Изобретение относится к фармацевтическому продукту, подходящему для лечения и/или профилактики аллергии на клещей домашней пыли и аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли, содержащему аллерген клещей, и к способу его получения.
Уровень техники
В странах с западным образом жизни аллергия является основной проблемой для здоровья людей. Более того, частота распространения аллергического заболевания возрастает в этих странах. Несмотря на то, что аллергию в общем нельзя рассматривать в качестве угрожающего жизни заболевания, ежегодно астма является причиной значительного числа смертей. Исключительно высокое распространение аллергии примерно у 30% подростков приводит к существенной потере качества жизни, рабочих дней и финансов, и служит основанием для классификации ее как большой проблемы со здоровьем в западных странах.
Клинически аллергия и ее симптомы проявляются несколькими путями и могут различаться в зависимости от конкретного сенсибилизированного индивидуума и причин аллергии. Распространенными симптомами являются отек, зуд, покраснение и истечения из глаз и носа (ринит и конъюнктивит) и симптомы со стороны верхних и нижних дыхательных путей, такие как одышка, кашель, затрудненное дыхание, кожные проявления, такие как экзема, крапивница и зуд. Также имеют место другие симптомы, такие как утомление или бессонница. Симптоматическое лечение направлено на снижение или воздействие на тяжесть симптомов или снижение необходимости в использовании других лекарственных препаратов, назначенных параллельно. Лекарственные препараты для симптоматического лечения включают антигистаминные препараты, такие как антагонисты Н1- и Н2-рецепторов, кортикостероиды для интраназального и системного введения, нестероидные противовоспалительные препараты, противоотечные средства для снятия заложенности носа, такие как агонисты адренорецепторов. Лечение и ослабление одного или более симптомов аллергии и/или снижение потребности в другом лечении является дополнительной целью данного изобретения.
Аллерген-специфическая иммунотерапия (также относящаяся к иммунотерапии аллергенами, иммунотерапии аллергии, специфической вакцинации от аллергии (SAV), гипосенсибилизации или десенсибилизации) является лечением аллергического заболевания, направленным на его причину. Она оказывает влияние на основные иммунологические механизмы, приводя к стойкому или долгосрочному улучшению иммунного статуса пациента. Таким образом, протективный эффект специфической вакцинации от аллергии сохраняется дольше, чем только в периоде лечения в противоположность симптоматическому лечению препаратами. Некоторые пациенты, получая такое лечение, излечиваются и, кроме того, у большинства пациентов имеет место ослабление тяжести и симптомов заболевания, или, по меньшей мере, остановка обострения заболевания. Иммунотерапия аллергенами также обладает профилактическими эффектами, снижающими риск сенной лихорадки, переходящей в астму, и снижающими риск развития новой чувствительности.
Обычную иммунотерапию аллергенами проводят с использованием многократного введения аллергена, применяемого в течение длительного периода времени.
Длительное применение иммунотерапии аллергенами проводят инъекционным путем (также называется SCIT, SIT или подкожная иммунотерапия). Обычно аллерген вводят подкожно в возрастающих дозах до достижения поддерживающей дозы, но также используют лечебные схемы с групповым введением или без повышения дозы. Аллерген можно вводить в течение периода времени до 3 лет или более до завершения или прекращения лечения в зависимости от применяемой схемы лечения.
Альтернативным путем введения является сублингвальное введение (SLIT), которое является более удобным для пациентов, поскольку его можно проводить дома.
Продукты для иммунотерапии для применения в иммунотерапии, как правило, содержат в качестве активного ингредиента аллерген, который вызывает аллергию у пациента или его производные, который можно формулировать различными способами соответственно выбранному пути введения, такие как водные композиции, суспензии гидроксида алюминия или аллергоиды. Активный ингредиент может представлять, например, водный экстракт пыльцы, содержащий аллергены пыльцы и/или водный экстракт клещей, содержащий аллергены клещей.
Наиболее распространенные клещи домашней пыли, относящиеся к семейству Pyroglyphidae, включают Euroglyphus maynei, Dermatophagoides pteronyssinus и Dermatophagoides farinae. Их можно найти в большинстве стран мира, включая Европу, США, Китай и многие другие страны, и аллергия и аллергическая астма, вызванные клещами домашней пыли, являются распространенными заболеваниями, поражающими 25% населения.
Некоторые пациенты сенсибилизируются к Euroglyphus maynei, Dermatophagoides pteronyssinus, некоторые другие к Dermatophagoides farinae, и другие к обоим видам.
Обычно пациенты сенсибилизируются (хотя, в различной степени) к двум основным аллергенам клещей домашней пыли, то есть, аллергену группы 1 и/или аллергену группы 2.
Клещи домашней пыли содержат более 20 различных аллергенов. Однако два основных аллергена группы 1 и группы 2 являются наиболее важными аллергенами, за счет большого количества пациентов, сенсибилизированных к этим двум аллергенам, количества продуцированного IgE в ответ на эти аллергены и их содержания в природных экстрактах.
При иммунотерапии пациентов аллергенами их лечат аллергенами, к которым они сенсибилизированы. Способность аллергенов вызывать опосредованные IgE иммунные ответы делает важным контроль содержания аллергенов, в частности, аллергенов группы 1 и группы 2 в экстрактах аллергенов, вводимых пациентам с аллергией во избежание проявления побочных эффектов.
Аллергены группы 1 и группы 2 из Der f и Der p тесно связаны между собой, но не идентичны, см. «Allergens and Allergen Immunotherapy, Clinical Allergy and Immunology Series 21», Lockey and Ledfors, 4th ed., page 162-164.
В настоящее время все продукты на рынке средств для иммунотерапии пациентов с аллергией на клещи домашней пыли содержат водные экстракты аллергенов, содержащие аллерген клещей группы 1 и группы 2. Многие продукты содержат экстракты обоих клещей Dermatophagoides pteronyssinus и Dermatophagoides farinae.
Экстракты аллергенов клещей обычно готовят культивированием клещей в подходящей для клещей среде с последующей экстракцией целой культуры клещей или экстракцией ее фракции тел клещей, «Allergens and Allergen Immunotherapy, Fourth Edition, Clinical Allergy and immunotherapy, series 21», Lockey and Ledfors, 4th ed., страница 286.
В производстве экстракта аллергена является важным контролировать вариабельность и достичь постоянства и воспроизводимости для обеспечения оптимальной безопасности и эффективности при последующем клиническом применении. Стандартизация экстракта аллергена является сложной проблемой и в принципе включает полную производственную цепь процессов, включая установление надежных и воспроизводимых производственных процедур, см. «Allergy Methods and Protocols», Jones and Lympany (2008), chapter 12 and 13. Поскольку способность экстракта аллергена связываться с IgE связана с содержанием одного или нескольких основных аллергенов, то общая стратегия стандартизации обычно включает стандартизацию экстракта в отношении содержания выбранных данных основных аллергенов в дополнении к общей способности связывания IgE и состава. В данной области хорошо известны соответствующие методы для оценки экстрактов аллергенов, и они включают иммуноэлектрофорез, такой как CIE, CRIE, FRIE, CLIE, количественные методы с использованием моно- или полиспецифических антител, такие как SRID, RIS, QIE, а также способы получения эталонов для стандартизации. Международные стандарты существуют ограниченно, одним примером является стандарты Управления за контролем продуктов и лекарств; стандарт CBER, обеспеченный для производств экстрактов для стандартизации и метки их продукта с получением метки по биологической активности AI или BAU (единицы аллергии и биоэквивалентные единицы аллергии).
Имеется значительная вариабельность от партии к партии в весовом количестве аллергенов группы 1 и группы 2 в экстрактах аллергенов, и весовое количество аллергена группы 1 в данных экстрактах аллергенов, как правило, выше по сравнению с весовым количеством аллергена группы 2.
Хорошо известно, что аллергены клещей домашней пыли группы 1 и группы 2 обнаруживаются в телах и в фекальных частицах клещей, продуцированных клещами во время культивирования. Также хорошо известно, что аллерген группы 1 ассоциирован с фекальными частицами, и аллерген группы 2 ассоциирован с телами клещей; см. Batard et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 2006, 140, p. 295-305.
Как уже упоминалось выше, имеется значительная вариабельность от партии к партии в содержании аллергенов группы 1 и группы 2 в партиях экстрактов целых культур клещей, включая экстракты тел клещей, что делает затруднительным приготовление экстрактов клещей с постоянным и заранее определенным содержанием аллергена группы 1 и группы 2. Конечно, это является серьезной проблемой для промышленного или крупномасштабного получения фармацевтического продукта, который будет содержать как можно более одинаковое количество активного ингредиента(в) в каждой партии.
Следовательно, усовершенствованные способы и продукт(ы) являются важными для получения максимальной эффективности производства, а также для обеспечения продуктов высокого качества в отношении эффективности и безопасности у конечного потребителя.
Сущность изобретения
Следовательно, настоящее изобретение относится к фармацевтическому продукту, содержащему экстракт аллергена или его аллергоида, который содержит, по меньшей мере, один экстракт тел клещей, выбранный из следующих групп (а)-(b):
(а) экстракт тел клещей Der p,
(b) экстракт тел клещей Der f,
и, по меньшей мере, один экстракт культур клещей, выбранный из следующих групп (с)-(g):
(с) экстракт фекальных частиц Der p,
(d) экстракт фекальных частиц Der f,
(е) экстракт целой культуры клещей Der f,
(f) экстракт целой культуры клещей Der p,
(g) комбинацию экстрактов (с)-(f).
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическому продукту, содержащему экстракт аллергена или его аллергоида, который содержит, по меньшей мере, один экстракт тел клещей, выбранный из следующих групп (а)-(b):
(а) экстракт тел клещей Der p,
(b) экстракт тел клещей Der f,
и, по меньшей мере, один экстракт фекальных частиц клещей, выбранный из следующих групп (с)-(d):
(с) экстракт фекальных частиц Der p,
(d) экстракт фекальных частиц Der f.
Изобретение также относится к фракции тел клещей, содержащей больше чем 70% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей.
Изобретение также относится к фракции фекальных частиц клещей, содержащей больше чем 70% об./об. фекальных частиц, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц, более предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц.
Изобретение также относится к способу производства экстракта аллергена клещей, содержащего аллерген Der p 1 и Der p 2, где данный способ включает следующие стадии:
(а) выделение фракции(й) тел клещей Der p из культур клещей Der p, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der p и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der p;
(b) необязательно объединение нескольких указанных фракций тел клещей Der p; и
(с) экстракция аллергенов из указанной фракции(й) тел клещей Der p, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, с получением указанного экстракта аллергена клещей.
Изобретение также относится к способу производства экстракта аллергена клещей, содержащего аллергены Der f 1 и Der f 2, где способ включает следующие стадии:
(а) выделение фракции(й) тел клещей Der f из культур клещей Der f, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der f, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der f, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der f и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der f;
(b) необязательно объединение нескольких указанных фракций тел клещей Der f; и
(с) экстракция аллергенов из указанной фракции(й) тел клещей Der f, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, с получением указанного экстракта аллергена клещей.
Изобретение также относится к способу производства фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики аллергии или аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли, которая содержит экстракт аллергена или его аллергоиды, имеющий заранее определенное и контролируемое содержание аллергенов, выбранных из аллергенов Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 2, и включающему следующие стадии:
(а) выделение фракций тел клещей Der p и/или фракций фекальных частиц клещей Der p из культур клещей Der p, и/или выделение фракций тел клещей Der f и/или фракций фекальных частиц клещей Der f из культур клещей Der f; необязательно
(b) объединение нескольких фракций тел клещей Der p, необязательно объединение нескольких фракций фекальных частиц Der p, необязательно объединение нескольких фракций тел клещей Der f, необязательно объединение нескольких фракций фекальных частиц Der f;
(с) экстракция аллергенов из фракции(й) тел клещей, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, и/или экстракция аллергенов из фракции(й) фекальных частиц клещей, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, и затем
(d) определение концентрации (мас./об.) аллергена группы 1 и группы 2 в экстрактах аллергена клещей, полученных на стадии (с), как описано выше; и необязательно
(е) смешивание одного или более экстрактов тел клещей с одним или более экстрактами фекальных частиц, полученными на стадии (с), как описано выше, с получением смеси экстрактов аллергена с заранее определенной концентрацией (мас./об.) аллергена группы 1 к аллергену группы 2, и необязательно
(f) превращение экстракта в аллергоиды экстракта.
Изобретение также относится к экстракту аллергена из серии экстрактов аллергена для применения в фармацевтическом продукте аллергена для лечения и/или профилактики аллергии и аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли, где каждый экстракт аллергена, содержит, по меньшей мере, один экстракт тел клещей, и, по меньшей мере, один экстракт фекальных частиц клещей, или экстракт тел клещей из фракции тел, содержащей меньше чем 70% об./об. тел клещей, или целой культуры клещей, где указанный экстракт аллергена имеет заранее определенное соотношение аллергена группы 1 и группы 2, и где коэффициент вариабельности указанного соотношения составляет не более чем 25, 20, 15, 10 или 7,5% для серии экстрактов.
Изобретение также относится к экстракту аллергена из серии экстрактов аллергена для применения в фармацевтическом продукте аллергена для диагностики аллергии, вызванной клещами домашней пыли, где каждый экстракт аллергена, содержит, по меньшей мере, один экстракт тел клещей, и, по меньшей мере, один экстракт фекальных частиц клещей, или экстракт тел клещей из фракции тел, содержащей меньше чем 70% об./об. тел клещей, или целой культуры клещей, где указанный экстракт аллергена имеет заранее определенное соотношение аллергена группы 1 и группы 2, и где коэффициент вариабельности указанного соотношения составляет не более чем 25, 20, 15, 10 или 7,5% для серии экстрактов.
Краткое описание фигур
На фиг.1 показана установка, дополнительно описанная в примере 2.
Определения
В том смысле, в котором в данном документе используется термин «клещ», он относится к клещам домашней пыли. Примерами таких клещей являются Dermatophagoides farinae и/или Dermatophagoides pteronyssinus, и/или Euroglyphus maynel или другие распространенные виды, относящиеся к семейству Pyroglyphidae.
В том смысле, в котором в данном документе используется термин «Der p», он означает Dermatophagoides pteronyssinus, «Der p 1» означает «аллерген Der p группы 1», и «Der p 2» означает «аллерген Der p группы 2».
В том смысле, в котором в данном документе используется термин «Der f», он означает Dermatophagoides farinae, «Der f 1» означает «аллерген Der f группы 1», и «Der f 2» означает «аллерген Der f группы 2».
Аллергены группы 1 и аллергены группы 2 двух видов клещей Der f и Der p существуют в природе в виде ряда изоформ, см., например, www.allergen.org по источникам аллергенов (Animalia Anthropoda/Astigmata/Dermatophagoides farinae или Dermatophagoides farinae). В том смысле, в котором в данном документе используются термины «аллерген группы 1», «группа 1», «аллерген группы 2» и «группа 2», они включают все встречающиеся в природе изоформы каждого из аллергенов группы 1 и группы 2, включая упомянутые на сайте www.allergen.org.
В том смысле, в котором в данном документе используется термины «культура клещей» или «клещевая культура», «целая культура клещей» и «целая культура», «культура клещей Der p» и «культура клещей Der f», и «культуры клещей Der p» и «культуры клещей Der f», они означают материал, полученный после культивирования Der p или Der f на подходящей среде, и он включает целые культуры, в том числе, клещей, фрагменты клещей, фекальные частицы, яйца, компоненты среды для клещей и т.д.
В том смысле, в котором в данном документе используются термины «культуральные среды или среда для клещей» или «среды или среда для клещей», они означают среду, подходящую для культивирования клещей домашней пыли.
В том смысле, в котором в данном документе используются термины «экстракт тел клещей», «экстракт тел клещей Der p» и «экстракт тел клещей Der f», они означают соответственно «экстракт одной фракции или в большей степени объединенных фракций тел клещей», «экстракт одной фракции или в большей степени объединенных фракций тел клещей Der p» и «экстракт одной фракции или в большей степени объединенных фракций тел клещей Der f».
В том смысле, в котором в данном документе используются термины «экстракт фекальных частиц клещей», «экстракт фекальных частиц», «экстракт фекальных клещей Der p» и «экстракт фекальных частиц клещей Der f», они означают соответственно «экстракт одной или более объединенных фракций фекальных частиц клещей», «экстракт одной фракции или в большей степени объединенной фракции(й) фекальных частиц клещей», «экстракт одной фракции или в большей степени объединенной фракции(й) фекальных частиц клещей Der p» и «экстракт одной фракции или в большей степени объединенной фракции(й) фекальных частиц клещей Der f».
В том смысле, в котором в данном документе используются термины «экстракт аллергена» и «экстракт аллергена (I)», то они используются взаимозаменяемо и означают экстракт, по меньшей мере, один «экстракт тел клещей» или «экстракт фекальных частиц» необязательно в комбинации с дополнительными экстрактами клещей и в любой комбинации.
В том смысле, в котором в данном документе используется термин «фракция(и) тел клещей», он означает одну или более объединенных фракций культур клещей, которые содержат больше чем 50% об./об. тел клещей, «фракция(и) тел клещей Der p» означает одну или более объединенных фракций культур клещей Der p, которые содержат больше чем 50% об./об. тел клещей Der p, и «фракция(и) тел клещей Der f» означает одну или более объединенных фракций культур клещей Der f, которые содержат больше чем 50% об./об. тел клещей Der f.
В том смысле, в котором в данном документе используются термины «фракция(и) фекальных частиц клещей» и «фракция(и) фекальных частиц», они означают одну или более объединенных фракций культур клещей, которые содержат больше чем 50% об./об. фекальных частиц клещей, «фракция(и) фекальных частиц Der p» означает одну или более объединенных фракций культур клещей Der p, которые содержат больше чем 50% об./об. фекальных частиц Der p, и «фракция(и) фекальных частиц Der f» означает одну или более объединенных фракций культур Der f, которые содержат больше чем 50% об./об. фекальных частиц Der f.
В том смысле, в котором в данном документе используется термин «s» в конце слова, он означает слово в единственной или множественной форме.
В том смысле, в котором в данном документе используется термин «лечение», он означает «излечивание или ослабление симптомов аллергии».
В том смысле, в котором в данном документе используется термин «быстро распадающаяся сублингвальная таблетка», он относится к прессованным и непрессованным лекарственным формам, которые распадаются в течение меньше чем примерно 90 сек, предпочтительно меньше чем примерно 60 сек, предпочтительно меньше чем примерно 30 сек, более предпочтительно меньше чем примерно 20 сек, еще более предпочтительно меньше чем примерно 10 сек в ротовой полости, еще более предпочтительно меньше чем примерно 5 сек и наиболее предпочтительно меньше чем примерно 2 сек после помещения под язык в ротовой полости. Такие быстро распадающиеся сублингвальные таблетки описаны в международной заявке WO 04/77994.
В том смысле, в котором в данном документе используется термин «CV», он означает коэффициент вариабельности, выраженный в процентах.
Подробное описание изобретения
Фармацевтические продукты по изобретению являются подходящими для лечения и/или профилактики аллергии на клещей домашней пыли и аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли.
Как уже указывалось выше, имеется высокая вариабельность от партии к партии в содержании аллергенов клещей группы 1 и группы 2 в партиях экстрактов целых культур клещей, включая экстракты тел клещей, что делает очень затруднительным готовить экстракты клещей с постоянным и заранее определенным содержанием аллергена группы 1 и группы 2.
В настоящее время было установлено, что посредством получения нескольких, например, двух экстрактов для каждой партии культуры клещей, например, выделением фракции культуры клещей, содержащей преимущественно тела клещей, и фракции культуры клещей, содержащей в основном фекальные частицы клещей, с последующей отдельной экстракцией фракции тел клещей и фракции фекальных частиц клещей, обеспечивается возможность контролировать соотношение аллергена группы 1 к аллергену группы 2 в конечном экстракте аллергена смешиванием экстракта тел клещей с экстрактом фекальных частиц клещей до достижения требуемого весового соотношения.
Также было установлено, что если культуру клещей, полученную культивированием клещей, очищают с получением фракции тел клещей, содержащей больше чем 70% об./об. или более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей, то экстракция данной очищенной фракции тел клещей обычно будет давать экстракт тел клещей, который содержит равное весовое количество аллергена группы 1 и группы 2 или больше аллергена группы 2, чем аллергена группы 1.
Экстракт тел клещей с большим весовым содержанием аллергена группы 2, чем аллергена группы 1 можно обогатить экстрактом фекальных частиц клещей, который обычно содержит больше аллергена группы 1, чем группы 2 по массе, с получением смеси экстрактов с заранее определенным и, если требуется, более равными весовыми количествами аллергена группы 1 и группы 2.
Примером экстрактов, которые обычно содержат больше по массе аллергена группы 1, чем аллергена группы 2 и которые можно использовать для обогащения, является экстракт целой культуры клещей или фракции(й) тел, содержащих меньше чем 70% об./об. тел клещей.
Экстракт тел клещей с большим содержанием аллергена группы 2, чем аллергена группы 1 также можно обогатить экстрактом целой культуры клещей или фракции тел клещей, содержащих меньше чем 70% об./об. тел клещей, которые обычно обе содержат больше по массе аллергена группы 1, чем аллергена группы 2, с получением смеси экстрактов с заранее определенными и, если требуется, более равными весовыми количествами аллергена группы 1 и группы 2.
Посредством смешения экстрактов тел клещей и другой фракции, предпочтительно фракции фекальных частиц, можно получить смесь экстрактов, которая имеет весовые соотношения аллергена группы 1 к группе 2 в более широких пределах, таких как от 1:0,6 до 1:1,6; от 1:0,7 до 1:1,5; от 1:0,8 до 1:1,4; от 1:0,9 до 1:1,3; от 1:0,95 до 1:1,2; от 1:0,98 до 1:1,15, включая смесь, которая содержит равные весовые количества аллергенов группы 1 и группы 2, т.е. смесь Der p 1, Der p 2, Der f 1 и Der f 2 в соотношении 1:1:1:1.
В одном аспекте изобретение относится к способу производства смеси экстрактов аллергена клещей для фармацевтического продукта, имеющего заранее определенное, контролируемое весовое количество аллергенов Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 2.
Изобретение также относится к фармацевтическому продукту, содержащему экстракты аллергена, выбранные, по меньшей мере, из одного экстракта тел клещей и необязательно, по меньшей мере, одного экстракта фекальных частиц клещей, выбранных из: (а) экстракта тел клещей Der p; (b) экстракта фекальных частиц Der p; (с) экстракта тел клещей Der и (d) экстракта фекальных частиц Der f, где основные аллергены Der p 1, Der p 2, Der f 1 и/или Der f 2 находятся в заранее определенных, контролируемых количествах.
В некоторых вариантах осуществления экстракты по изобретению отличаются большим весовым содержанием аллергена группы 2 по сравнению с продуктами, имеющимися на рынке. Авторы настоящей заявки обеспечили промышленный или крупномасштабный способ получения экстрактов аллергенов с измененным весовым соотношением аллергена группы 1 и группы 2.
Было установлено, что если отдельные экстракты тел клещей и фекальных частиц клещей готовят для каждого из двух видов клещей, и достаточно чистую фракцию тел клещей (и фракцию фекальных частиц клещей) используют для экстракции, то возможно получить экстракты клещей с весовым соотношением аллергена группы 1 к аллергену группы 2, которое находится в пределах от 1:0,6 до 1:1,6 для каждого вида клещей.
Посредством объединения экстрактов обоих видов можно достичь весового соотношения Der p 1, Der p 2, Der f 1 и Der f 2, которое составляет 1:1:1:1.
Такие продукты являются преимущественными, поскольку содержание аллергенов в фармацевтических продуктах хорошо контролируется.
Ранее экстракты аллергена клещей, как правило, содержали больше аллергена группы 1, чем аллергена группы 2 по массе, что могло быть причиной малоэффективного лечения пациентов с аллергией, которые, в частности, сенсибилизированы аллергеном группы 2.
Согласно изобретению обеспечивается промышленный способ получения экстрактов с более высоким весовым содержанием аллергена группы 2, чем аллергена группы 1, которое обычно находится в экстрактах.
Соответственно фармацевтический продукт, описанный выше, содержит, по меньшей мере, один экстракт тел клещей и, по меньшей мере, один экстракт фекальных частиц клещей, выбранных из групп (а)-(d), представленных выше.
Предпочтительно экстракт аллергена клещей содержит экстракт тел клещей Der p, экстракт фекальных частиц Der p, экстракт тел клещей Der f и экстракт фекальных частиц Der f.
Согласно дополнительным вариантам осуществления изобретения экстракт аллергена клещей включает:
- экстракт тел клещей Der p и экстракт фекальных частиц Der p и необязательно без экстрактов тел клещей Der f и без экстрактов фекальных частиц Der f; или
- экстракт тел клещей Der f и экстракт фекальных частиц Der f и необязательно без экстрактов тел клещей Der p и без экстрактов фекальных частиц Der p; или
- экстракт тел клещей Der p и экстракт тел клещей Der f и необязательно без экстракта фекальных частиц; или
- экстракт тел клещей Der p и без экстракта тел клещей Der f и необязательно без экстракта фекальных частиц клещей; или
- экстракт тел клещей Der f и без экстракта тел клещей Der p и необязательно без экстракта фекальных частиц клещей.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения экстракт тел клещей Der p готовят из одной или более фракций тел клещей Der p, где экстракция фракции(й) тел клещей Der p приводит к тому, что экстракт содержит равные весовые количества аллергена группы 1 и группы 2 или больше аллергена группы 2, чем аллергена группы 1 по массе, и/или экстракт тел клещей Der f готовят из одной или более фракций тел клещей Der f, и где экстракция фракции(й) тел клещей Der f приводит к тому, что экстракт содержит равные весовые количества аллергена группы 1 и группы 2, или больше аллергена группы 2, чем аллергена группы 1 по массе.
В предпочтительном варианте осуществления:
- экстракт тел клещей Der p соответственно готовят из одной фракции или объединенных фракций культур клещей Der p, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der p и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der p, и/или
- экстракт тел клещей Der f соответственно готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей Der f, где указанные фракции содержат больше чем 70% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der f, более предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der f и предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der f; и/или
- экстракт фекальных частиц Der p соответственно готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей Der p, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. фекальных частиц Der p, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц Der p, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц Der p, более предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц Der p, наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц Der p; и/или
- экстракт фекальных частиц Der f соответственно готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей Der f, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц Der f и более предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц Der f.
В одном варианте осуществления изобретения фракция фекальных частиц не является такой чистой, как фракция тел.
В предпочтительном варианте осуществления каждая из фракций или объединенных фракций, описанных выше, содержит менее 10% об./об. частиц культуральной среды для клещей.
Фракция тел клещей или объединенные фракции тел клещей могут содержать до 20% об./об. фрагментов клещей (конечности, яйца и т.д.), среды и фекальных частиц (т.е. любое, что не является телами клещей или является нежелательными примесями), при условии, что количество частиц среды составляет менее 10% об./об.
Фракция фекальных частиц клещей или объединенные фракции фекальных частиц клещей содержат до 20% об./об. фрагментов клещей (конечности, яйца и т.д.) и частиц среды (т.е. любое, что не является фекальными частицами клещей или является нежелательными примесями), при условии, что количество частиц среды составляет менее 10% об./об.
В дополнительном варианте осуществления каждая из фракций или объединенных фракций в целом содержит не более чем 1,0% мас./мас. детектируемых чужеродных веществ. Фекальные частицы клещей, фрагменты клещей, тела клещей или среда для клещей не рассматриваются в качестве чужеродных веществ.
Объемные проценты тел клещей и фекальных частиц клещей во фракциях тел клещей и фекальных частиц определяют микроскопией. Подсчитывают число частиц (например, число тел или фекальных частиц клеща) и выражают в % об./об. умножением на число, которое представляет средний объем данной частицы (например, тела или фекальной частицы клеща).
Подсчет частиц микроскопией во фракциях тел клещей
Образец взвешивают и суспендируют в глицерине, содержащем раствор (25% глицерин, 5% Игепал). Образец выливают на фильтр с нанесенной сеткой под вакуумом для удаления жидкости и иммобилизации частиц на фильтре. Затем фильтр высушивают для повышения видимости при микроскопии. Произвольно выбирают сетки для подсчета и подсчитывают все частицы в выбранной сетке. Сетки выбирают, пока не будет подсчитано, по меньшей мере, 800 частиц. Описанную выше процедуру можно проводить на нескольких образцах, например, двух, трех, четырех или пяти независимых образцах. При подсчете результатов вариабельность между образцами должна удовлетворять требуемым критериям приемлемости анализа (например, больше чем 80% об./об. целых тел клещей и/или меньше чем 10% об./об. частиц среды) для гарантии совпадения данных между образцами. Если результаты для образцов совпадают, то тогда выводят среднее число, дающее общий результат анализа.
Необъемные числа переводят в объемы с использованием заранее установленных объемов для тел клещей, частиц фекалий и среды.
Подсчет частиц микроскопией во фракциях фекальных частиц
Образец взвешивают, помещают в счетную камеру с нанесенной сеткой и смешивают с парафиновым маслом с получением однородного слоя. Произвольно выбирают сетки для подсчета и подсчитывают все частицы в выбранной сетке. Сетки выбирают, пока не будет подчитано, по меньшей мере, 800 частиц. Описанную выше процедуру можно проводить на нескольких образцах, например, двух, трех, четырех или пяти независимых образцах. При подсчете результатов вариабельность между образцами должна удовлетворять требуемым критериям приемлемости анализа (например, больше чем 80% об./об. целых тел клещей и/или меньше чем 10% об./об. частиц среды) для гарантии совпадения данных между образцами. Если результаты по образцам совпадают, то тогда выводят среднее число, дающее общий результат анализа. Необъемные числа переводят в объемы с использованием заранее установленных объемов тел клещей, частиц фекалий и среды.
Объемы, установленные для тел клещей, фекальных частиц, частиц среды для клещей, являются следующими:
тела клещей Der f: 21132000 кубических микрометров
тела клещей Der p: 12926000 кубических микрометров
частицы среды для клещей во фракциях тел: 6721000 кубических микрометров
частицы среды для клещей в фекальных фракциях: 19000 кубических микрометров
фекальные частицы: 19000 кубических микрометров
Как указывалось выше, настоящее изобретение основано на установлении того, что посредством очистки фракции(й) тел клещей таким образом, чтобы они содержали больше чем 70% об./об. тел клещей или более предпочтительно больше чем 80% об./об, возможно приготовить экстракт частиц тел из такой фракции тел клещей или объединенных фракций, в котором весовое количество аллергена группы 1 в экстракте ниже чем весовое количество аллергена группы 2 или весовая концентрация аллергена группы 1 и группы 2 является равной.
Согласно предпочтительному варианту осуществления весовое количество аллергена группы 1 ниже, чем весовое количество аллергена группы 2 в экстракте(х) тел клещей и весовое количество аллергена группы 1 значительно выше, чем аллергена группы 2 в экстрактах фекальных частиц клещей.
Соответственно весовое соотношение аллергена группы 1 к аллергену группы 2 ближе к весовому соотношению аллергена группы 1 к аллергену группы 2 в экстрактах тел клещей, чем весовое соотношение аллергена группы 1 к аллергену группы 2 в экстрактах фекальных частиц клещей, которые используют для его приготовления.
Согласно изобретению возможно изменить весовое соотношение аллергена группы 1 к аллергену группы 2 на более равные весовые количества в экстракте, чем имеются в экстракте тел клещей и фекальных частиц клещей, из которых они приготовлены. Это было невозможным ранее, когда типичные партии тел клещей и фекальных частиц содержали больше аллергена группы 2, чем аллергена группы 2 по массе.
Обеспечивается фармацевтический продукт по изобретению, содержащий экстракт аллергена, который содержит аллергены, выбранные из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, и где аллерген, находящийся в самой низкой концентрации (мас./об.) в экстракте аллергена, находится в концентрации, которая выше 50% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 60% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 70% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 80% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 85% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 90% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 95% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), предпочтительно выше 98% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 2, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.) или наиболее предпочтительно выше 99% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.).
Одна суточная доза продукта по изобретению соответственно содержит от 2 до 10 мкг или более предпочтительно от 3 до 8 мкг Der p 1, от 3 до 8 мкг Der p 2, от 3 до 8 мкг Der f 1 и от 3 до 8 мкг Der f 2.
В предпочтительном варианте осуществления суточная доза аллергенов группы 1 и группы 2 в сублингвальном продукте по изобретению соответственно находится в пределах от 3 до 4 мкг, более предпочтительно составляет примерно 3,6 мкг Der p 1, Der p 2, Der f 1 и/или Der f 2.
В еще одном варианте осуществления суточная доза аллергенов группы 1 и группы 2 в сублингвальном продукте по изобретению соответственно находится в пределах от 6 до 8 мкг, более предпочтительно составляет примерно 7,2 мкг Der p 1, Der p 2, Der f 1 и/или Der f 2.
Фармацевтический продукт, описанный выше, можно формулировать в виде прессованной или непрессованной сублингвальной таблетки (например, описанной в международной заявке WO 04/77994), жидкого сублингвального продукта (например, описанного в международной заявке WO 07/051476) или жидкого продукта для инъекций, необязательно с адъювантом гидроксидом алюминия (например, описанного в международной заявке WO 10/043675). Предпочтительно фармацевтический продукт представляет собой быстро распадающуюся сублингвальную таблетку. Предпочтительно фармацевтический продукт находится в форме таблеток, капсул, пастилок или капсул.
Экстракт аллергена может находиться в форме аллергоидов в фармацевтических продуктах, описанных выше.
Настоящее изобретение также относится к способу производства экстракта аллергена клещей для фармацевтического продукта, где указанный экстракт содержит заранее определенное, контролируемое и, если требуется, более равное весовое количество аллергена Der f 1, Der f 2, Der p 1 и/или Der p 2.
Изобретение также относится к способу производства экстракта аллергена клещей или его аллергоидов для фармацевтического продукта, как описано выше, где указанный экстракт аллергена имеет заранее определенное и контролируемое весовое количество аллергенов, выбранных из аллергенов Der f 1, Der f 2, Der p 1 и/или Der p 2, и включает следующие стадии (а) и (с)-(d) и необязательно (b), (e) и/или (f):
(а) выделение фракций тел клещей Der p и/или фракций фекальных частиц клещей Der p из культур клещей Der p, и/или выделение фракций тел клещей Der f и/или фракций фекальных частиц клещей Der f из культур клещей Der f;
(b) необязательно объединение нескольких фракций тел клещей Der p, необязательно объединение нескольких фракций фекальных частиц клещей Der p, необязательно объединение нескольких фракций тел клещей Der f, необязательно объединение нескольких фракций фекальных частиц клещей Der f;
(с) экстракция аллергенов из фракции(й) тел клещей, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, и/или экстракция аллергенов из фракции(й) фекальных частиц, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше; и затем
(d) определение концентрации (мас./об.) аллергена группы 1 и группы 2 в экстрактах аллергена клещей, полученных на стадии (с), как описано выше; и необязательно
(е) смешивание одного или более экстрактов тел клещей с одним или более экстрактами фекальных частиц клещей, полученными на стадии (с), как описано выше, с получением смеси экстрактов аллергена с заранее определенным количеством и весовым соотношением аллергена группы 1 к аллергену группы 2, и необязательно
(f) превращение экстракта аллергена в его аллергоид.
Согласно изобретению экстракты фракций тел клещей и экстракты фракций фекальных частиц клещей можно объединить или смешать, однако фракцию(и) тел клещей никогда не объединяют с фракцией(ями) фекальных частиц.
Соответственно один или более экстрактов тел клещей и один или более экстрактов фекальных частиц смешивают с получением смеси экстрактов аллергенов.
Предпочтительно смесь экстракта аллергена клещей содержит экстракт(ы) тел Der p, экстракт(ы) фекальных частиц Der p, экстракт(ы) тел клещей Der f и экстракт(ы) фекальных частиц Der f 2.
Для приготовления экстракта более чем одну фракцию тел клещей можно объединить на стадии (b) с последующей экстракцией на стадии (с).
Также более чем одну фракцию фекальных частиц клещей можно объединить на стадии (b) с последующей экстракцией на стадии (с).
Альтернативно экстракции подвергают фракцию тел клещей, полученную на стадии (а), и/или экстракции подвергают фракцию фекальных частиц клещей, полученную на стадии (а).
Соответственно один или более экстрактов тел клещей, полученных на стадии (с), смешивают на стадии (е) с одним или более экстрактами фекальных частиц клещей, полученными на стадии (с).
Соответственно один экстракт тел клещей, полученный на стадии (с), смешивают на стадии (е) с одним экстрактом фекальных частиц клещей, полученным на стадии (с).
В способе, описанном выше, один или более экстрактов тел клещей, полученных на стадии (с), можно смешать на стадии (е), с одним экстрактом фекальных частиц клещей, полученным на стадии (с).
Альтернативно один экстракт тел клещей, полученный на стадии (с), можно смешать на стадии (е), с одним или более экстрактами фекальных частиц клещей, полученными на стадии (с).
В том смысле, в котором в данном документе используется термин «смешивание экстрактов», он включает смешивание обоих целых партий экстрактов, а также частей целых партий.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения экстракт(ы) тел клещей обогащают количеством экстракта фекальных частиц, которое является достаточным для достижения требуемого весового соотношения аллергена группы 1 к аллергену группы 2 в смеси экстрактов аллергенов.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения экстракт тел клещей содержит почти равное весовое количество аллергена группы 1 и группы 2, и не требуется смешивать его с экстрактом фекальных частиц клещей.
Коэффициент вариабельности (CV) рассчитывают в виде отношения стандартного отклонения σ к среднему значению μ:
В некоторых случаях его выражают в виде процента, и в этом случае значение CV умножают на 100. CV используют для описания улучшенного постоянства экстракта и фармацевтических продуктов (терапевтических или диагностических) по изобретению от партии к партии.
Можно использовать доверительные интервалы (CI), такие как 95%.
Культивирование клещей
Известен ряд питательных материалов, подходящих для культивирования клещей, и имеются многочисленные исследования по эффективности для этой цели различных ингредиентов культуральных сред, таких как дрожжи, альбумины, корм для животных, корм для рыб (Tetramin), отслоившиеся чешуйки кожи человека, кожи свиней, яйца морских креветок, ростки пшеницы, корм для крыс, корм для собак, порошок из печени животных, гидролизат молочных белков, витамины, минеральные вещества, белковый гидролизат или соевая мука.
Питательные материалы для клещей описаны, например, в International Journal of Acarology, Vol. 8, Issue 3 (1982), p. 189-192, Rodriques, Recent Advances in Acarology, Vol. 11(1979), 211-216, Batard et al., Int. Arch. Immunol., 140(2006), p. 295-305, Yi et al.; Asian Pacific Journal of Allergy Clin. Immunol., No. 3 (1987), p. 457-466 и Европейский патент 1236394.
Один пример среды для культивирования клещей, содержащей смесь дрожжей и высушенные дафнии в соотношении 1:1, описан в Dust Mites, автор Matthew Colloff (2009), p. 270. Другой пример среды для выращивания клещей описан в Европейском патенте 1236394.
Предпочтительно использовать белковый гидролизат, а также другие ингредиенты, которые имеют низкий риск аллергизации для снижения возможности развития анафилактических реакций у сенсибилизированных аллергеном пациентов. Кроме того, предпочтительно использовать среду для клещей, которая не содержит белков животных и человека.
Соответственно среду для клещей используют в виде частиц, которые имеют достаточный размер и целостность, чтобы выдержать воздействия последующей обработки и легко удаляться при первичном просеивании.
Два вида клещей Der p и Der f всегда культивируют в отдельных контейнерах, но их можно культивировать на одной и той же среде для клещей. Примеры контейнеров включают стеклянные или пластиковые контейнеры подходящего размера и формы, такие как контейнер для насекомых. Одноразовые контейнеры для культивирования клещей описаны, например, в международной заявке WO 2008/119762.
Клещи культивируют в контейнерах с культуральной средой и помещают в контролируемую окружающую среду с контролем температуры и влажности среды, окружающей растущие культуры клещей. Подходящие условия для Der p и Der f представляют условия, описанные, например, в ряде статей, таких как Fain et al. (ISBN 90-71868-12-5) и Crowther: Exp. Appl. Acarol., 2007; 41(1-2): 61-86.
Один подходящий ряд параметров для условий культивирования каждого вида клещей приводится в таблице 1а ниже:
Проводят микроскопический анализ в отношении роста и жизнеспособности во время культивирования или для идентификации оптимального времени для сбора клещей.
Умерщвление клещей можно проводить замораживанием. Также гибель клещей можно вызвать «удушением», например, обработкой ацетоном. Контейнеры для хранения с убитыми клещами хранят при температуре -20ºС до последующей обработки.
Очистка культуры клещей
Культуры клещей оттаивают, высушивают и просеивают с получением фракций культуры клещей, содержащих компоненты различных размеров. Высушивание можно провести в воздушном потоке до содержания влаги ниже 20%, более предпочтительно на уровне 15%.
Затем культуру можно дополнительно очистить и выделить фракции тел клещей или фекальных частиц с использованием методов разделения, включающих просеивание (например, с использованием сит с размером отверстий 1 мм, 500 мкм, 250 мкм, 100 мкм на шейкере с ситом), насыщенные хлоридом натрия суспензии и этанольные суспензии, см., например, Dust Mites, автор Matthew Coloff (2009), p. 271.
В одном варианте осуществления фракцию(и) тел клещей и фракцию(и) фекальных частиц клещей можно приготовить просеиванием культуры клещей с получением четырех фракций:
а) крупные частицы среды >350 мкм
b) фракция тел клещей 350-90 мкм
с) фекальные агломераты и фрагменты клещей 90-50 мкм
d) фекальные частицы <50 мкм
В указанных пределах размеров частиц обычно находятся различные компоненты культуры клещей, такие как тела клещей, фекальные частицы и частицы среды и т.д. Фракции культуры клещей, выделенные в пределах размеров, которые отличаются от пределов размеров, указанных выше, также могут быть пригодными по изобретению, при условии, что можно приготовить фракции тел клещей и фекальных частиц, которые являются достаточно чистыми и в достаточном количестве.
Фракции (а) и (с) отбрасывают. Фракцию (d) можно использовать непосредственно в процессе экстракции, и фракция (b) подвергается дальнейшей очистке перед экстракцией.
Очистка фракции тел клещей
Способ очистки тел клещей от частиц среды флотацией в подходящей жидкости описан ранее, патент Великобритании 1318560 на странице 3. В J. Med. Entomol. (1979), Vol. 16, # 2, p. 128-132 описывается очистка флотацией в спирте (этаноле) для отделения тел клещей от частиц среды для клещей.
В настоящее время было установлено, что многократное центрифугирование в градиенте плотности фракции тел клещей в подходящей жидкости дает фракцию тел клещей высокой чистоты, которая при экстракции обеспечивает экстракт с большим весовым содержанием аллергена группы 2, чем аллергена группы 1 или равное весовое количество аллергена группы 1 и группы 2.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу выделения и очистки тел клещей, включающему стадии:
(i) выделение фракции(й) тел клещей из культуры(р) клещей Der p и/или Der f; и
(ii) центрифугирование одной или более фракций тел клещей Der p или одной или более фракций тел клещей Der f в градиенте плотности в первой жидкой среде, имеющей (iia) более высокую плотность, чем тела клещей и более низкую плотность, чем культуральная среда при температуре, использованной во время центрифугирования; и
(iii) сбор тел клещей с поверхности указанной первой жидкой среды и повторение стадий (ii) и (iii) до получения требуемой чистоты тел клещей, затем необязательно
(iv) отмывка тел клещей для удаления указанной первой жидкости второй жидкостью, которая не экстрагирует аллерген группы 1 и группы 2 из тел клещей при температуре, использованной во время стадии отмывки.
Предпочтительно первая и вторая жидкость в способе, описанном выше, не содержат воды (являются безводными) для ограничения экстракции аллергенов из материала-источника на стадии очистки растворимого материала-источника. В другом варианте осуществления способа выделения и очистки тел клещей на стадии (ii) центрифугирование одной или более фракций тел клещей Der p или одной или более фракций тел клещей Der f в градиенте плотности в первой жидкой среде проводят с первой жидкостью, имеющей (iia) более высокую плотность, чем тела клещей и более низкую плотность, чем частицы культуральной среды, и (iib) которая не экстрагирует аллерген группы 1 и группы 2 из тел клещей при температуре, использованной во время центрифугирования.
Подходящие жидкости включают производные метризоевой кислоты (такие как йоногексол, Nycodenz® (N-2,3-дигидроксипропилацетамидо-2,4,6-трииод-N,N-бис(2,3-дигидроксипропил)), полипропиленгликоли (такие как ARCOL® (полипропиленгликоль 4000), композиции на основе диоксида кремния (такие как RediGrad®).
Трудно полностью избежать некоторой экстракции аллергена группы 1 группы 2 из тел клещей во время центрифугирования, описанного выше. Согласно изобретению жидкости, которые не экстрагируют аллергены группы 1 и группы 2 из тел клещей, представляют жидкости, которые не экстрагируют аллерген группы 1 и аллерген группы 2 из тел клещей при температуре, использованной на стадии (ii) и (iv), описанных выше, в количестве, которое оказывает существенное влияние на конечный выход и соотношение аллергена группы 1 и группы 2.
Экстракцию аллергена группы 1 и группы 2 из тел клещей во время центрифугирования можно уменьшить проведением центрифугирования при низкой температуре, например, при температуре замерзания.
В предпочтительном варианте осуществления жидкость, имеющая плотность выше, чем тела клещей и ниже, чем частицы культуральной среды, представляет собой безводную жидкость, например, безводный глицерин.
Глицерин можно удалить из тел клещей промыванием этанолом, предпочтительно безводным этанолом.
Соответствующие стадии (ii) и (iii) проводят один раз или центрифугирование в глицерине повторяют до тех пор, пока полученная фракция тел клещей будет содержать, по меньшей мере, 70% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей, и фракция тел клещей содержит менее 20% об./об. фрагментов клещей, фекальных частиц и частиц среды и менее 10% частиц среды.
Вместо центрифугирования в градиенте плотности с глицерином, как описано на стадии (ii) и (iii), фракцию тел клещей можно очистить отделением насыщенным NaCl в качестве первой жидкости до тех пор, пока фракция тел клещей будет содержать, по меньшей мере, 70% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей, и содержит менее 20% об./об. фрагментов клещей, фекальных частиц и частиц среды и менее 10% частиц среды без необходимости в применении стадии (iv).
Вместо центрифугирования в градиенте плотности фракцию тел клещей можно очистить просеиванием до тех пор, пока фракция тел клещей будет содержать, по меньшей мере, 70% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей, и фракция тел клещей содержит менее 20% об./об. фрагментов клещей, фекальных частиц и частиц среды и менее 10% частиц среды.
Тела клещей могут быть иметь длину 400 мкм в одном измерении, но, тем не менее, могут быть способными проходить через сито с размером отверстий 300 мкм и 400 мкм, когда их высушивают перед просеиванием.
У клещей имеются конечности и волосы, и их можно выделить из среды для клещей на шейкере с ситом с горизонтальным циркулярным движением. Способ имеет преимущество, заключающееся в способности клещей образовывать спутанные клубки, образованные их волосами и конечностями, при горизонтальном движении на сите. В просеивающей башне, которая движется горизонтально кругами, тела клещей захватываются в верхней части сит с размером отверстий 200, 300 и/или 400 мкм, и в результате они отделяются от других частиц культуры клещей с размером 150 и 300 мкм.
Таким образом, в способе, альтернативном центрифугированию, богатую телами клещей фракцию с размером частиц в пределах от 90 до 350 мкм, выделенную в способе просеивания, описанном выше, можно очистить следующим способом:
(1) просеиванием культур клещей Der f или Der p в шейкере с вибрирующим ситом с башней с отверстиями размером 300, 150 и 80 мкм с последующим выделением богатой телами клещей фракции размером в пределах от 150 до 300 мкм и богатой фекальными частицами клещей фракции размером ниже 80 мкм, затем
(2) просеиванием богатой телами клещей фракции (150 мкм и 300 мкм) в шейкере с ситом с горизонтальным и циркулярным движением и с башней с ситами с размером отверстий 200, 300 и/или 400 мкм, и выделением богатой телами клещей фракции(й), захватываемой ситами с размером отверстий 200, 300 и/или 400 мкм, затем
(3) просеиванием богатой телами клещей фракции в шейкере с ситом, имеющим движение 3D кручения, и с ситом с размером отверстий 300, 200, 150 и/или 100 мкм с получением фракции тел клещей размером в пределах от 150 до 300 мкм и фракции фекальных частиц размером ниже 100 мкм; и
(4) необязательно объединением фракции фекальных частиц размером ниже 80 мкм с вибрирующего сита и фракции фекальных частиц размером ниже 100 мкм с сита с движением 3D кручения, и просеиванием объединенной фракции фекальных частиц на сите с 3D-движением 3D кручения и башней с ситами с размером отверстий 100, 80, 50 мкм.
Фракции тел клещей (b), полученные как описано выше, можно очистить стадиями 2 и 3 в описанном выше способе.
Экстракция
Фракции тел клещей и фекальных частиц клещей экстрагируют более или менее одинаковым путем, но в разных процессах, поскольку оптимальные условия для экстракции тел клещей не являются такими же, как для фекальных частиц клещей.
Для экстракции аллергенов из тел клещей и фекальных частиц, тела необходимо размолоть для высвобождения аллергенов. Размалывания можно достичь применением внешней силы к суспензии тел клещей.
Согласно изобретению было установлено, что смеситель с высоким срезывающим усилием является особенно эффективным для размалывания и высвобождения аллергенов из тел и фекальных частиц клещей.
Таким образом, согласно одному варианту осуществления изобретения экстракцию аллергенов проводят суспендированием тел клещей или фекальных частиц клещей в буфере с использованием смесителя с высоким срезывающим усилием (как правило, в течение 15-30 мин) и затем экстракцией без перемешивания (как правило, в течение 1-6 ч).
Высвобождение аллергенов различается для тел и фекальных частиц клещей. Аллергены в фекальных частицах экстрагируются через 1 ч экстракции, в то время как, по меньшей мере, 3 ч требуется для экстракции аллергенов из тел клещей.
Буферы для экстракции аллергенов клещей хорошо известны в данной области.
Материал-источник аллергенов (тело клещей и/или фекальные частицы клещей), например, можно экстрагировать буфером для экстракции, содержащим 0,15М NaCl, 0,012М NaHCO3 и смесь NaOH/HCl/вода для доведения рН. Экстракцию соответственно проводят с использованием соотношения буфера для экстракции к материалу-источнику аллергенов, равного 1:10 (мас./мас.) рН 7-8, температуры в пределах 4-12ºС и времени экстракции 1-6 ч.
Данные экстракты можно подвергнуть дополнительной очистке до того, как их используют в фармацевтическом продукте.
Оставшийся нерастворимый материал можно, например, удалить из экстракта фекальных частиц клещей центрифугированием и осветлением. Затем экстракт фекальных частиц клещей можно подвергнуть ультрафильтрации, проводимой в три стадии: первое концентрирование удалением воды и других небольших молекул тангенциальным проточным фильтрованием, затем диальфильтрацией для удаления небольших молекул и солей, и затем доведением до требуемого содержания сухого остатка.
Затем экстракт аллергена можно осветлить осветляющим фильтрованием.
Дальнейшая очистка экстрактов тел клещей соответственно включает следующие процессы: отделение с использованием диафильтрации, оставляя нерастворимое вещество на мембране и непрерывно добавляя воду к экстракту на другой стороне мембраны. Затем экстракт подвергают ультрафильтрации и осветлению, как описано выше.
Экстракты можно стабилизировать образованием замороженных гранул экстракта (криогранул), как описано в международной заявке WO 05/058474.
Концентрацию аллергена группы 1 и группы 2 в экстрактах тел клещей и фекальных частиц клещей можно определить рядом методов, обычно используемых для определения содержания аллергена, включая, например, ELISA, RID/SRID (простая радиальная иммунодиффузия) или МС (масс-спектрометрия, например, описанная в международной заявке WO 2007/031080), также смотри выше.
Принцип метода RID состоит в том, что белки (антигены), помещенные на круглую лунку диффундируют наружу, образуя градиент концентрации в агарозном геле, содержащем соответствующее антитело. Антитело, использованное в данном методе, является моноспецифическим антителом (т.е. продуцировано против специфического антигена) и поликлональным антителом, что делает возможным образование преципитатов комплексов антиген-антитело. Антитело находится в избытке, и диффузия антигена будет продолжаться до достижения точки равновесия, и образуется кольцо преципитатов антиген-антитело. Затем кольца преципитации окрашивают. Определяют площадь кольца преципитата и затем концентрацию антигена в неизвестных образцах можно интерполировать из калибровочной кривой, построенной с референс-стандартом. Содержание основного аллергена определяют относительно референс-стандарта (см., например, «Allergy Methods and Protocols», Jones and Lympany (2008), 138-141, p. 152-153 и p. 159-161).
Можно использовать различные варианты сэндвич-ELISA (твердофазный иммуносорбентный анализ) для определения содержания основного аллергена в Der p и Der f. Один для определения Der f 1, один для определения Der p 1 и один для определения Der группы 2, поскольку два основных аллергена группы 2 иммунохимически являются идентичными.
Моноклональные антитела, специфичные для основного аллергена (Der f 1, Der p 1 и Der группы 2) адсорбируются в лунках 96-луночного микротитрационного планшета. mAbs распознают эпитопы на основном аллергене и связывают аллерген, присутствующий в образце. Комплекс антитело-антиген вымывают и добавляют меченное пероксидазой кроличье IgG антитело против основного аллергена. При добавлении субстрата фермента будет развиваться цветная реакция, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию связанного основного аллергена. Также анализируют стандартную кривую в аналитическом цикле, и активность основного аллергена интерполируют на калибровочной кривой. После использования внутреннего стандарта используют Center for Biologics Evaluation and Research under FDA для конкурентной ELISA, как описано в «Potency Limits for Standardized Dust Mite and Grass Allergen Vaccines: A revised protocol. 2000 (http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComlianceRegulatoryInformation/Glidances/Allergenics/ucm01931.htm) для определения активности продуктов аллергенов.
В еще одном варианте осуществления концентрацию аллергена группы 1 и группы 2 определяют МС (масс-спекторометрией), как описано в международной заявке WO 2007/031080 с использованием следующих стандартных пептидов для калибровки:
TNACSINGNAPAEIDLR (Dep p 1) SEQ ID NO:1
NSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM (Der f 1) SEQ ID NO:2
VLVPGCHGSEPCIIHR (Dep p 2) SEQ ID NO:3
GKPFTLEALFDANQNTK (Der f 2) SEQ ID NO:4 и
GIEYIQQNGVVEER (Der f 1) SEQ ID NO:5
Когда концентрация аллергена группы 1 и группы 2 определена для ряда экстрактов клещей, то экстракты тел клещей и экстракты фекальных частиц смешивают для достижения требуемого массового соотношения аллергена группы 1 и группы 2.
Определение того, какой экстракт и какую массу указанных экстрактов следует смешать, является итеративным процессом, в котором весовые количества экстрактов из различных партий, которые следует использовать, определяются и вносятся в следующую формулу для Der f, пока не достигается требуемое соотношение:
соотношение основного аллергена = общее для группы 1/общее для группы 2=mf1×Cf1grp1+mb1×Cb1grp1+mf2×Cf2grp1+…/
mf1×Cf1grp2+mb1×Cb1grp2+mf2×Cf2grp2+…
где mf1 представляет массу первого использованного экстракта фекальных частиц Der f, mf2 представляет массу второго использованного экстракта фекальных частиц Der f и т.д…. Cf1grp1 является концентрацией аллергена группы 1 в mf1, Cf2grp1 является концентрацией аллергена группы 1 во вторых использованных экстрактах фекальных частиц, mb1 представляет первый использованный экстракт тел клещей, и Cb1grp1 представляет концентрацию аллергена группы 1 в mb1. Cf1grp2 является концентрацией аллергена группы 2 в mf1, Cb1grp2 является концентрацией аллергена в mb1, и Cf2grp2 является концентрацией аллергена группы 2 в mf2 и т.д.
Аналогичную формулу для Der p используют для определения того, какой и как много экстракта следует смешать для получения экстракта с требуемым соотношением аллергена группы 1 к группе 2.
Отдельные экстракты размораживают и смешивают согласно формуле, представленной выше.
Смесь экстрактов аллергенов можно стабилизировать и хранить в виде замороженных капель, как описано в международной заявке WO 05/0058474, или использовать непосредственно в композиции.
Обычно экстракты подвергают другим процессам стандартизации, включающим ряд тестов, например, тест определения активности, перед тем, как они выпускаются для формуляции.
Смесь экстрактов аллергенов клещей можно использовать в качестве активного ингредиента в твердой лекарственной форме для сублингвального введения, как описано в международной заявке WO 04/77994.
Альтернативно смесь экстрактов аллергенов можно формулировать в виде жидкой композиции для сублингвального введения в виде капель. Как правило, такая композиция содержит примерно 50% глицерина, NaCl и NaOH.
Смесь также можно формулировать в виде жидкой композиции для подкожной инъекции. Экстракт можно вводить в виде водной жидкой композиции без адъювантов или с адъювантом, таким как гидроксид алюминия.
Аллергоиды можно приготовить поперечным сшиванием экстрактов с использованием сшивающего агента, который, как правило, является альдегидом, таким как глутаральдегид. В данной области известны способы получения аллергоидов.
Дополнительные варианты осуществления по изобретению:
Вариант осуществления 1. Фармацевтический продукт, содержащий экстракт аллергена или его аллергоид, который содержит, по меньшей мере, один экстракт тел клещей, выбранный из следующих групп (а)-(b):
(а) экстракт тел клещей Der p,
(b) экстракт тел клещей Der f,
и, по меньшей мере, один экстракт культур клещей, выбранный из следующих групп (с)-(g):
(с) экстракт фекальных частиц Der p,
(d) экстракт фекальных частиц Der f,
(е) экстракт целой культуры клещей Der f,
(f) экстракт целой культуры клещей Der p,
(g) комбинацию экстрактов (с)-(f).
Вариант осуществления 2. Фармацевтический продукт, содержащий экстракт аллергена или его аллергоид, который содержит, по меньшей мере, один экстракт тел клещей, выбранный из следующих групп (а)-(b):
(а) экстракт тел клещей Der p,
(b) экстракт тел клещей Der f,
и, по меньшей мере, один экстракт фекальных частиц, выбранный из следующих групп (с)-(g):
(с) экстракт фекальных частиц Der p,
(d) экстракт фекальных частиц клещей Der f.
Вариант осуществления 3. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-2,
где экстракт тел клещей Der p готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der p и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der p, и/или
экстракт тел клещей Der f готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанные фракции содержат больше чем 70% об./об. тел Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. тел Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. тел Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел Der f, более предпочтительно больше чем 95% об./об. тел Der f и предпочтительно больше чем 98% об./об. тел Der f.
Вариант осуществления 4. Фармацевтический продукт, содержащий экстракт аллергена, который включает аллергены, выбранные из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, и где аллерген, находящийся в самой низкой концентрации (мас./об.) в экстракте аллергена, находится в концентрации, которая выше 50% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 60% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 70% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 80% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 85% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 90% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 95% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), предпочтительно выше 98% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 2, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.) или наиболее предпочтительно выше 99% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.).
Вариант осуществления 5. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-4, содержащий экстракт тел клещей Der p и экстракт фекальных частиц Der p.
Вариант осуществления 6. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-4, содержащий экстракт тел клещей Der f и экстракт фекальных частиц Der f.
Вариант осуществления 7. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-4, содержащий экстракт тел клещей Der p и экстракт тел Der f.
Вариант осуществления 8. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-7, содержащий экстракт тел клещей Der p, экстракт фекальных частиц Der f, экстракт тел клещей Der f и экстракт фекальных частиц Der f 2.
Вариант осуществления 9. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 4-8, где экстракт тел клещей Der p готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der p и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der p, и/или
экстракт тел клещей Der f готовят из фракции или объединенной фракции(й) культур клещей Der f, где указанные фракции содержат больше чем 70% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der f, более предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der f и предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der f.
Вариант осуществления 10. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-9, где экстракт тел клещей Der p готовят из одной фракции тел клещей Der p или объединенных фракций тел клещей Der p, и где экстракция указанной фракции(й) тел клещей приводит к тому, что экстракт содержит равные весовые количества аллергена группы 1 и группы 2, или больше аллергена группы 2, чем аллергена группы 1 по массе и/или экстракт тел клещей Der f готовят из одной или в большей степени из объединенных фракций тел клещей Der f, и где экстракция указанной фракции(й) тел клещей приводит к тому, что экстракт содержит равные весовые количества аллергена группы 1 и группы 2, или больше аллергена группы 2 чем аллергена группы 1.
Вариант осуществления 11. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-10, где экстракт тел клещей Der p готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der p и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der p, и/или
экстракт тел клещей Der f готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанные фракции содержат больше чем примерно 70% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der f и предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der f.
Вариант осуществления 12. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-10, где
экстракт фекальных частиц клещей Der p готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц клещей Der p, наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц клещей Der p, и/или
экстракт фекальных частиц клещей Der f готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем примерно 70% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц клещей Der f, более предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц клещей Der f.
Вариант осуществления 13. Фармацевтический продукт по варианту осуществления 12, где фракция или объединенные фракции тел клещей и/или где фракция или объединенные фракции фекальных частиц клещей каждая содержит менее 10% об./об. культуральной среды для клещей.
Вариант осуществления 14. Фармацевтический продукт по варианту осуществления 13, где фракция тел клещей или объединенные фракции тел клещей содержат до 20% об./об. фрагментов клещей (например, конечности), фекальных частиц и среды для клещей.
Вариант осуществления 15. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 12-14, где фракция фекальных частиц клещей или объединенные фракции фекальных частиц содержат до 20% об./об. фрагментов клещей (например, конечности) и среды для клещей.
Вариант осуществления 16. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 12-15, где весовое количество аллергена группы 1 ниже, чем весовое количество аллергена группы 2 в экстрактах тел клещей и весовое количество аллергена группы 1 выше, чем весовое количество аллергена группы 2 в экстрактах фекальных частиц клещей.
Вариант осуществления 17. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-16, содержащий экстракт аллергена, который включает аллергены, выбранные из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, и где аллерген, находящийся в самой низкой концентрации (мас./об.) в экстракте аллергена, находится в концентрации, которая выше 50% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 60% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 70% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 80% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 85% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 90% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 95% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), предпочтительно выше 98% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 2, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.) или наиболее предпочтительно выше 99% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.).
Вариант осуществления 18. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-17, где фармацевтический продукт представляет прессованную или непрессованную сублингвальную таблетку(и), содержащую экстракт(ы) или аллергоиды, приготовленные из экстракта(ов), жидкий сублингвальный продукт, содержащий экстракт(ы) или аллергоиды, приготовленные из экстракта(ов), или жидкий продукт для инъекции, содержащий экстракт(ы) или аллергоиды, приготовленные из экстракта(ов).
Вариант осуществления 19. Фармацевтический продукт по варианту осуществления 18, где фармацевтический продукт представляет быстро распадающуюся сублингвальную таблетку, которая содержит экстракт.
Вариант осуществления 20. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-19, дополнительно содержащий экстракт целой культуры клещей или фракции(й) тел, содержащих меньше чем 70% об./об. тел клещей.
Вариант осуществления 21. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-20 для лечения и/или профилактики аллергии или аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли и/или диагностики аллергии.
Вариант осуществления 22. Применение фармацевтического продукта по одному из вариантов осуществления 1-21 для получения медицинского продукта для лечения и/или профилактики аллергии или аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли, и/или для диагностики аллергии.
Вариант осуществления 23. Фракция тел клещей, содержащая больше чем 70% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей.
Вариант осуществления 24. Фракция тел клещей по варианту осуществления 23, где тела клещей представляют тела клещей Der p или тела клещей Der f.
Вариант осуществления 25. Фракция тел клещей по одному из вариантов осуществления 23-24, содержащая менее 10% частиц культуральной среды.
Вариант осуществления 26. Фракция тел клещей по одному из вариантов осуществления 23-25, содержащая меньше чем 20% об./об. фрагментов клещей, фекальных частиц и среды для клещей.
Вариант осуществления 27. Экстракт фракции тел клещей по одному из вариантов осуществления 23-26 для применения в фармацевтическом продукте для лечения и/или профилактики аллергии и аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли.
Вариант осуществления 28. Фракция фекальных частиц клещей, содержащая больше чем 70% об./об. фекальных частиц, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц, более предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц, наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц.
Вариант осуществления 29. Фракция фекальных частиц клещей по варианту осуществления 28, где фекальные частицы представляют частицы Der p или фекальные частицы Der f.
Вариант осуществления 30. Фракция фекальных частиц клещей по одному из вариантов осуществления 28-29, содержащая до 20% об./об. фрагментов клещей (например, конечности) и среды для клещей.
Вариант осуществления 31. Экстракт фракции фекальных частиц клещей по одному из вариантов осуществления 28-30 для применения в фармацевтическом продукте для лечения и/или профилактики аллергии или аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли.
Вариант осуществления 32. Применение экстракта по одному из вариантов осуществления 27 или 31 для получения фармацевтического продукта для применения в фармацевтическом продукте для лечения и/или профилактики аллергии или аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли.
Вариант осуществления 33. Способ производства экстракта аллергена клещей, содержащего аллерген Der p 1 и Der p 2, где способ включает следующие стадии:
(а) выделение фракции(й) тел клещей Der p из культур клещей Der p, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно более чем 85% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der p и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der p;
(b) необязательно объединение нескольких указанных фракций тел клещей Der p; и
(с) экстракция аллергенов из указанной фракции(й) тел клещей Der p, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, с получением указанного экстракта аллергена клещей.
Вариант осуществления 34. Способ производства экстракта аллергена клещей, содержащего аллерген Der f 1 и Der f 2, где способ включает следующие стадии:
(а) выделение фракции(й) тел клещей Der f из культур клещей Der f, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der f, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der f, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно более чем 85% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der f и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der f;
(b) необязательно объединение нескольких указанных фракций тел клещей Der f; и
(с) экстракция аллергенов из указанной фракции(й) тел клещей Der f, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, с получением указанного экстракта аллергена клещей.
Вариант осуществления 35. Способ по одному из вариантов осуществления 33-34, где способ дополнительно включает следующую стадию: смешивание одного или более экстрактов аллергена клещей по варианту осуществления 33 с одним или более экстрактами аллергена клещей по варианту осуществления 34 с получением смеси экстрактов аллергена клещей, содержащих аллерген Der p 1, Der p 2, Der f 1 и Der f 2.
Вариант осуществления 36. Способ по одному из вариантов осуществления 33-35, где способ дополнительно включает стадии:
а. выделение фракции(й) фекальных частиц клещей Der p из культур клещей Der p;
b. необязательно объединение нескольких указанных фракций фекальных частиц клещей Der p;
с. экстракция аллергенов из фракции(й) фекальных частиц клещей Der p, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, и
d. смешивание одного или более экстрактов аллергена клещей по одному из вариантов осуществления 33-35 с одним или более экстрактами фекальных частиц, полученными на стадии (с), как описано выше, с получением смеси экстрактов аллергена клещей.
Вариант осуществления 37. Способ по одному из вариантов осуществления 33-36, где способ дополнительно включает следующие стадии:
а. выделение фракции(й) фекальных частиц клещей Der f из культур клещей Der f;
b. необязательно объединение нескольких указанных фракций фекальных частиц клещей Der f;
с. экстракция аллергенов из фракции(й) фекальных частиц клещей Der f, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, и
d. смешивание одного или более экстрактов аллергена клещей по одному из вариантов осуществления 33-35 с одним или более экстрактами фекальных частиц, полученными на стадии (с), как описано выше, с получением смеси экстрактов аллергена клещей.
Вариант осуществления 38. Способ по одному из вариантов осуществления 33-37, где способ дополнительно включает следующую стадию: смешивание одного или более экстрактов аллергена клещей по варианту осуществления 33 и варианту осуществления 34 с одним или более экстрактами аллергена клещей со стадии (с) по варианту осуществления 36 и со стадии (с) по варианту осуществления 37 с получением смеси экстрактов аллергена клещей, содержащей аллерген Der p 1, Der p 2, Der f 1 и Der f 2.
Вариант осуществления 39. Способ по одному из вариантов осуществления 33-38, где полученный экстракт аллергена клещей превращают в его аллергоид.
Вариант осуществления 40. Способ по одному из вариантов осуществления 33-39, где способ включает дополнительную стадию
а. определение концентрации (мас./об.) аллергена группы 1 и группы 2 в экстрактах аллергена клещей, полученных на стадии (с), по одному из вариантов осуществления 33-34 и 36-37.
Вариант осуществления 41. Способ по варианту осуществления 40, где способ включает дополнительную стадию
(е) смешивание одного или более экстрактов тел клещей со стадии (с) по одному из вариантов осуществления 33-34 с одним или более экстрактами фекальных частиц со стадии (с) по одному из вариантов осуществления 36-37 с получением смеси экстрактов аллергена клещей с заранее определенным весовым количеством аллергена группы 1 к аллергену группы 2.
Вариант осуществления 42. Способ по одному из вариантов осуществления 33-41, где смесь экстрактов аллергена клещей содержит экстракт(ы) тел клещей Der p, экстракт(ы) фекальных частиц Der p, экстракт(ы) тел клещей Der f и экстракт(ы) фекальных частиц Der f.
Вариант осуществления 43. Способ по одному из вариантов осуществления 33-42, где более чем одну фракцию тел клещей объединяют на стадии (b) с последующей экстракцией на стадии (с) по варианту осуществления 33 и/или 34.
Вариант осуществления 44. Способ по одному из вариантов осуществления 33-43, где более чем одну фракцию фекальных частиц объединяют на стадии (b) с последующей экстракцией на стадии (с) по варианту осуществления 36 и/или 37.
Вариант осуществления 45. Способ по одному из вариантов осуществления 33-44, где один или более экстрактов тел клещей, полученных на стадии (с) по варианту осуществления 33 и/или 34, смешивают на стадии (е), с одним или более экстрактами фекальных частиц клещей, полученными на стадии (с) по варианту осуществления 36 и/или 37.
Вариант осуществления 46. Способ по одному из вариантов осуществления 33-45, где один или более экстрактов тел клещей, полученных на стадии (с) по варианту осуществления 33 и/или 34, смешивают на стадии (е), с одним или более экстрактами фекальных частиц клещей, полученными на стадии (с) по варианту осуществления 36 и/или 37.
Вариант осуществления 47. Способ по одному из вариантов осуществления 33-46, где один экстракт тел клещей, полученный на стадии (с) по варианту осуществления 33 и/или 34, смешивают на стадии (d), с одним или более экстрактами фекальных частиц клещей, полученными на стадии (с) по варианту осуществления 36 и/или 37.
Вариант осуществления 48. Способ по одному из вариантов осуществления 33-47, где экстракт(ы) тел клещей обогащают весовым количеством экстракта фекальных частиц, экстракта тел из фракции тел с меньше чем 70% об./об. или экстракта целой культуры, которое является достаточным для достижения требуемого весового соотношения аллергена группы 1 к аллергену группы 2 в смеси экстрактов аллергенов клещей.
Вариант осуществления 49. Способ по одному из вариантов осуществления 33-48, где
экстракт фекальных частиц клещей Der p на стадии (с) по варианту осуществления 36 готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц клещей Der p, более предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц клещей Der p, наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц клещей Der p, и/или
экстракт фекальных частиц клещей Der f на стадии (с) по варианту осуществления 37 готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц Der f, более предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц Der f.
Вариант осуществления 50. Способ по одному из вариантов осуществления 33-49, где фракция тел клещей на стадии (а) или объединенные фракции тел клещей на стадии (b) по варианту осуществления 33 и/или 34, и/или где фракция фекальных частиц на стадии (а) или объединенные фракции фекальных частиц клещей на стадии (b) по варианту осуществления 36 и/или 37 каждая содержат менее 10% об./об. культуральной среды для клещей.
Вариант осуществления 51. Способ по варианту осуществления 50, где фракция тел клещей на стадии (а) или объединенные фракции тел клещей на стадии (b) по варианту осуществления 33 и/или 34 содержат до 20% об./об. фрагментов клещей (например, конечности), фекальных частиц и среды для клещей.
Вариант осуществления 52. Способ по варианту осуществления 50, где фракция фекальных частиц клещей на стадии (а) или объединенные фракции фекальных частиц на стадии (b) по варианту осуществления 36 и/или 37 содержат до 20% об./об. фрагментов клещей (например, конечности) и среды для клещей.
Вариант осуществления 53. Способ по одному из вариантов осуществления 33-52, где фракцию(и) тел клещей по варианту осуществления 33 и/или 34, и/или фракцию(и) фекальных частиц клещей на стадии (а) по варианту осуществления 36 и/или 37 выделяют из культуры(р) клещей просеиванием культуры(р) клещей Der p и/или Der f с получением фракции тел клещей (b) и фракции фекальных частиц клещей (d).
Вариант осуществления 54. Способ по вариантам осуществления 33-53, где фракцию(и) тел клещей и фракцию(и) фекальных частиц клещей получают просеиванием культуры(р) клещей Der p и/или Der f с получением четырех фракций:
а. крупные частицы среды >350 мкм;
b. фракция тел клещей 350-90 мкм;
с. фекальные агломераты и фрагменты клещей 90-50 мкм;
d. фекальные частицы <50 мкм;
е. фракцию (а) и (с) отбрасывают, фракцию (d) и (b) необязательно подвергают дополнительной очистке или непосредственно используют для экстракции.
Вариант осуществления 55. Способ по варианту осуществления 54, где фракция (b) представляет:
(ii) подвергнутую центрифугированию в градиенте плотности в первой жидкой среде, имеющей более высокую плотность, чем тела клещей и более низкую плотность, чем частицы культуральной среды; затем
(iii) сбор тел клещей из указанной первой жидкой среды и повторение стадий (ii) и (iii) до достижения требуемой чистоты тел клещей, необязательно затем
(iv) отмывку тел клещей для удаления указанной первой жидкости второй жидкостью.
Вариант осуществления 56. Способ выделения и очистки тел клещей, включающий стадии:
(i) выделение фракции(й) тел клещей из культуры(р) клещей Der p и/или Der f; и
(ii) центрифугирование одной или более фракций тел клещей Der p или одной или более фракций тел клещей Der f в градиенте плотности в первой жидкой среде, имеющей (iia) более высокую плотность, чем тела клещей и более низкую плотность, чем частицы культуральной среды; и
(iii) сбор тел клещей из указанной первой жидкой среды
и повторение стадий (ii) и (iii) до достижения требуемой чистоты тел клещей, необязательно затем
(iv) отмывку тел клещей для удаления указанной первой жидкости второй жидкостью.
Вариант осуществления 57. Способ по одному из вариантов осуществления 55-56, где первая и вторая жидкости являются безводными, предпочтительно фармацевтически приемлемыми жидкостями.
Вариант осуществления 58. Способ по одному из вариантов осуществления 55-57, где первая жидкость является безводным глицерином.
Вариант осуществления 59. Способ по одному из вариантов осуществления 55-58, где вторая жидкость является безводным этанолом.
Вариант осуществления 60. Способ по одному из вариантов осуществления 55-59, где стадию (ii) и (iii) проводят один раз.
Вариант осуществления 61. Способ по одному из вариантов осуществления 55-60, где стадию (ii) и (iii) повторяют до тех пор, пока полученная фракция тел клещей будет содержать, по меньшей мере, 70% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей.
Вариант осуществления 62. Способ по вариантам осуществления 55-61, где очистку фракции тел клещей продолжают до тех пор, пока фракция тел клещей будет содержать менее 10% частиц культуральной среды.
Вариант осуществления 63. Способ по варианту осуществления 62, где очистку фракции тел клещей продолжают до тех пор, пока будет присутствовать меньше чем 20% об./об. фрагментов клещей, фекальных частиц и среды для клещей.
Вариант осуществления 64. Способ по одному из вариантов осуществления 33-63, где фракции тел клещей Der f, фракции тел клещей Der p, фракцию(и) фекальных частиц Der p и/или фракции фекальных частиц Der f на стадии (а) по одному из вариантов осуществления 33-34 и 36-37 выделяют просеиванием, включающим:
(1) просеивание культур клещей Der f или Der p в шейкере с вибрирующим ситом с башней с отверстиями размером 300, 150 и 80 мкм с последующим выделением богатой телами клещей фракции размером в пределах от 150 до 300 мкм и богатой фекальными частицами клещей фракции размером ниже 80 мкм, затем
(2) просеивание богатой телами клещей фракции (150 мкм и 300 мкм) в шейкере с ситом с горизонтальным и циркулярным движением и с башней с ситами с размером отверстий 200, 300 и/или 400 мкм, и выделение богатой телами клещей фракции(й), захватываемой ситами с размером отверстий 200, 300 и/или 400 мкм, затем
(3) просеивание богатой телами клещей фракции в шейкере с ситом, имеющим движение 3D кручения, и с ситом с размером отверстий 300, 200, 150 и/или 100 мкм с получением фракции тел клещей размером в пределах от 150 до 300 мкм и фракции фекальных частиц размером ниже 100 мкм; и
(4) необязательно объединение фракции фекальных частиц размером ниже 80 мкм с вибрирующего сита и фракции фекальных частиц размером ниже 100 мкм с сита с движением 3D кручения, и просеивание объединенной фракции фекальных частиц на сите с 3D-движением 3D кручения и башней с ситами с размером отверстий 100, 80, 50 мкм, и выделение богатой фекальными частицами фракции размером ниже 50 мкм.
Вариант осуществления 65. Способ по одному из вариантов осуществления 33-64, где полученные экстракты или смеси экстрактов формулируют в фармацевтический продукт, такой как прессованная или непрессованная сублингвальная таблетка(и), содержащая экстракт(ы) или аллергоиды, приготовленные из экстракта(ов), жидкий сублингвальный продукт, содержащий экстракт(ы) или аллергоиды, приготовленные из экстракта(ов), или жидкий продукт для инъекции, содержащий экстракт(ы) или аллергоиды, приготовленные из экстракта(ов).
Вариант осуществления 66. Способ по варианту осуществления 65, где фармацевтический продукт представляет быстро распадающуюся сублингвальную таблетку, которая содержит экстракт.
Вариант осуществления 67. Фармацевтический продукт, полученный способом по одному из вариантов осуществления 33-66.
Вариант осуществления 68. Фармацевтический продукт по варианту осуществления 67 для лечения и/или профилактики аллергии или аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли.
Вариант осуществления 69. Экстракт аллергена из серии экстрактов аллергена для применения в фармацевтическом продукте аллергена для лечения и/или профилактики аллергии и аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли, где каждый экстракт аллергена содержит, по меньшей мере, один экстракт тел клещей, и, по меньшей мере, один экстракт фекальных частиц клещей, или экстракт тел клещей из фракции тел, содержащей меньше чем 70% об./об. тел клещей или экстракт целой культуры клещей, где указанный экстракт аллергена имеет заранее определенное соотношение аллергена группы 1 и группы 2, и где коэффициент вариабельности указанного соотношения составляет не более чем 25, 20, 15, 10 или 7,5% для серии экстрактов.
Вариант осуществления 70. Экстракт аллергена из серии экстрактов аллергена для применения в фармацевтическом продукте аллергена для диагностики аллергии, вызванной клещами домашней пыли, где каждый экстракт аллергена содержит, по меньшей мере, один экстракт тел клещей, и, по меньшей мере, один экстракт фекальных частиц клещей, или экстракт тел клещей из фракции тел, содержащей меньше чем 70% об./об. тел клещей или экстракт целой культуры клещей, где указанный экстракт аллергена имеет заранее определенное соотношение аллергена группы 1 и группы 2, и где коэффициент вариабельности указанного соотношения составляет не более чем 25, 20, 15, 10 или 7,5% для серии экстрактов.
Вариант осуществления 71. Экстракт аллергена по одному из вариантов осуществления 69-70, где весовое количество аллергена группы 1 ниже, чем весовое количество аллергена группы 2 в экстрактах тел клещей, и весовое количество аллергена группы 1 выше, чем весовое количество аллергена группы 2 в экстрактах фекальных частиц клещей.
Вариант осуществления 72. Экстракт аллергена по одному из вариантов осуществления 69-71, где экстракт аллергена представляет аллерген по одному из вариантов осуществления 1-32.
Вариант осуществления 73. Экстракт аллергена по одному из вариантов осуществления 69-71, где экстракт аллергена получают по одному из вариантов осуществления 33-66.
Дополнительные варианты осуществления по изобретению:
Вариант осуществления 1. Фармацевтический продукт, содержащий экстракт аллергена (I) или его аллергоида, для лечения и/или профилактики аллергии и аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли, содержащий, по меньшей мере, один экстракт тел клещей и необязательно, по меньшей мере, один экстракт фекальных частиц клещей, выбранный из следующих групп (а)-(d):
а) экстракт тел клещей Der p,
b) экстракт фекальных частиц Der p,
с) экстракт тел клещей Der f, и
d) экстракт фекальных частиц Der f.
Вариант осуществления 2. Фармацевтический продукт, содержащий экстракт аллергена (I) для лечения и/или профилактики аллергии и аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли, содержащий аллергены, выбранные из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, и где аллерген, находящийся в самой низкой концентрации (мас./об.) в экстракте аллергена, находится в концентрации, которая выше 50% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 60% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 70% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 80% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 85% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 90% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 95% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), предпочтительно выше 98% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 2, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.) или наиболее предпочтительно выше 99% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.).
Вариант осуществления 3. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-2, содержащий, по меньшей мере, один экстракт тел клещей и, по меньшей мере, один экстракт фекальных частиц клещей.
Вариант осуществления 4. Фармацевтический продукт по варианту осуществления 3, содержащий экстракт тел клещей Der p, экстракт фекальных частиц Der p, экстракт тел клещей Der f и экстракт фекальных частиц Der f 2.
Вариант осуществления 5. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-2, содержащий экстракт тел клещей Der p и экстракт фекальных частиц Der p, и не содержащий экстракты тел клещей Der f и экстракты фекальных частиц Der f.
Вариант осуществления 6. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-2, содержащий экстракт тел клещей Der f и экстракт фекальных частиц Der f, и не содержащий экстракты тел клещей Der p и экстракты фекальных частиц Der p.
Вариант осуществления 7. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-2, содержащий экстракт тел клещей Der p и экстракт тел клещей Der f, и не содержащий экстракт фекальных частиц клещей.
Вариант осуществления 8. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-2, содержащий экстракт тел клещей Der p и не содержащий экстракт тел клещей Der f и экстракт фекальных частиц клещей.
Вариант осуществления 9. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-2, содержащий экстракт тел клещей Der f и не содержащий экстракт тел клещей Der p и экстракт фекальных частиц клещей.
Вариант осуществления 10. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-9, где
экстракт тел клещей Der p готовят из одной фракции тел клещей Der p или объединенных фракций тел клещей Der p, и где экстракция указанной фракции(й) тел клещей приводит к тому, что экстракт содержит равные весовые количества аллергена группы 1 и группы 2, или больше аллергена группы 2, чем аллергена группы 1 по массе, и/или
экстракт тел клещей Der f готовят из одной или в большей степени объединенных фракций тел клещей Der f, и где экстракция указанной фракции(й) тел клещей приводит к тому, что экстракт содержит равные весовые количества аллергена группы 1 и группы 2, или больше аллергена группы 2 чем аллергена группы 1 по массе.
Вариант осуществления 11. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-10, где
экстракт тел клещей Der p готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der p и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der p,
экстракт тел клещей Der f готовят из фракции или объединенной фракции(й) культур клещей Der f, где указанные фракции содержат больше чем 70% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der f, более предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der f и предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der f,
экстракт фекальных частиц Der p готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. фекальных частиц Der p, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц Der p, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц Der p, более предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц Der p, наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц Der p, и/или
экстракт фекальных частиц Der f готовят из фракции или объединенной фракции(й) культур клещей Der f, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц Der f, предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц Der f, более предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц клещей Der f.
Вариант осуществления 12. Фармацевтический продукт по варианту осуществления 11, где фракция или объединенные фракции тел клещей и/или где фракция или объединенные фракции фекальных частиц клещей каждая содержит менее 10% об./об. культуральной среды для клещей.
Вариант осуществления 13. Фармацевтический продукт по варианту осуществления 12, где фракция тел или объединенные фракции тел клещей содержат до 20% об./об. фрагментов клещей (например, конечности), фекальных частиц и среды для клещей.
Вариант осуществления 14. Фармацевтический продукт по варианту осуществления 12, где фракция фекальных частиц или объединенные фракции фекальных частиц клещей содержат до 20% об./об. фрагментов клещей (например, конечности) и среды для клещей.
Вариант осуществления 15. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-14, где весовое количество аллергена группы 1 ниже, чем весовое количество аллергена группы 2 в экстрактах тел клещей, и весовое количество аллергена группы 1 выше, чем весовое количество аллергена группы 2 в экстрактах фекальных частиц клещей.
Вариант осуществления 16. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1, 3-15, содержащий экстракт аллергена (I) для лечения и/или профилактики аллергии и аллергической астмы, вызванной клещами домашней пыли, аллергены, выбранные из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, и где аллерген, находящийся в самой низкой концентрации (мас./об.) в экстракте аллергена (I), находится в концентрации, которая выше 50% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 60% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 70% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 80% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 85% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 90% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), более предпочтительно выше 95% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.), предпочтительно выше 98% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 2, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.) или наиболее предпочтительно выше 99% концентрации аллергена, выбранного из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 1, находящегося в самой высокой концентрации (мас./об.).
Вариант осуществления 17. Фармацевтический продукт по одному из вариантов осуществления 1-16, где фармацевтический продукт представляет прессованную или непрессованную сублингвальную таблетку(и), содержащую экстракт (I) или аллергоиды, приготовленные из экстракта (I) в твердой форме, жидкий сублингвальный продукт или жидкий продукт для инъекции, содержащий экстракт (I) или аллергоиды, приготовленные из экстракта (I), предпочтительно фармацевтический продукт представляет быстро распадающуюся сублингвальную таблетку, которая содержит экстракт (I) в твердой форме.
Вариант осуществления 18. Способ производства экстракта аллергена клещей (I) или его аллергоида для фармацевтического продукта по одному из вариантов осуществления 1-10 и 15-16, где указанный экстракт аллергена (I) имеет заранее определенное и контролируемое весовое количество аллергенов, выбранных из аллергенов Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 2, и включающий следующие стадии:
(а) выделение фракции(й) тел клещей Der p и/или фракций фекальных частиц клещей Der p из культур клещей Der p, и/или выделение фракции(й) тел клещей Der f и/или фракций фекальных частиц Der f из культур клещей Der f;
(b) необязательно объединение нескольких фракций клещей Der p, необязательно объединение нескольких фракций фекальных частиц клещей Der p, необязательно объединение нескольких фракций тел клещей Der f и необязательно объединение нескольких фракций фекальных частиц клещей Der f;
(с) экстракция аллергенов из фракции(й) тел клещей Der p, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше, и/или экстракция аллергенов из фракции(й) фекальных частиц клещей, полученной на стадии (а) или стадии (b), как описано выше; и затем
(d) определение концентрации (мас./об.) аллергена группы 1 и группы 2 в экстрактах аллергена клещей, полученных на стадии (с), как описано выше; и необязательно
(е) смешивание одного или более экстрактов тел клещей с одним или более экстрактами фекальных частиц, полученными на стадии (с), как описано выше, с получением смеси экстрактов аллергена (I) с заранее определенным весовым количеством аллергена группы 1 к аллергену группы 2, и необязательно
(f) превращение экстракта (I) в его аллергоид.
Вариант осуществления 19. Способ по варианту осуществления 18, где один или более экстрактов тел клещей и один или более экстрактов фекальных частиц смешивают с получением смеси экстрактов аллергена (I).
Вариант осуществления 20. Способ по одному из вариантов осуществления 18-19, где смесь экстрактов аллергена клещей (I) содержит экстракт(ы) тел клещей Der p, экстракт(ы) фекальных частиц Der p, экстракт(ы) тел клещей Der f и экстракт(ы) фекальных частиц Der f 2.
Вариант осуществления 21. Способ по одному из вариантов осуществления 18-20, где более чем одну фракцию тел клещей объединяют на стадии (b) с последующей экстракцией на стадии (с) по варианту осуществления 33 и/или 34.
Вариант осуществления 22. Способ по одному из вариантов осуществления 18-21, где более чем одну фракцию фекальных частиц объединяют на стадии (b) с последующей экстракцией на стадии (с).
Вариант осуществления 23. Способ по одному из вариантов осуществления 18-22, где один или более экстрактов тел клещей, полученных на стадии (с), смешивают на стадии (е) с одним или более экстрактами фекальных частиц клещей, полученными на стадии (с).
Вариант осуществления 24. Способ по одному из вариантов осуществления 18-23, где один или более экстрактов тел клещей, полученных на стадии (с), смешивают на стадии (е) с одним экстрактом фекальных частиц клещей, полученным на стадии (с).
Вариант осуществления 25. Способ по одному из вариантов осуществления 18-24, где один экстракт тел клещей, полученный на стадии (с), смешивают на стадии (е) с одним или более экстрактами фекальных частиц клещей, полученными на стадии (с).
Вариант осуществления 26. Способ по одному из вариантов осуществления 18-25, где экстракт(ы) тел клещей обогащают весовым количеством экстракта фекальных частиц, которое достаточно для достижения требуемого весового соотношения аллергена группы 1 к аллергену группы 2 в смеси экстрактов аллергена клещей (I).
Вариант осуществления 27. Способ по одному из вариантов осуществления 14-26, где
экстракт тел клещей Der p на стадии (с) готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der p, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der p, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der p и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der p;
экстракт тел клещей Der f на стадии (с) готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанные фракции содержат больше чем 70% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей Der f, более предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей Der f и предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей Der f,
экстракт фекальных частиц клещей Der p на стадии (с) готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц клещей Der p, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц клещей Der p, более предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц клещей Der p, наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц клещей Der p;
экстракт фекальных частиц клещей Der f на стадии (с) готовят из одной фракции или объединенной фракции(й) культур клещей, где указанная фракция(и) содержит больше чем 70% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 75% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 80% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 85% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 90% об./об. фекальных частиц клещей Der f, предпочтительно больше чем 95% об./об. фекальных частиц клещей Der f, более предпочтительно больше чем 98% об./об. фекальных частиц клещей Der f.
Вариант осуществления 28. Способ по варианту осуществления 27, где фракция тел клещей на стадии (а) или объединенные фракции тел клещей на стадии (b), и/или где фракция фекальных частиц на стадии (а) или объединенные фракции фекальных частиц клещей на стадии (b) каждая содержит менее 10% об./об. культуральной среды для клещей.
Вариант осуществления 29. Способ по варианту осуществления 28, где фракция тел клещей на стадии (а) или объединенные фракции тел клещей на стадии (b) содержат до 20% об./об. фрагментов клещей (например, конечности), фекальных частиц и среды для клещей.
Вариант осуществления 30. Способ по варианту осуществления 29, где фракция фекальных частиц клещей на стадии (а) или объединенные фракции фекальных частиц на стадии (b) содержат до 20% об./об. фрагментов клещей (например, конечности) и среды для клещей.
Вариант осуществления 31. Способ по одному из вариантов осуществления 18-30, где фракцию(и) тел клещей и/или фракцию(и) фекальных частиц клещей на стадии (а) по варианту осуществления 18 выделяют из культуры(р) клещей просеиванием культуры(р) клещей Der p и/или Der f с получением фракции тел клещей (b) и фракции фекальных частиц клещей (d).
Вариант осуществления 32. Способ по варианту осуществления 31, где фракцию(и) тел клещей и фракцию(и) фекальных частиц клещей получают просеиванием культуры(р) клещей Der p и/или Der f с получением четырех фракций:
(а) крупные частицы среды >350 мкм;
(b) фракция тел клещей 350-90 мкм;
(с) фекальные агломераты и фрагменты клещей 90-50 мкм;
(d) фекальные частицы <50 мкм;
фракцию (а) и (с) отбрасывают, фракцию (d) непосредственно используют для экстракции и фракцию (b) подвергают дополнительной очистке.
Вариант осуществления 33. Способ выделения и очистки тел клещей, включающий стадии:
(i) выделение фракции(й) тел клещей из культуры(р) клещей Der p и/или Der f; и
(ii) центрифугирование одной или более фракций тел клещей Der p или одной или более фракций тел клещей Der f в градиенте плотности в первой жидкой среде, имеющей (iia) более высокую плотность, чем тела клещей и более низкую плотность, чем частицы культуральной среды, и (iib) не экстрагирует аллерген группы 1 и группы 2 из тел клещей; и
(iii) сбор тел клещей с поверхности указанной первой жидкой среды
и повторение стадий (ii) и (iii) до достижения требуемой чистоты тел клещей, необязательно затем
(iv) отмывку тел клещей для удаления указанной первой жидкости второй жидкостью, которая не экстрагирует аллерген группы 1 и группы 2 из тел клещей.
Вариант осуществления 34. Способ по одному из вариантов осуществления 31-32, где фракция тел клещей (b) представляет:
(ii) подвергнутую центрифугированию в градиенте плотности в первой жидкой среде, имеющей (iia) более высокую плотность, чем тела клещей и более низкую плотность, чем частицы культуральной среды, и (iib) которая не экстрагируют аллерген группы 1 и группы 2 из тел клещей; затем
(iii) сбор тел клещей с поверхности указанной первой жидкой среды и повторение стадий (ii) и (iii) до достижения требуемой чистоты тел клещей, необязательно затем
(iv) отмывку тел клещей для удаления указанной первой жидкости второй жидкостью, которая не экстрагирует аллерген группы 1 и группы 2 из тел клещей.
Вариант осуществления 35. Способ по одному из вариантов осуществления 33 или 34, где первая и вторая жидкости являются безводными, предпочтительно фармацевтически приемлемыми жидкостями.
Вариант осуществления 36. Способ по варианту осуществления 35, где первая жидкость является безводным глицерином.
Вариант осуществления 37. Способ по варианту осуществления 36, где вторая жидкость является безводным этанолом.
Вариант осуществления 38. Способ по вариантам осуществления 33-37, где стадию (ii) и (iii) проводят один раз.
Вариант осуществления 39. Способ по одному из вариантов осуществления 33-37, где стадию (ii) и (iii) повторяют до тех пор, пока полученная фракция тел клещей будет содержать содержит, по меньшей мере, 70% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей.
Вариант осуществления 40. Способ по вариантам осуществления 31-33 и 38-39, где очистку фракции тел клещей продолжают до тех пор, пока фракция тел клещей будет содержать менее 10% частиц культуральной среды.
Вариант осуществления 41. Способ по варианту осуществления 40, где очистку тел клещей продолжают до тех пор, пока будет присутствовать меньше чем 20% об./об. фрагментов клещей, фекальных частиц и среды для клещей.
Вариант осуществления 42. Фракция тел клещей, содержащая больше чем 70% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 75% об./об. тел клещей, более предпочтительно больше чем 80% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 85% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 90% об./об. тел клещей, предпочтительно больше чем 95% об./об. тел клещей и наиболее предпочтительно больше чем 98% об./об. тел клещей.
Вариант осуществления 43. Фракция тел клещей по варианту осуществления 42, содержащая менее 10% частиц культуральной среды.
Вариант осуществления 44. Фракция тел клещей по варианту осуществления 43, содержащая меньше чем 20% об./об. фрагментов клещей, фекальных частиц и среды для клещей.
Вариант осуществления 45. Способ по одному из вариантов осуществления 18-30, где фракции тел клещей Der f, фракции тел клещей Der p, фракцию(и) фекальных частиц Der p и/или фракции фекальных частиц Der f на стадии (а) выделяют просеиванием, включающим:
(1) просеивание культур клещей Der f или Der p в шейкере с вибрирующим ситом с башней с отверстиями размером 300, 150 и 80 мкм с последующим выделением богатой телами клещей фракции размером в пределах от 150 до 300 мкм и богатой фекальными частицами клещей фракции размером ниже 80 мкм, затем
(2) просеивание богатой телами клещей фракции (150 мкм и 300 мкм) в шейкере с ситом с горизонтальным и циркулярным движением и с башней с ситами с размером отверстий 200, 300 и/или 400 мкм, и выделение богатой телами клещей фракции(й), захватываемой ситами с размером отверстий 200, 300 и/или 400 мкм, затем
(3) просеивание богатой телами клещей фракции в шейкере с ситом, имеющим движение 3D кручения, и с ситом с размером отверстий 300, 200, 150 и/или 100 мкм с получением фракции тел клещей размером в пределах от 150 до 300 мкм и фракции фекальных частиц размером ниже 100 мкм; и
(4) необязательно объединение фракции фекальных частиц размером ниже 80 мкм с вибрирующего сита и фракции фекальных частиц размером ниже 100 мкм с сита с движением 3D кручения, и просеивание объединенной фракции фекальных частиц на сите с 3D-движением 3D кручения и башней с ситами с размером отверстий 100, 80, 50 мкм, и выделение богатой фекальными частицами фракции размером ниже 50 мкм.
Вариант осуществления 46. Способ по одному из вариантов осуществления 18-45, 45, где полученную смесь экстрактов (I) формулируют в виде прессованной или непрессованной сублингвальной таблетки(ток), содержащей экстракт (I) или аллергоиды, приготовленные из экстракта (I) в твердой форме, жидкий сублингвальный продукт или жидкий продукт для инъекции, содержащий экстракт(I) или аллергоиды, приготовленные из экстракта (I), предпочтительно фармацевтический продукт представляет быстро распадающуюся сублингвальную таблетку, которая содержит экстракт (I) в твердой форме.
Экспериментальный раздел
Пример 1
Культивирование клещей
Клещей Der p и Der f культивируют по отдельности в подходящей среде с частицами среды, которые имеют достаточный размер и целостность, чтобы выдержать воздействия последующей обработки и легко удаляться при первичном просеивании. Среда для клещей соответственно содержит источник белков, углеводы, минеральные вещества, масла, витамины и консерванты.
Клещей умерщвляют замораживанием при температуре -20ºС±5ºС, когда достигнут оптимальный рост.
1.1. Очистка тел клещей и фекальных частиц клещей
Культуру клещей (Der p или Der f) высушивают до содержания влаги менее 15% и просеивают с получением четырех фракций:
(1) крупные частицы среды >350 мкм;
(2) фракция тел клещей 350-90 мкм;
(3) фекальные агломераты и фрагменты клещей 90-50 мкм;
(4) фекальные частицы <50 мкм.
Для просеивания высушенной культуры клещей используют автоматическую установку для просеивания. В просеивателе используется вращение при установленных углах и скорости для получения фракций. Сито, которое дает фракции 1, 2 и 3, описанные выше, можно очищать во время просеивания. Мелкие частицы (фракцию 4) Собирают на нижнем поддоне устройства для просеивания.
Крупные частицы среды во фракции 1 и фекальные агломераты, и фрагменты клещей во фракции 3 отбрасывают.
Тестируют качество фекальных частиц (для гарантии того, что фракция содержит преимущественно фекальные частицы и соответствует требованиям спецификации), и затем решается вопрос, насколько фракция подходит для экстракции аллергенов Der p и Der f.
Определяют % об./об. целых тел клещей, фрагментов тел клещей, фекальных частиц, среды для клещей и примесей микроскопией образцов, смотри страницы 13-14.
Несколько фекальных фракций можно объединить перед экстракцией.
1.2. Очистка фракции тел клещей 2 центрифугированием с глицерином
Центрифугирование фракции 2 проводят на центрифуге (Beckman J6M1).
Не более 900 г фракции 2 медленно добавляют к безводному глицерину, Фармакопея США (чистота 99,0-101,0%) в количестве, которое превосходит массу фракции 2 в пять раз.
Культуру клещей, смешанную с безводным глицерином, выливают в стакан центрифуги таким образом, чтобы все стаканы содержали одинаковый объем. Стаканы помещают в ротор и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 7 мин при -5°С. Образовавшийся осадок тел клещей удаляют с поверхности безводного глицерина и взвешивают. Тела клещей смешивают с безводным глицерином, количество которого в 3 раза превосходит массу фракции тел клещей, и центрифугирование повторяют.
Слой тел клещей осторожно удаляют с поверхности безводного глицерина и взвешивают. Массу тел клещей умножают на 2,5 для определения минимального весового количества безводного этанола, необходимого для образования суспензии. Тела клещей и этанольную суспензию смешивают в течение 5 мин в смешивающем резервуаре, снабженном ножом с низким срезывающим усилием. Суспензию выливают на два сита с размером отверстий 106 микрон со сбором в сборном поддоне.
Тела клещей соскребают с сит и регистрируют массу клещей. Повторяют последнюю стадию очистки с этанолом еще раз и высушивают тела клещей с использованием вакуума или дают высушиться на сите 106 в вытяжном шкафу.
Определяют % об./об. целых тел клещей, фрагментов тел клещей, фекальных частиц, среды для клещей и примесей микроскопией образцов, смотри страницы 13-14. Получаемая фракция тел клещей, как правило, содержит 98-99% об./об. целых тел клещей.
Можно смешать фракции тел клещей из различных культур клещей.
1.3. Очистка фракции тел клещей 2 центрифугированием с насыщенным раствором NaCl
Фракцию тел клещей 2 смешивают с насыщенным раствором NaCl (в количестве, которое в пять раз превосходит массу фракции 2) с получением суспензии. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 7 мин (15°С в центрифуге Sorvall). Слой тел клещей осторожно удаляют с поверхности и ресуспендируют в количестве NaCl, которое в пять раз превосходит массу, и центрифугирование повторяют. Определяют % об./об. целых тел клещей, фрагментов тел клещей, фекальных частиц, среды для клещей и примесей микроскопией образцов, смотри страницы 13-14.
Получаемая фракция тел клещей, как правило, содержит 98-99% об./об. целых тел клещей.
Пример 2
2.0. Очистка тел клещей и фекальных частиц клещей
Замороженную культуру помещают на подносы в помещении для проведения очистки. Культуру равномерно распределяют на подносах и культуру размораживают и высушивают при комнатной температуре в течение 4-14 суток.
Затем культуру превращают в жидкость для высушивания и разделения на две партии, смотри фиг.1. Применяют воздушный поток, соединяя вакуумный насос с одной стороны и входное отверстие для воздуха с другой.
Стеклянные контейнеры на фиг.1 обозначаются слева направо, как фракция «А» с целой культурой клещей, фракция «В» представляет фракцию, богатую частицами тел, и фракция «С» представляет фекальные частицы.
Выделяют две фракции (В) и (С) и подвергают просеиванию.
2.1. Очистка тел клещей
2.1.1. Крупное сито
Фракции В вносят в промышленный шейкер с вибрирующим ситом с непрерывной подачей Filtra FT 500. Сито имеет просеивающую башню с тремя видами отверстий: 300, 150 и 80 мкм и работает при 1500 об/мин.
Материал с размером частиц больше 300 мкм в основном представляет частицы питательного материала и его отбрасывают.
Материал с размером частиц меньше 80 мкм дополнительно очищают на малом сите для выделения фекальной фракции.
Материал с размером частиц меньше 300 мкм и больше 150 мкм выделяют как богатую телами клещей фракцию и просеивают на среднем сите.
2.1.2. Среднее сито
Клещи имеют форму, которая является неправильной, и их размеры могут достигать 400 мкм в одном измерении, но обычно их размеры меньше в сухой форме. У клещей имеются конечности и волосы, и в том случае, когда используют горизонтальное циркулярное движение во время просеивания, то тела клещей ориентируются горизонтально, что вынужденно приводит к образованию спутанных клубков. Только меньшая часть неориентированных частиц или более мелких частиц, не участвующих в образовании фрагмента клубка, проходят в отверстие, и сито не закупориваются так быстро.
Используемое сито представляет шейкер с ситом Retsch AS 400 с просеивающей башней с отверстиями размером 400, 300 и 200 мкм. Используется режим горизонтального циркулярного просеивания, и процесс просеивания преимущественно способствует образованию клубков клещей, имеющих размер более 200, 300 и/или 400 мкм.
Материал с крупного сита разделяют на порции массой 150-200 г и помещают на второе сито (среднее сито).
Сито работает со скоростью в пределах от 210 до 240 об/мин, и каждую партию просеивают в течение 1-2 мин.
Фракции частиц с размером больше 200 и 300 мкм подвергают повторной обработке 2-6 раз.
Количество тел клещей, захваченных на ситах с размером отверстий 200, 300 и/или 400 мкм, определяют исследованием фракций микроскопией и отделяют богатую телами фракцию и подвергают дополнительному просеиванию, как описано ниже.
2.1.3. Малое сито
Богатую телами клещей фракцию, извлеченную со среднего сита, затем подвергают просеиванию на малом сите (Retsch AS 200) с использованием движения 3D кручения. Среднее количество богатой телами клещей фракции, нагруженное на сито, составляет 60 г, и используют башню с отверстиями размером 300, 200, 150 и 100 мкм.
Скорость устанавливают на 240-60 об/мин, амплитуду устанавливают на 30 сек и каждую загрузку просеивают в течение 5-15 мин. Каждую загрузку обрабатывают повторно 1-6 раз.
Внутрипроцессные контроли: во время процесса просеивания тестируют чистоту фракций с использованием микроскопа.
Фракцию частиц с размером меньше 100 мкм отделяют как фракцию фекальных частиц, которую очищают, как описано ниже.
Фракции частиц с размером больше 100 мкм и 150 мкм отделяют как фракции тел клещей.
2.2. Очистка фекальной фракции
Объединяют богатые фекальными частицами фракции, полученные на предшествующих стадиях (фракция С со стадии предварительной обработки, фракция частиц с размером <80 мкм из шейкера с крупным ситом и фракция частиц с размером <100 мкм из шейкера с малым ситом).
Используют шейкер с малым ситом (Retsch AS 200) с башней с отверстиями 100, 80 и 50 мкм, и рабочие условия являются такими же, как описано выше для данного сита.
Фракцию частиц с размером меньше 50 мкм отделяют как фекальную фракцию.
Внутрипроцессные контроли: во время процесса просеивания тестируют чистоту фракций с использованием микроскопа.
Пример 3
3.0. Экстракция тел клещей
Тела клещей суспендируют с использованием высокоскоростного смесителя (20 мин). Экстракцию проводят в буфере, содержащем 0,012М NaHCO3, 0,154М NaCl при рН 7,5 в течение 3 ч при температуре 8°С. Соотношение тел клещей к буферу составляет 1+10 (мас./мас.).
3.0.1. Отделение
Оставшийся нерастворимый материал-источник отделяют от раствора экстракта центрифугированием.
После центрифугирования полученный центрифугат сливают от твердой фракции и осветляют фильтрованием в раствор фильтрата. После фильтрации экстракта аллергена фильтр промывают буфером для экстракции и объединяют с экстрактом для повышения выхода.
3.0.2 Ультрафильтрация
Ультрафильтрацию проводят в три стадии: стадия концентрирования, стадия диафильтрации и стадия доведения до требуемого содержания сухого вещества. Первое, раствор фильтрата концентрируют удалением воды и других небольших молекул тангенциальным проточным фильтрованием. Второе, небольшие молекулы и соли удаляют из раствора экстракта аллергена диафильтрацией против очищенной воды. Третье, концентрацию сухого вещества (СВ) экстракта аллергена доводят дальнейшим концентрированием или добавлением очищенной воды. Во время ультрафильтрации контролируют температуру и трансмембранное давление (TMP) и поддерживают в пределах критериев приемлемости.
Внутрипроцессные контроли:
температура: 3-15ºС
трансмембранное давление: ≤3 бар
концентрация СВ: 40-60 мг/мл
3.0.3. Осветляющее фильтрование
Раствор экстракта аллергена осветляют пропусканием через фильтр с размером пор 0,2 мкм.
3.0.4. Стабилизация
После фильтрования экстракт распыляют в виде свободно падающих капель в контейнер, заполненный жидким азотом, в котором капли немедленно замерзают. Затем жидкий азот выпаривают. Во время процесса стабилизации поток подачи (поток продукта) контролируется для того, чтобы он находился в пределах критериев приемлемости.
Внутрипроцессный контроль: поток продукта: 8-12 мл/мин/распыляющее отверстие.
3.1. Фекальные частицы
Фекальные частицы клещей суспендируют с использованием смесителя с высоким срезывающим усилием (20 мин). Экстракцию проводят в буфере, содержащем 0,012М NaHCO3, 0,154М NaCl при рН 7,5 в течение 1 ч при температуре 8ºС. Соотношение тел клещей к буферу составляет 1+10 (мас./мас).
3.1.1. Отделение
После экстракции оставшийся нерастворимый материал-источник отделяют от раствора аллергена стадией диафильтрации. Диафильтрацию проводят с использованием вибрирующей системы для мембранной фильтрации (метод TFF). Экстракт аллергена проходит через мембрану, как пермеат, в то время как нерастворимый материал-источник будет оставаться на мембране. Во время диафильтрации постоянно добавляется заранее определенный объем очищенной воды к рециркулирующему раствору экстракта с такой же скоростью, с какой собирают экстракт аллергена (пермеата) с другой стороны мембраны.
Внутрипроцессный контроль:
Поток пермеата: 18-22 л/м2/ч.
Температура: 4-12°С.
3.1.2. Ультрафильтрация
Ультрафильтрацию проводят в три стадии: стадия концентрирования, стадия диафильтрации и стадия доведения до требуемого содержания сухого вещества. Первое, раствор фильтрата концентрируют удалением воды и других небольших молекул тангенциальным проточным фильтрованием. Второе, небольшие молекулы и соли удаляют из раствора экстракта аллергена диафильтрацией против очищенной воды. Третье, концентрацию сухого вещества (СВ) раствора аллергена доводят дополнительным концентрированием или добавлением очищенной воды. Во время ультрафильтрации контролируют температуру и трансмембранное давление (TMP) в качестве внутрипроцессных контролей и поддерживают в пределах критериев приемлемости.
Внутрипроцессный контроль:
температура: 3-15°С
трансмембранное давление: 3 бар
концентрация СВ: 40-60 мг/мл.
3.1.3. Осветляющее фильтрование
Раствор экстракта аллергена осветляют пропусканием через фильтр с размером пор 0,2 мкм.
3.1.4. Стабилизация
После фильтрования экстракт распыляют в виде свободно падающих капель в контейнер, заполненный жидким азотом, в котором капли немедленно замерзают. Затем жидкий азот выпаривают. Во время процесса стабилизации поток подачи (поток продукта) контролируется для того, чтобы он находился в пределах критериев приемлемости.
Внутрипроцессный контроль:
поток продукта: 8-12 мл/мин/распыляющее отверстие.
Пример 4
Содержание аллергена группы 1 и группы 2 определяют МС (масс-спекторометрией), как описано в международной заявке WO 2007/031080 с использованием следующих стандартных пептидов для калибровки:
TNACSINGNAPAEIDLR (Dep p 1) SEQ ID NO:1
NSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM (Der f 1) SEQ ID NO:2
VLVPGCHGSEPCIIHR (Dep p 2) SEQ ID NO:3
GKPFTLEALFDANQNTK (Der f 2) SEQ ID NO:4 и
GIEYIQQNGVVEER (Der f 1) SEQ ID NO:5.
Пример 5
5.0. Смешивание экстрактов
К замороженным гранулам экстракта тел клещей добавляют замороженные гранулы экстракта фекальных частиц для достижения требуемого соотношения аллергена группы 1 и группы 2.
Определение того, какие партии замороженных гранул и какое число замороженных гранул следует использовать, является итеративным процессом.
Готовят смесь с требуемым соотношением согласно расчету весового количества аллергена, которое будет обеспечиваться в результате смешения числа гранул, по меньшей мере, одной партии экстрактов тел клещей и, по меньшей мере, одной партии фекальных частиц клещей. Весовое количество аллергена группы 1 рассчитывают как весовое количество любой партии умножением на концентрации аллергена группы 1 в указанной партии. Весовое количество аллергена группы 2, обеспеченное смешиванием тех же партий, рассчитывают аналогичным путем.
Добавляют или удаляют больше партий или частей партий согласно расчету, описанному на стр. 27 выше, до достижения требуемого соотношения.
Пример:
Количество экстрактов из каждой партии рассчитывают, как равное 140 г mf1 и 966 г mb1.
Соотношение основного аллергена = общее для группы 1/общее для группы 2 = mf1 × Cf1grp1 + mb1 × Cb1grp1/mf1 × Cf1grp2 + mb1 × Cb1grp2 = 2393×140+991×966/792×140+1223×966=1.
Необходимые замороженные гранулы затем оттаивают и смешивают, и необязательно снова замораживают в виде гранул. Оттаявшие смеси можно использовать в процессе формуляции.
Пример 6
Аллергены группы 1 и группы 2 определяют, как описано в примере 5.
Пример 7
7.1. Приготовление быстро распадающейся фармацевтической композиции, содержащей экстракт
Состав таблетки с экстрактом аллергена клещей домашней пыли перед сублимацией воды во время лиофилизации:
Экстракт фекальных частиц клещей Der p
Экстракт тел клещей Der f
Экстракт фекальных частиц клещей Der f
Приготовление таблетки
Смешивают желатин, маннит и очищенную воду, и полученный премикс нагревают до соответствующей температуры. После охлаждения рН раствора доводят с использованием раствора гидроксида натрия (≈6% мас./мас). К премиксу добавляют субстанции препарата в виде замороженных капель. Проверяют и, если необходимо, доводят рН смеси. Рассчитывают дополнительные количества очищенной воды, необходимые для завершения формуляции с использованием производственного рецепта и переносят в раствор смеси. Раствор распределяют в заранее формованные подносы с блистерами. После дозирования заполненные блистерные упаковки пропускают через туннель для заморозки жидким азотом. Все замороженные продукты немедленно помещают в морозильную камеру для хранения в замороженном состоянии перед лиофилизацией. Композиции лиофилизуют и хранят в сухой камере для хранения в среде с контролируемой влажностью до запаивания фольгой. Затем лиофилизованные композиции запаивают фольгой.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРОДУКТ, СОДЕРЖАЩИЙ ЭКСТРАКТ(Ы) АЛЛЕРГЕНА КЛЕЩЕЙ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2011 |
|
RU2593778C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРОДУКТ, СОДЕРЖАЩИЙ ЭКСТРАКТ(Ы) АЛЛЕРГЕНА КЛЕЩЕЙ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 2011 |
|
RU2710544C2 |
| Ветеринарный продукт | 2018 |
|
RU2819906C2 |
| СПОСОБЫ ОЧИСТКИ ЭКСТРАКТА АЛЛЕРГЕНА | 2019 |
|
RU2809823C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА АЛЛЕРГЕНА | 2011 |
|
RU2572230C2 |
| Способ получения экстракта аллергена | 2011 |
|
RU2706685C2 |
| ГИБРИДНЫЕ БЕЛКИ-НОСИТЕЛИ ПЕПТИДОВ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН ОТ АЛЛЕРГИИ | 2012 |
|
RU2630652C2 |
| НОВЫЕ МУТАНТНЫЕ АЛЛЕРГЕНЫ | 2001 |
|
RU2285042C2 |
| РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pQE30/derf2L, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК der f 2L КЛЕЩА Dermatophagoides farinae, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli M15/pQE30/derf2L - ПРОДУЦЕНТ ТАКОГО БЕЛКА | 2012 |
|
RU2522817C9 |
| ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА, СОДЕРЖАЩАЯ АЛЛЕРГЕН | 2003 |
|
RU2372074C2 |
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к фармацевтической композиции для лечения аллергии, вызванной клещами домашней пыли. Предлагается фармацевтическая композиция для лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами, включающая экстракт аллергенов Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) и Dermatophagoides farinae (Der f) в качестве активного ингредиента, которая содержит экстракт аллергена: аллергены клещей группы 1 - Der f 1 и Der p 1 и аллергены клещей группы 2 - Der f 2 и Der p 2 и где аллергены Der p 1, Der f 1, Der p 2 и Der f 2 присутствуют в заранее определенных контролируемых количествах, так что количество по массе аллергенов группы 1 - Der f 1 и Der p 1, к аллергенам группы 2 - Der f 2 и Der p 2, находится в соотношении от 1:0,7 до 1:1,5; и где фармацевтическая композиция представляет собой быстро растворяющуюся сублингвальную таблетку; применение фармацевтической композиции для получения медицинского продукта для лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами; медицинский продукт для лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами; применение фармацевтической композиции для лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами; способ лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами, причем указанный способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. Вышеописанное решение позволяет получить и применять фармацевтический препарат, содержащий экстракт клещей с контролируемым соотношением аллергена группы1 к аллергену группы 2. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 7 пр.
1. Фармацевтическая композиция для лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами, включающая экстракт аллергенов Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) и Dermatophagoides farinae (Der f) в качестве активного ингредиента, которая содержит экстракт аллергена: аллергены клещей группы 1 Der f 1 и Der p 1 и аллергены клещей группы 2 Der f 2 и Der p 2 и
где аллергены Der p 1, Der f 1, Der p 2 и Der f 2 присутствуют в заранее определенных контролируемых количествах, так что количество по массе аллергенов группы 1 - Der f 1 и Der p 1, к аллергенам группы 2 - Der f 2 и Der p 2, находится в соотношении от 1:0,7 до 1:1,5; и
где фармацевтическая композиция представляет собой быстро растворяющуюся сублингвальную таблетку.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, где аллерген, выбранный из Der f 1, Der f 2, Der p 1 и Der p 2, который присутствует в самой низкой концентрации, масс./об., в экстракте аллергена, присутствует в концентрации выше 70% от концентрации аллергена Der f 1, Der f 2, Der p 1 или Der p 2, присутствующих в наивысшей концентрации масс./об.
3. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1, 2, где указанная фармацевтическая композиция имеет массовое соотношение аллергена клещей группы 1 к группе 2 в диапазоне от 1:0,9 до 1:1,3.
4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, включающая
a) экстракт из тел клещей Der p, где экстракт из тел клещей Der p получают из одной фракции или комбинированной фракции(ий) культур клещей, указанная фракция(и) содержит более 90% об./об. тел клещей Der p,
b) экстракт из тел клещей Der f, где экстракт из тел клещей Der f получают из одной фракции или комбинированной фракции(ий) культур клещей, указанная фракция содержит более 90% об./об. тел клещей Der f,
c) экстракт из фекальных частиц Der p, где экстракт из фекальных частиц Der p получают из одной фракции или комбинированной фракции(ий) культур клещей, указанная фракция(и) содержит более 90% об./об. фекальных частиц Der p, и
d) экстракт из фекальных частиц Der f, где экстракт из фекальных частиц Der f получают из одной фракции или комбинированной фракции(ий) культур клещей, указанная фракция(и) содержит более 90% об./об. фекальных частиц Der f.
5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, где экстракт из тел клещей Der p получают из одной фракции тел клещей Der p или комбинированных фракций тел клещей Der p и
где экстракция указанной фракции(й) тел клещей приводит к получению экстракта, включающего по массе равные количества аллергена группы 1 и аллергена группы 2 или более аллергена группы 2, чем аллергена группы 1, и экстракт тел клещей Der f получают из одной фракции тел клещей Der f или комбинированных фракций тел клещей Der f и при экстрагировании указанной фракции(ий) тел клещей получают экстракт, содержащий равные по массе количества аллергена группы 1 и аллергена группы 2 или больше аллергена группы 2, чем аллергена группы 1 по массе.
6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, где
экстракт из тел клещей Der p получают из одной фракции или комбинированной фракции(ий) культур клещей, причем указанная фракция(и) содержит более 95% об./об тел клещей Der p;
экстракт из тел клещей Der f получают из одной фракции или комбинированной фракции(ий) культур клещей, причем указанная фракция(и) содержит более 95% об./об. тел клещей Der f;
экстракт из фекальных частиц Der p получают из одной фракции или комбинированной фракции(ий) культур клещей, причем указанная фракция(и) содержит более 95% об./об. фекальных частиц Der p; и
экстракт из фекальных частиц Der f получают из одной фракции или комбинированной фракции(ий) культур клещей, указанная фракция (и), содержит более 95% об./об. фекальных частиц Der f.
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, где суточная доза указанной фармацевтической композиции содержит от 3 до 8 мкг Der p 1, от 3 до 8 мкг Der p 2, от 3 до 8 мкг Der f 1 и от 3 до 8 мкг Der f 2.
8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-7, где фармацевтическая композиция представляет собой непрессованную, быстро растворяющуюся сублингвальную таблетку.
9. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1-8 для получения медицинского продукта для лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами.
10. Медицинский продукт для лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами, причем указанный медицинский продукт содержит фармацевтическую композицию по любому из пп.1-8 в качестве активного ингредиента.
11. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1-8 для лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами.
12. Способ лечения аллергии, вызванной домашними пылевыми клещами, причем указанный способ включает введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.1-8.
| US 5773010 A, 30.06.1998 | |||
| ВОДОМЕРНЫЙ ПОСТ | 1991 |
|
RU2010177C1 |
| HEYMANN P W ET AL, "Antigenic and structural analysis of group II allergens (Der f II and Der p II) from house dust mites (Dermatophagoides spp)", JOURNAL OF ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY, vol | |||
| Пуговица | 0 |
|
SU83A1 |
| Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков | 1922 |
|
SU6A1 |
| ВСПОМОГАТЕЛЬНАЯ МАШИНА ДЛЯ РЕГУЛИРОВАНИЯ СКОРОСТИ ТРЕХФАЗНОГО АСИНХРОННОГО ДВИГАТЕЛЯ | 1924 |
|
SU1055A1 |
| YASUEDA H ET AL., "Estimation of Der p and Der f I quantities | |||
