ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[001] В данном документе раскрыты один или несколько вариантов субтилизина, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы, связанные с их получением и применениями, в том числе один или несколько вариантов субтилизина, которые характеризуются улучшенной стабильностью и/или способностью удалять грязь по сравнению с одним или несколькими эталонными субтилизинами.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[002] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным №62/351649, поданной 17 июня 2016 г., и предварительной заявке на патент США с серийным №62/437174, поданной 21 декабря 2016 г.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[003] Содержание электронной подачи текстового файла перечня последовательностей под названием "NB41146-WO-PCT-SEQ_Listing.txt" создано 14 июня 2017 г., и размер его составляет 101 KB, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[004] Серин-протеазы представляют собой ферменты (EC №3.4.21), имеющие активный участок, который инициирует гидролиз пептидных связей белков. Серин-протеазы включают разнообразный класс ферментов, имеющих широкий диапазон специфичности и биологических функций, которые дополнительно разделены на основании их структуры на химотрипсин-подобные (трипсин-подобные) и субтилизин-подобные. Прототипный субтилизин (EC №3.4.21.62) изначально был получен из Bacillus subtilis. Субтилизины и их гомологи являются членами семейства пептидаз S8 согласно классификационной схеме MEROPS. Члены семейства S8 имеют каталитическую триаду в порядке Asp, His и Ser в своей аминокислотной последовательности. Несмотря на то, что ряд пригодных вариантов протеаз был разработаны для применений, связанных с очищением, в данной области техники сохраняется потребность в улучшенных вариантах протеаз.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[005] В одном варианте осуществления предусматривается один или несколько вариантов субтилизина, содержащих две, три или четыре или больше аминокислотных замен, выбранных из (i) 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245, и 248; (ii) 40, 101, 128, и 130; (iii) 40 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (iv) 44 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (v) 48 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (vi) 58 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (vii) 89 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (viii) 101 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (ix) 116 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 128, 130, 232, 245 и 248; (x) 128 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 130, 232, 245 и 248; (xi) 130 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 232, 245 и 248; (xii) 248 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232 и 245; (xiii) 22 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (xiv) 103 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 104, 116, 128, 130, 232, 245, и 248; (xv) 104 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (xvi) 232 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 245 и 248; (xvi) 245 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232 и 248; при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[006] Другие варианты осуществления направлены на способы повышения продуцирования варианта субтилизина в грамположительной бактериальной клетке-хозяине, при этом способ предусматривает (a) введение в клетку-хозяина полинуклеотидной конструкции, кодирующей вариант субтилизина, содержащий замену 248D, и (b) выращивание клетки-хозяина в условиях, подходящих для продуцирования кодируемого варианта субтилизина, при этом клетка-хозяин продуцирует повышенное количество варианта субтилизина по сравнению с грамположительной клеткой-хозяином того же рода, вида и генетического фона, содержащей введенную полинуклеотидную конструкцию, кодирующую вариант субтилизина, который не содержит замену 248D; и при этом аминокислотные положения вариантов нумеруют в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[007] Определенные другие варианты осуществления направлены на композиции, содержащие один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе. Дополнительные варианты осуществления направлены на способы очищения, предусматривающие приведение в контакт поверхности или предмета, нуждающихся в очистке, с одним или несколькими вариантами субтилизина, описанными в данном документе, или одной или несколькими композициями, описанными в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[008] На фигуре 1 представлено выравнивание зрелой аминокислотной последовательности субтилизина B. lentus P29600 (SEQ ID NO: 6) и зрелой аминокислотной последовательности субтилизина B. amyloliquefaciens BPN' (SEQ ID NO: 26).

[009] На фигурах 2A-2C представлено выравнивание в соответствии с CLUSTAL W последовательности вариантов субтилизина P29600 (SEQ ID NO: 6), BPN' (SEQ ID NO: 26) и P29600 (от SEQ ID NO: 7 до SEQ ID NO: 25), описанных в данном документе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0010] Если в данном документе не указано иное, один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, можно получать и применять с помощью стандартных методик, широко используемых в молекулярной биологии, микробиологии, очищении белка, конструировании белка, секвенировании белка и ДНК, областях рекомбинантной ДНК и промышленном применении и разработке ферментов. Термины и сокращения, не определенные в данном документе, должны соответствовать их общепринятому значению, используемому в данной области техники. Если не указано иное, в данном документе все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники. Любые определения, предусмотренные в данном документе, следует трактовать в контексте описания в целом. Применяемая в данном документе форма единственного числа включает ссылки на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Если не указано иное, последовательности нуклеиновых кислот записаны слева направо в направлении от 5' к 3'; и аминокислотные последовательности записаны слева направо в направлении от амино- к карбокси-концу. Каждый числовой диапазон, используемый в данном документе, включает каждый более узкий числовой диапазон, который находится в пределах такого более широкого числового диапазона, как если бы все такие более узкие числовые диапазоны были явно приведены в данном документе.

[0011] Используемый в данном документе в отношении числового значения термин "приблизительно" относится к диапазону +/- 0,5 от числового значения, если указанный термин иным образом конкретно не определен в контексте. Например, фраза "значение pH, составляющее приблизительно 6" относится к значениям pH от 5,5 до 6,5, если конкретно не определено иное значение pH.

[0012] В номенклатуре аминокислотных замен одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, используется одно или несколько из следующего: положение; положение: аминокислотная (аминокислотные) замена (замены); или исходная (исходные) аминокислота (аминокислоты) : положение: аминокислотная (аминокислотные) замена (замены). Упоминание термина "положения" (т.е. 5, 8, 17, 22 и т.д.) охватывает любую исходную аминокислоту, которая может присутствовать в таком положении, и любую замену, которая может присутствовать в таком положении. Упоминание термина "положение: аминокислотная (аминокислотные) замена (замены)" (т.е. 1S/T/G, 3G, 17T и т.д.) охватывает любую исходную аминокислоту, которая может присутствовать в таком положении, и одну или несколько аминокислот, которыми такая исходная аминокислота может быть замещена. Отсылка на исходную или замещенную аминокислоту может быть дополнительно выражена в виде нескольких исходных или замещенных аминокислот, разделенных наклонной чертой вправо ("/"). Например, D275S/K указывает, что положение 275 замещено серином (S) или лизином (K), а P/S197K указывает, что исходная аминокислота пролин (P) или серин (S) в положении 197 замещена лизином (K).

[0013] Положение аминокислотного остатка в определенной аминокислотной последовательности нумеруют в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. Т.е. аминокислотная последовательность BPN', показанная под SEQ ID NO: 26, выступает в роли эталонной последовательности. Например, аминокислотную последовательность одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, выравнивают с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26 с помощью алгоритма выравнивания, описанного в данном документе, и каждый аминокислотный остаток в определенной аминокислотной последовательности, которая выравнивается (предпочтительно оптимально выравнивается) с аминокислотным остатком из SEQ ID NO: 26, для удобства нумеруется с помощью отсылки на числовое положение такового соответствующего аминокислотного остатка. Алгоритмы выравнивания последовательностей, такие как, например, описанные в данном документе, будут идентифицировать положение, в которых встречаются вставки или делеции в рассматриваемой последовательности при сравнении с последовательностью запроса.

[0014] Термины "протеаза" и "протеиназа" относятся к ферменту, который обладает способностью разрушать белки и пептиды. Протеаза обладает способностью осуществлять "протеолиз" посредством гидролиза пептидных связей, которые соединяют вместе аминокислоты в пептидной или полипептидной цепи, образующей белок. Такую активность протеазы как разрушающего белок фермента называют "протеолитической активностью". Для измерения протеолитической активности существует много хорошо известных процедур. Например, протеолитическую активность можно определять с помощью сравнительных анализов, в которых анализируют способность соответствующей протеазы гидролизовать подходящий субстрат. Иллюстративные субстраты, пригодные в анализе протеазной или протеолитической активности, включают без ограничения диметилказеин (Sigma C-9801), бычий коллаген (Sigma C-9879), бычий эластин (Sigma E-1625) и бычий кератин (ICN Biomedical 902111). Колориметрические анализы с использованием этих субстратов хорошо известны из уровня техники (см., например, WO 99/34011 и US 6376450). Пептидильный анализ pNA (см., например, Del Mar et al., Anal Biochem, 99:316-320, 1979) также находит применение в определении концентрации активного фермента. С помощью данного анализа измеряют скорость, при которой п-нитроанилин высвобождается по мере того, как фермент гидролизует растворимый синтетический субстрат, такой как сукцинил-аланин-аланин-пролин-фенилаланин-п-нитроанилид (suc-AAPF-pNA). Скорость появления желтого цвета в результате реакции гидролиза измеряют при 410 нм на спектрофотометре, и она пропорциональна концентрации активного фермента. Кроме того, для определения концентрации общего белка в образце очищенного белка можно применять измерения поглощения при 280 нанометрах (нм). Активность при концентрации субстрат/белок обеспечивает специфическую активность фермента.

[0015] Фраза "композиция (композиции), по сути, не содержащая(не содержащие) бор" или "моющее средство(моющие средства), по сути, не содержащее(не содержащие) бор" относится к композиции(композициям) или моющему средству(моющим средствам) соответственно, которые содержат следовые количества бора, например, менее приблизительно 1000 ppm (1 мг/кг или литр равняется 1 ppm), менее приблизительно 100 ppm, менее приблизительно 50 ppm, менее приблизительно 10 ppm или менее приблизительно 5 ppm, или менее приблизительно 1 ppm, возможно, из других композиций или компонентов моющего средства.

[0016] Используемый в данном документе термин "род Bacillus" включает все виды в пределах рода "Bacillus", известные специалистам в данной области техники, в том числе без ограничения B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii и B. thuringiensis. Следует признать, что род Bacillus продолжает проходить таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые были переклассифицированы, в том числе без ограничения такие организмы как B. stearothermophilus, который в настоящее время называется "Geobacillus stearothermophilus", или B. polymyxa, который в настоящее время называется "Paenibacillus polymyxa". Продуцирование устойчивых эндоспор в стрессовых условиях окружающей среды рассматривают как определяющее свойство рода Bacillus, хотя данная характеристика также присуща недавно названным Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus и Virgibacillus.

[0017] Используемый в данном документе термин "мутация" относится к изменениям, сделанным в эталонной аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты. Подразумевается, что данный термин охватывает замены, вставки и делеции.

[0018] Используемый в данном документе термин "вектор" относится к конструкции на основе нуклеиновой кислоты, применяемой для введения или переноса нуклеиновой кислоты(нуклеиновых кислот) в целевую клетку или ткань. Вектор, как правило, применяют для введения чужеродной ДНК в клетку или ткань. Векторы включают плазмиды, клонирующие векторы, бактериофаги, вирусы (например, вирусный вектор), космиды, векторы экспрессии, челночные векторы и т.п. Вектор, как правило, включает точку начала репликации, сайт множественного клонирования и селектируемый маркер. Процесс вставки вектора в целевую клетку, как правило, называют трансформацией. Настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления относится к вектору, который содержит последовательность ДНК, кодирующую полипептид серин-протеазы (например, предшественник или зрелый полипептид серин-протеазы), которая функционально связана с подходящей пропоследовательностью (например, секреторной, сигнальной пептидной последовательностью и т.д.), способной влиять на экспрессию последовательности ДНК у подходящего хозяина, а также на сворачивание и транслокацию цепи рекомбинантного полипептида.

[0019] Используемый в данном документе в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку термин "введенный" относится к любому способу, подходящему для переноса последовательности нуклеиновой кислоты в клетку. Такие способы введения включают без ограничений слияние протопластов, трансфекцию, трансформацию, электропорацию, конъюгацию и трансдукцию. Трансформация относится к генетическому изменению клетки, которое происходит в результате поглощения, необязательного встраивания в геном и экспрессии генетического материала (например, ДНК).

[0020] Термин "экспрессия" относится к транскрипции и стабильному накоплению смысловой (mRNA) или антисмысловой РНК, полученной из молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Экспрессия также может относиться к трансляции mRNA в полипептид. Таким образом, термин "экспрессия" включает любую стадию, вовлеченную в "продуцирование полипептида", в том числе без ограничения посттранскрипционные модификации, трансляцию, посттрансляционные модификации, секрецию и т. п.

[0021] Фразы "повышенная экспрессия варианта субтилизина", "повышенное продуцирование варианта субтилизина" и "повышенная продуктивность варианта субтилизина" используются взаимозаменяемо и относятся к выходу полипептида (варианта) субтилизина в виде выделенного или секретированного из рекомбинантной клетки-хозяина, в которую был введен (например, с помощью трансформации) полинуклеотид, кодирующий вариант субтилизина. Более конкретно используемые в данном документе фразы "повышенная экспрессия варианта субтилизина" или "повышенное продуцирование варианта субтилизина" относятся к повышению выхода (т. е. продуктивности белка) конкретного варианта (полипептида) субтилизина в виде выделенного или секретированного из рекомбинантной клетки-хозяина (т. е. в которую был введен полинуклеотид, кодирующей вариант субтилизина), при этом "повышение" выхода варианта полипептида субтилизина является относительным по отношению (по сравнению) к эталонному (контрольному) полипептиду субтилизина в виде выделенного или секретированного из аналогичной рекомбинантной клетки-хозяина (в которую был введен полинуклеотид, кодирующий эталонный (контрольный) полипептид субтилизин). Например, первый полинуклеотид, кодирующей вариант полипептида субтилизина по настоящему изобретению, и второй полинуклеотид, кодирующий эталонный (контрольный) субтилизин, может быть трансформирован в популяцию клеток-хозяев (т. е. популяцию клеток-хозяев того же рода, вида и генетического фона). Затем клетки-хозяева-трансформанты, содержащие первый полинуклеотид, и клетки-хозяева-трансформанты, содержащие второй полинуклеотид, выращивают/культивируют в идентичных условиях, и количество варианта полипептида субтилизина и эталонного (контрольного) полипептида субтилизина, экспрессируемого/продуцируемого в клетках-хозяевах сравнивают по отношению друг к другу (например, с помощью измерений концентрации белка или активности субтилизина).

[0022] Фразы "кассета экспрессии" или "вектор экспрессии" относится к конструкции нуклеиновой кислоты или вектору, полученному рекомбинантно или синтетически для экспрессии представляющей интерес нуклеиновой кислоты (например, чужеродной нуклеиновой кислоты или трансгена) в целевой клетке. Представляющая интерес нуклеиновая кислота, как правило, экспрессирует представляющий интерес белок. Вектор экспрессии или кассета экспрессии, как правило, включают промоторную нуклеотидную последовательность, которая управляет экспрессией чужеродной нуклеиновой кислоты или способствует ей. Вектор или кассета экспрессии, как правило, также включают другие указанные элементы нуклеиновой кислоты, которые делают возможной транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в целевой клетке. Рекомбинантную кассету экспрессии можно встроить в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Некоторые векторы экспрессии обладают способностью к встраиванию и экспрессии гетерологичных фрагментов ДНК в клетке-хозяине или геноме клетки-хозяина. Множество векторов для экспрессии у прокариот и эукариот являются коммерчески доступными. Выбор соответствующих векторов экспрессии для экспрессии белка с последовательности нуклеиновой кислоты, встроенной в вектор экспрессии, находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники.

[0023] Как используется в данном документе, нуклеиновая кислота является "функционально связанной" с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, если она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с нуклеотидной кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. Сайт связывания рибосом может быть функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы способствовать трансляции кодирующей последовательности. Как правило, "функционально связанные" последовательности ДНК являются смежными. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляют путем лигирования по подходящим сайтам рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, можно применять синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с традиционной практикой.

[0024] Используемый в данном документе термин "ген" относится к полинуклеотиду (например, сегменту ДНК), который кодирует полипептид и включает области, предшествующие кодирующим областям и идущие следом за ними. В некоторых случаях ген включает промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

[0025] Используемый в данном документе термин "рекомбинантный" в случае применения по отношению к клетке, как правило, указывает на то, что клетка была модифицирована путем введения чужеродной последовательности нуклеиновой кислоты, или что клетка происходит от клетки, модифицированной подобным образом. Например, рекомбинантная клетка может содержать ген, не обнаруживаемый в идентичной форме в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или рекомбинантная клетка может содержать нативный ген (обнаруживаемый в нативной форме клетки), который был модифицирован и повторно введен в клетку. Рекомбинантная клетка может содержать нуклеиновую кислоту, эндогенную по отношению к клетке, которая была модифицирована без удаления нуклеиновой кислоты из клетки; такие модификации включают модификации, получаемые путем замещения гена, сайт-специфической мутации и смежных методик, известных специалистам в данной области техники. Технология рекомбинантной ДНК включает методики получения рекомбинантной ДНК in vitro и перенос рекомбинантной ДНК в клетки, где она может экспрессироваться или размножаться, за счет чего обеспечивается получение рекомбинантного полипептида. "Рекомбинация" и "рекомбинирование" полинуклеотидов или нуклеиновых кислот в целом относится к сборке или объединению двух или более нуклеиновых кислот или полинуклеотидных нитей или фрагментов с образованием нового полинуклеотида или нуклеиновой кислоты.

[0026] Считается, что нуклеиновая кислота или полинуклеотид "кодируют" полипептид, если в своем нативном состоянии или при воздействии на них посредством способов, известных специалистам в данной области техники, они могут транскрибироваться и/или транслироваться с получением полипептида или его фрагмента. Также считается, что антисмысловая нить такой нуклеиновой кислоты кодирует последовательность.

[0027] Термины "штамм-хозяин" и "клетка-хозяин" относятся к подходящему хозяину для вектора экспрессии, содержащего представляющую интерес последовательность ДНК.

[0028] "Белок" или "полипептид" содержат полимерную последовательность аминокислотных остатков. Термины "белок" и "полипептид" используются в данном документе взаимозаменяемо. В данном раскрытии используется одно- и 3-буквенный код для аминокислот, который определен согласно объединенной комиссии IUPAC-IUB по биохимической номенклатуре (JCBN). Отдельная буква X относится к любой из двадцати аминокислот. Также понятно, что полипептид может быть закодирован несколькими нуклеотидными последовательностями вследствие вырожденности генетического кода.

[0029] "Пропоследовательность" или "пропептидная последовательность" относится к аминокислотной последовательности между сигнальной пептидной последовательностью и зрелой последовательностью протеазы, которая необходима для правильного сворачивания и секреции протеазы; их иногда называют внутримолекулярными шаперонами. Расщепление пропоследовательности или пропептидной последовательности приводит в результате к зрелой активной протеазе. Бактериальные серин-протеазы часто экспрессируются в виде проферментов.

[0030] Термины "сигнальная последовательность" и "сигнальный пептид" относятся к последовательности аминокислотных остатков, которая может участвовать в секреции или непосредственном транспорте зрелой формы или формы-предшественника белка. Сигнальная последовательность, как правило, расположена на N-конце по отношению к последовательности белка-предшественника или последовательности зрелого белка. Сигнальная последовательность может быть эндогенной или экзогенной. Сигнальная последовательность в норме отсутствует у зрелого белка. Сигнальная последовательность, как правило, отщепляется от белка сигнальной пептидазой после осуществления транспорта белка.

[0031] Термин "зрелая" форма белка, полипептида или пептида относится к функциональной форме белка, полипептида или пептида без сигнальной пептидной последовательности и пропептидной последовательности.

[0032] Термин форма-"предшественник" белка или пептида относится к зрелой форме белка с пропоследовательностью, функционально связанной с амино- или карбонильным концом белка. Предшественник может также иметь "сигнальную" последовательность, функционально связанную с аминоконцом пропоследовательности. Предшественник также может иметь дополнительные полипептиды, которые вовлечены в посттрансляционную активность (например, полипептиды, отщепляемые от него с тем, чтобы оставить зрелую форму белка или пептида).

[0033] Термин "дикий тип" в отношении аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты указывает на то, что аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты является нативной или встречающейся в природе последовательностью. Используемый в данном документе термин "встречающийся в природе" относится к чему-нибудь (например, белкам, аминокислотам или последовательностям нуклеиновых кислот), что обнаруживается в природе. И, наоборот, термин "не встречающийся в природе" относится к чему-нибудь, что не обнаруживается в природе (например, рекомбинантные нуклеиновые кислоты и последовательности белков, получаемые в лаборатории, или модификация последовательности дикого типа).

[0034] Используемые в данном документе в отношении положений аминокислотных остатков выражения "соответствующий", или "соответствует чему-либо", или "соответствует" относятся к аминокислотному остатку в пронумерованном положении в белке или пептиде или аминокислотному остатку, который является аналогичным, гомологичным или эквивалентным пронумерованному остатку в белке или пептиде. Используемый в данном документе термин "соответствующая область", как правило, относится к аналогичному положению в родственных белках или эталонном белке.

[0035] Термины "происходящий от" и "полученный от" относятся не только к белку, продуцированному или продуцируемому штаммом рассматриваемого организма, но также к белку, кодируемому последовательностью ДНК, выделенной из такого штамма, и продуцируемому в организме-хозяине, содержащем такую последовательность ДНК. Кроме того, данный термин относится к белку, который кодируется последовательностью ДНК синтетического происхождения и/или происходящей от cDNA, и который имеет отличительные характеристики рассматриваемого белка. Для примера, выражение "протеазы, происходящие от Bacillus" относится к таким ферментам с протеолитической активностью, которые в природе продуцируются Bacillus, а также к серин-протеазам, наподобие тех, которые продуцируются источниками Bacillus, но которые благодаря применению методик генной инженерии продуцируются другими клетками-хозяевами, трансформированными нуклеиновой кислотой, кодирующей серин-протеазы.

[0036] Термин "идентичный" в контексте двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к нуклеиновым кислотам или аминокислотам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании в отношении максимального соответствия, измеряемого с помощью сравнения последовательностей или алгоритмов анализа, описанных ниже и известных из уровня техники.

[0037] Фразы "% идентичности" или "процент идентичности" или "PID" относятся к идентичности последовательности белка. Процент идентичности можно определять с использованием стандартных методик, известных из уровня техники. Процент аминокислотной идентичности, разделяемой последовательностями, представляющими интерес, можно определять с помощью выравнивания последовательностей в целях непосредственного сравнения информации о последовательности, например, с помощью программы, такой как BLAST, MUSCLE или CLUSTAL. Алгоритм BLAST описан, например, в Altschul et al., J Mol Biol, 215:403-410 (1990) и Karlin et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787 (1993). Значение процента (%) идентичности аминокислотной последовательности определяют путем деления числа совпадающих идентичных остатков на общее количество остатков "эталонной" последовательности, включая любые гэпы, созданные программой для оптимального/максимального выравнивания. Алгоритмы BLAST относятся к "эталонной" последовательности как к последовательности "запроса".

[0038] Используемые в данном документе термины "гомологичные белки" или "гомологичные протеазы" относятся к белкам, которые имеют отчетливое сходство в первичной, вторичной и/или четвертичной структуре. Гомология белка может относиться к сходству в линейной аминокислотной последовательности при выравнивании белков. Гомологию можно определять путем выравнивания аминокислотных последовательностей, например, с использованием программы, такой как BLAST, MUSCLE или CLUSTAL. Гомологичный поиск белковых последовательностей может быть выполнен с помощью BLASTP и PSI-BLAST от NCBI BLAST с пороговым значением (предельным E-значением) при 0,001 (Altschul et al., "Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res, Set 1;25(17):3389-402(1997)). В программе BLAST используется несколько параметров поиска, большинство из которых выставлены на значения по умолчанию. Алгоритм NCBI BLAST находит наиболее подходящие последовательности с точки зрения биологического сходства, однако не рекомендуется для последовательностей запроса из менее чем 20 остатков (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3389-3402, 1997 и Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2994-3005, 2001). Иллюстративные параметры BLAST по умолчанию для поиска последовательностей нуклеиновой кислоты включают порог соседних слов=11; предельное E-значение =10; матрицу замен=NUC.3.1 (совпадение=1, несовпадение=-3); открытие гэпа=5; и продление гэпа=2. Иллюстративные параметры BLAST по умолчанию для поиска аминокислотных последовательностей включают размер слова=3; предельное E-значение=10; матрицу замен=BLOSUM62; открытие гэпа=11; и продление гэпа=1. С помощью этой информации последовательности белка можно группировать и/или из них строить филогенетическое древо. Аминокислотные последовательности можно вводить в программу, такую как пакет программ Vector NTI Advance, и Guide Tree может быть создан с помощью способа Neighbor Joining (NJ) (Saitou and Nei, Mol Biol Evol, 4:406-425, 1987). Конструкцию древа можно рассчитать с использованием коррекции Кимуры для расстояния последовательностей и игнорируя положения с гэпами. Программа, такая как AlignX, может отображать вычисленные значения расстояния в скобках после названия молекулы, отображаемого на филогенетическом древе.

[0039] Понимание гомологии между молекулами может выявить историю эволюции молекул, а также информацию об их функции; если новый секвенированный белок гомологичен уже охарактеризованному белку, то имеет место явное указание на биохимическую функцию нового белка. Гомология является наиболее фундаментальной взаимосвязью между двумя объектами; считается, что две молекулы являются гомологичными, если они происходят от общего предка. Гомологичные молекулы или гомологи можно разделить на два класса: паралоги и ортологи. Паралоги представляют собой гомологи, которые присутствуют в пределах одного вида. Паралоги часто отличаются своими конкретными биохимическими функциями. Ортологи представляют собой гомологи, которые присутствуют у различных видов и имеют очень схожие или идентичные функции. Суперсемейство белков представляет собой наиболее широкую группу (клад) белков, для которых может предполагаться общее происхождение. Обычно это общее происхождение основано на выравнивании последовательности и сходстве механизма действия. Суперсемейства обычно содержат несколько семейств белков, которые характеризуются сходством последовательностей в пределах семейства. Термин "клан белков" обычно используется для суперсемейств протеаз, основанных на системе классификации протеаз MEROPS.

[0040] Алгоритм CLUSTAL W представляет собой другой пример алгоритма выравнивания последовательностей (см. Thompson et al., Nucleic Acids Res, 22:4673-4680, 1994). Параметры по умолчанию для алгоритма CLUSTAL W включают следующие: штраф за открытие гэпа=10,0; штраф за продление гэпа=0,05; матрица сравнения аминокислот=серии BLOSUM; матрица сравнения нуклеотидов=IUB; задержка выравнивания дивергентных последовательностей в %=40; расстояние, разделяющее гэпы=8; вес транзиций ДНК=0,50; перечень гидрофильных остатков=GPSNDQEKR; применение отрицательных значений в матрице=OFF; штрафы за гэпы со специфичностью по остаткам=ON; штрафы за гэпы среди гидрофильных остатков=ON; и штрафы за несоответствие в концевых гэпах=OFF. В алгоритмы CLUSTAL включены делеции, встречающиеся на любом конце. Например, вариант с делецией пяти аминокислот на любом конце (или в полипептиде) полипептида из 500 аминокислот будет характеризоваться процентной идентичностью последовательности, составляющей 99% (495/500 идентичных остатков × 100), относительно "эталонного" полипептида. Такой вариант будет охвачен вариантом, характеризующимся "по меньшей мере 99% идентичностью последовательности" относительно полипептида.

[0041] Нуклеиновая кислота или полинуклеотид являются "выделенными", если их по меньшей мере частично или полностью отделяют от других компонентов, в том числе без ограничения, например, других белков, нуклеиновых кислот, клеток и т.п. Подобным образом, полипептид, белок или пептид является "выделенным", если их по меньшей мере частично или полностью отделяют от других компонентов, в том числе без ограничения, например, других белков, нуклеиновых кислот, клеток и т. п. В молях выделенные частицы преобладают над другими частицами в композиции. Например, выделенные частицы могут содержать по меньшей мере приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% (в молях) всех присутствующих макромолекулярных частиц. Предпочтительно, представляющие интерес частицы очищают до необходимой однородности (т.е. загрязняющие частицы не могут быть выявлены в композиции традиционными способами выявления). Чистоту и однородность можно определить с помощью ряда методик, хорошо известных из уровня техники, таких как электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле образца нуклеиновой кислоты или белка, соответственно, с последующей визуализацией при окрашивании. При необходимости для очистки материала можно использовать методику с высокой разрешающей способностью, такую как высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) или подобные способы.

[0042] Термин "очищенный" при применении к нуклеиновым кислотам или полипептидам обычно означает нуклеиновую кислоту или полипептид, которые в общем не содержат других компонентов при определении аналитическими методиками, хорошо известными из уровня техники (например, очищенный полипептид или полинуклеотид образуют отдельную полосу в электрофоретическом геле, хроматографическом элюате и/или средах, подвергаемых центрифугированию в градиенте плотности). Например, нуклеиновая кислота или полипептид, которые дают фактически одну полосу в электрофоретическом геле, являются "очищенными". Чистота очищенных нуклеиновой кислоты или полипептида составляет по меньшей мере приблизительно 50%, обычно по меньшей мере приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,5%, приблизительно 99,6%, приблизительно 99,7%, приблизительно 99,8% или более (например, весовой процент в молях). Иными словами, композиция обогащена молекулой, если имеет место значительное увеличение концентрации молекулы после применения методики очищения или обогащения. Термин "обогащенный" относится к соединению, полипептиду, клетке, нуклеиновой кислоте, аминокислоте или другому определенному материалу или компоненту, который присутствует в композиции в относительной или абсолютной концентрации, которая выше, чем в исходной композиции.

[0043] Используемый в данном документе термин "функциональный анализ" относится к анализу, который обеспечивает показатель активности белка. В некоторых вариантах осуществления данный термин относится к аналитическим системам, в которых белок анализируется в отношении его способности функционировать в контексте его обычной функциональной активности. Например, в случае протеазы, функциональный анализ предусматривает определение эффективности протеазы при гидролизе белкового субстрата.

[0044] Термин "очищающая активность" относится к очищающему действию, достигаемому с помощью пептида серин-протеазы или эталонного субтилизина в условиях, преобладающих в ходе протеолитического, гидролизного, очищающего или другого процесса по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления очищающее действие серин-протеазы или эталонного субтилизина можно определить с помощью различных анализов в отношении очищения одного или нескольких чувствительных к ферментам загрязнений на предмете или поверхности (например, загрязнение, полученное от пищи, травы, крови, чернила, молока, масла и/или яичного белка). Очищающее действие одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, или эталонного субтилизина можно определить путем воздействия на загрязнение на предмете или поверхности стандартным (стандартными) моющим(моющими) условием(условиями) и оценки степени, до которой удаляется загрязнение, с помощью различных хроматографических, спектрофотометрических или других количественных методик. Иллюстративные анализы и способы по исследованию очищающего действия известны из уровня техники и включают без ограничения описанные в WO 99/34011 и US 6605458, а также анализы и способы по исследованию очищающего действия, включенные в примеры, приведенные ниже.

[0045] Термин "эффективное очищающее количество" одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, или эталонного субтилизина, относится к количеству протеазы, при котором достигается требуемый уровень ферментативной активности в конкретной очищающей композиции. Такие эффективные количества легко установит специалист в данной области техники, и они основываются на многих факторах, таких как конкретная применяемая протеаза, применение, связанное с очищением, конкретный состав очищающей композиции и того, необходима ли жидкая или сухая композиция (например, гранулированная форма, таблетка, брусок) и т.д.

[0046] Термин "очищающий вспомогательный материал" относится к любой жидкому, твердому или газообразному материалу, включенному в очищающую композицию, отличному от одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, или рекомбинантного пептида или их активного фрагмента. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции по настоящему изобретению содержат один или несколько очищающих вспомогательных материалов. Каждый очищающий вспомогательный материал, как правило, выбирают в зависимости от конкретного типа и формы очищающей композиции (например, жидкость, гранула, порошок, брусок, паста, аэрозоль, таблетка, гель, пена или другая композиция). Предпочтительно, каждый очищающий вспомогательный материал является совместимым с применяемым в композиции ферментом, представляющим собой протеазу.

[0047] Очищающие композиции и очищающие составы включают любую композицию, которая подходит для очистки, отбеливания, дезинфекции и/или стерилизации любого объекта, предмета и/или поверхности. Такие композиции и составы включают без ограничения, например, жидкие и/или твердые композиции, в том числе очищающие композиции или моющие композиции (например, очищающие или моющие композиции для стирки и моющие композиции для тонкой легкой ткани в виде жидкости, таблетки, геля, бруска, гранулы и/или в твердом виде; очищающие композиции и составы для твердых поверхностей, как, например, для стеклянных, деревянных, керамических и металлических столешниц и окон; средства для очистки ковров; средства для очистки печей; освежители тканей; смягчители тканей; и очищающие или моющие композиции с усилителем для стирки белья и текстильного изделия, вспомогательные очищающие композиции для стирки и очищающие композиции для стирки с предварительным замачиванием; композиции для мытья посуды, включая композиции для ручного мытья посуды или мытья посуды вручную (например, моющие средства для "ручного" мытья посуды или мытья посуды "вручную") и композиции для автоматического мытья посуды (например, "моющие средства для автоматического мытья посуды"). Формы в виде отдельных дозированных единиц находят применение в настоящем изобретении, в том числе без ограничения пилюли, таблетки, желатиновые капсулы или другие отдельные дозированные единицы, такие как предварительно отмеренные порошки или жидкости.

[0048] Очищающая композиция и очищающие составы, используемые в данном документе, включают, если не указано иное, гранулированные или порошкообразные универсальные или с высокой моющей способностью средства для мытья, особенно очищающие моющие средства; универсальные средства для мытья в форме жидкости, гранулы, геля, твердой форме, таблетки, пасты или в форме дозированной единицы, особенно так называемые типы жидких моющих средств с высокой моющей способностью (HDL) или сухих моющих средств с высокой моющей способностью (HDD); жидкие моющие средства для тонкой легкой ткани; средства для ручного мытья посуды или мытья посуды вручную, включая средства сильнопенящегося типа; средства для ручного мытья посуды или мытья посуды вручную, автоматического мытья посуды или для столовой посуды или столовой утвари, включая различные типы таблеток, порошков, твердые, гранулированные, жидкие, гелеобразные и вспомогательные для ополаскивания для домашнего применения и применения в учреждениях; жидкие очищающие и дезинфицирующие средства, включая антибактериальные типы для мытья рук, очищающие бруски, ополаскиватели для рта, средства для очистки зубных протезов, шампуни для автомобилей, шампуни для ковров, средства для очистки ванн; шампуни для волос и/или ополаскиватели для волос для людей и других животных; гели для душа, и пены для ванн, и средства для очистки металлов; а также вспомогательные очищающие средства, такие как отбеливающие добавки и "карандаш-пятновыводитель" или средства типа предварительной обработки. В некоторых вариантах осуществления гранулированные композиции находятся в "компактной" форме; в некоторых вариантах осуществления жидкие композиции находятся в "концентрированной" форме.

[0049] Как используется в данном документе, "очищающие композиции для тканей" включают моющие композиции для ручной и автоматической стирки, в том числе вспомогательные композиции для стирки и композиции, подходящие для применения при замачивании и/или предварительной обработке загрязненных тканей (например, одежды, белья и других текстильных материалов).

[0050] Как используется в данном документе, "не предназначенные для ткани очищающие композиции" включают очищающие композиции для нетекстильных (т.e. нетканевых) поверхностей, в том числе без ограничения, например, моющие композиции для ручного мытья, или для мытья вручную, или автоматического мытья посуды, очищающие композиции для полости рта, очищающие композиции для зубных протезов, очищающие композиции для контактных линз, очищающие композиции для обработки ран и композиции для личной гигиены.

[0051] Используемый в данном документе термин "моющая композиция" или "моющий состав" применяют в отношении композиции, предназначенной для применения в моющей среде для очистки загрязненных или грязных объектов, включая конкретные тканевые и/или нетканевые объекты или предметы. В некоторых вариантах осуществления моющие средства по настоящему изобретению содержат один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и, кроме того, одно или несколько поверхностно-активных веществ, трансферазу (трансферазы), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, моющие компоненты (например, моющий компонент-соль), отбеливающие средства, активаторы отбеливания, подсинивающие средства, флуоресцентные красители, средства, препятствующие слеживанию, дезодораторы, активаторы ферментов, антиоксиданты и/или солюбилизаторы. В некоторых случаях моющий компонент-соль является смесью силикатной соли и фосфатной соли, предпочтительно с большим количеством силиката (например, метасиликата натрия), чем фосфата (например, триполифосфата натрия). Некоторые варианты осуществления направлены на очищающие композиции или моющие композиции, которые не содержат какой-либо фосфат (например, фосфатную соль или фосфатный моющий компонент).

[0052] Используемый в настоящем изобретении термин "отбеливание" относится к обработке материала (например, ткани, белья, технической целлюлозы и т.д.) или поверхности в течение достаточно длительного времени и/или при соответствующем pH и/или температурных условиях до достижения эффекта осветления (т.е. отбеливания) и/или очищения материала. Примеры химических веществ, подходящих для отбеливания, включают без ограничения, например, ClO₂, H₂O₂, перкислоты, NO₂ и т.д.

[0053] Используемый в данном документе термин "моющее действие" протеазы (например, одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, или рекомбинантного полипептида или его активного фрагмента) относится ко вкладу одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, в отмывание, которое обеспечивает дополнительное очищающее действие моющему средству по сравнению с моющим средством без добавления одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, к композиции. Моющее действие сравнивают при соответствующих условиях мытья. В некоторых тестовых системах другие соответствующие факторы, такие как моющая композиция, концентрация пены, жесткость воды, механика мытья, время, pH и/или температура, можно контролировать таким образом, чтобы имитировать условие (условия), типичное (типичные) для домашнего применения в определенном рыночном сегменте (например, ручное мытье посуды или мытье посуды вручную, автоматическое мытье посуды, очищение столовой посуды, очищение столовой утвари, очищение ткани и т.д.).

[0054] Термин "соответствующие условия мытья" используется в данном документе для обозначения условий, в частности температуры мытья, времени, механики мытья, концентрации пены, типа моющего средства и жесткости воды, обычно применяемых в быту, в сегменте рынка, ориентированного на ручное мытье посуды, автоматическое мытье посуды или моющие средства для стирки.

[0055] Используемый в данном документе термин "дезинфекция" относится к удалению загрязняющих веществ с поверхностей, а также ингибированию или уничтожению микробов на поверхностях предметов.

[0056] "Компактная" форма очищающих композиций согласно данному документу лучше всего отражается в плотности и, в пересчете на композицию, в количестве неорганической соли-наполнителя. Неорганические соли-наполнители являются традиционными ингредиентами моющих композиций в порошкообразной форме. В традиционных моющих композициях соли-наполнители присутствуют в значительных количествах, как правило, от приблизительно 17 до приблизительно 35% по весу всей композиции. Наоборот, в компактных композициях соль-наполнитель присутствует в количествах, не превышающих приблизительно 15% всей композиции. В некоторых вариантах осуществления соль-наполнитель присутствует в количествах, не превышающих приблизительно 10% или более предпочтительно приблизительно 5% по весу композиции. В некоторых вариантах осуществления неорганические соли-наполнители выбирают из солей щелочных и щелочноземельных металлов, представляющих собой сульфаты и хлориды. В некоторых вариантах осуществления солью-наполнителем является сульфат натрия.

[0057] В данном документе раскрываются один или несколько вариантов субтилизина, пригодных для применений, связанных с очищением, и в способах очищения, а также в ряде промышленных применений. В данном документе раскрывается один или несколько выделенных, рекомбинантных, практически чистых или не встречающихся в природе вариантов субтилизина. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, пригодны в применениях, связанных с очищением, и могут быть включены в очищающие композиции, которые пригодны в способах очищения предмета или поверхности, нуждающихся в этом.

[0058] В одном варианте осуществления предусмотрен один или несколько вариантов субтилизина, содержащих две, три или четыре или больше аминокислотных замен, выбранных из (i) 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245, и 248; (ii) 40, 101, 128, и 130; (iii) 40 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (iv) 44 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (v) 48 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (vi) 58 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (vii) 89 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (viii) 101 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (ix) 116 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 128, 130, 232, 245 и 248; (x) 128 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 130, 232, 245 и 248; (xi) 130 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 232, 245 и 248; (xii) 248 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232 и 245; (xiii) 22 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (xiv) 103 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 104, 116, 128, 130, 232, 245, и 248; (xv) 104 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 116, 128, 130, 232, 245 и 248; (xvi) 232 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 245 и 248; (xvi) 245 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из 22, 40, 44, 48, 58, 89, 101, 103, 104, 116, 128, 130, 232 и 248; при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0059] В другом варианте осуществления предусмотрен один или несколько вариантов субтилизина, содержащих аминокислотную последовательность, содержащую две, три или четыре или больше аминокислотных замен в положениях, выбранных из (i) T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (ii) P40, S101, G/S128, и S130; (iii) T22 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (iv) P40 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (v) I/V44 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (vi) A48 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (vii) P/T58 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (viii) E/S89 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (ix) S101 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (x) S103 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, V104, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (xi) V104 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, A/N116, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (xii) A/N116 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, G/S128, S130, A232, Q245 и N/S248; (xiii) G/S128 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, S130, A232, Q245 и N/S248; (xiv) S130 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, A232, Q245 и N/S248; (xv) A232 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, Q245 и N/S248; (xvi) Q245 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232 и N/S248; и (xvii) N/S248 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22, P40, I/V44, A48, P/T58, E/S89, S101, S103, V104, A/N116, G/S128, S130, A232 и Q245, при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0060] В еще одном варианте осуществления предусмотрен один или несколько вариантов субтилизина, содержащих аминокислотную последовательность, содержащую две, три или четыре или больше аминокислотных замен, выбранных из (i) T22R, P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (ii) P40E, S101R, G/S128T, и S130A; (iii) T22R в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (iv) P40E в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (v) I44V в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (vi) A48V в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, I44V, P/T58Y, E/S89D, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (vii) P/T58Y в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, I44V, A48V, E/S89D, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (viii) E/S89D в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, I44V, A48V, P/T58Y, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (ix) S101 в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (x) S103A в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (xi) V104I в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, S103A, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V, Q245R и N/S248D; (xii) A/N116Q в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, G/S128T, S130A, и N/S248D; (xiii) G/S128T в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, A/N116Q, S130A, и N/S248D; (xiv) S130A в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, A/N116Q, G/S128T, и N/S248D; (xv) A232V в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, Q245R и N/S248D; (xvi) Q245R в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V и N/S248D; и (xvii) N/S248D в комбинации с одной или несколькими аминокислотными заменами в положении, выбранном из T22R, P40E, I44V, A48V, P/T58Y, E/S89D, S101R, S103A, V104I, A/N116Q, G/S128T, S130A, A232V и Q245R, при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0061] В дополнительном варианте осуществления предусмотрен один или несколько вариантов субтилизина, содержащих аминокислотную последовательность, содержащую две, три или четыре или больше аминокислотных замен, выбранных из P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D; P40E-T58Y-E89D-N116Q; P40E-E89D-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S128T; P40E-S101R-S128T-N248D; P40E-S101R-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T-N248D; P40E-E89D-S101R-S130A-N248D; S101R-S128T-N248D; P40E-E89D; P40E-S101R-S128T-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T; T58Y-N116Q; S101R-S128T; T58Y-S101R-N116Q-S128T-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S130A-N248D; P40E-S101R-S130A; P40E-E89D-S101R-S130A; P40E-S101R-S128T; I44V-A48V-N248D; I44V-A48V-S101R-S128T-N248D; I44V-A48V-S101R-S130A-N248D; I44V-A48V-T58Y-N116Q-N248D; P40E-I44V-A48V-E89D-N248D; S101R-S130A-N248D; и их комбинаций; и при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0062] В еще одном дополнительном варианте осуществления предусмотрен один или несколько вариантов выделенного субтилизина, содержащих аминокислотную последовательность, содержащую две, три или четыре или больше аминокислотных замен, выбранных из P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D; P40E-T58Y-E89D-N116Q; P40E-E89D-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S128T; P40E-S101R-S128T-N248D; P40E-S101R-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T-N248D; P40E-E89D-S101R-S130A-N248D; S101R-S128T-N248D; P40E-E89D; P40E-S101R-S128T-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T; T58Y-N116Q; S101R-S128T; T58Y-S101R-N116Q-S128T-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S130A-N248D; P40E-S101R-S130A; P40E-E89D-S101R-S130A; P40E-S101R-S128T; I44V-A48V-N248D; I44V-A48V-S101R-S128T-N248D; I44V-A48V-S101R-S130A-N248D; I44V-A48V-T58Y-N116Q-N248D; P40E-I44V-A48V-E89D-N248D; S101R-S130A-N248D; и их комбинаций; и при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0063] В еще одном варианте осуществления предусмотрен один или несколько вариантов субтилизина, содержащих аминокислотную последовательность, содержащую две, три или четыре или больше аминокислотных замен, выбранных из P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D; P40E-T58Y-E89D-N116Q; P40E-E89D-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S128T; P40E-S101R-S128T-N248D; P40E-S101R-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T-N248D; P40E-E89D-S101R-S130A-N248D; S101R-S128T-N248D; P40E-E89D; P040E-S101R-S128T-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T; T58Y-N116Q; S101R-S128T; T58Y-S101R-N116Q-S128T-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S130A-N248D; P040E-S101R-S130A; P40E-E89D-S101R-S130A; P40E-S101R-S128T; и их комбинаций; и при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0064] В другом варианте осуществления предусмотрен один или несколько вариантов выделенного субтилизина, содержащих аминокислотную последовательность, содержащую две, три или четыре или больше аминокислотных замен, выбранных из P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D; P40E-T58Y-E89D-N116Q; P40E-E89D-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S128T; P40E-S101R-S128T-N248D; P40E-S101R-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T-N248D; P40E-E89D-S101R-S130A-N248D; S101R-S128T-N248D; P40E-E89D; P40E-S101R-S128T-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T; T58Y-N116Q; S101R-S128T; T58Y-S101R-N116Q-S128T-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S130A-N248D; P40E-S101R-S130A; P40E-E89D-S101R-S130A; P40E-S101R-S128T; и их комбинаций; и при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0065] В другом варианте осуществления предусмотрен один или несколько вариантов выделенного субтилизина, содержащих аминокислотную последовательность, содержащую две, три или четыре или больше аминокислотных замен, выбранных из P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D; P40E-T58Y-E89D-N116Q; P40E-E89D-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S128T; P40E-S101R-S128T-N248D; P40E-S101R-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T-N248D; P40E-E89D-S101R-S130A-N248D; S101R-S128T-N248D; P40E-E89D; P40E-S101R-S128T-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T; T58Y-N116Q; S101R-S128T; T58Y-S101R-N116Q-S128T-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S130A-N248D; P40E-S101R-S130A; P40E-E89D-S101R-S130A; P40E-S101R-S128T; I44V-A48V-N248D; I44V-A48V-S101R-S128T-N248D; I44V-A48V-S101R-S130A-N248D; I44V-A48V-T58Y-N116Q-N248D; P40E-I44V-A48V-E89D-N248D; S101R-S130A-N248D; T22R-S101G-S103A-V104I-A-232V-Q245R-N248D.

[0066] В другом варианте осуществления предусмотрен один или несколько вариантов выделенного субтилизина, содержащих аминокислотную последовательность, содержащую замену 248D.

[0067] В одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, получены из исходной формы, характеризующейся 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6 или 26. В другом варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, получены из исходной формы, характеризующейся 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6 или 26. В еще одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, получены из исходной формы, характеризующейся 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6. В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, получены из исходной формы, характеризующейся 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6. В еще одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, получены из исходной формы, характеризующейся 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, получены из исходной формы, характеризующейся 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0068] В еще одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6 или 26. В других вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6. В еще одних вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В еще одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6 или 26. В еще одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6. В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В дополнительных вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6 или 26. В других дополнительных вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее чем 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6. В других дополнительных вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, содержат аминокислотную последовательность, характеризующуюся 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0069] В одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, обладают ферментативной активностью (например, протеазной активностью) и, таким образом, пригодны в применениях, связанных с очищением, включая без ограничения способы очищения предметов столовой посуды, предметов столовой утвари, тканей и предметов, имеющих твердые поверхности (например, твердая поверхность стола, столешницы, стены, предмета мебели, пола, потолка и т.д.). Иллюстративные очищающие композиции, содержащие один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, описаны ниже. Ферментативная активность (например, протеазная ферментативная активность) одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, можно легко определить с помощью процедур, хорошо известных специалистам в данной области техники. В примерах, представленные ниже, описаны способы оценки ферментативной активности и очищающего действия. Действие полипептидных ферментов по настоящему изобретению при удалении загрязнений (например, белковое загрязнение, такое как кровь/молоко/чернило, пигмент/молоко/чернило или яичный желток), очищении твердых поверхностей или очищении белья, предмета (предметов) столовой посуды или предмета(предметов) столовой утвари можно легко определить с помощью процедур, хорошо известных из уровня техники, и/или с помощью процедур, изложенных в примерах. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, представляют собой выделенный, рекомбинантный, практически чистый или не встречающийся в природе субтилизин, обладающий активностью субтилизина или активностью гидролиза казеина (например, активность гидролиза диметилказеина).

[0070] В других вариантах осуществления один или несколько вариантов, описанных в данном документе, характеризуется одним или несколькими улучшенными свойствами по сравнению с эталонным субтилизином; при этом улучшенное свойство выбрано из улучшенной протеазной активности, улучшенного очищающего действия в моющем средстве и улучшенной термостабильности в моющем средстве; при этом моющее средство необязательно представляет собой не содержащее бор моющее средство. В других вариантах осуществления один или несколько вариантов, описанных в данном документе, характеризуется одним или несколькими улучшенными свойствами по сравнению с эталонным субтилизином; при этом улучшенное свойство выбрано из улучшенной протеазной активности, улучшенного очищающего действия в моющем средстве и улучшенной термостабильности в моющем средстве; при этом моющее средство необязательно представляет собой не содержащее бор моющее средство, при этом эталонный субтилизин содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 или 26. В одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, являются более стабильными в течение более длительного периода мытья по сравнению с эталонным субтилизином. В другом варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, являются более стабильными в течение короткого холодного цикла мытья или длинного горячего цикла мытья по сравнению с эталонным субтилизином. В еще одном дополнительном варианте осуществления одно или несколько улучшенных свойств представляют собой (i) улучшенную протеазную активность, при этом указанный вариант характеризуется PI > 1 в отношении N-suc-AAPF-pNA или диметилказеинового субстрата; (ii) улучшенное очищающее действие в моющем средстве, при этом указанный вариант характеризуется очисткой от BMI и/или яичного загрязнения с PI >1; и/или (iii) улучшенную термостабильность в моющем средстве, при этом указанный вариант характеризуется стабильностью с PI > 1; при этом моющее средство необязательно представляет собой не содержащее бор моющее средство. В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, обладают улучшенной протеазной активностью, при этом указанный вариант характеризуется PI >1 в отношении N-suc-AAPF-pNA или диметилказеинового субстрата. В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, обладают улучшенным очищающим действием в моющем средстве, при этом указанный вариант характеризуется очисткой от BMI и/или яичного загрязнения с PI > 1, при этом моющее средство необязательно представляет собой не содержащее бор моющее средство. В другом варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, характеризуются улучшенной термостабильностью в моющем средстве, при этом указанный вариант характеризуется стабильностью с PI > 1, при этом моющее средство необязательно представляет собой не содержащее бор моющее средство. В другом варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, обладают улучшенной протеазной активностью, при этом указанный вариант характеризуется PI > 1 в отношении N-suc-AAPF-pNA или диметилказеинового субстрата, и указанный PI измеряют в соответствии с анализом протеазной активности из примера 3. В дополнительном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, обладают улучшенным очищающим действием в моющем средстве, при этом указанный вариант характеризуется очисткой от BMI и/или яичного загрязнения с PI > 1, и указанный PI измеряют в соответствии с анализом очищающего действия в моющих средствах для стирки (HDL) и ADW из примера 4. В еще одном дополнительном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, характеризуются улучшенной термостабильностью в моющем средстве, при этом указанный вариант характеризуется стабильностью с PI > 1 и указанный PI измеряют в соответствии с анализом стабильности из примера 4.

[0071] В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, демонстрируют очищающее действие в очищающей композиции. Очищающие композиции часто содержат ингредиенты, оказывающие неблагоприятное воздействие на стабильность и действие ферментов, делая очищающие композиции агрессивной средой для ферментов, например, серин-протеаз, для сохранения функции. Таким образом, введение фермента в очищающую композицию и ожидание ферментативной функции не является тривиальным (например, серин-протеазная активность, такая как показана с помощью очищающего действия). В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, демонстрируют очищающее действие в моющих композициях для автоматического мытья посуды (ADW). В некоторых вариантах осуществления очищающее действие в моющих композициях для ADW включает очищение загрязнений от яичного желтка. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, демонстрируют очищающее действие в моющих композициях для стирки. В некоторых вариантах осуществления очищающее действие в моющих композициях для стирки включает очищение загрязнений от крови/молока/чернил, яйца, яичного желтка и/или РОМ. В каждой из очищающих композиций один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, демонстрируют очищающее действие с отбеливающим компонентом или без него. В еще одном дополнительном варианте осуществления одна или несколько моющих композиций для ADW или стирки, описанных в данном документе, содержат один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, при этом указанный вариант является стабильным в присутствии одного или нескольких вспомогательных материалов и/или одного или нескольких дополнительных ферментов, и/или дополнительно при этом указанный вариант является стабильным к аутопротеолизу.

[0072] Определенные варианты осуществления настоящего изобретения направлены на способы повышения продуцирования варианта субтилизина в грамположительной бактериальной клетке(-хозяине). Например, в определенных вариантах осуществления способ предусматривает (a) введение в клетку-хозяина полинуклеотидной конструкции, кодирующей вариант субтилизина, содержащий замену 248D, и (b) выращивание клетки-хозяина в условиях, подходящих для продуцирования кодируемого варианта субтилизина, при этом клетка-хозяин продуцирует повышенное количество варианта субтилизина, содержащего замену 248D, по сравнению с грамположительной клеткой-хозяином того же рода, вида и генетического фона, содержащей введенную полинуклеотидную конструкцию, кодирующую вариант субтилизина, который не содержат замену 248D; при этом аминокислотные положения вариантов нумеруют в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В определенных вариантах осуществления вариант субтилизина, содержащий замену 248D, характеризуется индексом продуктивности (PI) > 1,0 относительно варианта субтилизина, который не содержит замену 248D.

[0073] В еще одних вариантах осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению представляет собой экспрессирующую конструкцию, содержащую в направлении от 5' к 3' (i) промоторную последовательность, которая расположена выше (5') и функционально связана с сигнальной пептидной последовательностью, (ii) пропептидную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с 5' сигнальной пептидной последовательностью, (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант субтилизина, содержащий замену 248D, при этом последовательность нуклеиновой кислоты расположена ниже (3') и функционально связана с 5' пропептидной последовательностью, и (iv) необязательную терминаторную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант, содержащий замену 248D, при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В определенных других вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция по настоящему изобретению (т. е. для повышения продуцирования варианта субтилизина в грамположительной бактериальной клетке-хозяине) содержит экспрессирующую конструкцию, содержащую в направлении от 5' к 3' (i) промоторную последовательность; (ii) сигнальную пептидную последовательность, представляющую собой SEQ ID NO: 28; (iii) пропептидную последовательность, представляющую собой SEQ ID NO: 3; (iv) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид варианта субтилизина, выбранный из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51; и/или (v) необязательную терминаторную последовательность, представляющую собой SEQ ID NO: 30, при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0074] В еще одном варианте осуществления вариант субтилизина в способах повышения продуцирования варианта субтилизина в грамположительной бактериальной клетке-хозяине дополнительно содержит одну или несколько замен в одном или нескольких положениях, выбранных из 40, 44, 48, 58, 89, 101, 116, 128 и 130, при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В еще одном дополнительном варианте осуществления вариант субтилизина в способах повышения продуцирования варианта субтилизина в грамположительной бактериальной клетке-хозяине дополнительно содержит аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен, выбранных из I44V-A48V, I44V-A48V-S101R-S128T, I44V-A48V-S101R-S130A, I44V-A48V-T58Y-N116Q, P40E-E89D, P40E-E89D-S101R-S128T, P40E-E89D-S101R-S130A, P40E-I44V-A48V-E89D, P40E-S101R-S128T, P40E-S101R-S128T-S130A, P40E-S101R-S130A, P40E-T58Y-E89D-N116Q, S101R-S128T, S101R-S130A, T58Y-S101R-N116Q-S128T, T58Y-S101R-N116Q-S130A, P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D; P40E-T58Y-E89D-N116Q; P40E-E89D-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S128T; P40E-S101R-S128T-N248D; P40E-S101R-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T-N248D; P40E-E89D-S101R-S130A-N248D; S101R-S128T-N248D; P40E-E89D; P40E-S101R-S128T-S130A-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T; T58Y-N116Q; S101R-S128T; T58Y-S101R-N116Q-S128T-N248D; T58Y-S101R-N116Q-S130A-N248D; P40E-S101R-S130A; P40E-E89D-S101R-S130A; P40E-S101R-S128T; I44V-A48V-N248D; I44V-A48V-S101R-S128T-N248D; I44V-A48V-S101R-S130A-N248D; I44V-A48V-T58Y-N116Q-N248D; P40E-I44V-A48V-E89D-N248D; S101R-S130A-N248D; T22R-S101G-S103A-V104I-A-232V-Q245R-N248D и их комбинаций, при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В еще одном дополнительном варианте осуществления вариант субтилизина в способах повышения продуцирования варианта субтилизина в грамположительной бактериальной клетке-хозяине содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6 или 26.

[0075] Один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, могут быть подвергнуты различным изменениям, таким как одна или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен, либо консервативных, либо неконсервативных, включая случаи, при которых такие изменения по сути не изменяют ферментативную активность варианта. Аналогично, нуклеиновая кислота по настоящему изобретению также может быть подвергнута различным изменениям, таким как одна или несколько замен в одном или нескольких нуклеотидах в одном или нескольких кодонах, так, чтобы конкретный кодон кодировал такую же или иную аминокислоту, приводя либо к молчащей вариации (например, когда кодируемая аминокислота не изменяется мутацией нуклеотида), либо немолчащей вариации, одна или несколько делеций в одной или нескольких нуклеиновых кислотах (или кодоне) в последовательности, одно или несколько присоединений или вставок в одной или нескольких нуклеиновых кислотах (или кодоне) в последовательности; и/или расщепление или одно или несколько укорачиваний одной или нескольких нуклеиновых кислот (или кодона) в последовательности. Многие такие изменения в последовательности нуклеиновой кислоты могут по сути не изменять ферментативную активность получаемого в результате кодируемого полипептидного фермента по сравнению с полипептидным ферментом, кодируемым первоначальной последовательностью нуклеиновой кислоты. Последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе, также можно модифицировать для включения одного или нескольких кодонов, которые обеспечивают оптимальную экспрессию в системе экспрессии (например, бактериальная система экспрессии), при этом, при необходимости, указанный один или несколько кодонов продолжают кодировать одинаковую аминокислоту(аминокислоты).

[0076] В данном документе описаны один или несколько выделенных не встречающихся в природе или рекомбинантных полипептидов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, или рекомбинантный полипептид или его активный фрагмент. Одна или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, описанных в данном документе, пригодны в рекомбинантном продуцировании (например, экспрессии) одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, как правило, путем экспрессии плазмидного вектора экспрессии (например, кассеты экспрессии), содержащего последовательность, кодирующую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, или его фрагмент. В одном варианте осуществления предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, при этом вариант представляет собой зрелую форму, имеющую протеолитическую активность. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, экспрессируются рекомбинантным образом с гомологичной пропептидной последовательностью. В других вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, экспрессируются рекомбинантным образом с гетерологичной пропетидной последовательностью (например, пропептидной последовательностью GG36).

[0077] В другом варианте осуществления один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе, кодируют вариант субтилизина, содержащий замену 248D, при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В еще одном варианте осуществления один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе, кодируют вариант субтилизина, содержащий замену 248D, при этом указанный вариант субтилизина характеризуется индексом продуктивности (PI), составляющим более 1,0, при этом PI рассматривается относительно полипептида варианта субтилизина, который не содержит замену 248D, при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В еще одном варианте осуществления один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе, представляют собой экспрессирующую конструкцию, содержащую в направлении от 5' к 3' промоторную последовательность, которая расположена выше (5') и функционально связана с сигнальной пептидной последовательностью, пропептидную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с 5' сигнальной пептидной последовательностью, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант, содержащий замену 248D, при этом последовательность нуклеиновой кислоты расположена ниже (3') и функционально связана с 5' пропептидной последовательностью, и необязательную терминаторную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант, содержащий замену 248D, при этом аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26. В еще одном варианте осуществления один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе, представляют собой экспрессирующую конструкцию, содержащую в направлении от 5' к 3' промоторную последовательность, которая расположена выше (5') и функционально связана с сигнальной пептидной последовательностью, пропептидную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с 5' сигнальной пептидной последовательностью, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант, содержащий замену 248D, при этом последовательность нуклеиновой кислоты расположена ниже (3') и функционально связана с 5' пропептидной последовательностью, и необязательную терминаторную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант, содержащий замену 248D, при этом сигнальная пептидная последовательность содержит SEQ ID NO: 28; пропептидная последовательность содержит SEQ ID NO: 3; последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид варианта субтилизина, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51; и/или необязательная терминаторная последовательность содержит SEQ ID NO: 30, при этом положения аминокислот варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 26.

[0078] Одна или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, описанных в данном документе, могут быть созданы с использованием любых подходящих методик синтеза, манипуляции и/или выделения или их комбинаций. Например, один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе, могут быть получены с использованием стандартных методик синтеза нуклеиновых кислот, таких как методики синтеза в твердой фазе, хорошо известные специалистам в данной области техники. В таких методиках, как правило, синтезируют фрагменты до 50 или более нуклеотидных оснований, затем соединяют (например, с помощью способов ферментативного или химического лигирования) с образованием практически любой желаемой непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты. Синтез одного или нескольких полинуклеотидов, описанных в данном документе, также может быть облегчен с помощью любого подходящего способа, известного из уровня техники, в том числе без ограничения химического синтеза с использованием классического фосфорамидатного способа (см., например, Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22:1859-69 (1981)) или с помощью способа, описанного в Matthes et al., EMBO J. 3:801-805 (1984), как в типичном случае осуществляется в автоматизированных синтетических способах. Один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе, могут также быть получены с помощью автоматического ДНК-синтезатора. Индивидуализированные нуклеиновые кислоты могут быть получены из ряда коммерческих источников (например, от Midland Certified Reagent Company, Great American Gene Company, Operon Technologies Inc. и DNA 2.0). Другие методики синтеза нуклеиновых кислот и соответствующие принципы описаны, например, в Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323 (1984) и Itakura et al., Science 198:1056 (1984).

[0079] Методики рекомбинантной ДНК, пригодные в модификации нуклеиновых кислот, хорошо известны из уровня техники, такие как, например, расщепление рестрикционными эндонуклеазами, лигирование, обратная транскрипция и образование cDNA, а также полимеразная цепная реакция (например, ПЦР). Один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе, могут также быть получены с помощью скрининга библиотек cDNA с использованием одного или нескольких олигонуклеотидных зондов, которые могут гибридизироваться с полинуклеотидами или амплифицировать их посредством ПЦР, которые кодируют один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, или рекомбинантный полипептид или его активный фрагмент. Процедуры для скрининга и выделения клонов cDNA и процедуры ПЦР-амплификации хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны в стандартных справочниках, известных специалистам в данной области техники. Один или несколько полинуклеотидов, описанных в данном документе, могут быть получены путем изменения встречающегося в природе полинуклеотидного остова (например, который кодирует один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, или эталонный субтилизин), например, с помощью известных процедур мутагенеза (например, сайт-направленного мутагенеза, сайт-насыщающего мутагенеза и in vitro рекомбинации). Из уровня техники известен ряд способов, которые пригодны для создания модифицированных полинуклеотидов, описанных в данном документе, которые кодируют один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, в том числе без ограничения, например, сайт-насыщающий мутагенез, сканирующий мутагенез, инсерционный мутагенез, делеционный мутагенез, случайный мутагенез, сайт-направленный мутагенез и направляемая эволюция, а также различные другие подходы в отношении модификации последовательностей.

[0080] Дополнительный вариант осуществления направлен на один или несколько векторов, содержащих один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе (например, полинуклеотид, кодирующий один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе); векторы экспрессии или кассеты экспрессии, содержащие одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот или полинуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе; выделенные практически чистые или рекомбинантные конструкции ДНК, содержащие одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты или полинуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе; выделенные или рекомбинантные клетки, содержащие одну или несколько полинуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе; и композиции, содержащие одно или несколько из такого вектора, нуклеиновой кислоты, вектора экспрессии, кассеты экспрессии, конструкции ДНК, клетки, клеточной культуры или любой их комбинации или смесей.

[0081] Такие варианты осуществления направлены на одну или несколько рекомбинантных клеток, содержащих один или несколько векторов (например, вектор экспрессии или конструкцию ДНК), описанных в данном документе, которые содержат одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты или полинуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе. Некоторые такие рекомбинантные клетки трансформированы или трансфицированы таким по меньшей мере одним вектором, хотя другие способы доступны и известны из уровня техники. Такие клетки, как правило, называют клетками-хозяевами. Некоторые такие клетки включают бактериальные клетки, в том числе без ограничения клетки Bacillus sp., такие как клетки B. subtilis. Другие варианты осуществления направлены на рекомбинантные клетки (например, рекомбинантные клетки-хозяева), содержащие один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе.

[0082] В некоторых вариантах осуществления один или несколько векторов, описанных в данном документе, представляют собой вектор экспрессии или кассету экспрессии, содержащие одну или несколько полинуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, функционально связанных с одним или несколькими дополнительными сегментами нуклеиновой кислоты, необходимыми для эффективной экспрессии генов (например, промотором, функционально связанным с одной или несколькими полинуклеотидными последовательностями, описанными в данном документе). Вектор может включать терминатор транскрипции и/или ген отбора (например, ген устойчивости к антибиотику), который позволяет непрерывное поддерживание в культуре инфицированных плазмидой клеток-хозяев при выращивании в содержащих противомикробное средство средах.

[0083] Вектор экспрессии может быть получен из плазмидной или вирусной ДНК или в альтернативных вариантах осуществления содержит элементы и той, и другой. Типичные векторы включают без ограничения pC194, pJH101, pE194, pHP13 (см. Harwood and Cutting [eds.], Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons (1990); подходящие реплецирующиеся плазмиды для B. subtilis включают те, которые перечислены на стр. 92). (См. также Perego, "Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis"; Sonenshein et al., [eds.]; "Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics", American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993), pp. 615-624); и p2JM103BBI).

[0084] Для экспрессии и продуцирования представляющего интерес белка (например, одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе) в клетке один или несколько векторов экспрессии, содержащих одну или несколько копий полинуклеотида, кодирующего один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и в некоторых случаях содержащих несколько копий, трансформируют в клетку, в условиях, подходящих для экспрессии варианта. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе (а также другие последовательности, включенные в вектор), интегрируют в геном клетки-хозяина, тогда как в других вариантах осуществления плазмидный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, остается автономным внехромосомным элементом в клетке. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены как внехромосомные элементы нуклеиновой кислоты, так и входящие нуклеотидные последовательности, которые интегрированы в геном клетки-хозяина. Векторы, описанные в данном документе, пригодны для продуцирования одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция, кодирующая один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, присутствует в интегрирующемся векторе, что обеспечивает интеграцию и необязательно амплификацию полинуклеотида, кодирующего вариант в хромосоме хозяина. Примеры сайтов интеграции хорошо известны специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления транскрипция полинуклеотида, кодирующего один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, осуществляется с помощью промотора, который является промотором дикого типа для родительского субтилизина. В некоторых других вариантах осуществления промотор является гетерологичным по отношению к одному или нескольким вариантам субтилизина, описанным в данном документе, но функциональным в клетке-хозяине. Иллюстративные промоторы для применения в бактериальных клетках-хозяевах включают без ограничения промоторы amyE, amyQ, amyL, pstS, sacB, pSPAC, pAprE, pVeg, pHpaII, промотор гена мальтогенной амилазы B. stearothermophilus, гена амилазы B. amyloliquefaciens (BAN), гена щелочной протеазы B. subtilis, гена щелочной протеазы B. clausii, гена ксилозидазы B. pumilis, cryIIIA B. thuringiensis и гена альфа-амилазы B. licheniformis. Дополнительные промоторы включают без ограничения промотор A4, а также PR- или PL-промоторы фага лямбда и промоторы lac, trp или tac E. coli.

[0085] Один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, могут быть продуцированы в клетках-хозяевах любого подходящего микроорганизма, в том числе бактерий и грибов. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, могут быть продуцированы в грамположительных бактериях. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой Bacillus spp., Streptomyces spp., Escherichia spp., Aspergillus spp., Trichoderma spp., Pseudomonas spp., Corynebacterium spp., Saccharomyces spp. или Pichia spp. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, продуцируются клетками-хозяевами Bacillus sp. Примеры клеток-хозяев Bacillus sp., которые находят применение в продуцировании одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, включают без ограничения B. licheniformis, B. lentus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. coagulans, B. circulans, B. pumilis, B. thuringiensis, B. clausii и B. megaterium, а также другие организмы рода Bacillus. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева B. subtilis используются для продуцирования вариантов, описанных в данном документе. В патенте США №5264366 и патенте США №4760025 (RE 34606) описаны различные штаммы-хозяева Bacillus, которые можно использовать для продуцирования одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, хотя могут быть использованы другие подходящие штаммы.

[0086] Некоторые бактериальные штаммы, которые можно использовать для продуцирования одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, включают нерекомбинантные штаммы (т.e. дикого типа) Bacillus sp., а также варианты встречающихся в природе штаммов и/или рекомбинантных штаммов. В некоторых вариантах осуществления штамм-хозяин представляет собой рекомбинантный штамм, в котором полинуклеотид, кодирующий один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, был введен в хозяина. В некоторых вариантах осуществления штаммом-хозяином является штамм-хозяин B. subtilis и, в частности, рекомбинантный штамм-хозяин B. subtilis. Известны многочисленные штаммы B. subtilis, в том числе без ограничения, например, штамм 1A6 (ATCC 39085), 168 (1A01), SB19, W23, Ts85, B637, PB1753-PB1758, PB3360, JH642, 1A243 (ATCC 39,087), ATCC 21332, ATCC 6051, MI113, DE100 (ATCC 39,094), GX4931, PBT 110 и PEP 211 (см., например, Hoch et al., Genetics 73:215-228 (1973); см. также патент США №4450235; патент США №4302544 и EP 0134048). Применение B. subtilis в качестве клетки-хозяина для экспрессии хорошо известно из уровня техники (см., например, Palva et al., Gene 19:81-87 (1982); Fahnestock and Fischer, J. Bacteriol., 165:796-804 (1986); и Wang et al., Gene 69:39-47 (1988)).

[0087] В некоторых вариантах осуществления клеткой-хозяином Bacillus является Bacillus sp., которая содержит мутацию или делецию в по меньшей мере одном из следующих генов degU, degS, degR и degQ. В некоторых вариантах осуществления мутация находится в гене degU, и в некоторых вариантах осуществления мутация представляет собой degU(Hy)32 (см, например, Msadek et al., J. Bacteriol. 172:824-834 (1990); и Olmos et al., Mol. Gen. Genet. 253:562-567 (1997)). В некоторых вариантах осуществления хозяин Bacillus содержит мутацию или делецию в scoC4 (см., например, Caldwell et al., J. Bacteriol. 183:7329-7340 (2001)); spoIIE (см., например, Arigoni et al., Mol. Microbiol. 31:1407-1415 (1999)); и/или oppA или в других генах оперона opp (см., например, Perego et al., Mol. Microbiol. 5:173-185 (1991)). Действительно, предполагают, что любая мутация в опероне opp, которая приводит к такому же фенотипу, что и мутация в гене oppA, найдет применение в некоторых вариантах осуществления измененного штамма Bacillus, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления такие мутации происходят отдельно, тогда как в других вариантах осуществления наблюдаются комбинации мутаций. В некоторых вариантах осуществления измененным штаммом-хозяином Bacillus для получения клеток-хозяев, который можно использовать для продуцирования одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, является штамм-хозяин Bacillus, который уже содержит мутацию в одном или нескольких из вышеупомянутых генов. Кроме того, находят применение клетки-хозяева Bacillus sp., которые содержат мутацию (мутации) и/или делецию (делеции) эндогенных генов протеазы. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева Bacillus содержат делецию генов aprE и nprE. В других вариантах осуществления клетка-хозяин Bacillus sp. содержит делецию 5 генов протеазы, тогда как в других вариантах осуществления клетка-хозяин Bacillus sp. содержит делецию 9 генов протеазы (см., например, US 2005/0202535).

[0088] Клетки-хозяева трансформируют одной или несколькими последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующей один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, с использованием любого подходящего способа, известного из уровня техники. Хорошо известны способы введения нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетки Bacillus или клетки E. coli с использованием плазмидных конструкций ДНК или векторов и с трансформацией таких плазмидных конструкций ДНК или векторов в такие клетки. В некоторых вариантах осуществления плазмиды затем выделяют из клеток E. coli и трансформируют в клетки Bacillus. Однако не является обязательным применение промежуточных микроорганизмов, таких как E. coli, и в некоторых вариантах осуществления конструкцию ДНК или вектор вводят непосредственно в хозяина Bacillus.

[0089] Иллюстративные способы введения одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты, описанных в данном документе, в клетки Bacillus, описаны, например, в Ferrari et al., "Genetics," in Harwood et al. [eds.], Bacillus, Plenum Publishing Corp. (1989), pp. 57-72; Saunders et al., J. Bacteriol. 157:718-726 (1984); Hoch et al., J. Bacteriol. 93:1925-1937 (1967); Mann et al., Current Microbiol. 13:131-135 (1986); Holubova, Folia Microbiol. 30:97 (1985); Chang et al., Mol. Gen. Genet. 168:11-115 (1979); Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett. 7:261-263 (1980); Smith et al., Appl. Env. Microbiol. 51:634 (1986); Fisher et al., Arch. Microbiol. 139:213-217 (1981); и McDonald, J. Gen. Microbiol. 130:203 (1984)). Действительно, такие способы как трансформация, в том числе протопластная трансформация и трансфекция, трансдукция и протопластное слияние, хорошо известны и подходят для применения согласно данному документу. Способы, известные из уровня техники для трансформации клеток Bacillus, включают такие способы как трансформация методом спасения плазмидного маркера, которая предусматривает поглощение донорной плазмиды компетентными клетками, несущими частично гомологичную резидентную плазмиду (см. Contente et al., Plasmid 2:555-571 (1979); Haima et al., Mol. Gen. Genet. 223:185-191 (1990); Weinrauch et al., J. Bacteriol. 154:1077-1087 (1983); и Weinrauch et al., J. Bacteriol. 169:1205-1211 (1987)). В этом способе входящая донорная плазмида рекомбинируется с гомологичной областью резидентной "хелперной" плазмиды в процессе, который имитирует хромосомную трансформацию.

[0090] Помимо традиционно используемых способов в некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева непосредственно трансформируются конструкцией ДНК или вектором, содержащими нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе (т.е. промежуточную клетку не используют для амплификации, или иного процесса, конструкции ДНК или вектора перед введением в клетку-хозяина). Введение конструкции ДНК или вектора, описанных в данном документе, в клетку-хозяина предусматривает такие физические и химические способы, которые известны из уровня техники для введения последовательности нуклеиновой кислоты (например, последовательности ДНК) в клетку-хозяина без вставки в геном хозяина. Такие способы включают без ограничения осаждение хлоридом кальция, электропорацию, оголенную ДНК и липосомы. В дополнительных вариантах осуществления конструкции ДНК или вектор совместно трансформируют с плазмидой без вставки в плазмиду. В дополнительных вариантах осуществления селективный маркер удаляют из измененного штамма Bacillus с помощью способов, известных из уровня техники (см. Stahl et al., J. Bacteriol. 158:411-418 (1984); и Palmeros et al., Gene 247:255 -264 (2000)).

[0091] В некоторых вариантах осуществления трансформированные клетки культивируют в традиционных питательных средах. Подходящие специальные условия для культуры, такие как температура, pH и т. п., известны специалистам в данной области техники и хорошо описаны в научной литературе. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена культура (например, клеточная культура), содержащая один или несколько вариантов субтилизина или последовательностей нуклеиновой кислоты, описанных в данном документе.

[0092] В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева, трансформированные одной или несколькими полинуклеотидными последовательностями, кодирующими один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, культивируют в подходящей питательной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию варианта, после чего полученный вариант выделяют из культуры. В некоторых вариантах осуществления вариант, продуцируемый клетками, выделяют из культуральной среды традиционными процедурами, в том числе без ограничения, например, отделением клеток-хозяев от среды путем центрифугирования или фильтрацией, осаждением белковых компонентов супернатанта или фильтрата посредством соли (например, сульфатом аммония) и хроматографической очисткой (например, ионообменной, гель-фильтрационной, аффинной и т.д.).

[0093] В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, продуцируемых рекомбинантной клеткой-хозяином, секретируются в культуральную среду. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует облегчающий очищение домен, может быть использована для облегчения очищения варианта. Вектор или конструкция ДНК, содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько вариантов субтилизина, описанные в данном документе, дополнительно могут содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей облегчающий очищение домен для облегчения очищения варианта (см., например, Kroll et al., DNA Cell Biol. 12:441-53 (1993)). Такие облегчающие очищение домены включают без ограничения, например, металл-хелатирующие пептиды, такие как модули гистидин-триптофан, которые обеспечивают очищение на иммобилизированных металлах (см. Porath, Protein Expr. Purif. 3:263-281 [1992]), домены белка A, которые обеспечивают очищение на иммобилизированном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе FLAGS-удлинения/аффинной очистки. Включение отщепляемой линкерной последовательности, такой как фактор XA или энтерокиназа (например, последовательности, доступные от Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), между доменом очистки и гетерологичным белком также находит применение в облегчении очищения.

[0094] Для определения уровня продуцирования одного или нескольких зрелых вариантов субтилизина, описанных в данном документе, в клетке-хозяине можно использовать ряд способов. Такие способы включают без ограничения, например, способы, в которых используют либо поликлональные, либо моноклональные антитела, специфичные для протезы. Типичные способы включают без ограничения твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммунологические анализы (RIA), флуоресцентные иммуноанализы (FIA) и сортировку флюоресцентно-активированных клеток (FACS). Эти и другие анализы хорошо известны из уровня техники (см., например, Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211 (1983)).

[0095] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы изготовления или продуцирования одного или нескольких зрелых вариантов субтилизина, описанных в данном документе. Зрелый вариант субтилизина не включает сигнальный пептид или пропептидную последовательность. Некоторые способы предусматривают получение или продуцирование одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, в рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине, такой как, например, клетка Bacillus sp. (например, клетка B. subtilis). В других вариантах осуществления предусмотрен способ продуцирования одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, при этом способ предусматривает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, в условиях, благоприятных для продуцирования варианта. Таки способы дополнительно предусматривают выделение варианта из культуры.

[0096] В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены способы продуцирования одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, при этом способы предусматривают (a) введение рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант, в популяцию клеток (например, бактериальных клеток, таких как клетки B. subtilis); и (b) культивирование клеток в культуральной среде в условиях, благоприятных для продуцирования варианта, кодируемого вектором экспрессии. Некоторые из таких способов дополнительно предусматривают (c) выделение варианта из клеток или из культуральной среды.

[0097] Если не отмечено иное, уровни всех компонентов или композиции, представленных в данном документе, приводятся относительно активного уровня этих компонента или композиции и без учета примесей, например, остаточных растворителей или побочных продуктов, которые могут присутствовать в коммерчески доступных источниках. Вес ферментных компонентов приводят на основе общего активного белка. Все значения процентного содержания и соотношения рассчитывают по весу, если не указано иное. Все значения процентного содержания и соотношения рассчитывают на основе всей композиции, если не указано иное. Композиции, описанные в данном документе, включают очищающие композиции, такие как моющие композиции. В иллюстративных моющих композициях уровни ферментов выражают как чистый фермент по весу всей композиции и, если не указано иное, моющие ингредиенты выражают по весу всех композиций.

[0098] В одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, пригодны в применениях, связанных с очищением, таких как, например, без ограничения очищение столовой посуды или предметов столовой утвари, медицинских инструментов и предметов, имеющих твердые поверхности (например, твердая поверхность стола, столешницы, стены, предмета мебели, пола и потолка). В других вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, пригодны в применениях, связанных с дезинфекцией, таких как, например, без ограничения дезинфекция посудомоечной или стиральной машины-автомат.

[0099] Другой вариант осуществления направлен на композицию, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композицией является очищающая композиция. В других вариантах осуществления композицией является моющая композиция. В еще одних вариантах осуществления композицию выбрана из моющей композиции для стирки, композиции для автоматического мытья посуды (ADW), моющей композиции для ручного мытья посуды (вручную), композиции для очистки твердой поверхности, композиции для очистки очков, композиции для очистки медицинского инструмента, композиции для дезинфекции (например, от неприятного запаха или микроорганизмов) и очищающей композиции для личной гигиены. В еще одних вариантах осуществления композиция представляет собой моющую композицию для стирки, композицию для ADW или моющую композицию для ручного мытья посуды (вручную). Еще одни варианты осуществления направлены на композиции для очистки тканей, в то время как другие варианты осуществления направлены на не предназначенные для ткани очищающие композиции. В некоторых вариантах осуществления очищающая композиция не содержит бор. В других вариантах осуществления очищающая композиция не содержит фосфат. В еще одних вариантах осуществления композиция содержит один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и одно или несколько из наполнителя, вспомогательного материала и/или дополнительного фермента.

[00100] В еще одном дополнительном варианте осуществления композиция, описанная в данном документе, содержит фосфат, не содержит фосфат, содержит бор, не содержит бор или представляет собой их комбинации. В других вариантах осуществления композиция представляет собой не содержащую бор композицию. В некоторых вариантах осуществления не содержащая бор композиция представляет собой композицию, к которой не добавляли стабилизатор на основе бората. В другом варианте осуществления не содержащая бор композиция представляет собой композицию, которая содержит менее 5,5% бора. В еще одном дополнительном варианте осуществления не содержащая бор композиция представляет собой композицию, которая содержит менее 4,5% бора. В еще другом варианте осуществления не содержащая бор композиция представляет собой композицию, которая содержит менее 3,5% бора. В еще одном дополнительном варианте осуществления не содержащая бор композиция представляет собой композицию, которая содержит менее 2,5% бора. В еще одних дополнительных вариантах осуществления не содержащая бор композиция представляет собой композицию, которая содержит менее 1,5% бора. В другом варианте осуществления не содержащая бор композиция представляет собой композицию, которая содержит менее 1,0% бора. В еще одних дополнительных вариантах осуществления не содержащая бор композиция представляет собой композицию, которая содержит менее 0,5% бора. В еще одном дополнительном варианте осуществления не содержащая бор композиция представляет собой композицию, по сути, не содержащую бор.

[00101] В другом варианте осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, находятся в форме, выбранной из геля, таблетки, порошка, гранулы, твердой формы, жидкой формы, однократной дозы и их комбинаций. В еще одном варианте осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, находятся в форме, выбранной из компактной формулы с низким содержанием воды, HDL или UD с низким содержанием воды или формулы или HDL с высоким содержанием воды. В некоторых вариантах осуществления очищающая композиция, описанная в данном документе, находится в форме однократной дозы. В других вариантах осуществления форма единичной дозы выбрана из пилюль, таблеток, капсул, желатиновых капсул, саше, пакетов, многокамерных пакетов и предварительно отмеренных порошков или жидкостей. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен формат единичной дозы для обеспечения регулируемого высвобождения ингредиентов в многокамерном пакете (или другой формат с однократной дозой). Подходящие форматы с однократной дозой и форматы с контролируемым высвобождением описаны, например, в EP 2100949; WO 02/102955; US 4765916; US 4972017 и WO 04/111178. В некоторых вариантах осуществления форма с однократной дозой представляет собой таблетку или порошок, содержащиеся в водорастворимой пленке или пакете.

[00102] Иллюстративные моющие композиции для стирки включают без ограничения, например, жидкие и порошкообразные моющие композиции для стирки. Иллюстративные композиции для очистки твердой поверхности включают без ограничения, например, композиции, используемые для очистки твердой поверхности предмета, не являющегося столовой посудой, предмета, не являющегося столовой утварью, стола, столешницы, предмета мебели, стены, пола и потолка. Иллюстративные композиции для очистки твердых поверхностей описаны, например, в USPN 6610642, 6376450 и 6376450. Иллюстративные композиции для личной гигиены включают без ограничения композиции, применяемые для очистки зубных протезов, зубов, волос, контактных линз и кожи. Иллюстративные компоненты такой композиции для ухода за полостью рта включают таковые, описанные, например, в US 6376450.

[00103] В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, очищают при низких значениях температуры. В других вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, очищают при низких значениях температуры. В других вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат эффективное количество одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, в качестве пригодных или эффективных для очистки поверхности, нуждающейся в удалении белковых загрязнений.

[00104] В некоторых вариантах осуществления вспомогательные материалы включают, например, для обеспечения или усиления очищающего действия, для обработки субстрата, подлежащего очищению, или для модификации органолептических свойств очищающей композиции, как в случае с отдушками, окрашивающими средствами, красителями или подобным. Один вариант осуществления направлен на композицию, содержащую один или несколько вспомогательных материалов и один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе. Другой вариант осуществления направлен на композицию, содержащую один или несколько вспомогательных материалов или один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, при этом вспомогательный материал выбран из катализатора отбеливания, дополнительного фермента, стабилизатора фермента (в том числе, например, стабилизирующей фермент системы), хелатирующего средства, оптического отбеливателя, высвобождающего грязь полимера, средства переноса красителя, диспергирующего средства, гасителя пены, красителя, отдушки, окрашивающего средства, наполнителя, фотоактиватора, флуоресцирующего вещества, кондиционера для ткани, гидролизуемого поверхностно-активного вещества, консерванта, антиоксиданта, средства против усадки ткани, средства против образования складок, бактерицидного средства, фунгицидного средства, средства против образования пятнистости, средства по уходу за серебром, средства, препятствующего образованию оксидов, антикоррозионного средства, источника щелочности, солюбилизирующего средства, носителя, вспомогательного вещества, пигмента, средства контроля pH, поверхностно-активного вещества, моющего компонента, хелатирующего средства, средства, подавляющего перенос красителя, осаждающей добавки, диспергирующего средства, каталитического вещества, активатора отбеливания, усилителя отбеливания, пероксида водорода, источника пероксида водорода, предварительно образованной перкислоты, полимерного диспергирующего средства, средства для удаления/против повторного осаждения грязи, средства, обеспечивающего эластичность структуры, смягчителя тканей, носителя, гидротропного вещества, вспомогательного вещества, пигмента и их комбинаций. Иллюстративные вспомогательные материалы и уровни применения встречаются в USPN 5576282; 6306812; 6326348; 6610642; 6605458; 5705464; 5710115; 5698504; 5695679; 5686014 и 5646101. В вариантах осуществления, в которых один или несколько очищающих вспомогательных материалов не совместимы с одним или несколькими вариантами субтилизина, описанными в данном документе, используют способы содержания вспомогательного материала и варианта (вариантов) отдельно (т.е. без возможности контакта друг с другом) до тех пор, пока комбинация из двух компонентов не будет подходящей. Такие способы разделения включают любой подходящий способ, известный из уровня техники (например, желатиновые капсулы, инкапсулирование, таблетки, физическое разделение и т.п.).

[00105] Некоторые варианты осуществления направлены на дополнительные продукты для очистки, содержащие один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления добавку упаковывают в дозированную форму для добавления в процессе очищения. В некоторых вариантах осуществления добавку упаковывают в дозированную форму для добавления в процессе очищения, при применении источника пероксигена, и когда необходимо усиление отбеливающего действия.

[00106] Иллюстративные наполнители или носители для гранулярных композиций включают без ограничения, например, различные соли сульфата, карбоната и силиката; тальк и глину. Иллюстративные наполнители или носители для жидких композиций включают без ограничения, например, воду или низкомолекулярные первичные и вторичные спирты, в том числе полиолы и диолы (например, метанол, этанол, пропанол и изопропанол). В некоторых вариантах осуществления композиции содержат от приблизительно 5% до приблизительно 90% такого наполнителя или носителя. Кислые наполнители могут быть включены в такие композиции для снижения pH полученного в результате раствора в способе очищения или применении, связанном с очищением.

[00107] В одном варианте осуществления одна или несколько очищающих композиций, описанных в данном документе, содержат эффективное количество одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, в отдельности или в комбинации с одним или несколькими дополнительными ферментами. Как правило, очищающая композиция содержит по меньшей мере от приблизительно 0,0001 до приблизительно 20 вес. %, от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 вес. %, от приблизительно 0,0001 до приблизительно 1 вес. %, от приблизительно 0,001 до приблизительно 1 вес. % или от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 вес. % одной или нескольких протеаз. В другом варианте осуществления одна или несколько очищающих композиций, описанных в данном документе, содержат от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 2 мг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 мг, от приблизительно 0,05 до приблизительно 1 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 4 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 4 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 3 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 2 мг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 4 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 3 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 мг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мг или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мг одной или нескольких протеаз на грамм композиции.

[00108] Очищающие композиции, описанные в данном документе, как правило, составляют так, что при применении в операциях водного очищения вода для мытья будет характеризоваться pH от приблизительно 4,0 до приблизительно 11,5, или даже от приблизительно 5,0 до приблизительно 11,5, или даже от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, или даже от приблизительно 7,5 до приблизительно 10,5. Составы жидкого продукта, как правило, составляют с pH от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0 или даже от приблизительно 3 до приблизительно 5. Гранулированные продукты для стирки, как правило, составляют с pH от приблизительно 9 до приблизительно 11. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции по настоящему изобретению могут быть составлены с щелочным pH в условиях мытья, таким как pH от приблизительно 8,0 до приблизительно 12,0, или от приблизительно 8,5 до приблизительно 11,0, или от приблизительно 9,0 до приблизительно 11,0. В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции по настоящему изобретению могут быть составлены с нейтральным pH в условиях мытья, таким как pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, или от приблизительно 5,5 до приблизительно 8,0, или от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, или от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5. В некоторых вариантах осуществления условия нейтрального значения pH могут быть измерены, если очищающая композиция растворена 1:100 (вес:вес) в деионизированной воде при 20°C, измеренной с помощью стандартного pH-метра. Методики регулирования pH при рекомендуемых уровнях применения включают применение буферов, щелочей, кислот и т. д. и хорошо известны специалистам в данной области техники.

[00109] В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, инкапсулированы для защиты его во время хранения от других компонентов в композиции и/или контроля доступности варианта во время очищения. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирование усиливает действие варианта и/или дополнительного фермента. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующий материал, как правило, инкапсулирует по меньшей мере часть варианта субтилизина, описанного в данном документе. Как правило, инкапсулирующий материал является водорастворимым и/или диспергируемым в воде. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующий материал характеризуется температурой стеклования (Tg) 0°C или выше. Иллюстративные инкапсулирующие материалы включают без ограничения углеводы, природные или синтетические смолы, хитин, хитозан, целлюлозу и производные целлюлозы, силикаты, фосфаты, бораты, поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль, парафины и их комбинации. Если инкапсулирующим материалом является углевод, то его, как правило, выбирают из моносахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления инкупсулирующий материал представляет собой крахмал (см., например, EP0922499, US 4977252, US 5354559 и US 5935826). В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующий материал представляет собой микросферу, изготовленную из пластика, такого как термопластик, акрилонитрил, метакрилонитрил, полиакрилонитрил, полиметакрилонитрил и их смеси. Иллюстративные коммерческие микросферы включают без ограничения EXPANCEL^® (Stockviksverken, Швеция); и PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES^®, LUXSIL^®, Q-CEL^® и SPHERICEL^® (PQ Corp., Вэлли-Фордж, Пенсильвания).

[00110] Существует множество условий мытья, в том числе различные моющие составы, объемы воды для мытья, значения температуры воды для мытья и длительность времени мытья, которым может быть подвергнут один или несколько вариантов субтилизина. Система с низкой концентрацией моющего средства направлена на содержание воды для мытья менее приблизительно 800 ppm компонентов моющего средства. Система со средней концентрацией моющего средства направлена на содержание воды для мытья от приблизительно 800 ppm до приблизительно 2000 ppm компонентов моющего средства. Система с высокой концентрацией моющего средства направлена на содержание воды для мытья более приблизительно 2000 ppm компонентов моющего средства. В некоторых вариантах осуществления при "мытье в холодной воде" в соответствии с настоящим изобретением используют "моющее средство для холодной воды", подходящее для мытья при значениях температуры от приблизительно 10°C до приблизительно 40°C, или от приблизительно 20°C до приблизительно 30°C, или от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C, а также все другие комбинации в диапазоне от приблизительно 15°C до приблизительно 35°C или от 10°C до 40°C.

[00111] Различные регионы имеют различную жесткость воды. Жесткость является мерой количества кальция (Ca²⁺) и магния (Mg²⁺) в воде. Жесткость воды обычно описывают в гранах на галлон (gpg) смешанных Ca²⁺/Mg²⁺. Большая часть воды в Соединенных Штатах Америки является жесткой, но степень жесткости варьируется. Вода от среднежесткой (60-120 ppm) до жесткой (121-181 ppm) содержит 60-181 ppm (ppm в пересчете на граны на галлон США, поделенные на 17,1) минералов жесткости.

Вода Граны на галлон Части на миллион Мягкая Менее 1,0 Менее 17 Слегка жесткая От 1,0 до 3,5 От 17 до 60 Среднежесткая От 3,5 до 7,0 От 60 до 120 Жесткая От 7,0 до 10,5 От 120 до 180 Очень жесткая Более 10,5 Более 180

[00112] Другие варианты осуществления направлены на одну или несколько очищающих композиций, содержащих от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% по весу композиции одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и от приблизительно 99,999% до приблизительно 90,0% по весу композиции одного или нескольких вспомогательных материалов. В другом варианте осуществления очищающая композиция содержит от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% или от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% по весу композиции одного или нескольких вариантов субтилизина и от приблизительно 99,9999% до приблизительно 90,0%, от приблизительно 99,999% до приблизительно 98%, от приблизительно 99,995% до приблизительно 99,5% по весу композиции одного или нескольких вспомогательных материалов.

[00113] В других вариантах осуществления композиция, описанная в данном документе, содержит один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и один или несколько дополнительных ферментов. Один или несколько дополнительных ферментов выбраны из ацилтрансфераз, альфа-амилаз, бета-амилаз, альфа-галактозидаз, арабинозидаз, арилэстераз, бета-галактозидаз, каррагиназ, каталаз, целлобиогидролаз, целлюлаз, хондроитиназ, кутиназ, ДНКаз, эндо-бета-1,4-глюканаз, эндо-бета-маннаназ, эстераз, экзоманнаназ, галактаназ, глюкоамилаз, гемицеллюлаз, гиалуронидаз, кератиназ, лакказ, лактаз, лигниназ, липаз, липоксигеназ, маланаз, маннаназ, металлопротеаз, оксидаз, оксидоредуктаз, пектатлиаз, пектинацетилэстераз, пектиназ, пентозаназ, пероксидаз, фенолоксидаз, фосфатаз, фосфолипаз, фитаз, полигалактуроназ, полиэстераз, дополнительных протеаз, пуллуланаз, редуктаз, рамногалактуроназ, бета-глюканаз, танназ, трансглутаминаз, ксиланацетилэстераз, ксиланаз, ксилоглюканаз, ксилозидаз и любой их комбинации или смеси. Некоторые варианты осуществления направлены на комбинацию ферментов (т.е. "коктейль"), содержащую стандартные ферменты, например, амилазу, липазу, кутиназу и/или целлюлазу в сочетании с одним или несколькими вариантами субтилизина, описанными в данном документе, и/или одной или несколькими дополнительными протеазами.

[00114] В другом варианте осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и одну или несколько дополнительных протеаз. В одном варианте осуществления дополнительная протеаза представляет собой серин-протеазу. В другом варианте осуществления дополнительная протеаза представляет собой щелочную микробную протеазу или трипсиноподобную протеазу. Подходящие дополнительные протеазы включают протеазы животного, растительного или микробного происхождения. В некоторых вариантах осуществления дополнительная протеаза представляет собой микробную протеазу. В других вариантах осуществления дополнительная протеаза представляет собой химически или генетического модифицированную мутантную форму. В другом варианте осуществления дополнительная протеаза представляет собой щелочную микробную протеазу или трипсиноподобную протеазу. Иллюстративные щелочные протеазы включают субтилизины, полученные, например, из Bacillus (например, субтилизин lentus, amyloliquefaciens, gibsonii, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168). Иллюстративные дополнительные протеазы включают без ограничения таковые, описанные в WO 92/21760, WO 95/23221, WO 2008/010925, WO 09/149200, WO 09/149144, WO 09/149145, WO 10/056640, WO 10/056653, WO 2010/0566356, WO 11/072099, WO 2011/13022, WO 11/140364, WO 12/151534, WO 2015/038792, WO 2015/089447, WO 2015/089441, публикации США №2008/0090747, US 5801039, US 5340735, US 5500364, US 5855625, RE 34606, US 5955340, US 5700676 US 6312936, US 6482628, US 8530219, предварительных заявках на патент США №№62/180673 и 62/161077, и предварительных заявках согласно PCT №№PCT/US2015/021813, PCT/US2015/055900, PCT/US2015/057497, PCT/US2015/057492, PCT/US2015/057512, PCT/US2015/057526, PCT/US2015/057520, PCT/US2015/057502, PCT/US2016/022282 и PCT/US16/32514, а также металлопротеазы, описанные в WO 1999014341, WO 1999033960, WO 1999014342, WO 1999034003, WO 2007044993, WO 2009058303, WO 2009058661, WO 2014071410, WO 2014194032, WO 2014194034, WO 2014194054 и WO 2014/194117. Иллюстративные дополнительные протеазы включают без ограничения трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеазу Fusarium, описанную в WO 89/06270. Иллюстративные коммерческие протеазы включают без ограничения протеазы MAXATASE^®, MAXACAL^™, MAXAPEM^™, OPTICLEAN^®, OPTIMASE^®, PROPERASE^®, PURAFECT^®, PURAFECT^® OXP, PURAMAX^™, EXCELLASE^™, PREFERENZ^™ (например, P100, P110, P280), протеазы EFFECTENZ^™ (например, P1000, P1050, P2000), протеазы EXCELLENZ^™ (например, P1000), ULTIMASE^® и PURAFAST^™ (DuPont); ALCALASE^®, BLAZE^®, BLAZE^® EVITY^®, BLAZE^® EVITY^® 16L, CORONASE^®, SAVINASE^®, SAVINASE^® ULTRA, SAVINASE^® EVITY^®, SAVINASE^® EVERIS^®, PRIMASE^®, DURAZYM^™, POLARZYME^®, OVOZYME^®, KANNASE^®, LIQUANASE^®, LIQUANASE EVERIS^®, NEUTRASE^®, RELASE^® и ESPERASE^® (Novozymes); варианты BLAP^™ и BLAP^™ (Henkel); и KAP (субтилизин B. alkalophilus (Kao). Иллюстративные металлопротеазы включают nprE, рекомбинантную форму нейтральной металлопротеазы, экспрессируемой в B. subtilis (см., например, WO 07/044993), и PMN, очищенную нейтральную металлопротеазу из B. amyloliquefaciens.

[00115] Другой вариант осуществления направлен на композицию, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и одну или несколько липаз. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% или от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% липазы по весу композиции. Иллюстративная липаза может представлять собой химически или генетически модифицированную мутантную форму. Иллюстративные липазы включают без ограничения, например, таковые бактериального или грибного происхождения, такие как, например, липаза H. lanuginosa (см., например, EP 258068 и EP 305216), липаза T. lanuginosus (см., например, WO 2014/059360 и WO 2015/010009), липаза Rhizomucor miehei (см., например, EP 238023), липаза Candida, такая как липаза C. antarctica (например, липаза A или B C. antarctica) (см., например, EP 214761), липазы Pseudomonas, такие как липаза P. alcaligenes и P. pseudoalcaligenes (см., например, EP 218272), липаза P. cepacia (см., например, EP 331376), липаза P. stutzeri (см., например, GB 1372034), липаза P. fluorescens, липаза Bacillus (например, липаза B. subtilis (Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 (1993)), липаза B. stearothermophilus (см., например, JP 64/744992) и липаза B. pumilus (см., например, WO 91/16422)). Иллюстративные клонированные липазы включают без ограничения липазу Penicillium camembertii (см. Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 (1991)), липазу Geotricum candidum (см. Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 (1989)) и различные липазы Rhizopus, такие как липаза R. delemar (см. Hass et al., Gene 109:117-113 (1991)), липазу R. niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 (1992)) и липазу R. oryzae. Другие липолитические ферменты, такие как кутиназы, могут также находить применение в одной или нескольких композициях, описанных в данном документе, в том числе без ограничения, например, кутиназа, полученная из Pseudomonas mendocina (см. WO 88/09367) и/или Fusarium solani pisi (см. WO 90/09446). Иллюстративные коммерческие липазы включают без ограничения M1 LIPASE^™, LUMA FAST^™ и LIPOMAX^™ (DuPont); LIPEX®, LIPOCLEAN^®, LIPOLASE^® и LIPOLASE^® ULTRA (Novozymes); и LIPASE P^™ (Amano Pharmaceutical Co. Ltd).

[00116] Еще один дополнительный вариант осуществления направлен на композицию, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и одну или несколько амилаз. В одном варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% или от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% амилазы по весу композиции. Любая амилаза (например, альфа и/или бета), подходящая для применения в щелочных растворах, может быть пригодной для включения в такую композицию. Иллюстративная амилаза может представлять собой химически или генетически модифицированную мутантную форму. Иллюстративные амилазы включают без ограничения таковые бактериального и грибного происхождения, такие как, например, амилазы, описанные в GB 1296839, WO 9100353, WO 9402597, WO 94183314, WO 9510603, WO 9526397, WO 9535382, WO 9605295, WO 9623873, WO 9623874, WO 9630481, WO 9710342, WO 9741213, WO 9743424, WO 9813481, WO 9826078, WO 9902702, WO 9909183, WO 9919467, WO 9923211, WO 9929876, WO 9942567, WO 9943793, WO 9943794, WO 9946399, WO 0029560, WO 0060058, WO 0060059, WO 0060060, WO 0114532, WO 0134784, WO 0164852, WO 0166712, WO 0188107, WO 0196537, WO 02092797, WO 0210355, WO 0231124, WO 2004055178, WO 2004113551, WO 2005001064, WO 2005003311, WO 2005018336, WO 2005019443, WO 2005066338, WO 2006002643, WO 2006012899, WO 2006012902, WO 2006031554, WO 2006063594, WO 2006066594, WO 2006066596, WO 2006136161, WO 2008000825, WO 2008088493, WO 2008092919, WO 2008101894, WO 2008/112459, WO 2009061380, WO 2009061381, WO 2009100102, WO 2009140504, WO 2009149419, WO 2010/059413, WO 2010088447, WO 2010091221, WO 2010104675, WO 2010115021, WO 10115028, WO 2010117511, WO 2011076123, WO 2011076897, WO 2011080352, WO 2011080353, WO 2011080354, WO 2011082425, WO 2011082429, WO 2011087836, WO 2011098531, WO 2013063460, WO 2013184577, WO 2014099523, WO 2014164777 и WO 2015077126. Иллюстративные коммерческие амилазы включают без ограничения AMPLIFY®, DURAMYL^®, TERMAMYL^®, FUNGAMYL^®, STAINZYME^®, STAINZYME PLUS^®, STAINZYME PLUS^®, STAINZYME ULTRA^®EVITY^® и BAN^™ (Novozymes); EFFECTENZ^™ S 1000, POWERASE^™, PREFERENZ^™ S 100, PREFERENZ^™ S 110, EXCELLENZ^™ S 2000, RAPIDASE^® и MAXAMYL^® P (DuPont).

[00117] Еще один дополнительный вариант осуществления направлен на композицию, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и одну или несколько целлюлаз. В одном варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% или от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% целлюлазы по весу композиции. Любая подходящая целлюлаза может находить применение в композиции, описанной в данном документе. Иллюстративная целлюлаза может представлять собой химически или генетически модифицированную мутантную форму. Иллюстративные целлюлазы включают без ограничения таковые бактериального или грибного происхождения, такие как, например, описаны в WO 2005054475, WO 2005056787, US 7449318, US 7833773, US 4435307; EP 0495257; и предварительной заявке на патент США №62/296678. Иллюстративные коммерческие целлюлазы включают без ограничения CELLUCLEAN^®, CELLUZYME^®, CAREZYME^®, ENDOLASE^®, RENOZYME^® и CAREZYME^® PREMIUM (Novozymes); REVITALENZ^™ 100, REVITALENZ^™ 200/220 и REVITALENZ^® 2000 (DuPont); и KAC-500(B)^™ (Kao Corporation). В некоторых вариантах осуществления целлюлазы включены в виде частей или фрагментов зрелых дикого типа или вариантных целлюлаз, при этом удаляют часть N-конца (см., например, US 5874276).

[00118] Еще один дополнительный вариант осуществления направлен на композицию, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и одну или несколько маннаназ. В одном варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% или от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% маннаназы по весу композиции. Иллюстративная маннаназа может представлять собой химически или генетически модифицированную мутантную форму. Иллюстративные маннаназы включают без ограничения таковые бактериального или грибного происхождения, такие как, например, описаны в WO 2016/007929; USPN 6566114; 6602842 и 6440991; и предварительных заявках на патент США №№62/251516, 62/278383 и 62/278387. Иллюстративные коммерческие маннаназы включают без ограничения MANNAWAY^® (Novozymes) и EFFECTENZ^™ M 1000, PREFERENZ^® M 100, MANNASTAR^® и PURABRITE^™ (DuPont).

[00119] Еще один дополнительный вариант осуществления направлен на композицию, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и один или несколько ферментов, представляющих собой пероксидазу и/или оксидазу. В одном варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% или от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% пероксидазы или оксидазы по весу композиции. Пероксидаза может быть использована в комбинации с пероксидом водорода или его источником (например, перкарбонатом, перборатом или персульфатом), а оксидаза может быть использована в комбинации с кислородом. Пероксидазы и оксидазы используют для "раствора для отбеливания" (т. e. для предотвращения перехода текстильного красителя из окрашенной ткани на другую ткань при стирке тканей вместе в моющей жидкости), в отдельности или в комбинации с усиливающим средством (см., например, WO 94/12621 и WO 95/01426). Иллюстративная пероксидаза и/или оксидаза может представлять собой химически или генетически модифицированную мутантную форму. Иллюстративные пероксидазы/оксидазы включают без ограничения таковые растительного, бактериального или грибного происхождения.

[00120] Другой вариант осуществления направлен на композицию, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и одну или несколько пергидролаз, таких как, например, описаны в WO 2005/056782, WO 2007/106293, WO 2008/063400, WO 2008/106214 и WO 2008/106215.

[00121] В еще одном варианте осуществления каждый из одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и каждый из одного или нескольких дополнительных ферментов, содержащихся в одной или нескольких композициях, описанных в данном документе, может независимо находиться в диапазоне приблизительно 10%, при этом уравновешивающим компонентом очищающей композиции является один или несколько вспомогательных материалов.

[00122] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, находят применение в качестве моющего дополнительного средства, при этом указанное дополнительное средство находится в жидкой или твердой форме. Такие дополнительные продукты предназначены для дополнения и/или усиления действия традиционных моющих композиций и их можно добавлять на любой стадии процесса очищения. В некоторых вариантах осуществления плотность моющей композиции для стирки варьирует от приблизительно 400 до приблизительно 1200 г/литр, тогда как в других вариантах осуществления она варьирует от приблизительно 500 до приблизительно 950 г/литр композиции при измерении при 20°C.

[00123] Некоторые варианты осуществления направлены на моющую композицию для стирки, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, и один или несколько вспомогательных материалов, выбранных из поверхностно-активных веществ, стабилизаторов фермента, соединений моющих компонентов, полимерных соединений, отбеливающих средств, дополнительных ферментов, гасителей пены, диспергирующих средств, диспергирующих средств известкового мыла, суспензионных средств для удаления грязи, средств против повторного осаждения грязи, ингибиторов коррозии и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления композиции для стирки также содержат смягчающие средства.

[00124] Дополнительные варианты осуществления направлены на композицию для ручного мытья посуды, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, или один или несколько вспомогательных материалов, выбранных из поверхностно-активных веществ, органических полимерных соединений, средств, усиливающих образование пены, ионов металлов II группы, растворителей, гидротропных средств и дополнительных ферментов.

[00125] Другие варианты осуществления направлены на одну или несколько композиций, описанных в данном документе, при этом указанная композиция представляет собой компактную гранулированную очищающую композицию для ткани, которая находит применение в стирке цветных тканей или обеспечивает смягчение посредством моющей возможности, или представляет собой очищающую композицию для ткани с высокой моющей способностью (HDL). Иллюстративные очищающие композиции для ткани и/или способы их получения описаны в USPN 6610642 и 6376450. Другие иллюстративные очищающие композиции описаны, например, в USPN 6605458; 6294514; 5929022; 5879584; 5691297; 5565145; 5574005; 5569645; 5565422; 5516448; 5489392; и 5486303; 4968451; 4597898; 4561998; 4550862; 4537706; 4515707 и 4515705.

[00126] В некоторых вариантах осуществления очищающие композиции содержат моющий компонент на основе подкисляющих частиц или аминокарбоновый моющий компонент. Примеры аминокарбонового моющего компонента включают аминокарбоновые кислоты, их соли и производные. В некоторых вариантах осуществления аминокарбоновый моющий компонент представляет собой аминополикарбоновый моющий компонент, такой как глицин-N,N-диуксусная кислота или производное с общей формулой MOOC-CHR-N(CH₂COOM)₂, где R представляет собой C_1-12алкил, и M представляет собой щелочной металл. В некоторых вариантах осуществления аминокарбоновый моющий компонент может представлять собой метилглициндиуксусную кислоту (MGDA), GLDA (глутаминовую N,N-диуксусную кислоту), иминодиянтарную кислоту (IDS), карбоксиметилинулин и их соли и производные, аспарагиновую кислоту-N-моноуксусную кислоту (ASMA), аспарагиновую кислоту-N,N-диуксусную кислоту (ASDA), аспарагиновую кислоту-N-монопропионовую кислоту (ASMP), иминодиянтарную кислоту (IDA), N-(2-сульфометил)аспарагиновую кислоту (SMAS), N-(2-сульфоэтил)аспарагиновую кислоту (SEAS), N-(2-сульфометил)глутаминовую кислоту (SMGL), N-(2-сульфоэтил)глутаминовую кислоту (SEGL), IDS (иминодиуксусную кислоту) и их соли и производные, такие как N-метилиминодиуксусная кислота (MIDA), альфа-аланин-N,N-диуксусная кислота (альфа-ALDA), серин-N,N-диуксусная кислота (SEDA), изосерин-N,N-диуксусная кислота (ISDA), фенилаланин-N,N-диуксусная кислота (PHDA), антраниловая кислота-N,N-диуксусная кислота (TUDA) и сульфометил-N,N-диуксусная кислота (SMDA), и их соли щелочных металлов и производные. В некоторых вариантах осуществления подкисляющая частица характеризуется взвешенным геометрическим средним размера частиц от приблизительно 400 мкм до приблизительно 1200 мкм и объемной плотностью по меньшей мере 550 г/л. В некоторых вариантах осуществления подкисляющая частица составляет по меньшей мере приблизительно 5% моющего компонента.

[00127] В некоторых вариантах осуществления подкисляющая частица может содержать любую кислоту, включая органические кислоты и неорганические кислоты. Органические кислоты, такие как муравьиная, уксусная, пропионовая, каприновая, щавелевая, янтарная, адипиновая, малеиновая, фумаровая, себациновая, яблочная, молочная, гликолевая, винная и глиоксиловая кислоты, могут иметь один или два карбоксила и в некоторых случаях до 15 атомов углерода, в частности, до 10 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления кислота представляет собой лимонную кислоту. Неорганические кислоты включают соляную и серную кислоты. В некоторых случаях подкисляющая частица представляет собой высокоактивную частицу, содержащую высокий уровень аминокарбонового моющего компонента. Было обнаружено, что серная кислота также дополнительно способствует стабильности конечной частицы.

[00128] Дополнительные варианты осуществления направлены на очищающую композицию, содержащую один или несколько вариантов субтилизина или одно или несколько из поверхностно-активного вещества и/или системы поверхностно-активных веществ, при этом поверхностно-активное вещество выбрано из неионных поверхностно-активных веществ, анионных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, амфолитических поверхностно-активных веществ, цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ, полу-полярных неионных поверхностно-активных веществ и их смесей. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество присутствует на уровне от приблизительно 0,1 до приблизительно 60%, тогда как в альтернативных вариантах осуществления уровень составляет от приблизительно 1 до приблизительно 50%, тогда как в других дополнительных вариантах осуществления уровень составляет от приблизительно 5 до приблизительно 40%, по весу очищающей композиции.

[00129] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат один или несколько из моющего компонента для мытья или системы моющих компонентов для мытья. В одном варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 80%, от приблизительно 3% до приблизительно 60%, от приблизительно 5% до приблизительно 40% или от приблизительно 10% до приблизительно 50% моющего компонента по весу композиции. Иллюстративные моющие компоненты включают без ограничения полифосфатные соли щелочного металла, аммония и алканоламмония, силикаты щелочных металлов, карбонаты щелочноземельных и щелочных металлов, алюмосиликаты, поликарбоксилатные соединения, гидроксиполикарбоксилаты простого эфира, сополимеры малеинового ангидрида с этилен- или винилметиловым эфиром, 1,3,5-тригидроксибензол-2,4,6-трисульфокислоту и карбоксиметилоксиянтарную кислоту; соль аммония и замещенного аммония полиуксусных кислот, таких как этилендиаминтетрауксусная кислота и нитрилотриуксусная кислота; поликарбоксилаты, такие как меллитовая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, оксидиянтарная кислота, полималеиновая кислота, бензол-1,3,5-трикарбоновая кислота, карбоксиметилоксиянтарная кислота и их растворимые соли. В некоторых таких композициях моющие компоненты образуют водорастворимые комплексы обеспечивающих жесткость ионов (например, секвестрирующие моющие компоненты), такие как цитраты и полифосфаты, например, натрия триполифосфат и натрия триполифосфата гексагидрат, калия триполифосфат и смешанный натрия и калия триполифосфат. Иллюстративные моющие компоненты описаны, например, в EP 2100949. В некоторых вариантах осуществления моющие компоненты включают фосфатные моющие компоненты и не содержащие фосфат моющие компоненты. В некоторых вариантах осуществления моющий компонент представляет собой фосфатный моющий компонент. В некоторых вариантах осуществления моющий компонент представляет собой не содержащий фосфат-моющий компонент. В некоторых вариантах осуществления моющий компонент содержит смесь фосфатных моющих компонентов и не содержащих фосфат моющих компонентов. Иллюстративные фосфатные моющие компоненты включают без ограничения монофосфаты, дифосфаты, трифосфаты или олигомерные полифосфаты, в том числе соли щелочных металлов этих соединений, в том числе соли натрия. В некоторых вариантах осуществления моющий компонент может представлять собой триполифосфат натрия (STPP). В дополнение к этому композиция может содержать карбонат и/или цитрат. Другие подходящие не содержащие фосфат моющие компоненты включают гомополимеры и сополимеры поликарбоновых кислот и их частично или полностью нейтрализованных солей, мономерных поликарбоновых кислот и гидроксикарбоновых кислот и их солей. В некоторых вариантах осуществления соли упомянутых выше соединений включают аммониевые соли и/или соли щелочных металлов, т.е. соли лития, натрия и калия, включая соли натрия. Подходящие поликарбоновые кислоты включают ациклические, алициклические, гетероциклические и ароматические карбоновые кислоты, причем в некоторых вариантах осуществления они могут содержать по меньшей мере две карбоксильные группы, которые в каждом случае отделены друг от друга, в некоторых случаях, не более чем двумя атомами углерода.

[00130] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат одно или несколько хелатирующих средств. В одном варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 0,1% до приблизительно 15% или от приблизительно 3% до приблизительно 10% хелатирующего средства по весу композиции. Иллюстративные хелатирующие средства включают без ограничения, например, медь, железо, марганец и их смеси.

[00131] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат одну или несколько осаждающих добавок. Иллюстративные осаждающие добавки включают без ограничения, например, полиэтиленгликоль; полипропиленгликоль; поликарбоксилат; высвобождающие грязь полимеры, такие как, например, политерефталевая кислота; глины, такие как, например, каолинит, монтмориллонит, атапульгит, иллит, бентонит и галлуазит; и их смеси.

[00132] В других вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат одно или несколько средств против повторного осаждения или неионных поверхностно-активных веществ (которые могут предупреждать повторное осаждение грязи) (см., например, EP 2100949). Например, в композициях для ADW находят применение неионные поверхностно-активные вещества для целей изменения свойств поверхности, в частности, для защитного покрытия, во избежание образования пленки и пятен и для улучшения блеска. Такие неионные поверхностно-активные вещества также находят применение в предотвращении повторного осаждения грязи. В некоторых вариантах осуществления неионное поверхностно-активное вещество может представлять собой этоксилированные неионные поверхностно-активные вещества, эпокси-кэппированные поли(оксиалкилированные) спирты и аминоксидные поверхностно-активные вещества.

[00133] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат одно или несколько средств, подавляющих перенос красителя. Иллюстративные полимерные средства, подавляющие перенос красителя, включают без ограничения поливинилпирролидоновые полимеры, полиамин-N-оксидные полимеры, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны, поливинилимидазолы и их смеси. В одном варианте осуществления композиция содержит от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% или от приблизительно 0,1% до приблизительно 3% средства, подавляющего перенос красителя, по весу композиции.

[00134] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат один или несколько силикатов. Иллюстративные силикаты включают без ограничения силикаты натрия, например, дисиликат натрия, метасиликат натрия и кристаллические филлосиликаты. В некоторых вариантах осуществления силикаты присутствуют на уровне от приблизительно 1% до приблизительно 20% или от приблизительно 5% до приблизительно 15% по весу композиции.

[00135] В некоторых дополнительных вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат одно или несколько диспергирующих средств. Иллюстративные водорастворимые органические материалы включают без ограничения, например, гомо- или сополимерные кислоты или их соли, при этом поликарбоновая кислота содержит по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода.

[00136] В некоторых дополнительных вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат один или несколько стабилизаторов фермента. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор фермента представляет собой водорастворимый источник ионов кальция и/или магния. В некоторых вариантах осуществления стабилизаторы фермента включают олигосахариды, полисахариды и неорганические соли двухвалентных металлов, в том числе щелочноземельных металлов, такие как соли кальция. В некоторых вариантах осуществления ферменты, используемые в данном документе, стабилизируются присутствием водорастворимых источников ионов цинка (II), кальция (II) и/или магния (II) в конечных композициях, которые обеспечивают ферменты такими ионами, а также ионами других металлов (например, бария (II), скандия (II), железа (II), марганца (II), алюминия (III), олова (II), кобальта (II), меди (II), никеля (II) и оксованадия (IV)). Хлориды и сульфаты также находят применение в некоторых вариантах осуществления. Иллюстративные олигосахариды и полисахариды (например, декстрины) описаны, например, в WO 07/145964. В некоторых вариантах осуществления также находят применение ингибиторы обратной протеазы, такие как содержащие бор соединения (например, борат, 4-формилфенилбороновая кислота и производные фенилбороновой кислоты (такие как, например, описанные таким образом в WO 96/41859) и/или пептиальдегид, такой как, например, дополнительно описанный в WO 2009/118375 и WO 2013004636.

[00137] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат один или несколько отбеливателей, активаторов отбеливания и/или катализиторов отбеливания. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат одно или несколько неорганических и/или органических отбеливающих соединений. Иллюстративные неорганические отбеливатели включают без ограничения пергидратные соли, например, перборатные, перкарбонатные, перфосфатные, персульфатные и персиликатные соли. В некоторых вариантах осуществления неорганическими пергидратными солями являются соли щелочных металлов. В некоторых вариантах осуществления включены неорганические пергидратные соли в виде кристаллического твердого вещества, без дополнительной защиты, хотя в некоторых других вариантах осуществления соль является покрытой. Активаторами отбеливания, как правило, являются предшественники органических перкислот, которые усиливают отбеливающее действие в ходе очищения при значениях температуры 60°C и ниже. Иллюстративные активаторы отбеливания включают соединения, которые в условиях пергидролиза обеспечивают алифатические пероксикарбоновые кислоты, содержащие от приблизительно 1 до приблизительно 10 атомов углерода или от приблизительно 2 до приблизительно 4 атомов углерода, и/или необязательно замещенную пербензойную кислоту. Иллюстративные активаторы отбеливания описаны, например, в EP 2100949. Иллюстративные катализаторы отбеливания включают без ограничения триазациклононан магния и соответствующие комплексы, а также комплексы кобальта, меди, марганца и железа. Дополнительные иллюстративные катализиторы отбеливания описаны, например, в US 4246612; US 5227084; US 4810410; WO 99/06521 и EP 2100949.

[00138] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат один или несколько комплексов каталитических металлов. В некоторых вариантах осуществления находит применение содержащий металл катализатор отбеливания. В некоторых вариантах осуществления содержащий металл катализатор отбеливания содержит каталитическую систему, содержащую катион переходного металла с определенной каталитической активностью отбеливания (например, катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца), вспомогательный катион металла, обладающий незначительной каталитической активностью или не обладающий каталитической активностью (например, катионы цинка или алюминия), и секвестрирующее средство с определенными константами стойкости для каталитических и вспомогательных катионов металлов, в частности, этилендиаминтетрауксусная кислота, этилендиаминтетра(метиленфосфоновая кислота) и их водорастворимые соли (см., например, US 4430243). В некоторых вариантах осуществления одну или несколько композиций, описанных в данном документе, катализируют с помощью соединения марганца. Такие соединения и уровня применения описаны, например, в US 5576282. В дополнительных вариантах осуществления катализаторы отбеливания на основе кобальта находят применение и включены в одну или несколько композиций, описанных в данном документе. Различные катализаторы отбеливания на основе кобальта описаны, например, в USPN 5597936 и 5595967.

[00139] В некоторых дополнительных вариантах осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат комплекс переходного металла и макрополициклического жесткого лиганда (MRL). С практической точки зрения, а не в качестве ограничения, в некоторых вариантах осуществления композиции и способы очищения, описанные в данном документе, корректируют для обеспечения порядка по меньшей мере одной части на сто миллионов, от приблизительно 0,005 ppm до приблизительно 25 ppm, от приблизительно 0,05 ppm до приблизительно 10 ppm или от приблизительно 0,1 ppm до приблизительно 5 ppm активного MRL в моющей жидкости. Иллюстративные MRL включают без ограничения специальные сверхжесткие лиганды, которые соединяются поперечными мостиками, например, 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло(6.6.2)гексадекан. Иллюстративные содержащие металл MRL описаны, например, в WO 2000/32601 и US 6225464.

[00140] В другом варианте осуществления одна или несколько композиций, описанных в данном документе, содержат одно или несколько средств по уходу за металлом. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от приблизительно 0,1% до приблизительно 5% средства по уходу за металлом по весу композиции. Иллюстративные средства по уходу за металлом включают, например, алюминий, нержавеющую сталь и цветные металлы (например, серебро и медь). Дополнительные иллюстративные средства по уходу за металлом описаны, например, в EP 2100949, WO 94/26860 и WO 94/26859. В некоторых композициях средством по уходу за металлом является соль цинка.

[00141] В некоторых вариантах осуществления очищающая композиция представляет собой жидкую композицию высокой плотности (HDL), содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе. Жидкое моющее средство HDL для стирки может содержать моющее поверхностно-активное вещество (10-40%), содержащее анионное моющее поверхностно-активное вещество, выбранное из группы линейных, или разветвленных, или со случайной цепью замещенных или незамещенных алкилсульфатов, алкилсульфонатов, алкоксилированного алкилсульфата, алкилфосфатов, алкилфосфонатов, алкилкарбоксилатов и/или их смесей; и необязательно неионное поверхностно-активное средство, выбранное из группы линейного, или разветвленного, или со случайной цепью замещенного или незамещенного алкоксилированного алкилового спирта, например, этоксилированного C₈-C₁₈алкилового спирта и/или C₆-C₁₂алкилфенолалкоксилатов, при этом необязательно весовое соотношение анионного моющего поверхностно-активного вещества (с индексом гидрофильности (HIc) от 6,0 до 9) и неионного моющего поверхностно-активного вещества составляет более 1:1. Подходящие моющие поверхностно-активные вещества также включают катионные моющие поверхностно-активные вещества (выбранные из соединений алкилпиридиния, алкильных соединений четвертичного аммония, алкильных соединений четвертичного фосфония, алкильных соединений третичного сульфония и/или их смесей), цвиттерионные и/или амфотерные моющие поверхностно-активные вещества (выбранные из алканоламинсульфобетаинов), амфолитические поверхностно-активные вещества, полуполярные неонионные поверхностно-активные вещества и их смеси.

[00142] Композиция необязательно может содержать усиливающий поверхностно-активные свойства полимер, состоящий из амфифильных алкоксилированных очищающих грязь полимеров, выбранных из группы алкоксилированных разветвленных полимеров с гидрофильными и гидрофобными свойствами, таких как алкоксилированные полиалкиленимины, в диапазоне 0,05 вес. % - 10 вес. %, и/или статистических привитых полимеров, как правило, содержащих гидрофильную основную цепь, включающую мономеры, выбранные из группы, состоящей из ненасыщенных C₁-C₆карбоновых кислот, эфиров, спиртов, альдегидов, кетонов, сложных эфиров, звеньев сахаров, алкокси звеньев, малеинового ангидрида, насыщенных полиспиртов, таких как глицерин, и их смесей; и гидрофобную (гидрофобные) боковую (боковые) цепь (цепи), выбранную (выбранные) из группы состоящей из C₄-C₂₅алкильной группы, полипропилена, полибутилена, винилового эфира насыщенной C₂-C₆монокарбоновой кислоты, C₁-C₆алкилового эфира акриловой или метакриловой кислоты и их смесей.

[00143] Композиция может содержать дополнительные полимеры, такие как высвобождающие грязь полимеры, включающие, например, сложные полиэфиры с защищенными анионными концами, например, SRP1, полимеры, содержащие по меньшей мере одно мономерное звено, выбранное из сахарида, дикарбоновой кислоты, полиола и их комбинаций, со статистической или блок-конфигурацией; полимеры на основе этилентерефталата и его сополимеры со статистической или блок-конфигурацией, например, Repel-o-tex SF, SF-2 и SRP6, Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 и SRN325, Marloquest SL; полимеры, препятствующие повторному осаждению (от 0,1 вес. % до 10 вес. %, в том числе, например, карбоксилатные полимеры, такие как полимеры, содержащие по меньшей мере один мономер, выбранный из акриловой кислоты, малеиновой кислоты (или малеинового ангидрида), фумаровой кислоты, итаконовой кислоты, аконитовой кислоты, мезаконовой кислоты, цитраконовой кислоты, метиленмалоновой кислоты и любой их смеси, винилпирролидоновый гомополимер и/или полиэтиленгликоль с молекулярной массой в диапазоне от 500 до 100000 Да); полимеры целлюлозы (в том числе, например, алкилцеллюлозу, алкилалкоксиалкилцеллюлозу, карбоксиалкилцеллюлозу, алкилкарбоксиалкилцеллюлозу, примеры которой включают карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, метилгидроксиэтилцеллюлозу, метилкарбоксиметилцеллюлозу; и их смеси) и полимерные карбоксилаты (такие как, например, статический сополимер малеата/акрилата или полиакрилатный гомополимер).

[00144] Композиция может дополнительно содержать насыщенную или ненасыщенную жирную кислоты, предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C₁₂-C₂₄жирную кислоту (0-10 вес. %); осаждающие добавки (в том числе, например, полисахариды, целлюлозные полимеры, галогениды полидиаллилдиметиламмония (DADMAC) и сополимеры DADMAC с винилпирролидоном, акриламиды, имидазолы, галогениды имидазолиния и их смеси, со статистической или блок-конфигурацией, катионную гуаровую камедь; катионную целлюлозу, такую как катионную гидроксиэтилцеллюлозу; катионный крахмал; катионные полиакриламиды; и их смеси.

[00145] Композиция может дополнительно содержать средства, подавляющие перенос красителей, примеры которых включают фталоцианин марганца, пероксидазы, поливинилпирролидодновые полимеры, полиамин-N-оксидные полимеры, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и полививнилимидазолы и/или их смеси; хелатирующие средства, примеры которых включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентаметиленфосфоновую кислоту (DTPMP), гидроксиэтандифосфоновую кислоту (HEDP), этилендиамин-N,N'-диянтарную кислоту (EDDS), метилглициндиуксусную кислоту (MGDA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), пропилендиаминтетрауксусную кислоту (PDT A), 2-гидроксипиридин-N-оксид (HPNO) или метилглициндиуксусную кислоту (MGDA), глутаминовую N,N-диуксусную кислоту (тетранатриевую соль N,N-дикарбоксиметилглутаминовой кислоты, GLDA), нитрилотриуксусную кислоту (NTA), 4,5-дигидрокси-м-бензолдисульфокислоту, лимонную кислоту и любую ее соль, N-гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусную кислоту (HEDTA), триэтилентетраамингексауксусную кислоту (TTHA), N-гидроксиэтилиминодиуксусную кислоту (HEIDA), дигидроксиэтилглицин (DHEG), этилендиаминтетрапропионовую кислоту (EDTP) и их производные.

[00146] Композиция может дополнительно содержать гасители пены на основе силикона или жирной кислоты; стабилизатор фермента; оттеночные красители, катионы кальция и магния, ингредиенты визуальной сигнализации, противовспенивающее средство (от 0,001 до приблизительно 4,0 вес. %) и структурообразующий компонент/загуститель (0,01-5 вес. %), выбранный из группы, состоящей из диглицеридов, триглицеридов, этиленгликольдистеарата, микрокристаллической целлюлозы, материалов на основе целлюлозы, микроволокнистой целлюлозы, биополимеров, ксантановой камеди, геллановой камеди и их смесей.

[00147] В некоторых вариантах осуществления очищающая композиция представляет собой порошкообразную композицию высокой плотности (HDD), содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе. Порошкообразное моющее средство HDD для стирки может содержать моющее поверхностно-активное вещество, в том числе анионные моющие поверхностно-активные вещества (выбранные из линейных, или разветвленных, или со случайной цепью замещенных или незамещенных алкилсульфатов, алкилсульфонатов, алкоксилированного алкилсульфата, алкилфосфатов, алкилфосфонатов, алкилкарбоксилатов и/или их смесей), неионное моющее поверхностно-активное вещество (выбранное из линейных, или разветвленных, или со случайной цепью замещенных или незамещенных C₈-C₁₈алкилэтоксилатов и/или C₆-C₁₂алкилфенолалкоксилатов), катионные моющие поверхностно-активные вещества (выбранные из соединений алкилпиридиния, соединений четвертичного алкиламмония, соединений четвертичного алкилфосфония, соединений третичного алкилсульфония и их смесей), цвиттерионные и/или амфотерные моющие поверхностно-активные вещества (выбранные из алканоламинсульфобетаинов); амфолитические поверхностно-активные вещества; полуполярные неионные поверхностно-активные вещества и их смеси; моющие компоненты (бесфосфатные моющие компоненты, например, цеолитные моющие компоненты, примеры которых включают цеолит A, цеолит X, цеолит P и цеолит MAP в диапазоне от 0 до менее 10 вес. %); фосфатные моющие компоненты, например, три-полифосфат натрия в диапазоне от 0 до менее 10 вес. %; лимонную кислоту, цитратные соли и нитрилотриуксусную кислоту или ее соль в диапазоне менее 15 вес. %; силикатную соль (силикат натрия или калия, или метасиликат натрия в диапазоне от 0 до менее 10 вес. %, или слоистый силикат (SKS-6)); карбонатную соль (карбонат натрия и/или бикарбонат натрия в диапазоне от 0 до менее 10 вес. %) и отбеливающие средства (фотоотбеливатели, например, сульфонированные фталоцианины цинка, сульфонированные фталоцианины алюминия, ксантановые красители и их смеси); гидрофобные или гидрофильные активаторы отбеливания (например, додеканоил оксибензолсульфонат, деканоилоксибензолсульфонат, деканоилоксибензойную кислоту или ее соли, 3,5,5-триметилгексаноилоксибензолсульфонат, тетраацетилэтилендиамин-TAED и нонаноилоксибензолсульфонат-NOBS, соединения четвертичного нитриламмония и их смеси); пероксид водорода; источники пероксида водорода (неорганические пергидратные соли, например, моно- или тетрагидрат натриевой соли пербората, перкарбоната, персульфата, перфосфата или персиликата); предварительно образованные гидрофильные и/или гидрофобные перкислоты (выбранные из перкарбоновых кислот и солей, перугольных кислот и солей, перимидокислот и солей, пероксимоносерных кислот и солей) и их смеси, и/или катализатор отбеливания (например, иминовые усилители отбеливания, такие как катионы и полиионы иминия; цвиттерионы иминия; модифицированные амины; модифицированные аминоксиды; N-сульфонилимины; N-фосфонилимины; N-ацилимины; тиадиазолдиоксиды; перфторимины; циклические кетоны сахаров и их смеси); содержащий металл катализатор отбеливания (например, катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца наряду со вспомогательными катионами металла, такого как цинк или алюминий, и секвестрирующее средство, такое как этилендиаминтетрауксусная кислота, этилендиаминтетра(метиленфосфоновая кислота) и их растворимые в воде соли).

[00148] Композиция может дополнительно содержать дополнительные моющие ингредиенты, в том числе микрокапсулы отдушки, смеси отдушек в оболочке из крахмала, стабилизаторы фермента, оттеночные средства, дополнительные полимеры, включающие полимеры для прочности ткани и катионные полимеры, ингредиенты, закрепляющие краситель, смягчители ткани, осветители (например, C.I. флуоресцентные осветители), флоккулянты, хелатирующие средства, алкоксилированные полиамины, добавки для осаждения на ткани и/или циклодекстрин.

[00149] В некоторых вариантах осуществления очищающая композиция представляет собой моющую композицию для ADW, содержащую один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе. Моющая композиция для ADW может содержать два или более неионных поверхностно-активных веществ, выбранных из этоксилированных неионных поверхностно-активных веществ, спиртовых алкоксилированных поверхностно-активных веществ, эпокси-кэппированных поли(оксиалкилированных) спиртов и аминоксидных поверхностно-активных веществ, присутствующих в количествах 0-10% по весу; моющих компонентов в диапазоне 5-60%, либо содержащих фосфат (монофосфатов, дифосфатов, триполифосфатов или олигомерных полифосфатов), натрия триполифосфата-STPP, либо бесфосфатных моющих компонентов (соединений на основе аминокислот, например, MGDA (метил-глицин-диуксусную кислоту), а также ее соли и производные, GLDA (глутамин-N,N-диуксусную кислоту), а также ее соли и производные, IDS (иминодиянтарную кислоту), а также ее соли и производные, карбоксиметилинулин, а также его соли и производные, и их смеси, нитрилотриуксусную кислоту (NTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) и B-анилиндиуксусную кислоту (B-ADA) и ее соли), гомополимеров и сополимеров поликарбоновых кислот и их частично или полностью нейтрализованных солей, мономерных поликарбоновых кислот и гидроксикарбоновых кислот, а также их солей в диапазоне 0,5-50% по весу; сульфонатных/карбоксилированных полимеров (обеспечивающих размерную стабильность продукта) в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 50% по весу; добавок для сушки в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% по весу (выбранных из сложных полиэфиров, особенно анионных сложных полиэфиров, необязательно вместе с дополнительными мономерами с 3-6 функциональными группами, которые обеспечивают поликонденсацию, особенно функциональными группами кислоты, спирта или сложного эфира, поликарбонатных, полиуретановых и/или полемочевина-полиорганосилоксановых соединений или их соединений-предшественников типа реакционноспособного циклического карбоната и мочевины); силикатов в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 20% по весу (силикатов натрия или калия, например, дисиликата натрия, метасиликата натрия и кристаллических филлосиликатов); отбеливателя неорганического (например, солей пергидрата, таких как перборатные, перкарбонатные, перфосфатные, персульфатные и персиликатные соли) и органического (например, органических пероксикислот, в том числе диацил- и тетраацилпероксидов, особенно дипероксидодекандионовой кислоты, диперокситетрадекандионовой кислоты и дипероксигексадекандионовой кислоты); активаторов отбеливания - предшественников органических перкислот в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 10% по весу; катализаторов отбеливания (выбранных из марганца триазациклононана и родственных комплексов, Co, Cu, Mn и Fe биспиридиламина и родственных комплексов, а также пентаминацетата кобальта(III) и родственных комплексов); средств по уходу за металлом в диапазоне от приблизительно 0,1-5% по весу (выбранных из бензатриазолов, солей, и комплексов, и силикатов металлов); ферментов в диапазоне от приблизительно 0,01 до 5,0 мг активного фермента на грамм моющей композиции для ADW (ацилтрансфераз, альфа-амилаз, бета-амилаз, альфа-галактозидаз, арабинозидаз, арилэстераз, бета-галактозидаз, каррагиназ, каталаз, целлобиогидролаз, целлюлаз, хондроитиназ, кутиназ, эндо-бета-1,4-глюканаз, эндо-бета-маннаназ, эстераз, экзоманнаназ, галактаназ, глюкоамилаз, гемицеллюлаз, гиалуронидаз, кератиназ, лакказ, лактаз, лигниназ, липаз, липоксигеназ, маннаназ, оксидаз, оксидоредуктаз, пектатлиаз, пектинацетилэстераз, пектиназ, пентозаназ, пероксидаз, фенолоксидаз, фосфатаз, фосфолипаз, фитаз, полиэстераз, полигалактуроназ, протеаз, пуллуланаз, редуктаз, рамногалактуроназ, бета-глюканаз, танназ, трансглутаминаз, ксиланацетилэстераз, ксиланаз, ксилоглюканаз, ксилозидаз и их смесей); и компонентов-стабилизаторов ферментов (выбранных из олигосахаридов, полисахаридов и неорганических солей двухвалентных металлов).

[00150] Дополнительные варианты осуществления направлены на композиции и способы обработки тканей (например, для расшлифтования текстиля) с помощью одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе. Способы обработки тканей хорошо известны из уровня техники (см., например, US 6077316). Например, тактильные качества и внешний вид ткани можно улучшить с помощью способа, предусматривающего приведение ткани в контакт с вариантом, описанным в данном документе, в растворе. Ткань можно обрабатывать раствором под давлением.

[00151] Один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, можно наносить во время или после плетения текстиля, во время стадии расшлифтовывания или одной или нескольких дополнительных стадий обработки ткани. При плетении текстиля нити подвергаются значительному механическому напряжению. Перед плетением на механических ткацких станках нити основы часто покрывают шлихтовочным крахмалом или производными крахмала для повышения их прочности на растяжение и для предотвращения разрыва. Один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, можно наносить во время или после плетения природных волокон, таких как шерсть или шелк. После плетения вариант может быть использован для усиления окрашивания и смягчения ткани. Один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, могут быть использованы в отдельности или с другими расшлифтовывающими химическими реагентами и/или расшлифтовывающими ферментами для расшлифтовывания тканей, в том числе тканей, содержащих хлопок, в качестве моющих дополнительных средств, например, в водных композициях. Целлюлаза также может быть использована в композициях и способах получения вареного вида на окрашенной индиго джинсовой ткани и швейных изделиях. Амилаза также может быть использована в композиции и способах расшлифтовывания текстильных изделий. В производстве одежды ткань может быть раскроена и сшита в одежду или швейные изделия, на которых затем получают требуемую отделку. В частности, в производстве джинсов из джинсовой ткани разработаны различные ферментативные способы окончательной отделки.

[00152] Один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, могут быть использованы для удаления белков из животных и их последующего разложения или удаления, например, перьев, кожи, волос и шкуры. В некоторых случаях погружение туши животного в раствор, содержащий один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, может способствовать защите кожи от разрушения по сравнению с традиционным погружением в воду для обваривания или процессом удаления перьев. В одном варианте осуществления перья могут быть обрызганы одним или несколькими вариантами субтилизина, описанными в данном документе, в условиях, подходящих для переваривания или инициации разложения оперения. В некоторых вариантах осуществления вариант может быть использован в комбинации с окисляющим средством.

[00153] В некоторых вариантах осуществления удаление масла или жира, ассоциированного с необработанными перьями, может происходить с участием одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, используют в композициях для очистки перьев, а также для дезинфекции и частично обезвоживания волокон. В еще одних вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, находят применение в выделении белка из оперения. В некоторых других вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, применяют в моющем растворе в комбинации с 95% этанолом или другим полярным органическим растворителем с поверхностно-активным веществом или без него при содержании приблизительно 0,5% (об./об.). В других вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, могут быть применены в отдельности или в комбинации с подходящими способами обработки перьев и протеолитическими способами, такими как таковые, раскрытые в PCT/EP2013/065362, PCT/EP2013/065363 и PCT/EP2013/065364. В некоторых вариантах осуществления выделенный белок можно впоследствии применять в корме для животных и рыб.

[00154] В еще одном варианте осуществления одна или несколько композиций корма для животных, дополнительное средство для корма для животных и/или пища для домашних животных содержат один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе. Другие варианты осуществления направлены на способы получения такой композиции корма для животных, дополнительного средства для корма для животных и/или пищи для животным, предусматривающие смешивание одного или нескольких вариантов субтилизина, описанных в данном документе, с одним или несколькими ингредиентами корма для животных и/или дополнительными ингредиентами корма для животных и/или ингредиентами пищи для домашних животных.

[00155] Термин "животное" включает всех нежвачных и жвачных животных. В конкретном варианте осуществления животное представляет собой нежвачное животное, такое как лошадь и животное с однокамерным желудком. Примеры животных с однокамерным желудком включают без ограничения свиней и домашних свиней, таких как поросята, выращиваемые свиньи, свиноматки; птицу, такую как индюшки, утки, куры, бройлерные цыплята, несушки; рыбу, такую как лосось, форель, тилапия, сомы и карпы; и ракообразные, такие как мелкие креветки и крупные креветки. В еще одном варианте осуществления животное представляет собой жвачное животное, в том числе без ограничения крупный рогатый скот, телята, козы, овцы, жирафы, бизон, американский лось, лось, яки, буйвол, олень, верблюды, альпаки, ламы, антилопа, вилорогая антилопа и антилопа нильгау.

[00156] В данном контексте предполагается, что термин "пища для домашних животных" означает пищу для животных, содержащихся дома, таких как без ограничения собаки, кошки, песчанки, хомячки, шиншиллы, необычные крысы, морские свинки; домашние птицы, такие как канарейки, длиннохвостые попугаи и попугаи; домашние рептилии, такие как черепахи, ящерицы и змеи; водные домашние животные, такие как тропические рыбки и лягушки.

[00157] Термины "композиция корма для животных", "кормовой продукт" и "фураж" используются взаимозаменяемо и могут представлять собой один или несколько кормовых материалов, выбранных из a) зерновых, таких как мелкозерновые (например, пшеница, ячмень, рожь, овес и их комбинации) и/или крупнозерновые, такие как кукуруза и копра, b) субпродукты зерновых культур, такие как кукурузная клейковина, высушенные растворимые вещества барды (DDGS) (в частности, высушенные растворимые вещества барды на основе кукурузы (cDDGS), пророщенная пшеница, пшеничные отруби, пшеничные мелкие отруби, пророщенный рис, рисовая шелуха, овсяная шелуха, пальмовые зародыши и цитрусовая пульпа, c) белок, полученный из таких источников, как соя, подсолнечник, арахис, люпин, горох, бобы, хлопок, рапс, рыбная мука, высушенный белок плазмы, мясо и костная мука, картофельный белок, сыворотка, копра, кунжут, d) масла и жиры, полученные из источников растительного и животного происхождения; е) минералы и витамины.

[00158] Один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, находят дополнительное применение в опосредованном ферментом отбеливании бумажной массы, такой как виды целлюлозы, полуцеллюлозы, крафт-целлюлозы, механической целлюлозы или масса, полученная с помощью сульфитного способа. В общем виде бумажную массу инкубируют с одним или несколькими вариантами субтилизина, описанными в данном документе, в условиях, подходящих для отбеливания бумажной массы.

[00159] В некоторых вариантах осуществления масса представляет собой бесхлорную массу, отбеленную кислородом, озоном, пероксидом или пероксикислотами. В некоторых вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, используют в опосредованном ферментом отбеливании массы, полученной с помощью модифицированных или непрерывных способов варки, которые характеризуются низким содержанием лигнина. В некоторых других вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, применяют в отдельности или предпочтительно в комбинации с ферментами ксиланазой и/или эндоглюканазой и/или альфа-галактозидазой и/или целлобиогидролазой.

[00160] В других вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, находят дополнительное применение в опосредованном ферментом удалении ткани. Это включает удаление мертвой или поврежденной ткани, например, удаление из ран для содействия заживлению.

[00161] В еще одних дополнительных вариантах осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, находят дополнительное применение в культивировании тканей. В частности, один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, могут быть использованы для суспендирования или ресуспендирования клеток, прилегающих к стенке культуры клеток, например, во время процесса сбора клеток. В другом варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, могут быть использованы для расщепления белковых связей между культивируемыми клетками и культуральной чашкой, обеспечивая суспендирование клеток в растворе.

[00162] В еще одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, находят дополнительное применение в качестве пищевой добавки, способствующего пищеварению средства и/или способствующего обработки пищи средства.

[00163] В еще одном варианте осуществления один или несколько вариантов субтилизина, описанных в данном документе, находят дополнительное применение в обработке кожи путем удаления волос из шкур животных, замачивания, обезжиривания или смягчения, что представляет собой процесс, включающий разрушение неструктурных белков во время изготовления кожи.

ПРИМЕРЫ

[00164] Аспекты штаммов, композиций и способов по настоящему изобретению могут быть дополнительно поняты в свете следующих примеров, которые не следует подразумевать как ограничивающие. Модификации материалов и способов будут очевидны для специалистов в данной области техники.

ПРИМЕР 1

Конструкция вариантов субтилизина B. lentus

[00165] Манипуляции с ДНК для получения вариантов субтилизина B. lentus осуществляли с помощью стандартных методик молекулярной биологии (см., например, Sambrook et al, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Все субтилизины экспрессировали и выделяли, как описано в следующих примерах. Создавали ряд искусственных последовательностей ДНК, кодирующих зрелые последовательности субтилизина B. lentus, которые вводят множественные аминокислотные модификации в последовательность протеазы B. lentus P29600 (UniProtKB SUBS_BACL) (SEQ ID NO: 6).

[00166] ДНК-кассеты, содержащие промотор B. subtilis aprE (SEQ ID NO: 1), сигнальный пептид B. subtilis aprE (SEQ ID NO: 2), пропептид из B. lentus (SEQ ID NO: 4) и последовательность, соответствующую гену субтизина B. lentus P29600, синтезировали с помощью ПЦР-амплификации. Перечень вариантов субтилизина B. lentus P29600, которые получали, приведен в данном документе ниже в таблице 2, с мутациями, описанными по отношению к P29600 с использованием нумерации BPN'.

[00167] ПЦР-фрагменты использовали для трансформации 200 мкл компетентных клеток B. subtilis подходящего штамма. Трансформированные клетки инкубировали при 37°C в течение 1 часа, встряхивая при этом при 250 об./мин. Клетки из смеси для трансформации высевали на планшеты LA, содержащие 1,6% обезжиренного молока и 5 ppm хлорамфеникола (CMP) и инкубировали при 37°C. По одной колонии, полученной в результате каждой из трансформаций, собирали и выращивали в бульоне Луриа+5 ppm CMP при 37°C. Образец каждого штамма замораживали при -80°C с 20% глицерином.

ПРИМЕР 2

Гетерологичная экспрессия вариантов субтилизина Bacillus lentus P29600

[00168] Для получения вариантов субтилизина B. lentus P29600, изложенных в таблица 2, штаммы-хозяева B. Subtilis, трансформированные различными ПЦР-фрагментами, культивировали в обогащенных полуопределенных средах на основе буфера MOP, с мочевиной в качестве источника азота, глюкозой в качестве основного источника углерода и с добавлением 1% сойтона для устойчивого роста клеток. После инкубации секретируемые протеазы выделяли из питательной среды путем центрифугирования и фильтрации. Осветленные супернатанты культур использовали для анализов, описанных ниже.

ПРИМЕР 3

Протеазная активность вариантов субтилизина Bacillus lentus P29600

[00169] Протеазную активность субтилизина B. lentus P29600 и его вариантов исследовали путем измерения гидролиза N-suc-AAPF-pNA. Растворы реагентов, используемых для анализа гидролиза AAPF, были следующими: 100 мМ Tris/HCl pH 8,6, содержащий 0,005% TWEEN®-80 (буфер для разведения Tris); 100 мМ буфер Tris pH 8,6, содержащий 10 мМ CaCl₂ и 0,005% TWEEN®-80 (буфер Tris/Ca); и 160 мМ suc-AAPF-pNA в DMSO (исходный раствор suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388). Для получения рабочего раствора субстрата 1 мл исходного раствора suc-AAPF-pNA добавляли к 100 мл буфера Tris/Ca и тщательно смешивали. Образец фермента добавляли в микротитровальный планшет (MTP) (Greiner 781101), содержащий 1 мг рабочего раствора suc-AAPF-pNA и анализировали в отношении активности при 405 нм в течение 3 минут с использованием планшет-ридера SpectraMax в кинетическом режиме при комнатной температуре (RT). Поглощение холостого раствора, не содержащего протеазу, вычитали из показания каждого образца. Активность протеазы выражали в mOD⋅мин.^-1.

ПРИМЕР 4

Измерение очищающего действия и стабильности вариантов субтилизина Bacillus lentus P29600

[00170] Концентрацию протеаз в супернатанте культуры определяли с помощью UHPLC с использованием колонки Zorbax 300 SB-C3. Супернатант культуры разводили соответствующим образом в буфере для разведения (Tris 25 мМ, pH 7,4, 5 мМ CaCl₂). Образцы элюировали из колонки с использованием градиента буфера A (0,1% трифторуксусная кислота) и буфера B (0,07% ацетонитрил). Концентрацию белка в образцах рассчитывали на основании стандартной кривой очищенного родительского фермента.

[00171] Очищающее действие каждого варианта субтилизина B. lentus P29600 измеряли в применениях с использованием чашки (ADW) с помощью формулы GSM-B (см. таблицу 1), pH 10,5 и микрообразцов яичного желтка (PAS-38, Центр материалов для испытаний BV, Влардинген, Нидерланды). Предварительно измельченные образцы PAS-38, которые использовали в эксплуатационных анализах при ADW, либо ополаскивали, либо не ополаскивали. Для получения прополосканных образцов PAS38 180 мкл 10 мМ буфера CAPS pH 11 добавляли к MTP, содержащим микрообразцы PAS38. MTP герметизировали и инкубировали в инкубаторе iEMS в течение 30 мин при 60°C и при встряхивании при 1100 об/мин. После инкубирования буфер удаляли и образцы ополаскивали деионизированной водой для удаления остаточного буфера. MTP высушивали на воздухе до применения в эксплуатационном анализе. Планшеты с микрообразцами перед добавлением фермента заполняли посредством 3 г/л раствора GSM-B в воде с жесткостью 374 ppm.

[00172] Очищающее действие при стирке (HDL) каждого варианта субтилизина B. lentus P29600 исследовали с помощью микрообразцов BMI (кровь/молока/чернила на хлопчатобумажной ткани) (EMPA-116, Центр материалов для испытаний BV, Влардинген, Нидерланды). Использовали планшеты, заполненные предварительно измельченными (для того, чтобы подходить к MTP) микрообразцами. Планшеты с микрообразцами заполняли перед добавлением фермента посредством 2,7 г/л жидкого моющего средства Persil Non-Bio (Unilever) в воде с жесткостью 250 ppm, который представляет собой коммерческое жидкое моющее средство, которое не содержит бор или ферменты и которое приобретали для применения в этом тесте.

[00173] После инкубации (образцы PAS-38, икубировали в течение 30 мин при 40°C и образцы EMPA116 инкубировали в течение 15 мин при 25°C) считывали поглощение при 405 нм в случае образцов EMPA-116 и PAS-38 с помощью планшет-ридера SpectraMax. Результаты поглощения получали путем вычитания значения холостого контрольного раствора (без фермента) из каждого значения образца (далее в данном документе "поглощение за вычетом холостого образца"). Для каждого условия и варианта субтилизина B. lentus P29600 индекс продуктивности (PI) рассчитывали путем деления поглощения за вычетом холостого образца на таковое родительской протеазы при той же концентрации. Значение родительской протеазы определяли исходя из стандартной кривой родительской протеазы, которую включали в исследование и которую подгоняли под аппроксимацию с использованием сигмоидного уравнения Ленгмюра или сигмоидного уравнения Хилла.

Таблица 1. Ингредиенты бесфосфатных моющих средств GSM-B pH 10,5 для ADW Компонент Весовой % Безводный цитрат натрия 30,0 Натриевая соль сополимера малеиновой кислоты/акриловой кислоты (SOKALAN^® CP5; BASF) 12,0 Моногидрат пербората натрия 5,0 TAED 2,0 Дисиликат натрия: Protil A (Cognis) 25,0 Этоксилат линейного жирного спирта 2,0 Безводный карбонат натрия Добавить до 100

[00174] Для измерения стабильности подходящие разведения вариантов субтилизина B. lentus P29600 выполняли в стрессовом буфере. Затем протеолитическую активность протеаз измеряли перед и после стадии тепловой инкубации с помощью анализа AAPF, описанного в примере 3. Температуру и продолжительность стадии тепловой инкубации выбирали таким образом, что эталонная протеаза характеризовалась ~30% остаточной активностью. Стабильность измеряли в буферном состоянии Tris-EDTA (50 мМ Tris pH 9; 1 мМ EDTA; 0,005% Tween). % остаточных активностей рассчитывали в результате получения соотношения стрессовой и нестрессовой активности и умножения на 100. PI стабильности получали путем деления остаточной активности варианта субтилизина B. lentus P29600 на таковую родительской протеазы.

[00175] Субтилизин B. lentus P29600 представлял собой родительскую протеазу, используемую для расчета очищающего действия, а результаты стабильности изложены в таблицах 3A и 3B. Перечень вариантов субтилизина B. lentus P29600, которые получали, приведен в данном документе ниже в таблице 2, с мутациями, описанными по отношению к P29600 с использованием нумерации BPN'.

Таблица 2. Перечень вариантов субтилизина B. lentus P29600 с мутациями по отношению к P29600 ID образца Мутации по отношению к P29600 (нумерация P29600) Мутации по отношению к P29600 (нумерация BPN') SEQ ID NO P29600-10839 P39E-T56Y-E87D-N114Q-N242D P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D 14 P29600-10860 P39E-T56Y-E87D-N114Q P40E-T58Y-E89D-N116Q 20 P29600-10832 P39E-E87D-N242D P40E-E89D-N248D 12 P29600-10851 T56Y-S99R-N114Q-S126T T58Y-S101R-N116Q-S128T 18 P29600-10901 P39E-S99R-S126T-N242D P40E-S101R-S128T-N248D 24 P29600-10905 P39E-S99R-S128A-N242D P40E-S101R-S130A-N248D 25 P29600-10829 P39E-E87D-S099R-S126T-N242D P40E-E89D-S101R-S128T-N248D 10 P29600-10823 P39E-E87D-S99R-S128A-N242D P40E-E89D-S101R-S130A-N248D 8 P29600-10849 S99R-S126T-N242D S101R-S128T-N248D 17 P29600-10835 P39E-E087D P40E-E089D 13 P29600-10895 P39E-S99R-S126T-S128A-N242D P40E-S101R-S128T-S130A-N248D 23 P29600-10824 P09E-E87D-S99R-S126T P40E-E89D-S101R-S128T 9 P29600-10846 T56Y-N114Q T58Y-N116Q 16 P29600-10844 S99R-S126T S101R-S128T 15 P29600-10853 T56Y-S99R-N114Q-S126T-N242D T58Y-S101R-N116Q-S128T-N248D 19 P29600-10833 T56Y-S99R-N114Q-S128A-N242D T58Y-S101R-N116Q-S130A-N248D 11 P29600-10890 P39E-S99R-S128A P40E-S101R-S130A 22 P29600-10821 P39E-E87D-S99R-S128A P40E-E89D-S101R-S130A 7 P29600-10885 P39E-S99R-S126T P40E-S101R-S128T 21 Таблица 3A. Очищающее действие и стабильность при ADW вариантов субтилизина Bacillus lentus P29600 ID образца PI ADW pH 10,5 - прополосканное яичное загрязнение ADW pH 10,5 - непрополосканное яичное загрязнение Стабильность в EDTA P29600-10839 0,9 1,0 1,3 P29600-10860 0,9 1,0 1,3 P29600-10832 1,0 1,0 1,3 P29600-10851 1,0 1,6 1,3 P29600-10901 1,0 1,6 1,3 P29600-10905 0,9 2,0 1,2 P29600-10829 1,0 1,7 1,2 P29600-10823 1,0 1,5 1,2 P29600-10849 0,9 1,5 1,2 P29600-10835 1,2 1,2 1,1 P29600-10895 1,0 2,0 1,1 P29600-10824 1,1 2,2 1,0 P29600-10846 1,0 0,8 1,0 P29600-10844 1,0 2,0 1,0 P29600-10853 1,0 1,5 1,0 P29600-10833 0,9 1,3 1,0 P29600-10890 1,0 2,3 0,9 P29600-10821 1,2 2,1 0,9 P29600-10885 1,0 2,7 0,9

Таблица 3B. Очищающее действие и стабильность HDL вариантов субтилизина Bacillus lentus P29600 ID образца PI не содержащих бор HDL, pH 8,2, загрязнение от BMI P29600-10835 1,3 P29600-10832 1,2 P29600-10860 1,2 P29600-10839 1,2

ПРИМЕР 5

Экспрессия дополнительных вариантов субтилизина B. lentus P29600

[00176] Манипуляции с ДНК для получения родительского субтилизина B. lentus P29600 (UnitProtKB_ SUBS_BACL) (GG36) (SEQ ID NO: 6) и его вариантов осуществляли с помощью стандартных методик молекулярной биологии (см., например, Sambrook et al, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Получали ряд искусственных последовательностей ДНК, которые кодируют зрелые последовательности варианта субтилизина с аминокислотными модификациями, включенными в последовательность родительского субтилизина. Все субтилизины экспрессировали и выделяли, как описано ниже в данном документе. Образцы протеаз для исследований, описанных в данном документе, получали путем культивирования клеток в среде для избирательного выращивания в 96-луночном MTP при 31°C в течение 68 часов. Супернатант культуры получали путем центрифугирования и фильтрации.

[00177] Родительский субтилизин B. lentus P29600 (SEQ ID NO: 6) и его варианты экспрессировали с использованием фрагментов ДНК, содержащих фланкирующую область 5'AprE, которая содержит промоторную последовательность B. subtilis SEQ ID NO: 27 (описанную в US2014-0329309), сигнальную пептидную последовательность aprE (SEQ ID NO: 28), пропоследовательность из B. lentus (SEQ ID NO: 3), последовательность, соответствующую гену субтилизина B. lentus P29600 (SEQ ID NO: 29) и последовательностям его вариантов, терминатор BPN' (SEQ ID NO: 30), кассету экспрессии гена хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) из S. aureus (SEQ ID NO: 31) и фланкирующую последовательность 3'AprE (SEQ ID NO: 32) в последовательном порядке собирали с помощью стандартных молекулярных методик. Аминокислотная последовательность сигнального пептида aprE B. subtilis, кодируемого SEQ ID NO: 28, изложена под SEQ ID NO: 33. Аминокислотная последовательность пропоследовательности, кодируемой SEQ ID NO: 3, изложена под SEQ ID NO: 4. Аминокислотная последовательность белка, кодируемого геном субтилизина B. lentus P29600, изложена под SEQ ID NO: 6. Эту линейную кассету экспрессии B. lentus P29600 использовали для трансформации 200 мкл компетентных клеток B. subtilis подходящего штамма. Трансформированные клетки инкубировали при 37°C в течение 1 часа, встряхивая при этом при 250 об/мин. Смесь для трансформации высевали на планшеты LA, содержащие 1,6% обезжиренного молока и 5 ppm хлорамфеникола (CMP) и инкубировали при 37°C. Одиночные колонии собирали и выращивали в бульоне Лурия+5 ppm CMP при 37°C. Образцы штамма замораживали при -80°C с 20% глицерином для хранения.

[00178] Геномную ДНК штамма B. subtilis, экспрессирующего родительский субтилизин B. lentus P29600, выделяли и использовали в качестве матрицы для получения вариантов области зрелой протеазы B. lentus P29600. Библиотеку вариантов, содержащих конкретные аминокислотные замены, создавали с помощью полимеразной цепной реакции с подходящими парами праймеров, матрицей ДНК и полимеразой Q5 (New England Biolabs). Эти собранные фрагменты использовали для трансформации компетентных клеток B. subtilis, а трансформанты обрабатывали, как описано выше.

[00179] Варианты субтилизина B. lentus P29600, которые получали, приведены ниже в таблице 4, с положениями аминокислотных замен, описанных по отношению как к дикому типу BPN', так и родительскому штамму B. lentus P29600. Последовательность каждого варианта субтилизина, изложенного в таблице 4, подтверждали с помощью анализа последовательности ДНК.

ПРИМЕР 6

Продуктивность различных вариантов субтилизина B. lentus P29600

[00180] Родительский субтилизин B. lentus P29600 (SEQ ID NO: 6) и его дополнительные варианты, приведенные ниже в таблице 4, получали, как изложено в примере 5.

[00181] Концентрацию родительского субтилизина B. lentus P29600 (SEQ ID NO: 6) и его вариантов в супернатанте культуры определяли с помощью UHPLC с использованием колонки Zorbax 300 SB-C3 и линейного градиента 0,1% трифторуксусной кислоты (буфер A) и 0,07% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле (буфер B) и детекции при 220 нм. Супернатанты культуры разводили в 10 мМ NaCl, 0,1 мМ CaCl₂, 0,005% Tween 80 для загрузки в колонку. Концентрацию белка образцов рассчитывали на основании стандартной кривой очищенного родительского фермента (дикий тип P29600) (SEQ ID NO: 6).

[00182] Концентрация белка каждого варианта, содержащего мутацию N242D, изложена в таблице 4, выраженная в виде значения PI. Значение индекса продуктивности (PI) рассчитывали путем деления концентрации белка варианта, содержащего мутацию N242D, на концентрацию белка варианта без мутации N242D.

Таблица 4. Продуктивность дополнительных вариантов субтилизина P29600, содержащих замену N242D Варианты P29600 Замены по отношению к B. lentus P29600 Замены по отношению к BPN' PI SEQ ID NO: P29600-10914 N242D N248D 1,2 50 P29600-10808 S99R-S128A-N242D S101R-S130A-N248D 1,3 47 P29600-10809 I43V-A47V-T56Y-N114Q-N242D I44V-A48V-T58Y-N116Q-N248D 1,7 37 P29600-10812 I43V-A47V-S99R-S126T-N242D I44V-A48V-S101R-S128T-N248D 1,2 35 P29600-10828 P39E-E87D-S99R-S128A-N242D P40E-E89D-S101R-S130A-N248D 1,7 40 P29600-10829 P39E-E87D-S99R-S126T-N242D P40E-E89D-S101R-S128T-N248D 1,2 39 P29600-10832 P39E-E87D-N242D P40E-E89D-N248D 2,5 38 P29600-10839 P39E-T56Y-E87D-N114Q-N242D P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D 1,2 45 P29600-10847 P39E-I43V-A47V-E87D-N242D P40E-I44V-A48V-E89D-N248D 1,1 41 P29600-10853 T56Y-S99R-N114Q-S126T-N242D T58Y-S101R-N116Q-S128T-N248D 1,1 48 P29600-10877 S99R-S126T-N242D S101R-S128T-N248D 1,3 46 P29600-10895 P39E-S99R-S126T-S128A-N242D P40E-S101R-S128T-S130A-N248D 1,1 43 P29600-10901 P39E-S99R-S126T-N242D P40E-S101R-S128T-N248D 1,7 42 P29600-10906 P39E-S99R-S128A-N242D P40E-S101R-S130A-N248D 1,2 44 P29600-10909 I43V-A47V-S99R-S128A-N242D I44V-A48V-S101R-S130A-N248D 1,3 36 P29600-10913 T56Y-S99R-N114Q-S128A-N242D T58Y-S101R-N116Q-S130A-N248D 1,6 49 P29600-10915 T022R-S099G-S101A-V102I-A226V-Q239R-N242D T22R-S101G-S103A-V104I-A232V-Q245R-N248D 1,3 51

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Danisco US Inc.

<120> ВАРИАНТЫ ПРОТЕАЗ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> NB41146-WO-PCT

<160> 51

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 608

<212> ДНК

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

gaattctcca ttttcttctg ctatcaaaat aacagactcg tgattttcca aacgagcttt 60

caaaaaagcc tctgcccctt gcaaatcgga tgcctgtcta taaaattccc gatattggtt 120

aaacagcggc gcaatggcgg ccgcatctga tgtctttgct tggcgaatgt tcatcttatt 180

tcttcctccc tctcaataat tttttcattc tatccctttt ctgtaaagtt tatttttcag 240

aatactttta tcatcatgct ttgaaaaaat atcacgataa tatccattgt tctcacggaa 300

gcacacgcag gtcatttgaa cgaatttttt cgacaggaat ttgccgggac tcaggagcat 360

ttaacctaaa aaagcatgac atttcagcat aatgaacatt tactcatgtc tattttcgtt 420

cttttctgta tgaaaatagt tatttcgagt ctctacggaa atagcgagag atgatatacc 480

taaatagaga taaaatcatc tcaaaaaaat gggtctacta aaatattatt ccatctatta 540

caataaattc acagaatagt cttttaagta agtctactct gaattttttt aaaaggagag 600

ggtaaaga 608

<210> 2

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu

1 5 10 15

Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Ser Ala

20 25

<210> 3

<211> 252

<212> ДНК

<213> Bacillus lentus

<400> 3

gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60

tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120

gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180

gaagatgtgg acgcgcttga gctcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240

gtaacgacaa tg 252

<210> 4

<211> 84

<212> БЕЛОК

<213> Bacillus lentus

<400> 4

Ala Glu Glu Ala Lys Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu

1 5 10 15

Ala Val Ser Glu Phe Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala

20 25 30

Ile Leu Ser Glu Glu Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe

35 40 45

Glu Thr Ile Pro Val Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp

50 55 60

Ala Leu Glu Leu Asp Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu

65 70 75 80

Val Thr Thr Met

<210> 5

<211> 93

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Терминатор

<400> 5

ggttaccttg aatgtatata aacattctca aagggatttc taataaaaaa cgctcggttg 60

ccgccgggcg ttttttatgc atcgatggaa ttc 93

<210> 6

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Bacillus lentus

<400> 6

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 7

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 7

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 8

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 8

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 9

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 9

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 10

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 10

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 11

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 11

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 12

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 12

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 13

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 13

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 14

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 14

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 15

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 15

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 16

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 16

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 17

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 17

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 18

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 18

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 19

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 19

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 20

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 20

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 21

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 21

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 22

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 22

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 23

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 23

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 24

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 24

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 25

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 25

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 26

<211> 275

<212> БЕЛОК

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 26

Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30

Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60

Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95

Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110

Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140

Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly

145 150 155 160

Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175

Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190

Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205

Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

210 215 220

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

225 230 235 240

Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255

Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270

Ala Ala Gln

275

<210> 27

<211> 1052

<212> ДНК

<213> Bacillus subtilis

<400> 27

gcaaaacgcg gatcattgga agagacgacc gtacccgcag catcaatgcc taaaataagc 60

ggatactctc tgacgatatt gcctcctgct tttccggcca gaccatcttt gtaattaatg 120

ccggaataag caactttaat caggacacca tccttcggca aatcctctgt tgatatggtt 180

ttcacatgga ctgaaacatc atcggcattt ttttctgcct gcaaggcttg aaataacgtt 240

gacattcggc acactccttt tcatttatat cgtaaccgaa gaacgttcaa aaaaccaaat 300

catcaagccg ccattttcac ttcgccggca cattgagaca ataatggaca aatccggtat 360

cctcttcata gccgttttgc tcatacaagc ttcttgcctt ccggttgtgg tgctcagtct 420

gaagtgttaa acattttgcc ccgttttgcc ctgcataatc ctttgcggca gaaagcagcc 480

ggccgccggc tccctttgta cgcgcatgag gaacgacaaa taagtcattt aatatgtata 540

tccttttcat tgacacagaa gaaaacgttg gatagagctg ggtaaagcct atgaattctc 600

cattttcttc tgctatcaaa ataacagact cgtgattttc caaacgagct ttcaaaaaag 660

cctctgcccc ttgcaaatcg gatgcctgtc tataaaattc ccgatattgg ttaaacagcg 720

gcgcaatggc ggccgcatct gatgtctttg cttggcgaat gttcatctta tttcttcctc 780

cctctcaata attttttcat tctatccctt ttctgtaaag tttatttttc agaatacttt 840

tatcatcatg ctttgaaaaa atatcacgat aatatccatt gttctcacgg aagcacacgc 900

gtcgctgata aacagctgac atcaactaaa agcttcatta aatactttga aaaaagttgt 960

tgacttaaaa gaagctaaat gttatagtaa taaaacagaa tagtctttta agtaagtcta 1020

ctctgaattt ttttaaaagg agagggtaaa ga 1052

<210> 28

<211> 87

<212> ДНК

<213> Bacillus subtilis

<400> 28

gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgc gcaggct 87

<210> 29

<211> 810

<212> ДНК

<213> Bacillus lentus

<400> 29

gcgcaatcag tgccatgggg aattagccgt gtgcaagccc cagctgccca taaccgtgga 60

ttgacaggtt ctggtgtaaa agttgctgtc ctcgatacag gtatttccac tcatccagac 120

ttaaatattc gtggtggcgc tagctttgta ccaggggaac catccactca agatgggaat 180

gggcatggca cgcatgtggc cgggacgatt gctgctttaa acaattcgat tggcgttctt 240

ggcgtagcgc cgagcgcgga actatacgct gttaaagtat taggggcgag cggttcaggt 300

tcggtcagct cgattgccca aggattggaa tgggcaggga acaatggcat gcacgttgct 360

aatttgagtt taggaagccc ttcgccaagt gccacacttg agcaagctgt taatagcgcg 420

acttctagag gcgttcttgt tgtagcggca tctggaaatt caggtgcagg ctcaatcagc 480

tatccggccc gttatgcgaa cgcaatggca gtcggagcta ctgaccaaaa caacaaccgc 540

gccagctttt cacagtatgg cgcagggctt gacattgtcg caccaggtgt aaacgtgcag 600

agcacatacc caggttcaac gtatgccagc ttaaacggta catcgatggc tactcctcat 660

gttgcaggtg cagcagccct tgttaaacaa aagaacccat cttggtccaa tgtacaaatc 720

cgcaatcatc taaagaatac ggcaacgagc ttaggaagca cgaacttgta tggaagcgga 780

cttgtcaatg cagaagctgc aactcgttaa 810

<210> 30

<211> 254

<212> ДНК

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 30

tctagataca taaaaaaccg gccttggccc cgccggtttt ttattatttt tcttcctccg 60

catgttcaat ccgctccata atcgacggat ggctccctct gaaaatttta acgagaaacg 120

gcgggttgac ccggctcagt cccgtaacgg ccaagtcctg aaacgtctca atcgccgctt 180

cccggtttcc ggtcagctca atgccgtaac ggtcggcggc gttttcctga taccgggaga 240

cggcattcgt aatc 254

<210> 31

<211> 855

<212> ДНК

<213> Staphylococcus aureus

<400> 31

ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 60

gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 120

aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 180

tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 240

ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 300

gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 360

ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 420

tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 480

cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 540

aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 600

tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 660

cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 720

tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 780

ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 840

ccaattttcg tttgt 855

<210> 32

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фланкирующая область 3' aprE

<400> 32

tcagccttat tctcctgata acgcgagaca gcattagaaa aaggcgtaac cgcaaagctc 60

aaaacagaaa acaaaagcaa taacagcgga agtgccgcaa gatcatgccg cccttctaaa 120

tgaaacatgc tgcgggttag gcgaaccgtc cgcttgtaaa gcttatcaat gacataaaat 180

ccggcgagcg acacgagcaa atagccagcc agaccgatgt aaacgtgctt catgacataa 240

tggcccattt cgtggcccat aataaacaga atttctgaat cgtcaagttt gttcagcgtc 300

gtatcccaca atacaatccg tttattggcc ccaattcctg taacataggc attcagcgca 360

tttgtttttt ctgacatgtt cacttcatat acatggtcag ccggaatatt ggcttcatct 420

gccagctcta aaattttgct ttcaagctct ttgtttttca gcggataaaa atcattgtat 480

aaaggatcga taatgaccgg ctgaataaaa aacagaaaca gcgaaaacgg cactgttaac 540

agccaggcgt ataaccacca ttttttttca tgccttttga tcagccaata aaaaacgaga 600

acgcaaagcg taaagattgg aaagctgatc caaaagctga taacctgatc cttagcccag 660

ctggccgttg tctgtgtgga aatgttatag tcaagcgata cttgatagcc tatccaatct 720

aaaggcagcg tcaccaatgt tgtaatcagc gaaagcacaa acacaaaacc aacggtctgc 780

aaaaaccgaa aaggcacggc cgcttcgatc catttcttga ttttctttga aacaccgctg 840

acaagcagaa caaaaaacag aaaccaatca agtggtaccc cgataaaaaa taaaaaattc 900

ttgacattcg aatactgctc ggccactgcc aactcagacg gcttcatgaa agaagccgga 960

tcagcctgcg tccctttcac ggcttccggt att 993

<210> 33

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Bacillus subtilis

<400> 33

Val Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu

1 5 10 15

Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala

20 25

<210> 34

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 34

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Val Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 35

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 35

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Val Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 36

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 36

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Val Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 37

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 37

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Val Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 38

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 38

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 39

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 39

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 40

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 40

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 41

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 41

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Val Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 42

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 42

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 43

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 43

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 44

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 44

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 45

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 45

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Glu Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 46

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 46

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 47

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 47

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 48

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 48

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Thr Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 49

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 49

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Tyr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Arg Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Gln Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ala

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 50

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 50

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 51

<211> 269

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант Bacillus lentus

<400> 51

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Arg Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Val Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Arg Ile

225 230 235 240

Arg Asp His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен вариант субтилизина, имеющий одно или более улучшенных свойств по сравнению с эталонным субтилизином, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, при этом улучшенное свойство выбирают из улучшенной протеазной активности, улучшенного очищающего действия в моющем средстве и улучшенной термостабильности в моющем средстве. Также предложены нуклеиновая кислота, кодирующая вариант субтилизина, композиции и способы, относящиеся к получению и применению указанного варианта субтилизина. Изобретение позволяет получить эффективный фермент и использовать его в моющих средствах. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 6 пр.

1. Вариант субтилизина, содержащий аминокислотную последовательность с по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, содержащую аминокислотную замену P40E в комбинации с E/S89D, где аминокислотные положения варианта пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 26, и где вариант имеет одно или более улучшенных свойств по сравнению с эталонным субтилизином, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, при этом улучшенное свойство выбирают из улучшенной протеазной активности, улучшенного очищающего действия в моющем средстве и улучшенной термостабильности в моющем средстве.

2. Вариант субтилизина по п. 1, где вариант содержит комбинацию аминокислотных замен, выбранных из P40E-T58Y-E89D-N116Q-N248D; P40E-T58Y-E89D-N116Q; P40E-E89D-N248D; P40E-E89D-S101R-S128T-N248D; P40E-E89D-S101R-S130A-N248D; P40E-E89D; P40E-E89D-S101R-S128T; P40E-E89D-S101R-S130A и их комбинаций.

3. Вариант субтилизина по п. 1, где вариант содержит аминокислотную последовательность c по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или менее чем 100% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6.

4. Вариант субтилизина по п. 1, где вариант

(i) получен из исходной формы, содержащей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:6;

(ii) является выделенным или

(iii) предусматривает комбинацию (i)-(ii).

5. Вариант субтилизина по п. 1, где улучшенное свойство по сравнению с эталонным субтилизином представляет собой:

(i) улучшенную протеазную активность, где указанный вариант характеризуется PI > 1 в отношении N-suc-AAPF-pNA или диметилказеинового субстрата;

(ii) улучшенное очищающее действие в моющем средстве, где указанный вариант характеризуется очисткой от крови/молока/чернил на хлопчатобумажной ткани (BMI) и/или яичного загрязнения с PI >1; и/или

(iii) улучшенную термостабильность в моющем средстве, где указанный вариант характеризуется стабильностью с PI > 1,

где указанное моющее средство необязательно является композицией, не содержащей бор.

6. Композиция, содержащая один или несколько вариантов субтилизина по п. 1, где композиция представляет собой моющую композицию.

7. Композиция по п. 6, где моющая композиция выбрана из моющего средства для стирки, моющего средства для смягчения ткани, моющего средства для мытья посуды и моющего средства для очистки твердых поверхностей.

8. Композиция по п. 6, где композиция:

(i) дополнительно содержит один или несколько ионов, выбранных из кальция и цинка; один или нескольких стабилизаторов ферментов; от приблизительно 0,001% до приблизительно 1,0 вес. % указанного варианта; одно или несколько отбеливающих средств; один или несколько вспомогательных материалов; и/или один или несколько дополнительных ферментов или производных ферментов, выбранных из группы, состоящей из ацилтрансфераз, альфа-амилаз, бета-амилаз, альфа-галактозидаз, арабинозидаз, арилэстераз, бета-галактозидаз, каррагиназ, каталаз, целлобиогидролаз, целлюлаз, хондроитиназ, кутиназ, эндо-бета-1,4-глюканаз, ДНКаз, эндо-бета-маннаназ, эстераз, экзоманнаназ, галактаназ, глюкоамилаз, гемицеллюлаз, гиалуронидаз, кератиназ, лакказ, лактаз, лигниназ, липаз, липоксигеназ, маннаназ, оксидаз, оксидоредуктаз, пектатлиаз, пектинацетилэстераз, пектиназ, пентозаназ, пероксидаз, фенолоксидаз, фосфатаз, фосфолипаз, фитаз, полигалактуроназ, полиэстераз, дополнительных протеаз, пуллуланаз, редуктаз, рамногалактуроназ, бета-глюканаз, танназ, трансглутаминаз, ксиланацетилэстераз, ксиланаз, ксилоглюканаз, ксилозидаз, металлопротеаз, дополнительных серин-протеаз и их комбинаций; и/или

(ii) содержит фосфат или не содержит фосфат и/или содержит бор или не содержит бор; и/или

(iii) представляет собой гранулированную, порошкообразную, твердую, брусковую, жидкую, таблетированную, гелеобразную, пастообразную композицию или композицию с однократной дозой.

9. Способ очистки предмета, предусматривающий приведение в контакт предмета с вариантом по п. 1 или композицией по п. 6 и необязательно дополнительно включающий стадию ополаскивания поверхности или предмета после приведения в контакт предмета с вариантом или композицией, где указанный предмет представляет собой столовую посуду или ткань.

10. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант субтилизина по любому из пп. 1-5.

11. Нуклеиновая кислота по п. 10, где вариант, кодируемый полинуклеотидом, дополнительно содержит замену 248D по сравнению с эталонным субтилизином, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

12. Нуклеиновая кислота по п. 11, где нуклеиновая кислота представляет собой экспрессирующую конструкцию, содержащую в направлении от 5' к 3':

(i) промоторную последовательность, которая расположена выше (5') и функционально связана с сигнальной пептидной последовательностью, необязательно, где сигнальная пептидная последовательность содержит SEQ ID NO: 28,

(ii) пропептидную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с 5' сигнальной пептидной последовательностью, необязательно, где пропептидная последовательность содержит SEQ ID NO: 3;

(iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант, содержащий дополнительную замену 248D, при этом последовательность нуклеиновой кислоты расположена ниже (3') и функционально связана с 5' пропептидной последовательностью, необязательно, где последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует вариант, кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:45; и

(iv) необязательную терминаторную последовательность, которая расположена ниже (3') и функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант, содержащий дополнительную замену 248D, необязательно, где необязательная терминаторная последовательность содержит SEQ ID NO:30.

13. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 10.

14. Рекомбинантная клетка-хозяин для продуцирования варианта субтилизина по п. 1, содержащая вектор по п. 13 или нуклеиновую кислоту по п. 10.

название	год	авторы	номер документа
ВАРИАНТЫ ПРОТЕАЗЫ КЛАДЫ APRL И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2016	Эстелл, Дэвид А. Гудегебур, Фриц Колкман, Марк Антон Бернхард Мейльдаль, Рие Огастин, Кэтрин Бэйб, Лилия Мария Ботт, Ричард Р. Яо, Цзянь Гхирникар, Роопа	RU2733987C2
ВАРИАНТЫ ФАКТОР H-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2015	Бирнинк, Питер Т.	RU2811942C2
ВАРИАНТЫ ФАКТОР Н-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2015	Бирнинк Питер Т.	RU2714248C2
Слитые молекулы, происходящие от Cholix-токсина, для пероральной доставки биологически активных нагрузок	2015	Мрсни Рэндэлл Дж. Махмуд Тахир	RU2723178C2
АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА К PCSK9 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СПОСОБАХ ЛЕЧЕНИЯ КОНКРЕТНЫХ ГРУПП ИНДИВИДУУМОВ	2012	Анотэн Коринн Бессак Лоранс Чаудхари Умеш	RU2721279C2
ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ РЕГУЛЯТОРНЫХ T-КЛЕТОК	2017	Грив, Джеффри Ким, Чонмин Нагараджан, Ниранджана Чо, Джон	RU2769871C2
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРЛИПИДЕМИИ У ПАЦИЕНТОВ С ДИАБЕТОМ ПОСРЕДСТВОМ ВВЕДЕНИЯ ИНГИБИТОРА PCSK9	2018	Буяс-Бобановиц, Мая	RU2772712C2
МУЛЬТИВАЛЕНТНЫЕ PD-L1-СВЯЗЫВАЮЩИЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ	2020	Бэрри, Майкл, А.	RU2816646C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИТЕЛА К PCSK-9, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ	2018	Тянь, Чэньминь Ли, Хао Лю, Сюнь	RU2782792C2
НОВЫЙ ШТАММ PAENIBACILLUS, ПРОТИВОГРИБКОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2016	Боу Джереми Джу Даниел М. Швинтек Патрик Тейлор Коллин С. Траг Бьорн А.	RU2763542C2

Способ приготовления лака	1924	Петров Г.С.	SU2011A1
Изложница с суживающимся книзу сечением и с вертикально перемещающимся днищем	1924	Волынский С.В.	SU2012A1
ПРОТЕАЗЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ОДНУ ИЛИ НЕСКОЛЬКО КОМБИНИРУЕМЫХ МУТАЦИЙ	2009	Каскао-Перейра, Луис Г. Эстелл, Дэвид А. Келлис, Мл., Джеймс Т.	RU2560978C2

ВАРИАНТЫ ПРОТЕАЗ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C12N9/54 C11D3/386

Описание патента на изобретение RU2790443C2

Похожие патенты RU2790443C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 790 443 C2

Реферат патента 2023 года ВАРИАНТЫ ПРОТЕАЗ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Формула изобретения RU 2 790 443 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2790443C2

RU 2 790 443 C2