с последующим получением антитела из культурального супернатанта.

[0115] В этом контексте, можно использовать, например, эукариотические клетки и, предпочтительно, клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, лимфоциты или миеломные клетки, например, в качестве хозяина.

[0116] Кроме того, также известен способ получения человеческого антитела методом фагового дисплея, которое было отобрано из библиотеки человеческих антител (см. Wormstone I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Carmen S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; Siriwardena D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431).

[0117] Например, можно использовать метод фагового дисплея, который включает обеспечение экспрессии вариабельных областей человеческого антитела в виде одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фагов и затем селекцию фага, связывающегося с антигеном (Nature Biotechnology (2005) 23, (9), p. 1105-1116).

[0118] Анализируя ген фага, который был отобран за счет его способности связываться с антигеном, можно определить последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области человеческого антитела, связывающегося с антигеном.

[0119] После определения последовательности ДНК scFv, связывающегося с антигеном, получают экспрессионный вектор, имеющий вышеуказанную последовательность, и затем полученный экспрессионный вектор вводят в подходящего хозяина, и его можно экспрессировать в нем, с получением тем самым человеческого антитела (публикации международных заявок WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438 и WO95/15388, Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).

[0120] Если вновь полученное человеческое антитело связывается с частичным пептидом или частичной трехмерной структурой, с которыми связывается любое крысиное антитело против человеческого CDH6, химерное антитело против человеческого CDH6 или гуманизированное антитело против человеческого CDH6, раскрытое в настоящем описании (например, антитело rG019, антитело rG055, антитело rG056, антитело rG061, антитело chG019, антитело H01L02, антитело H02L02, антитело H02L03 или антитело H04L02), то можно определить, что человеческое антитело связывается с тем же эпитопом, с которым связывается крысиное антитело против человеческого CDH6, химерное антитело против человеческого CDH6 или гуманизированное антитело против человеческого CDH6. Альтернативно, подтверждая, что человеческое антитело конкурирует с крысиным антителом против человеческого CDH6, химерным антителом против человеческого CDH6 или гуманизированным антителом против человеческого CDH6, раскрытым в настоящем описании (например, антителом rG019, антителом rG055, антителом rG056, антителом rG061, антителом chG019, антителом H01L02, антителом H02L02, антителом H02L03 или антителом H04L02) за связывание антитела с CDH6 (например, человеческое антитело препятствует связыванию антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056, антитела rG061, антитела chG019, антитела H01L02, антитела H02L02, антитела H02L03 или антитела H04L02 с CDH6, предпочтительно EC3 CDH6), то можно определить, что человеческое антитело связывается с тем же эпитопом, с которым связывается крысиное антитело против человеческого CDH6, химерное антитело против человеческого CDH6 или гуманизированное антитело против человеческого CDH6, раскрытое в настоящем описании, даже если конкретная последовательность или структура эпитопа не была определена. В настоящем описании, когда, по меньшей мере, одним из этих методов определения установлено, что человеческое антитело «связывается с тем же эпитопом», делается вывод, что вновь полученное человеческое антитело «связывается с тем же эпитопом», что и крысиное антитело против человеческого CDH6 человека, химерное антитело против человеческого CDH6 или гуманизированное антитело против человеческого CDH6, раскрытое в настоящем описании. Когда подтверждается, что человеческое антитело связывается с тем же эпитопом, то тогда предполагается, что человеческое антитело должно иметь биологическую активность, эквивалентную активности крысиного антитела против человеческого CDH6, химерного антитела против человеческого CDH6 или гуманизированного антитела против человеческого CDH6 (например, антитела rG019, антитела rG055, антитела rG056, антитела rG061, антитела chG019, антитела H01L02, антитела H02L02, антитела H02L03 или антитела H04L02).

[0121] Химерные антитела, гуманизированные антитела или человеческие антитела, полученные вышеописанными способами, оценивают на их связывающую активность в отношении антигена с использованием известного способа и т.д., так что в результате можно выбрать предпочтительное антитело.

[0122] Один пример другого показателя для сравнения свойств антител может включать стабильность антитела. Дифференциальный сканирующий калориметр (DSC) представляет собой прибор, с помощью которого можно быстро и точно измерить среднюю точку термической денатурации (Tm), служащую хорошим показателем относительной структурной стабильности белка. Используя DSC для измерения значений Tm и сравнивая полученные значения, можно сравнить различия в термостабильности. Известно, что сохранение стабильности антитела имеет определенную корреляцию с термостабильностью антитела (Lori Burton et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273) и, таким образом, предпочтительное антитело можно выбрать с использованием термостабильности в качестве показателя. Другие примеры показателя для отбора антител могут включать высокий выход в подходящих клетках-хозяевах и низкую агглютинацию в водном растворе. Например, поскольку антитело с самым высоким выходом не всегда проявляет самую высокую термостабильность, то необходимо выбрать антитело, наиболее подходящее для введения человеку, посредством его всесторонней оценки на основе вышеуказанных показателей.

[0123] Антитело по настоящему изобретению также включает модификацию антитела. Под модификацией подразумевается антитело по настоящему изобретению, которое является химически или биологически модифицированным. Примеры такой химической модификации включают связывание химической группы с аминокислотным скелетом и химическую модификацию N-связанной или O-связанной углеводной цепи. Примеры такой биологической модификации включают антитела, которые подверглись посттрансляционной модификации (например, N-связанное или O-связанное гликозилирование, N-концевой или C-концевой процессинг, дезамидирование, изомеризация аспарагиновой кислоты, окисление метионина и превращение N-концевого глутамина или N-концевой глутаминовой кислоты в пироглутаминовую кислоту) и антитела, к N-концу которых добавлен остаток метионина, в результате чего оно может экспрессироваться с использованием прокариотических клеток-хозяев. Кроме того, такая модификация также подразумевает включение меченых антител для обеспечения возможности детектирования или выделения антитела по настоящему изобретению или антигена, например, ферментативно меченого антитела, флуоресцентно меченого антитела и аффинно-меченого антитела. Такая модификация антитела по настоящему изобретению пригодна для повышения стабильности и удерживания в крови антитела; снижения антигенности; детектирования или выделения антитела или антигена; и т.п.

[0124] Кроме того, регулируя модификацию сахарной цепи (гликозилирование, дефукозилирование и т.д.), которая связывается с антителом по настоящему изобретению, можно усилить антителозависимую клеточную цитотоксическую активность. В качестве методов регулирования модификации сахарной цепи антитела, известны методы, описанные в публикациях международных заявок WO 1999/54342, WO 2000/61739 и WO 2002/31140 и т.д., хотя методы этим не ограничиваются. Антитело по настоящему изобретению также включает антитела, в отношении которых вышеуказанная модификация сахарной цепи была регулирована.

[0125] После выделения гена антитела этот ген можно ввести в подходящего хозяина для продукции антитела, используя подходящую комбинацию хозяина и экспрессионного вектора. Конкретным примером гена антитела может быть комбинация гена, кодирующего последовательность тяжелой цепи антитела, описанного здесь, и гена, кодирующего последовательность легкой цепи антитела, описанного здесь. При трансформации клеток-хозяев такой ген последовательности тяжелой цепи и ген последовательности легкой цепи можно вставить в один экспрессионный вектор, или вместо этого каждый из этих генов может быть вставлен в разные экспрессионные векторы.

[0126] Когда в качестве хозяев используются эукариотические клетки, то можно использовать клетки животных, растительные клетки или эукариотические микроорганизмы. В частности, примеры клеток животных могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки COS, которые представляют клетки обезьяны (Gluzman Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), мышиные фибробласты NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), клеточную линию яичника китайского хомячка, дефицитную по дигидрофолатредуктазе (клетки CHO, ATCC CCL-61) (Urlaub G. and Chasin L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p. 4126-4220) и клетки FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.).

[0127] Когда в качестве хозяев используются прокариотические клетки, то можно использовать, например, Escherichia coli или Bacillus subtilis.

[0128] Ген антитела, представляющего интерес, вводят в эти клетки для трансформации, и затем трансформированные клетки культивируют in vitro для получения антитела. В вышеуказанной культуре имеются случаи, когда выход различается в зависимости от последовательности антитела, и, таким образом, можно выбрать антитело, которое легко продуцируется в качестве лекарственного средства, из антител, имеющих эквивалентную связывающую активность, используя выход в качестве показателя для отбора. Следовательно, антитело по настоящему изобретению также включает антитело, полученное вышеописанным способом получения антитела, который включает стадию культивирования трансформированных клеток-хозяев и стадию сбора представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела из культуры, полученной на вышеуказанной стадии.

[0129] Известно, что остаток лизина на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела, продуцированного в культивируемых клетках млекопитающих, делецируется (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), а также известно, что два аминокислотных остатка на карбоксильном конце тяжелой цепи, глицин и лизин, делецированы, и что остаток пролина, вновь расположенный на карбоксильном конце, амидирован (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Однако такая делеция и модификация этих последовательностей тяжелых цепей не оказывает влияния на антигенсвязывающую активность и эффекторную функцию (активацию комплемента, антителозависимую клеточную цитотоксичность и т.д.) антитела. Следовательно, антитело по настоящему изобретению также включает антитело, которое подверглось вышеуказанной модификации, и функциональный фрагмент антитела, и конкретные примеры такого антитела включают делеционный мутант, содержащий делецию 1 или 2 аминокислот на карбоксильном конце тяжелой цепи, и делеционный мутант, образованный амидированием вышеуказанного делеционного мутанта (например, тяжелая цепь, в которой остаток пролина в карбоксильном концевом сайте амидирован). Однако делеционные мутанты, включающие делецию на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению, не ограничиваются вышеуказанными делеционными мутантами, если они сохраняют антигенсвязывающую активность и эффекторную функцию. Две тяжелые цепи, входящие в состав антитела по настоящему изобретению, могут представлять любой тип тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из полноразмерного антитела и вышеуказанных делеционных мутантов, или могут представлять собой комбинацию любых двух типов, выбранных из вышеуказанной группы. На соотношение отдельных делеционных мутантов могут влиять типы культивируемых клеток млекопитающих, которые продуцируют антитело по настоящему изобретению, и условия культивирования. Примеры основного ингредиента антитела по настоящему изобретению могут включать антитела, в которых один аминокислотный остаток делецирован на каждом из карбоксильных концов двух тяжелых цепей.

[0130] Примеры изотипа антитела по настоящему изобретению могут включать IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Среди прочего, IgG1 и IgG4 являются предпочтительными.

[0131] Примеры биологической активности антитела могут, как правило, включать антигенсвязывающую активность, способность к интернализации в клетки, экспрессирующие антиген, посредством связывания с антигеном, способность нейтрализации активности антигена, способность усиления активности антигена, антителозависимую клеточную цитотоксическую (ADCC) активность, комплемент-зависимую цитотоксическую (CDC) активность и антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP). Функцией антитела по настоящему изобретению является способность к связыванию с CDH6 и, предпочтительно, способность к интернализации в клетки, экспрессирующие CDH6, посредством связывания с CDH6. Кроме того, антитело по настоящему изобретению может иметь активность ADCC, активность CDC и/или активность ADCP, а также способность к интернализации в клетки.

[0132] Полученное антитело можно очистить до гомогенного состояния. Для разделения и очистки антитела можно использовать методы разделения и очистки, используемые для обычных белков. Например, соответствующим образом выбирают и объединяют друг с другом, колоночную хроматографию, фильтрацию, ультрафильтрацию, высаливание, диализ, препаративный электрофорез в полиакриламидном геле и изоэлектрическое фокусирование, чтобы в результате можно было отделить и очистить антитело (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); and Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), хотя, примеры методов разделения и очистки не ограничиваются этим.

[0133] Примеры хроматографии могут включать аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, обращенно-фазовую хроматографию и абсорбционную хроматографию.

[0134] Эти хроматографические методы можно выполнить с использованием жидкостной хроматографии, такой как ВЭЖХ или FPLC.

[0135] Примеры колонки, используемой в аффинной хроматографии, могут включать колонку с протеином А и колонку с протеином G. Примеры колонки, включающей применение протеина A, могут включать Hyper D, POROS и Sepharose F. F. (Pharmacia).

[0136] Кроме того, используя иммобилизованный на носителе антиген, антитело можно выделить с использованием активности связывания антитела с антигеном.

[0137] 3. Конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство

(1) Лекарственное средство

Анти-CDH6-антитело, полученное, как описано в разделе «2. Получение антит-CDH6-антитела» выше, можно конъюгировать с лекарственным средством через группу линкерной структуры с получением конъюгата анти-CDH6-антитело-лекарственное средство. Лекарственное средство особым образом не ограничивается, при условии, что оно имеет заместитель или частичную структуру, которые можно связать с линкерной структурой. Конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство можно использовать для различных целей в зависимости от конъюгированного лекарственного средства. Примеры такого лекарственного средства могут включать соединения, обладающие противоопухолевой активностью, соединения, эффективные при заболеваниях крови, соединения, эффективные при аутоиммунных заболеваниях, противовоспалительные соединения, противомикробные соединения, противогрибковые соединения, противопаразитарные соединения, противовирусные соединения и обезболивающие соединения.

[0138] (1)-1 Противоопухолевое соединение

Пример использования противоопухолевого соединения в качестве соединения, которое должно быть конъюгировано в конъюгате анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, будет описан ниже. Противоопухолевое соединение особым образом не ограничивается, при условии, что соединение обладает противоопухолевым эффектом и имеет заместитель или частичную структуру, которые можно связать с линкерной структурой. При расщеплении фрагмента или всего линкера в опухолевых клетках компонент противоопухолевое соединение высвобождается, в результате противоопухолевое соединение проявляет свой противоопухолевый эффект. Поскольку линкер расщепляется в месте соединения с лекарственным средством, то противоопухолевое соединение высвобождается в своей исходной структуре, с проявлением своего исходного противоопухолевого действия.

[0139] Анти-CDH6-антитело, полученное, как описано в вышеприведенном разделе «2. Получение анти-CDH6-антитела», можно конъюгировать с противоопухолевым соединением через группу линкерной структуры с получением конъюгата анти-CDH6-антитело-лекарственное средство.

[0140] В качестве одного примера противоопухолевого соединения, используемого в настоящем изобретении, предпочтительно можно использовать экзатекан, производное камптотецина ((1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино [1,2-b]хинолин-10,13(9Н,15Н)дион, представленный следующей формулой).

[0141]

Формула 5

[0142] Соединение можно легко получить, например, способом, описанным в публикации патента США № US2016/0297890, или другими известными способами, и аминогруппу в положении 1 предпочтительно можно использовать в качестве соединительного положения со структурой линкера. Кроме того, экзатекан может высвобождаться в опухолевых клетках, пока фрагмент линкера все еще соединен с ним. Однако соединение оказывает превосходный противоопухолевый эффект даже в таком состоянии.

[0143] Поскольку экзатекан имеет структуру камптотецина, известно, что в кислой водной среде (например, порядка рН 3) равновесие смещается к структуре с образованным лактоновым кольцом (замкнутым кольцом), тогда как в щелочной водной среде (например, порядка рН 10) равновесие смещается к структуре с открытым лактоновым кольцом (открытым кольцом). Предполагается, что лекарственный конъюгат, в который введены остатки экзатекана, соответствующие такой структуре с замкнутым кольцом и структурой с открытым кольцом, также будет иметь эквивалентный противоопухолевый эффект, и нет необходимости отмечать, что любой такой конъюгат с лекарственным средством включается в объем настоящее изобретение.

[0144] Другие примеры противоопухолевого соединения могут включать противоопухолевые соединения, описанные в литературе (Pharmacological Reviews, 68, p. 3-19, 2016). Конкретные их примеры могут включать доксорубицин, калихеамицин, доластатин 10, ауристатины, такие как монометилауристатин E (MMAE) и монометилауристатин F (MMAF), мейтанзиноиды, такие как DM1 и DM4, димер пирролобензодиазепина SN-13GG6, производное камптотецина SN2000 (SJG-136), дуокармицины, такие как CC-1065, аманитин, даунорубицин, митомицин С, блеомицин, циклоцитидин, винкристин, винбластин, метотрексат, противоопухолевые агенты на основе платины (цисплатин и его производные), и таксол и его производные.

[0145] В конъюгате антитело-лекарственное средство число молекул конъюгированного лекарственного средства на молекулу антитела является ключевым фактором, влияющим на его эффективность и безопасность. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство осуществляют при определении условий реакции, таких как количества исходных соединений и реагентов, используемых для реакции, для достижения постоянного числа конъюгированных молекул лекарственного средства. В отличие от химической реакции с низкомолекулярными соединениями, обычно получается смесь, содержащая различное количество конъюгированных молекул лекарственного средства. Количество конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела определяется и указывается в виде среднего значения, т.е. среднего числа конъюгированных молекул лекарственного средства. Если не указано иное, т.е. за исключением случая обеспечения конъюгата антитело-лекарственное средство, имеющего определенное количество молекул конъюгированного лекарственного средства, которое включено в смесь конъюгатов антитело-лекарственное средство, имеющих различное количество молекул конъюгированного лекарственного средства, то, как правило, количество молекул конъюгированного лекарственного средства по настоящему изобретению также означает среднее значение. Количество молекул экзатекана, конъюгированных с молекулой антитела, является контролируемым, и в виде среднего числа конъюгированных молекул лекарственного средства на антитело может быть конъюгировано примерно 1-10 молекул экзатекана. Количество молекул экзатекана предпочтительно составляет 2-8, 3-8, 4-8, 5-8, 6-8 или 7-8, более предпочтительно 5-8, еще более предпочтительно 7-8, еще более предпочтительно 8. Следует отметить, что специалист в данной области может разработать реакцию конъюгирования необходимого количества молекул лекарственного средства с молекулой антитела на основе описания примеров настоящей заявки и может получить конъюгат антитело-лекарственное средство с контролируемым числом конъюгированных молекул экзатекана.

[0146] (2) Линкерная структура

Будет описана линкерная структура, посредством которой лекарственное средство конъюгировано с анти-CDH6-антителом в конъюгате анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению.

[0147] В конъюгате антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению линкерная структура, посредством которой анти-CDH6-антитело конъюгирует с лекарственным средством, особым образом не ограничивается при условии, что можно использовать полученный конъюгат антитело-лекарственное средство. Линкерная структура может быть соответствующим образом выбрана и использованас учетом цели применения. Один пример линкерной структуры может включать линкер, описанный в известной литературе (Pharmacol. Rev., 68: 3-19, January 2016, Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0 и т.д.). Ее дополнительные конкретные примеры могут включать VC (валин-цитруллин), MC (малеимидокапроил), SMCC (сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат), SPP (N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноат, SS (дисульфид), SPDB (N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутират, SS/гидразон, гидразон и карбонат.

[0148] Другой пример может включать линкерную структуру, описанную в публикации патента США № US2016/0297890 (в качестве одного примера, описанные в абзацах [0260]-[0289]). Любая линкерная структура, приведенная ниже, предпочтительно может быть использована. Следует отметить, что левый конец структуры представляет положение соединения с антителом, и правый конец представляет положение соединения с лекарственным средством. Кроме того, GGFG в линкерных структурах, приведенных ниже, представляет аминокислотную последовательность, состоящую из глицин-глицин-фенилаланин-глицина (GGFG), связанных через пептидные связи.

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

[0149] Более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

Еще более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

[0150] Антитело соединено с концом -(сукцинимид-3-ил-N) (например, с концом, противоположным (левым концом) концу, с которым -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂- связан в "-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-"), и противоопухолевое соединение соединено с концом (карбонильной группой CH₂-O-CH₂-C(=O)- на правом конце в описанном выше примере), противоположном концу, к которому присоединено антитело -(сукцинимид-3-ил-N). «-(сукцинимид-3-ил-N)-» имеет структуру, представленную следующей формулой:

[0151]

Формула 6

[0152] Положение 3 данной частичной структуры является положением соединения с анти-CDH6-антителом. Это соединение с антителом в положении 3 характеризуется образованием тиоэфирной связи. Атом азота в положении 1 этой структурной группы связан с атомом углерода метилена, который находится в линкере, включая структуру.

[0153] В конъюгате антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, содержащем экзатекан в качестве лекарственного средства, структурная группа лекарственное средство-линкер, имеющая любую структуру, указанную ниже, является предпочтительной для конъюгации с антителом. Для этих структурных групп лекарственное средство-линкер среднее число конъюгированных на антитело может составлять 1-10 и предпочтительно 2-8, более предпочтительно 5-8, еще более предпочтительно 7-8 и еще более предпочтительно 8.

- (сукцинимид-3-ил-N), -CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-С(= O)-(NH-DX),

-(сукцинимид-3-ил-N), -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-С(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-С(= O)-(NH-DX),

- (сукцинимид-3-ил-N), -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-С(= O)-GGFG-NH-СН₂-О-СН₂-С(=O)-(NH-DX),

-(сукцинимид-3-ил-N), -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-С(=O)-GGFG-NH-СН₂СН₂-O-СН₂-С(= O)-(NH-DX),

- (сукцинимид-3-ил-N), -CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-СН₂СН₂-С(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-С(= O)-(NH-DX), и

- (сукцинимид-3-ил-N), -CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-СН₂СН₂-С(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-С(= O)-(NH-DX).

[0154] Более предпочтительными являются следующие:

- (сукцинимид-3-ил-N), -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-С(=O)-GGFG-NH-СН₂-О-СН₂-С(=O)-(NH-DX),

- (сукцинимид-3-ил-N) -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX) и

- (сукцинимид-3-ил-N), -CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-СН₂СН₂-С(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-С(=O)-(NH-DX) ,

[0155] Еще более предпочтительными являются следующие:

- (сукцинимид-3-ил-N) -CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-(NH-DX) и

- (сукцинимид-3-ил-N), -CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-СН₂СН₂-С(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-С(=O)-(NH-DX),

[0156] -(NH-DX) имеет структуру, представленную следующей формулой:

[0157]

Формула 7

[0158] и она представляет группу, которая получена удалением одного атома водорода из аминогруппы в положении 1 экзатекана.

[0159] (3) Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство

Антитело, которое можно использовать в конъюгате антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, особым образом не ограничивается, если оно представляет собой антитело против CDH6, обладающее способностью к интернациализации, или функциональный фрагмент антитела, как описано в вышеприведенном разделе «2. Получение анти-CDH6-антитела» и в примерах.

[0160] Далее будет описан типичный способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению. Следует отметить, что в приведенном ниже описании «номер соединения», показанный на каждой схеме реакции, используется для представления соединения. В частности, каждое соединение указано как «соединение формулы (1)», «соединение (1)» или тому подобное. То же самое относится и к другим номерам соединений.

[0161] (3)-1 Способ получения 1

Конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный нижеприведенной формулой (1), в которой анти-CDH6-антитело соединено с линкерной структурой через тиоэфирную связь, может быть получен взаимодействием антитела, имеющего сульфгидрильную группу, полученную из дисульфидной связи, восстановлением анти-CDH6-антитела соединением (2), где соединение (2) можно получить известным способом (например, получить способом, описанным в литературе в публикации патента US2016/297890 (например, способом, описанным в абзацах [0336]-[374]). Этот конъюгат антитело-лекарственное средство можно получить, например, следующим способом.

[0162]

Схема реакции 1

[0163]

где AB представляет антитело с сульфгидрильной группой, где

L¹ имеет структуру, представленную -(сукцинимид-3-ил-N)-, и

L¹'представляет малеимидильную группу, представленную следующей формулой.

[0164]

Формула 8

[0165] -L¹-L^X имеет структуру, представленную любой из следующих формул:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

[0166] Среди них более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

[0167] Еще более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

[0168] На вышеприведенной схеме реакции конъюгат антитело-лекарственное средство (1) представляет собой структуру, в которой одна структурная группа от лекарственного средства до конца линкера связана с одним антителом. Однако такое представление дано для удобства, и на самом деле существует много случаев, в которых множество вышеуказанных структурных групп связано с одной молекулой антитела. То же самое верно для пояснения способа получения, описанного ниже.

[0169] В частности, конъюгат антитело-лекарственное средство (1) можно получить взаимодействием соединения (2), полученного известным способом (например, полученного способом, описанным в литературе в публикации патента US2016/297890 (например, полученного способом, описанным в абзацах [0336]-[0374])), с антителом (3a), имеющим сульфгидрильную группу.

[0170] Антитело (3а), имеющее сульфгидрильную группу, можно получить способом, хорошо известным специалистам в данной области (Hermanson, GT, Bioconjugate Techniques, стр. 56-136, стр. 456-493, Academic Press (1996)). Примеры способа могут включать, не ограничиваясь этим: реагент Траута, взаимодействующий с аминогруппой антитела; N-сукцинимидил-S-ацетилтиоалканоаты, взаимодействующие с аминогруппой антитела с последующей реакцией с гидроксиламином; N-сукцинимидил-3-(пиридилдитио)пропионат, взаимодействующий с антителом с последующей реакцией с восстановителем; антитело, взаимодействующее с восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол, 2-меркаптоэтанол или трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (ТСЕР), с восстановлением межцепочечной дисульфидной связи в антителе с образованием сульфгидрильной группы.

[0171] В частности, антитело с межцепочечными дисульфидными связями, частично или полностью восстановленными, можно получить применением от 0,3 до 3 моль-экв TCEP в качестве восстановителя межцепочечной дисульфидной связи в антителе и взаимодействием восстановителя с антителом в буферном растворе, содержащем хелатирующий агент. Примеры хелатирующего агента могут включать этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и диэтилентриаминпентауксусную кислоту (ДТПА). Хелатирующий агент можно использовать в концентрации от 1 до 20 мМ. В качестве буферного раствора можно использовать раствор фосфата натрия, бората натрия, ацетата натрия или тому подобное. В качестве конкретного примера, антитело (3a), имеющее частично или полностью восстановленные сульфгидрильные группы, можно получить взаимодействием антитела с TCEP при температуре от 4°C до 37°C в течение от 1 до 4 ч.

[0172] Следует отметить, что при проведении реакции присоединения сульфгидрильной группы к группе лекарственное средство-линкер группу лекарственное средство-линкер можно конъюгировать тиоэфирной связью.

[0173] Затем с использованием 2-20 моль-экв соединения (2) на антитело (3a), имеющего сульфгидрильную группу, можно получить конъюгат антитело-лекарственное средство (1), в котором 2-8 молекул лекарственного средства конъюгировано с молекулой антитела. В частности, раствор, содержащий растворенное в нем соединение (2), можно добавить к буферному раствору, содержащему антитело (3a), имеющее сульфгидрильную группу, для взаимодействия. В этом контексте в качестве буферного раствора можно использовать раствор ацетата натрия, фосфата натрия, бората натрия или тому подобное. Значение рН в реакции составляет от 5 до 9, и более предпочтительно, реакцию можно проводить примерно при рН 7. Органический растворитель, такой как диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид (ДМФА), диметилацетамид (ДМАА) или N-метил-2-пирролидон (NMP) можно использовать в качестве растворителя для растворения соединения (2). Реакция может быть осуществлена добавлением раствора, содержащего соединение (2), растворенного в органическом растворителе в количестве от 1 до 20% (об./об.), к буферному раствору, содержащему антитело (3a), имеющее сульфгидрильную группу. Температура реакции составляет от 0°С до 37°С, более предпочтительно от 10°С до 25°С, и время реакции составляет от 0,5 до 2 ч. Реакцию можно остановить дезактивацией реакционной способности непрореагировавшего соединения (2) тиолсодержащим реагентом. Тиолсодержащим реагентом является, например, цистеин или N-ацетил-L-цистеин (NAC). Более конкретно, реакцию можно остановить добавлением 1-2 моль-экв NAC к используемому соединению (2) и инкубацией полученной смеси при комнатной температуре в течение от 10 до 30 мин.

[0174] (1) Идентификация конъюгата антитело-лекарственное средство

Полученный конъюгат антитело-лекарственное средство (1) можно подвергнуть концентрированию, буферному обмену, очистке и измерению концентрации антитела и среднего числа молекул конъюгированного лекарственного средства на молекулу антитела в соответствии с общими процедурами, описанными ниже, для идентификации конъюгата антитело-лекарственное средство (1).

[0175] (1)-1 Общая процедура А: концентрирование водного раствора антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство

В центрифужное устройство Amicon Ultra (50000 MWCO, Millipore Corporation) добавляли раствор антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство, и раствор антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство концентрировали центрифугированием (центрифугирование при 2000g до 3800g в течение 5-20 мин) с использованием центрифуги (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.)

[0176] (4)-2 Общая процедура В: измерение концентрации антитела

Используя УФ-детектор (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), измерение концентрации антитела проводили в соответствии с методом, описанным производителем. Для этого использовали коэффициент поглощения при 280 нм, различающийся между антителами (от 1,3 мл/мг×см до 1,8 мл/мг×см).

[0177] (4)-3. Общая процедура С: буферный обмен для антитела

Колонку NAP-25 (кат. № 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) с использованием носителя Sephadex G-25 уравновешивали фосфатным буфером (50 мМ, рН 6,0) (в настоящем описании относится к PBS6.0/EDTA), содержащим хлорид натрия (50 мМ) и ЭДТА (2 мМ) в соответствии с методом, описанным производителем. Водный раствор антитела наносили в количестве 2,5 мл на колонку NAP-25, и затем собирали фракцию (3,5 мл), элюированную 3,5 мл PBS6.0/EDTA. Данную фракцию концентрировали с помощью общей процедуры A. После измерения концентрации антитела с использованием общей процедуры B концентрацию антитела доводили до 20 мг/мл с использованием PBS6.0/EDTA.

[0178] (4)-4. Общая процедура D: очистка конъюгата антитело-лекарственное средство

Колонку NAP-25 уравновешивали любым коммерчески доступным буферным раствором, таким как ацетатный буфер, содержащим сорбит (5%) (10 мМ, рН 5,5; в настоящем описании относится к ABS). Водный реакционный раствор конъюгата антитело-лекарственное средство (примерно 2,5 мл) наносили на колонку NAP-25, и затем проводили элюирование буферным раствором в количестве, определенном производителем, для сбора фракции антитела. Процесс очистки гель-фильтрацией, в котором собранную фракцию вновь наносили на колонку NAP-25 и проводили элюирование буферным раствором, повторяли в общей сложности 2 или 3 раза, с получением конъюгата антитело-лекарственное средство, не содержащего неконъюгированную группу лекарственное средство-линкер и низкомолекулярные соединения (трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP), N-ацетил-L-цистеин (NAC) и диметилсульфоксид).

[0179] (4)-5. Общая процедура E: измерение концентрации антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство и среднего числа молекул конъюгированного лекарственного средства на молекулу антитела

Концентрацию конъюгированного лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство можно определить измерением УФ-поглощения водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при двух длинах волн: 280 нм и 370 нм, затем выполнением расчета, показанного ниже.

[0180] Общее поглощение на любой данной длине волны равно сумме поглощения всех поглощающих свет химических молекул, присутствующих в системе [аддитивность поглощения]. Следовательно, исходя из гипотезы о том, что молярные коэффициенты поглощения антитела и лекарственного средства не изменяются до и после конъюгации антитела и лекарственного средства, концентрация антитела и концентрация лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство можно представить следующими уравнениями:

A₂₈₀=A_D,280+A_A,280 = ε_D,280C_D + ε_A,280C_A Уравнение (1) A₃₇₀=A_D,370+A_A,370 = ε_D,370C_D + ε_A,370C_A Уравнение (2)

В данном контексте A₂₈₀ представляет поглощение водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при 280 нм, A₃₇₀ представляет поглощение водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при 370 нм, A_A,280 представляет поглощение антитела при 280 нм, A_A,370 представляет поглощение антитела при 370 нм, A_D,280 представляет поглощение предшественника конъюгата при 280 нм, A_D,370 представляет поглощение предшественника конъюгата при 370 нм, ε_A,280 представляет молярный коэффициент поглощения антитела при 280 нм, ε_A,370 представляет молярный коэффициент поглощения антитела при 370 нм, ε_D,280 представляет молярный коэффициент поглощения предшественника конъюгата при 280 нм, ε_D,370 представляет молярный коэффициент поглощения предшественника конъюгата при 370 нм, C_A представляет концентрацию антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство, и C_D представляет концентрацию лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство.

[0181] В этом контексте, в отношении ε_A,280, ε_A,370, ε_D,280 и ε_D,370, то используются предварительно полученные значения (установленные значения, основанные на расчетных или измеренных значениях, полученных измерением поглощения соединения в УФ-свете). Например, ε_A,280 можно установить по аминокислотной последовательности антитела известным методом расчета (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). ε_A,370 обычно равен нулю. ε_D,280 и ε_D,370 могут быть получены в соответствии с законом Ламберта-Бера (поглощение=молярная концентрация × молярный коэффициент поглощения × длина кюветы) измерением поглощения раствора, в котором используемый предшественник конъюгата растворяется в определенной молярной концентрации. C_A и C_D можно определить измерением A₂₈₀ и A₃₇₀ водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство, и затем решением одновременных уравнений (1) и (2) подстановкой этих значений. Кроме того, делением C_D на C_A можно определить среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства на антитело.

[0182] (4)-6 Общая процедура F: измерение среднего числа конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство - (2)

Среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство также можно определить с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием следующего метода в дополнение к вышеуказанной процедуре, описанной в разделе «(4)-5. Общая процедура E». Далее будет описан метод измерения среднего числа конъюгированных молекул лекарственного средства с использованием ВЭЖХ, когда антитело конъюгировано с группой лекарственное средство-линкер посредством дисульфидной связи. Специалист в данной области способен соответствующим образом определить среднее число молекул конъюгированного лекарственного средства с помощью ВЭЖХ, в зависимости от способа соединения антитела и лекарственное средство-линкер, со ссылкой на этот метод.

[0183] F-1. Подготовка образца для анализа ВЭЖХ (восстановление конъюгата антитело-лекарственное средство)

Раствор конъюгата антитело-лекарственное средство (примерно 1 мг/мл, 60 мкл) смешивают с водным раствором дитиотреитола (DTT) (100 мМ, 15 мкл). При инкубации смеси при 37°С в течение 30 мин дисульфидная связь между легкой цепью и тяжелой цепью конъюгата антитело-лекарственное средство расщепляется. Полученный образец используется в анализе ВЭЖХ.

[0184] F-2. Анализ ВЭЖХ

Анализ ВЭЖХ проводят в следующих условиях определения.

[0185] Система ВЭЖХ: система ВЭЖХ Agilent 1290 (Agilent Technologies, Inc.)

Детектор: ультрафиолетовый абсорбционный спектрометр (длина волны анализа: 280 нм)

Колонка: ACQUITY UPLC BEH Phenyl (2,1 × 50 мм, 1,7 мкм, 130 ангстрем; Waters Corp., P/N 186002884)

Температура колонки: 80°C

Подвижная фаза A: водный раствор, содержащий 0,10% трифторуксусной кислоты (TFA) и 15% 2-пропанола

Подвижная фаза B: раствор ацетонитрила, содержащий 0,075% TFA и 15% 2-пропанола

Градиентная программа: 14%-36% (0 мин-15 мин), 36%-80% (15 мин-17 мин), 80%-14% (17 мин-17,01 мин) и 14% (17,01 мин-25 мин)

Объем инжектирования образца: 10 мкл

F-3. Анализ данных

F-3-1. По сравнению с легкой (L0) и тяжелой (H0) цепями неконъюгированного антитела, легкая цепь, связанная с молекулой(и) лекарственного средства (легкая цепь, связанная с i молекулой(и) препарата: L_i), и тяжелая цепь, связанная с молекулой(и) лекарственного средства (тяжелая цепь, связанная с молекулой(и) лекарственного средства: H_i) проявляют более высокую гидрофобность пропорционально количеству конъюгированных молекул лекарственного средства и, таким образом, имеют большее время удерживания. Следовательно, эти цепи элюируются, например, в порядке: L0 и L1 или H0, H1, H2 и H3. Пики детектирования могут быть приписаны любой из L0, L1, H0, H1, H2 и H3 сравнением с временем удерживания L0 и H0. Специалист в данной области может определить количество молекул конъюгированного лекарственного средства, но предпочтительно оно равно L0, L1, H0, H1, H2 и H3.

[0186] F-3-2. Поскольку лекарственное средство-линкер имеет поглощение в УФ-свете, то значения площади пика корректируют в зависимости от количества конъюгированных молекул лекарственное средство-линкер в соответствии со следующим уравнением, используя молярные коэффициенты поглощения легкой цепи или тяжелой цепи и лекарственное средство-линкера.

[0187]

Уравнение 2

[0188]

[Уравнение 3]

[0189] В данном контексте значение, установленное по аминокислотной последовательности легкой цепи или тяжелой цепи каждого антитела с помощью известного метода расчета (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423), можно использовать в качестве молярного коэффициента поглощения (280 нм) легкой цепи или тяжелой цепи антитела. В случае H01L02 молярный коэффициент поглощения 31710 и молярный коэффициент поглощения 79990 использовали в качестве установленных значений для легкой цепи и тяжелой цепи соответственно, в соответствии с аминокислотной последовательностью антитела. Фактически измеренный молярный коэффициент поглощения (280 нм) соединения, в котором малеимидная группа была превращена в сукцинимидный тиоэфир взаимодействием каждой группы лекарственное средство-линкер с меркаптоэтанолом или N-ацетилцистеином, использовали в качестве молярного коэффициента поглощения (280 нм) лекарственное средство-линкера. Специалист в данной области может соответствующим образом установить длину волны для измерения поглощения, но предпочтительно это длина волны, на которой может быть измерен пик антитела, и более предпочтительно она равна 280 нм.

[0190] F-3-3. Соотношение площадей пиков (%) каждой цепи рассчитывается для суммы скорректированных значений площадей пиков согласно следующему уравнению.

[0191]

Уравнение 4

[0192] F-3-4. Среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство рассчитывают в соответствии со следующим уравнением.

[0193] Среднее число молекул конъюгированного лекарственного средства = (отношение площади пика L₀ × 0+отношение площади пика L₁ × 1+отношение площади пика H₀ × 0+отношение площади пика H₁ × 1+отношение площади пика H₂ × 2+отношение площади пика H₃ × 3)/100 × 2.

Следует отметить, что для обеспечения количества конъюгата антитело-лекарственное средство множество конъюгатов антитело-лекарственное средство имеют практически одинаковое среднее число молекул конъюгированного лекарственного средства (например, порядка ±1), которые были приготовлены в аналогичных условиях, можно смешать для подготовки новой партии. В этом случае среднее число молекул лекарственного средства новой партии попадает между средним числом молекул лекарственного средства перед смешиванием.

[0194] Один конкретный пример конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению может включать конъюгат антитело-лекарственное средство, имеющий структуру, представленную следующей формулой:

[0195]

Формула 9

[0196]

или следующей формулой:

[0197]

Формула 10

[0198]

[0181] В данном контексте АВ представляет анти-CDH6-антитело, раскрытое в настоящем описании, и антитело конъюгировано со структурой лекарственное средство-линкер через сульфгидрильную группу, происходящую от антитела. В данном контексте значение n имеет то же значение, что и так называемое DAR (соотношение лекарственное средство-антитело), и представляет соотношение лекарственное средство-антитело на антитело. В частности, n представляет число молекул конъюгированного лекарственного средства на молекулу антитела, которое представляет собой числовое значение, определенное и обозначенное как среднее значение, т.е. среднее число молекул конъюгированного лекарственного средства. В случае конъюгата антитело-лекарственное средство, представленного формулой 9 или формулой 10 по настоящему изобретению, то n может составлять 2-8 и предпочтительно 5-8, более предпочтительно 7-8 и еще более предпочтительно 8, при измерении с использованием общей процедуры F.

[0200] Один пример конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению может включать конъюгат антитело-лекарственное средство, имеющий структуру, представленную вышеуказанной формулой [формула 9] или [формула 10], где антитело, представленное AB, включает любое антитело, выбранное из группы, состоящей из следующих антител (а)-(g), или функциональный фрагмент антитела, или фармакологически приемлемая соль конъюгата антитело-лекарственное средство:

(а) антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 69;

(b) антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 73;

(c) антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 61, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 77;

(d) антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 65, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 69;

(e) антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 65, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 73;

(f) антитело, состоящее из легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в аминокислотной последовательности полноразмерной легкой цепи, показанной в SEQ ID NO: 65, и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в аминокислотной последовательности полноразмерной тяжелой цепи, показанной в SEQ ID NO: 77; и

(g) любое антитело, выбранное из группы, состоящей из антител (а)-(f), где тяжелая цепь или легкая цепь содержит одну или две или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, О-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, С-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, добавление остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина, превращения N-концевого глутамина или N-концевой глутаминовой кислоты в пироглутаминовую кислоту и делеции одной или двух аминокислот из карбоксильного конца.

[0201] 4. Лекарственное средство

Поскольку анти-CDH6-антитело по настоящему изобретению или функциональный фрагмент антитела описаны в вышеприведенном разделе «2. Получение анти-CDH6-антитела» и в примерах, связывается с CDH6 на поверхности опухолевых клеток и обладает способностью к интернализации, его можно использовать в качестве лекарственного средства, и, в частности, в качестве терапевтического средства для лечения рака, такого как почечно-клеточная карцинома или опухоль яичника, например, почечно-клеточная карцинома, почечноклеточная светлоклеточная карцинома, папиллярная почечноклеточная карцинома, рак яичника, серозная аденокарцинома яичника, рак щитовидной железы, рак желчных протоков, рак легкого (например, мелкоклеточный рак легкого или немелкоклеточный рак легкого), глиобластома, мезотелиома, рак матки, рак поджелудочной железы, опухоль Вильмса или нейробластома, самостоятельно или в комбинации с дополнительным лекарственным средством.

[0202] Кроме того, анти-CDH6-антитело по настоящему изобретению или функциональный фрагмент антитела можно использовать для детектирования клеток, экспрессирующих CDH6.

[0203] Кроме того, поскольку анти-CDH6-антитело по настоящему изобретению или функциональный фрагмент антитела обладает способностью к интернализации, то его можно применять в качестве антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство.

[0204] Когда лекарственное средство, обладающее противоопухолевой активностью, такой как цитотоксическая активность, используется в качестве лекарственного средства, то конъюгат анти-CDH6 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, описанный в вышеприведенном разделе «3. Конъюгат анти-CDH6 антитело-лекарственное средство» и в примерах, представляет собой конъюгат анти-CDH6-антитела и/или функционального фрагмента антитела, обладающего способностью к интернализации, и лекарственного средства, обладающего противоопухолевой активностью, такой как цитотоксическая активность. Поскольку такой конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство проявляет противоопухолевую активность для опухолевых клеток, экспрессирующих CDH6, то его можно использовать в качестве лекарственного средства и, в частности, в качестве терапевтического агента и/или профилактического агента от рака.

[0205] Конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению может поглощать влагу или содержать адсорбционную воду, например, превращаться в гидрат, когда его оставляют на воздухе или подвергают процедурам перекристаллизации или очистки. Такое соединение или фармакологически приемлемая соль, содержащая воду, также включается в настоящее изобретение.

[0206] Когда конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению имеет основную группу, такую как аминогруппа, то он может образовывать фармакологически приемлемую кислотно-аддитивную соль, если желательно. Примеры такой кислотно-аддитивной соли могут включать: гидрогалогениды, такие как гидрофторид, гидрохлорид, гидробромид и гидроиодид; соли неорганических кислот, такие как нитрат, перхлорат, сульфат и фосфат; низшие алкансульфонаты, такие как метансульфонат, трифторметансульфонат и этансульфонат; арилсульфонаты, такие как бензолсульфонат и п-толуолсульфонат; соли органических кислот, такие как формиат, ацетат, трифторацетат, малат, фумарат, сукцинат, цитрат, тартрат, оксалат и малеат; и соли аминокислот, такие как соль орнитина, глутамат и аспартат.

[0207] Когда конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению имеет кислотную группу, такую как карбоксильная группа, то он может образовывать фармакологически приемлемую основно-аддитивную соль, если это желательно. Примеры такой основно-аддитивной соли могут включать соли щелочных металлов, такие как соль натрия, соль калия и соль лития; соли щелочноземельных металлов, такие как соль кальция и соль магния; неорганические соли, такие как соль аммония; и соли органических аминов, такие как соль дибензиламина, соль морфолина, соль алкилового эфира фенилглицина, соль этилендиамина, соль N-метилглюкамина, соль диэтиламина, соль триэтиламина, соль циклогексиламина, соль дициклогексиламина, соль N, N''-дибензилэтилендиамина, соль диэтаноламина, соль N-бензил-N-(2-фенилэтокси)амина, соль пиперазина, соль тетраметиламмония и соль трис(гидроксиметил)аминометана.

[0208] Настоящее изобретение также может включать конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство, в котором один или несколько атомов, составляющих конъюгат антитело-лекарственное средство, заменены изотопами атомов. Существует два типа изотопов: радиоизотопы и стабильные изотопы. Примеры изотопов могут включать изотопы водорода (²H и ³H), изотопы углерода (¹¹C, ¹³C и ¹⁴C), изотопы азота (¹³N и ¹⁵N), изотопы кислорода (¹⁵O, ¹⁷O и ¹⁸O) и изотопы фтора (¹⁸F). Композиция, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство, меченный таким изотопом, пригодна в качестве, например, терапевтического агента, профилактического агента, исследовательского реагента, реагента для анализа, диагностического агента и агента для диагностической визуализации in vivo. Каждый и любой конъюгат антитело-лекарственное средство, меченный изотопом, и смеси конъюгатов антитело-лекарственное средство, меченные изотопом при любом данном соотношении, включаются в настоящее изобретение. Конъюгат антитело-лекарственное средство, меченный изотопом, можно получить, например, с использованием исходного вещества, меченного изотопом, вместо исходного вещества, используемого для способа получения по настоящему изобретению, опиаснного ниже, в соответствии со способом, известным в данной области техники.

[0209] Цитотоксичность in vitro можно оценить, например, на основе активности подавления пролиферативных реакций клеток. Например, культивируют линию опухолевых клеток со сверхэкспрессией CDH6, и конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство добавляют в культуральную систему в различных концентрациях. Затем можно измерить его подавляющую активность в отношении образования очага, образования колонии и роста сфероидов. В данном контексте, например, с использованием линии опухолевых клеток, полученных из почечноклеточной опухоли или опухоли яичника, можно исследовать активность ингибирования роста клеток для почечноклеточной опухоли или опухоли яичника.

[0210] Терапевтические эффекты in vivo на злокачественную опухоль у экспериментального животного можно оценить, например, введением конъюгата анти-CDH6-антитело-лекарственное средство nude мыши, которой была инокулирована линия опухолевых клеток с высокой экспрессией CDH6, и затем оценкой изменения опухолевых клеток. В этом контексте, например, используя животные модели, полученные от иммунодефицитных мышей, инокуляцией клеточных линий, происходящих от почечноклеточной карциномы, почечноклеточной светлоклеточной карциномы, папиллярной почечноклеточной карциномы, рака яичника, серозной аденокарциномы яичника или рака щитовидной железы, можно оценить терапевтические эффекты на почечноклеточную карциному, почечноклеточную светлоклеточную карциному, папиллярную почечноклеточную карциному, рак яичника, серозная аденокарцинома яичника или рак щитовидной железы.

[0211] Тип злокачественной опухоли, в отношении которой применяется конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, особым образом не ограничивается, при условии, что злокачественная опухоль экспрессирует CDH6 в опухолевых клетках, подлежащих лечению. Его примеры могут включать почечноклеточную карциному (например, почечноклеточную светлоклеточную карциному или папиллярную почечноклеточную карциному), рак яичника, серозную аденокарциному яичника, рак щитовидной железы, рак желчных протоков, рак легкого (например, мелкоклеточный рак легкого или немелкоклеточный рак легкого), глиобластому, мезотелиому, рак матки, рак поджелудочной железы, опухоль Вильмса или нейробластому, хотя злокачественная опухоль не ограничивается этим, при условии, что опухоль экспрессирует CDH6. Более предпочтительные примеры злокачественной опухоли могут включать почечноклеточную карциному (например, почечноклеточную светлоклеточную карциному и папиллярную почечноклеточную карциному) и рак яичника.

[0212] Конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению предпочтительно можно вводить млекопитающему и более предпочтительно человеку.

[0213] Вещество, используемое в фармацевтической композиции, содержащей конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, может быть соответствующим образом выбрано из фармацевтических добавок и других, обычно используемых в данной области, с учетом применяемой дозы или применяемой концентрации, и затем использовать.

[0214] Конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить в виде фармацевтической композиции, содержащей один или более фармацевтически совместимых компонентов. Например, фармацевтическая композиция обычно содержит один или более фармацевтических носителей (например, стерилизованные жидкости (например, вода и масло) (включая минеральное масло и масло животного происхождения, растительного происхождения или синтетического происхождения (например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло кунжутное масло))). Вода является более типичным носителем, когда фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Водный солевой раствор, водный раствор декстрозы и водный раствор глицерина также можно использовать в качестве жидкого носителя, в частности, для инъекционного раствора. В данной области известны подходящие фармацевтические носители. При желании композиция также может содержать следовое количество смачивающего агента, эмульгирующего агента или буферного агента рН. Примеры подходящих фармацевтических носителей раскрыты в «Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. Состав соответствует способу введения.

[0215] Известны различные системы доставки, и их можно использовать для введения конъюгата анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению. Примеры пути введения могут включать, не ограничиваясь этим, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный пути. Введение может быть сделано, например, инъекцией или болюсной инъекцией. Согласно конкретному предпочтительному варианту осуществления введение вышеописанного конъюгата антитело-лекарственное средство осуществляют инъекцией. Парентеральное введение является предпочтительным путем введения.

[0216] Согласно типичному варианту осуществления фармацевтическую композицию назначают в виде фармацевтической композиции, подходящей для внутривенного введения человеку, в соответствии с общепринятыми процедурами. Композиция для внутривенного введения обычно представляет собой раствор в стерильном и изотоническом водном буферном растворе. Если необходимо, то лекарственное средство может также содержать солюбилизирующий агент и местный анестетик для облегчения боли в месте инъекции (например, лигнокаин). Как правило, вышеуказанные ингредиенты обеспечиваются по отдельности или вместе в смеси в стандартной лекарственной форме, в виде лиофилизированного порошка или безводного концентрата, содержащихся в контейнере, который получают герметизацией, например, в ампуле или упаковке «саше» с указанием количества активного агента. Когда лекарственное средство вводят инъекцией, то его можно вводить с использованием, например, флакона для инъекций, содержащего воду или физиологический раствор стерильного фармацевтического качества. Когда лекарственное средство предназначено для инъекционного введения, то может быть обеспечена ампула со стерильной водой или физиологическим раствором для инъекции, так что вышеописанные ингредиенты смешиваются друг с другом перед введением.

[0217] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может представлять собой фармацевтическую композицию, содержащую только конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, или может представлять фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство и, по меньшей мере, один другой терапевтический агент для лечения рака. Конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению также можно вводить вместе с дополнительным терапевтическим агентом, используемым для лечения рака и, таким образом, можно усилить противоопухолевый эффект. Дополнительный противоопухолевый агент, используемый для этой цели, можно вводить субъекту одновременно, по отдельности или непрерывно вместе с конъюгатом антитело-лекарственное средство. В противном случае дополнительный противоопухолевый агент и конъюгат анти-CDH6-антитело-лекарственное средство каждый можно вводить субъекту с различными интервалами введения. Примеры такого терапевтического агента для лечения рака могут включать ингибиторы тирозинкиназы, включая иматиниб, сунитиниб и регорафениб, ингибиторы CDK4/6, включая палбоциклиб, ингибиторы HSP90, включая TAS-116, ингибиторы MEK, включая MEK162, и ингибиторы иммунных контрольных точек, включая ниволумаб, пембролизумаб, и ипилимумаб, хотя терапевтический агент для лечения рака этим не ограничивается, при условии, что препарат обладает противоопухолевой активностью.

[0218] Такую фармацевтическую композицию можно приготовить в виде композиции, имеющей выбранный состав и необходимую чистоту, в форме лиофилизированной композиции или жидкой композиции. Фармацевтическая композиция, приготовленная в виде лиофилизированной композиции, может представлять собой композицию, содержащую подходящую фармацевтическую добавку, используемую в данной области. Аналогично, жидкая композиция может быть приготовлена так, что жидкая композиция может содержать различные фармацевтические добавки, используемые в данной области.

[0219] Состав и концентрация фармацевтической композиции также варьируются в зависимости от способа введения. В отношение аффинности конъюгата анти-CDH6-антитело-лекарственное средство, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, к антигену, т.е. константа диссоциации (значение Kd) конъюгата анти-CDH6-антитело-лекарственное средство с антигеном, то по мере повышения аффинности (т.е. значение Kd низкое), фармацевтическая композиция может оказывать лекарственное действие, даже если ее применяемая доза снижена. Следовательно, применяемую дозу конъюгата антитело-лекарственное средство также можно определить установлением применяемой дозы на основе статуса аффинности конъюгата антитело-лекарственное средство к антигену. Когда конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению вводят человеку, то его можно вводить в дозе, например, примерно от 0,001 до 100 мг/кг один раз или многократно с интервалами от 1 до 180 суток. Предпочтительно его можно вводить в дозе от 0,1 до 50 мг/кг и более предпочтительно от 1 до 50 мг/кг, от 1 до 30 мг/кг, от 1 до 20 мг/кг, от 1 до 15 мг/кг, от 2 до 50 мг/кг, от 2 до 30 мг/кг, от 2 до 20 мг/кг или от 2 до 15 мг/кг многократно с интервалами от 1 до 4 недель, предпочтительно от 2 до 3 недель.

Примеры

[0220] Далее настоящее изобретение будет конкретно описано в следующих примерах. Однако эти примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Кроме того, эти примеры не следует истолковывать каким-либо образом ограничивающими изобретение. Следует отметить, что в следующих примерах, если не указано иное, то отдельные операции, касающиеся генетических манипуляций, выполнялись в соответствии с методами, описанными в руководстве «Molecular Cloning» (Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis, T., опубликованном Cold Spring Harbor Laboratory Press в 1989), или другими методами, описанными в экспериментальных руководствах, используемых специалистами в данной области, или когда использовали коммерчески доступные реагенты или наборы, то примеры выполняли в соответствии с инструкциями, включенными в коммерчески доступные продукты. В настоящем описании реагенты, растворители и исходные вещества являются легкодоступными из коммерческих источников, если не указано иное.

[0221] Пример 1: получение крысиного антитела против человеческого CDH6, обладающего способностью к интернализации

1)-1. Конструирование экспрессионных векторов CDH6 человека, мыши, крысы и обезьяны cynomolgus

С использованием экспрессионного вектора с кДНК, кодирующей белок человеческого CDH6 (NP_004923) (OriGene Technologies Inc., RC217889), кДНК включали в экспрессионный вектор для млекопитающих в соответствии со способом, известным специалистам в данной области, с получением экспрессионного вектора CDH6 человека pcDNA3.1-hCDH6. Аминокислотная последовательность ORF CDH6 человека (открытой рамки считывания) показана в SEQ ID NO: 1.

[0222] С использованием экспрессионного вектора с кДНК, кодирующей белок мышиного CDH6 (NP_031692) (OriGene Technologies Inc., MC221619), кДНК вводили в экспрессионный вектор для млекопитающих в соответствии со способом, известным специалистам в данной области, с получением экспрессионных векторов мышиного CDH6 pcDNA3.1-mCDH6 и p3xFLAG-CMV-9-mCDH6. Аминокислотная последовательность ORF мышиного CDH6 показана в SEQ ID NO: 7.

[0223] Используя каждый фрагмент кДНК экспрессионного вектора с кДНК, кодирующей белок крысиного CDH6 (NP_037059) (OriGene Technologies Inc., RN211850), кДНК включали в экспрессионный вектор для млекопитающих в соответствии со способом, известным специалистам в данной области с получением экспрессионных векторов крысиного CDH6 pcDNA3.1-rCDH6 и p3xFLAG-CMV-9-rCDH6. Аминокислотная последовательность ORF крысиного CDH6 показана в SEQ ID NO: 8.

[0224] кДНК, кодирующую белок CDH6 обезьяны cynomolgus, клонировали с кДНК, синтезированной из общей фракции РНК почки обезьяны cynomolgus, в качестве матрицы с использованием праймера 1 (5'-CACCATGAGAACTTACCGCTACTTCTTGCTGCTC-3') (SEQ ID NO: 85) и праймера 2 (5'-TTAGGAGTCTTTGTCACTGTCCACTCCTCC-3') (SEQ ID NO: 86). Было подтверждено, что полученная последовательность соответствует внеклеточной области CDH6 обезьяны cynomolgus (NCBI, XP_005556691.1). Также было подтверждено, что последовательность соответствует полноразмерной последовательности CDH6 обезьяны cynomolgus (EHH54180.1), зарегистрированной в EMBL. кДНК вставляли в экспрессионный вектор для млекопитающих в соответствии со способом, известным специалистам в данной области, с получением экспрессионного вектора CDH6 обезьяны cynomolgus pcDNA3.1-cynoCDH6. Аминокислотная последовательность ORF CDH6 обезьяны cynomolgus показана в SEQ ID NO: 9.

[0225] Набор EndoFree Plasmid Giga (Qiagen N.V.) использовали для массовой продукции полученной плазмидной ДНК.

[0226] 1)-2. Иммунизация

Для иммунизации использовали крыс-самок WKY/Izm (Japan SLC, Inc.). Сначала задние конечности каждой крысы предварительно обрабатывали гиалуронидазой (Sigma-Aldrich Co. LLC), и затем вектор экспрессии человеческого CDH6 pcDNA3.1-hCDH6, полученный в примере 1)-1, вводили внутримышечно в эти участки. Затем, используя ECM830 (BTX), проводили электропорацию in vivo на этих участках с использованием двухигольчатого электрода. Примерно один раз в две недели такую электропорацию повторяли in vivo, после чего у крысы отбирали образцы лимфатических узлов или селезенки, и затем использовали для получения гибридом.

[0227] 1)-3. Получение гибридом

Клетки лимфатического узла или клетки селезенки подвергали слиянию с клетками мышиной миеломы SP2/0-ag14 (ATCC, № CRL-1 581) в соответствии с методом электрослияния клеток с использованием LF301 Cell Fusion Unit (BEX Co., Ltd.), и затем клетки суспендировали и разбавляли средой ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies Inc.), и затем культивировали в условиях 37°C и 5% CO₂. Отдельные гибридомные колонии, которые появились в культуральной среде, собирали в виде моноклональных гибридом, затем суспендировали в жидкой среде E для для селекции гибридом ClonaCell-HY (StemCell Technologies Inc.) и затем культивировали в условиях 37°С и 5% CO₂. После умеренной пролиферации клеток получали замороженные стоки отдельных клеток гибридомы, в то время как полученный супернатант гибридомной культуры использовали для скрининга гибридом, продуцирующих антитела против человеческого CDH6.

[0228] 1)-4. Скрининг гибридом, продуцирующих антитела, методом Cell-ELISA

1)-4-1. Подготовка клеток, экспрессирующих ген антигена, для использования в Cell-ELISA

Клетки 293α (клеточная линия со стабильной экспрессией, происходящая из клеток HEK293, экспрессирующих интегрин αv и интегрин β3) получали с титром 5×10⁵ клеток/мл в среде DMEM с добавлением 10% FBS. В соответствии с процедурами трансдукции с использованием липофектамина 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.) ДНК pcDNA3.1-hCDH6 или pcDNA3.1-cynoCDH6 или pcDNA3.1, который использовали в качестве отрицательного контроля, вводили в клетки 293α, и клетки распределяли из расчета 100 мкл/лунку в 96-луночный планшет (Corning Inc.). После этого клетки культивировали в условиях 37°С и 5% СО₂ в среде DMEM с добавлением 10% FBS в течение 24-27 ч. Полученные трансфицированные клетки использовали для Cell-ELISA в адгезивном состоянии.

[0229] 1)-4-2. Cell-ELISA

Культуральный супернатант клеток 293α, трансфицированных вектором экспрессии, полученным в примере 1)-4-1, удаляли, и затем культуральный супернатант из каждой гибридомы добавляли к клеткам 293α, трансфицированным pcDNA3.1-hCDH6 или pcDNA3.1-cynoCDH6 или pcDNA3.1. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки в лунках промывали один раз PBS (+) с добавлением 5% FBS, и затем в лунки добавляли IgG антитело против крысиной пероксидазы, продуцированное у кролика (Sigma-Aldrich Co. LLC), которое разбавляли в 500 раз PBS (+) с добавлением 5% FBS. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки в лунках трижды промывали PBS (+) с добавлением 5% FBS и затем вносили окрашивающий раствор OPD (который готовили растворением о-фенилендиамина дигидрохлорида (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и H₂O₂ в растворе OPD (0,05 М тринатрий цитрата, 0,1 М гидрофосфата натрия с 12 H₂O₂; рН 4,5), так что концентрация соединений становилась равной 0,4 мг/мл и 0,6% (об./об.) соответственно, в лунки из расчета 100 мкл/лунку. Реакцию окрашивания проводили с периодическим перемешиванием. После этого добавляли в планшет добавляли 1 М HCl (100 мкл/лунку) для остановки реакции окрашивания с последующим измерением поглощения при 490 нм с использованием ридера для планшетов (ENVISION: PerkinElmer, Inc.). Гибридомы, которые продуцировали культуральный супернатант, проявляющий более высокую абсорбцию в клетках 293α, трансфицированных экспрессионным вектором pcDNA3.1-hCDH6 или pcDNA3.1-cynoCDH6, чем в клетках 293α, трансфицированных контрольным pcDNA3.1, выбирали в качестве гибридом, продуцирующих антитела, связывающиеся с CDH6 человека и CDH6 обезьяны cynomolgus.

[0230] 1)-5. Селективный скрининг на связывание антитела с CDH6 обезьяны cynomolgus с использованием проточной цитометрии

1)-5-1. Подготовка клеток, экспрессирующих ген антигена для использования в анализе проточной цитометрией

Клетки 293T высевали в культуральный флакон емкостью 225 см² (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) из расчета 5×10⁴ клеток/см², и затем клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO₂ в среде DMEM с добавлением 10% FBS. pcDNA3.1-cynoCDH6 или pcDNA3.1, который использовали в качестве отрицательного контроля, вводили в клетки 293T с использованием липофектамина 2000, и клетки дополнительно культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO₂. Клетки 293T, трансфицированные каждым вектором, обрабатывали TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Corp.), и клетки промывали DMEM с добавлением 10% FBS и затем суспендировали в PBS с добавлением 5% FBS. Полученную клеточную суспензию использовали для анализа проточной цитометрией.

[0231] 1)-5-2. Анализ проточной цитометрией

Специфичность связывания с CDH6 обезьяны cynomolgus антитела, полученного из гибридом, продуцирующих CDH6-связывающие антитела CDH6 человека и обезьяны cynomolgus, которые были отобраны с помощью Cell-ELISA в примере 1)-4, дополнительно подтверждали проточной цитометрией. Суспензию клеток 293Т с транзиентной экспрессией, полученную в примере 1) -5-1, центрифугировали и затем супернатант удаляли. Затем клетки суспендировали добавлением культурального супернатанта из каждой гибридомы. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS, и затем клетки суспендировали добавлением конъюгата антикрысиного IgG с FITC (Sigma-Aldrich Co. LLC), который разбавляли в 500 раз PBS с добавлением 5% FBS. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS, и затем ресуспендировали в PBS с добавлением 5% FBS и 2 мкг/мл 7-аминоактиномицина D (Molecular Probes, Inc.) с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). После того, как мертвые клетки были удалены из анализа гейтированием 7-аминоактиномицин D-позитивных клеток, генерировали гистограмму интенсивности флуоресценции FITC живых клеток. Гибридомы, продуцирующие антитела, специфически связывающиеся с CDH6 обезьяны cynomolgus, экспрессированные на поверхности клеточной мембраны, отбирали на основе результатов, где гистограмма для антитела смещалась в сторону высокой интенсивности флуоресценции в клетках 293T, трансфицированных pcDNA3.1-cynoCDH6, по сравнению с клетками, трансфицированными 293T, трансфицированных контрольным pcDNA3.1.

[0232] 1)-6. Определение изотипа крысиного моноклонального антитела

Клоны rG019, rG055, rG056 и rG061, предположительно специфически и сильно связывающиеся с CDH6 человека и CDH6 обезьяны отбирали из гибридом, продуцирующих крысиные анти-CDH6-антитела, отобранные в примере 1)-5, и идентифицировали изотип каждого антитела. Подкласс тяжелой цепи и тип легкой цепи антитела определяли с использованием набора для изотипирования крысиных моноклональных антител (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). В результате было подтверждено, что все эти 4 клона rG019, rG055, rG056 и rG061 имели тяжелую цепь подкласса IgG2b и легкую цепь κ типа.

[0233] 1)-7-1. Получение крысиного антитела против человеческого CDH6

1)-7-1. Получение культурального супернатанта

Крысиные моноклональные антитела против человеческого CDH6 выделяли из гибридомных культуральных супернатантов. Сначала объем каждой крысиной гибридомы, продуцирующей крысиное моноклональное антитело против CDH6, был достаточно увеличен с помощью селективной среды ClonaCell-HY E (StemCell Technologies Inc.), и затем среду заменяли на Hybridoma SFM (Thermo Fisher Scientific Corp.), к смеси добавляли 20% телячьей эмбриональной сыворотки Ultra Low IgG FBS (Thermo Fisher Scientific Corp.). После этого гибридому культивировали в течение 4-5 суток. Полученный культуральный супернатант собирали и из него удаляли нерастворимое вещество, пропуская через фильтр 0,8 мкм и через фильтр 0,2 мкм.

[0234] 1)-7-2. Очистка крысиного анти-CDH6-антитела

Антитело (крысиное анти-CDH6-антитело (rG019, rG055, rG056 или rG061)) выделяли из культурального супернатанта гибридом, полученного в примере 1)-7-1, с использованием аффинной хроматографии с протеином G. Антитело адсорбировали на колонке с протеином G (GE Healthcare Biosciences Corp.), затем колонку промывали PBS и затем антитело элюировали 0,1 М водным раствором глицина/HCl (рН 2,7). К элюату добавляли 1 М трис-HCl (рН 9,0), тем самым доводя рН до 7,0-7,5. Затем, используя центрифужное фильтрационное устройство UF VIVASPIN20 (отсечение по молекулярной массе: UF30K, Sartorius Inc.), буфер заменяли на HBSor (25 мМ гистидин/5% сорбита, pH 6,0), одновременно концентрируя антитело, с доведением концентрации антитела до 1 мг/мл. Наконец, антитело фильтровали через фильтр Minisart-Plus (Sartorius Inc.), с получением очищенного образца.

[0235] Пример 2: оценка in vitro крысиного анти-CDH6-антитела

2)-1. Оценка активности связывания крысиного анти-CDH6-антитела методом проточной цитометрии

Активность связывания с человеческим CDH6 крысиного анти-CDH6-антитела, полученного в примере 1)-7, оценивали с помощью проточной цитометрии. Используя липофектамин 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.), pcDNA3.1-hCDH6, полученный в примере 1)-1, транзиентно вводили в клетки 293T (ATCC). Клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°С и 5% СО₂, и затем готовили клеточную суспензию. Суспензию трансфицированных клеток 293Т центрифугировали и затем супернатант удаляли. Затем клетки суспендировали добавлением каждого из 4 крысиных моноклональных анти-CDH6-антител (клоны NG: rG019, rG055, rG056 и rG061), которые были получены в примере 1)-7, или контрольного крысиного IgG (R & D Systems, Inc.) (конечная концентрация: 10 нг/мл). Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS, и затем суспендировали добавлением антитела против крысиного IgG (цельная молекула)-FITC, продуцированного у кролика (Sigma-Aldrich Co. LLC), которое в 50 раз разбавляли PBS с добавлением 5% FBS. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Данные были анализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты показаны на фиг. 1. На гистограмме фиг. 1 на оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток. Затененная гистограмма показывает, что использовали нетрансфицированные hCDH6 клетки 293T в качестве отрицательного контроля, и незатененная гистограмма в виде сплошной линии показывает, что использовали клетки 293T, трансфицированные hCDH6. Как видно, интенсивность флуоресценции усиливалась за счет связывания антитела с hCDH6 на клеточной поверхности. Крысиный контрольный IgG не связывается с клетками. В результате было подтверждено, что 4 продуцированных крысиных моноклональных анти-CDH6-антитела связываются с клетками 293T, трансфицированными pcDNA3.1-hCDH6.

[0236] 2)-2. Анализ CDH6-связывающего сайта крысиного анти-CDH6-антитела с помощью проточной цитометрии

2)-2-1. Конструирование экспрессионного вектора для мутанта CDH6 человека с делецией каждого домена

Полноразмерная внеклеточная область человеческого CDH6 имеет пять внеклеточных доменов: EC1 (SEQ ID NO: 2), EC2 (SEQ ID NO: 3), EC3 (SEQ ID NO: 4), EC4 (SEQ ID NO: 5), и EC5 (SEQ ID NO: 6). Ген, который должен быть экспрессирован таким образом, чтобы каждый из пяти доменов ЕС можно было делецировать из полноразмерного человеческого CDH6, синтезировали GeneArt и вставляли в векторы p3×FLAG-CMV-9 для экспрессии в клетках млекопитающих (Sigma-Aldrich Co. LLC) согласно способу, известному специалистам в данной области, с получением экспрессионного вектора для мутанта с делецией каждого домена, в котором отсутствует один из EC1-EC5.

[0237] 2)-2-2. Эпитопный анализ крысиного анти-CDH6-антитела с помощью проточной цитометрии с использованием мутанта с делецией домена

Эпитопы, с которыми связывались крысиные антитела против человеческого CDH6, идентифицировали методом проточной цитометрии с использованием клеточной линии 293, трансфицированной вектором с делецией каждого домена EC. Используя липофектамин 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.), каждый экспрессионный вектор мутанта с делецией домена, полученный в примере 2)-2-1, или pcDNA3.1-hCDH6 для экспрессии полноразмерного человеческого CDH6 транзиентно вводили в клеточную линию 293α, которая представляла собой клеточную линию, полученную из клеток HEK293 посредством стабильной трансфекции векторами экспрессии интегрина αv и интегрина β3. Клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°С и 5% СО₂, и затем готовили клеточную суспензию. Суспензию трансфицированных клеток 293α центрифугировали и затем супернатант удаляли. После этого клетки суспендировали добавлением каждого из 4 крысиных моноклональных анти-CDH6-антител (клоны: rG019, rG055, rG056 и rG061), которые были получены в примере 1)-7, или контрольного крысиного IgG (R & D Systems, Inc.) (конечная концентрация: 20 нМ). Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS, и затем суспендировали добавлением антитела против крысиного IgG (цельная молекула)-FITC, продуцированного у кролика (Sigma-Aldrich Co. LLC), которое разбавляли в 50 раз PBS с добавлением 5% FBS. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (Canto II; BD Biosciences). Данные анализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты показаны на фиг. 2-1 по 2-6. На гистограммах на фиг. 2-1 по 2-6 на оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ордината показано количество клеток. Затемненная гистограмма показывает, что использовали нетрансфицированные клетки 293α в качестве отрицательного контроля, и незатемненная гистограмма в виде сплошной линии показывает, что использовали клетки 293, экспрессирующие полноразмерный hCDH6 или мутант с делецией каждого домена EC. Интенсивность флуоресценции усиливается, когда антитело связывается с полноразмерным hCDH6 или мутантом с делецией каждого домена EC на клеточной поверхности. Крысиный контрольный IgG не связывается с трансфицированными клетками. Полученные 4 крысиных моноклональных анти-CDH6-антитела связываются с полноразмерным hCDH6, мутантом с делецией EC1, мутантом с делецией EC2, мутантом с делецией EC4 и мутантом с делецией EC5, но не связываются с мутантом с делецией EC3. Данные результаты показывают, что 4 моноклональных крысиных анти-CDH6-антитела специфически связываются с EC3 в hCDH6 в качестве эпитопа.

[0238] 2)-3. Способность к интернализации крысиного анти-CDH6-антитела

2)-3-1. Подтверждение экспрессии CDH6 в линии опухолевых клеток человека

Для выбора CDH6-позитивной линии опухолевых клеток человека для использования при оценке полученных антител, получали информацию об экспрессии CDH6 из известной базы данных, и экспрессию CDH6 на поверхности клеточной мембраны оценивали с помощью проточной цитометрии. Клеточные линии опухоли яичника человека NIH:OVCAR-3, PA-1 и ES-2 и клеточную линию почечноклеточной опухоли человека 786-O (все получены из ATCC) культивировали в условиях 37°С и 5% CO₂, и затем готовили клеточную суспензию. Клетки центрифугировали и затем супернатант удаляли. После этого клетки суспендировали добавлением коммерчески доступного антитела против человеческого CDH6 (MABU2715, R & D Systems, Inc.) или мышиного IgG1 (BD Pharmingen), который использовали в качестве отрицательного контроля (конечная концентрация: 50 мкг/мл). Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS, и затем суспендировали добавлением FITC-конъюгированного F(ab')₂-фрагмента козьих антител против мышиных иммуноглобулинов (Dako), который разбавляли в 50 раз PBS с добавлением PBS 5% FBS. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (Canto II; BD Biosciences). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты показаны на фиг.3. На гистограмме на фиг.3 на оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции FITC, указывающая количество связанного антитела, и на оси ордината показано количество клеток. Затемненная гистограмма показывает, что mIgG1 использовали в качестве отрицательного контроля при окрашивании, и незатемненная гистограмма в виде сплошной линии показывает, что использовали антитело против человеческого CDH6 при окрашивании. Как видно, интенсивность флуоресценции усиливалась за счет связывания антитела с hCDH6 на клеточной поверхности. Контрольный mIgG1 не связывается с клетками. В результате было подтверждено, что клеточные линии NIH:OVCAR-3, PA-1 и 786-O эндогенно экспрессируют CDH6 на клеточной поверхности. С другой стороны, было показано, что клеточная линия ES-2 не экспрессирует CDH6.

[0239] 2)-3-2. Оценка способности к интернализации крысиного анти-CDH6-антитела

Способность к интернализации крысиных анти-CDH6-антител оценивали с использованием реагента Rat-ZAP против крысиного IgG (Advanced Targeting Systems), конъюгированного с токсином (сапорином), ингибирующим синтез белка. В частности, человеческий CDH6-позитивную клеточную линию опухоли яичника человека NIH:OVCAR-3 (ATCC) высевали из расчета 4×10³ клеток/лунку в 96-луночный планшет, и затем культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO₂. Человеческий CDH6-позитивную клеточную линию почечноклеточной опухоли человека 786-O (ATCC) высевали из расчета 1×10³ клеток/лунку в 96-луночный планшет, и затем культивировали в течение ночи. На следующий день каждое крысиное антитело против CDH6 (конечная концентрация: 1 нМ) или крысиное IgG2b антитело (R & D Systems, Inc.), которое использовали в качестве отрицательного контроля, добавляли в планшет. Затем в планшет добавляли Rat-ZAP (конечная концентрация: 0,5 нМ) или козий F(гамма)₂-фрагмент против мышиных иммуноглобулинов (Dako) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), не конъюгированный с токсином (конечная концентрация: 0,5 нМ) в качестве отрицательного контроля, и клетки культивировали в условиях 37°С и 5% СО₂ в течение 3 суток. Количество живых клеток измеряли количественным определением активности ATP (RLU) с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo™ (Promega Corp.). В этом анализе Rat-ZAP проникает в клетки, в зависимости от способности крысиного анти-CDH6-антитела к интернализации, в результате сапорин, ингибирующий синтез белка, высвобождается в клетки с подавлением роста клеток. Эффект ингибирования роста клеток, вызванный добавлением анти-CDH6-антитела, определяется относительной выживаемостью, когда количество живых клеток в лунке с отрицательным контролем вместо Rat-ZAP устанавливали на 100%. На фиг. 4 приведен график и таблица с данными по выживаемости клеток. В результате было показано, что крысиные анти-CDH6-антитела связываются с CDH6 и вызывают интернализацию.

[0240] Пример 3: определение нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей вариабельную область крысиного анти-CDH6-антитела

3)-1. Амплификация и секвенирование фрагментов гена вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи rG019

3)-1-1. Получение общей фракции РНК из G019

Для амплификации кДНК, кодирующей каждую вариабельную область rG019, получали общую фракцию РНК из G019 с использованием реагента TRIzol (Ambion, Inc.).

3)-1-2. Амплификация кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи rG019, с помощью 5'-RACE ПЦР и определение нуклеотидной последовательности

кДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, амплифицировали, используя примерно 1 мкг общей РНК, полученной в примере 3)-1-1, и набор для амплификации кДНК SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.). В качестве праймеров для амплификации кДНК вариабельной области гена тяжелой цепи rG019 в соответствии с ПЦР, использовали UPM (Universal Primer A Mix: входит в набор для амплификации кДНК SMARTer RACE) и использовали праймеры, сконструированные из известных последовательностей константных областей крысиных тяжелых цепей.

[0242] кДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, амплифицированную с помощью 5'-RACE ПЦР, клонировали в плазмиду, и после этого нуклеотидную последовательность кДНК вариабельной области тяжелой цепи подвергали секвенированию.

[0243] Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи rG019, показана в SEQ ID NO: 16, и ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 15.

3)-1-3. Амплификация кДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи rG019, с помощью 5'-RACE ПЦР и определение нуклеотидной последовательности

Амплификацию и секвенирование проводили тем же методом, который использовали в примере 3)-1-2. Однако в качестве праймеров для амплификации кДНК вариабельной области гена легкой цепи rG019 в соответствии с ПЦР, использовали UPM (Universal Primer A Mix: входит в набор для амплификации кДНК SMARTer RACE) и использовали праймеры, сконструированные из известных последовательностей константных областей крысиных легких цепей.

[0245] Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи rG019, показана в SEQ ID NO: 11, и ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 10.

[0246] 3)-2. Амплификация и секвенирование фрагментов гена вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи rG055

Последовательности определяли тем же методом, который использовали в примере 3)-1.

[0247] Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи rG055, показана в SEQ ID NO: 26, и ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 25. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи rG055 показана в SEQ ID NO: 21, и ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 20.

3)-3. Амплификация и секвенирование фрагментов гена вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи rG056

Последовательности определяли тем же методом, который использовали в примере 3)-1.

Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи rG056, показана в SEQ ID NO: 36, и ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 35. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи rG056 показана в SEQ ID NO: 31, и ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 30.

3)-4. Амплификация и секвенирование фрагментов гена вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи rG061

Последовательности определяли тем же методом, который применяли в примере 3)-1.

[0251] Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи rG061, показана в SEQ ID NO: 46, и ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 45. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи rG061 показана в SEQ ID NO: 41, и ее аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 40.

[0252] Пример 4: получение человеческого-химерного анти-CDH6-антитела chG019

4)-1. Конструирование экспрессионного вектора человеческого-химерного анти-CDH6-антитела chG019

4)-1-1. Конструирование экспрессионного вектора химерной и гуманизированной легкой цепи pCMA-LK

Фрагмент размером 5,4 т.п.н., который был получен расщеплением плазмиды pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.) рестриктазами XbaI и PmeI, связывали с фрагментом ДНК, содержащим последовательность ДНК (SEQ ID NO: 50), кодирующую сигнальную последовательность легкой цепи человека и константную область человеческой цепи с использованием набора для клонирования In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) для получения pcDNA3.3/LK.

[0253] Функциональную единицу экспрессии гена неомицина удаляли из pcDNA3.3/LK для конструирования pCMA-LK.

4)-1-2 Конструирование экспрессионного вектора химерной и гуманизированной тяжелой цепи типа IgG1 pCMA-G1

Фрагмент ДНК, который был получен расщеплением pCMA-LK рестриктазами XbaI и PmeI, для удаления последовательности ДНК, кодирующей сигнальную последовательность легкой цепи и константную область человеческой цепи, связывали с фрагментом ДНК, содержащим последовательность ДНК (SEQ ID NO: 51), кодирующим сигнальную последовательности тяжелой цепи человека и константную область человеческого IgG1 с использованием набора для клонирования In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) для конструирования pCMA-G1.

[0255] 4)-1-3. Конструирование экспрессионного вектора тяжелой цепи chG019

Синтезировали фрагмент ДНК из нуклеотидных положений 36-440 в нуклеотидной последовательности тяжелой цепи chG019, показанной в SEQ ID NO: 57 (GENEART). С использованием набора для клонирования In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.) синтезированный фрагмент ДНК вставляли в сайт pCMA-G1, который был расщеплен рестриктазой BlpI, для конструирования вектора экспрессии тяжелой цепи chG019. Следует отметить, что для тяжелой цепи chG019 использовали последовательность CDR с цистеином, замещенным пролином, для предупреждения образования непредполагаемых дисульфидных связей.

[0256] 4)-1-4. Конструирование экспрессионного вектора легкой цепи chG019

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК (SEQ ID NO: 52), кодирующую легкую цепь chG019 (GENEART). С использованием набора для клонирования In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.) синтезированный фрагмент ДНК связывали с фрагментом ДНК, который получали расщеплением pCMA-LK с помощью XbaI и PmeI для удаления последовательности ДНК, кодирующей сигнальную последовательность легкой цепи и константную область человеческой κ цепи из нее, для конструирования экспрессионного вектора легкой цепи chG019.

[0257] 4)-2. Получение и очистка человеческого-химерного анти-CDH6-антитела chG019

4)-2-1. Получение chG019

В соответствии с наставлением клетки FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) культивировали и пассажировали. 1,2×10⁹ клеток FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) в логарифмической фазе роста высевали в колбе Фернбаха-Эрленмейера емкостью 3 л (Corning Inc.), затем разбавляли экспрессионной средой FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) при 2,0×10⁶ клеток/мл. К 40 мл среды Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.) добавляли 0,24 мг экспрессионного вектора тяжелой цепи, 0,36 мг экспрессионного вектора легкой цепи и 1,8 мг полиэтиленимина (Polyscience # 24765) и полученную смесь осторожно перемешивали. После инкубации в течение 5 мин смесь добавляли к клеткам FreeStyle 293F. Клетки культивировали при встряхивании со скоростью 90 об/мин в термостате с 8% CO₂ при 37°C в течение 4 ч, и затем 600 мл среды EX-CELL VPRO (SAFC Biosciences Inc.), 18 мл GlutaMAX I (GIBCO), и 30 мл дрожжевого ультрафильтрата (GIBCO) добавляли к культуре. Затем клетки культивировали при встряхивании со скоростью 90 об/мин в термостате с 8% CO₂ при 37°C в течение 7 суток. Полученный культуральный супернатант фильтровали через одноразовый капсульный фильтр (Advantec # CCS-045-E1H).

[0258] 4)-2-2. Выделение chG019

Антитело выделяли из культурального супернатанта, полученного в примере 4)-2-1, одностадийным способом с использованием аффинной хроматографии с протеином А. Культуральный супернатант наносили на колонку, которая была заполнена MabSelectSuRe (GE Healthcare Biosciences Corp.), уравновешивали PBS, и затем колонку промывали PBS в количестве, в два или более раза превышающем объем колонки. Затем антитело элюировали 2 М раствором гидрохлорида аргинина (рН 4,0), в результате собирали фракцию, содержащую антитело. Фракцию подвергали диализу (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), в результате буфер заменяли HBSor (25 мМ гистидин/5% сорбита, pH 6,0). Используя центрифужное фильтрационное устройство UF VIVASPIN20 (отсечение по молекулярной массе: UF10K, Sartorius Inc.), антитело концентрировали с доведением концентрации IgG до 5 мг/мл или выше. Наконец, антитело фильтровали через фильтр Minisart-Plus (Sartorius Inc.) с получением очищенного образца.

[0259] 4)-3. Оценка активности связывания человеческого-химерного анти-CDH6-антитела chG019

Активность связывания с CDH6 человеческого-химерного анти-CDH6-антитела chG019, выделенного в примере 4)-2, подтверждали проточной цитометрией. Используя липофектамин 2000, pcDNA3.1-hCDH6 или pcDNA3.1-cynoCDH6, полученный в примере 1)-1, или pcDNA3.1 транзиентно вводили в клетки 293α. Клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°С и 5% СО₂, и затем готовили клеточную суспензию. chG019 добавляли к суспензии каждой из этих клеток. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. После этого клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS, и затем суспендировали добавлением PE-меченного F(ab')₂-фрагмента антитела Fcγ против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), который разбавляли в 500 раз PBS с добавлением 5% FBS. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS и затем ресуспендировали в PBS с добавлением 5% FBS с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (Canto II; BD Biosciences). Данные анализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Как показано на фиг.5, chG019 не связывалось с клетками 293α, трансфицированными pcDNA3.1, который использовали в качестве отрицательного контроля, но связывалось с клетками 293α, трансфицированными pcDNA3.1-hCDH6 или pcDNA3.1-cynoCDH6, в зависимости от концентрации антитела. На фиг.5 на оси абсцисс показана концентрация антитела, и на оси ординат показано количество связанного антитела, основываясь на средней интенсивности флуоресценции. Данные результаты показывают, что chG019 специфически связывается с CDH6 человека и CDH6 обезьяны cynomolgus с почти одинаковой активностью связывания.

[0260] Пример 5: Получение гуманизированного анти-CDH6-антитела

5)-1. Конструирование гуманизированной формы анти-CDH6-антитела

5)-1-1. Молекулярное моделирование вариабельной области chG019

При молекулярном моделировании вариабельных областей chG019 использовали метод, известный как гомологическое моделирование (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Использовали коммерчески доступную программу анализа трехмерной структуры белков BioLuminate (производства Schrodinger, LLC) с использованием в качестве матрицы структуры (PDB ID: 2I9L), зарегистрированной в банке данных белков (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303). (2007)) с высокой идентичностью последовательности с вариабельными областями тяжелой цепи и легкой цепи chG019.

[0261] 5)-1-2. Конструирование аминокислотной последовательности гуманизированного hG019

chG019 гуманизировали с помощью метода CDR-прививки (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Консенсусные последовательности подгруппы 1 человеческой гамма цепи и подгруппы 1 каппа цепи определяли согласно системе нумерации KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) имели высокую идентичность с каркасными областями chG019, и на основании этого выбирали в качестве акцепторов для тяжелой цепи и легкой цепи соответственно. Донорные остатки, которые должны быть привиты на акцепторы, отбирали анализом трехмерных моделей со ссылкой, например, на критерии, приведенные Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)).

[0262] 5)-2. Гуманизация тяжелой цепи chG019

Три тяжелые цепи, сконструированные таким образом, были названы hH01, hH02 и hH04. Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи hH01 показана в SEQ ID NO: 69. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, показана в SEQ ID NO: 70. Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи hH02 показана в SEQ ID NO: 73. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, показана в SEQ ID NO: 74. Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи hH04 показана в SEQ ID NO: 77. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77, показана в SEQ ID NO: 78.

[0263] 5)-3. Гуманизация легкой цепи chG019

Две легкие цепи, сконструированные таким образом, были названы hL02 и hL03. Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи hL02 показана в SEQ ID NO: 61. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, показана в SEQ ID NO: 62. Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи hL03 показана в SEQ ID NO: 65. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, показана в SEQ ID NO: 66.

[0264] 5)-4. Конструирование гуманизированного hG019 комбинированием тяжелой цепи и легкой цепи

Антитело, состоящее из hH01 и hL02, было названо «антителом H01L02» или «H01L02». Антитело, состоящее из hH02 и hL02, было названо «антителом H02L02» или «H02L02». Антитело, состоящее из hH02 и hL03, было названо «антителом H02L03» или «H02L03». Антитело, состоящее из hH04 и hL02, было названо «антителом H04L02» или «H04L02».

[0265] 5)-5. Экспрессия гуманизированного анти-CDH6-антитела

5)-5-1. Конструирование экспрессионного вектора гуманизированной тяжелой цепи hG019

5)-5-1-1. Конструирование экспрессионного вектора гуманизированной тяжелой цепи типа hG019-H01

Синтезировали фрагмент ДНК из нуклеотидных положений 36-440 в нуклеотидной последовательности тяжелой цепи гуманизированного типа hG019-H01, показанной в SEQ ID NO: 70 (GENEART). Экспрессионный вектор гуманизированной тяжелой цепи типа hG019-H01 конструировали таким же методом, который использовали в примере 4)-1-3.

[266] 5)-5-1-2. Конструирование экспрессионного вектора гуманизированной тяжелой цепи типа hG019-H02

Синтезировали фрагмент ДНК из нуклеотидных положений 36-440 в нуклеотидной последовательности гуманизированной тяжелой цепи типа hG019-H01, показанной в SEQ ID NO: 70 (GENEART). Экспрессионный вектор гуманизированной тяжелой цепи типа hG019-H01 конструировали таким же методом, который использовали в примере 4)-1-3.

[267] 5)-5-1-3 Конструирование экспрессионного вектора гуманизированной тяжелой цепи типа hG019-H04

Синтезировали фрагмент ДНК из нуклеотидных положений 36-440 в нуклеотидной последовательности гуманизированной тяжелой цепи типа hG019-H04, показанной в SEQ ID NO: 78 (GENEART). Экспрессионный вектор гуманизированной тяжелой цепи типа hG019-H04 конструировали таким же методом, который использовали в примере 4)-1-3.

[268] 5)-5-2. Конструирование экспрессионного вектора гуманизированной легкой цепи hG019

5)-5-2-1. Конструирование экспрессионного вектора гуманизированной легкой цепи типа hG019-L02

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область гуманизированной легкой цепи типа hG019-L02, из нуклеотидных положений 37-399 в нуклеотидной последовательности гуманизированной легкой цепи типа hG019-L02, показанной в SEQ ID NO: 62 (GENEART). Используя набор для клонирования In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.), синтезированный фрагмент ДНК вставляли в сайт pCMA-LK, который был расщеплен рестриктазой BsiWI, с получением экспрессионного вектора гуманизированный легкой цепи типа hG019-L02.

[269] 5)-5-2-2. Конструирование экспрессионного вектора гуманизированной легкой цепи типа hG019-L03

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область гуманизированной легкой цепи типа hG019-L03, из нуклеотидных положений 37-399 в нуклеотидной последовательности гуманизированной легкой цепи типа hG019-L03, показанной в SEQ ID NO: 66 (GENEART). Экспрессионный вектор гуманизированной легкой цепи типа hG019-L03 конструировали таким же методом, который использовали в примере 5)-5-2-1.

[0270] 5)-5-3. Получение гуманизированного hG019

5)-5-3-1. Получение H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02

Антитела получали тем же методом, который использовали в примере 4)-2-1. H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02 получали комбинированием тяжелой цепи и легкой цепи, показанных в примере 5)-4.

[0271] 5)-5-3-2. Двустадийное выделение H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02

Антитело выделяли из культурального супернатанта, полученного в примере 5)-5-3-1, двустадийным способом, а именно аффинной хроматографией на протеине А и керамическом гидроксиапатите. Культуральный супернатант наносили на колонку, которая была заполнена MabSelectSuRe (производства GE Healthcare Biosciences Corp.), уравновешивали PBS, и после этого колонку промывали PBS в количестве, в два или более раза превышающем объем колонки. Затем антитело элюировали с использованием 2 М раствора аргинина гидрохлорида (рН 4,0). Фракцию, содержащую антитело, подвергали диализу (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), с заменой буфера на PBS. Раствор антитела разбавляли в 5 раз буфером 5 мМ фосфата натрия/50 мМ MES/pH 7,0 и затем наносили на колонку с керамическим гидроксиапатитом (Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite), которую уравновешивали буфером 5 мМ NaPi/50 мМ MES/30 мМ NaCl/pH 7,0. Элюирование проводили в линейном градиенте концентрации хлорида натрия, в результате собирали фракцию, содержащую антитело. Эту фракцию подвергали диализу (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), с заменой буфера на HBSor (25 мМ гистидин/5% сорбит, pH 6,0). Антитело концентрировали с помощью центрифужного фильтрационного устройства UF VIVASPIN20 (отсечение по молекулярной массе: UF10K, Sartorius Inc.), тем самым доводя концентрацию IgG до 20 мг/мл. Наконец, антитело фильтровали через фильтр Minisart-Plus (Sartorius Inc.), с получением очищенного образца.

[0272] Ссылочный пример 1: получение анти-CDH6-антитела NOV0712

Анти-CDH6-антитело NOV0712, используемое в примерах, получали со ссылкой на аминокислотные последовательности полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи (SEQ ID NO: 235 и SEQ ID NO: 234, соответственно, в публикации международной зпявки WO 2016/024195) NOV0712, описанного в публикации международной заявки WO 2016/024195.

[0273] Ссылочный пример 1)-1. Анти-CDH6-антитело NOV0712

Ссылочный пример 1)-1-1. Конструирование экспрессионного вектора тяжелой цепи анти-CDH6-антитела NOV0712

Синтезировали фрагмент ДНК, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи NOV0712, из нуклеотидных положений 36-428 в нуклеотидной последовательности тяжелой цепи NOV0712, показанной в SEQ ID NO: 84, (GENEART). Экспрессионный вектор тяжелой цепи NOV0712 конструировали таким же методом, который использовали в примере 4)-1-3. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи NOV0712, экспрессированная вектором экспрессии тяжелой цепи NOV0712, показана в SEQ ID NO: 83. В аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 83, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет сигнальную последовательность.

[0274] Ссылочный пример 1)-1-2. Конструирование экспрессионного вектора легкой цепи анти-CDH6-антитела NOV0712

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи NOV0712, из нуклеотидных положений 37-405 в нуклеотидной последовательности легкой цепи NOV0712, показанной в SEQ ID NO: 82 (GENEART). Экспрессионный вектор легкой цепи NOV0712 конструировали таким же методом, который использовали в примере 5)-5-2-1. Аминокислотная последовательность легкой цепи NOV0712, экспрессированная вектором экспрессии легкой цепи NOV0712, показана в SEQ ID NO: 81. В аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 81, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет сигнальную последовательность.

[0275] Ссылочный пример 1)-2. Приготовление анти-CDH6-антитела NOV0712

Ссылочный пример 1)-2-1. Получение анти-CDH6-антитела NOV0712

NOV0712 получали тем же методом, который использовали в примере 4)-2-1.

[0276] Ссылочный пример 1)-2-2. Одностадийное выделение анти-CDH6-антитела NOV0712

Анти-CDH6-антитело NOV0712 выделяли из культурального супернатанта, полученного в ссылочном примере 1)-2-1, тем же методом, который использовали в примере 4)-2-2 (концентрация антитела: 5 мг/л HBSor).

[0277] Пример 6: оценка in vitro гуманизированных hG019 и NOV0712

6)-1. Оценка активности связывания гуманизированного hG019

6)-1-1. Антигенсвязывающая активность гуманизированного hG019 с человеческим CDH6

Константу диссоциации антитела и антигена (рекомбинантный человеческий-химерный CDH6 Fc His, R & D Systems, Inc.) измеряли с использованием Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences Corp.) в соответствии с захвата захвата, который включает захват антигена в качестве лиганда иммобилизованным анти-His антителом и затем измерение константы диссоциации с использованием антитела в качестве аналита. Примерно 1000 RU антигистидинового антитела (набор His capture, GE Healthcare Biosciences Corp.) ковалентно связывали с сенсорным чипом CM5 (GE Healthcare Biosciences Corp.) методом аминного связывания. Антитело также иммобилизовали на контрольных ячейках таким же образом, как указано выше. В качестве рабочего буфера использовали HBS-P+ (10 мМ HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,05% поверхностно-активного вещества P20), с добавлением 1 мМ CaCl₂. Антиген наносили на чип с иммобилизованным антигистидиновым антителом, в течение 60 с, и затем добавляли серийные разведения раствора (0,391-100 нМ) антитела со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 300 с. Затем фазу диссоциации контролировали в течение 600 с. В качестве раствора для регенерации дважды добавляли раствор глицина (рН 1,5), с добавлением 5 М MgCl₂, со скоростью потока 10 мкл/мин в течение 30 с. При анализе данных использовали модель аффинности в стационарным состоянии в аналитическом программном обеспечении (программное обеспечение BIAevaluation, версия 4.1), и рассчитывали константу диссоциации (KD). Результаты показаны в таблице 2.

[0278]

Таблица 2 Антитело KD(M) 1 H02L02 1,5E-09 2 H01L02 1,1E-09 3 H02L03 1,4E-09 4 H04L02 1,1E-09

[279] 6)-1-2. Активность связывания с CDH6 человека, обезьяны, мыши или крысы

С использованием липофектамина 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.) pcDNA3.1-hCDH6, pcDNA3.1-cynoCDH6, p3×FLAG-CMV-9-mCDH6 или p3×FLAG-CMV-9-rCDH6, полученные в примере 1)-1, транзиентно вводили в клетки 293α. Клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°С и 5% СО₂, и затем готовили клеточную суспензию. Нетрансфицированные клетки 293α использовали в качестве отрицательного контроля. Суспензию клеток 293α, полученных, как описано выше, центрифугировали, и затем супернатант удаляли. Затем клетки суспендировали добавлением каждого из 4 гуманизированных антител hG019 (клоны: H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), которые были получены в примере 5)-5-3, или человеческого контрольного IgG1 (Calbiochem). Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS, и затем суспендировали добавлением козьего Fc(гамма) PE F(ab')-фрагмента против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), который разбавляли в 500 раз PBS с добавлением 5% FBS. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (Canto II; BD Biosciences). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). На фиг. 6-1 и 6-2 на оси абсцисс показана концентрация антитела, и на оси ординат показано количество связанного антитела на основе средней интенсивности флуоресценции. Как показано на фиг.6-1 и 6-2, человеческий IgG1, который использовали в качестве отрицательного контроля, не связывается с CDH6-трансфицированными клетками. 4 гуманизированных антитела hG019 (клоны: H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02) связываются с CDH6 человека и CDH6 обезьяны cynomolgus, но не связываются с CDH6 мыши и с CDH6 крысы. Ни одно из антител не связывается с клетками, трансфицированными пустым вектором pcDNA3.1, который использовали в качестве отрицательного контроля. С другой стороны, в публикации международной заявки WO 2016/024195 раскрывается, что антитело NOV0712 проявляет связывающую активность для всех CDH6 человека, CDH6 обезьяны cynomolgus, CDH6 мыши и CDH6 крысы. В результате было показано, что 4 гуманизированных антитела hG019, полученные в настоящем описании, представляют антитела против CDH6, которые проявляют свойства связывания, отличные от свойств антитела NOV0712.

[0280] 6)-2. Анализ CDH6-связывающих сайтов гуманизированных hG019 и NOV0712

6)-2-1. Эпитопный анализ с использованием мутанта с делецией домена

С использованием липофектамина 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.) экспрессионный вектор мутанта с делецией каждого домена, полученный в примере 2)-2-1, или pcDNA3.1-hCDH6, обеспечивающий экспрессию полноразмерного человеческого CDH6, транзиентно вводили в клетки. Клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°С и 5% СО₂, и затем готовили клеточную суспензию. Суспензию трансфицированных клеток 293α центрифугировали и затем супернатант удаляли. После этого клетки суспендировали добавлением каждого из 4 гуманизированных антител hG019 (клоны: H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), которые были получены в примере 5)-5-3, или анти-CDH6-антитела NOV0712, которое было получено в ссылочном примере 1, или человеческого IgG1 (Calbiochem), который использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS, и затем суспендировали добавлением козьего F(ab')₂ APC-античеловеческого IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), который разбавляли в 500 раз PBS с добавлением 5% FBS. Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. Клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (Canto II; BD Biosciences). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты показаны на фиг.7-1 по 7-6. На гистограммах на с фиг.7-1 по 7-6 на оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции АРС, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток. Затемненная гистограмма показывает, что использовали нетрансфицированные клетки 293α в качестве отрицательного контроля, и незатемненная гистограмма в виде сплошной линии показывает, что использовали клетки 293α, экспрессирующие полноразмерный hCDH6 или мутант с делецией каждого домена EC. Интенсивность флуоресценции усиливается, когда антитело связывается с полноразмерным hCDH6 или мутантом с делецией каждого домена EC на клеточной поверхности. Человеческий контрольный IgG1 не связывается с трансфицированными клетками. 4 гуманизированных антитела hG019 (клоны: H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02) связываются с полноразмерным hCDH6, мутантом с делецией EC1, мутантом с делецией EC2, мутантом с делецией EC4 и мутантом с делецией EC5, но не связываются с мутантом с делецией EC3. В частности, было показано, что 4 гуманизированных антитела hG019 специфически связываются с EC3 в hCDH6 в качестве эпитопа. С другой стороны, анти-CDH6-антитело NOV0712 связывается с полноразмерным hCDH6, мутантом с делецией EC1, мутантом с делецией EC2, мутантом с делецией EC3 и мутантом с делецией EC4, но не связывается с мутантом с делецией EC5. В частности, было показано, что анти-CDH6-антитело NOV0712 специфически связывается с hCDH6 с EC5 в качестве эпитопа. Это согласуется с информацией об эпитопе NOV0712, описанной в публикации международной заявки WO 2016/024195. Полученные результаты показывают, что 4 гуманизированных антитела hG019, полученные в настоящем описании, являются антителами против CDH6, которые проявляют свойства, отличные от свойств NOV0712.

[0281] 6)-2-2. Анализ конкурентного связывания антител

6)-2-2-1. Получение стабильно экспрессирующей клеточной линии 786-O/hCDH6.

Стабильно экспрессирующую клеточную линию 786-O/hCDH6 получали инфицированием клеток 786-O (ATCC) рекомбинантным ретровирусом для экспрессии полноразмерного человеческого CDH6. Экспрессионный ретровирусный вектор CDH6 человека (pQCXIN-hCDH6) получали с использованием вектора экспрессии кДНК, кодирующей белок CDH6 (NP_004923) человека (OriGene Technologies Inc., RC217889), и включением кДНК в ретровирусный вектор pQCXIN (Clontech Laboratories, Inc.) в соответствии со способом, известным специалистам в данной области. Используя FuGene HD (Promega Corp.), pQCXIN-hCDH6 транзиентно вводили в ретровирусные упаковочные клетки RetroPack PT67 (Clontech Laboratories, Inc.). Через 48 ч культуральный супернатант, содержащий рекомбинантный ретровирус, извлекали и затем добавляли в систему культивирования клеток 786-O, для инфицирования клеток. Через 3 суток после инфицирования инфицированные клетки культивировали в условиях 37°С и 5% СО₂ в среде с добавлением G418 (Gibco) (конечная концентрация: 50 мг/мл) и проводили скрининг с лекарственным препаратом для установления клеточной линии 786-O/hCDH6, стабильно экспрессирующей человеческий CDH6. Высокую экспрессию человеческого CDH6 в стабильно экспрессирующей линии подтверждали проточной цитометрией аналогично тому, как описано в примере 2)-3-1 (фиг. 8). В качестве антитела для детектирования использовали козье антимышиное вторичное IgG1 антитело Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific Inc.), которое разбавляли в 500 раз PBS с добавлением 5% FBS. Результаты показаны на фиг. 8. На гистограмме на фиг. 8 на оси абсцисс показана интенсивность флуоресценции Alexa Fluor 647, указывающая количество связанного антитела, и на оси ординат показано количество клеток. Затемненная гистограмма показывает, что использовали mIgG1 в качестве отрицательного контроля при окрашивании, и незамненная гистограмма в виде сплошной линии показывает, что использовали антитело против CDH6 человека при окрашивании. Как видно, интенсивность флуоресценции усиливалась за счет связывания антитела с hCDH6 на клеточной поверхности. Контрольный mIgG1 не связывается с клетками. В результате было показано, что стабильно экспрессирующая клеточная линия 786-O/hCDH6 экспрессирует человеческий CDH6 на более высоком уровне, чем клетки родительской линии 786-O.

[0282] 6)-2-2-2. Анализ конкурентного связывания с использованием меченого H01L02 и меченого NOV0712

Меченое H01L02 и меченое NOV0712 получали с использованием набора для мечения моноклональных антител Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific Inc.). Клеточную суспензию стабильно экспрессирующей клеточной линии 786-O/hCDH6, полученной в примере 7)-2-2-1, центрифугировали и затем супернатант удаляли. Затем клетки суспендировали добавлением меченого NOV0712 или меченого H01L02 (конечная концентрация: 5 нМ) и, также добавлением каждого из 4 гуманизированных антител hG019 (клоны: H01L02, H02L02, H02L03 и H04L02), которые были получены в примере 5)-5-3, или анти-CDH6-антитела NOV0712, которое было получено в ссылочном примере 1, или человеческого IgG1 (Calbiochem), который использовали в качестве отрицательного контроля (конечная концентрация: как показано на оси абсцисс на фиг. 9). Клетки выдерживали при 4°С в течение 1 ч. После этого клетки дважды промывали PBS с добавлением 5% FBS с последующим детектированием с использованием проточного цитометра (Canto II; BD Biosciences). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты показаны на фиг. 9. На оси абсцисс показана конечная концентрация добавленного немеченого антитела, и на оси ординат показано количество связанного антитела, основанное на средней интенсивности флуоресценции. Когда немеченое NOV0712 добавляли к клеткам с добавлением меченого NOV0712, то количество связанного меченого антитела уменьшается в результате замены немеченым антителом, зависимым от концентрации, поскольку они конкурируют друг с другом за связывание с одним и тем же эпитопом. С другой стороны, даже если каждое из 4 гуманизированных антител hG019 или человеческий IgG1, который использовали в качестве отрицательного контроля, добавляли к клеткам, с добавлением меченым NOV0712, изменения количества связанного меченого антитела отсутствовали, что указывает на то, что эти антитела различаются по эпитопу и, таким образом, не конкурируют друг с другом за связывание. Аналогичным образом, когда каждое из 4 немеченых гуманизированных антител hG019 добавляли к клеткам с добавлением меченого H01L02, то количество связанного меченого антитела уменьшается за счет замены немеченым антителом в зависимости от концентрации добавления, поскольку они конкурируют друг с другом за связывание с одним и тем же эпитопом. С другой стороны, даже если NOV0712 или человеческий IgG1, который использовали в качестве отрицательного контроля, добавляли к клеткам, с добавлением меченого H01L02, изменения в количестве связанного меченого антитела отсутствовали, что указывает на то, что эти антитела различаются по эпитопу и, следовательно, не конкурируют друг с другом за связывание.

[0283] 6)-3. Оценка способности к интернализации гуманизированных hG019 и NOV0712

Способность к интернализации гуманизированных hG019 и NOV0712 оценивали с использованием реагента Hum-ZAP против человеческого IgG (Advanced Targeting Systems), конъюгированного с токсином (сапорином), ингибирующим синтез белка. В частности, человеческий CDH6-позитивную клеточную линию опухоли яичника NIH:OVCAR-3 (ATCC) высевали из расчета 4×10³ клеток/лунку в 96-луночный планшет, и затем культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO₂. Человеческий CDH6-позитивную клеточную линию почечноклеточной опухоли 786-O (ATCC) высевали из расчета 1×10³ клеток/лунку в 96-луночный планшет, и затем культивировали в течение ночи. Человеческий CDH6-позитивную клеточную линию опухоли яичника PA-1 (ATCC) высевали из расчета 1×10³ клеток/лунку в 96-луночный планшет, и затем культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO₂. На следующий день в планшет добавляли каждое антитело против CDH6 (конечная концентрация: 1 нМ) или человеческое IgG1 антитело (Calbiochem) в качестве антитела отрицательного контроля. Hum-ZAP (конечная концентрация: 0,5 нМ) или козий F(ab')₂-фрагмент против человеческого IgG, специфический Fc(гамма)-фрагмент (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), не конъюгированный с токсином (конечная концентрация: 0,5 нМ), который использовали в качестве отрицательного контроля, затем добавляли в планшет, и клетки культивировали в условиях 37°С и 5% СО₂ в течение 3 суток. Количество живых клеток измеряли количественным определением активности ATP (RLU) с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo™. В данном анализе Hum-ZAP проникает в клетки в зависимости от способности к интернализации гуманизированного анти-CDH6-антитела, в результате сапорин, который ингибирует синтез белка, высвобождается в клетки, с подавлением роста клеток. Эффект ингибирования роста клеток, вызванный добавлением анти-CDH6-антитела, выражался относительной выживаемостью, когда количество живых клеток в лунке с отрицательным контролем вместо Hum-ZAP устанавливали 100%. На фиг.10-1 по 10-3 приведены график и таблица с результатами оценки выживаемости клеток. В данном опыте считается, что антитело, обладающее сильной способностью к интернализации, обеспечивает низкую выживаемость клеток. В результате 4 гуманизированных антитела к hG019 имеют степень интернализации примерно от 50% до 75%, определенную по показателям выживаемости клеток для всех 3 клеточных линий. Таким образом, 4 гуманизированных антитела к hG019 проявляют очень высокую способность к интернализации и существенно более высокую способность к интернализации, чем активность NOV0712. Исходя из механизма лекарственных эффектов ADC, антитело, обладающее более высокой способностью к интернализации, считается более подходящим в качестве антитела для ADC.

[0284] Пример 7: получение конъюгата гуманизированное hG019-лекарственное средство

7)-1. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство H01L02-DXd

Стадия 1: конъюгат антитело-лекарственное средство (1)

[0285]

Формула 11

[0286] Восстановление антитела: концентрацию H01L02, полученного в примере 5, доводили до 9,85 мг/мл с помощью PBS6,0/EDTA с использованием общих процедур B (с использованием 1,53 мл/мг×см в качестве коэффициента поглощения 280 нм) и C, описанных в способе получения 1. К данному раствору (5,7 мл) добавляли 10 мМ водный раствор TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,231 мл; 6,0 экв на молекулу антитела) и 1 М водный раствор гидрокарбоната калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0855 мл). После подтверждения того, что раствор имеет рН в пределах 7,0±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали инкубированием раствора при 37°С в течение 2 ч.

[0287] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: вышеописанный раствор инкубировали при 15°С в течение 10 мин. Затем добавляли 10 мМ раствор N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамида в диметилсульфоксиде (0,386 мл; 10 экв на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°С в течение 1 ч для конъюгирования лекарственное средство- линкера с антителом. Затем к смеси добавляли 100 мМ водный раствор NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0347 мл; 9 экв на молекулу антитела) и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, для остановки реакции лекарственное средство-линкер.

[0288] Очистка: вышеописанный раствор очищали с помощью общей процедуры D, описанной в способе получения 1, с получением 19 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство «H01L02-ADC».

[0287] Характеристика: при использовании общей процедуры E (с использованием ε_D,280=5440 и ε_D,370=21240), описанной в способе получения 1, были получены следующие показатели.

Концентрация антитела: 2,26 мг/мл, выход антитела: 42,9 мг (76%), среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитела, измеренное с помощью общей процедуры E: 5,9, и среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитела, измеренное общей процедурой F: 7,7.

[0290] 7)-2. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство H02L02-DXd

Стадия 1: конъюгат антитело-лекарственное средство (2)

[0291]

Формула 12

[0292] Восстановление антитела: концентрацию H02L02, полученного в примере 5, доводили до 9,95 мг/мл с помощью PBS6,0/EDTA с использованием общих процедур B (с использованием 1,51 мл/мг×см в качестве коэффициента поглощения 280 нм) и C, описанных в способе получения 1. К данному раствору (5,7 мл) добавляли 10 мМ водный раствор TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,231 мл; 6,0 экв на молекулу антитела) и 1 М водный раствор гидрокарбоната калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0855 мл). После подтверждения того, что раствор имеет рН в пределах 7,0±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали инкубированием раствора при 37°С в течение 2 ч.

[0293] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: вышеописанный раствор инкубировали при 15°С в течение 10 мин. Затем добавляли 10 мМ раствор N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-(2-{[(1S,9S) -9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамида в диметилсульфоксиде (0,389 мл; 10 экв на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°С в течение 1 ч для конъюгирования лекарственное средство-линкера с антителом. Затем к смеси добавляли 100 мМ водный раствор NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0350 мл; 9 экв на молекулу антитела) и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, для остановки реакции лекарственное средство-линкер.

[0294] Очистка: вышеописанный раствор очищали с помощью общей процедуры D, описанной в способе получения 1, с получением 19 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство «H02L02-ADC».

[0295] Характеристика: при использовании общей процедуры E (с использованием ε_D,280=5440 и ε_D,370=21240), описанной в способе получения 1, были получены следующие показатели.

Концентрация антитела: 2,61 мг/мл, выход антитела: 49,6 мг (87%), среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитела, измеренное с помощью общей процедуры E: 5,9, и среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитело, измеренное общей процедурой F: 7,6.

[0296] 7)-2. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство H02L02-DXd

Стадия 1: конъюгат антитело-лекарственное средство (3)

[0297]

Формула 13

[0298] Восстановление антитела: концентрацию H02L03, полученного в примере 5, доводили до 9,86 мг/мл с помощью PBS6,0/EDTA с использованием общих процедур B (с использованием 1,53 мл/мг×см в качестве коэффициента поглощения 280 нм) и C, описанных в способе получения 1. К данному раствору (5,7 мл) добавляли 10 мМ водный раствор TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,270 мл; 7,0 экв на молекулу антитела) и 1 М водный раствор гидрокарбоната калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0855 мл). После подтверждения того, что раствор имеет рН в пределах 7,0±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали инкубированием раствора при 37°С в течение 2 ч.

[0299] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: вышеописанный раствор инкубировали при 15°С в течение 10 мин. Затем добавляли 10 мМ раствор N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-(2-{[(1S,9S) -9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамида в диметилсульфоксиде (0,386 мл; 10 экв на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°С в течение 1 ч для конъюгирования лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к смеси добавляли 100 мМ водный раствор NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0347 мл; 9 экв на молекулу антитела) и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, для остановки реакции лекарственное средство-линкер.

[0300] Очистка: вышеописанный раствор очищали с помощью общей процедуры D, описанной в способе получения 1, с получением 19 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство «H01L02-ADC».

[0301] Характеристика: при использовании общей процедуры E (с использованием ε_D,280=5440 и ε_D,370=21240), описанной в способе получения 1, были получены следующие показатели.

Концентрация антитела: 2,71 мг/мл, выход антитела: 51,4 мг (91%), среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитела, измеренное с помощью общей процедуры E: 5,7, и среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитело, измеренное общей процедурой F: 7,6.

[0302] 7)-4. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство H04L02-DXd

Стадия 1: конъюгат антитело-лекарственное средство (4)

[0303]

Формула 14

[0304] Восстановление антитела: концентрацию H02L03, полученного в примере 5, доводили до 9,86 мг/мл с помощью PBS6,0/EDTA с использованием общих процедур B (с использованием 1,53 мл/мг×см в качестве коэффициента поглощения 280 нм) и C, описанных в способе получения 1. К данному раствору (5,7 мл) добавляли 10 мМ водный раствор TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,232 мл; 6,0 экв на молекулу антитела) и 1 М водный раствор гидрокарбоната калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0855 мл). После подтверждения того, что раствор имеет рН в пределах 7,0±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали инкубированием раствора при 37°С в течение 2 ч.

[0305] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: вышеописанный раствор инкубировали при 15°С в течение 10 мин. Затем добавляли 10 мМ раствор N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-(2-{[(1S,9S) -9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамида в диметилсульфоксиде (0,386 мл; 10 экв на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°С в течение 1 ч для конъюгирования лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к смеси добавляли 100 мМ водный раствор NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0347 мл; 9 экв на молекулу антитела) и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин для остановки реакции лекарственное средство-линкер.

[0306] Очистка: вышеописанный раствор очищали с помощью обычной процедуры D, описанной в способе получения 1, с получением 19 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство «H04L02-ADC».

[0307] Характеристика: при использовании общей процедуры E (с использованием ε_D,280=5440 и ε_D,370=21240), описанной в способе получения 1, были получены следующие показатели.

Концентрация антитела: 2,56 мг/мл, выход антитела: 48,7 мг (87%), среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитела, измеренное с помощью общей процедуры E: 5,8, и среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитело, измеренное общей процедурой F: 7,6.

[0308] Ссылочный пример 2: получение конъюгата NOV0712-лекарственное средство

Ссылочный пример 2)-1. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство NOV0712-DM4

Конъюгат антитело-лекарственное средство (5)

Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: концентрацию NOV0712, полученного в ссылочном примере 1, доводили до 9,7 мг/мл с помощью 20 мМ HEPES8.1 (HEPES, 1 М буферный раствор (20 мл), производства Life Technologies Corp., доводили pH до 8,1 с помощью 1 М гидроксида натрия, и затем доводили объем до 1 л дистиллированной водой), используя общие процедуры B (с использованием 1,51 мл/мг×см в качестве коэффициента поглощения при 280 нм) и C, описанные в способе получения 1. Раствор инкубировали при 20°C в течение 10 мин. Затем добавляли 10 мМ раствор 1-(2,5-диоксопирролидин-1-илокси)-1-оксо-4-(пиридин-2-илдисульфанил)бутан-2-сульфоновой кислоты, описанный в WO2016/024195, в ДМАА (0,366 мл); 5,2 экв на молекулу антитела), 10 мМ раствор N2-деацетил-деацетил-N2-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтанзина (DM4) в ДМАА (0,366 мл; 6,8 экв на молекулу антитела) и к этой смеси добавляли 0,243 мл ДМАА, и полученную смесь инкубировали при 20°C в течение 16 ч для конъюгирования лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к смеси добавляли 1 М водный раствор уксусной кислоты для доведения рН до 5,0, и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин, для остановки реакции лекарственное средство-линкер.

[0309] Очистка: вышеописанный выше раствор очищали с помощью общей процедуры D, описанной в способе получения 1, с получением 28 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство «NOV0712-DM4».

[0310] Характеристика: с использованием общей процедуры E (с использованием ε_A,280=200500, ε_A,252=76295, ε_D,280=43170 и ε_D,252=23224), описанной в способе получения 1, были получены следующие показатели.

Концентрация антитела: 2,58 мг/мл, выход антитела: 72,2 мг (93%) и среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитела, измеренное общей процедурой E: 3,0.

[0311] Ссылочный пример 2)-2: получение конъюгата антитело-лекарственное средство NOV0712-DXd

Стадия 1: конъюгат антитело-лекарственное средство (6)

[0312]

Формула 15

[0313] Восстановление антитела: концентрацию NOV0712, полученного в ссылочном примере 1, доводили до 9,26 мг/мл с помощью PBS6,0/EDTA, используя общие процедуры B (с использованием 1,5 мл/мг×см в качестве коэффициента поглощения 280 нм) и C, описанные в способе получения 1. К данному раствору (6,6 мл) добавляли 10 мМ водный раствор TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,254 мл; 6,0 экв на молекулу антитела) и 1 М водный раствор гидрокарбоната калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0990 мл). После подтверждения того, что раствор имеет рН в пределах 7,0±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали инкубированием раствора при 37°С в течение 2 ч.

[0314] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: вышеописанный раствор инкубировали при 15°С в течение 10 мин. Затем добавляли 10 мМ раствор N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-(2-{[(1S,9S) -9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамида в диметилсульфоксиде (0,381 мл; 9 экв на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°С в течение 1 ч для конъюгирования лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к смеси добавляли 100 мМ водный раствор NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0381 мл; 9 экв на молекулу антитела) и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин для остановки реакции лекарственное средство-линкер.

[0315] Очистка: вышеописанный раствор очищали с помощью общей процедуры D, описанной в способе получения 1, с получением 19 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство «NOV0712-ADC».

[0316] Характеристика: при использовании общей процедуры E (с использованием ε_D,280=5440 и ε_D,370=21240), описанной в способе получения 1, были получены следующие показатели.

Концентрация антитела: 2,26 мг/мл, выход антитела: 56,4 мг (92%), среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитела, измеренное с помощью общей процедуры E: 6,4, и среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитело, измеренное общей процедурой F: 7,8.

[0317] Ссылочный пример 3: получение H01L02-DM4

Ссылочный пример 3)-1. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство H01L02-DM4

Конъюгат антитело-лекарственное средство (7)

Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: концентрацию H01L02, полученного в примере 5, доводили до 9,8 мг/мл с помощью 20 мМ HEPES8.1 (HEPES, 1 М буферный раствор (20 мл), производства Life Technologies Corp., доводили до pH 8,1 с помощью 1М раствора гидроксида натрия, и затем доводили до 1 л дистиллированной водой), используя общие процедуры B (с использованием 1,53 мл/мг×см в качестве коэффициента поглощения при 280 нм) и C, описанные в способе получения 1. Раствор инкубировали при 20°C в течение 10 мин. Затем к этой смеси добавляли 10 мМ раствор 1-(2,5-диоксопирролидин-1-илокси)-1-оксо-4-(пиридин-2-илдисульфанил)бутан-2-сульфоновой кислоты, описанной в WO2016/024195, в ДМАА (0,062 мл); 11,5 экв на молекулу антитела) и 10 мМ раствор N2-деацетил-N2-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтанзина (DM4) в ДМАА (0,082 мл; 15,1 экв на молекулу антитела), и полученную смесь инкубировали при 20°С в течение 18 ч для конъюгирования лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к смеси добавляли 1М водный раствор уксусной кислоты для доведения рН до 5,0, и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин для остановки реакции лекарственное средство-линкер.

[0318] Очистка: вышеописанный раствор очищали с помощью общей процедуры D, описанной в способе получения 1, с получением 3,5 мл раствора, содержащего указанный в заголовке конъюгат антитело-лекарственное средство «H01L02-ADC».

[0316] Характеристика: при использовании общей процедуры E (с использованием ε_А,280=223400, ε_А,252=85646, ε_D,280=4317 и ε_D,252=23224), описанной в способе получения 1, были получены следующие показатели.

Концентрация антитела: 1,97 мг/мл, выход антитела: 6,90 мг (88%) и среднее количество молекул конъюгированного лекарственного средства (n) на молекулу антитела, измеренное с помощью общей процедуры E: 3,6.

[0320] Пример 8: Оценка in vitro активности конъюгата антитело-лекарственное средство

8)-1. Оценка in vitro активности конъюгата антитело-лекарственное средство в ингибировании роста клеток на CDH6-позитивной клеточной линии опухоли человека

CDH6-позитивную клеточную линию опухоли яичника человека PA-1 высевали в 96-луночный планшет из расчета 2×10³ клеток/100 мкл/лунку в среде MEM с добавлением 10% FBS, и затем клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°С и 5% СО₂. На следующий день каждый из 4 конъюгатов гуманизированное hG019-лекарственное средство (названия клонов: H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd и H04L02-DXd), полученные в примере 7, или конъюгат NOV0712-лекарственное средство (NOV0712-DM4), полученный в ссылочном примере 2, добавляли к клеткам таким образом, чтобы конечные концентрации составляли от 0,0001 (нМ) до 100 (нМ). После культивирования в течение 4 суток количество живых клеток измеряли количественным определением ATP с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo™ (Promega Corp.). На фиг. 11 показана зависимая от концентрации активность ингибирования роста клеток, когда каждый конъюгат антитело-лекарственное средство добавляли к клеткам. Полученные результаты показывают, что 4 конъюгата гуманизированное hG019-лекарственное средство проявляют активность ингибирования роста против опухолевых клеток в более низкой добавленной концентрации, чем для конъюгата NOV0712-лекарственное средство, и обладают высокой противоопухолевой активностью.

[0321] Пример 9: противоопухолевый эффект конъюгата антитело-лекарственное средство in vivo

Противоопухолевые эффекты конъюгатов антитело-лекарственное средство оценивали с использованием животных моделей, полученных от иммунодефицитных мышей инокуляцией CDH6-позитивных клеточных линий опухолей человека. Nude мыши BALB/c в возрасте от 4 до 5 недель (CAnN.Cg-Foxnl [nu]/CrlCrlj [Foxnlnu/Foxnlnu], Charles River Laboratories Japan Inc.) и мыши SCID (CB17/Icr-Prkdc [scid]/CrlCrlj, Charles River Laboratories Japan Inc.) находились на адаптации в течение 3 суток или более в условиях SPF перед использованием в эксперименте. Мышам скармливали стерилизованный твердый корм (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) и давали стерилизованную водопроводную воду (которая была приготовлена добавлением 5-15 ppm раствора гипохлорита натрия в водопроводную воду). Два раза в неделю измеряли длинный диаметр и короткий диаметр инокулированной опухоли, используя электронные цифровые штангенциркули (CD-15CX, Mitutoyo Corp.), и затем рассчитывали объем опухолей с использованием следующей формулы.

Объем опухоли (мм³) = 1/2 × длинный диаметр (мм) × [короткий диаметр (мм)]²

Каждый конъюгат антитело-лекарственное средство разбавляли буфером ABS (10 мМ ацетатного буфера, 5% сорбита, рН 5,5) (Nacalai Tesque, Inc.) и разведенный раствор вводили внутривенно в дозе, показанной в каждом примере, в хвостовую вену каждой мыши. ABS-буфер вводили так же, как описано выше, контрольной группе мышей (группа с носителем). В эксперименте использовали шесть мышей на группу.

[0322] 9)-1. Противоопухолевый эффект - (1)

CDH6-позитивная клеточная линия почечноклеточной опухоли человека 786-O (ATCC), экспрессию CDH6 которой подтверждали в примере 2)-3-1, суспендировали в матригеле (Corning Inc.), и клеточную суспензию подкожно инокулировали в дозе 5×10⁶ клеток в правую боковую область каждой мыши-самца SCID (сутки 0). На сутки 18 мышей произвольно распределяли на группы. В день распределения на группы каждый из 4 конъюгатов антитело-лекарственное средство (названия клонов: H01L02-DXd, H02L02-DXd, H02L03-DXd и H04L02-DXd), полученных в примере 7, или NOV0712-DM4, полученный в ссылочном примере 2, вводили внутривенно в дозе 3 мг/кг в хвостовую вену каждой мыши. Результаты показаны на фигуре 12. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение SE.

[0323] NOV0712-DM4 не проявляло достоверного противоопухолевого эффекта на данной опухолевой модели. Все 4 конъюгата антитело-лекарственное средство, полученные в примере 7, уменьшали объем опухолей после введения, вызывали достоверную регрессию опухолей и сохраняли эффект регрессии опухолей в течение 24 суток после введения (фиг.12).

[0324] 9)-2. Противоопухолевый эффект - (2)

CDH6-позитивная клеточная линия почечноклеточной опухоли человека PA-1 (ATCC), экспрессию CDH6 которой подтверждали в примере 2)-3-1, суспендировали в матригеле (Corning Inc.), и клеточную суспензию подкожно инокулировали в дозе 8,5×10⁶ клеток в правую боковую область каждой nude мыши-самке (сутки 0). На сутки 11 мышей произвольно распределяли на группы. В день распределения на группы конъюгат антитело-лекарственное средство H01L02-DXd, полученный в примере 7, или NOV0712-DM4 или NOV0712-DXd, полученные в ссылочном примере 2, вводили внутривенно в дозах 1 или 3 мг/кг в хвостовую вену каждой мыши. Результаты показаны на фигуре 13. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение SE.

[0325] NOV0712-DM4 не проявлял противоопухолевого эффекта ни в одной из доз 1 и 3 мг/кг на данной опухолевой модели. С другой стороны, H01L02-DXd достоверно уменьшал объем опухолей после введения в дозах 1 и 3 мг/кг и оказывал эффект регрессии опухолей (фиг. 13). Антитело H01L02, полученное в настоящем описании, и антитело NOV0712 конъюгировали с одним и тем же лекарственным средством DXd, и сравнивали лечебные эффекты полученных образцов. В результате H01L02-DXd проявлял более сильный противоопухолевый эффект, чем NOV0712-DXd, в обеих дозах 1 и 3 мг/кг. В частности, было показано, что антитело H01L02 по настоящему изобретению является превосходным антителом для конъюгатов антитело-лекарственное средство в качестве противоопухолевых агентов по сравнению с антителом NOV0712 (фиг. 13).

[0326] 9)-3. Противоопухолевый эффект - (3)

CDH6-позитивная клеточная линия опухоли яичника человека NIH:OVCAR (ATCC), экспрессию CDH6 которой подтверждали в примере 2)-3-1, суспендировали в матригеле (Corning Inc.), и клеточную суспензию подкожно инокулировали в дозе 1×10⁷ клеток в правую боковую область каждой nude мыши-самки (сутки 0). На сутки 22 мышей произвольно распределяли на группы. В день распределения на группы конъюгат антитело-лекарственное средство H01L02-DXd, полученный в примере 7, или NOV0712-DM4, полученный в ссылочном примере 2, вводили внутривенно в дозах 1 или 3 мг/кг в хвостовую вену каждой мыши. Результаты показаны на фигуре 14. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение SE.

[0327] NOV0712-DM4 не проявлял противоопухолевого эффекта в дозе 1 мг/кг и проявлял противоопухолевый эффект в дозе 3 мг/кг, хотя рост опухоли наблюдали через 2 недели после введения. С другой стороны, H01L02-DXd достоверно подавлял увеличение объема опухолей при введении в дозах 1 и 3 мг/кг и поддерживал, в частности, в дозе 3 мг/кг эффект ингибирования роста опухоли в течение длительного периода времени до 31 суток после введения (фиг. 14).

[0328] Эффект ингибирования роста опухолей под действием NOV0712-DM4, полученного в ссылочном примере 2, или H01L02-DM4, полученного в ссылочном примере 3, оценивали таким же образом, как описано выше, с использованием клеток PA-1. H01L02-DM4 дополнительно уменьшал объем опухолей, чем NOV0712-DM4. Таким образом, антитело H01L02 по настоящему изобретению превосходит антитело для конъюгатов антитело-лекарственное средство, действующее как противоопухолевое средство, по сравнению с антителом NOV0712.

[0329] 9)-4. Противоопухолевый эффект - (4)

CDH6-позитивная клеточная линия почечноклеточной опухоли человека 786-O (ATCC), экспрессия CDH6 которой подтверждали в примере 2)-3-1, суспендировали в матригеле (Corning Inc.), и клеточную суспензию подкожно инокулировали в дозе 5×10⁶ клеток в правую боковую область каждой мыши-самца SCID (сутки 0). На сутки 20 мышей произвольно распределяли на группы. В день распределения на группы конъюгат антитело-лекарственное средство H01L02-DXd, полученный в примере 7, или NOV0712-DM4, полученный в ссылочном примере 2, вводили внутривенно в дозах 1 или 3 мг/кг в хвостовую вену каждой мыши. Результаты показаны на фигуре 15. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение SE.

[0330] NOV0712-DM4 не проявлял достоверного противоопухолевого эффекта в любой из доз 1 и 3 мг/кг на данной опухолевой модели. С другой стороны, H01L02-DXd уменьшал объем опухолей после введения в дозах 1 и 3 мг/кг и проявлял, в частности, в дозе 3 мг/кг достоверную регрессию опухоли и поддерживал эффект регрессии опухоли в течение 20 суток после введения (фиг. 15).

[0331] 9)-5. Противоопухолевый эффект - (5)

CDH6-негативную клеточную линию опухоли яичника человека ES-2 (ATCC), отсутствие экспрессии CDH6 которой было подтверждено в примере 2)-3-1, суспендировали в физиологическом растворе и клеточную суспензию подкожно инокулировали в дозе 1×10⁶ клеток в правую боковую область каждой nude мыши-самки (сутки 0). На сутки 7 мышей произвольно распределяли на группы. В день распределения на группы конъюгат антитело-лекарственное средство H01L02-DXd, полученный в примере 7, или NOV0712-DM4, полученный в ссылочном примере 2, вводили внутривенно в дозах 1 или 3 мг/кг в хвотовую вену каждой мыши. Результаты показаны на фиг. 16. На оси абсцисс показано количество суток, и на оси ординат показан объем опухолей. Диапазон ошибок показывает значение SE.

[0332] На данной опухолевой модели, не экспрессирующей CDH6, H01L02-DXd и NOV0712-DM4 не проявляли противоопухолевый эффект во всех дозах. Исходя из этого результата, противоопухолевый эффект конъюгата антитело-лекарственное средство на CDH6-позитивных опухолевых моделях, продемонстрированный в примерах 9)-1, 9)-2, 9)-3 и 9)-4, является эффектом, зависящим от экспрессии CDH6 в опухолевых клетках. Таким образом, конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению рассматривается в качестве селективного и безопасного противоопухолевого лекарственного средства, которое специфически проявляет противоопухолевое действие на CDH6-позитивную опухоль, не вызывая цитотоксичность для CDH6-негативных нормальных тканей (фиг. 16).

Промышленная применимость

[0333] Настоящее изобретение обеспечивает анти-CDH6-антитело, обладающее способностью к интернализации, и конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело. Конъюгат антитело-лекарственное средство можно использовать в качестве терапевтического лекарственного средства против рака и тому подобное.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДАЙИТИ САНКИО КОМПАНИ, ЛИМИТЕД

<120> АНТИ-CDH6-АНТИТЕЛО И КОНЪЮГАТ АНТИ-CDH6-АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

<130> DSPCT-FP1814

<150> JP2017-096749

<151> 2017-05-15

<160> 86

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 790

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Arg Thr Tyr Arg Tyr Phe Leu Leu Leu Phe Trp Val Gly Gln Pro

1 5 10 15

Tyr Pro Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro

20 25 30

Ala Lys Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Asn Glu Leu

35 40 45

Asn Arg Ser Lys Arg Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu

50 55 60

Glu Tyr Thr Gly Ser Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp

65 70 75 80

Gln Asp Arg Gly Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly

85 90 95

Ala Gly Asp Leu Phe Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala

100 105 110

Thr Lys Arg Leu Asp Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala

115 120 125

Gln Ala Ile Asn Arg Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu

130 135 140

Phe Ile Ile Lys Ile His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe Thr

145 150 155 160

Lys Glu Val Tyr Thr Ala Thr Val Pro Glu Met Ser Asp Val Gly Thr

165 170 175

Phe Val Val Gln Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly

180 185 190

Asn Ser Ala Lys Val Val Tyr Ser Ile Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Phe

195 200 205

Ser Val Glu Ser Glu Thr Gly Ile Ile Lys Thr Ala Leu Leu Asn Met

210 215 220

Asp Arg Glu Asn Arg Glu Gln Tyr Gln Val Val Ile Gln Ala Lys Asp

225 230 235 240

Met Gly Gly Gln Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Thr Val Asn Ile

245 250 255

Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Arg Phe Pro Gln Ser Thr

260 265 270

Tyr Gln Phe Lys Thr Pro Glu Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ile Gly

275 280 285

Arg Ile Lys Ala Ser Asp Ala Asp Val Gly Glu Asn Ala Glu Ile Glu

290 295 300

Tyr Ser Ile Thr Asp Gly Glu Gly Leu Asp Met Phe Asp Val Ile Thr

305 310 315 320

Asp Gln Glu Thr Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Lys Lys Leu Leu Asp

325 330 335

Phe Glu Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Lys Val Glu Ala Ser Asn Pro

340 345 350

Tyr Val Glu Pro Arg Phe Leu Tyr Leu Gly Pro Phe Lys Asp Ser Ala

355 360 365

Thr Val Arg Ile Val Val Glu Asp Val Asp Glu Pro Pro Val Phe Ser

370 375 380

Lys Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Ile Arg Glu Asp Ala Gln Ile Asn Thr

385 390 395 400

Thr Ile Gly Ser Val Thr Ala Gln Asp Pro Asp Ala Ala Arg Asn Pro

405 410 415

Val Lys Tyr Ser Val Asp Arg His Thr Asp Met Asp Arg Ile Phe Asn

420 425 430

Ile Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Phe Thr Ser Lys Leu Leu Asp Arg

435 440 445

Glu Thr Leu Leu Trp His Asn Ile Thr Val Ile Ala Thr Glu Ile Asn

450 455 460

Asn Pro Lys Gln Ser Ser Arg Val Pro Leu Tyr Ile Lys Val Leu Asp

465 470 475 480

Val Asn Asp Asn Ala Pro Glu Phe Ala Glu Phe Tyr Glu Thr Phe Val

485 490 495

Cys Glu Lys Ala Lys Ala Asp Gln Leu Ile Gln Thr Leu His Ala Val

500 505 510

Asp Lys Asp Asp Pro Tyr Ser Gly His Gln Phe Ser Phe Ser Leu Ala

515 520 525

Pro Glu Ala Ala Ser Gly Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Asn Lys Asp

530 535 540

Asn Thr Ala Gly Ile Leu Thr Arg Lys Asn Gly Tyr Asn Arg His Glu

545 550 555 560

Met Ser Thr Tyr Leu Leu Pro Val Val Ile Ser Asp Asn Asp Tyr Pro

565 570 575

Val Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Thr Val Arg Val Cys Ala Cys Asp

580 585 590

His His Gly Asn Met Gln Ser Cys His Ala Glu Ala Leu Ile His Pro

595 600 605

Thr Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Val Ala Ile Leu Leu Cys Ile Val

610 615 620

Ile Leu Leu Val Thr Val Val Leu Phe Ala Ala Leu Arg Arg Gln Arg

625 630 635 640

Lys Lys Glu Pro Leu Ile Ile Ser Lys Glu Asp Ile Arg Asp Asn Ile

645 650 655

Val Ser Tyr Asn Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Gln Ala Phe

660 665 670

Asp Ile Gly Thr Leu Arg Asn Pro Glu Ala Ile Glu Asp Asn Lys Leu

675 680 685

Arg Arg Asp Ile Val Pro Glu Ala Leu Phe Leu Pro Arg Arg Thr Pro

690 695 700

Thr Ala Arg Asp Asn Thr Asp Val Arg Asp Phe Ile Asn Gln Arg Leu

705 710 715 720

Lys Glu Asn Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Ala

725 730 735

Thr Tyr Ala Tyr Glu Gly Thr Gly Ser Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser

740 745 750

Leu Glu Ser Val Thr Thr Asp Ala Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Ser

755 760 765

Asp Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Val

770 775 780

Asp Ser Asp Lys Asp Ser

785 790

<210> 2

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Thr Gly Ser

1 5 10 15

Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp Gln Asp Arg Gly Asp

20 25 30

Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly Ala Gly Asp Leu Phe

35 40 45

Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala Thr Lys Arg Leu Asp

50 55 60

Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala Gln Ala Ile Asn Arg

65 70 75 80

Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu Phe Ile Ile Lys Ile

85 90 95

His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe

100 105

<210> 3

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Thr Lys Glu Val Tyr Thr Ala Thr Val Pro Glu Met Ser Asp Val Gly

1 5 10 15

Thr Phe Val Val Gln Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Ala Lys Val Val Tyr Ser Ile Leu Gln Gly Gln Pro Tyr

35 40 45

Phe Ser Val Glu Ser Glu Thr Gly Ile Ile Lys Thr Ala Leu Leu Asn

50 55 60

Met Asp Arg Glu Asn Arg Glu Gln Tyr Gln Val Val Ile Gln Ala Lys

65 70 75 80

Asp Met Gly Gly Gln Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Thr Val Asn

85 90 95

Ile Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Arg Phe

100 105

<210> 4

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Pro Gln Ser Thr Tyr Gln Phe Lys Thr Pro Glu Ser Ser Pro Pro Gly

1 5 10 15

Thr Pro Ile Gly Arg Ile Lys Ala Ser Asp Ala Asp Val Gly Glu Asn

20 25 30

Ala Glu Ile Glu Tyr Ser Ile Thr Asp Gly Glu Gly Leu Asp Met Phe

35 40 45

Asp Val Ile Thr Asp Gln Glu Thr Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Lys

50 55 60

Lys Leu Leu Asp Phe Glu Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Lys Val Glu

65 70 75 80

Ala Ser Asn Pro Tyr Val Glu Pro Arg Phe Leu Tyr Leu Gly Pro Phe

85 90 95

Lys Asp Ser Ala Thr Val Arg Ile Val Val Glu Asp Val Asp Glu Pro

100 105 110

Pro Val Phe

115

<210> 5

<211> 103

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 5

Ser Lys Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Ile Arg Glu Asp Ala Gln Ile Asn

1 5 10 15

Thr Thr Ile Gly Ser Val Thr Ala Gln Asp Pro Asp Ala Ala Arg Asn

20 25 30

Pro Val Lys Tyr Ser Val Asp Arg His Thr Asp Met Asp Arg Ile Phe

35 40 45

Asn Ile Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Phe Thr Ser Lys Leu Leu Asp

50 55 60

Arg Glu Thr Leu Leu Trp His Asn Ile Thr Val Ile Ala Thr Glu Ile

65 70 75 80

Asn Asn Pro Lys Gln Ser Ser Arg Val Pro Leu Tyr Ile Lys Val Leu

85 90 95

Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro

100

<210> 6

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Phe Ala Glu Phe Tyr Glu Thr Phe Val Cys Glu Lys Ala Lys Ala

1 5 10 15

Asp Gln Leu Ile Gln Thr Leu His Ala Val Asp Lys Asp Asp Pro Tyr

20 25 30

Ser Gly His Gln Phe Ser Phe Ser Leu Ala Pro Glu Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Asn Lys Asp Asn Thr Ala Gly Ile Leu

50 55 60

Thr Arg Lys Asn Gly Tyr Asn Arg His Glu Met Ser Thr Tyr Leu Leu

65 70 75 80

Pro Val Val Ile Ser Asp Asn Asp Tyr Pro Val Gln Ser Ser Thr Gly

85 90 95

Thr Val Thr Val Arg Val Cys Ala Cys Asp His His Gly Asn Met Gln

100 105 110

Ser Cys His Ala Glu Ala Leu Ile His Pro

115 120

<210> 7

<211> 790

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 7

Met Arg Thr Tyr Arg Tyr Phe Leu Leu Leu Phe Trp Val Gly Gln Pro

1 5 10 15

Tyr Pro Thr Phe Ser Asn Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro

20 25 30

Ala Lys Arg Lys Ala Leu Glu Leu Ser Ala Asn Ser Arg Asn Glu Leu

35 40 45

Ser Arg Ser Lys Arg Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu

50 55 60

Glu Tyr Thr Gly Ser Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp

65 70 75 80

Gln Asp Arg Gly Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly

85 90 95

Ala Gly Asp Leu Phe Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala

100 105 110

Thr Lys Arg Leu Asp Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala

115 120 125

Gln Ala Val Asn Arg Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu

130 135 140

Phe Ile Ile Lys Ile His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe Thr

145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Thr Ala Thr Val Pro Glu Met Ala Asp Val Gly Thr

165 170 175

Phe Val Val Gln Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly

180 185 190

Asn Ser Ala Lys Val Val Tyr Ser Ile Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Phe

195 200 205

Ser Val Glu Ser Glu Thr Gly Ile Ile Lys Thr Ala Leu Leu Asn Met

210 215 220

Asp Arg Glu Asn Arg Glu Gln Tyr Gln Val Val Ile Gln Ala Lys Asp

225 230 235 240

Met Gly Gly Gln Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Thr Val Asn Ile

245 250 255

Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Arg Phe Pro Gln Ser Thr

260 265 270

Tyr Gln Phe Lys Thr Pro Glu Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ile Gly

275 280 285

Arg Ile Lys Ala Ser Asp Ala Asp Val Gly Glu Asn Ala Glu Ile Glu

290 295 300

Tyr Ser Ile Thr Asp Gly Glu Gly His Glu Met Phe Asp Val Ile Thr

305 310 315 320

Asp Gln Glu Thr Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Lys Lys Leu Leu Asp

325 330 335

Phe Glu Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Lys Val Glu Ala Ser Asn Pro

340 345 350

His Val Glu Pro Arg Phe Leu Tyr Leu Gly Pro Phe Lys Asp Ser Ala

355 360 365

Thr Val Arg Ile Val Val Asp Asp Val Asp Glu Pro Pro Val Phe Ser

370 375 380

Lys Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Ile Arg Glu Asp Ala Arg Ile Asn Thr

385 390 395 400

Thr Ile Gly Ser Val Ala Ala Gln Asp Pro Asp Ala Ala Arg Asn Pro

405 410 415

Val Lys Tyr Ser Val Asp Arg His Thr Asp Met Asp Arg Ile Phe Asn

420 425 430

Ile Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Phe Thr Ser Lys Leu Leu Asp Arg

435 440 445

Glu Thr Leu Leu Trp His Asn Ile Thr Val Ile Ala Thr Glu Ile Asn

450 455 460

Asn Pro Lys Gln Ser Ser Arg Val Pro Leu Tyr Ile Lys Val Leu Asp

465 470 475 480

Val Asn Asp Asn Ala Pro Glu Phe Ala Glu Phe Tyr Glu Thr Phe Val

485 490 495

Cys Glu Lys Ala Lys Ala Asp Gln Leu Ile Gln Thr Leu Arg Ala Val

500 505 510

Asp Lys Asp Asp Pro Tyr Ser Gly His Gln Phe Ser Phe Ser Leu Ala

515 520 525

Pro Glu Ala Ala Ser Ser Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Asn Lys Asp

530 535 540

Asn Thr Ala Gly Ile Leu Thr Arg Lys Asn Gly Tyr Asn Arg His Glu

545 550 555 560

Met Ser Thr Tyr Leu Leu Pro Val Val Ile Ser Asp Asn Asp Tyr Pro

565 570 575

Val Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Thr Val Arg Val Cys Ala Cys Asp

580 585 590

His His Gly Asn Met Gln Ser Cys His Ala Glu Ala Leu Ile His Pro

595 600 605

Thr Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Val Ala Ile Leu Leu Cys Ile Val

610 615 620

Ile Leu Leu Val Thr Val Val Leu Phe Ala Ala Leu Arg Arg Gln Arg

625 630 635 640

Lys Lys Glu Pro Leu Ile Ile Ser Lys Glu Asp Ile Arg Asp Asn Ile

645 650 655

Val Ser Tyr Asn Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Gln Ala Phe

660 665 670

Asp Ile Gly Thr Leu Arg Asn Pro Glu Ala Met Glu Asp Ser Lys Ser

675 680 685

Arg Arg Asp Ile Val Pro Glu Ala Leu Phe Leu Pro Arg Arg Thr Pro

690 695 700

Thr Ala Arg Asp Asn Thr Asp Val Arg Asp Phe Ile Asn Gln Arg Leu

705 710 715 720

Lys Glu Asn Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Ala

725 730 735

Thr Tyr Ala Tyr Glu Gly Thr Gly Ser Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser

740 745 750

Leu Glu Ser Val Thr Thr Asp Gly Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Ser

755 760 765

Asp Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Met

770 775 780

Asp Ser Asp Lys Asp Ser

785 790

<210> 8

<211> 789

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 8

Met Arg Thr Tyr Arg Tyr Phe Leu Leu Leu Phe Trp Val Gly Gln Pro

1 5 10 15

Tyr Pro Thr Phe Ser Asn Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro

20 25 30

Ala Lys Arg Arg Ala Leu Glu Leu Ser Ala Asn Ser Arg Asn Glu Leu

35 40 45

Ser Arg Ser Lys Arg Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu

50 55 60

Glu Tyr Thr Gly Ser Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp

65 70 75 80

Gln Asp Arg Gly Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly

85 90 95

Ala Gly Asp Leu Phe Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala

100 105 110

Thr Lys Arg Leu Asp Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala

115 120 125

Gln Ala Ile Asn Arg Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu

130 135 140

Phe Ile Ile Lys Ile His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe Thr

145 150 155 160

Lys Asp Val Tyr Thr Ala Thr Val Pro Glu Met Ala Asp Val Gly Thr

165 170 175

Phe Val Val Gln Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly

180 185 190

Asn Ser Ala Lys Val Val Tyr Ser Ile Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Phe

195 200 205

Ser Val Glu Ser Glu Thr Gly Ile Ile Lys Thr Ala Leu Leu Asn Met

210 215 220

Asp Arg Glu Asn Arg Glu Gln Tyr Gln Val Val Ile Gln Ala Lys Asp

225 230 235 240

Met Gly Gly Gln Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Thr Val Asn Ile

245 250 255

Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Arg Phe Pro Gln Ser Thr

260 265 270

Tyr Gln Phe Lys Thr Pro Glu Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ile Gly

275 280 285

Arg Ile Lys Ala Ser Asp Ala Asp Val Gly Glu Asn Ala Glu Ile Glu

290 295 300

Tyr Ser Ile Thr Asp Gly Glu Gly His Asp Met Phe Asp Val Ile Thr

305 310 315 320

Asp Gln Glu Thr Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Lys Lys Leu Leu Asp

325 330 335

Phe Glu Lys Lys Arg Val Tyr Thr Leu Lys Val Glu Ala Ser Asn Pro

340 345 350

His Ile Glu Pro Arg Phe Leu Tyr Leu Gly Pro Phe Lys Asp Ser Ala

355 360 365

Thr Val Arg Ile Val Val Asp Asp Val Asp Glu Pro Pro Val Phe Ser

370 375 380

Lys Pro Ala Tyr Ile Leu Gln Ile Arg Glu Asp Ala Gln Ile Asn Thr

385 390 395 400

Thr Ile Gly Ser Val Ala Ala Gln Asp Pro Asp Ala Ala Arg Asn Pro

405 410 415

Val Lys Tyr Ser Val Asp Arg His Thr Asp Met Asp Arg Ile Phe Asn

420 425 430

Ile Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Phe Thr Ser Lys Leu Leu Asp Arg

435 440 445

Glu Thr Leu Leu Trp His Asn Ile Thr Val Ile Ala Thr Glu Ile Asn

450 455 460

Asn Pro Lys Gln Ser Ser Arg Val Pro Leu Tyr Ile Lys Val Leu Asp

465 470 475 480

Val Asn Asp Asn Ala Pro Glu Phe Ala Glu Phe Tyr Glu Thr Phe Val

485 490 495

Cys Glu Lys Ala Lys Ala Asp Gln Leu Ile Gln Thr Leu His Ala Val

500 505 510

Asp Lys Asp Asp Pro Tyr Ser Gly His Gln Phe Ser Phe Ser Leu Ala

515 520 525

Pro Glu Ala Ala Ser Gly Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Asn Lys Asp

530 535 540

Asn Thr Ala Gly Ile Leu Thr Arg Lys Asn Gly Tyr Asn Arg His Glu

545 550 555 560

Met Ser Thr Tyr Leu Leu Pro Val Val Ile Ser Asp Asn Asp Tyr Pro

565 570 575

Val Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Thr Val Arg Val Cys Ala Cys Asp

580 585 590

His His Gly Asn Met Gln Ser Cys His Ala Glu Ala Leu Ile His Pro

595 600 605

Thr Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Val Ala Ile Leu Leu Cys Ile Val

610 615 620

Ile Leu Leu Val Thr Val Val Leu Phe Ala Ala Leu Arg Arg Gln Arg

625 630 635 640

Lys Lys Glu Pro Leu Ile Ile Ser Lys Glu Asp Ile Arg Asp Asn Ile

645 650 655

Val Ser Tyr Asn Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Gln Ala Phe

660 665 670

Asp Ile Gly Thr Leu Arg Asn Pro Lys Pro Trp Arg Gln Gln Ser Arg

675 680 685

Arg Asp Met Val Pro Glu Ala Leu Phe Leu Pro Arg Arg Thr Pro Thr

690 695 700

Ala Arg Asp Asn Thr Asp Val Arg Asp Phe Ile Ser Gln Arg Leu Arg

705 710 715 720

Lys Met Asn Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Ala Thr

725 730 735

Tyr Ala Tyr Glu Gly Thr Gly Ser Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser Leu

740 745 750

Glu Ser Val Thr Thr Asp Gly Asp Gln Asp Tyr Gly Tyr Leu Ser Asp

755 760 765

Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Met Asp

770 775 780

Ser Asp Lys Asp Ser

785

<210> 9

<211> 790

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 9

Met Arg Thr Tyr Arg Tyr Phe Leu Leu Leu Phe Trp Val Gly Gln Pro

1 5 10 15

Tyr Pro Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro

20 25 30

Ala Lys Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Asn Glu Leu

35 40 45

Asn Arg Ser Lys Arg Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu

50 55 60

Glu Tyr Thr Gly Ser Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp

65 70 75 80

Gln Asp Arg Gly Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly

85 90 95

Ala Gly Asp Leu Phe Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala

100 105 110

Thr Lys Arg Leu Asp Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala

115 120 125

Gln Ala Ile Asn Arg Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu

130 135 140

Phe Ile Ile Lys Ile His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe Thr

145 150 155 160

Lys Glu Val Tyr Thr Ala Thr Val Pro Glu Met Ser Asp Val Gly Thr

165 170 175

Phe Val Val Gln Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly

180 185 190

Asn Ser Ala Lys Val Val Tyr Ser Ile Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Phe

195 200 205

Ser Val Glu Ser Glu Thr Gly Ile Ile Lys Thr Ala Leu Leu Asn Met

210 215 220

Asp Arg Glu Asn Arg Glu Gln Tyr Gln Val Val Ile Gln Ala Lys Asp

225 230 235 240

Met Gly Gly Gln Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Thr Val Asn Ile

245 250 255

Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Arg Phe Pro Gln Ser Thr

260 265 270

Tyr Gln Phe Lys Thr Pro Glu Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ile Gly

275 280 285

Arg Ile Lys Ala Ser Asp Ala Asp Val Gly Glu Asn Ala Glu Ile Glu

290 295 300

Tyr Ser Ile Thr Asp Gly Glu Gly Leu Asp Met Phe Asp Val Ile Thr

305 310 315 320

Asp Gln Glu Thr Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Lys Lys Leu Leu Asp

325 330 335

Phe Glu Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Lys Val Glu Ala Ser Asn Pro

340 345 350

His Val Glu Pro Arg Phe Leu Tyr Leu Gly Pro Phe Lys Asp Ser Ala

355 360 365

Thr Val Arg Ile Val Val Glu Asp Val Asp Glu Pro Pro Val Phe Ser

370 375 380

Lys Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Ile Arg Glu Asp Ala Gln Ile Asn Thr

385 390 395 400

Thr Ile Gly Ser Val Thr Ala Gln Asp Pro Asp Ala Ala Arg Asn Pro

405 410 415

Val Lys Tyr Ser Val Asp Arg His Thr Asp Met Asp Arg Ile Phe Asn

420 425 430

Ile Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Phe Thr Ser Lys Leu Leu Asp Arg

435 440 445

Glu Thr Leu Leu Trp His Asn Ile Thr Val Ile Ala Thr Glu Ile Asn

450 455 460

Asn Pro Lys Gln Ser Ser Arg Val Pro Leu Tyr Ile Lys Val Leu Asp

465 470 475 480

Val Asn Asp Asn Ala Pro Glu Phe Ala Glu Phe Tyr Glu Thr Phe Val

485 490 495

Cys Glu Lys Ala Lys Ala Asp Gln Leu Ile Gln Thr Leu Arg Ala Val

500 505 510

Asp Lys Asp Asp Pro Tyr Ser Gly His Gln Phe Ser Phe Ser Leu Ala

515 520 525

Pro Glu Ala Ala Ser Gly Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Asn Lys Asp

530 535 540

Asn Thr Ala Gly Ile Leu Thr Arg Lys Asn Gly Tyr Asn Arg His Glu

545 550 555 560

Met Ser Thr Tyr Leu Leu Pro Val Val Ile Ser Asp Asn Asp Tyr Pro

565 570 575

Val Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Thr Val Arg Val Cys Ala Cys Asp

580 585 590

His His Gly Asn Met Gln Ser Cys His Ala Glu Ala Leu Ile His Pro

595 600 605

Thr Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Val Ala Ile Leu Leu Cys Ile Val

610 615 620

Ile Leu Leu Val Thr Val Val Leu Phe Ala Ala Leu Arg Arg Gln Arg

625 630 635 640

Lys Lys Glu Pro Leu Ile Ile Ser Lys Glu Asp Ile Arg Asp Asn Ile

645 650 655

Val Ser Tyr Asn Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Gln Ala Phe

660 665 670

Asp Ile Gly Thr Leu Arg Asn Pro Glu Ala Ile Glu Asp Asn Lys Leu

675 680 685

Arg Arg Asp Ile Val Pro Glu Ala Leu Phe Leu Pro Arg Arg Thr Pro

690 695 700

Thr Ala Arg Asp Asn Thr Asp Val Arg Asp Phe Ile Asn Gln Arg Leu

705 710 715 720

Lys Glu Asn Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Ala

725 730 735

Thr Tyr Ala Tyr Glu Gly Thr Gly Ser Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser

740 745 750

Leu Glu Ser Val Thr Thr Asp Gly Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Ser

755 760 765

Asp Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Val

770 775 780

Asp Ser Asp Lys Asp Ser

785 790

<210> 10

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Gly Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Ala

85 90 95

Phe Gly Gly Val Thr Asn Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 11

<211> 324

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 11

gacatccaga tgacccagtc tccttcactc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60

ctcaactgca aagcaagtca gaatatttat aagaacttag cctggtatca gcaaaagctt 120

ggagaaggtc ccaaactcct gatttatgat gcaaacactt tgcaaacggg catcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggttcagat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatgttg ccacatattt ctgccagcag tactatagcg ggtgggcgtt cggtggagtc 300

accaacctgg aattgaaacg ggct 324

<210> 12

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 12

Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 13

Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 14

Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Ala

1 5

<210> 15

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn

20 25 30

Phe Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Cys Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 366

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 16

caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aggaacttta tgcactggat aaaacagcag 120

cctggaaatg gccttgagtg gattgggtgg atttattgtg gagatggtga gacagagtac 180

aatcaaaagt tcaatgggaa ggcaacactc actgcggaca gatcctccag cacagcctat 240

atggagctca gcagactgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaggggtt 300

tacggagggt ttgccggggg ctactttgat ttctggggcc aaggagtcat ggtcacagtc 360

tcctca 366

<210> 17

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 17

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Phe Met His

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 18

Trp Ile Tyr Cys Gly Asp Gly Glu Thr Glu

1 5 10

<210> 19

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 19

Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 20

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 20

Asp Val Gln Met Thr His Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Thr Ser Lys Asn Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Tyr Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Glu Lys Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

100 105

<210> 21

<211> 327

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 21

gatgtccaga tgacccactc tccgtcttat cttgctgcgt ctcctggaga aagtgtttcc 60

atcagttgca agacaagtaa gaacattagt aattatttag tctggtatca acagaaacct 120

ggggaagcat ataagcttct tatctattct gggtcaactt tgcaatctgg aactccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ctatcagaag cctggagcct 240

gaagattttg gactctattt ctgtcaacag tattatgaaa aaccattcac gttcggctca 300

gggacgaagt tggaaataaa acgggct 327

<210> 22

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 22

Lys Thr Ser Lys Asn Ile Ser Asn Tyr Leu Val

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 23

Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 24

Gln Gln Tyr Tyr Glu Lys Pro Phe Thr

1 5

<210> 25

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 25

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Arg Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Gln

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Ile Asn His Gly Gly Tyr Ser Tyr Val Val Asp Ala Trp Gly

100 105 110

Pro Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 363

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 26

gaggtgcaac ttcaggagtc aggacctggc cttgtgagac cctcacagtc actctccctc 60

tcctgttctg tcactgatta ctccatcact agtaattact ggggctggat ccggaggttc 120

ccaggaaata aaatggagtg gatgggatac ataacctata gtggttacac tagctacaac 180

ccatctctcc aaagtcgaat ctccattact agagacacat cgaagaatca gttcttcctg 240

cagttgaact ctgtaactgc tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag atcgattaac 300

cacggaggat atagttatgt tgtggatgcc tggggtccgg gagcttcagt cactgtctcc 360

tca 363

<210> 27

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 27

Asp Tyr Ser Ile Thr Ser Asn Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 28

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 28

Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser

1 5

<210> 29

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 29

Ser Ile Asn His Gly Gly Tyr Ser Tyr Val Val Asp Ala

1 5 10

<210> 30

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 30

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ala Thr Lys Ser Ile Gly Ile Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Phe Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Tyr Glu Asn Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg Arg Ala

100 105

<210> 31

<211> 327

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 31

gatgtccaga tgacccagtc tccgtcttct cttgctgcgt ctcctggaga aagtgtttcc 60

atcagttgca gggcaactaa gagcattggt atttatttag cctggtatca acagaaacct 120

gggaaaacat ttaagcttct tatctactct gggtcaactt tgcaatctgg aactccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct 240

gaagattttg gactctattt ctgtcaacag ttttatgaaa acccattcac gttcggctca 300

gggacgaagt tggaaataag acgggct 327

<210> 32

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 32

Arg Ala Thr Lys Ser Ile Gly Ile Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 33

Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 34

Gln Gln Phe Tyr Glu Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 35

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 35

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Ile Thr Thr Tyr

20 25 30

Phe Trp Gly Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Met Ser Tyr Arg Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Cys Pro Asn Tyr Gly Gly His Ser Leu Val Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 363

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 36

gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc cttgtgaaac cctcacagtc actctccctc 60

acctgttctg tcactgatta ctccatcact acttatttct ggggctggat ccggaagttc 120

ccaggaaata aaatggagtg gatgggatac atgagctacc gtggtggcac ttcctacaac 180

ccatctctca agagtcgaat ctccattact agagacacat cgaagaatca gttcttcctg 240

cagttgaact ctgtaactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag atgccctaac 300

tacggagggc attcccttgt ttttgattac tggggccaag gagtcatggt cacagtgtcc 360

tca 363

<210> 37

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 37

Asp Tyr Ser Ile Thr Thr Tyr Phe Trp Gly

1 5 10

<210> 38

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 38

Tyr Met Ser Tyr Arg Gly Gly Thr Ser

1 5

<210> 39

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 39

Cys Pro Asn Tyr Gly Gly His Ser Leu Val Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 40

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 40

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Ala Thr Lys Ser Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Tyr Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Ser Cys Gln Gln Tyr Tyr Glu Lys Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

100 105

<210> 41

<211> 327

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 41

gatgtccaga tgacccagtc tccgtcttat cttgctgcgt ctcctggaga aagtgtttcc 60

atcagttgca aggcaactaa gagcattagt aattatttag cctggtatca acagaaacct 120

ggggaagcat ataaggttct tatctattct gggtcaactt tgcaatctgg aactccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct 240

gaagattttg gactctattc ctgtcaacag tattatgaaa aaccgctcac gttcggttct 300

gggaccaagc tggagatcaa acgggct 327

<210> 42

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 42

Lys Ala Thr Lys Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 43

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 43

Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 44

Gln Gln Tyr Tyr Glu Lys Pro Leu Thr

1 5

<210> 45

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 45

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Met Ser Ile Thr Arg Asp Ala Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ser Pro Ile Asn His Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly

100 105 110

Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 46

<211> 363

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 46

gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc cttgtgaaac cctcacagtc actctccctc 60

acctgttctg tcactggtta ctccatcact acttattact ggggctggat ccggaagttc 120

ccaggaaata aaatggagtg gatggggtac ataagctaca gtggtcgcac tagttataac 180

ccatctctca aaagtcgaat gtccattact agagacgcat cgaagaatca gttcttccta 240

cagttgaact ctgtaactac tgacgacaca gccacatatt actgtgcaag atccccaatt 300

aaccacggag ggtactggta ctttgacttc tggggcccag gaaccatggt caccgtgtcc 360

tca 363

<210> 47

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 47

Gly Tyr Ser Ile Thr Thr Tyr Tyr Trp Gly

1 5 10

<210> 48

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 48

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Thr Ser

1 5

<210> 49

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 49

Ser Pro Ile Asn His Gly Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 50

<211> 449

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, содержащая последовательность ДНК, кодирующую сигнальную

последовательность легкой цепи человека и константную область каппа цепи

человека

<400> 50

gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60

gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120

cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180

cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240

gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300

cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360

cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420

ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449

<210> 51

<211> 1132

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, содержащая последовательность ДНК, кодирующую сигнальную

последовательность тяжелой цепи человека и константную область

IgG1 человека

<400> 51

gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60

tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc ctccaccaag 120

ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 180

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 240

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 300

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 360

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 420

aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 480

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 660

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 780

cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 840

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900

gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 960

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1020

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1080

tccctgtctc ccggcaaatg agatatcggg cccgtttaaa cgggggaggc ta 1132

<210> 52

<211> 749

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, содержащая последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь chG019

<400> 52

ccagcctccg gactctagag ccaccatggt gctgcagacc caggtgttca tcagcctgct 60

gctgtggatc agcggcgcct acggcgacat ccagatgacc cagagcccta gcctgctgag 120

cgccagcgtg ggcgatagag tgaccctgaa ctgcaaggcc agccagaaca tctacaagaa 180

cctggcctgg tatcagcaga agctgggcga gggccccaag ctgctgatct acgacgccaa 240

caccctgcag accggcatcc ccagcagatt ttctggcagc ggcagcggct ccgacttcac 300

cctgacaatc agcagcctgc agcccgagga cgtggccacc tacttttgcc agcagtacta 360

cagcggctgg gccttcggcg gcgtgaccaa cctggaactg aagagagccg tggccgctcc 420

ctccgtgttc atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt 480

gtgcctgctg aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc 540

cctgcagtct ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta 600

cagcctgagc agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc 660

ctgcgaagtg acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga 720

gtgttgagtt taaacggggg aggctaact 749

<210> 53

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи chG019

<400> 53

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Ile Tyr Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Gly Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr

100 105 110

Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gly Val Thr Asn Leu Glu Leu Lys Arg Ala

115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 54

<211> 699

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность полноразмерной легкой цепи chG019

<400> 54

atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatcagcgg cgcctacggc 60

gacatccaga tgacccagag ccctagcctg ctgagcgcca gcgtgggcga tagagtgacc 120

ctgaactgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagctg 180

ggcgagggcc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg catccccagc 240

agattttctg gcagcggcag cggctccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300

gaggacgtgg ccacctactt ttgccagcag tactacagcg gctgggcctt cggcggcgtg 360

accaacctgg aactgaagag agccgtggcc gctccctccg tgttcatctt cccacctagc 420

gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 480

cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aatgccctgc agtctggcaa cagccaggaa 540

agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600

agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660

tctagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgt 699

<210> 55

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи chG019

<400> 55

gacatccaga tgacccagag ccctagcctg ctgagcgcca gcgtgggcga tagagtgacc 60

ctgaactgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagctg 120

ggcgagggcc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg catccccagc 180

agattttctg gcagcggcag cggctccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 240

gaggacgtgg ccacctactt ttgccagcag tactacagcg gctgggcctt cggcggcgtg 300

accaacctgg aactgaagag agcc 324

<210> 56

<211> 471

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи chG019

<400> 56

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Asn Phe Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe

115 120 125

Asp Phe Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 57

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность полноразмерной тяжелой цепи chG019

<400> 57

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60

gtgcagctgc agcagtctgg cgccgagctc gtgaagcctg gcagcagcgt gaagatcagc 120

tgcaaggcca gcggctacac cttcacccgg aacttcatgc actggatcaa gcagcagccc 180

ggcaacggcc tggaatggat cggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacaac 240

cagaagttca acggcaaggc caccctgacc gccgacagaa gcagctccac cgcctacatg 300

gaactgagcc ggctgaccag cgaggacagc gccgtgtact tttgcgccag aggcgtgtac 360

ggcggcttcg ctggcggcta cttcgatttt tggggccagg gcgtgatggt caccgtcagc 420

tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540

agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960

aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320

tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380

acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413

<210> 58

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи chG019

<400> 58

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn

20 25 30

Phe Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 59

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи chG019

<400> 59

caggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgag ctcgtgaagc ctggcagcag cgtgaagatc 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc cggaacttca tgcactggat caagcagcag 120

cccggcaacg gcctggaatg gatcggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180

aaccagaagt tcaacggcaa ggccaccctg accgccgaca gaagcagctc caccgcctac 240

atggaactga gccggctgac cagcgaggac agcgccgtgt acttttgcgc cagaggcgtg 300

tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcgtgat ggtcaccgtc 360

agctca 366

<210> 60

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDRH2 chG019

<400> 60

Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu

1 5 10

<210> 61

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи hL02

<400> 61

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Ile Tyr Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr

100 105 110

Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 62

<211> 699

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность полноразмерной легкой цепи hL02

<400> 62

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120

atcacatgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg cgtgcccagc 240

agattttctg gcagcggcag cggctccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctactt ttgccagcag tactacagcg gctgggcctt cggccagggc 360

accaaggtgg aaatcaagcg tacggtggcc gccccctccg tgttcatctt ccccccctcc 420

gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaataa cttctacccc 480

agagaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccgggaa ctcccaggag 540

agcgtgaccg agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600

agcaaagccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggcctg 660

agctcccccg tcaccaagag cttcaacagg ggggagtgt 699

<210> 63

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи hL02

<400> 63

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 64

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи hL02

<400> 64

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacatgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg cgtgcccagc 180

agattttctg gcagcggcag cggctccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctactt ttgccagcag tactacagcg gctgggcctt cggccagggc 300

accaaggtgg aaatcaagcg tacg 324

<210> 65

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи hL03

<400> 65

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Ile Tyr Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Gly Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr

100 105 110

Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 66

<211> 699

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность полноразмерной легкой цепи hL03

<400> 66

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120

atcacatgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagctg 180

ggcgagggcc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg cgtgcccagc 240

agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacagcg gctgggcctt tggccagggc 360

accaaggtgg aaatcaagcg tacggtggcc gccccctccg tgttcatctt ccccccctcc 420

gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaataa cttctacccc 480

agagaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccgggaa ctcccaggag 540

agcgtgaccg agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600

agcaaagccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggcctg 660

agctcccccg tcaccaagag cttcaacagg ggggagtgt 699

<210> 67

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи hL03

<400> 67

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Gly Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Ala

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 68

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи hL03

<400> 68

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacatgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagctg 120

ggcgagggcc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg cgtgcccagc 180

agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacagcg gctgggcctt tggccagggc 300

accaaggtgg aaatcaagcg tacg 324

<210> 69

<211> 471

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи hH01

<400> 69

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Asn Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala

65 70 75 80

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe

115 120 125

Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 70

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность полноразмерной тяжелой цепи hH01

<400> 70

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggcca gcggctacac ctttacccgg aacttcatgc actgggtgcg ccaggctcca 180

ggccagggac tggaatggat gggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacgcc 240

cagaaattcc agggcagagt gaccatcacc gccgacacca gcacctccac cgcctacatg 300

gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag aggcgtgtac 360

ggcggcttcg ctggcggcta cttcgatttt tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420

tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540

agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960

aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320

tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380

acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413

<210> 71

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи hH01

<400> 71

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn

20 25 30

Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 72

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи hH01

<400> 72

gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc cggaacttca tgcactgggt gcgccaggct 120

ccaggccagg gactggaatg gatgggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180

gcccagaaat tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcgtg 300

tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360

agctca 366

<210> 73

<211> 471

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи hH02

<400> 73

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Asn Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe

115 120 125

Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 74

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность полноразмерной тяжелой цепи hH02

<400> 74

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggcca gcggctacac ctttacccgg aacttcatgc actgggtgcg ccaggctcca 180

ggccagggac tggaatggat gggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacaac 240

cagaaattcc agggcagagt gaccatcacc gccgacagaa gcaccagcac cgcctacatg 300

gaactgagca gcctgcggag cgaggatacc gccgtgtact tctgtgccag aggcgtgtac 360

ggcggcttcg ctggcggcta cttcgatttt tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420

tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540

agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960

aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320

tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380

acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413

<210> 75

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи hH02

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn

20 25 30

Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 76

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи hH02

<400> 76

gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc cggaacttca tgcactgggt gcgccaggct 120

ccaggccagg gactggaatg gatgggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180

aaccagaaat tccagggcag agtgaccatc accgccgaca gaagcaccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaggcgtg 300

tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360

agctca 366

<210> 77

<211> 471

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи hH04

<400> 77

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Arg Asn Phe Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala

65 70 75 80

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe

115 120 125

Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 78

<211> 1413

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность полно полноразмерной тяжелой цепи hH04

<400> 78

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggcca gcggctacac ctttacccgg aacttcatgc actggatccg gcaggcccct 180

ggacagggcc tggaatggat gggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacgcc 240

cagaaattcc agggcagagt gaccctgacc gccgacagaa gcaccagcac cgcctacatg 300

gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag aggcgtgtac 360

ggcggcttcg ctggcggcta cttcgatttt tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420

tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480

ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540

agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780

ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960

aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080

tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200

atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320

tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380

acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413

<210> 79

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи hH04

<400> 79

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn

20 25 30

Phe Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 80

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи hH04

<400> 80

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc cggaacttca tgcactggat ccggcaggcc 120

cctggacagg gcctggaatg gatgggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180

gcccagaaat tccagggcag agtgaccctg accgccgaca gaagcaccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcgtg 300

tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360

agctca 366

<210> 81

<211> 235

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи NOV0712

<400> 81

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly

100 105 110

Thr Phe Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 82

<211> 705

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную

последовательность номер 81

<400> 82

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120

atcacctgta gagccagcca gagcatcagc agctacctga actggtatca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaaactgct gatctacgcc gtgtccacac tgcagagcgg cgtgcccagc 240

agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag tccggcacct tcccccccac cacatttggc 360

cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggccgccc cctccgtgtt catcttcccc 420

ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtgg tgtgcctgct gaataacttc 480

taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cgggaactcc 540

caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcaccctg 600

accctgagca aagccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 660

ggcctgagct cccccgtcac caagagcttc aacagggggg agtgt 705

<210> 83

<211> 467

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи NOV0712

<400> 83

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Gly Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Trp Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ser Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 84

<211> 1401

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную

последовательность номер 83

<400> 84

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60

gtgcagctgc tggaatctgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctctct gagactgtct 120

tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcagc cacggaatgc actgggtgcg ccaggcccct 180

ggaaagggac tggaatgggt gtccgtgatc agcggcagcg gctccaatac cggctacgcc 240

gatagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300

cagatgaaca gcctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag acagtggggc 360

agctacgcct tcgattcttg gggccagggc accctcgtga ccgtcagctc agcctccacc 420

aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480

gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540

ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600

tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660

aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720

gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaac tcctgggggg accctcagtc 780

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960

cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080

ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200

tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380

ctctccctgt ctcccggcaa a 1401

<210> 85

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 85

caccatgaga acttaccgct acttcttgct gctc 34

<210> 86

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 86

ttaggagtct ttgtcactgt ccactcctcc 30

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено антитело, связывающееся с CDH6 и обладающее способностью к интернализации. Также предложены конъюгаты указанного антитела и лекарственного средства, обладающие противоопухолевой активностью. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим конъюгат антитело-лекарственное средство, применяемым для лечения или для диагностики опухоли, способу лечения опухоли с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции. Изобретение обеспечивает повышенную способность антитела к интернализации в клетки, экспрессирующие CDH6, что позволяет использование его в качестве антитела для ADC. 14 н. и 45 з.п. ф-лы, 29 ил., 16 табл., 9 пр.

1. Антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, специфически связывающееся с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, и обладающее способностью к интернализации, которая обеспечивает поглощение клетками,

которое содержит CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (1)-(4):

(1) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14,

(2) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:22,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:23, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:24,

(3) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:33, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:34, и

(4) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:42,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:43, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:44, и

CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (5)-(9):

(5) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19,

(6) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:27,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29,

(7) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:37,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:38, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:39,

(8) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:47,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:48, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:49, и

(9) CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:60, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19.

2. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, которое содержит CDRL1, CDRL2 и CDRL3 и CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в любой комбинации, выбранной из группы, включающей следующие комбинации (1)-(5):

(1) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, и

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19,

(2) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:22,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:23, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:24, и

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29,

(3) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:33, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:34, и

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:37,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:38, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:39,

(4) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:42,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:43, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:44, и

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:47,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:48, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:49, и

(5) CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, и

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:60, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19.

3. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, которое является гуманизированным.

4. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, которое имеет любую вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из следующих вариабельных областей (1)-(4):

(1) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63,

(2) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:67,

(3) аминокислотная последовательность, которая по меньшей мере на 95% или более идентична последовательности каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в аминокислотных последовательностях (1) и (2), и

(4) аминокислотная последовательность, содержащая делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательности каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в аминокислотных последовательностях (1)-(3), и

любую вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из следующих вариабельных областей (5)-(9):

(5) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:71,

(6) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:75,

(7) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:79,

(8) аминокислотная последовательность, которая по меньшей мере на 95% или более гомологична последовательности каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в аминокислотных последовательностях (5)-(7), и

(9) аминокислотная последовательность, содержащая делецию, замену или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательности каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в аминокислотных последовательностях (5)-(8).

5. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, которое содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи в любой из следующих комбинаций (1)-(4):

(1) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63, и

вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:71,

(2) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63, и

вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:75,

(3) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:67, и

вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:75, и

(4) вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63, и

вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:79.

6. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, которое имеет любую из следующих комбинаций (1)-(4):

(1) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:69,

(2) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73,

(3) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:65, и

тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73, и

(4) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:77.

7. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 6, которое имеет

легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:69.

8. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 6, которое имеет

легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73.

9. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 6, которое имеет

легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:65, и

тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73.

10. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 6, которое имеет

легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:77.

11. Антиген-связывающий фрагмент по п. 1, где антиген-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab')₂, Fab' и Fv.

12. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп. 1-11.

13. Полинуклеотид по п. 12, который включает полинуклеотиды в любой комбинации, выбранной из группы, включающей следующие комбинации (1)-(5):

(1) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую

CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, и

полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19,

(2) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую

CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:22,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:23, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:24, и

полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29,

(3) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую

CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:32,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:33, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:34, и

полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:37,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:38, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:39,

(4) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую

CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:42,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:43, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:44, и

полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:47,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:48, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:49, и

(5) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую

CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12,

CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13, и

CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, и

полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую

CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:17,

CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:60, и

CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19.

14. Полинуклеотид по п. 12, который включает

полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:69.

15. Полинуклеотид по п. 12, который включает

полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73.

16. Полинуклеотид по п. 12, который включает

полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:65, и

полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73.

17. Полинуклеотид по п. 12, который включает

полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:77.

18. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 12-17.

19. Клетка-хозяин для получения антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп. 1-11, трансформированные экспрессионным вектором по п. 18.

20. Клетка-хозяин по п. 19, где клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.

21. Способ получения антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп. 1-11, который включает

стадию культивирования клеток-хозяев по п. 19 и

стадию сбора антитела или антиген-связывающего фрагмента антитела из культуры, полученной на вышеуказанной стадии.

22. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, где тяжелая цепь или легкая цепь подверглась одной, двум или более модификациям, выбранным из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, О-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, С-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, добавление остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина, превращения N-концевого глутамина или N-концевой глутаминовой кислоты в пироглутаминовую кислоту и делеции одной или двух аминокислот из карбоксильного конца.

23. Антитело по п. 22, где одна или две аминокислоты делецированы из карбоксильного конца его тяжелой цепи.

24. Антитело по п. 23, где одна аминокислота делецирована из каждого карбоксильного конца его обеих тяжелых цепей.

25. Антитело по п. 22, где остаток пролина на карбоксильном конце его тяжелой цепи дополнительно амидирован.

26. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п. 1, где модификация сахарных цепей регулируется с целью усиления антителозависимой клеточной цитотоксической активности.

27. Конъюгат антитело-лекарственное средство для использования в качестве лекарственного средства для лечения опухоли,

где конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп. 1-11 и 22-26, конъюгированное с противоопухолевым средством.

28. Конъюгат антитело-лекарственное средство для использования в качестве исследовательского реагента, реагента для анализа, диагностического агента и агента для диагностической визуализации in vivo, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11 и 22-26, конъюгированное с противоопухолевым соединением.

29. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, где лекарственное средство представляет противоопухолевое соединение, представленное следующей формулой:

[Формула 1]

.

30. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, где антитело или его антиген-связывающий фрагмент конъюгировано с лекарственным средством через линкер, имеющий любую структуру, выбранную из группы, состоящей из следующих формул (а)-(f):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

(b) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

(d) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

(e) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-, и

(f) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-,

где антитело связано с концом -(сукцинимид-3-ил-N), противоопухолевое соединение связано с карбонильной группой

-CH₂CH₂CH₂-C(=O)- (a), (b), (e) или (f), группа CH₂-O-CH₂-C(=O)- в (c) или группа CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)- в (d) с атомом азота аминогруппы в положении 1 в качестве соединительного положения, GGFG представляет аминокислотную последовательность, состоящую из глицин-глицин-фенилаланин-глицина, связанного через пептидные связи, и

-(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:

[Формула 2]

которая связана с антителом в его положении 3 и связана с метиленовой группой в линкерной структуре, содержащей эту структуру в атоме азота в положении 1.

31. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, где линкер представлен любой формулой, выбранной из группы, состоящей из следующих формул (с), (d) и (е):

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-,

(d) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂-O-CH₂-C(=O)-, и

(e) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

32. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, где линкер представлен следующей формулой (с) или (е):

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂-O-CH₂-C(=O)-, и

(e) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH₂CH₂-C(=O)-NH-CH₂CH₂O-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-C(=O)-GGFG-NH-CH₂CH₂CH₂-C(=O)-.

33. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, который имеет структуру, представленную следующей формулой:

[Формула 3]

где AB представляет антитело или его антиген-связывающий фрагмент, n представляет среднее число звеньев структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, в расчете на антитело, и антитело связано с линкером через сульфгидрильную группу антитела.

34. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, который имеет структуру, представленную следующей формулой:

[Формула 4]

где AB представляет антитело или его антиген-связывающий фрагмент,

n представляет среднее число звеньев структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, в расчете на антитело, и

антитело связано с линкером через сульфгидрильную группу, происходящую из антитела.

35. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, который имеет структуру, представленную следующей формулой:

где Ab представляет собой антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:71, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:63,

n равно среднему число единиц структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, на антитело,

где среднее число единиц выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, равно от 1 до 10.

36. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, который имеет структуру, представленную следующей формулой:

где Ab представляет собой антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:75, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:63,

n равно среднему число единиц структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, на антитело,

где среднее число единиц выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, равно от 1 до 10.

37. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, который имеет структуру, представленную следующей формулой:

где Ab представляет собой антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:79, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:63,

n равно среднему число единиц структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, на антитело,

где среднее число единиц выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, равно от 1 до 10.

38. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, где антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (1)-(4), или его антиген-связывающий фрагмент:

(1) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелая цепь, состоящая из: (i) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:69; или (ii) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:69, где одна или две аминокислот удалены с карбоксильного конца,

(2) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелая цепь, состоящая из: (i) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73; или (ii) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73, где одна или две аминокислот удалены с карбоксильного конца,

(3) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:65, и

тяжелая цепь, состоящая из: (i) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73; или (ii) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73, где одна или две аминокислот удалены с карбоксильного конца, и

(4) легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелая цепь, состоящая из: (i) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:77; или (ii) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:77, где одна или две аминокислот удалены с карбоксильного конца.

39. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 38, где антитело содержит

легкую цепь, состоящую из: (i) аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:69; или (ii) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:69, где одна или две аминокислот удалены с карбоксильного конца, или его антиген-связывающий фрагмент.

40. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 38, где антитело содержит

легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и

тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:77; или аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:77, где одна или две аминокислот удалены с карбоксильного конца, или его антиген-связывающий фрагмент.

41. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 38, где антитело содержит легкую цепь, состоящую из:

(i) аминокислотной последовательности в положениях 21-233 в SEQ ID NO:61, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73; или

(ii) аминокислотной последовательности в положениях 20-471 в SEQ ID NO:73, где одна или две аминокислот удалены с карбоксильного конца, или его антиген-связывающий фрагмент.

42. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 27 или 28, где тяжелая цепь или легкая цепь подверглись одной, двум или более модификациям, выбранным из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, О-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, С-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, добавление остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина, превращения N-концевого глутамина или N-концевой глутаминовой кислоты в пироглутаминовую кислоту и делеции одной или двух аминокислот из карбоксильного конца.

43. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 27, 28, 33 или 34, где среднее число звеньев выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, находится в диапазоне от 1 до 10.

44. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 35-37 и 43, где среднее число звеньев выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, находится в диапазоне от 2 до 8.

45. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 44, где среднее число звеньев выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, находится в диапазоне от 5 до 8.

46. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 45, где среднее число звеньев выбранной структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных на антитело, находится в диапазоне от 7 до 8.

47. Фармацевтическая композиция для использования в качестве лекарственного средства для лечения опухоли, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 27-46, его фармацевтически приемлемую соль, или гидрат конъюгата или соли.

48. Фармацевтическая композиция для использования в качестве исследовательского реагента, реагента для анализа, диагностического агента и агента для диагностической визуализации in vivo, содержащий конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп. 27-46, его фармакологически приемлемую соль или гидрат конъюгата или соль.

49. Фармацевтическая композиция по п. 47, где опухоль представляет опухоль, экспрессирующую CDH6.

50. Фармацевтическая композиция по п. 47, где опухоль представляет почечноклеточную карциному, почечноклеточную светлоклеточную карциному, папиллярную почечноклеточную карциному, рак яичника, серозную аденокарциному яичника, рак щитовидной железы, рак желчных протоков, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, глиобластому, мезотелиому, рак матки, рак поджелудочной железы, опухоль Вильмса или нейробластому.

51. Способ лечения опухоли, который включает введение любого компонента, выбранного из конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 27-46, его фармацевтически приемлемой соли, и гидрата конъюгата или соли, субъекту.

52. Способ лечения по п. 51, где опухоль представляет опухоль, экспрессирующую CDH6.

53. Способ лечения по п. 51, где опухоль представляет почечноклеточную карциному, почечноклеточную светлоклеточную карциному, папиллярную почечноклеточную карциному, рак яичника, серозную аденокарциному яичника, рак щитовидной железы, рак желчных протоков, рак легкого, мелкоклеточный рак легких, глиобластому, мезотелиому, рак матки, рак поджелудочной железы, опухоль Вильмса или нейробластому.

54. Применение, по меньшей мере, одного конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 27-46, их фармацевтически приемлемой соли, и гидрата конъюгата или соли для производства лекарственного препарата для лечения опухоли у индивида.

55. Применение по п. 54, где опухоль представляет опухоль, экспрессирующую CDH6.

56. Применение по п. 54, где опухоль представляет почечноклеточную карциному, почечноклеточную светлоклеточную карциному, папиллярную почечноклеточную карциному, рак яичника, серозную аденокарциному яичника, рак щитовидной железы, рак желчных протоков, рак легкого, мелкоклеточный рак легких, глиобластому, мезотелиому, рак матки, рак поджелудочной железы, опухоль Вильмса или нейробластому.

57. Способ лечения опухоли, который включает введение фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один компонент, выбранный из конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 27-46, его фармацевтически приемлемой соли, и гидрата конъюгата или соли и, по меньшей мере, одного противоопухолевого лекарственного средства субъекту одновременно, отдельно или непрерывно.

58. Применение фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, одно из конъюгатов антитело-лекарственное средство по пп. 27-46, их фармацевтически приемлемой соли, и гидрата конъюгата или соли, для производства лекарственного препарата для лечения опухоли у индивида, где лекарственный препарат вводят одновременно, отдельно или непрерывно, по меньшей мере, с одним противоопухолевым лекарственным средством.

59. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп. 27-46, который включает стадию взаимодействия антитела или антиген-связывающего фрагмента по любому из пп. 1-11 и 22-26, или антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, полученного способом получения по п. 21 с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер.