Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США №08/956323, поданной 23 октября 1998 г. заявки на патент США №08/956564, поданной 23 октября 1998 г. и заявки на патент США №08/956324, поданной 23 октября 1998 г., которые полностью включены в это описание изобретения в качестве ссылки.
Предпосылки изобретения
Сериновые протеазы входят в подгруппу карбонильных гидролаз. Они образуют класс разнообразных ферментов, обладающих различными специфичностями и биологическими функциями. Stroud R., Sci.Amer., 131:74-88. Несмотря на функциональное разнообразие, каталитический механизм сериновых протеаз присущ по крайней мере двум генетически различным семействам ферментов: 1) субтилизинам и 2) родственным химотрипсину млекопитающего и гомологичным бактериальным сериновым протеазам (таким как трипсин и трипсин S.gresius). Эти два семейства сериновых протеаз обладают чрезвычайно похожими механизмами катализа. Kraut J., (1977), Annu. Rev.Biochem., 46:331-358. Кроме того, хотя первичные структуры ферментов этих семейств не являются родственными, их третичные структуры имеют консервативную каталитическую триаду аминокислот, состоящую из серина, гистидина и аспартата.
Субтилизины являются сериновыми протеазами (примерная молекулярная масса 27500), которые в больших количествах секретируют различные виды Bacillus и другие микроорганизмы. Белковая последовательность субтилизина определена по крайней мере у девяти разных видов Bacillus. Markland F.S. et al., (1983), Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem., 364:1537-1540. В научной литературе описана трехмерная кристаллографическая структура субтилизинов, выделенных из Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis и нескольких природных вариантов B.lentus. Эти исследования показывают, что, хотя у субтилизина нет генетического родства с сериновыми протеазами млекопитающих, он имеет сходную структуру активного сайта. Рентгеновские кристаллические структуры субтилизина, содержащие ковалентно связанные ингибиторы пептида (Robertus J.D. et al., (1972), Biochemistry, 11:2439-2449) или комплексы продуктов (Robertus J.D. et al., (1976), J.Biol. Chem., 251:1097-1103), также позволили получить информацию об активном сайте и предполагаемом субстратсвязывающим участке субтилизина. Помимо этого, было проведено большое количество исследований кинетических и химических модификаций субтилизина; Svendsen В., (1976), Carlsberg Res.Commun., 41: 237-291; Markland F.S., там же), при этом по крайней мере в одной научной работе описано превращение боковой цепи метионина в положении остатка 222 субтилизина в метионинсульфоксид под действием перекиси водорода (Stauffer D.C. et al., (1965), J.Biol.Chem., 244:5333-5338) и обширный сайт-специфический мутагенез (Wells and Estell, (1988), TIBS, 13:291-297).
Главной проблемой при создании варианта протеазы, предназначенного для применения в моющем средстве, является разнообразие условий стирки, в том числе моющих составов, в которых может быть использован данный вариант протеазы. Например, моющие составы, используемые в разных регионах, имеют разные концентрации моющих компонентов в моечной воде. Например, применяемая в Европе моющая система обычно содержит примерно 4500-5000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде, в то время как применяемая в Японии моющая система обычно содержит примерно 667 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. В Северной Америке, в частности в США, моющая система обычно содержит примерно 975 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. Заявители разработали способ рационального конструирования варианта протеазы, предназначенного для применения в системе с низкой концентрацией детергента, в системе с высокой концентрацией детергента и/или в системе со средней концентрацией детергента, а также для применения в системах с концентрацией детергентов всех трех типов.
Краткое изложение существа изобретения
Объектом этого изобретения являются варианты протеазы с замещениями аминокислот в положении одного или нескольких остатков, выполненными так, что такое замещение изменяет заряд в этом положении, делая его более отрицательным или менее положительным по сравнению с протеазой-предшественником, в результате чего указанный вариант протеазы оказывается более эффективным в системе с низкой концентрацией детергента, чем протеаза-предшественник. Система с низкой концентрацией детергента является моющей системой, которая содержит менее 800 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.
Другим объектом этого изобретения являются варианты протеазы с замещениями аминокислот в положении одного или нескольких остатков, выполненными так, что такое замещение изменяет заряд в этом положении, делая его более положительным или менее отрицательным по сравнению с протеазой-предшественником, в результате чего указанный вариант протеазы оказывается более эффективным в системе с высокой концентрацией детергента, чем протеаза-предшественник. Система с высокой концентрацией детергента является моющей системой, которая содержит более 2000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.
Другим объектом этого изобретения являются варианты протеазы с замещениями аминокислот в положении одного или нескольких остатков, выполненными так, что такое замещение изменяет заряд в этом положении, делая его более положительным или менее отрицательным по сравнению с протеазой-предшественником, в результате чего указанный вариант протеазы оказывается более эффективным в системе со средней концентрацией детергента, чем протеаза-предшественник. Система со средней концентрацией детергента является системой, которая содержит от около 800 до около 2000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.
Другим объектом этого изобретения являются варианты протеазы с замещениями аминокислот в положении одного или нескольких остатков, выполненными так, что такое замещение изменяет заряд в этом положении, делая его более отрицательным или менее положительным по сравнению с протеазой-предшественником, в результате чего указанный вариант протеазы оказывается более эффективным в системе со средней концентрацией детергента, чем протеаза-предшественник. Система со средней концентрацией детергента является моющей системой, которая содержит от около 800 до около 2000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.
Еще одним объектом этого изобретения являются последовательности ДНК, кодирующие такие варианты протеазы, и экспрессирующие векторы, содержащие последовательности ДНК таких вариантов.
Еще одним объектом этого изобретения являются клетки-хозяева, трансформированные такими векторами, и клетки-хозяева, способные экспрессировать такую ДНК с целью продуцирования вариантов протеазы внутриклеточно или внеклеточно.
Еще одним объектом этого изобретения является очищающая композиция, содержащая вариант протеазы по настоящему изобретению.
Кроме того, объектом этого изобретения является корм для животных, содержащий вариант протеазы по настоящему изобретению.
Объектом этого изобретения является также композиция для обработки тканей, содержащая вариант протеазы по настоящему изобретению.
Данное изобретение далее относится к способу получения варианта протеазы, являющегося более эффективным в системе с низкой, средней и высокой концентрацией детергента, чем протеаза-предшественник, который включает следующие стадии:
a) замещение аминокислоты в положении одного или нескольких остатков так, что такое замещение изменяет заряд в этом положении, делая его более положительным или менее отрицательным по сравнению с протеазой-предшественником;
b) замещение аминокислоты в положении одного или нескольких остатков так, что такое замещение изменяет заряд в этом положении, делая его более отрицательным или менее положительным по сравнению с протеазой-предшественником;
c) испытание полученного варианта для определения его эффективности в системе с высокой, средней и низкой концентрацией детергента по сравнению с протеазой-предшественником;
и
d) повторное выполнение стадий а)-с) в случае необходимости для получения варианта протеазы, который является более эффективным в системе с низкой, средней и высокой концентрацией детергента, чем протеаза-предшественник, причем стадии а) и b) могут быть выполнены в любом порядке.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 А-В показаны последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для субтилизина Bacillus amyloliquefaciens и частичная рестрикционная карта этого гена.
На фиг.2 показаны консервативные аминокислотные остатки субтилизинов из Bacillus amyloliquefaciens (BPN)' и Bacillus lentus (дикого типа).
На фиг.3А и 3В показаны аминокислотные последовательности четырех субтилизинов. Верхняя строка относится к аминокислотной последовательности субтилизина из Bacillus amyloliquefaciens (который иногда определяется как субтилизин BPN'). Вторая строка относится к аминокислотной последовательности субтилизина из Bacillus subtilis. Третья строка относится к аминокислотной последовательности субтилизина из В.licheniformis. Четвертая строка относится к аминокислотной последовательности субтилизина из Bacillus lentus (который именуется субтилизином 309 в РСТ WO 89/06276). Символ * означает отсутствие специфических аминокислотных остатков по сравнению с субтилиэином BPN'.
Подробное описание изобретения
Как указывалось выше, в разных регионах применяются разные режимы стирки и, как следствие этого, используются детергенты разных типов. Например, в Японии используется система с низкой концентрацией детергента, в то время как в Европе используется система с высокой концентрацией детергента. Как указывалось выше, в США используется система со средней концентрацией детергента. Заявители обнаружили, что в разных моющих средствах оптимальная эффективность достигается при использовании разных вариантов протеазы. На основании этих результатов можно предположить, что нельзя найти протеазу, которая будет эффективно действовать в дегергентах всех трех типов. Однако это не так. Заявители разработали способ рационального конструирования варианта протеазы, пригодного для использования в системе с низкой концентрацией детергента, в системе с высокой концентрацией детергента или в системе со средней концентрацией детергента, то есть он эффективно действует в системах со всеми тремя концентрациями детергента.
Заявители обнаружили, что для того, чтобы получить вариант протеазы, который более эффективен в системе с низкой концентрацией детергента, один или несколько положительно заряженных остатков нужно заменить одним или несколькими отрицательно заряженными остатками, нейтральными остатками, и/или один или несколько нейтральных остатков нужно заменить одним или несколькими отрицательно заряженными остатками. При этом следует отметить, что для того, чтобы получить вариант протеазы, который более эффективен в системе с высокой концентрацией детергента, один или несколько отрицательно заряженных остатков нужно заменить одним или несколькими положительно заряженными остатками или нейтральными остатками и/или один или несколько нейтральных остатков нужно заменить одним или несколькими положительно заряженными остатками. Кроме того, заявители обнаружили, что многие варианты протеазы, полезные в системе с низкой концентрацией детергента и/или в системе с высокой концентрацией детергента, эффективно действуют также в системе со средней концентрацией детергента. Уравновешивая эти изменения, можно получить вариант протеазы, который хорошо действует в системах с низкой концентрацией детергента, в системах с низкой и средней концентрацией детергента, в системах со средней и высокой концентрацией детергента, в системе с высокой концентрацией детергента или в системах со всеми тремя концентрациями детергента.
Предполагается, что электростатический заряд в боковой цепи любых ионизируемых аминокислот с кислой или основной функцией зависит в водном растворе от показателя рН. Кислые остатки Glu и Asp в процессе уравновешивания теряют протон вследствие диссоциации при рН 3-6 и приобретают отрицательный заряд. Аналогичным образом His, Lys и Arg постепенно депротонируют соответственно при рН 5-8, рН 8,5-11,5 и рН 11-14, теряя таким образом положительный заряд. Протон Туr ОН диссоциирует в степени при рН 8,5-11,5, в результате чего Туr приобретает отрицательный заряд. Область диссоциации для карбоксильного конца соответствует рН 1-4, давая отрицательный заряд, и для аминоконца соответствует рН 8-11, сопровождаясь потерей положительного заряда. Указанная здесь область диссоциации для боковых цепей аминокислот представляет собой средние значения для нескольких белков, но известно, что на эти величины могут влиять необычные структурные конфигурации некоторых белков.
Кумулятивный эффект всех зарядов показывает, имеет ли белок суммарный положительный или суммарный отрицательный заряд при данном рН. Показатель рН, при котором положительные и отрицательные заряды являются одинаковыми и сообщают белку электростатически нейтральное состояние, называется изоэлектрической точкой (рI). Белок теряет или приобретает заряд, когда происходит смещение рН или когда боковая цепь приобретает или утрачивает аминокислоту с ионизируемым остатком. Суммарный положительный заряд можно увеличить путем замены отрицательно заряженного остатка при данном показателе рН незаряженным или положительно заряженным остатком, в результате чего заряд формально становится равным соответственно +1 и +2. При замене незаряженного остатка в боковой цепи остатком, протонированным при данном показателе рН, заряд формально становится равным +1. Аналогичным образом, суммарный отрицательный заряд можно увеличить, заменяя положительно заряженные или незаряженные боковые цепи отрицательно заряженными боковыми цепями при данном показателе рН, в результате чего происходит формальное увеличение отрицательного заряда соответственно на -1 и -2.
Система с низкой концентрацией детергента обеспечивает содержание в моечной воде менее 800 частей на миллион моющих компонентов. Японские детергенты обычно считаются системами с низкой концентрацией детергента, так как они содержат примерно 667 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.
Система со средней концентрацией детергента включает детергенты, характеризующиеся наличием примерно 800-2000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. Детергенты, используемые в Северной Америке, обычно считаются системами со средней концентрацией детергента, так как они характеризуются наличием примерно 975 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. В Бразилии обычно используются детергенты, обеспечивающие примерно 1500 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.
Система с высокой концентрацией детергента включает детергенты, которые обеспечивают присутствие в моечной воде более 2000 частей на миллион моющих компонентов. Европейские детергенты обычно считаются системами с высокой концентрацией детергента, так как они обеспечивают примерно 4500-5000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде.
Детергенты, используемые в Латинской Америке, обычно являются высокопенными, фосфатмодифицированными детергентами, поэтому их можно классифицировать как системы со средней и высокой концентрацией детергента, так как характеризуются наличием от 1500 до 6000 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. Как указывалось выше, Бразильские детергенты обычно характеризуются наличием примерно 1500 частей на миллион моющих компонентов в моечной воде. Однако в других регионах, для которых характерно применение высокопенных, модифицированных фосфатом детергентов и которые не ограничиваются странами Латинской Америки, могут использоваться системы с высокой концентрацией детергента, обеспечивающие наличие в моечной воде до 6000 частей на миллион моющих компонентов.
В свете вышеизложенного становится очевидным тот факт, что концентрации детергентов в типичных моечных растворах, используемых в различных регионах мира, изменяются от менее 800 частей на миллион ("регионы применения систем с низкой концентрацией детергента"), например около 667 частей на миллион в Японии, до около 800-2000 ("регионы применения систем со средней концентрацией детергента"), например около 975 частей на миллион в США и около 1500 частей на миллион в Бразилии, до более 2000 частей на миллион ("регионы применения систем с высокой концентрацией детергента"), например около 4500-5000 частей на миллион в Европе и около 6000 частей на миллион в регионах применения высокопенных, модифицированных фосфатом детергентов.
Концентрации обычных моечных растворов определяются эмпирически. Например, в США обычная стиральная машина вмещает примерно 64,4 л моечного раствора. Таким образом, чтобы получить в моечном растворе концентрацию, равную примерно 975 частям на миллион детергента, в 64,4 л моечного раствора нужно добавить примерно 62,79 г моющей композиции. Именно это количество отмеряет потребитель при помощи мерного стаканчика, прилагаемого к детергенту.
Протеазы являются карбонильными гидролазами, которые расщепляют пептидные связи белков или пептидов. В используемом здесь значении термин "протеаза" означает природную или рекомбинантную протеазу. К природным протеазам относятся гидролаза α-аминоацилпептида, гидролаза пептидил-аминокислоты, ациламиногидролаза, сериновая карбоксипептидаза, металлокарбоксипептидаза, тиолпротеиназа, карбоксилпротеиназа и металлопротеиназа. В объем этого изобретения входят сериновые протеазы, металлопротеазы, тиолпротеазы и кислотные протеазы, а также эндо- и экзопротеазы.
Настоящее изобретение относится к ферментам протеазы, которые не являются природными вариантами карбонильной гидролазы (вариантами протеазы), так как они обладают другой протеолитической активностью, устойчивостью, специфичностью к субстрату, профилем рН и/или эффективностью по сравнению с карбонильной гидролазой-предшественником, из которой была получена аминокислотная последовательность. В частности, такие варианты протеазы содержат аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе, которая получена путем замещения нескольких аминокислотных остатков протеазы-предшественника другими аминокислотами. Протеаза-предшественник может быть природной или рекомбинантной протеазой.
В вариантах протеазы по настоящему изобретению могут быть замещены любые из девятнадцати природных L-аминокислот в определенных положениях аминокислотных остатков. Такие замещения могут быть произведены в субтилизине-предшественнике (прокариотический субтилизин, эукариотический субтилизин, субтилизин млекопитающих и т.д.). В этом описании изобретения разные аминокислоты обозначены общепринятыми одно- и трехбуквенными кодами. Такие коды приведены в справочнике Dale M.W., (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Appendix B.
Варианты протеазы по этому изобретению предпочтительно получают из субтилизина Bacillus. Более предпочтительно варианты протеазы получают из субтилизина Bacillus lentus и/или субтилизина 309.
Субтилизины являются протеазами бактерий или грибов, которые обычно расщепляют пептидные связи белков или пептидов. В используемом здесь значении термин "субтилизин" означает природный или рекомбинантный субтилизин. Известно, что разные виды микроорганизмов продуцируют и часто секретируют целый ряд природных субтилизинов. Аминокислотные последовательности этих субтилизинов не являются полностью гомологичными. Однако субтилизины, входящие в эту группу, обладают одинаковой или подобной протеолитической активностью. Этот класс сериновых протеаз имеет общую аминокислотную последовательность, определяющую каталитическую триаду, которая отличает их от класса сериновых протеаз, родственных химотрипсину. Как субтилизины, так и родственные химотрипсину сериновые протеаэы имеют каталитическую триаду, состоящую из аспартата, гистидина и серина. В протеазах, родственных субтилизину, эти аминокислоты при считывании от аминоконца к карбоксильному концу расположены в следующем относительном порядке: аспартат-гистидин-серин. Однако родственные химотрипсину протеазы имеют следующий относительный порядок расположения этих аминокислот: гистидин-аспартат-серин. Таким образом, субтилизин относится к сериновой протеазе, имеющей каталитическую триаду родственных субтилизину протеаз. Примерами таких субтилизинов являются, но не ограничиваются ими, субтилизины, показанные на фиг.3. Нумерация этих аминокислот в протеазах обычно и в соответствии с целями настоящего изобретения соответствует номерам, присвоенным последовательности зрелого субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, изображенной на фиг.1.
"Рекомбинантный субтилизин" или "рекомбинантная протеаза" означают субтилизин или протеазу, в которых последовательность ДНК, кодирующая субтилизин или протеазу, модифицирована с возможностью продуцирования варианта (или мутанта) последовательности ДНК, кодирующей замещение, делению или вставку одной или нескольких аминокислот в природной аминокислотной последовательности. Приемлемые способы выполнения такой модификации, которые можно использовать в сочетании со способами, описанными в этом изобретении, включают способы, описанные в патентах США №№ RE 34606, 5204015, 5185258, 5700676, 5801038 и 5763257.
"Субтилизины, не принадлежащие человеку" и кодирующие их ДНК, можно получить из многих прокариотических и эукариотических микроорганизмов. Приемлемыми примерами прокариотических микроорганизмов являются грамотрицательные микроорганизмы, такие как E.coli или Pseudomonas, и грамположительные бактерии, такие как Micrococcus или Bacillus. Примерами эукариотических микроорганизмов, из которых может быть получен субтилизин и его гены, являются дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, и грибы, такие как Aspergillus sp.
"Вариант протеазы" имеет аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности "протеазы-предшественника". Протеазами-предшественниками являются природные и рекомбинантные протеазы. Аминокислотную последовательность варианта протеазы получают из аминокислотной последовательности протеазы-предшественника путем замещения, делеции или вставки одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности предшественника. Это достигается путем модификации "последовательности ДНК предшественника", кодирующей аминокислотную последовательность протеазы-предшественника, а не манипуляцией с ферментом протеазы-предшественника per se. Приемлемые способы модификации последовательности ДНК предшественника включают описанные здесь способы, а также способы, известные специалистам в этой области (см., например, европейский патент №0328299, WO 89/06279 и приведенные выше патенты и заявки на патент США).
Номера положений этих аминокислот относятся к номерам, присвоенным последовательности зрелого субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, показанной на фиг.1. Однако это изобретение не ограничивается зрелой формой этого субтилизина и включает протеазы-предшественники, содержащие аминокислотные остатки в положениях, которые "эквивалентны" конкретным идентифицированным остаткам в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения протеаза-предшественник является субтилизином Bacillus lentus и замещения произведены в положениях, эквивалентных аминокислотным остаткам в В.lentus, которые соответствуют указанным выше.
Положение остатка (аминокислоты) протеазы-предшественника эквивалентно положению остатка субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, если он гомологичен (то есть соответствует положению в первичной или третичной структуре) или аналогичен конкретному остатку или части этого остатка в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens (то есть обладает такой же или подобной функциональной способностью соединяться, реагировать или химически взаимодействовать).
Для установления гомологии с первичной структурой аминокислотную последовательность протеазы-предшественника сравнивают непосредственно с первичной последовательностью субтилизина Bacillus amyloliquefaciens и, в частности, с набором остатков, которые, как известно, являются неизменяемыми в субтилизинах и определяют характер последовательности. Например, на фиг.2 показаны консервативные остатки, которые являются общими для субтилизинов В.amyloliquefaciens и В.lentus. После выполнения сравнительного анализа консервативных остатков, позволяющего определить необходимые вставки и делении при сохранении первичной структуры (то есть во избежание удаления консервативных остатков в случае случайных делеций и инсерций), определяют остатки, эквивалентные определенным аминокислотам в первичной последовательности субтилизина Bacillus amyloliquefaciens. Сравнение консервативных остатков предпочтительно должно выявить наличие 100% таких остатков. Однако наличие более 75% или не менее 50% консервативных остатков также является достаточным для определения эквивалентных остатков. Каталитическая триада Asp32/His64/Ser221 должна быть полностью сохранена. Siezen et al., (1991), Protein Eng., 4 (7):719-737 выполнили сравнительный анализ большого количества сериновых протеаз. Siezen et al. определяют эту группу как субтилазы или субтилизинподобные сериновые протеазы.
Например, на фиг.3 показан сравнительный анализ аминокислотных последовательностей субтилизина из Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis. Bacillus licheniformis (carlshergensis) и Bacillus lentus, целью которого является выявление максимальной гомологии между этими аминокислотными последовательностями. Сравнение этих последовательностей показывает, что в каждой последовательности имеется несколько консервативных остатков. Эти консервативные остатки (для BPN' и В.lentus) представлены на фиг.2.
Таким образом, эти консервативные остатки можно использовать для определения соответствующих эквивалентных аминокислотных остатков субтилизина Васillus amyloliquefaciens в других субтилизинах, таких как субтилизин из Bacillus lentus (публикация РСТ № WO 89/06279 от 13 июля 1989 г.), предпочтительный фермент протеазы-предшественника, или субтилизин, определяемый как РВ92 (европейский патент №0328299), который гомологичен предпочтительному субтилизину Bacillus lentus. На фиг.3А и 3В показан сравнительный анализ аминокислотных последовательностей некоторых из этих субтилизинов с последовательностью субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, позволяющий выявить максимальную гомологию консервативных остатков. Как видно, в последовательности Bacillus lentus имеется ряд делеций по сравнению с субтилизином Bacillus amyloliquefaciens. Так, например, аминокислота для Val165 в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens эквивалентна изолейцину в других субтилизинах В.lentus и В.licheniformis.
"Эквивалентные остатки" можно также установить, определяя гомологию на уровне третичной структуры для протеазы-предшественника, третичная структура которой исследована рентгеновской кристаллографией. Эквивалентными остатками являются такие остатки, для которых атомные координаты двух или более атомов в главной цепи определенного аминокислотного остатка протеазы-предшественника и субтилизина Bacillus amyloliquefaciens (N перекрывает N, СА перекрывает СА, С перекрывает С и О перекрывает О) после упорядочения находятся в пределах 0,13 нм и предпочтительно в пределах 0,1 нм. Упорядочение первичной структуры достигается тогда, когда ориентация и расположение лучшей модели обеспечивает максимальное перекрывание атомных координат атомов белка, не являющихся водородом, у рассматриваемой протеазы и субтилизина Bacillus amyloliquefaciens. Лучшая модель является кристаллографической моделью, которая позволяет получить наименьший R-фактор для экспериментальных данных дифракции при самом высоком разрешении.
Эквивалентные остатки, которые функционально аналогичны специфическому остатку субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, определяют в качестве аминокислот протеазы-предшественника, которые могут принять такую конформацию, при которой они могут изменять, модифицировать или стимулировать образование белковой структуры, связывание с субстратом или катализ аналогично определенному и свойственному специфическому остатку субтилизина Bacillus amyloliquefaciens. Кроме того, такие остатки являются остатками протеазы-предшественника (третичная структура которой установлена рентгеновской кристаллографией), занимающими аналогичное положение, при котором атомные координаты по крайней мере двух атомов в боковой цепи остатка находятся на расстоянии 0,13 нм от соответствующих атомов в боковой цепи субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, хотя атомы в главной цепи данного остатка могут не удовлетворять критерию эквивалентности с точки зрения гомологии положения. Координаты трехмерной структуры субтилизина Bacillus amyloliquefaciens приведены в публикации ЕРО №0251446 (соответствует патенту США №5182204, который включен в это описание изобретения в качестве ссылки), и, как указано выше, могут быть использованы для определения эквивалентных остатков на уровне третичной структуры.
Некоторые замещаемые остатки являются консервативными остатками, в то время как другие остатки такими не являются. В случае остатков, которые не являются консервативными, замещение одной или нескольких аминокислот ограничено замещениями, позволяющими получить вариант, имеющий аминокислотную последовательность, которая не соответствует природной последовательности. В случае консервативных остатков такие замещения не должны привести к образованию природной последовательности. Варианты протеазы по настоящему изобретению включают зрелые формы вариантов протеазы, а также про- и препроформы таких вариантов протеазы. Препроформы являются предпочтительной конструкцией, так как они облегчают экспрессию, секрецию и созревание вариантов протеазы.
"Пропоследовательность" означает последовательность аминокислот, связанных с N-концевой частью зрелой формы протеазы, удаление которой вызывает появление "зрелой" формы протеазы. Многие протеолитические ферменты встречаются в природе в виде продуктов трансляции профермента, и при отсутствии посттрансляционного процессинга они экспрессируются в таком виде. Предпочтительной пропоследовательностью для получения вариантов протеазы является предполагаемая Пропоследовательность субтилизина Bacillus amyloliquefaciens, хотя можно использовать и другие пропоследовательности протеазы.
"Сигнальная последовательность" или "препоследовательность" означает любую последовательность аминокислот, связанных с N-концевой частью протеазы или с N-концевой частью пропротеазы, которая может участвовать в секреции зрелой формы или проформы протеазы. Это определение сигнальной последовательности является функциональным и включает все аминокислотные последовательности, кодированные N-концевой частью гена протеазы, которые участвуют в секреции протеазы в естественных условиях. Такие последовательности использованы в настоящем изобретении для осуществления секреции описанных здесь вариантов протеазы. Одна приемлемая сигнальная последовательность содержит семь первых аминокислотных остатков сигнальной последовательности, выделенной из субтилизина Bacillus subtills, слитых с остальной частью сигнальной последовательности субтилизина Bacillus lentus (ATCC 21536).
"Препро" форма варианта протеазы содержит зрелую форму протеазы, имеющей пропоследовательность, операбельно связанную с аминоконцом протеазы, и "пре" или "сигнальную" последовательность, операбельно связанную с аминоконцом пропоследовательности.
"Экспрессирующий вектор" означает конструкцию на основе ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая операбельно связана с приемлемой регуляторной последовательностью, способной экспрессировать указанную ДНК в приемлемом хозяине. Такие регуляторные последовательности включают промотор для осуществления транскрипции, необязательную операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность, кодирующую сайты связывания рибосомы с приемлемой мРНК, и последовательности, контролирующие окончание транскрипции и трансляции. Вектор может быть плазмидой, фаговой частицей или просто потенциальной геномной вставкой. После введения приемлемому хозяину вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина, и в некоторых случаях он может интегрироваться в сам геном. В этом описании изобретения термины "плазмида" и "вектор" иногда использованы во взаимозаменяемом значении, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора в настоящее время. Однако в объем этого изобретения входят и другие формы экспрессирующих векторов, которые выполняют эквивалентные функции и известны в этой области.
"Клетки-хозяева", используемые в настоящем изобретении, обычно являются прокариотическими или эукариотическими хозяевами, которые предпочтительно подвергают обработке в соответствии с методами, описанными в патенте США № RE 34606, в результате чего они утрачивают способность секретировать ферментативно активную эндопротеазу. Предпочтительной клеткой-хозяином для экспрессии протеазы является штамм BG2036 Bacillus, который не имеет ферментативно активной нейтральной протеазы и щелочной протеазы (субтилизина). Конструирование штамма BG2036 подробно описано в патенте США №5264366. Другими клетками-хозяевами для экспрессии протеазы являются Bacillus subtills I168 (описанные также в патентах США №№ RE 34606 и 5264366, которые включены в это описание изобретения в качестве ссылки), а также любой приемлемый штамм Bacillus, такой как В.licheniformis, B.lentus и т.д.
Клетки-хозяева трансформируют или трансфицируют векторами, сконструированными методами рекомбинантных ДНК. Такие трансформированные клетки-хозяева способны реплицировать векторы, кодирующие варианты протеазы, или экспрессировать требуемый вариант протеазы. В случае векторов, кодирующих про- или препроформу варианта протеазы, такие варианты, будучи экспрессированными, обычно секретируются из клетки-хозяина в среду, содержащую клетки-хозяева.
Термин "операбельно связанный", используемый для описания взаимосвязи между двумя областями ДНК, просто означает, что они функционально связаны друг с другом. Например, препоследовательность операбельно связана с пептидом, если она действует в качестве сигнальной последовательности, участвующей в секреции зрелой формы белка, вызывая расщепление указанной сигнальной последовательности. Промотор операбельно связан с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы операбельно связан с кодирующей последовательностью, если его положение делает возможной трансляцию.
Гены, кодирующие природную протеазу-предшественника, можно получить обычными методами, известными в этой области. Эти методы обычно включают синтез меченых зондов, имеющих мнимые последовательности, кодирующие области представляющей интерес протеазы, создание геномных библиотек из микроорганизмов, экспрессирующих протеазу, и скрининг этих библиотек в отношении требуемого гена путем гибридизации с зондами. Затем положительно гибридизирующие клоны картируют и секвенируют.
Клонированную протеазу используют для трансформации клетки-хозяина с целью экспрессии протеазы. Ген протеазы затем лигируют в плазмиду с большим количеством копий. Эта плазмида реплицируется в хозяевах, так как она содержит хорошо известные элементы, необходимые для репликации плазмиды: промотор, оператабельно связанный с рассматриваемым геном (который может быть введен в виде гомологичного промотора гена, если его распознает, то есть транскрибирует, хозяин), область терминации транскрипции и область полиаденилирования (которая необходима для обеспечения устойчивости мРНК, транскрибируемой хозяином из гена протеазы в определенных эукариотических клетках-хозяевах), которая является экзогенной или поддерживается эндогенной областью терминатора гена протеазы, и желательно селектируемый ген, в частности ген устойчивости к антибиотикам, что делает возможным постоянное сохранение в культуре инфицированных плазмидой клеток-хозяев путем выращивания в средах, содержащих антибиотики. Плазмиды с большим количеством копий имеют также источник репликации для хозяина, что позволяет получать большие количества плазмид в цитоплазме без хромосомных ограничений. Однако настоящее изобретение относится также к интеграции нескольких копий гена протеазы в геном хозяина. Это облегчается прокариотическими и эукариотическими микроорганизами, которые особенно подвержены гомологичной рекомбинации.
Ген может быть природным геном B.lentus. Альтернативно можно получить синтетический ген, кодирующий природную или мутантную протеазу-предшественника. В этом случае определяют ДНК и/или аминокислотную последовательность протеазы-предшественника. Затем синтезируют несколько перекрывающихся фрагментов синтетической одноцепочечной ДНК, которые после гибридизации и лигирования образуют синтетическую ДНК, кодирующую протеазу-предшественника. Пример конструирования синтетического гена приведен в примере 3 патента США №5204015, который включен в это описание изобретения в качестве ссылки.
После клонирования природного или синтетического гена протеазы-предшественника выполняют ряд модификаций, направленных на усиление синтеза гена по сравнению с природной протеазой-предшественником. Такие модификации включают продуцирование рекомбинантных протеаз, как это описано в патенте США № RE 34606 и в публикации ЕРО №0251446, а также продуцирование описанных здесь вариантов протеазы.
Можно использовать нижеследующий способ кассетного мутагенеза, который облегчает конструирование вариантов протеазы по настоящему изобретению, хотя возможно применение и других способов. Сначала получают природный ген, кодирующий протеазу, который секвенируют полностью или частично. Затем последовательность сканируют для нахождения точки, в которой желательно произвести мутацию (делению, вставку или замещение) одной или нескольких аминокислот в кодированном ферменте. Последовательности, фланкирующие эту точку, исследуют на наличие сайтов рестрикции для замены короткого сегмента гена пулом олигонуклеотидов, которые во время экспрессии должны кодировать разные мутанты. Такие сайты рестрикции предпочтительно являются уникальными сайтами в гене протеазы, облегчающими замену сегмента гена. Однако можно использовать любой удобный сайт рестрикции, который не является избыточным в гене протеазы, при условии, что фрагменты гена, полученные в результате рестриктирования, можно вновь собрать в требуемую последовательность. Если сайты рестрикции отсутствуют в местах, расположенных на удобном расстоянии от выбранной точки (от 10 до 15 нуклеотидов), такие сайты можно создать, замещая нуклеотиды в гене так, чтобы в конечной конструкции не была изменена рамка считывания и кодированные аминокислоты. Мутацию гена с целью изменения его последовательности так, чтобы она соответствовала требуемой последовательности, осуществляют при помощи праймера М13 в соответствии с известными методами. Задача локализации приемлемых фланкирующих областей и определения необходимых изменений для достижения двух удобных последовательностей в сайте рестрикции значительно облегчается благодаря наличию избыточного генетического кода, рестрикционной карты фермента гена и большого количества разных рестрикционных ферментов. Следует отметить, что при наличии удобного фланкирующего сайта рестрикции рассмотренный выше метод необходимо использовать только в случае фланкирующей области, не имеющей нужного сайта.
После клонирования природной или синтетической ДНК сайты рестрикции, фланкирующие предназначенные для мутации положения, расщепляют родственными рестрикционными ферментами и лигируют в ген несколько кассет олигонуклеотидов, комплементарных концевым областям. Этот метод позволяет упростить мутагенез, так как все олигонуклеотиды можно синтезировать так, чтобы они имели одинаковые сайты рестрикции, причем для создания сайтов рестрикции не требуются синтетические линкеры.
В используемом здесь значении термин "протеолитическая активность" означает скорость гидролиза пептидных связей на миллиграмм активного фермента. Известно много методов измерения протеолитической активности (K.M.Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in Biochenical Engineering/Biotechnology, A.Fiechter ed., 1988). Помимо или в качестве альтернативы модифицированной протеолитической активности у вариантов ферментов по настоящему изобретению могут быть изменены другие свойства, такие как Km, kcat, отношение kcat/Km, специфичность к субстрату и/или профиль активности в зависимости от рН. Эти ферменты могут быть предназначены для определенного субстрата, который, как предполагается, будет иметь место, например, при получении пептидов или в гидролитических процессах, применяемых при стирке.
В одном из аспектов изобретения целью является получение варианта протеазы с измененной протеолитической активностью по сравнению с протеазой-предшественником, так как повышение такой активности (в числовом выражении) позволяет более эффективно использовать данный фермент на субстрате-мишени. Кроме того, особый интерес представляют собой вариантные ферменты с измененной теплостойкостью и/или измененной специфичностью к субстрату по сравнению с предшественником. В некоторых случаях может быть желательна более низкая протеолитическая активность, например снижение протеолитической активности необходимо при использовании синтезирующей активности протеаз (например, для синтеза пептидов). Необходимость в снижении протеолитической активности может возникнуть в тех случаях, когда она может разрушить продукт такого синтеза. И наоборот, в некоторых случаях желательно увеличить протеолитическую активность вариантного фермента по сравнению с его предшественником. Кроме того, иногда желательно повысить или понизить (изменить) устойчивость варианта, например устойчивость к щелочи или теплостойкость. Увеличение или уменьшение таких кинетических параметров, как kcat, Km или kcat/Km, производится в зависимости от субтрата.
Другим аспектом изобретения является открытие того, что варианты протеазы с замещениями аминокислот в положении одного или нескольких остатков, выполненными так, что такое замещение изменяет заряд в этом положении, делая его более отрицательным или менее положительным по сравнению с протеазой-предшественником, являются более эффективными при низкой концентрации детергента, чем протеаза-предшественник.
Еще одной отличительной особенностью этого изобретения является открытие того, что варианты протеазы с замещениями аминокислот в положении одного или нескольких остатков, выполненными так, что такое замещение изменяет заряд в этом положении, делая его более положительным или менее отрицательным по сравнению с протеазой-предшественником, являются более эффективными при высокой концентрации детергента, чем протеаза-предшественник.
Кроме того, заявители установили, что многие варианты протеазы, являющиеся эффективными в системе с низкой концентрацией детергента и/или в системе с высокой концентрацией детергента, эффективно действуют также в системе со средней концентрацией детергента.
Эти замещения предпочтительно производят в субтилизине Bacillus lentus (рекомбинантного или нативного типа), хотя подобные замещения могут быть выполнены в любой протеазе Bacillus, предпочтительно в субтилизинах Bacillus.
На основании результатов, полученных при исследовании вариантов протеаз, можно отметить, что указанные мутации в субтилизине Bacillus amyloliquefaciens имеют важное значение для протеолитической активности, эффективности и/или устойчивости этих ферментов, а также для очищающего или моющего действия таких вариантных ферментов.
Многие варианты протеазы по этому изобретению полезны для получения разных моющих композиций или средств личной гигиены, таких как шампуни или лосьоны. В композициях, содержащих мутанты протеазы по этому изобретению, можно использовать целый ряд известных соединений, являющихся приемлемыми поверхностно-активными веществами. Эти вещества являются неионогенными, анионными, катионными или цвиттерионными детергентами, описанными в патенте США №4404128, выданном Barry J.Andersen, и в патенте США №4261868, выданном Jiri Flora et al. Приемлемый моющий состав описан в примере 7 патента США №5204015 (ранее включенный в это описание изобретения в качестве ссылки). В этой области известны разные составы, которые можно использовать в качестве очищающих композиций. Понятно, что помимо обычных очищающих композиций варианты протеазы по этому изобретению могут быть использованы в любой области, где применяются нативные протеазы или протеазы дикого типа. Так, эти варианты можно использовать, например, при применениях твердого или жидкого мыла, составов для мытья посуды, растворов или продуктов для очистки контактных линз, составов для гидролиза пептидов, утилизации отходов, обработки тканей, а также в качестве расщепляющих ферментов при получении белков и т.д. Варианты по настоящему изобретению могут сообщать моющему составу более высокую эффективность (по сравнению с предшественником). Более высокая эффективность детергента определяется как лучшее выведение пятен, восприимчивых к конкретному ферменту, таких как пятна растительного происхождения или пятна крови, по методу обычной оценки после стандартного цикла стирки.
Протеазы по этому изобретению могут входить в состав известных порошкообразных и жидких детергентов с рН от 6,5 до 12,0 и концентрацией от около 0,01% вес. до около 5% вес. (предпочтительно от 0,1% до 0,5%). Эти очищающие композиции с детергентами могут содержать другие ферменты, такие как известные протеазы, амилазы, целлюлазы, липазы или эндогликозидазы, а также добавки и стабилизаторы.
Введение протеаз по этому изобретению в обычные очищающие композиции не связано с какими-либо особыми ограничениями. Другими словами, любые значения температуры и рН, приемлемые для данного детергента, приемлемы также для композиций по настоящему изобретению, если показатель рН находится в пределах вышеуказанного диапазона и данная температура ниже температуры денатурации описанной протеазы. Кроме того, протеазы по этому изобретению можно использовать в очищающей композиции без детергентов отдельно или в сочетании с добавками и стабилизаторами.
Настоящее изобретение относится также к очищающим композициям, содержащим варианты протеазы по этому изобретению. Очищающие композиции могут дополнительно содержать добавки, которые обычно используются в таких композициях. Эти добавки включают, но не ограничиваются ими, отбеливатели, поверхностно-активные вещества, модифицирующие компоненты, ферменты и катализаторы отбеливания. Специалисту в этой области должно быть очевидно, что добавки выбирают с учетом их пригодности для данной композиции. Приведенный здесь список является иллюстративным и должен рассматриваться только в качестве примеров приемлемых добавок. Специалисту в этой области должно быть также понятно, что необходимо использовать только те добавки, которые совместимы с ферментами и другими компонентами композиции, например с поверхностно-активным веществом.
Количество добавки в очищающей композиции, если она используется, составляет от около 0,01% до около 99,9%, предпочтительно от около 1% до около 95%, более предпочтительно от около 1% до около 80%.
Варианты протеаз по настоящему изобретению могут быть введены в корм для животных в качестве части добавок, как это описано, например, в патентах США №№5612055, 5314692 и 5147642.
Одним аспектом изобретения является композиция для обработки тканей, включающая варианты протеаз по настоящему изобретению. Эту композицию можно использовать для обработки, например, шелка или шерсти, как это описано в таких публикацих, как RD 216034, европейский патент №134267, патент США №4533359 и европейский патент №344259.
Далее настоящее изобретение иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем нижеследующей формулы изобретения.
Все приведенные здесь публикации и патенты полностью включены в это описание изобретения в качестве ссылки.
ПРИМЕР 1.
Большое количество вариантов протеазы получено и очищено методами, хорошо известными в этой области. Все мутации произведены в субтилизине Bacillus lentus GG36.
Полученные варианты протеазы испытывали на эффективность в двух типах детергентов и условий стирки при помощи микроскопического анализа, описанного в патенте США №60/068796 "An improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition".
В таблицах 1-13 представлены подвергнутые анализу варианты протеаз и результаты испытания в двух разных детергентах. Все значения приведены в сравнении с первой протеазой, показанной в таблице (т.е. значение 1,32 соответствует 132% выведению пятна по сравнению со 100%, полученными для первого варианта в таблице).
В столбце А показана разность заряда варианта. В столбце В приведены данные для фильтрованного детергента с концентрацией 0,67 г/л Ariel Ultra (Procter & Gamble, Цинциннати, шт.Огайо, США) в растворе, содержащем 42,78 г/м3 (3 гран/галлон) смешанной жесткости Са2+/Мg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 25°С (система с низкой концентрацией детергента). В столбце С приведены данные для фильтрованного детергента с концентрацией 3,38 г/л Ariel Futur (Procter & Gamble, Цинциннати, шт.Огайо, США) в растворе, содержащем 213,9 г/м3 (15 гран/галлон) смешанной жесткости Са2+/Мg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 40°С (система с высокой концентрацией детергента).
ПРИМЕР 2.
Нижеследующие варианты протеазы получены и испытаны аналогично примеру 1.
Варианты, приведенные в таблице 14, являются вариантами протеазы, имеющими оба типа замещений: замещения, изменяющие заряд в указанном положении, делая его более отрицательным или менее положительным, и замещения, изменяющие заряд в указанном положении, делая его более положительным или менее отрицательным по сравнению с B.lentus GG36, а также нейтральные замещения, которые не изменяют заряд в положении данного остатка. Это позволяет получить варианты протеазы, которые являются более эффективными, чем стандартная протеаза, как в системах с низкой концентрацией детергента (столбец А; 0,67 г/л фильтрованного Ariel Ultra (Procter & Gamble, Цинциннати, шт.Огайо, США) в растворе, содержащем 42,78 г/м3 (3 гран/галлон) смешанной жесткости Ca2+/Мg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 25°С), так и в системах с высокой концентрацией детергента (столбец В; 3,38 г/л фильтрованного Ariel Futur (Procter & Gamble, Цинциннати, шт. Огайо, США) в растворе, содержащем 213,9 г/м3 (15 гран/галлон) смешанной жесткости Са2+/Mg2+ и 0,3 части на миллион фермента в каждой емкости при 40°С).
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ВАРИАНТ СУБТИЛИЗИНА BACILLUS (ВАРИАНТЫ), КОДИРУЮЩАЯ ЕГО ДНК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР И ОЧИЩАЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 1998 |
|
RU2252254C2 |
| ВАРИАНТЫ ПРОТЕАЗЫ, ЗАМЕЩЕННЫЕ В НЕСКОЛЬКИХ ПОЛОЖЕНИЯХ | 1998 |
|
RU2269572C2 |
| Способы и композиции, содержащие варианты сериновой протеазы | 2012 |
|
RU2663114C2 |
| МОДИФИЦИРОВАННЫЙ СУБТИЛИЗИН, ДНК, КОДИРУЮЩАЯ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ СУБТИЛИЗИН, ВЕКТОР ЭКСПРЕССИИ, КОДИРУЮЩИЙ ДНК, И ШТАММ КУЛЬТУРЫ КЛЕТКИ ХОЗЯИНА | 1994 |
|
RU2136756C1 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ВАРИАНТЫ МИКРОБНЫХ ПРОТЕАЗ | 2009 |
|
RU2541786C2 |
| ПРОТЕАЗЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ОДНУ ИЛИ НЕСКОЛЬКО КОМБИНИРУЕМЫХ МУТАЦИЙ | 2009 |
|
RU2560978C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ В СЕБЯ ПРИМЕНЕНИЕ ВАРИАНТНЫХ МИКРОБНЫХ ПРОТЕАЗ | 2009 |
|
RU2575073C2 |
| СПОСОБЫ УЛУЧШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ БЕЛКОВ | 2008 |
|
RU2569106C2 |
| БЕЛКИ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ ИЗМЕНЕННУЮ ИММУНОГЕННУЮ РЕАКЦИЮ, И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ | 2002 |
|
RU2311458C2 |
| СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ УЛУЧШЕННЫХ ВАРИАНТОВ БЕЛКА | 2008 |
|
RU2520808C2 |
Изобретение относится к области энзимологии и белковой инженерии и может быть использовано в различных отраслях народного хозяйства, которые производят продукцию, содержащую добавки фермента с протеолитической активностью. Предложены новые варианты субтилизина, получаемые путем введения замен в аминокислотную последовательность фермента дикого типа, сопровождающихся определенным изменением заряда в соответствующем сайте, а именно увеличением отрицательного (снижением положительного) или положительного (снижением отрицательного) заряда. Варианты субтилизина, образующиеся в результате замещений первого типа, демонстрируют более высокую эффективность очищающего действия в основном в системах с низкой концентрацией детергента. Варианты субтилизина с замещениями второго типа обычно более активны в системах с высокой концентрацией детергента. Среди полученных вариантов субтилизина представлены формы, эффективно действующие как в системах с низкой, так и в системах с высокой концентрацией детергента. Получение новых вариантов субтилизина предусматривает экспрессию мутантной последовательности ДНК в клетках штамма Bacillus. Мутеины субтилизина по изобретению могут применяться в составе очищающих композиций и композиций для обработки тканей, а также в виде добавки к корму животных, и обеспечивают при этом большую эффективность действия, чем нативные формы фермента. 4 с. и 14 з.п. ф-лы, 4 ил., 14 табл.
Конвенционный приоритет установлен от 23.10.1997 в соответствии с датой подачи заявок 08/956,323, 08/956,324 и 08/956,564 в Патентное ведомство США.
| Огнетушитель | 0 |
|
SU91A1 |
| Прибор для очистки паром от сажи дымогарных трубок в паровозных котлах | 1913 |
|
SU95A1 |
| Экономайзер | 0 |
|
SU94A1 |
