ПРИМЕНЕНИЕ ТЕТРААЦЕТИЛИРОВАННОГО 5-АМИНО-4-КАРБАМОИЛИМИДАЗОЛИЛ-1-β-D-РИБОФУРАНОЗИДА В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНКИНАЗЫ Cδ Российский патент 2020 года по МПК A61K31/7056 C07H17/02 C07D405/04 A61P43/00 

Настоящее изобретение относится к области органической и медицинской химии, а более конкретно к применению тетраацетилированного производного5-амино-4-карбамоилимидазолил-1-β-D-рибофуранозида -((АсО)₄АИКАР) в качестве ингибитора протеинкиназы Сδ.

АИКАР является природным активатором аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (АМПК). Активация АМПК оказывает разнонаправленное действие на огромное количество метаболических процессов, транскрипцию ряда генов, а также на процессы деления и апоптоза практически всех типов клеток животных (1).

Соответственно АИКАР рассматривается как потенциальное лекарственное средство для лечения и профилактики многих заболеваний, связанных с нарушением процессов, контролируемых АМПК: патологии сердечно-сосудистой системы, геморрагический шок, ожирение, метаболический синдром и диабет II типа, различные онкологические заболевания, а также как средство, повышающее физическую выносливость организма (2-9).

Однако использованию АИКАР в клинической практике препятствует его быстрая метаболизация в организме и недостаточно эффективное проникновение через биологические мембраны, что требует высоких доз для проявления его терапевтических свойств.

В связи с этим в настоящее время проводятся исследования, направленные на получение новых производных АИКАР с улучшенным целенаправленным действием и/или проявляющих новую терапевтическую активность.

С целью повышения метаболической стабильности и более эффективного проникновения соединения сквозь биологические мембраны было получено фторированное производное АИКАР, в котором одна гидроксильная группа заменена атомом фтора (10). Однако его биологические свойства не были исследованы.

Scudiero et al. получили несколько триацетилированных производных АИКАР с использованием уксусного ангидрида в пиридине в качестве ацетилирующего агента при комнатной температуре (11). В этих условиях проходит три О-ацетилирование рибозида и не затрагивается аминогруппа имидазольного фрагмента, имеющего ароматический характер.

Полученные соединения являются более гидрофобными по сравнению с исходным АИКАР, однако они не обладают активностью в отношении AMPK.

Авторами настоящего изобретения было исследовано тетраацетилированное производное (АсО)₄АИКАР, обладающее лучшими гидрофобными свойствами по сравнению с исходным соединением.

Неожиданно было обнаружено, что в отличие от АИКАР, его тетраацетилированное производное (АсО)₄АИКАР не проявляет активность в отношении АМПК, а обладает новыми, не характерными для других представителей этого класса свойствами: является эффективным ингибитором протеинкиназы Сδ(ПКСδ).

Физиологическая роль протеинкиназы С-δ (ПKCδ) крайне многообразна, так как при активации этот фермент может фосфорилировать большое количество таргетных белков, участвующих в разных и разнонаправленных процессах - апоптоз (1), пролиферация и выживание (2), гормональная регуляция (3), и иммунный ответ (4,5) и воспалительные реакции (6). У мышей, лишенных протеинкиназы С-δ, (PKCδ^-/- мутанты) не развивается резистентность к глюкозе при содержании на высокожировой диете (7), не развивается воспалительная реакция и апоптоз в гладкой мускулатуре при моделировании аневризмы брюшной аорты (6), с другой стороны такие мыши более восприимчивы к туберкулезу и заболевание протекает у них в более тяжелой форме(8).

Протеинкиназа С-δ, также как и другие протеинкиназы С, включает каталитический и регуляторный домен. Предполагается, что взаимодействие различных активаторов с регуляторным доменом PKCδ приводит к транслокации ее в разные компартменты клетки, что приводит к активации разных процессов (9). Так церамид и интерферон стимулируют перемещение протеинкиназы С дельта в аппарат Гольджи, форболовый эфир - в митохондрии (10).

По аналогичной схеме ингибиторы протеинкиназы С-δисключают ее участие из различных процессов.

В частности, показано, что неспецифический ингибитор всех протеинкиназ С: роттлерин ингибирует синтез коллагена культурой фибробластов.

Peter J. Wermuth предложено использование специфических ингибиторов протеинкиназы С-δ для лечения системной склеродермии человека. (11).

В другой работе предлагается использование синтетической молекулы CGX1037 в качестве специфического ингибитора протеинкиназы С-δ в тромбоцитах для предотвращения повышенного тромбообразования (12). Данное решение выбрано в качестве прототипа. К его недостаткам можно отнести сложность молекулы, а также его активность лишь в отношении тромбоцитов.

Задачей предлагаемого изобретения является применение тетраацетилированного АИКАР - 5-ацетиламино-4-карбамоилимидазолил-1-(2',3',5'-три-O-ацетил)-β-D-рибофуранозида ((АсО)₄АИКАР) по новому, не характерному для АИКАР и его производных назначению - для ингибирования протеинкиназы Сδ.

Технический результат - заявленное тетраацетилированное производное (АсО)₄АИКАР является эффективным селективным ингибитором протеинкиназы Сδ (ПКСδ), действующим за счет специфического ингибирования ПКСδ/NF-κB пути.

Важным является и то, что (АсО)₄АИКАР не обладает высокой токсичностью в отношении здоровых клеток, что позволяет активно использовать его в предотвращении нарушений, вызванных активностью ПКСδ без повреждения здоровых клеток.

Предлагаемое соединение (АсО)₄АИКАР получается путем проведения реакции ацилирования АИКАР уксусным ангидридом в присутствии пиридина при нагревании. Процесс проводят при нагревании смеси АИКАР с уксусным ангидридом в присутствии пиридина в мольном соотношении 1:5:5 при 90°С-110°С в течение 6-10 ч. В этих условиях проходит реакция О-ацетилирования трех гидроксигрупп в положениях 2', 3' и 5' фрагмента молекулы рибофуранозида и N-ацетилирование аминогруппы в положении 5 имидазольного фрагмента молекулы.

Реакция протекает по следующей схеме:

Процедура получения (АсО)₄АИКАР заключается в следующем:

К смеси эквимолярных количеств уксусного ангидрида и пиридина добавляют АИКАР, массу нагревают до 90°С-110°С и перемешивают при этой температуре в течение 6-10 ч. За ходом реакции наблюдают с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ - метанол в соотношении 10:1. Анализ пластин проводят под УФ-лампой с длиной волны 254 нм. После охлаждения до комнатной температуры реакционную массу разбавляют бензолом и упаривают на роторном испарителе. Небольшой избыток уксусного ангидрида и пиридина удаляется при этом вместе с бензолом в виде азеотропной смеси. Выделение и очистку (АсО)₄АИКАР проводят при помощи колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя для удаления примесей вначале хлороформом, затем смесью хлороформ - метанол в соотношении 40:1. Целевой продукт элюируют смесью хлороформ - метанол в соотношении 10:1.

С помощью молекулярного моделирования выполнена оценка встраивания (АсО)₄АИКАР в регуляторный домен белка ПКСδ. Исходная структура ПКСδ 1PTR, размещенная в базе www.rcsb.org, представляет собой ПКСδ в комплексе с форболовым эфиром (ФЭ). Предполагается, что встраивание (АсО)₄АИКАР в сайт связывания ФЭ определяет возможность блокировать ПКСδ-зависимый апоптоз.

Проведенное in silico исследование ввиду успешного встраивания (АсО)₄АИКАР в регуляторный домен белка ПКСδ дало основание для его анализа как ингибитора ПКСδ в клеточных системах.

Исследования проводились на культурах клеток линий MCF-7 и MDA-МВ231, полученных из коллекции АТСС (США).

Базовый раствор (АсО)₄АИКАР представляет собой 100 мМ раствор в 100% ДМСО. Эксперименты проводили с 4-мя концентрациями (АсО)₄АИКАР - 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 мМ, для этого базовый раствор перед добавлением к клеткам разводили культуральной средой, так, чтобы конечная концентрация ДМСО не превышала 2%.

Активация транскрипционного фактора NF-κB - один из основных «ответов» клетки на активацию ПКСδ. Форболовый эфир является специфическим активатором ПКСδ/NF-κВ-сигнального пути. (14). В опытах с культурами клеток показано, что (АсО)₄АИКАР в концентрации 1 мМ предотвращает трансактивацию NF-κB, вызванную форболовым эфиром. Таким образом, (АсО)₄АИКАР рассматривается как специфичный ингибитор ПКСδ/NF-κВ-пути.

Исследования in vitro и in silico свидетельствуют о том, что (АсО)₄АИКАР является специфичным ингибитором ПКСδ/NF-κB сигнального пути и приводит к блокированию ПКСδ-зависимого апоптоза.

Изобретение иллюстрируется следующими рисунками:

Фиг. 1. Масс-спектр (ESI/MS) (АсО)₄АИКАР.

Фиг. 2. ИК спектр (АсО)₄АИКАР в диске с калия бромидом.

Фиг. 3. Молекулярное моделирование встраивания (АсО)₄АИКАР в регуляторный домен ПКСδ.

Фиг. 4. Анализ ПКСδ/NF-κВ-зависимой трансактивации.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами, но не ограничивается ими.

Примеры (1-3) ацетилирования 5-амино-4-карбамоилимидазолил-1-β-D-рибофуранозида (АИКАР).

Пример 1. Смесь 3,9 г (38,5 ммоль, 3,6 мл) уксусного ангидрида и 3,0 г (38,5 ммоль, 3,2 мл) сухого пиридина перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем добавляют 2 г (7,7 ммоль) 5-амино-4-карбамоилимидазолил-1-β-D-рибофуранозида. Реакционную массу нагревают до 110°С и перемешивают при этой температуре в течение 6 ч, затем охлаждают до комнатной температуры. Далее в реакционную массу добавляют 50 мл бензола и упаривают на роторе досуха. Остаток хроматографируют на силикагеле вначале хлороформом, затем смесью хлороформ-метанол (40:1). Собирают фракцию с R_f 0,39 (SiO₂, хлороформ-метанол, 10:1). После удаления растворителей осадок перемешивают с 10 мл абсолютного этилового спирта при комнатной температуре в течение 15 мин, отфильтровывают и сушат. Получают 0,48 г (30,0%) 5-Ацетиламино-4-карбамоилимидазолил-1-(2',3',5'-три-O-ацетил)-β-D-рибофуранозида ((АсО)₄АИКАР). Т. пл. 122-124°С. Найдено: %С 47.71, %Н 5.51, %N 12.90. C₁₇H₂₂N₄O₉. Вычислено: %С 47.89, %Н 5.20, %N 13.14. Масс-спектр (ESI/MS), m/z: получено 449.1273 [M+Na]⁺, 875.2665 [2M+Na]⁺(Рассчитано для C₁₇H₂₂N₄O₉[M+Na]⁺449.13, [2M+Na]⁺875.27). ¹Н ЯМР-спектр (400 МГц) в ДМСО-d₆, (δ, м.д): 7,96 (с, 1Н, 2-Н), 5,60 (d, 1Н, 1'Н), 5,53 (t, 1Н, 2'Н), 5,31 (t, 1H, 3'Н), 4,24-4,34 (сложный сигнал, 3Н, 2×5'-Н, 4'-Н), 2,50 (с, 3Н, СН₃). 2,08 (с, 3Н, СН₃). 2,05 (с, 3Н, СН₃), 2,04 (с, 3Н, СН₃) (Фиг. 1). ИК-спектр, см^-1:1740, 1680, 1650 см^-1 (С=O), 1620, 1580 см^-1 (С=С, C=N), 1230, 1250, 1280 см^-1 (С-О), 3070, 3410 (NH), 2800-2940 и 3180-3300 см^-1 (СН) (Фиг. 2).

Пример 2. Смесь 2,0 г (19,3 ммоль, 1,8 мл) уксусного ангидрида и 1,5 г (19,3 ммоль, 1,6 мл) сухого пиридина перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем добавляют 1 г (3,9 ммоль) 5-амино-4-карбамоилимидазолил-1-β-D-рибофуранозида. Реакционную массу нагревают до 90°С и перемешивают при этой температуре в течение 10 ч. По окончании реакции реакционную массу обрабатывают как описано в примере 1 и получают 0,19 г (23,1%) (АсО)₄АИКАР с т. пл. 122-124°С.

Пример 3. (АсО)₄АИКАР получают аналогично примеру 2, но реакционную массу нагревают до 100°С и перемешивают при этой температуре в течение 8 ч. Получают 0,21 г (26,5%) (АсО)₄АИКАР с т. пл. 122-124°С.

Пример 4. Компьютерное моделирование взаимодействия (АсО)₄АИКАР с ПКСδ.

Исходная структура ПКСδ 1PTR, размещенная в базе www.rcsb.org, представляет собой ПКСδ в комплексе с форболовым эфиром (ФЭ). Молекулярное моделирование проведено в программе ICM 3.8 с использованием структуры регуляторного домена ПКСδ 1PTR.

Согласно данным молекулярного моделирования, наличие в молекуле (АсО)₄АИКАР ацетильной группы при 5-ом атоме азота имидазольного цикла определяет способность молекулы проникать в сайт ПКСδ, отвечающий за связывание ФЭ (обозначен коричневым цветом) и эффективно с ним взаимодействовать (Фиг. 3). Встраивание молекулы (АсО)₄АИКАР в сайт связывания ФЭ стерически препятствует присоединению к ПКС(ФЭ, ингибируя ПКСδ-зависимый апоптоз.

Как видно из фиг. 3 ингибирование ПКСδ обеспечивается встраиванием в активный центр фермента молекулы, содержащей ацетильный остаток при 5-ом атоме рибозы.

Проведенное in silico исследование дало основание для анализа (АсО)₄АИКАР как ингибитора ПКСδ в клеточных системах.

Пример 5. Оценка цитотоксичности (АсО)₄АИКАР.

Прежде, чем изучать специфическое влияние (АсО)₄АИКАР на активность ПКСδ, определяли концентрацию (АсО)₄АИКАР в культивационный среде, не угнетающую рост и развитие клеток - IC50 (концентрация полумаксимального ингибирования). Для оценки цитотоксичности использовали стандартный МТТ-тест (15,16).

Для приготовления базового 100 мМ раствора (АсО)₄АИКАР 50 мг соединения растворили в 1,17 мл ДМСО (AcrosOrganics, 99,7% pure) при комнатной температуре. 100 мМ раствор хранили при -20°С до проведения анализа.

Клетки человека линии MCF-7и MDA-MB231 получены из коллекции АТСС (США). Клеточные линии культивировали in vitro в стандартной среде DMEM (HyClone, highmodified), содержавшей 10% эмбриональной сыворотки телят (HyClone), 110 мг/л пирувата натрия, пенициллин (50 ед./мл, ПанЭко) и стрептомицин (50 мкг/мл, ПанЭко) при 37°С, 5% СО2,370С и относительной влажности 85%.

Клетки рассевали на 24-луночные планшеты (Costar, США) (3×104 клеток в 900 мкл культуральной среды). Через 24 часа в лунки вносили (АсО)₄АИКАР или ДМСО (контроль) в 100 мкл культуральной среды. Использовали 4 концентрации (АсО)₄АИКАР - 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 мМ, для этого из базового раствора отбирали 5, 10, 15 и 20 мкл соответственно и доводили объем до 100 мкл культуральной средой. Культуры инкубировали при 370С, 5% CO2 в течение 72 часов. По окончании инкубации среду удаляли и вносили в лунки 350 мкл раствора МТТ - смеси тетразолиевой соли (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Р-тетразолий, внутренняя соль), и планшеты помещали в CO2-инкубатор на 2 часа. О жизнеспособности клеток судили по цветной реакции, развивающейся при восстановлении тетразолия формазандегидрогеназами митохондрий. Раствор МТТ удаляли из лунок и образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 300 мкл ДМСО. Окраску регистрировали на спектрофотометре при длине волны 540 нм. Оптическую плотность в лунках, где клетки инкубировались только с растворителем (контроль), принимали за 100%. Показатели оптической плотности в лунках с каждой концентрацией испытуемых препаратов усредняли и вычисляли процент выживших клеток при определенной концентрации исследуемого препарата. Расчет IC50 (концентрация полумаксимального ингибирования) выполняли в ПО Graph Pad Prismc помощью алгоритма нелинейной регрессии.

МТТ-тест не выявил значительных цитотоксических эффектов(АсО)₄АИКАР. Значения IC50 для исследованных линий клеток превышали 1,3 мМ. Таким образом, работа с (АсО)₄АИКАР в краткосрочных тестах in vitro возможна в концентрациях до 1,3 мМ.

Пример 6. Ингибирование активации ПКСδ (АсО)₄АИКАР в культуре клеток.

Специфическим активатором ПКСδ является форболовый эфир (ФЭ). Внесение к культуральную среду ФЭ в 20 нг/мл вызывает в культивируемых клетках активацию ПКСδ, которая, в свою очередь, активирует транскрипцию, регулируемую транскрипционным фактором NF-κB.

Для определения уровня ингибирования NF-κВ-зависимой трансактивации (АсО)₄АИКАР в клетках MCF-7, клетки трансфицировали плазмидой, содержащей репортерный ген люциферазы под контролем NF-κВ-чувствительного промотора.

Определение активности люциферазы проводили на планшетном люминометре "TECAN Infinite M200Pro" согласно рекомендациям производителя люциферазного реагента (Promega). Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р<0.05. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программ DATAPLOT и GraphPadPrism.

(АсО)₄АИКАР предотвращает трансактивацию NF-κB, вызванную ФЭ (Фиг. 4). Добавление 1 мМ (АсО)₄АИКАР приводит к снижению активности NF-κB до неиндуцированного (контрольного) уровня.

Таким образом, (АсО)₄АИКАР рассматривается как специфичный ингибитор ПКСδ/NF-κB-пути.

Исследования in vitro и in silico свидетельствуют о том, что (АсО)₄АИКАР является специфичным ингибитором ПКСδ/NF-κB сигнального пути, не обладает высокой токсичностью и подходит для блокирования ПКСδ-зависимого апоптоза в клетках различных линий.

Список литературы.

1. Hardie DG1, Ross FA, Hawley SA.AMP-activated protein kinase: a target for drugs both ancient and modern. Chem Biol. 2012 Oct 26;19(10):1222-36.

2. Agnes S. Kim, Edward J. Miller, Tracy M. Wright, Ji Li, Dake Qi, Kwame Atsina, Vlad Zaha, Kei Sakamoto, and Lawrence H. Younga. A small molecule AMPK activator protects the heart against ischemia-reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol. 2011 Jul; 51(1): 24-32.

3. Terai K, Hiramoto Y, Masaki M, Sugiyama S, Kuroda T, Hori M, Kawase I, Hirota H. AMP-activated protein kinase protects cardiomyocytes against hypoxic injury through attenuation of endoplasmic reticulum stress. Mol Cell Biol. 2005 Nov; 25(21):9554-75.

4. Dzmitry Matsiukevich, Giovanna Piraino, Lindsey R.Klingbeil, Paul W. Hake, Vivian Wolfe, Michael O'Connor, and Basilia Zingarelli. The AMPK activator AICAR ameliorates age-dependent myocardial injury in murine hemorrhagic shock. Shock. 2017 Jan; 47(1): 70-78.

5. BlerinaKola Ashley B. Grossman MartaKorbonits. The Role of AMP-Activated Protein Kinase in Obesity. Front Horm Res. Basel, Karger, 2008, vol 36, pp 198-211.

6. Lingyan Wu1, Lina Zhang 1, Bohan Li1, Haowen Jiang, YananDuan, ZhifuXie, Lin Shuai1, Jia Li and Jingya Li. AMP-Activated Protein Kinase (AMPK) Regulates Energy Metabolism through Modulating Thermogenesis in Adipose Tissue. Front. Physiol., 21 February 2018.

7. Philippe, Pinson, Jim Dompierre, Pantesco, Bertrand Daignan-Fornier, and Michel Moenner. AICAR Antiproliferative Properties Involve the AMPK-Independent Activation of the Tumor Suppressors LATS 1 and 2. Neoplasia. 2018 Jun; 20(6): 555-562.

8. Enyu Rao, Yuwen Zhang, Qiang Li, Jiaqing Hao, Nejat K. Egilmez, Jill Suttles, Bing Li. AMPK-dependent and independent effects of AICAR and compound С on T-cell responses

9. Narkar VA, Downes M, Yu RT, Embler E, Wang YX, Banayo E, Mihaylova MM, Nelson MC, Zou Y, Juguilon H, Kang H, Shaw RJ, Evans RM. AMPK and PPARdelta agonists are exercise mimetics. Cell. 2008 Aug 8;134(3):405-15.

10. Stefano , Giorgia Oliviero, Nicola Borbone, Jussara Amato, Daniele , Vincenzo Piccialli, Luciano Mayol and Gennaro Piccialli. A Facile Synthesis of 5'-Fluoro-5'-deoxyacadesine (5'-F-AICAR):A Novel Non-phosphorylable AICAR Analogue. Molecules 2012, 17, 13036-13044.

11. Olga Scudiero, Ersilia Nigra, Maria Ludovica Monaco, Giorgia Oliviero, Rita Polito, Nicola Borbone, Stefano , Luciano Mayol, Aurora Daniele &Gennaro Piccialli. New synthetic AICAR derivatives with enhancedAMPK and ACC activation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 31:5, 748-753.

12. Brodie C, Blumberg P.M. Regulation of cell apoptosis by protein kinase с delta. Apoptosis. 2003, 8, 19-27.

13. Pabla N, Dong G, Jiang M, Huang S, Kumar MV, Messing RO, Dong Z (2013) Inhibition of PKCdelta reduces cisplatin-induced nephrotoxicity without blocking chemotherapeutic efficacy in mouse models of cancer. J Clin Invest 121:2709-2722.

14. Holden N.S., Squires P.E., Kaur M., Bland R., Jones C.E., Newton R. Phorbol ester-stimulated NF-kappaB-dependent transcription: roles for isoforms of novel protein kinase C. Cell Signal. 2008; 20(7): 1338-1348.

15. Iselt M., Holtei W., Hilgard P. The tetrazolium dye assay for rapid in vitro assessment of cytotoxicity. Arzneimittelforschung. 1989; 39(7): 747-749.

16. Merlin J.L., Azzi S., Lignon D., Ramacci C., Zeghari N., Guillemin F. MTT assays allow quick and reliable measurement of the response of human tumour cells to photodynamic therapy. Eur J Cancer. 1992; 28A(8-9): 1452-1458.

Изобретение относится к области органической химии и к медицине. Предложено применение тетраацетилированного производного 5-амино-4-карбамоилимидазолил-1-β-D-рибофуранозида - ((АсО)₄АИКАР) в качестве селективного ингибитора протеинкиназы Сδ. (АсО)₄АИКАР эффективно ингибирует протеинкиназу Сδ (ПКСδ) за счёт специфичного ингибирования ПКСδ/NF-κB сигнального пути. Поскольку (АсО)₄АИКАР не обладает высокой токсичностью в отношении здоровых клеток, это позволяет использовать его в предотвращении нарушений ПКСδ/NF-κB сигнального пути, например для предотвращения апоптоза или повышенного тромбообразования. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 пр.

1. Применение соединения структурной формулы (I) для селективного ингибирования протеинкиназы Сδ

2. Применение соединения по п. 1, в котором ингибирование протеинкиназы Сδ приводит к селективному ингибированию ПКСδ/NF-κВ сигнального пути.

3. Применение соединения по п. 1, в котором ингибирование протеинкиназы Сδ приводит к блокировке ПКСδ-зависимого апоптоза.

4. Применение соединения по п. 1, в котором ингибирование протеинкиназы Сδ происходит в клеточной системе.