ДЕТЕКЦИЯ ЦЕЛЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПУТЕМ НАНОПОРОВОГО СЕНСОРНОГО ОБНАРУЖЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ЗОНДОВ Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/68 G01N33/487 G01N27/00 B82Y5/00 

Ссылка на родственную заявку

Согласно настоящей заявке испрашивается преимущество в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №62/056378, поданной 26 сентября 2014 года, раскрытие которой включено в настоящий документ с помощью ссылки.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и, следовательно, включен с помощью ссылки в полном его объеме. Указанная копия в формате ASCII, созданная 28 октября 2015 года, имеет название 30607PCT_CRF_sequencelisting.txt и размер 753 байта.

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для детекции целевой последовательности с помощью нанопорового устройства.

Уровень техники

Детекция, локализация и определение числа копий конкретных участков последовательностей в отрезке нуклеиновых кислот, называемая здесь «детекцией целевой последовательности», применяется в медико-биологической науке и технологии, медицине, сельском хозяйстве и криминалистике, а также в других областях. Детекция генов и их модификаций, последовательности, локализации или количества является важным для усовершенствования молекулярной диагностики в медицине. ДНК-микрочипы, ПЦР, саузерн-блоттинг и FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) - все они являются способами, которые можно применять для проведения или облегчения детекции целевой последовательности. Эти способы являются медленными и трудоемкими и имеют ограниченную точность и разрешение. Более современные способы, такие как методы ПЦР в режиме реального времени и секвенирование нового поколения (NGS), обладают улучшенной производительностью, но до сих пор не имеют достаточного разрешения для многих применений.

Было продемонстрировано, что с помощью твердотельных нанопор можно детектировать молекулы путем подачи напряжения между этими порами и измерения электрического сопротивления при прохождении молекулы через нанопору. Общая эффективность любого данного нанопорового устройства зависит от его способности точно и надежно измерять электрическое сопротивление и производить различие молекул различных типов, которые проходят через него. Из опубликованных в литературе результатов экспериментов видно, что детекция как цепей ДНК и РНК, проходящих через поры, так и синтетических молекул, которые гибридизируются с конкретными последовательностями на них. Тем не менее, никто не смог их использовать для создания высокопроизводительного и надежного нанопорового устройства для детекции зондов на конкретных последовательностях ДНК или РНК. Разработанные к настоящему моменту зонды были недостаточно надежны для детекции последовательностей. Таким образом, существует потребность в группе зондов и комплексах зондов, которые могу специфически связываться с последовательностью для детекции в нанопоре.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам детекции полинуклеотида, содержащего целевую последовательность, в образце, предусматривающим: приведение в контакт указанного образца с зондом, который специфично связывается с указанным полинуклеотидом, содержащим указанную целевую последовательность, в условиях, которые способствуют связыванию указанного зонда с указанной целевой последовательностью, с образованием комплекса полинуклеотид-зонд; загрузку указанного образца в первую камеру нанопорового устройства, причем указанное нанопоровое устройство содержит по меньшей мере одну нанопору и по меньшей мере указанную первую камеру и вторую камеру, причем указанные первая и вторая камеры находятся в электрическом и жидкостном сообщении посредством указанной по меньшей мере одной нанопоры, и причем нанопоровое устройство дополнительно характеризуется независимо управляемым напряжением между каждой из указанной по меньшей мере одной нанопоры и сенсором, связанным с каждой из указанной по меньшей мере одной нанопоры, причем указанный сенсор может идентифицировать объекты, проходящие через по меньшей мере одну нанопору, и причем указанный комплекс полинуклеотид-зонд, перемещающийся через указанную по меньшей мере одну нанопору, подает детектируемый сигнал, связанный с указанным комплексом полинуклеотид-зонд; и определение наличия или отсутствия указанного комплекса полинуклеотид-зонд в указанном образце путем отслеживания указанного детектируемого сигнала, таким образом детектируя указанный полинуклеотид, содержащий указанную целевую последовательность. В соответствии с одним вариантом осуществления способ дополнительно предусматривает создание напряжения в указанной по меньшей мере одной нанопоре, причем указанное напряжение создает силу, оказывающую воздействие на указанный комплекс полинуклеотид-зонд для протягивания указанного комплекса полинуклеотид-зонд через указанную по меньшей мере одну нанопору, заставляя указанный комплекс полинуклеотид-зонд перемещаться через указанную по меньшей мере одну нанопору для создания указанного детектируемого сигнала.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления указанный полинуклеотид представляет собой ДНК или РНК. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный детектируемый сигнал представляет собой электрический сигнал. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный детектируемый сигнал представляет собой оптический сигнал. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный зонд включает в себя молекулу, выбранную из группы, состоящей из белка, пептида, нуклеиновой кислоты, TALEN, CRISPR, пептид-нуклеиновой кислоты или химического соединения. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный зонд включает в себя молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК), пептид-нуклеиновой кислоты (PNA), гибрида ДНК/РНК, полипептида или любого химически полученного полимера.

В соответствии с одним вариантом осуществления указанный зонд включает в себя молекулу PNA, связанную со вторичной молекулой, способной облегчать детекцию зонда, связанного с указанным полинуклеотидом, в процессе перемещения через указанную по меньшей мере одну нанопору. В соответствии со следующим вариантом осуществления указанной вторичной молекулой является PEG. В соответствии со следующим вариантом осуществления указанный PEG характеризуется молекулярной массой по меньшей мере 1 кДа, 2 кДа, 3 кДа, 4 кДа, 5 кДа, 6 кДа, 7 кДа, 8 кДа, 9 кДа или 10 кДа.

В соответствии с одним вариантом осуществления указанный способ детекции полинуклеотида, содержащего целевую последовательность, в образце дополнительно предусматривает применение к указанному образцу условия, предположительно приводящего к изменению связывающего взаимодействия между зондом и целевой последовательностью. В соответствии со следующим вариантом осуществления условие выбрано из группы, состоящей из удаления зонда из образца, добавления средства, которое конкурирует с зондом за связывание с целевой последовательностью, и изменение изначального pH, солевого или температурного условия.

В соответствии с одним вариантом осуществления указанный полинуклеотид содержит химическую модификацию, способную модифицировать связывание полинуклеотида с зондом. В соответствии со следующим вариантом осуществления химическая модификация выбрана из группы, состоящей из биотинилирования, ацетилирования, метилирования, сумоилирования, гликозилирования, фосфорилирования и окисления.

В соответствии с одним вариантом осуществления указанный зонд содержит химическую модификацию, соединенную с зондом с помощью расщепляемой связи. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный зонд взаимодействует с целевой последовательностью полинуклеотида посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, металлической связи, ван-дер-ваальсовой силы, гидрофобного взаимодействия или межплоскостных стэкинг-взаимодействий. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный способ детекции полинуклеотида, содержащего целевую последовательность, в образце дополнительно предусматривает приведение образца в контакт с одной или более детектируемыми метками, способными связываться с зондом или с комплексом полинуклеотид-зонд. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный полинуклеотид содержит по меньшей мере две целевые последовательности.

В соответствии с одним вариантом осуществления указанная нанопора имеет диаметр от около 1 нм до около 100 нм, длину от 1 нм до около 100 нм, и причем каждая из камер содержит электрод. В соответствии с одним вариантом осуществления указанное нанопоровое устройство содержит по меньшей мере две нанопоры, выполненные с возможностью управлять движением указанного полинуклеотида одновременно в обоих нанопорах. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный способ детекции полинуклеотида, содержащего целевую последовательность, в образце дополнительно предусматривает изменение полярности указанного независимо управляемого напряжения после начальной детекции комплекса полинуклеотид-зонд по указанному детектируемому сигналу, с тем чтобы обращалось движение указанного полинуклеотида через нанопору после прохождения связанной с зондом части через нанопору, таким образом еще раз идентифицируя наличие или отсутствие комплекса полинуклеотид-зонд.

В соответствии с одним вариантом осуществления указанное нанопоровое устройство содержит две нанопоры, и причем указанный полинуклеотид одновременно расположен в обеих из указанных двух нанопор. В соответствии со следующим вариантом осуществления указанный способ детекции полинуклеотида. содержащего целевую последовательность, в образце предусматривает корректировку величины и или направления напряжения в каждой из указанных двух нанопор так, чтобы нанопорами создавалась противодействующая сила для управления скоростью перемещения полинуклеотида через нанопоры.

Настоящее изобретение относится к способу детекции полинуклеотида или полинуклеотидной последовательности в образце, предусматривающему: приведение в контакт указанного образца с первым зондом и вторым зондом, причем указанный первый зон специфично связывается с первой целевой последовательностью указанного полинуклеотида в условиях, которые способствуют связыванию указанного первого зонда с указанной первой целевой последовательностью, а указанный второй зонд специфично связывается со второй целевой последовательностью указанного полинуклеотида в условиях, которые способствуют связыванию указанного второго зонда с указанной второй целевой последовательностью; приведение в контакт указанного образца с третьей молекулой, которая может одновременно связываться с указанным первым и вторым зондом при нахождении в достаточной близости друг к другу указанного первого и второго зонда в условиях, которые способствуют связыванию указанной третьей молекулы с указанным первым зондом и указанным вторым зондом, таким образом образуя слитый комплекс, содержащий указанный полинуклеотид, указанный первый зонд, указанный второй зонд и указанную третью молекулу; загрузку указанного образца в первую камеру нанопорового устройства, причем указанное нанопоровое устройство содержит по меньшей мере одну нанопору и по меньшей мере указанную первую камеру и вторую камеру, причем указанная первая и вторая камеры находятся в электрическом и жидкостном сообщении посредством указанной по меньшей мере одной нанопоры, и причем нанопоровое устройство дополнительно характеризуется управляемым напряжением между каждой из указанной по меньшей мере одной нанопоры и сенсором, связанным с каждой их указанной по меньшей мере одной нанопорой, причем указанный сенсор может идентифицировать объекты, проходящие через по меньшей мере одну нанопору, а указанный слитый комплекс, перемещающийся через указанную по меньшей мере одну нанопору, подает детектируемый сигнал, связанный с указанным слитым комплексом; и определение наличия или отсутствия указанного слитого комплекса в указанном образце путем отслеживания указанного детектируемого сигнала.

В соответствии с одним вариантом осуществления указанный полинуклеотид представляет собой ДНК или РНК. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный детектируемый сигнал представляет собой электрический сигнал. В соответствии с одним вариантом осуществления указанный детектируемый сигнал представляет собой оптический сигнал. В соответствии с одним вариантом осуществления указанная достаточная близость составляет менее 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 нуклеотидов. В соответствии с одним вариантом осуществления указанная третья молекула включает в себя PEG или антитело.

В соответствии с одним вариантом осуществления указанная третья молекула и указанные первый и второй зонды связаны с ssDNA, и причем указанная ssDNA, связанная с указанной третьей молекулой, содержит участок, комплементарный участку ssDNA, связанному с указанным первым зондом, и комплементарный участку ssDNA, связанному со указанным вторым зондом. В соответствии с одним вариантом осуществления способ детекции полинуклеотида или полинуклеотидной последовательности в образце дополнительно предусматривает приведение в контакт образца с одной или более детектируемыми метками, способными связываться с третьей молекулой или со слитым комплексом.

Также настоящее изобретение относится к набору, содержащему первый зонд, второй зонд и третью молекулу, причем первый зонд может связываться с первой целевой последовательностью на целевом полинуклеотиде, второй зонд может связываться со второй целевой последовательностью на указанном целевом полинуклеотиде, а указанная третья молекула может связываться с первым зондом и вторым зондом при связывании указанного первого и второго зондов с указанным полинуклеотидом в указанной первой и второй целевых последовательностях, таким образом локализуя первый и второй зонд в достаточной близости для осуществления одновременного связывания указанной третьей молекулы с указанным первым и вторым зондами.

В соответствии с одним вариантом осуществления указанный первый зонд и указанный второй зонд выбраны из группы, состоящей из белка, пептида, нуклеиновой кислоты, TALEN, CRISPR, пептид-нуклеиновой кислоты или химического соединения. В соответствии с одним вариантом осуществления указанная третья молекула включает в себя PEG или антитело. В соответствии с одним вариантом осуществления указанная третья молекула включает в себя модификацию, модифицирующую аффинность связывания с указанными зондами.

Также настоящее изобретение относится к нанопоровому устройству, содержащему по меньшей мере две камеры и нанопору, причем указанное устройство содержит модифицированный PNA-зонд, связанный с полинуклеотидом в указанной нанопоре.

Также настоящее изобретение относится к двухпоровому устройству со сдвоенным усилителем для детекции заряженного полимера с помощью двух пор, причем устройство содержит верхнюю камеру, среднюю камеру и нижнюю камеру, первую пору, соединяющую верхнюю камеру и среднюю камеру, и вторую пору, соединяющую среднюю камеру и нижнюю камеру, причем указанное устройство содержит модифицированный PNA-зонд, связанный с полинуклеотидом в указанной первой или второй поре.

В соответствии с одним вариантом осуществления устройство выполнено с возможностью одновременного управления движением указанного заряженного полимера через как указанную первую пору, так и указанную вторую пору. В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированный PNA-зонд связан по меньшей мере с одной молекулой PEG. В соответствии с одним вариантом осуществления устройство дополнительно содержит источник питания, способный подавать первое напряжение между верхней камерой и средней камерой и подавать второе напряжение между средней камерой и нижней камерой, причем каждое напряжение можно независимо корректировать, средняя камера соединена с общим заземлением для двух напряжений, устройство имеет электронный компонент, выполняющий функцию сдвоенного усилителя и предназначенный для независимого управления напряжением и измерения тока в каждой поре, причем два напряжения могут отличаться по величине, а первая и вторая пора выполнены таким образом, чтобы заряженный полимер мог одновременно двигаться через обе поры в любом направлении и управляемым образом.

Краткое описание чертежей

Чертежи представлены в качестве вариантов осуществления настоящего раскрытия и приведены лишь в качестве примерной иллюстрации, а не ограничения.

На фиг. 1 проиллюстрирована детекция целевой молекулы, связанной с модифицированным зондом в паре нанопор, в качестве одного из вариантов раскрываемого в настоящем документе способа.

На фиг. 2 показано влияние зонда, связывающегося с целевой молекулой, на электрический сигнал, вырабатываемый при перемещение комплекса через нанопору.

На каждой из фиг. 3А и 3В показан вариант осуществления с двумя зондами, связанными с полинуклеотидом на их соответствующих целевых последовательностях, а также третьей, образующей мостик молекулой (например, антителом) для облегчения детекции зонда в нанопоре при связывании обоих зондов с остовом.

На фиг. 4 показаны два зонда, связанные с полинуклеотидом на их соответствующих целевых последовательностях, причем третья, образующая мостик молекула является PEG и присоединяется к зондам с помощью комплементарных ssDNA-линкеров, делая возможной детекцию зонда при связывании в достаточной близости обоих зондов с остовом.

На фиг. 5 показаны два зонда, связанные с полинуклеотидом на их соответствующих целевых последовательностях в достаточной близости для осуществления детекции оптического сигнала, вырабатываемого при их близости, например, при резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET).

На фиг. 6А представлено схематическое изображение системы, которая сочетает в себе нанопоровое устройство с эпифлуоресцентным микроскопом, обеспечивающим возможность детекции модифицированного флуорофором связывающего средства. На фиг. 6В представлена иллюстрация того, что видно с помощью детектора по мере прохождения флуорофора через устройство с двумя нанопорами, расположенными в одной плоскости. На фиг. 6С показано изменение амплитуды тока и соответствующего флуоресцентного сигнала при прохождении остова через нанопору.

На фиг. 7 показано связывание зондов, у которых есть группы (например, флуорофоры), которые поддаются отщеплению, для облегчения детекции.

На фиг. 8 проиллюстрирована мультиплексирующая способность настоящей технологии при включении зондов разного размера, каждый из которых связывается к уникальной целевой последовательностью несущей целевую последовательность молекуле. На этой иллюстрации двухцепочечная ДНК представляет собой полинуклеотид с целевой последовательностью и несколькими различными связывающимися с ДНК зондами, которые связываются с подлежащими детекции целевыми последовательностями.

На фиг. 9А показан PNA-лиганд, который был модифицирован с целью увеличения заряда лиганда и, следовательно, облегчения детекции с помощью нанопоры. На фиг. 9В показан пример, в котором двухцепочечную ДНК используют в качестве несущего целевую последовательность полимера и нескольких различных связывающихся с ДНК зондов, которые связываются с подлежащими детекции целевыми последовательностями.

На фиг. 10 показано несколько различных специфических к последовательностям зондов, связанных с ДНК при ее прохождении через нанопору, что обеспечивает мультиплексированную детекцию.

На фиг. 11А-С показаны нанопора и иллюстративные кривые тока и популяции, полученные в результате перемещения молекул через нанопору. На фиг. 11А показан контур твердотельной поры и напряжения. На фиг. 11В показана блокада тока и время задержки молекулы, проходящей через нанопоры. На фиг. 11С показаны различные популяции молекул, проходящих через нанопору, на основе их времени задержки и средней амплитуды тока.

На фиг. 12А показан пример применения PNA-зондов, связанных с биотипом, которые образуют комплекс с более крупной молекулой нейтравидин, что обеспечивает детекцию последовательностей на ДНК-остове. На фиг. 12В показаны сайты связывания для PNA-зондов на ДНК-остове.

На фиг. 13 показано перемещение несвязанной ДНК, свободного нейтравидина и комплекса PNA-биотин, связанного с ДНК и с нейтравидином. Также показаны полученные кривые тока (ток по оси y, время по оси x) при перемещении молекулы через нанопору под действием подаваемого напряжения на каждый комплекс.

Такие комплексы ДНК/PNA/нейтравидин лежат в основе кривых изменения тока при перемещении молекул, которые можно детектировать относительно фоновых событий других типов (например, только связанной ДНК и только нейтравидина) и поэтому можно пометить как детектируемые события, представляющие собой PNA-зонды, связанные с ДНК (т.е. комплекс ДНК/PNA/нейтравидин).

На фиг. 14А показана диаграмма разброса событий, характеризующихся сдвигом длительности и средней проводимости, обусловленным перемещением через нанопору трех популяций: только ДНК (x), только нейтравидина (квадрат) и ДНК в комплексе с биотиновым зондом, присоединенным к нейтравидину (кружок), На фиг. 14В показана гистограмма вероятности времени задержки, связанной с каждой из описанных выше трех популяций. На фиг. 14С показаны результаты анализа по сдвигу в геле только ДНК (дорожка 2), образца, содержащего ДНК, PNA с 3 биотиновыми сайтами для связывания нейтравидина и нейтравидин (дорожка 3), образца, содержащего ДНК, PNA с 7 биотиновыми сайтами для связывания нейтравидина и нейтравидин (дорожка 3), образца, содержащего ДНК, PNA с 16 биотиновыми сайтами для связывания нейтравидина и нейтравидин (дорожка 3), и образца, содержащего ДНК, PNA с 36 биотиновыми сайтами для связывания нейтравидина и нейтравидин (дорожка 3).

На фиг. 15 приведена схема сайтов связывания зондов на ДНК-остове, где зондом является белок VspR.

На фиг. 16А приведена схема несвязанной молекулы ДНК, проходящей через нанопору, и иллюстративная кривая тока, связанная с одной молекулой, проходящей через нанопору. На фиг. 16В приведена схема связанной с VspR молекулы ДНК, проходящей через нанопору, и иллюстративная кривая тока, связанная с ее прохождением через нанопору.

На фиг. 17 показаны еще десять иллюстративных событий ослабления тока, соответствующих прохождению через пору связанного с VspR остова.

На фиг. 18А показан PNA-PEG-зонд, связанный с его целевой последовательностью на молекуле dsDNA. На фиг 18В показаны результаты анализа по сдвигу в геле со следующими образцами: только ДНК (дорожка 1), ДНК/PNA (дорожка 2), ДНК/PNA-PEG (10 кДа) (дорожка 3) и ДНК/PNA-PEG (20 кДа) (дорожка 4). На фиг 18С показаны результаты анализа по сдвигу в геле со следующими образцами: ДНК-маркер (дорожка 1), случайная последовательность ДНК, инкубированная с PNA-зондом (дорожка 2), ДНК с одним несовпадением в целевой последовательности, инкубированная с соответствующим PNA-зондом (дорожка 3), а также ДНК с целевой последовательностью, смешанная с соответствующим PNA-зондом, специфичным к целевой последовательности (дорожка 4).

На фиг. 19А показаны иллюстративные события кривой тока по мере прохождения молекулы, изображенной ниже для каждой кривой тока, через нанопору по действием подаваемого напряжения. На фиг. 19В показана диаграмма разброса событий, характеризующихся сдвигом длительности и средней проводимости, обусловленным перемещением через нанопору трех популяций: ДНК/bisPNA (квадрат), ДНК/bisPNA-PEG 5 кДа (кружок) и ДНК/bisPNA-PEG 10 кДа (ромб). На фиг. 19С показана гистограмма вероятности сдвига средней проводимости, связанной с каждой из описанных выше трех популяций. На фиг. 19D показана гистограмма вероятности длительности события, связанной с каждой из описанных выше трех популяций.

На фиг. 20А показаны иллюстративные кривые событий, коррелирующие с перемещением PNA-PEG-зонда, связанного с молекулой ДНК. На фиг. 20В показан график зависимости сдвига средней проводимости относительно длительности для каждого зарегистрированного события в нанопоре от образца, содержащего бактериальную ДНК и PNA-PEG -зонд. На фиг. 20С и фиг. 20D показаны соответствующие гистограммы, описывающие характеристики этих событий, детектированных по соответственно сдвигу средней проводимости и длительности каждого события. На фиг. 20Е показаны результаты анализа по сдвигу в геле, на которых видны: лесенка 100 п.о. (дорожка 1), ДНК 300 п.о. с последовательностью cftr дикого типа, инкубированная с PNA-PEG-зондом (дорожка 2), и ДНК 300 п.о. с последовательностью cftr ΔF508, инкубированная с PNA-PEG-зондом (дорожка 3).

На фиг. 21А приведены результаты анализа по сдвигу в геле, причем дорожка 1 содержит бактериальную ДНК S. mitis без связанного bisPNA-PEG, а дорожка 2 содержит ДНК S. mitis со связанным сайт-специфичным bisPNA-PEG. На фиг. 21В показана диаграмма разброса сдвига средней проводимости (dG) по вертикальной оси относительно продолжительности по горизонтальной оси для всех зарегистрированных событий в двух последовательных экспериментах. Первый образец включал бактериальную ДНК с PEG-модифицированными PNA-зондами (ДНК/bisPNA-PEG). Второй образец включал только бактериальную ДНК.

Некоторые из фигур или все фигуры представляют собой схематичные представления для иллюстрации; следовательно, на них не обязательно изображены действительные относительные размеры или расположения показанных элементов. Фигуры представлены с целью иллюстрации одного или более вариантов осуществления с явным пониманием того, что они не ограничивают объем или значение пунктов приведенной ниже формулы изобретения.

Подробное описание изобретения

По всей настоящей заявке текст относится к различным вариантам осуществления настоящих питательных веществ, композиций и способов. Различные описанные варианты осуществления предназначены для приведения ряда иллюстративных примеров и не должны пониматься как описания альтернативных категорий. Скорее следует отметить, что описания различных вариантов осуществления, приведенных в настоящем документе, могут быть перекрывающимися по объему. Рассматриваемые в настоящем документе варианты осуществления являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Также, в настоящем раскрытии различные публикации, патенты и опубликованные описания патентов приведены с помощью указательной ссылки. Раскрытия этих публикаций, патентов и опубликованных описаний патентов таким образом включены в настоящее раскрытие с помощью ссылки для более полного описания состояния области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Используемая в описании и формуле изобретения форма единственного числа включает ссылки на множественное число, если контекст явно не указывает на иное. Например, термин «электрод» включает в себя множество электродов, в том числе их смеси.

В контексте настоящего описания термин «содержащий» предназначен для обозначения, что устройства и способы включают перечисленные компоненты или стадии, но без исключения других. «Фактически состоящий из» при использовании для определения устройств и способов должен подразумевать исключение других компонентов или стадий, представляющих какое-либо существенное значение для комбинации. «Состоящий из» должен подразумевать исключение других компонентов или стадий. Варианты осуществления, определяемые каждым из таких переходных терминов, входят в объем настоящего изобретения.

Все числовые обозначения, например, расстояние, размер, температура, время, напряжение и концентрация, в том числе диапазоны, являются приближениями, которые понимают как охватывающие обычное экспериментальное отклонение при измерении параметров, и что такие отклонения понимают как входящие в объем описанного варианта осуществления. Следует понимать, хотя и не всегда указано явно, что перед всеми такими числовыми обозначениями идет термин «около». Также следует понимать, хотя и не всегда указано явно, что описанные в настоящем документе компоненты являются всего лишь иллюстративными, и что в настоящей области техники известны их эквиваленты.

В контексте настоящего описания термин «нанопора» (или просто «пора») относится к одному наноразмерному отверстию в мембране, которая разделяет два объема. Пора может представлять собой, например, белковый канал, внедренный в липидную двухслойную мембрану, или может быть сконструирована путем пробуривания, или протравливания, или с помощью способа импульсного напряжения через тонкую твердотельную основу, такую как нитрид кремния, или диоксид кремния, или графен, или слои из комбинации этих или других материалов. Геометрически пора имеет размеры не менее 0,1 нм в диаметре и не более 1 мкм в диаметре; длина поры регулируется толщиной мембраны, которая может быть субнанометровой толщиной или до 1 мкм или более. В случае мембран толще нескольких сот нанометров нанопора может называться «наноканалом».

В контексте настоящего описания термин «нанопоровые приборы» относятся к устройствам, которые сочетают в себе одну или более нанопор (параллельно или последовательно) с контуром для сенсорного обнаружения отдельных молекулярных событий. В частности, нанопоровые приборы предусматривают применение чувствительного усилителя с фиксатором напряжения для подачи указанного напряжения через пору или поры при измерении ионного тока через пору(поры). При захвате и направлении через пору под действием электрофореза одной заряженной молекулы, такой как двухцепочечная ДНК (dsDNA), измеренные значения сдвига тока, указывающие на событие захвата (т.е. перемещение молекулы через нанопору или захват молекулы в нанопоре), и величину сдвига (в амплитуде тока) и длительность события используют для характеристики молекулы, захваченной в нанопоре. После регистрации множества событий в ходе эксперимента, распределения событий анализируют для получения характеристик соответствующей молекулы по величине ее сдвига (т.е. ее кривой тока). Таким образом, нанопоры обеспечивают простой, без использования меток, чисто электрический мономолекулярный способ биомолекулярного сенсорного обнаружения.

В контексте настоящего описания термин «событие» относится к перемещению детектируемой молекулы или молекулярного комплекса через нанопору и к связанному с ним показателю. Его можно определить по его току, длительности и/или другим характеристикам детекции молекулы в нанопоре. Множество событий с аналогичными характеристиками указывают на популяцию молекул или комплексов, которые являются идентичными или имеют схожие характеристики (например, объем, заряд).

Молекулярная детекция

Настоящее раскрытие относится к способам и системам для молекулярной детекции и количественного определения. Кроме того, с помощью способов и систем также можно измерять аффинность связывания зонда с целевой молекулой. Кроме того, такая детекция, количественное определение и измерение могу быть осуществлены мультиплексным образом, что значительно увеличивает их эффективность.

На фиг. 1 представлена иллюстрация одного варианта осуществления раскрываемых способов и систем. Более конкретно, система включает в себя несущую целевую последовательность молекулу (102), которая содержит целевой мотив 101, который необходимо детектировать или количественно определить. Зонд (103) способен связываться со специфическим мотивом 101 связывания на несущей целевую последовательность молекуле 102. Можно добавить дополнительную молекулу для облегчения детекции зонда (107), при его наличии на несущем целевую последовательность полинуклеотиде.

Таким образом, если все они присутствуют в растворе, зонд 103 связывается с целевым мотивом посредством специфического распознавания зондом целевого мотива 101. Такое связывание обуславливает образование комплекса, который включает в себя зонд и целевую последовательность.

Образовавшийся комплекс (101/103 или 101/103/107) можно детектировать с помощью устройства (104), которое включает в себя две поры (105 и 106), что разделяет внутреннее пространство устройства на 3 объема и сенсор рядом с порой, который может идентифицировать объекты, проходящие через пору. Этот вариант осуществление представляет собой двухнанопоровое устройство, причем две нанопоры расположены параллельно. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нанопоровое устройство включает электронные компоненты для подачи управляемых напряжений через нанопоры (причем такие напряжения, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, могут быть независимо управляемыми и фиксированными) по контуру для измерения движения тока через нанопоры. Напряжение может регулироваться для управляемого движения полинуклеотида из одного объема в другой через поры. Полинуклеиновая кислота заряжена или модифицирована таким образом, чтобы она содержала заряды, прилагаемая разница потенциалов или напряжения через поры облегчает движение заряженного остова и управляет им посредством приложения электростатической силы на заряженную молекулу, на которую воздействует поле напряжения. Несмотря на то, что фиг. 1 показано двухнанопоровое устройство, описанные выше принципы можно применять в соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения с использованием однонанопорового устройства. Если ниже не указано иное, отсылки к поре, или нанопоре, или нанопоровому устройству предназначены для охвата одно-, двух- или многопорового устройства в пределах идеи настоящего изобретения.

В случае загрузки в нанопору образца, который включает в себя образованный комплекс, нанопора может быть выполнена с возможностью пропускать несущую целевую последовательность молекулу через пору. При нахождении целевого мотива в поре или рядом с порой статус связывания целевого мотива может быть детектирован сенсором.

В контексте настоящего описания «статус связывания» целевого мотива относится к тому, занят ли зондом мотив связывания. Фактически, статус связывания имеет два варианта: либо связанный, либо не связанный. Или же, (i) целевой мотив свободен и не связан с зондом (см. 201 и 204 на фиг. 2), (ii) целевой мотив связан с зондом (см. 202 и 205 на фиг. 2). Кроме того, могут быть использованы зонды различных размеров или с различными сайтами связывания зонда с получением дополнительных профилей тока (см., например, 203 и 206 на фиг. 2), что делает возможной детекцию более одной целевой последовательности на одной несущей целевую последовательность молекуле.

Детекция статуса связывания целевого мотива может быть осуществлена различными способами. В соответствии с одним аспектом, в силу различных размеров целевого мотива в каждом статусе (т.е. занятом или не занятом), при прохождении целевого мотива через пору различные размеры дают в результате различные токи через пору. В связи с этим нет необходимости в отдельном сенсоре для детекции, поскольку электроды, которые соединены с источником питания и могут детектировать ток, могут выполнять сенсорную функцию. Таким образом, эти два электрода могут служить в качестве «сенсора».

В соответствии с некоторыми аспектами средство (например, 107 на фиг. 1) добавляют к комплексу для усиления детекции. Это средство может связываться с зондом или комплексом полинуклеотид/зонд. В соответствии с одним аспектом средство имеет заряд, либо отрицательный, либо положительный, что облегчает детекцию. В соответствии с другим аспектом средство увеличивает размер, что облегчает детекцию. В соответствии с другим аспектом средство включает детектируемую метку, например, флуорофор.

В этом контексте идентификация статуса связывания (II) свидетельствует о том, что целевая последовательность в несущей целевую последовательность молекуле находится в комплексе с зондом. Другими словами, происходит детекция целевой последовательности.

В соответствии с другим вариантом осуществления связанные молекулы расположены на расстоянии друг от друга для индивидуальной детекции связанных молекул по изменениям сопротивления, причем каждая связанная молекула дает значение сопротивления, которое не перекрывается соседними связанными молекулами.

В соответствии с одним вариантом осуществления связанные зонды отделены друг от друга расстоянием по меньшей мере 1 нм (т.е. примерно 3 п.н. для полинуклеотида на основе нуклеиновой кислоты). В соответствии с другим вариантом осуществления связанные зонды отделены друг от друга расстоянием по меньшей мере 10 нм (т.е. примерно 33 п.н. для полинуклеотида на основе нуклеиновой кислоты). В соответствии с другим вариантом осуществления связанные зонды отделены друг от друга расстоянием по меньшей мере 100 нм (т.е. примерно 333 п.н. для полинуклеотида на основе нуклеиновой кислоты). В соответствии с другим вариантом осуществления связанные зонды отделены друг от друга расстоянием по меньшей мере 500 нм (т.е. примерно 1666 п.н. для полинуклеотида на основе нуклеиновой кислоты).

В соответствии с некоторыми аспектами способ дополнительно предусматривает наличие двух независимых зондов, которые, если они достаточно близко друг к другу, после связывания с полинуклеотидом могут связываться с третьей молекулой. Связывание с этой третьей молекулой дает отличную кривую тока при перемещении, таким образом свидетельствуя о том, что два независимых зонда находятся в непосредственной близости.

Механизмы определения, связываются ли зонды в непосредственной близости, позволяют применять короткие зонды, с помощью которых можно проводить различие между несоответствиями по отдельным парам оснований, и, следовательно, детектировать аллели с однонуклеотидным полиморфизмом (или однонуклеотидными мутациями), а также более длинные зонды, выполняющие роль маркеров для определения уникальной области в геноме. В соответствии с одним вариантом осуществления применяют два зонда в комбинации для определения, является ли конкретная последовательность ассоциированной с конкретным целевым геном. В соответствии с другим вариантом осуществления этот способ применяют для определения структурных перестроек с помощью зондов в качестве маркеров для таких участков в геноме. В соответствии с другим вариантом осуществления применяют два зонда в комбинации для определения, является ли конкретная последовательность химически (эпигенетически, например, путем метилирования, гидроксиметилирования) модифицированной и ассоциированной с конкретным целевым геном.

В соответствии с одним вариантом осуществления третья молекула представляет собой антитело (301), которое связывается только с зондами (305 и 306), если по меньшей мере два зонда связаны с полинуклеотидом (304) и находятся весьма близко друг к другу (на расстоянии от 0,01 нм до 50 нм) (фиг. 3А). В соответствии с другим вариантом осуществления половина эпитопа, относящегося к антителу (301), соединена с каждой молекулой зонда (302 и 303) (посредством ковалентного присоединения, ионной, Н-связи или иным образом), что делает связывание антитела зависимым от того, чтобы оба эпитопа были расположены в непосредственной близости друг от друга, что свидетельствует о том, что зонды располагаются достаточно близко друг к другу (фиг. 3В). В соответствии с одним вариантом осуществления каждый зонд представляет собой молекулу PNA, и каждая молекула PNA содержит сегмент эпитопа связывания, относящегося к антителу, или присоединена к нему (ковалентным присоединением, ионной, Н-связью или иным образом). В соответствии с одним вариантом осуществления частичные эпитопы должны находиться в достаточной близости для связывания антителом с образованием комплекса с полинуклеотидом.

В соответствии с другим вариантом осуществления молекулу PEG (310) применяют в качестве третьей молекулы для связывания с двумя зондами (302 и 303), которые находятся в непосредственной близости и связаны с полинуклеотидом (304). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления PEG модифицирован для придания достаточного объема, заряда или других свойств, которые, при наличии, обеспечивают уникальную кривую (фиг. 4). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления PEG модифицирован для увеличения аффинности связывания к зондам, которые находятся в непосредственной близости. Такая модификация связывания на PEG может представлять собой, например, молекулу одноцепочечной ДНК (ssDNA) на каждом конце PEG, которая комплементарна свободной ssDNA, прикрепленной к каждому зонду. В соответствии с одним вариантом осуществления энергетический барьер, необходимый для связывания PEG с зондами, преодолевается только в том случае, когда оба олигомера ssDNA связаны с их комплементарной последовательностью, прикрепленной к зондам (фиг. 4). Таким образом, зонды, которые находятся на таком расстоянии, которое охватывается PEG, детектируют в нанопоре посредством детекции комплекса PEG/зонд/полинуклеотид, в то время как находящиеся на более далеком расстоянии друг от друга - нет. Как будет понятно рядовому специалисту, ssDNA можно заменить на синтетические аналоги нуклеиновых кислот, такие как PNA, или на РНК.

В соответствии с некоторыми аспектами два независимых зонда модифицирут так, чтобы сделать возможной детекцию в случае, если они связаны с полинуклеотидом в непосредственной близости. В соответствии с одним вариантом осуществление модификация зондов включает в себя изменение ионного заряда зондов с тем, чтобы изменить кривую тока в том случае, когда зонды связаны с полинуклеотидом в непосредственной близости и проходят через нанопору, по сравнению с кривой тока в том случае, когда через нанопору проходит один комплекс зонд/полинуклеотид. не находящийся в непосредственной близости от второго зонда. В соответствии с одним вариантом осуществления добавление положительного заряда обоим зондам (например, путем внесения в зонды метки 2-гидроксиэтилтиосульфонат (MTSET)) дает иную кривую тока перемещения, если оба зонда находятся в достаточной близости в пространстве на полинуклеотиде, а эффект заряда является аддитивным, в отличие от их связывания с полинуклеотидом на далеком расстоянии друг от друга.

В соответствии с некоторыми аспектами способ дополнительно предусматривает применение зондов, которые имеют достаточную длину, чтобы сделать возможным связывание только с одной уникальной последовательности в целевой популяции, но также обладают способностью не связываться с целевым сайтом, если присутствует хотя бы одно несоответствие пар оснований. Это возможно при применении PNA-зондов. Как было показано (Strand-Invasion of Extended, Mixed-Sequence B-DNA by γPNAs. G. He, D. Ly et. al., J Am Chem Soc. 2009 September 2; 131 (34): 12088-12090. Doi:10.1021/ja900228j), гамма-PNA-зонд из 20 п.о. способен эффективно связываться с идеально соответствующей целевой последовательностью, но связывание не происходит, если целевая последовательность и последовательность зонда различаются хотя бы одним основанием. Если рассматривать человеческий геном, который содержит 3,1 миллиарда оснований, то последовательность из 20 пар оснований может случайным образом встретиться 0,003 раза. Таким образом, зонд из 20 пар оснований, сконструированный для связывания с конкретной исследуемой последовательностью, весьма маловероятно свяжется с нежелательным местоположением и даст ложноположительный результат. В примерах, приведенных на (фиг. 19С и 21), показано, как PNA- и PNA-PEG-зонды избирательно связываются только с комплементарной последовательностью.

В соответствии с некоторыми аспектами способ дополнительно предусматривает наличие двух независимых зондов, которые содержат элементы, которые испускают детектируемый сигнал, если два зонда присоединены к полинуклеотиду на достаточно близком расстоянии друг от друга. В соответствии с одним вариантом осуществления каждый зонд помечен флуорофором (см., например, фиг. 5 (315, 316)). Спектры эмиссии детектируют с помощью детектора (317), если зонды находятся на достаточно близком расстоянии друг от друга, чтобы вырабатывать детектируемый сигнал. В соответствии с одним вариантом осуществления два зонда помечены флуорофорами различного цвета. Если зонды находятся в непосредственной близости друг от друга, то цвета будут визуализироваться вместе (или при смешивании будут давать новый цвет), который можно детектировать с помощью внешнего сенсора, например, камеры или микроскопа, и это будет свидетельствовать о том, что два зонда находятся близко друг к другу в пространстве. В соответствии с родственным вариантом осуществления тип детекции FRET (или BRET) применяют для определения близости двух зондов, при котором один флуоресцентно меченый зонд будет влиять на спектр испускания энергии другого при нахождении в непосредственной близости от него.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления детектируемая метка представляет собой флуорофор. Для детекции флуорофора нанопоровое устройство, изготовленное в одной плоскости со стеклянной крышкой, может быть объединено в комбинацию с эпифлуоресцентным микроскопом для обеспечения возможности детекции двойной амплитуды тока и флуоресцентного сигнала. На фиг. 6А показано, как такое устройство можно применять для детекции внесенной флуорофорной метки. Нанопоровое устройство помещают под объектив эпифлуоресцентного микроскопа. По мере проведения измерения показателей нанопор, микроскоп непрерывно захватывает изображения области нанопор. Область нанопор освещают с помощью источника широкополосного возбуждения, которое фильтруют таким образом, чтобы через него могли проходить только волны со значениями длины, соответствующими спектру возбуждения флуорофора. Дихроичный фильтр избирательно обеспечивает передачу волн со значениями длины, соответствующими спектру излучения флуорофора, при этом отражая все волны с другими значениями длины волны. По мере прохождения через нанопоры модифицированной флуорофором связывающей молекулы, флуорофоры поглощают спектр возбуждения и вторично испускают другой спектр излучения. Эмиссионный фильтр перед детектором обеспечивает, чтобы детектировались только волны со значениями длины, соответствующими спектру излучения флуорофора. Таким образом, детектор будет получать сигнал только при прохождении флуорофора через нанопору. На фиг. 6В показана проекция сверху вниз нанопорового устройства, которую видно под микроскопом во время испускания сигнала от флуорофора. На фиг. 6С показано, как детекцию флуорофора можно применять в сочетании с сигналом от нанопоры. Применение двух сигналов повышает достоверность детекции биомолекулы.

В соответствии с некоторыми аспектами способ дополнительно предусматривает применение зондов, имеющих присоединенные элементы, которые делают возможной детекцию с помощью сенсора, но они присоединены к зонду с помощью расщепляемого линкера. Таким образом, группа зондов, которые можно отличить друг от друга в нанопоре, связана с несущим целевую последовательность полинуклеотидом. После детекции группы зондов в нанопоре, элементы отщепляются, и вносят новую группу зондов, у которых также есть отщепляемый элемент детекции (фиг. 7). Цикл внесение/отщепление/промывка можно продолжать, пока вся информация о последовательности не будет извлечена из захваченной целевой молекулы. Пример молекул, которые облегчают детекцию зонда, рассмотрены выше. Примерами расщепляемых линкеров являются расщепляемые при восстановлении линкеры (дисульфидные линкеры, расщепляемые ТСЕР), расщепляемый под действием кислоты линкер (гидразоновые/гидразидные связи), аминокислотные последовательности, которые расщепляются под действием протеаз, линкеры на основе нуклеиновых кислот, которые расщепляются эндонуклеазами (сайт-специфическими ферментами рестрикции), расщепляемые под действием основания линкеры или легкие расщепляемые линкеры [Leriche, Geoffray, Louise Chisholm, and Alain Wagner. "Cleavable linkers in chemical biology." Bioorganic & medicinal chemistry 20, no. 2 (2012): 571-582.]

Целевые мотивы

Для нуклеиновых кислот и полипептидов, в отношении которых применяют способ детекции целевой последовательности, целевой мотив связывания может представлять собой нуклеотидную или пептидную последовательность, которая узнается молекулой зонда. Целевые мотивы могут быть химически модифицированными (например, метилированными) или заняты другими молекулами (например, активатором или репрессорами), и, в зависимости от природы зонда, можно выявить статус целевого мотива. В соответствии с некоторыми аспектами целевая последовательность содержит химическую модификацию для связывания зонда с полинуклеотидом. В соответствии с некоторыми аспектами химическая модификация выбрана из группы, состоящей из ацетилирования, метилирования, сумоилирования, гликозилирования, фосфорилирования, биотинилирования и окисления.

Молекулы зондов

В соответствии с настоящей технологией молекулу зонда детектируют или количественно определяют по ее связыванию с несущим целевую последовательность полинуклеотидом.

В контексте настоящего описания подразумевают, что зонды способны специфически связываться с сайтом на полинуклеотиде, причем такой сайт характеризуется определенной последовательностью или структурой. Примеры молекул зонда включают в себя PNA (белок-нуклеиновую кислоту), bisPNA, гамма-PNA, PNA-конъюгат, который увеличивает размер или заряд PNA. Другие примеры молекул зондов можно найти в группе, состоящей из природного или рекомбинантного белка, слитого белка, ДНК-связывающего домена белка, пептида, нуклеиновой кислоты, олигонуклеотида, TALEN, CRISPR, PNA (белок-нуклеиновой кислоты), bisPNA, гамма-PNA, PNA-конъюгата, который увеличивает размер, заряд, флуоресценцию или функциональность (например, введение олиго-метки), или любого другого дериватизированного из PNA полимера и химического соединения.

В соответствии с некоторыми аспектами зонд содержит γ-PNA. γ-PNA имеет одну модификацию в пептидо-подобном остове, в частности, в γ-положении N-(2-аминоэтил) глицинового остова, в результате чего образуется хиральный центр (Rapireddy S., et al., 2007. J. Am. Chem. Soc, 129:1 5596-600; He G, et al., 2009, J. Am. Chem. Soc, 131: 12088-90; Chema V, et al., 2008, Chembiochem 9: 2388-91; Dragulescu-Andrasi, A., et al., 2006, J. Am. Chem. Soc, 128: 10258-10267). В отличие от bisPNA, γ-PNA может связываться с dsDNA без ограничения последовательности, оставляя одну из двух цепей ДНК доступной для последующей гибридизации.

В соответствии с некоторыми аспектами функция зонда заключается в гибридизации с полинуклеотидом с целевой последовательностью путем комплементарного спаривания оснований с образованием стабильного комплекса. Молекулу PNA можно дополнительно связать с дополнительными молекулами с образованием комплекса, который имеет достаточно большую площадь поверхности в поперечном сечении для создания детектируемого изменения или контраста амплитуды сигнала относительно фона, который является средней или усредненной амплитудой сигнала, соответствующей сечениям полинуклеотида без связанного зонда.

Стабильность связывания целевой последовательности полинуклеотида с молекулой PNA имеет важное значение для того, чтобы ее можно было детектировать с помощью нанопорового устройства. Стабильность связывания должна сохраняться на протяжении всего периода перемещения через нанопору несущего целевую последовательность полинуклеотида. Ecли устойчивость является слабой или нестабильной, то зонд может отделиться от целевого полинуклеотида и не будет детектироваться по мере прохождения через нанопоры несущего целевую последовательность полинуклеотида.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления примером зонда является PNA-конъюгат, в котором PNA-часть специфично распознает нуклеотидную последовательность, а конъюгатная часть увеличивает различия размера/формы/заряда между различными PNA-конъюгатами.

Как проиллюстрировано на фиг. 8, каждый из лигандов А, В, С и D специфично связывается с сайтом молекулы ДНК, и эти лиганды можно идентифицировать и отличить друг от друга по их ширине, длине, размеру и/или заряду. Если их соответствующие сайты соответственно обозначить как А, В, С и D, то идентификация лигандов приводит к выявлению таких последовательностей ДНК. A-B-C-D. с учетом состава сайтов и порядка.

В лиганды могут быть включены различные реакционноспособные фрагменты для создания химической «ручки», с которой можно конъюгировать метки. Примеры реакционноспособных фрагментов включают без ограничения первичные аминогруппы, группы карбоновых кислот, кетоновые, амидные, альдегидные, бориновых кислот, гидразиновые, тиоловые, малеимидные, спиртовые и гидроксильные группы и биотип.

На фиг. 9А показан PNA-лиганд, который был модифицирован с целью увеличения заряда лиганда и, следовательно, облегчения детекции с помощью нанопоры. В частности, этот лиганд, который связывается с целевой последовательностью ДНК путем комплементарного спаривания оснований и хугстеновского спаривания оснований между основаниями на молекуле PNA и основаниями в целевой ДНК, имеет цистеиновые остатки, включенные в остов, которые создают свободную тиоловую химическую «ручку» для введения метки. В данном случае цистеин метят пептид-2-аминоэтилметантиосульфонатом (MTSRA) через малеимидный линкер, что дает средство для детекции, связан ли лиганд со своей целевой последовательностью, поскольку метка/пептид дает увеличение заряда лиганда. Такой больший заряд дает большее изменение движения тока через пору по сравнению с немеченной PNA.

В соответствии с некоторыми аспектами для увеличения контраста изменения между связанным с лигандом полинуклеотидом и другими фоновыми молекулами, присутствующими в образце, в псевдопептидный остов можно внести модификацию для изменения общего размера лиганда (например, PNA) с целью увеличения такого контраста. См., например, фиг. 9В, на которой показана PNA, которая имеет включенные цистеиновые остатки (301), которые модифицированы линкером SMCC (302) для обеспечения возможности конъюгации с пептидами (303) через N-концевую аминогруппу пептида. Помимо внесения заряда посредством мечения лиганда (например, как показано на фиг. 9А), для увеличения заряда PNA может послужить подбор более заряженных аминокислот вместо неполярных аминокислот. Кроме того, малые частицы, молекулы, белки, пептиды или полимеры (например, PEG) могут быть конъюгированы с псевдопептидным остовом для увеличения объема или площади поперечного сечения поверхности комплекса лиганда и несущего целевую последовательность полинуклеотида. Увеличенный объем служит для улучшения амплитудного контраста сигнала, так чтобы можно было легко детектировать любой дифференциальный сигнал, полученный от увеличенного объема. Примеры малой частицы, молекул, белка или пептидов, которые могут быть конъюгированы с псевдопептидным остовом, включают в себя без ограничения образующие альфа-спираль пептиды, частицы или стержни золота манометрового размера (например, 3 нм), квантовые точки, полиэтиленгликоль (PEG). Способы конъюгации молекул хорошо раскрыты в уровне техники, например, в патентах США №№5180816, 6423685, 6706252, 6884780 и 7022673, которые включены таким образом с помощью ссылки в их полном объеме.

В приведенных выше вариантах осуществления описано мечение PEG с помощью цистеиновых остатков, однако, также можно применять и другие остатки. Например, лизиновый остаток легко заменяется цистеиновыми остатками для обеспечения химизма связи с участием сложных NHS-эфиров и свободных аминов. Кроме того, PEG можно легко заменить другими придающими объем составляющими, такими как дендроны, гранулы или стержни, между бифункциональным линкером и PNA, или для непосредственного связывания дендрона. Специалисту в настоящей области техники будет понятна гибкость такой системы в том, что аминокислота может быть заменена, а химизм связи модифицирован для такой конкретной аминокислоты, например, изоцианаты с сериновыми реакционноспособными группами. Некоторые примеры химизма связи, которые могут быть использованы для этой реакции, указаны в приведенной ниже таблице.

На фиг. 3А, 3В, 4, 5, 9А, 9В и 18А показаны PNA-зонды, которые были модифицированы с тем, чтобы увеличить размера зонда, они содержали эпитоп, содержали ssDNA-олигомеры, содержали флуорофоры, дополнительный заряд или дополнительный размер для облегчения детекции или для детекции того, что два зонда находятся в непосредственной близости друг к другу.

В зонды могут быть включены различные реакционноспособные фрагменты для создания химической «ручки», с которой можно конъюгировать метки. Примеры реакционноспособных фрагментов включают без ограничения первичные аминогруппы, группы карбоновых кислот, кетоновые, амидные, альдегидные, бориновых кислот, гидразиновые, тиоловые, малеимидные, спиртовые и гидроксильные группы и биотин.

Общий способ включения химических «ручек» должен предусматривать включение конкретной аминокислоты в остов зонда. Примеры включают без ограничения цистеины (дают тиоляты), лизины (дают свободные амины), треонин (дает гидроксил), глутамат и аспартат (дают карбоновые кислоты).

Метки различных типов можно внести с помощью реакционноспособных фрагментов. В их число входят метки, которые:

1. увеличивают размер зонда, например, биотин/стрептавидин, пептид, нуклеиновая кислота;

2. изменяют заряд зонда, например, заряженный пептид (6xHis (SEQ ID NO: 2)), или белок (например, харибдотоксин), или малая молекула, или пептид (например, MTSET);

3. изменяют или вносят флуоресценцию в зонд, например, общеизвестные флуорофоры, FITC, родамин, Су3, Су5;

4. обеспечивают наличие эпитопа или сайта взаимодействия для связывания третьей молекулы, например, пептиды для связывания антитела.

Мультиплексирование

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вместо включения зондов одного и того же вида, как описано выше, вносят набор различных зондов, каждый из которых связывается с уникальным сайтом или целевым мотивом.

В таких условиях можно применять несколько различных зондов для детекции множества различных целевых сайтов в пределах одного несущего целевую последовательность полинуклеотида. На фиг. 10 проиллюстрирован такой способ. В данном случае двухцепочечная ДНК 1002 содержит несколько различных целевых мотивов, две копии 1003, две копии 1004 и одну копию 1005.

При применении зондов, каждый из которых дает уникальную кривую тока (например, при различии по размеру) 1006, 1007 и 1008, с помощью настоящей технологии можно детектировать различные целевые мотивы в пределах одной молекулы, что обеспечивает средство для мультиплексирования детекции целевого мотива. Кроме того, путем подсчета, сколько связано каждого из уникальных зондов, может быть определено количество каждой цели (или количество копий). Путем корректировки условий, которые влияют на связывания, система может получить более подробную динамическую информацию о связывании.

Аналогичным образом, мультиплексирование может быть достигнуто при наличии набора зондов с различными атрибутами и подобранных в любом количестве в комбинации, единственным требованием является то, что такие зонды, которые связываются с другой последовательностью, должны быть различимы друг от друга. Например, в эксперименте можно применять одни зонды, которые отличимы по размеру, и дополнительные зонды, которые отличимы по размеру (фиг. 9А, 9В и 19).

Дополнительный способ мультиплексирования предусматривает конструирование зондов, которые связываются с полинуклеотидом на известных последовательностях в фиксированных положениях относительно друг от друга, для детального исследования образца, который содержит набор нуклеиновых кислот от различных видов. В качестве примера такого способа, в случае тестирования источника воды в отношении трех различных бактерий с известной последовательностью, можем расположить два зонда на расстоянии 1000 пар оснований для вида А, на расстоянии 3000 пар оснований для вида В и на расстоянии 5000 пар оснований для вида С. Если детектируют зонды, которые расположены на расстоянии 1000 пар оснований и 3000 пар оснований, то, до детектируемой степени, присутствуют вид А и В, но не С. Такой же способ с заданным расстоянием также можно применять для мультиплексированной детекции известной или мутантной последовательности в конкретном целевом образце.

Нанопоровые устройства

Предлагаемое нанопоровое устройство включает пору, которая образует отверстие в структуре, разделяющее внутреннее пространство устройства на два объема, и может идентифицировать объекты (например, путем детекции изменений параметров, указывающих на наличие объектов), проходящие через пору, например, с помощью сенсора. Нанопоровые устройства, применяемые в описываемых в настоящем документе способах, также раскрыты в РСТ публикации WO/2013/012881, включенной с помощью ссылки в полном ее объеме.

Пора(поры) в нанопоровом устройстве имеют наномасштаб или микромасштаб. В соответствии с одним аспектом каждая пора имеет размер, который позволяет проходить малой или большой молекуле или микроорганизму. В соответствии с одним аспектом каждая пора имеет диаметр по меньшей мере около 1 нм. В качестве альтернативы, каждая пора имеет диаметр по меньшей мере около 2 нм, 3 нм, 4 нм, 5 нм, 6 нм. 7 нм, 8 нм, 9 нм, 10 нм, 11 нм, 12 нм, 13 нм, 14 нм, 15 нм, 16 нм, 17 нм, 18 нм, 19 нм, 20 нм, 25 нм, 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм или 100 нм.

В соответствии с одним аспектом пора имеет диаметр не более чем около 100 нм. В качестве альтернативы, пора имеет диаметр не более чем около 95 нм, 90 нм, 85 нм, 80 нм, 75 нм, 70 нм, 65 нм, 60 нм, 55 нм, 50 нм, 45 нм, 40 нм, 35 нм, 30 нм, 25 нм, 20 нм, 15 нм или 10 нм.

В соответствии с некоторыми аспектами каждая пора имеет диаметр по меньшей мере около 100 нм, 200 нм, 500 нм, 1000 нм, 2000 нм, 3000 нм, 5000 нм, 10000 нм, 20000 нм или 30000 нм. В соответствии с одним аспектом пора имеет диаметр не более чем около 100000 нм. В качестве альтернативы, пора имеет диаметр не более чем около 50000 нм, 40000 нм, 30000 нм, 20000 нм, 10000 нм, 9000 нм, 8000 нм, 7000 нм, 6000 нм, 5000 нм, 4000 нм, 3000 нм, 2000 нм или 1000 нм.

В соответствии с одним аспектом пора имеет диаметр, который составляет от около 1 нм до около 100 нм, или, альтернативно, от около 2 нм до около 80 нм, или от около 3 нм до около 70 нм, или от около 4 нм до около 60 нм, или от около 5 нм до около 50 нм, или от около 10 нм до около 40 нм, или от около 15 нм до около 30 нм.

В соответствии с некоторыми аспектами пора(поры) в нанопоровом устройстве имеет больший масштаб для детекции крупных микроорганизмов или клеток. В соответствии с одним аспектом каждая пора имеет размер, который позволяет проходить крупной клетке или микроорганизму. В соответствии с одним аспектом каждая пора имеет диаметр по меньшей мере около 100 нм. В качестве альтернативы, каждая пора имеет диаметр по меньшей мере около 200 нм, 300 нм, 400 нм, 500 нм, 600 нм, 700 нм, 800 нм, 900 нм, 1000 нм, 1100 нм, 1200 нм, 1300 нм, 1400 нм, 1500 нм, 1600 нм, 1700 нм, 1800 нм, 1900 нм, 2000 нм, 2500 нм, 3000 нм, 3500 нм, 4000 нм, 4500 нм или 5000 нм.

В соответствии с одним аспектом пора имеет диаметр не более чем около 100000 нм. В качестве альтернативы, пора имеет диаметр не более чем около 90000 нм, 80000 нм, 70000 нм, 60000 нм, 50000 нм, 40000 нм, 30000 нм, 20000 нм, 10000 нм, 9000 нм, 8000 нм, 7000 нм, 6000 нм, 5000 нм, 4000 нм, 3000 нм, 2000 нм или 1000 нм.

В соответствии с одним аспектом пора имеет диаметр, который составляет от около 100 нм до около 10000 нм, или, альтернативно, от около 200 нм до около 9000 нм, или от около 300 нм до около 8000 нм, или от около 400 нм до около 7000 нм, или от около 500 нм до около 6000 нм, или от около 1000 нм до около 5000 нм, или от около 1500 нм до около 3000 нм.

В соответствии с некоторыми аспектами нанопоровое устройство дополнительно включает в себя средство для перемещения полимерного остова через пору и/или средство для идентификации объектов, которые проходят через пору. Дополнительные подробности приведены ниже, описаны в контексте двухпорового устройства.

По сравнению с однонанопоровым устройством, двухпоровое устройство может быть проще сконфигурировать таким образом, чтобы обеспечивать надлежащее управление скоростью и направлением движения полимерного остова через пору.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нанопоровое устройство включает в себя множество камер, причем каждая камера находится в сообщении с соседней камерой через по меньшей мере одну пору. Среди этих пор две поры, а именно первая пора и вторая пора, расположены таким образом, чтобы позволить по меньшей мере части полимерного остова выходить из первой поры и входить во вторую пору. Кроме того, устройство включает в себя сенсор, способный идентифицировать полимерный остов во время движения. В соответствии с одним аспектом идентификация подразумевает идентификацию отдельных компонентов полимерного остова. В соответствии с другим аспектом идентификация подразумевает идентификацию слитых молекул и/или целевых аналитов, связанных с полимерным остовом. Если используют один сенсор, то один сенсор может включать в себя два электрода, расположенных на обоих концах поры, для измерения ионного тока через пору. В соответствии с другим вариантом осуществления один сенсор содержит отличный от электродов компонент.

В соответствии с одним аспектом устройство включает в себя три камеры, соединенные с помощью двух пор. Устройства, имеющие более трех камер, могут быть легко сконструированы таким образом, чтобы они включали в себя одну или более дополнительных камер на любой стороне трехкамерного устройства или между любыми двумя из трех камер. Аналогично, в устройство можно включить более двух пор для соединения камер.

В соответствии с одним аспектом между двумя смежными камерами может быть две или более пор, обеспечивающих одновременное продвижение нескольких полимерных остовов из одной камеры в следующую. Такая многопоровая конструкция может повысить производительность анализа полимерного остова в устройстве.

В соответствии с некоторыми аспектами устройство дополнительно включает в себя средство для продвижения полимерного остова из одной камеры в другую. В соответствии с одним аспектом движение приводит к одновременному прохождению полимерного остова как через первую пору, так и через и вторую пору. В соответствии с другим аспектом средство дополнительно делает возможным движение полимерного остова через обе поры в одном направлении.

Например, в трехкамерном двухпоровом устройстве («двухпоровом» устройстве), каждая из камер может содержать электрод для соединения с источником питания, так чтобы через каждую из пор между камерами можно было подавать отдельное напряжение.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия предложено устройство, содержащее верхнюю камеру, среднюю камеру и нижнюю камеру, причем верхняя камера находится в сообщении со средней камерой через первую пору, а средняя камера находится в сообщении с нижней камерой через вторую пору. Такое устройство может иметь любые размеры или другие характеристики, ранее раскрытые в патентной публикации США №2013-0233709 под заголовком «Двухпоровое устройство» (Dual-Pore Device), которое включено в настоящий документ с помощью ссылки в полном его объеме.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, как показано на фиг. 7А, устройство включает в себя верхнюю камеру 705 (камеру А), среднюю камеру 704 (камеру В) и нижнюю камеру 703 (камеру С). Камеры разделены двумя разделительными слоями или мембранами (701 и 702), каждая из которых имеет отдельную пору (711 или 712). К тому же, каждая камера содержит электрод (721, 722 или 723) для соединения с источником питания. Маркировка верхней, средней и нижней камеры приведена в относительном выражении и не указывает, что, например, верхняя камера расположена над средней или нижней камерой по отношению к земле, или наоборот.

Каждая из пор 711 и 712 независимо друг от друга имеет размер, который позволяет проходить малой или большой молекуле или микроорганизму. В соответствии с одним аспектом каждая пора имеет диаметр по меньшей мере около 1 нм. В качестве альтернативы, каждая пора имеет диаметр по меньшей мере около 2 нм, 3 нм, 4 нм, 5 нм, 6 нм, 7 нм, 8 нм, 9 нм, 10 нм, 11 нм, 12 нм, 13 нм, 14 нм, 15 нм, 16 нм, 17 нм, 18 нм, 19 нм, 20 нм, 25 нм, 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм или 100 нм.

В соответствии с одним аспектом пора имеет диаметр не более чем около 100 нм. В качестве альтернативы, пора имеет диаметр не более чем около 95 нм, 90 нм, 85 нм, 80 нм, 75 нм, 70 нм, 65 нм, 60 нм, 55 нм, 50 нм, 45 нм, 40 нм, 35 нм, 30 нм, 25 нм, 20 нм, 15 нм или 10 нм.

В соответствии с одним аспектом пора имеет диаметр, который составляет от около 1 нм до около 100 нм, или, альтернативно, от около 2 нм до около 80 нм, или от около 3 нм до около 70 нм, или от около 4 нм до около 60 нм, или от около 5 нм до около 50 нм, или от около 10 нм до около 40 нм, или от около 15 нм до около 30 нм.

В соответствии с другими аспектами каждая пора имеет диаметр по меньшей мере около 100 нм, 200 нм, 500 нм, 1000 нм, 2000 нм, 3000 нм, 5000 нм, 10000 нм, 20000 нм или 30000 нм. В соответствии с одним аспектом каждая пора имеет диаметр от 50000 нм до 100000 нм. В соответствии с одним аспектом пора имеет диаметр не более чем около 100000 нм. В качестве альтернативы, пора имеет диаметр не более чем около 50000 нм, 40000 нм, 30000 нм, 20000 нм, 10000 нм, 9000 нм, 8000 нм. 7000 нм, 6000 нм, 5000 нм, 4000 нм, 3000 нм, 2000 нм или 1000 нм.

В соответствии с некоторыми аспектами пора имеет практически круглую форму. В контексте настоящей заявки «практически круглый» относится к форме, которая по меньшей мере около на 80% или на 90% имеет форму цилиндра. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления пора имеет квадратную, прямоугольную, треугольную, овальную или шестиугольную форму.

Каждая из пор 711 и 712 независимо друг от друга имеет глубину (т.е. длину поры между двумя соседними объемами). В соответствии с одним аспектом каждая пора имеет глубину, которая составляет по меньшей мере около 0,3 нм. В качестве альтернативы, каждая пора имеет глубину, которая составляет по меньшей мере около 0,6 нм, 1 нм, 2 нм, 3 нм, 4 нм, 5 нм, 6 нм, 7 нм, 8 нм, 9 нм, 10 нм, 11 нм, 12 нм, 13 нм, 14 нм, 15 нм, 16 нм, 17 нм, 18 нм, 19 нм, 20 нм, 25 нм, 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 60 нм, 70 нм или 90 нм.

В соответствии с одним аспектом каждая пора имеет глубину, которая не превышает около 100 нм. В качестве альтернативы, глубина не превышает около 95 нм, 90 нм, 85 нм, 80 нм, 75 нм, 70 нм, 65 нм, 60 нм, 55 нм, 50 нм, 45 нм, 40 нм, 35 нм, 30 нм, 25 нм, 20 нм, 15 нм или 10 нм.

В соответствии с одним аспектом пора имеет глубину, которая составляет от около 1 нм до около 100 нм, или, альтернативно, от около 2 нм до около 80 нм, или от около 3 нм до около 70 нм, или от около 4 нм до около 60 нм, или от около 5 нм до около 50 нм, или от около 10 нм до около 40 нм, или от около 15 нм до около 30 нм.

В соответствии с некоторыми аспектами нанопора проходит через мембрану. Например, пора может представлять собой белковый канал, внедренный в липидную двухслойную мембрану, или может быть сконструирована путем пробуривания, протравливания или иным образом образования поры через твердотельную подложку, такую как диоксид кремния, нитрид кремния, графен или слои, образованные из комбинаций этих или других материалов. В соответствии с некоторыми аспектами длина или глубина нанопоры является достаточно большой, чтобы сформировать канал, соединяющий два в ином случае разделенных объема. В соответствии с некоторыми такими аспектами глубина каждой поры превышает 100 нм, 200 нм, 300 нм, 400 нм, 500 нм, 600 нм, 700 нм, 800 нм или 900 нм. В соответствии с некоторыми аспектами, глубина каждой поры составляет не более 2000 нм или 1000 нм.

В соответствии с одним аспектом поры расположены друг от друга на расстоянии, которое составляет от около 10 нм до около 1000 нм. В соответствии с некоторыми аспектами расстояние между порами превышает 1000 нм, 2000 нм, 3000 нм, 4000 нм, 5000 нм, 6000 нм, 7000 нм, 8000 нм или 9000 нм. В соответствии с некоторыми аспектами поры расположены на расстоянии не более 30000 нм, 20000 нм или 10000 нм друг от друга. В соответствии с одним аспектом расстояние составляет по меньшей мере около 10 нм, или, альтернативно, по меньшей мере около 20 нм, 30 нм, 40 нм. 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм, 100 нм, 150 нм, 200 нм, 250 нм или 300 нм. В соответствии с другим аспектом расстояние не превышает около 1000 нм, 900 нм, 800 нм, 700 нм, 600 нм, 500 нм, 400 нм, 300 нм, 250 нм, 200 нм, 150 нм или 100 нм.

В соответствии с еще одним аспектом расстояние между порами составляет от около 20 нм до около 800 нм, от около 30 нм до около 700 нм, от около 40 нм до около 500 нм или от около 50 нм до около 300 нм.

Две поры могут быть расположены в любом положении, при условии, что они обеспечивают жидкостное сообщение между камерами и имеют заданный размер и расстояние между ними. В соответствии с одним аспектом поры расположены таким образом, чтобы между ними отсутствовала непосредственная блокада. Тем не менее, в соответствии с одним аспектом поры практически имеют общую ось, как проиллюстрировано на фиг. 7А.

В соответствии с одним аспектом, как показано на фиг. 7А, устройство при помощи электродов 721, 722 и 723 соответственно в камерах 703, 704 и 705 соединено с одним или более источниками питания. В соответствии с некоторыми аспектами источник питания включает в себя фиксатор напряжения или фиксатор потенциала, который может подавать напряжение на каждую пору и независимо измерять ток через каждую пору. В связи с этим, с помощью источника питания и конфигурации электродов можно задать среднюю камеру общей землей для обоих источников питания. В соответствии с одним аспектом источник или источники питания могут подавать первое напряжение V₁ между верхней камерой 705 (камерой А) и средней камерой 704 (камерой B) и второе напряжение V₂ между средней камерой 704 и нижней камерой 703 (камерой C).

В соответствии с некоторыми аспектами первое напряжение V₁ и второе напряжение V₂ регулируются независимо. В соответствии с одним аспектом среднюю камеру регулируют так, чтобы она стала землей для двух напряжений. В соответствии с одним аспектом средняя камера содержит среду для обеспечения проводимости между каждой из пор и электродом в средней камере. В соответствии с одним аспектом средняя камера включает среду для обеспечения сопротивления между каждой из пор и электродом в средней камере. Удержание такого сопротивления достаточно низким по отношению к значениям сопротивления нанопор полезно для разграничения двух напряжений и токов через поры, что полезно для независимой регулировки напряжений.

Регулировку напряжений можно применять для управления движением заряженных частиц в камерах. Например, если оба напряжения установлены в одной и той же полярности, то частица с соответствующим зарядом может быть последовательно перемещена из верхней камеры в среднюю камеру и в нижнюю камеру, или наоборот. В соответствии с некоторыми аспектами, если два напряжения установлены на противоположную полярность, то заряженная частица может быть перемещена из верхней или нижней камеры в среднюю камеру и удерживаться там.

Регулировка напряжений в устройстве может быть особенно полезна для управления движением большой молекулы, такой как заряженный полимерный остов, который имеет достаточную длину, чтобы одновременно пересечь обе поры. В соответствии с таким аспектом направлением и скоростью движения молекулы можно управлять с помощью относительной величины и полярности напряжения, как описано ниже.

Устройство может содержать материалы, подходящие для хранения жидких образцов, в частности, биологических образцов и/или материалов, пригодных для наноиндустрии. В соответствии с одним аспектом такие материалы включают диэлектрические материалы, такие как без ограничения оксид кремния, нитрид кремния, диоксид кремния, графен, углеродные нанотрубки, TiO₂, HfO₂, Al₂O₃ или слои из других металлов, или любую комбинацию этих материалов. В соответствии с некоторыми аспектами в качестве несущей пору мембраны можно применять, например, один слой графеновой мембраны с толщиной около 0,3 нм.

Устройства, которые являются микрожидкостными и которые содержат варианты двухпоровых микрожидкостных чипов, могут быть созданы с помощью различных средств и способов. Для микрожидкостного чипа, содержащего в своем составе две параллельные мембраны, обе мембраны можно одновременно пробурить с помощью одного пучка с образованием двух концентрических пор, хотя также можно использовать различные пучки с каждой стороны мембран совместно с любым подходящим методом выравнивания. В общих чертах, корпус обеспечивает герметичное разделение камер А-С. В соответствии с одним аспектом, как показано на фиг. 7В, корпус будет обеспечивать минимальное сопротивление на входе между электродами 721, 722 и 723 напряжения и нанопорами 711 и 712 для обеспечения того, чтобы каждое напряжение преимущественно подавалось через каждую пору.

В соответствии с одним аспектом устройство включает в себя микрожидкостный чип (обозначенный как «двухъядерных чип») и содержит в своем составе две параллельные мембраны, соединенные разделителями. Каждая мембрана содержит пору, пробуренную с помощью одного пучка через центр мембраны. Кроме того, устройство предпочтительно для чипа имеет корпус Teflon®. Корпус обеспечивает изолированное разделение камер А-С и обеспечивает минимальное сопротивление на входе для электрода для обеспечения того, чтобы каждое напряжение преимущественно подавалось через каждую пору.

Более конкретно, несущие поры мембраны могут быть получены с помощью сеток для просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) с рамками толщиной 5-100 нм из оксида кремния, нитрида кремния или диоксида кремния. Для разделения мембран можно применять разделители, с использованием диэлектрика, например, SU-8, фоторезиста, оксида PECVD, оксида ALD, алюмооксида ALD или напыляемого металлического материала, такого как Ag, Au или Pt, и с задействованием небольшого объема в водной в ином случае части камеры B между мембранами. Держатель расположен в водяной бане, которая содержится в крупнейшей объемной части камеры В. Камеры А и С доступны по каналам большего диаметра (для низкого сопротивления на входе), которые ведут к уплотнителям мембран.

Для бурения пор через мембраны может быть использован сфокусированный электронный или ионный пучок, естественным образом выравнивая их. Поры также можно размыть (сузить) до меньших размеров путем применения надлежащей фокусировки пучка для каждого слоя. Любой способ бурения отдельной нанопоры также можно применять для бурения пары пор в двух мембран, с учетом глубины бурения, которая возможна для такого способа, и толщины мембран. Также возможно предварительное бурение микропоры до заданной глубины, а затем нанопоры через оставшуюся часть мембран для дополнительной подгонки к толщине мембраны.

В соответствии с другим аспектом в двухпоровом способе можно использовать вставку биологических нанопор в твердотельные нанопоры с образованием гибридной поры в одной или в обеих порах. Биологическая пора может увеличить чувствительность измерений ионных токов и пригодна, если в двухпоровом устройстве необходимо захватывать только одноцепочечные полинуклеотиды и управлять ними, например, для секвенирования.

Посредством напряжений, присутствующих в порах устройства, заряженные молекулы можно перемещать через поры между камерами. Скоростью и направлением движения можно управлять с помощью величины и полярности напряжений. Кроме того, поскольку каждое из двух напряжений можно независимо друг от друга регулировать, можно тонко управлять направлением и скоростью движения заряженной молекулы в каждой камере.

Один пример относится к заряженному полимерному остову, такому как ДНК, имеющему длину, которая превышает объединенное расстояние, включающее глубину обоих пор плюс расстояние между двумя порами. Например, 1000 по dsDNA составляет в длину около 340 нм и будет существенно длиннее, чем 40 нм, охватываемые двумя порами с глубиной 10 нм, разделяемыми 20 нм. На первой стадии полинуклеотид загружают либо в верхнюю, либо в нижнюю камеру. В силу его отрицательного заряда в физиологических условиях при pH около 7,4, полинуклеотид может продвигаться через пору, на которую подают напряжение. Таким образом, на второй стадии два напряжения с одной полярностью и с одними и теми же или схожими величинами подают на поры для последовательного продвижения полинуклеотида через обе поры.

Около в момент, когда полинуклеотид достигает второй поры, может быть изменено одно или оба напряжения. Поскольку расстояние между двумя порами подбирают так, чтобы оно было короче, чем длина полинуклеотида, когда полинуклеотид достигает второй поры, то он также находится в первой поре. Быстрое изменение полярности напряжения в первой поре, таким образом, будет создавать силу, которая вытягивает полинуклеотид из второй поры, как проиллюстрировано на фиг. 7С.

Если предположить, что эти две поры оказывают идентичное силовое воздействие под действием напряжения и |N₁|=|V₂|+δV, значение δV>0 (или <0) можно скорректировать для подстраиваемого движения в направлении V₁| (или V₂). На практике, хотя индуцированная напряжением сила в каждой поре не будет идентичной с V₁=V₂, с помощью калибровочных экспериментов можно найти соответствующее напряжение смещения, которое в результате даст равные тяговые силы для данного двухпорового чипа; а отклонения вокруг такого напряжения смещения затем можно использовать для управления направлением перемещения.

Если в этот момент величина индуцированной напряжением силы в первой поре меньше, чем индуцированная напряжением сила во второй поре, то полинуклеотид будет продолжать прохождение обеих пор в направлении второй поры, но с более низкой скоростью. В связи с этим, легко понять, что скоростью и направлением движения полинуклеотида можно управлять с помощью полярностей и величин обоих напряжений. Как будет дополнительно описано ниже, такое тонкое управление движением имеет широкое применение.

Следовательно, в соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к способу управления движением заряженного полимерного остова через нанопоровое устройство. Способ предусматривает (а) загрузку образца, содержащего заряженный полимерный остов, в одну из верхней камеры, средней камеры или нижней камеры устройства по любому из указанных выше вариантов осуществления, причем устройство соединено с одним или более источниками питания для создания первого напряжения между верхней камерой и средней камерой и второго напряжения между средней камерой и нижней камерой; (b) установку начального первого напряжения и начального второго напряжения, так чтобы полимерный остов передвигался между камерами, таким образом размещая полимерный остов как в первой, так и во второй поре; и (с) регулировку первого напряжения и второго напряжения, так чтобы оба напряжения создавали силу, вытягивающую заряженный полимерный остов из средней камеры (режим конкурентного напряжения), причем два напряжения имеют различные величины, в управляемых условиях, так чтобы заряженный полимерный остов двигался через обе поры в любом направлении и управляемым образом.

Для создания режима конкурентного напряжения на стадии (с) необходимо определить для каждого применяемого двухпорового устройства относительную силу под действием каждого напряжения в каждой поре, и это можно осуществить с помощью калибровочных экспериментов путем отслеживания влияния различных значений напряжения на движение полинуклеотида, которое может быть измерено путем сенсорного отслеживания свойств, связанных с известным местоположением, и детектируемых свойств полинуклеотида, примеры таких свойств описаны далее в настоящем описании. Если силы эквивалентны, например, в каждом случая одинакового напряжения, то при использовании такого же значения напряжения в каждой поре (с одинаковой полярностью в верхней и нижней камерах по отношению к заземленной средней камере) создают суммарное нулевое движение в отсутствии теплового движения (наличие и влияние броуновского движения рассмотрено ниже). Если силы не эквивалентны в каждом случае одинакового напряжения, достижение равных сил включает нахождение и использование большего напряжения в порах, которые подвергаются воздействию более слабой силы при одинаковом напряжении. Калибровку для режима конкурентного напряжения можно провести для каждого двухпорового устройства, а также для конкретных заряженных полимеров или молекул, свойства которых влияют на силу при прохождении через каждую пору.

В соответствии с одним аспектом образец, содержащий заряженный полимерный остов, загружают в верхнюю камеру и устанавливают начальное первое напряжение для вытягивания заряженного полимерного остова из верхней камеры в среднюю камеру и устанавливают начальное второе напряжение для вытягивания полимерного остова из средней камеры в нижнюю камеру. Кроме того, образец изначально можно загрузить в нижнюю камеру, а заряженный полимерный остов можно вытянуть в среднюю и верхнюю камеры.

В соответствии с другим аспектом образец, содержащий заряженный полимерный остов, загружают в среднюю камеру, устанавливают начальное первое напряжение для вытягивания заряженного полимерного остова из средней камеры в верхнюю камеру и устанавливают начальное второе напряжение для вытягивания заряженного полимерного остова из средней камеры в нижнюю камеру.

В соответствии с одним аспектом отрегулированное первое напряжение и второе напряжение на стадии (с) от около в 10 раз до около в 10000 раз превышает по величине разность/дифференциал между двумя напряжениями. Например, два напряжения могут соответственно составлять 90 мВ и 100 мВ. Величина двух напряжений, около 100 мВ, около в 10 раз превышает разность/дифференциал между ними, 10 мВ. В соответствии с некоторыми аспектами величина напряжений превышает по меньшей мере около в 15 раз, 20 раз, 25 раз, 30 раз, 35 раз, 40 раз, 50 раз, 100 раз, 150 раз, 200 раз, 250 раз, 300 раз, 400 раз, 500 раз, 1000 раз, 2000 раз, 3000 раз, 4000 раз, 5000 раз, 6000 раз, 7000 раз, 8000 раз или 9000 раз разность/дифференциал между ними. В соответствии с некоторыми аспектами величина напряжения не превышает около в 10000 раз, 9000 раз, 8000 раз, 7000 раз, 6000 раз, 5000 раз, 4000 раз, 3000 раз, 2000 раз, 1000 раз, 500 раз, 400 раз, в 300 раз, 200 раз или в 100 раз разность/дифференциал между ними.

В соответствии с одним аспектом регулировку в режиме реального времени или онлайн первого напряжения и второго напряжения на стадии (с) выполняют путем активного управления или управления с обратной связью с использованием специализированных аппаратных средств и программного обеспечения, на тактовых частотах до сотен мегагерц. Автоматизированное управление первым или вторым или обоими напряжениями основано на обратной связи с первым или вторым или обоими показателями измерений ионного тока.

Сенсоры

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нанопоровые устройства по настоящему изобретению включают в себя один или более сенсоров для осуществления идентификации статуса связывания целевых мотивов.

Применяемые в устройстве сенсоры могут представлять собой любой сенсор, подходящим для идентификации молекулы или частицы, такой как заряженный полимер. Например, сенсор может быть выполнен с возможностью идентификации заряженного полимера путем измерения тока, напряжения, pH, оптического свойства или времени пребывания, связанного с заряженным полимером или одним или более отдельными компонентами заряженного полимера. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сенсор включает в себя пару электродов, расположенных на противоположных сторонах поры, для измерения ионного тока в поре при прохождении через пору молекулы или частицы, в частности, заряженного полимера (например, полинуклеотида).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сенсор измеряет оптическую характеристику полимера или компонента (или звена) полимера. Один пример такого измерения включает в себя идентификацию с помощью инфракрасной (или ультрафиолетовой) спектроскопии полосы поглощения, уникальной для конкретного звена.

При использовании результатов измерений времени пребывания они будут коррелировать с размером звена для конкретного звена на основе продолжительности времени, которое необходимо для прохождения через сенсорное устройство.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сенсор функционализирован реагентами, которые образуют отдельные нековалентные связи с каждым из зондов. В этом случае зазор может иметь больший размер и все еще позволять проводить эффективное измерение. Например, может быть использован зазор в 5 нм для детекции комплекса зонд/целевая последовательность, что соответствует измерению примерно 5 нм. Туннельное сенсорное отслеживания с помощью функционализированного сенсора называют «распознающим туннелированием». С помощью сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) с распознающим туннелированием легко идентифицируют зонд, связанный с целевым мотивом.

Таким образом, с помощью способов по настоящей технологии можно обеспечивать управление скоростью доставки заряженного полинуклеотида (например, ДНК) для одного или более сайтов распознающего туннелирования, каждый из которых расположен в одном или обоих нанопоровых каналах или между порами, а управление напряжением может обеспечивать, чтобы каждый комплекс зонд/целевая последовательность находился в каждом сайте в течение достаточного срока для надежной идентификации.

Сенсоры в устройствах и способах по настоящему раскрытию могут содержать золото, платину, графен или углерод, или другие подходящие материалы. В соответствии с конкретным аспектом сенсор включает в себя части, изготовленные из графена. Графен может выступать в качестве проводника и диэлектрика, таким образом, туннельные токи через графен и через нанопору могут секвенировать перемещающуюся ДНК.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, туннельный зазор имеет ширину, которая составляет от около 1 нм до около 20 нм. В соответствии с одним аспектом ширина зазора составляет по меньшей мере 1 нм или, альтернативно, по меньшей мере около 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 или 15 нм. В соответствии с другим аспектом ширина зазора не превышает около 20 нм или, альтернативно, не превышает около 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 нм. В соответствии с некоторыми аспектами ширина составляет от около 1 нм до около 15 нм, от около 1 нм до около 10 нм, от около 2 нм до около 10 нм, от около 2,5 нм до около 10 нм или от около 2,5 нм до около 5 нм.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сенсор является электрическим сенсором. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сенсор детектирует средство флуоресцентной детекции, если зонд имеет метку, создающую уникальную кривую флуоресценции. Для детекции такой кривой можно применять источник излучения на выходе.

Следует понимать, что несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с приведенными выше вариантами осуществления, такое приведенное выше описание и последующие примеры предназначены для иллюстрации, а не ограничения объема настоящего изобретения. Специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение, будут очевидны другие аспекты, преимущества и модификации в пределах объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Только ДНК в эксперименте с твердотельными нанопорами

Нанопоровые приборы предусматривают применение чувствительного усилителя с фиксатором напряжения для подачи напряжения V через пору при измерении ионного тока I₀ через открытую пору. При захватывании и проведении через пору одной заряженной молекулы, такой как двухцепочечная ДНК (dsDNA), с помощью электрофореза измеряемый ток сдвигался от I₀ до I_B, и для характеристики события использовали величину сдвига ΔI=I₀-I_B и длительность t_D. После регистрации множества событий в ходе эксперимента, анализировали распределения событий на графике ΔI относительно t_D для получения характеристики соответствующей молекулы в популяции на графике. Таким образом, нанопоры обеспечивают простой, без использования меток, чисто электрический мономолекулярный способ биомолекулярного сенсорного обнаружения.

Отдельная нанопора, изготовленная в подложке из нитрида кремния (SiN), представляла собой пору с диаметром 40 нм в SiN-мембране толщиной 100 нм (фиг. 11А) и показана в качестве примера твердотельной нанопоры. На фиг. 1 из иллюстративной регистрограммы тока видно событие блокады, вызванное прохождением dsDNA длиной 5,6 т.о. в однорядном формате (раскрученном) через нанопору с диаметром 11 нм в SiN толщиной 10 нм при 200 мВ в буфере, содержавшем 1 М KCl. Ток затухал при прохождении ДНК через пору для концентраций KCl на уровне или выше 0,3 М, в то же время ток усиливался при прохождении ДНК через пору для концентраций KCl ниже 0,3 М. Средний ток для открытого канала I₀=9,6 нА, со средней амплитудой события I_B=9,1 нА и средней продолжительностью события t_D=0,064 мс. Сдвиг амплитуды в результате перемещения молекулы dsDNA через нанопору составлял ΔI=I₀-I_B-0,5 нА. На фиг. 11С из диаграммы разброса видно |ΔI| относительно t_D для всех 1301 события, зарегистрированных в течение 16 минут.

Пример 2

Молекулы захвата, содержащие PNA и биотип, для детекции целевой последовательности

Нами был продемонстрирован подход, который делает возможной детекцию связывания соединения в растворе с помощью сконструированного полимерного остова. Нами был предложен PNA-зонд, который был модифицирован так, чтобы он содержал биотиновый фрагмент, который связывает нейтравидин. Нейтравидин увеличивает объем и, следовательно, делает PNA детектируемой в нанопорах, которые имеют большой размер (например, с диаметром 15-30 нм). В частности, нами был сконструирован dsDNA-остов длиной 5,6 т.о. для связывания с молекулой зонда, представлявшей собой 12-мерный пептид-нуклеиновую кислоту (PNA), причем каждый PNA-зонд имел 3 биотинилированных сайта, каждый для связывания нейтравидина (фиг. 12А). Нами был сконструирован такой dsDNA-остов, который содержал 25 различных сайтов (мотивов связывания), которые связывались с нашим PNA-зондом (фиг. 12В). Создавали раствор, содержащий либо только полимерный остов, либо свободный нейтравидин, либо комплекс зонд/ДНК (фиг. 13). Из кривых событий в виде результирующего тока от каждой популяции (фиг. 13) видно, что комплексы ДНК/PNА/нейтравидин давали кривые тока перемещения, которые детектировались относительно фоновых событий других типов (например, только несвязанной ДНК, только нейтравидина, только PNA/нейтравидина) поэтому могли быть идентифицированы в нанопоровом устройстве. В оставшейся части этого примера нами было показано, что комплексы ДНК/PNA/нейтравидин можно с высокой степенью достоверности детектировать с помощью нанопоры.

Зонд, который связывал конкретную последовательность ДНК, представлял собой молекулу белок-нуклеиновой кислоты (PNA), которая связывалась с уникальной последовательностью (GAAAGTGAAAGT (SEQ ID NO: 1), uSeq1), которая повторялась 25 раз на всем протяжении остова. Использованная в эксперименте PNA имела последовательность GAA*AGT*GAA*AGT (SEQ ID NO: 1), где * указывает на то, что PNA-остов в гамма-положении был включен биотин путем соединения с аминокислотой лизин, и, таким образом, каждая PNA имеет три молекулы биотина и потенциально связывает 3 молекулы нейтравидин (PNABio). Для связывания PNA нагревали 60 нМ остова до 95°C в течение 2 минут, охлаждали до 60°C и инкубировали с 10-кратным избытком PNA для связывания с возможными сайтами связывания PNA на остове в 15 мМ NaCl в течение 1 ч, а затем охлаждали до 4°C. Избыток PNA удаляли диализом (MWCO по 20000, Thermo Scientific) в течение 2 часов против 10 мМ Трис, pH 8,0. Такой комплекс ДНК/PNA затем помечали посредством 10-кратного избытка нейтравидина (Pierce/Thermo Scientific) на возможных биотиновых сайтах, связанных с остовами (предполагая на 60% уменьшение PNA при диализе). Реакционную смесь подвергали электрофорезу, как описано выше, для оценки чистоты, концентрации и потенциальной агрегации.

На фиг. 14А-В показаны данные сравнения распределений ΔI относительно t_D по результатам трех отдельных экспериментов: только ДНК (D), только нейтравидин (N) и реагенты D/P/N (DPN). Крупнейшие |ΔI| события в эксперименте с D/P/N соотносились с комплексами D/P/N (фиг. 13), что давало простой критерий для событий мечения на основе их состояния связывания (т.е. несвязанный, связанный остов с PNA и связанный остов с PNA и нейтравидином). В частности, мы можем отметить событие, как соответствующее комплексу D/P/N, если |ΔI|>4 нА для такого события. Для наборов данных на, фиг. 14А, 9,3% (390) событий в эксперименте с D/P/N имели |ΔI|>4 нА, причем только 0,46% событий D и 0,16% событий N в контрольной группе превышали 4 нА. В отдельном эксперименте (данные не показаны), с порой диаметром 7 нм в 1 М KCl и с подаваемым напряжением 200 мВ, в контроле с только PNA и нейтравидином в концентрации 0,4 нМ ни одно из событий (0%) не превышало 4 нА. После применения наших математических критериев случайная переменная Q={доля отмеченных событий} имела биномиальное распределение, и с помощью этого и других инструментов статистического моделирования мы могли рассчитать 99% доверительный интервал для этого набора данных: Q=9,29±1,15%. Поскольку 9,29%>0,46% (максимальный ложноположительный %) хорошо удовлетворяется в пределах 99% доверительного интервала для Q, у нас был положительный результат теста за период времени сбора данных менее 8 минут. Фактически же, 99% доверительный интервал достигался для этого набора данных уже за первые 60 секунд сбора данных. Из результатов сдвига в геле (фиг. 14С) видно, что миграция остова ДНК задерживается с некоторой зависимостью от нейтравидина; это послужило для нас указанием применять 10х концентрацию в этом предварительном эксперименте, поскольку оказалось, что вся ДНК помечена и была получена почти однородная популяция.

Пример 3

Белок Vspr, связывающийся с ДНК-остовом и нанопоровая детекция

Белок VspR представляет собой 90 кДа белок из V. cholerae, который связывается непосредственно с dsDNA с высоким микромолярным сродством зависимым от последовательности образом (см. ссылку: Yildiz, Fitnat Н., Nadia A. Dolganov, and Gary К. Schoolnik. "VpsR, a Member of the Response Regulators of the Two-Component Regulatory Systems, Is Required for Expression of Biosynthesis Genes and EPSETr-Associated Phenotypes in Vibrio cholerae Ol El Tor." Journal of bacteriology 183, no. 5 (2001): 1716-1726). В этом примере детекции целевой последовательности с использованием технологии нанопор VspR выступает в качестве молекулы зонда с доменом с сайт-специфическим связыванием ДНК. В этом эксперименте была показана детекция VspR на ДНК-остове в качестве модели применения белка для детекции наличия конкретной последовательности в ДНК. ДНК-остов содержал 10 VspR-специфичных сайтов связывания (фиг. 15). Для сохранения аффинности VspR в отношении связывания dsDNA была использована 0,1 М KCl, концентрация соли, при которой перемещение связанного с VspR остова через нанопору усиливает движение тока через нанопору (фиг. 16). Получали раствор, содержащий белок VspR в концентрации 18 нМ в буфере для регистрации данных и 180 нМ при внесении метки (на стадии связывания). Это давало в результате 18х избыток белка VspR для сайтов связывания на ДНК. Эксперимент проводили при pH 8,0 (pI белка VspR составляла 5,8). Принимая во внимание Kd и концентрацию ДНК, только 0,1-1% ДНК должно было быть полностью занято VspR, причем больший процент должен был быть занят частично, а некоторый неизвестный оставшийся процент ДНК - полностью несвязанным. В ходе эксперимента с нанопорами в растворе присутствовал также свободный белок VspR.

Два иллюстративных события показаны на фиг. 16А и фиг. 16В. В экспериментах с VspR, концентрация VspR составляла 18 нМ (1,6 мг/л), 10 нМ сайты связывания. Концентрация остова составляла 1 нМ, что в результате обеспечивало захват каждые 6,6 секунды. Размер поры составлял 15 нм в диаметре и длине. Напряжение составляло -100 мВ, и следует отметить, что отрицательные напряжения создавали отрицательные токи, поэтому сдвиги вверх соответствовали событиям затухания, как было показано для события ДНК, связанной с VspR (фиг. 16В), в то время как сдвиги вниз создавали положительные сдвига, как было показано для события несвязанного ДНК-остова (фиг. 16А). Это согласовывалось с теоретическими паттернами сигналов и состояниями на фиг. 2, причем событие ДНК (фиг. 16А) имело более короткую продолжительность и противоположную полярность по сравнению с событием ДНК, связанной со слитой молекулой (фиг. 16В). Таким образом, ключевой вывод, который можно сделать при рассмотрении этой фигуры, заключается в том, что связанные с VspR события имеют противоположную полярность сигнала по сравнению с событиями несвязанной ДНК и, следовательно, являются легко детектируемым признаком того, что присутствует конкретная последовательность ДНК. На фиг. 17 показаны еще десять иллюстративных событий ослабления тока, соответствующих прохождению через пору связанного с VspR остова. Имело место 90 таких событий на протяжении 10 минут регистрации, что соответствовало 1 связанному с VspR событию на каждые 6,6 секунды. События представляли собой ослабления, составлявшие от 50 до 150 пА по амплитуде и от 0,2 до 2 миллисекунд по длительности. Как было указано, события со сдвигами вниз соответствовали событиям усиления тока, а события со сдвигами вверх соответствовали событиям с ослаблением токов на фиг. 16-17, и это направление сдвига сохранялось даже при обнулении исходного уровня для визуализации результатов.

Пример 4

Синтез специфического к последовательности зонда и связывание целевой последовательности

В этом примере продемонстрировано создание PNA-зонда для связывания с представляющей интерес целевой последовательностью с элементами, внесенными в PNA-зонд для обеспечения повышенной чувствительности детекции в нанопоре.

Нами был создан bisPNA-зонд, содержащий 3 цистеиновых остатка. bisPNA-зонд содержал последовательность PNA, способную связываться с своей последовательностью ДНК, содержащей целевую последовательность СТТТССС в местоположении этой целевой последовательности на целевой молекуле ДНК. bisPNA-зонд был также помечен малеимидо-PEG-Me на 3 цистеиновых остатках на bisPNA-зонде для улучшения детекции в нанопоре зонда, прикрепленного к целевой молекуле ДНК. PNA-PEG-зонд создавали путем инкубации 100-кратного избытка линкера (метил-PEG(10 кДа)-малеимид) с bisPNA (Lys-Lys-Cys-PEG3-JTTTJJJ-PEG-Cys-PEG-CCCTTTC-PEG-Cys-Lys-Lys) в восстанавливающих условиях. Малеимидная часть линкера вступала в реакцию со свободными тиоловыми группами в PNA при pH 7,4, таким образом получая пегилированную PNA. Добавление лизинов увеличивало сродство реагента к его специфической когнатной последовательности ДНК, таким образом позволяя ему оставаться связанным в условиях высокого содержания солей (1 M LiCl). Полученный PNA-PEG-зонд, связанный с его целевой последовательностью на молекуле dsDNA, показан на фиг. 18А.

Для подтверждения связывания ДНК-PEG-зонда с его целевой последовательности на молекуле ДНК, инкубировали различные версии PEG-зонда с ДНК и проводили анализ по сдвигу в геле с использованием полученного раствора. Для этого анализа прогоняли 4 образца, результаты показаны на фиг. 18В. Дорожка 1 представляла собой только ДНК, дорожка 2 представляла собой ДНК + PNA, дорожка 3 представляла собой ДНК + PNA-PEG (10 кДа), а дорожка 4 представляла собой ДНК + PNA-PEG (20 кДа). Сдвиг вверх на дорожках 2-4 соответствовал молекулам bisPNA, которые находились в связанном с ДНК состоянии. Кругами обведены ДНК/PNA-PEG, квадратами обведены ДНК/PNA в дорожках 3 и 4, присутствовавшие в виде остаточной PNA (без PEG) в эксперименте с введением метки. Из результатов анализа по сдвигу в геле видно комплексообразование ДНК, содержащей целевую последовательность и PNA-зонда с когнатной последовательностью ДНК, комплементарной целевой последовательности, независимо от прикрепления PEG к PNA. Таким образом, в этом случае было показано успешное комплексообразование специфического к последовательности зонда, который можно детектировать в нанопоре.

Затем был проведен анализ для демонстрации специфичности PNA-зонда к своей целевой последовательности ДНК. В этом случае инкубировали PNA-зонд (без PEG) с образцом, содержащим ДНК без целевой последовательности (дорожка 2), ДНК с целевой последовательностью, содержащей одно несоответствие оснований с зондом PNA (дорожка 3), а также ДНК с полной целевой последовательностью (дорожка 4) и анализировали каждый образец с помощью анализа по сдвигу в геле, результаты которого показаны на фиг. 18С. На дорожке 1 представлен ДНК-маркер. Как видно из наших результатов, ДНК с полным соответствием целевой последовательности (дорожка 4) связывала PNA, тогда как у ДНК с целевой последовательностью, содержащей последовательность с одним несоответствием оснований (дорожка 3), и ДНК без целевой последовательности (случайная последовательность вместо целевой последовательности) (дорожка 2) не наблюдали связывание с PNA. Таким образом, из результатов анализа по сдвигу в геле видно, что PNA специфически связывалась с ДНК, содержащей целевую последовательность, без связывания с ДНК, содержащей хотя бы одно несоответствие в целевой последовательности.

Пример 5

Детекция целевой последовательности в нанопоре с помощью специфического зонда с модифицированной последовательностью

В этом примере показана детекция молекулы ДНК, содержащей целевую последовательность, связанную с нашим специфическим PNA-зондом с PEG-модифицированной последовательностью.

Создавали три различных PNA-зонда, так чтобы у них была различная объемистость, которая обусловлена присоединением PEG и длиной PEG. Использовали зонды трех типов: 1) PNA без какого-либо PEG, 2) PNA, связанную с 5 кДа PEG, и 3) PNA, связанную с 10 кДа PEG. Каждый зонд смешивали с ДНК, содержащей целевую последовательность, и загоняли в нанопоры для отслеживания детекции ДНК, связанной с PNA-зондом. Концентрация каждого комплекса в образце составляла 2 нМ в 1 М буфере LiCl. Образец гнали в нанопоровом устройстве под напряжением 100 мВ. Результаты показаны на фиг. 19А-19Е.

На фиг. 19А показаны иллюстративные отдельные наблюдаемые события для ДНК, связанной с зондом каждого типа. Кривая события, полученная от события ДНК/bisPNA показана слева. Посередине показана кривая события, полученная от комплекса ДНК/bisPNA-PEG с до 3 PEG, связанными с каждой PNA, и PEG размером 5 кДа. Справа показана кривая события, полученная от комплекса ДНК/bisPNA-PEG с до 3 PEG, связанными с каждой PNA, и PEG размером 10 кДа. Кривая события для каждого была получена при измерении по блокаде тока через нанопоры в процессе перемещения идентифицируемого комплекса. На фиг. 19 из отображений молекулы видны линейный PEG и ДНК, которые масштабированы для визуального сравнения. По мере увеличения размера (объема) зонда изменяется кривая события.

Анализировали группу событий и строили диаграмму разброса сдвига средней проводимости (dG) в зависимости от продолжительности для всех событий в каждом наборе данных. Строили диаграмму разброса средней проводимости для события (сдвиг среднего тока, разделенный на напряжении) в зависимости от длительности (размера) события по результатам нашего эксперимента, которая показана на фиг. 1. Из диаграммы видно, что из ДНК/PNA, ДНК/PNA-PEG (5 кДа) и ДНК/PNA-PEG (10 кДа) были получены перекрывающиеся популяции, которые отличаются по их продолжительности и средней проводимости. Строили гистограмму, на которой видно наблюдаемое различие сдвига средней проводимости для каждого события (dG) между различными комплексами (фиг. 19С). Также строили гистограмму, на которой видно наблюдаемое различие длительности события между различными комплексами (фиг. 19D).

Пример 6

Детекция целевой последовательности мутантного гена cftr в нанопоре для детекции кистозного фиброза у человека

Была показана специфичность связывания нашего модифицированного PNA-зонда с целевой последовательностью и способность детектировать целевую последовательность с помощью зонда в нанопоровом устройстве. В настоящем примере рассмотрено применение модифицированного PNA-зонда в нанопоровом устройстве для детекции мутации, обуславливающей развитие заболевания, в образце от пациента, в частности, муковисцидоза.

Создавали (в соответствии со способами, описанными в Примере 4) модифицированный PNA-зонд (PNA-PEG-зонд), который содержит молекулу PNA, которая специфично связывается с целевой последовательностью ДНК, содержащей ген cftr с мутацией в нем (ΔF508), которая вызывает муковисцидоз, PEG, связанный с PNA-зондом, имел массу 5 кДа. ДНК, содержащая мутацию, вызывающую развитие муковисцидоза, инкубировали со пегилированной PNA, специфичной к такой мутации. Затем образцы помещали в нанопоровое устройстве с 26 нм порой и регистрировали и анализировали события перемещения через нанопору.

Кривые событий перемещения, которые коррелировали с перемещением PNA-PEG-зонда, связанного с молекулой ДНК, наблюдали у образца с ДНК, содержащей мутацию, которая вызывает муковисцидоз (ΔF508). Иллюстративные кривые событий показаны на фиг. 20А. Эксперименты с использованием образца только с ДНК или только с ДНК/PNA (т.е. без PEG-PNA) не давали определенных событий перемещения относительно фоновых, откуда видна возможность с помощью поры точно идентифицировать PNA-PEG-зонд, связанный с ДНК, а также усиление детекции, обеспечиваемое модифицированными зондами, которые представлены в настоящем описании. Для группы зарегистрированных событий из образца с целевым мутантным геном и PNA-PEG-зондом, события характеризовали по сдвигу средней проводимости и длительности и анализировали. На фиг. 20В показан график сдвига средней проводимости в зависимости от длительности для каждого зарегистрированного события. На фиг. 20С и фиг. 20D показаны соответствующие гистограммы, описывающие характеристики событий, детектированных по соответственно сдвигу средней проводимости и длительности каждого события. Проанализированные данные соответствовали ожидаемым данным для перемещения комплекса ДНК/PNA-PEG (5 кДа) через нанопору, что указывало на успешное связывание и идентификацию целевой последовательности с мутацией cftr в нанопоровом устройстве.

Также был проведен анализ по сдвигу в геле на образцах, содержащих наш PNA-PEG-зонд (5 кДа), специфичный к мутации гена cftr ΔF508, с образцом, содержащим 300 п.о. ДНК с последовательностью cftr дикого типа (дорожка 2), и с образцом, содержащим 300 п.о. ДНК с мутацией гена cftr ΔF508 (дорожка 3) (фиг. 20Е). Из этих данных видно, что наш PNA-PEG-зонд специфично связывался только с целевой последовательностью ΔF508. но не связывался с последовательностью дикого типа.

Таким образом, была успешно детектирована ДНК, содержащая, мутацию одного основания гена cftr (ΔF508), и было продемонстрировано применение нашей системы для детекции конкретных последовательностей в полинуклеиновой кислоте в образце, в то числе для диагностических или лечебных показаний у пациента-человека.

Пример 7

Детекция инфекционных бактерий с помощью PNA-PEG-зонда в нанопоре

В этом примере рассмотрено применение наших модифицированных зондов для детекции наличия бактериальной ДНК в образце с использованием нанопорового устройства.

Синтезировали зонд с молекулой PNA, способной специфично связываться с ДНК бактерии Staphylococcus mitis (S. mitis). BisPNA содержит последовательность, комплементарную последовательности, которая является специфической для вида бактерий S. mitis.

В этом анализе PNA-зонд связан с 10 кДа PEG для обеспечения возможности детекции в нанопоре при связывании с бактериальной ДНК. Смешивали PNA-зонд с бактериальной ДНК и проводили анализ по сдвигу в геле на образце для отслеживания связывания. На фиг. 21А приведены результаты анализа по сдвигу в геле, причем дорожка 1 содержит бактериальную ДНК без PNA-зонда, а дорожка 2 содержит бактериальную ДНК с PNA-зондом. Из наблюдаемых результатов было видно, что наш PNA/PEG (10 кДа) зонд связывался с бактериальной ДНК S. mitis.

Затем готовили два образца для детекции в нанопоре. Первый образец включал бактериальную ДНК с PEG-модифицированными PNA-зондами (ДНК/bisPNA-PEG). Второй образец включал только бактериальную ДНК. Прогоняли эти образцы через нанопоровое устройство в двух последовательных экспериментах ианализировали полученные события. На фиг. 21В показана диаграмма разброса сдвига средней проводимости (dG) по вертикальной оси относительно продолжительности по горизонтальной оси для всех зарегистрированных событий в двух последовательных экспериментах. Показаны события, характеризующиеся тем, что получены от меченого образца 1 (квадраты) и немеченного образца 2 (кружки).

Меченные молекулы были стабильно выше относительно фонового порога (пунктирная линия), в то время как немеченные молекулы были ниже линии и соответствовали фоновой популяции. Популяцию молекул из различных экспериментов по оценке фона (ДНК/PNA без PEG, фильтрованная сыворотка и т.д.) применяли для определения порога (линия) для отметки меченных событий. Фоновые события здесь не показаны. Для точной детекции бактериальной ДНК в образце ДНК нужно было пометить с помощью высокочувствительного сайт-специфического зонда.

Из наших результатов видно, что связанная с PNA/PEG популяция бактериальной ДНК S. mitis является отличимой от фоновых событий, в то время как только ДНК и только ДНК/PNA - нет. Таким образом, наш специфический зонд с модифицированной PNA-PEG последовательностью позволяет проводить надежную детекцию наличия или отсутствия ДНК S. mitis в образце.

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Следует понимать, что слова, которые были использованы, являются словами описания, а не ограничения, и что в пределах объема прилагаемой формулы изобретения могут быть сделаны изменения без отступления от истинного объема и сущности настоящего изобретения в его более широких аспектах.

Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано достаточно подробно и с некоторыми деталями относительно нескольких описанных вариантов осуществления, не предполагается, что оно должно ограничиваться какими-либо такими деталями или вариантами осуществления или каким-либо конкретным вариантом осуществления, но должно истолковываться на основании прилагаемой формулы изобретения таким образом, чтобы обеспечивалось наиболее широкое возможное толкование такой формулы изобретения с учетом предшествующего уровня техники, и, следовательно, эффективно охватывался заданный объем настоящего изобретения.

Все упомянутые в настоящем документе публикации, патентные заявки, патенты и другие источники включены с помощью ссылки в их полном объеме. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, заголовки разделов, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ детекции полинуклеотида или полинуклеотидной последовательности в образце. Способ включает приведение в контакт образца с первым и вторым зондом, где первый и второй зонд специфично связываются с первой и второй целевой последовательностью полинуклеотида, соответственно, приведение в контакт образца с третьей молекулой для образования содержащего полинуклеотид, первый и второй зонд, третью молекулу слитого комплекса, загрузку образца в первую камеру нанопорового устройства и определение наличия или отсутствия комплекса в образце. Причем нанопоровое устройство содержит нанопору и находящиеся в электрическом и жидкостном сообщении посредством нанопоры первую камеру и вторую камеру. Кроме того, нанопоровое устройство характеризуется управляемым напряжением между нанопорой и связанным с нанопорой сенсором, где сенсор выполнен с возможностью идентифицирования проходящих через нанопору объектов. Изобретение обеспечивает специфическое связывание зонда с последовательностью для её детекции в нанопоре. 20 з.п. ф-лы., 41 ил., 1 табл., 7 пр.

1. Способ детекции полинуклеотида или полинуклеотидной последовательности в образце, содержащий:

a) приведение в контакт указанного образца с первым зондом и вторым зондом, причем указанный первый зонд специфично связывается с первой целевой последовательностью указанного полинуклеотида в условиях, которые способствуют связыванию указанного первого зонда с указанной первой целевой последовательностью, а указанный второй зонд специфично связывается со второй целевой последовательностью указанного полинуклеотида в условиях, которые способствуют связыванию указанного второго зонда с указанной второй целевой последовательностью;

b) приведение в контакт указанного образца с третьей молекулой, которая способна одновременно связываться с указанным первым и вторым зондом при нахождении в достаточной близости друг к другу указанного первого и второго зонда в условиях, которые способствуют связыванию указанной третьей молекулы с указанным первым зондом и указанным вторым зондом, таким образом образуя слитый комплекс, содержащий указанный полинуклеотид, указанный первый зонд, указанный второй зонд и указанную третью молекулу;

c) загрузку указанного образца в первую камеру нанопорового устройства, причем указанное нанопоровое устройство содержит по меньшей мере одну нанопору и по меньшей мере указанную первую камеру и вторую камеру, причем указанная первая и вторая камеры находятся в электрическом и жидкостном сообщении посредством указанной по меньшей мере одной нанопоры, и причем нанопоровое устройство дополнительно характеризуется управляемым напряжением между каждой из указанной по меньшей мере одной нанопоры и сенсором, связанным с каждой из указанной по меньшей мере одной нанопоры, причем указанный сенсор выполнен с возможностью идентифицирования объектов, проходящих через по меньшей мере одну нанопору, а указанный слитый комплекс, перемещающийся через указанную по меньшей мере одну нанопору, подает детектируемый сигнал, связанный с указанным слитым комплексом; и d) определение наличия или отсутствия указанного слитого комплекса в указанном образце путем отслеживания указанного детектируемого сигнала.

2. Способ по п. 1, в котором указанный полинуклеотид представляет собой ДНК или РНК.

3. Способ по п. 1, в котором указанный детектируемый сигнал представляет собой электрический сигнал.

4. Способ по п. 1, в котором указанный детектируемый сигнал представляет собой оптический сигнал.

5. Способ по п. 1, в котором указанная достаточная близость составляет менее 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 или 500 нуклеотидов.

6. Способ по п. 1, в котором указанная третья молекула содержит PEG или антитело.

7. Способ по п. 1, в котором указанная третья молекула и указанные первый и второй зонды связаны с ssDNA, и причем указанная ssDNA, связанная с указанной третьей молекулой, содержит участок, комплементарный участку ssDNA, связанному с указанным первым зондом, и комплементарный участку ssDNA, связанному со указанным вторым зондом.

8. Способ по п. 1, дополнительно содержащий приведение в контакт образца с одной или более детектируемыми метками, способными связываться с третьей молекулой или со слитым комплексом.

9. Способ по п. 1, в котором указанный первый зонд или указанный второй зонд содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из белка, пептида, нуклеиновой кислоты, TALEN, CRISPR, пептид-нуклеиновой кислоты или химического соединения.

10. Способ по п. 1, в котором указанный первый зонд или указанный второй зонд содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК), пептид-нуклеиновой кислоты (PNA), гибрида ДНК/РНК, полипептида или любого химически полученного полимера.

11. Способ по п. 1, в котором указанный первый зонд или указанный второй зонд содержит молекулу PNA, связанную с PEG.

12. Способ по п. 11, в котором указанный PEG характеризуется молекулярной массой по меньшей мере 1 кДа, 2 кДа, 3 кДа, 4 кДа, 5 кДа, 6 кДа, 7 кДа, 8 кДа, 9 кДа или 10 кДа.

13. Способ по п. 1, дополнительно содержащий применение к указанному образцу условия, предположительно приводящего к изменению связывающего взаимодействия между первым зондом и первой целевой последовательностью или вторым зондом и второй целевой последовательностью.

14. Способ по п. 13, в котором указанное условие выбрано из группы, состоящей из удаления зонда из образца, добавления средства, которое конкурирует с зондом за связывание с целевой последовательностью, и изменение изначального рН, солевого или температурного условия.

15. Способ по п. 1, в котором указанный первый зонд или указанный второй зонд взаимодействует с целевой последовательностью полинуклеотида посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, металлической связи, ван-дер-ваальсовой силы, гидрофобного взаимодействия или межплоскостных стэкинг-взаимодействий.

16. Способ по п. 1, дополнительно содержащий приведение образца в контакт с одной или более детектируемыми метками, способными связываться с зондом или с комплексом полинуклеотид-зонд.

17. Способ по п. 1, в котором нанопора имеет диаметр от 1 нм до 100 нм, длину от 1 нм до 100 нм, и причем каждая из камер содержит электрод.

18. Способ по п. 1, в котором указанное нанопоровое устройство содержит по меньшей мере две нанопоры, выполненные с возможностью управлять движением указанного полинуклеотида одновременно в обоих нанопорах.

19. Способ по п. 1, дополнительно содержащий изменение полярности указанного независимо управляемого напряжения после начальной детекции комплекса полинуклеотид-зонд по указанному детектируемому сигналу, с тем, чтобы обращалось движение указанного полинуклеотида через нанопору после прохождения связанной с зондом части через нанопору, таким образом еще раз идентифицируя наличие или отсутствие комплекса полинуклеотид-зонд.

20. Способ по п. 1, в котором указанное нанопоровое устройство содержит две нанопоры, и причем указанный полинуклеотид одновременно расположен в обеих из указанных двух нанопор.

21. Способ по п. 20, дополнительно содержащий корректировку величины и или направления напряжения в каждой из указанных двух нанопор так, чтобы нанопорами создавалась противодействующая сила для управления скоростью перемещения полинуклеотида через нанопоры.