Липосомальное лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи Российский патент 2020 года по МПК A61K38/17 A61K35/16 A61K47/24 A61K47/10 A61K47/14 A61K9/127 A61P17/02 

Изобретение относится к фармацевтике, в частности, к средствам для лечения местных радиационных поражений кожи липосомами, содержащими альфа-фетопротеин человека, и может использоваться в фармацевтике и в медицине.

Известно липосомальное лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи, представленное в п.РФ №2642957 по кл. А61К 31/00, 2039/5555, з. 11.03.2016., оп. 29.01.2018 г., и выбранное в качестве прототипа.

Известное средство включает в себя водный раствор человеческого альфа-фетапротеина (рчАФП) с содержанием его в количестве от 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл, раствор фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле и консерванты (парабены- метилпарабен и пропилпарабен, количество не указано). Дополнительно средство может содержать от 0,004 мг/мл до 0,06 мг/мл гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека. Получаемая композиция представляет собой эмульсию

Недостаток известного средства заключается в том, что оно не обладает агрегационной устойчивостью (стабильностью). Между тем, агрегационная стабильность является одной из ключевых характеристик любых эмульсионных препаратов, в том числе, липосомальных.

Агрегационная устойчивость является актуальной проблемой при получении липосомальных дисперсий. Даже если предполагается хранение препарата в виде лиофилизата, необходимо, чтобы за время, которое в производственном цикле липосомальная дисперсия ожидает лиофилизации, агрегация липосом была минимальной

Задачей является обеспечение агрегационной устойчивости (стабильности) лекарственного средства.

Поставленная задача решается тем, что в липосомальное лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи, включающее в себя водный раствор рекомбинантного человеческого альфа-фетопротеина (рчАФП) с содержанием его в количестве не менее 1,0 мг/мл, раствор фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле и консерванты - метилпарабен и пропилпарабен, СОГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЮ, дополнительно введен бутилгидрокситолуол при следующем соотношении компонентов:

Рекомбинантный альфа-фетопротеина (102±1)мг Фосфолипид LipoidS80 (1±0,05) г Пропиленгликоль (10,0±1,0) г Метилпарагидроксибензоат (метилпарабен) (200±5) мг Пропилпарагидроксибензоат (пропилпарабен) (75±5) мг Бутилгидрокситолуол (5±0,5) мг Вода очищенная до 100 г

Введение в липосомальное лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи такого стабилизатора как бутилгидрокситолуол, который является консервантом-антиоксидантом, ингибирует процессы окисления, следовательно, продлевает срок их хранения и годности, в указанном выше количестве позволяет существенно повысить агрегационную устойчивость липосомальной композиции при изготовлении и в дальнейшем обеспечить стабильность липосомальной композиции при хранении.

Технический результат - повышение агрегационной стойкости липосомального лекарственного средства.

Заявляемое липосомальное лекарственное средство обладает новизной в сравнении с прототипом, отличаясь от него такими существенными признаками как введение в качестве стабилизатора агрегационной устойчивости бутилгидрокситолуола и указанным выше количественным соотношением основных компонентов, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата.

Заявителю неизвестны технические решения, обладающими указанными отличительными признаками, обеспечивающими в совокупности достижение заданного результата, поэтому он считает, что заявляемое липосомальное лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи соответствует критерию «и» и из изобретательский уровень».

Заявляемое липосомальное лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи может найти широкое применение в медицине и потому соответствует критерию «промышленная применимость».

Изобретение иллюстрируется таблицами и снимками, где представлены следующие результаты испытаний заявляемого средства на агрегационную устойчивость и результаты испытаний его лечебной эффективности:

табл. 1 - результаты исследований стабильности полученных образцов;

табл. 2 - агрегационная устойчивость полученных липосом;

табл. 3 - оценка влияния липосомального лекарственного средства на течение лучевого ожога кожи у мышей CD1 при локальном облучении в дозе 60 Гр по клиническим показателям, (М±m) сутки;

табл. 4 - оценка влияния липосомального лекарственного средства на состояния кожи в зоне оговой раны у мышей через 7, 21 и 35 суток после локального облучения кожи в дозе 60 Гр гистологическим показателям (М±m);

- табл. 5 - оценка влияния липосомального лекарственного средства на стволовые клетки кожи мышей;

- фиг. 1 - депилированный участок кожи спины у мыши перед облучением

- фиг. 2 - поэтапная фиксация животного и формирование кожной складки на спине для получения локального лучевого ожога;

- фиг. 3 - вид лучевой ожоговой раны на различных стадиях патогенеза у мыши.

Заявляемое липосомальное лекарственное средство содержит водный раствор рекомбинантного человеческого альфа-фетопротеина (рчАФП), раствор фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле, консерванты - метилпарабен и пропилпарабен, и бутилгидрокситолуол при следующем соотношении компонентов:

Рекомбинантный альфа-фетопротеина (102±1)мг Фосфолипид LipoidS80 (1±0,05) г Пропиленгликоль (10,0±1,0) г Метилпарагидроксибензоат (метилпарабен) (200±5) мг Пропилпарагидроксибензоат (пропилпарабен) (75±5) мг Бутилгидрокситолуол (5±0,5) мг Вода очищенная до 100 г

Для оценки влияния бутилгидрокситолуола на стабильность и агрегационную устойчивость липосомального лекарственного средства заявителем были проведены эксперименты.

В экспериментах была проведена сравнительная оценка стабильности и агрегационной устойчивости исходной липосомальной композиции и липосомальной композиции, содержащей бутилгидрокситолуол.

Как уже говорилось выше, стабильность является одной из ключевых характеристик любых эмульсионных препаратов, в том числе, липосомальных.

Стабильность предлагаемых липосомальных композиций определялась по ГОСТ 29188.3-91 «Изделия косметические. Методы определения стабильности эмульсии» Метод основан на разделении эмульсии при центрифугировании. Используемое оборудование

Центрифуга лабораторная Eppendorf и набор пробирок; Баня водяная.

Весы лабораторные BIOSAN общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104;

Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498 и нормативно-технической документации с интервалом измеряемых температур от 0 до 100°С с ценой деления 1°С;

Две пробирки наполняли на 2/3 объема исследуемыми липосомальными композициями и взвешивали, результат записывали до второго десятичного знака. Разность массы пробирок с эмульсией не должна превышать 0,2 г.Пробирки помещали в водяную баню и выдерживали 20 мин при температуре 22-25°С. Затем пробирки вынимали, насухо вытирали их с внешней стороны и центрифугировали в течение 5 мин при частоте вращения 100 с^-1.

Затем определяли стабильность композиций. Если не наблюдали четкого расслоения, содержимое пробирки осторожно выливали на лист белой плотной бумаги и отмечали наличие или отсутствие расслоения композиции.

Липосомальную композицию считали стабильной, если после центрифугирования в пробирках наблюдали выделение не более капли водной фазы или слоя масляной фазы не более 0,5 см, а также не наблюдалось наличия расслоения композиции на листе белой бумаги.

Агрегационная устойчивость является актуальной проблемой при получении липосомальных дисперсий. Даже если предполагается хранение препарата в виде лиофилизата, необходимо, чтобы за время, которое в производственном цикле липосомальная дисперсия ожидает лиофилизации, агрегация липосом была минимальной. Поэтому, для гидратирования липидов при получении липосом в водную фазу вводятся различные стабилизаторы, повышающие агрегационную устойчивость, такие как мочевина (в концентрации от 0.1% до 5%), сахароза (до 3%), мальтоза (до 5%) и др. Агрегационную устойчивость оценивали по относительному изменению оптической плотности образца липосомальной дисперсии (8) на длине волны 650 нм до (D1) и после (D2) центрифугирования при 11000g в течение 10 минут:

Очевидно, что чем меньше относительное изменение оптической плотности образца, тем более устойчива оцениваемая дисперсия.

Обсуждение результатов.

Данные о стабильности полученных образцов приведены ниже в таблице 1.

Таким образом, использование бутилгидрокситолуола позволяет повысить стабильность липосомальной композиции.

Результаты определения агрегационной устойчивости полученных липосомальных препаратов представлены в таблице 2.

Таким образом, в сравнении с прототипом использование в заявляемом лекарственном средстве бутилгидрокситолуола позволяет повысить агрегационную устойчивость липосомальной композиции на 34% при изготовлении и в дальнейшем обеспечить стабильность липосомальной композиции при хранении.

При этом эффективность воздействия липосомального лекарственного средства с введенным в него бутилгидротокситолуолом для лечения местных радиационных поражений кожи сохранялась, что подтверждено проведенными экспериментами.

Целью данных экспериментов являлось изучение специфической фармакологической активности липосомального лекарственного средства на основе фосфолипидов, включающего рекомбинантный альфа-фетопротеин человека (рчАФП), на течение лучевого ожога кожи ША степени по клиническим показателям и показателям состояния стволовых клеток волосяных фолликулов кожи.

Липосомальное лекарственное средство представляет собой (на 100 г продукта):

Наименование компонента Концентрация Вода очищенная (ФС.2.2.0020.15) До 100 г Пропиленгликоль (ТУ 6-09-2434-81) (10,0±1,0) г Фосфолипид Lipoid S80 (ТУ 9154-004-77972392-2005) (1,0±0,05) г Метилпарагидроксибензоат (200±5) мг Пропилпарагидроксибензоат (75±5) мг Бутилгидрокситолуол (Новый компонент) (5±0,5) мг Рекомбинантный альфа-фетопротеин человека (102±1) мг

(ООО «НПП «Ферментные технологии»)

Исследования выполнены на мышах. В эксперименте использовали здоровых животных, не подвергавшихся ранее другим экспериментальным процедурам. Группы формировали методом сплошной выборки. Исследования проводили на самцах мышей стока CD1 (возраст 3 месяца на начало эксперимента, масса 24-28 г). Условия содержания и процедура эксперимента соответствовали общим правилам работ с использованием экспериментальных животных [10].

Животные каждого вида содержались в условиях вивария конвенционального типа при искусственном освещении. Животные получали полноценный гранулированный корм (БиоПро ООО «Альянс» и ПЗК 90 ОАО «Богдановичский комбикормовой завод») и питьевую воду ad libitum. Основные правила содержания и ухода соответствовали «Санитарно-эпидемиологическим требованиям к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденным постановлением Главного санитарного врача РФ от 29.08.2014 г., а также правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.).

Для каждого вида животных было сформировано по две группы: контрольная группа, где животным на место радиационного поражения кожи наносили воду для инъекций, и опытная группа, где животным на место радиационного поражения кожи наносили липосомальное лекарственное средство. Группы мышей состояли из 35 животных каждая. Из них 20 животных использовали для регистрации клинической картины лучевого ожога, 15 животных - для гистологических исследований (по 5 животных на 7-е, 21-е, 35-е сутки после облучения).

Получение лучевого ожога кожи у мышей.

Оптимальной моделью для экспериментальной оценки радиационного поражения кожи является лучевой ожог IIIA степени, так как при этом происходит повреждение эпидермиса и собственно кожи, но сохраняются эпителиальные элементы кожи, являющиеся исходным материалом для самостоятельного заживления раны, и, в то же время, клинические проявления ожога выглядят достаточно ярко. Ранее было установлено, что для получения ожога IIIA степени кожу мышей необходимо облучать в дозе 60 Гр. Процедуру получения локального лучевого ожога у мышей и кроликов проводили в соответствии с известными методикам.

За день до облучения у животных проводили депиляцию на участке кожи в центре спины площадью у мышей 9 см (фиг. 1), где показан депилированный участок кожи спины у мыши перед облучением.

Перед облучением мышей фиксировали на планшете в положении спиной кверху, формировали кожную складку на депилированном участке спины с помощью специального зажима (фиг. 2), затем проводили прицельное локальное облучение кожи в области складки. На фиг. 2 показана фиксация животного и формирование кожной складки на спине для получения локального лучевого ожога

Облучение кожи у мышей проводили с помощью гамма-установки Государственного лечебно-профилактического учреждения «Челябинский Областной Клинический Онкологический Диспансер» Theratron®Equinox. В данной установке используется источник гамма-излучения, содержащий кобальт-60. Для локального облучения кожи у животных применяли дополнительные коллиматоры с соответствующими отверстиями. Мощность дозы в зоне кожной складки у мышей составляла 1,87 Гр/мин. Площадь формируемого ожога у мышей составила 2±0,2 см².

Схема нанесения липосомального лекарственного средства на место радиационного поражения кожи следующая.

Трансдермальную аппликацию липосомального лекарственного средства и воды для инъекций на место радиационного воздействия проводили через 5 минут после облучения, затем ежедневно в течение 5 суток и далее на 7, 9, 11, 13 сутки после облучения (всего 10 аппликаций) с использованием дозатора-распрыскивателя. Мышам лекарственное средство наносили в объеме 0,04 мл в сутки (в сумме за 10 аппликаций - 0,4 мл на животное).

Животным контрольной группы наносили на место радиационного воздействия воду для инъекций по той же схеме и в тех же объемах, как и животным опытной группы.

Наблюдения клинической картины течения лучевого ожога кожи

В каждой группе животным присваивали индивидуальный номер: мышей метили стандартными способами.

Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 60 суток после облучения. Выполняли осмотр животного, оценивали и регистрировали в журнале визуальные признаки локального радиационного поражения кожи. Каждый день проводили фотографирование зоны лучевого ожога у животных с целью объективного документирования клинических проявлений лучевого поражения кожи. Фотографирование проводили с помощью фотокамеры SonyA-37 (Япония) с использованием объектива TamronAF 90 mmF/2.8 macro и фотовспышки YongnuoYN460. Применялись следующие настройки: диафрагма f 9-11, светочувствительность ISO 100, выдержка 1/160. Фокусировка проводилась вручную по дисплею камеры с использованием электронного увеличения. Масштаб съемки составлял 1:3. Для достижения равномерности освещения использовался светорассеиватель. Каталогизация, просмотр и обработка фотографий проводились с помощью программы AdobePhotoshop LightroomCC 2014.

Для каждого животного по визуальным наблюдениям и фотоматериалам рассчитывали длительность деструктивной и репаративной фаз, а также отдельных периодов этих фаз. Деструктивная фаза включает латентный период, период сухого эпидермита, период влажного эпидермита; репаративная фаза включает период струпа, период эпителизации ожоговой раны.

Длительность латентного периода рассчитывали со дня облучения до появления эритемы за вычетом 1 суток. Время со дня появления эритемы до дня формирования влажного экссудата составляет длительность периода сухого эпидермита. Время со дня появления влажного экссудата до дня формирования струпа составляет длительность периода влажного эпидермита. Время с первого дня формирования струпа до дня последнего отслоения струпа - длительность периода струпа. Время полного исчезновения дефекта кожи - окончание процесса эпителизации. Время со дня отпадения последней корочки до появления эпителия, сходного по структуре и рисунку с эпителием непораженного участка кожи - длительность периода восстановления эпителия.

Клиническая картина лучевого ожога кожи у мышей при локальном облучении в дозе 60 Гр представлена на фиг. 3, где представлен вид лучевой ожоговой раны на различных стадиях патогенеза у мыши.

Здесь А - латентный период; Б - сухой эпидермит (эритема, отек); В - влажный эпидермит; Г - струп; Д - клиническая картина лучевого ожога после отпадения последней корочки (струпа); Е - эпителизация ожоговой раны.

После скрытого периода (фиг. 3А) на депилированном участке кожи спины появлялось шелушение и легкая отечность - сухой эпидермит (фиг. 3Б), затем наступал период экссудации (фиг. 3В), характеризующийся формированием отдельных очагов серозно-геморрагического отделяемого, ссыхающегося в тонкие коричневые корочки. В дальнейшем очаги эксудации сливались между собой, образовывая сплошную корку (струп) светло-коричневого цвета (фиг. 3Г). В дальнейшем после последнего отпадения струпа наступала стадия эпителизации (фиг. 3Е).

Гистологические исследования кожи

В экспериментальных исследованиях была выполнена оценка защитного действия липосомального препарата, содержащего рекомбинантный альфа-фетопротеин человека (рчАФП) на стволовые клетки эпидермиса мышей в модели локального лучевого ожога IIIA степени тяжести.

Гистологические исследования кожи у мышей проводили на 7-е (деструктивная фаза местных лучевых поражений кожи), 21-е (репаративная фаза местных лучевых поражений кожи) и 35-е (период эпителизации репаративной фазы) сутки после облучения животных с использованием рутинных методов. Отбор животных на каждый срок обследования осуществлялся методом случайной выборки. При этом отбор материала для гистологических исследований выполнен после эвтаназии животных (методом дислокации шейных позвонков), Материал фиксировали в 10% растворе забуференного формалина (рН=7,2) и заливали в специальную среду «Гистомикс». С каждого блока-кассеты были изготовлены серийные плоскопараллельные срезы толщиной 4-5 мкм. Серийные гистологические срезы депарафинировали, окрашивали гематоксилином-эозином по общепринятым рутинным методикам.

На гистологических препаратах определяли толщину, количество слоев клеток эпидермиса в зоне ожоговой раны и количество волосяных фолликулов. Анализ линейных значений и площадей исследуемых структур и подсчет волосяных фолликулов проводили при помощи программно-аппаратного комплекса для анализа и обработки изображений в микроскопии - «ВидеоТест - Морфология 5.0».

Площадь поля зрения измерялась автоматически при помощи программно-аппаратного комплекса для анализа и обработки изображений в микроскопии, состоящей из тринокулярного микроскопа Motic ВА-400Т, цифровой цветной системы ввода изображений на базе цифровой камеры ProgRes СЗ, 1/1.8'' высокого разрешения (не менее 2080 × 1542) и программного обеспечения «ВидеоТест - Морфология 5.0», и составляла 1,2 мм². Подсчет исследуемых показателей (толщину, количество слоев эпидермиса в зоне ожоговой раны и количество волосяных фолликулов) проводили в 10 полях зрения при увеличении × 400.

Стволовые клетки эпидермиса определяли с помощью иммуногистохимической реакции с применением сыворотки CD34 производства Dako, разведение 1/65. В препаратах определяли количество CD34⁺ и CD34^- клеток. Подсчет исследуемых показателей проводили в 10 полях зрения при увеличении × 400, площадь поля зрения составляла 0,34 мм².

Статистический анализ. Для исследуемых показателей проводили расчет средней арифметической величины и ее стандартной ошибки (М±m). Статистическую значимость отличий показателей в экспериментальных группах определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты исследования. Критериями эффективности испытываемых химических веществ служит сокращение длительности периодов лучевого поражения кожи (например, более быстрое восстановление), или снижение тяжести повреждения, (например, формирование более легкой степени ожога), более длинный латентный период, отсутствие периодов влажного эпидермита, струпа в группах облученных животных, получающих испытываемое вещество по отношению к облученным нелеченым животным.

Результаты изучения действия липосомального лекарственного средства на течение лучевого ожога кожи.

Результаты клинических наблюдений, выполненных с использованием визуального и фотонаблюдения радиационного ожога кожи IIIA степени у мышей сток CD1, представлены в таблице 3.

Полное заживление ожоговой раны от момента облучения до восстановления эпителия в группе облученного контроля составило 45,4±1,7 суток. Длительность скрытого периода составила 9,2±0,4 суток, сухого эпидермита - 1,9±0,2 суток, длительность влажного эпидермита - 7,9±0,3 суток, длительность периода струпа - 6,4±0,8 суток. Длительность деструктивной фазы составила у животных контрольной группы 19,2±0,3 суток. Начиная с 26,5±0,8 суток, у животных наблюдался период эпителизации ожоговой раны (восстановление эпителия), который длился 18,9±1,3 суток. Длительность репаративной фазы составила у животных этой группы 26,2±1,8 суток.

При нанесении на кожу в зоне радиационного воздействия липосомального лекарственного средства, наблюдалось статистически значимое по отношению к показателю в облученном контроле укорочение периода струпа на 50% (t=3,45; р=0,0014). Длительность деструктивной фазы у животных этой группы статистически значимо уменьшилась по отношению к контролю на 6% (t=2,07; р=0,046), длительность репаративной фазы уменьшилась на 14%, но статистической значимости это различие не достигало. Общее время заживления лучевого ожога кожи составило 41,1±1,4 суток, что на 6% меньше, чем в контроле, однако уровень статистической значимости при t_ст=1,9 составил р=0,065.

Таким образом, по показателям длительности периодов течения лучевого ожога кожи IIIA степени у мышей исследование показало, что применение липосомального лекарственного средства оказывало благоприятное действие на течение лучевого ожога, что выразилось в сокращении длительности деструктивной фазы, сокращении периода струпа по сравнению с показателями в группе облученного контроля, более раннем наступлении периода эпителизации ожоговой раны.

В гистологических исследованиях выполнено определение толщины и количества рядов клеток эпидермиса, количество волосяных фолликулов в поле зрения. В таблице 2 представлены результаты гистологических исследований состояния кожи у мышей.

У мышей группы биологического контроля количество рядов клеток в эпидермисе составляло 2,07±0,20, толщина эпидермиса - 19,1±1,8 мкм, количество волосяных фолликулов - 13,3±0,7 в поле зрения 1,2 мм². Облучение в дозе 60 Гр привело к изменению этих показателей (группа контроль облучение + вода). На 7-е, 21-е и 35-е регистрировалось увеличение слоев эпидермиса соответственно в 1,4 раза (t=2,56; р=0,03), 4,5 (t=14,86; р<0,0001) и в 2 раза (t=5,17; р=0,0009) по отношению к биологическому контролю. Толщина эпидермиса была увеличена на 7-е, 21-е и 35-е сутки соответственно в 2 раза (t=3,58; р=0,0071), 9 раз (t=16,75; р<0,0001) и 3 раза (t=6,01; р=0,0003) по отношению к контролю. Количество волосяных фолликулов в поле зрения (1,2 мм²), напротив, было снижено на 7-е, 21-е и 35-е сутки в 8 раз (t=16,07; р<0,0001), 3 раза (t=8,84; р<0,0001) и 9 раз (t=15,49; р=р<0,0001) соответственно.

При трансдермальной аппликации липосомального лекарственного средства на ожоговую рану через 5 минут после облучения, в течение 5 суток и на 7, 9, 11, 13 сутки после облучения, на 7-е и 21-е сутки обследования показатели в группе «Облучение + лекарственное средство» не отличались от показателей в группе «Облучение + вода». Однако на 35-е сутки после облучения регистрировались статистически значимые отличия гистологических показателей у животных, получавших лечение, от облученного нелеченого контроля (группа контроль (облучение + вода)): регистрировалось увеличение толщины в 2,2 раза, количества слоев эпидермиса в 1,9 раз, что может быть интерпретировано как повышение пролиферативной активности клеток кожи на месте радиационного поражения. Количество волосяных фолликул в поле зрения у леченных липосомальным лекарственным средством мышей в 2,6 раз выше, чем у нелеченных (таблица 4).

Результаты оценки влияния липосомального лекарственного средства на стволовые клетки кожи мышей представлены в таблице 5.

У мышей в группе биологического контроля численность клеток CD34+ составила 33,1±4,3 в поле зрения, численность клеток CD34- составила 121±8,0 то есть в эпидермисе стволовые клетки составляют около трети от общего числа- - 0,28±0,03. Облучение в дозе 60 Гр привело к статистически значимому (t=5,43; р=0,0006) снижению количества клеток CD34+ до 60% от показателя в биологическом контроле на 7-е стуки после облучения, в дальнейшем наблюдалось восстановление их количества до уровня контроля. Количество CD34- клеток на 7-е и 35- е сутки не отличалось от контроля, а на 21-е сутки после облучения регистрировалось статистически значимое (t=5,43; р=0,0006) повышение показателя в 2,3 раза.

В дерме изменения, вызванные облучением в популяции стволовых клеток волосяных фолликулов, были более выражены, чем в эпидермисе. Количество CD34+ клеток во все сроки исследования было статистически значимо (соответственно t=10,38, р<0,0001; t=10,33, р<0,0001; t=10,45, р<0,0001) снижено и составляло 2-3% от показателя биологического контроля. Также регистрировалось снижение CD34- клеток на 7-е сутки в 2 раза (но не достигало статистической значимости), на 21-е и 35-е сутки в 5 (t=3,29; р=0,01) и 10 (t=3,73; р=0,01) раз соответственно.

В целом в коже (эпидермис + дерма) после облучения в дозе 60 Гр регистрируется существенное снижение CD34+ клеток в 15 раз (t=10,71; р<0,0001) на 7-е сутки, в 4 раза(5 t=8,11; р<0,0001) на 21 и в 3 раза (t=7,52; р=0,0001) на 35-е сутки после облучения. Количество CD34- клеток было статистически значимо снижено только на 35 сутки (t=3,84; р=0,005).

Трансдермальное применение липосомального лекарственного средства для лечения радиационного поражения кожи у мышей привело к статистически значимому повышению CD34+ клеток в эридермисе на 35- сутки в 4 раза, в дерме (в волосяных фолликулах) на 7-е в 4,4 раза, 21-е в 6,7 раз и 35-е в 14 раз относительно показателей у мышей с локальным нелеченным ожогом. В целом в коже (эпидермис + дерма) у облученных мышей, получавших лечение, по отношению к нелеченным мышам на всех сроках исследования наблюдается статистически значимое повышение содержания клеток CD34+. При этом увеличение CD34+ клеток более выражено не на 7-е сутки после облучения кожи, а в более отдаленные сроки - на 21-е и 35-е сутки. На основании чего, можно заключить, что срабатывает не столько защитное действие липосомального лекарственного средства, сколько стимулирующее пролиферацию стволовых клеток. На этих же сроках регистрируется повышение в 1,5 раза количества CD34- в коже (эпидермис + дерма).

В известных работах показано, что в репарации повреждений кожи участвуют как стволовые клетки эпидермиса, так и стволовые клетки волосяных фолликул. Эти клетки обладают свойствами клоногенности, мультипотентны и мигрируют в эпидермис как физиологически, так и в процессе регенерации. Таким образом, лечение липосомальным лекарственным средством обеспечивает при облучении кожи большую сохранность и восстановление волосяных фолликулов, в том числе стволовых клеток, что способствует более быстрому восстановлению кожи и является положительным эффектом действия лекарственного средства.

Таким образом, иммуногистохимические исследования показали, что в целом в коже (эпидермис + дерма) у облученных мышей, получавших лечение липосомальным лекарственным средством, по отношению к нелеченным мышам на всех сроках исследования наблюдается статистически значимое повышение содержания клеток CD34+. При этом увеличение CD34+ клеток выражено на всех сроках после облучения кожи, а в более отдаленные сроки более выражено повышение количества CD34-. У кроликов наблюдается аналогичная картина. На основании чего, можно заключить, что срабатывает не только защитное действие липосомального лекарственного средства на стволовые клетки кожи, но и стимулирующее их пролиферацию, что приводит к повышению их продукции - клеток CD34-.

По итогам экспериментов были сделаны следующие выводы:

1. В экспериментах на мышах выявлено, что по клиническим показателям заявляемое липосомальное лекарственное средство оказывает лечебное действие на течение лучевого ожога кожи IIIA степени у мышей при трансдермальном введении в течение 14 дней после облучения в месте радиационного поражения кожи, что выражается в сокращении длительности периода влажного эпидермита, периода струпа, наступлении стадии эпителизации и, таким образом, может применяться для лечения поражений кожи (радиационного дерматита), вызванных действием ионизирующего излучения

2. По гистологическим показателям применение заявляемого липосомального лекарственного средства для лечения лучевого ожога приводит к повышению пролиферативной активности клеток эпидермиса (по показателям толщины и количества слоев клеток эпидермиса), обеспечивает большую сохранность и восстановление волосяных фолликулов, а также стволовых клеток в коже.

Таким образом, заявляемое липосомальное лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи с введенным в него стабилизатором агрегационной устойчивости в виде бутилгидрокситолуола в сравнении с прототипом является агрегатно устойчивым и сохраняет при этом свою лечебную эффективность.

Изобретение относится к фармацевтике, в частности к средствам для лечения местных радиационных поражений кожи. Лекарственное средство по изобретению в виде липосом включает водный раствор рекомбинантного человеческого альфа-фетопротеина (рчАФП) с содержанием его в количестве не менее 1,0 мг/мл, раствор фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле, консерванты - метилпарабен и пропилпарабен, и бутилгидрокситолуол, в указанных в формуле изобретения количествах. Липосомальное лекарственное средство по изобретению является стабильным при хранении и характеризуется повышенной агрегационной устойчивостью как при изготовлении, так и при хранении. 3 ил., 5 табл.

Липосомальное лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи, включающее в себя водный раствор рекомбинантного человеческого альфа-фетопротеина (рчАФП) с содержанием его в количестве не менее 1,0 мг/мл, раствор фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле и консерванты - метилпарабен и пропилпарабен, отличающееся тем, что в него дополнительно введен бутилгидрокситолуол при следующем соотношении компонентов:

Рекомбинантный альфа-фетопротеин (102±1) мг Фосфолипид LipoidS80 (1±0,05) г Пропиленгликоль (10,0±1,0) г Метилпарагидроксибензоат (метилпарабен) (200±5) мг Пропилпарагидроксибензоат (пропилпарабен) (75±5) мг Бутилгидрокситолуол (5±0,5) мг Вода очищенная до 100 г