Композиция антимикробных пептидов, полученных из личинок Musca domestica, и способ ее получения Российский патент 2020 года по МПК A61K35/64 C07K1/16 C07K1/36 A61P33/00 

Композиция антимикробных пептидов, полученных из личинок Musca domestica, и способ ее получения

Область применения

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а именно к фармацевтике, и может быть использовано для лечения инфекций бактериальной этиологии.

Одной из важных задач современного сельского хозяйства является интенсификация производства. Увеличение производства животноводческой продукции достигается, в том числе, и применением антибактериальных препаратов. Однако это приводит к селекции антибиотикорезистентных штаммов к известным антибактериальным препаратам, поэтому поиск новых альтернативных композиций является актуальной задачей.

Известно много различных инъекционных композиций для лечения инфекций бактериальной этиологии у животных, например, на основе: азитромицина (RU 2512683 С2, 10.04.2014 и CN 102846649), флуниксина и хлорамфеникола (MY 135791 А), флуниксина и энрофлоксацина (ЕР 1875913 и CN 102697784), флуниксина, энрофлоксацина, сульфадиазина, триметоприма и дексаметазона (CN 101829124), флуниксина, энрофлоксацина, триметоприма, тилозина и сульфаметоксазола (CN 102697784), флуниксина и окситетрациклина (PL 335878). Все приведенные композиции обладают широким спектром действия, стабильны при хранении, обладают пролонгированным действием и высоким лечебным эффектом, однако большого числа микроорганизмов на данный момент времени выработана резистентность к данным действующим веществам.

II. Предшествующий уровень техники

Одним из перспективных направлений в заявленной области применения является использование в качестве действующего вещества пептидов насекомых, обладающих высокой антибактериальной активностью. На данный момент времени получены некоторые антимикробные пептиды, обладающие высокой антимикробной активностью, которые выделены из различных организмов например: производных меланоцит-стимулирующего гормона (US 6887846), ретроциклинов (WO 044998), магайнина (US 6872705), производных муцина (US 6790833), биоцидный пептид (RU 103887, 06.08.2018 бюл. №22), рекомбинантный полипептид (RU 123977, 17.01.2018 бюл. №2), пептида аллоферон (RU 2667128, 02.07.2018 бюл. №19), рекомбинантного полипептида, обладающего серинпротеазной активностью (RU 142580, 07.05.2018 бюл. №13), дефензинов человека (WO 081486, US 034820, WO 9807833, JP 288105, WO 9421672), антимикробных пептидов ракообразных (US 6642203), криптдина (WO 9616075), синтетических катионных пептидов (US 6906035, US 6624140, US 6172185), дефензиноподобный пептид стрекозы Aeschna cyanea (FR 2695392), комплексантимикробных пептидов мухи Calliphora vicina (US 6337093), антибактериальные пептиды жука Oryctes rhinoceros (US 6476189).

В настоящее время применяются три основных метода получения антимикробных пептидов: химический синтез, экстракция из организма-хозяина, синтез в культуре клеток-продуцентов.

Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки.

Так технология химического синтеза не позволяет получать пептиды высокой массы, так как синтез пептида с последовательностью более, чем 30 аминокислот затруднителен, однако данный метод позволяет получать пептиды в больших количествах и высокой чистоты, но обладает высокой себестоимостью и трудностью в случае синтеза длинных цепей, обладающих трехмерной организацией.

Синтез в культуре клеток-продуцентов обычно сводится к применению генно-инженерных методов. Генная инженерия дает возможность получать пептиды любой длины, однако в ряде случаев не позволяет точно воспроизводить пространственную структуру пептида и обычно отличается значительной стоимостью конечного продукта.

Метод экстракции из организма-хозяина позволяет получать целые комплексы антимикробных пептидов и обеспечивает максимально точное воспроизведение структуры активных компонентов, однако данный метод не позволяет выделять пептиды в особо чистом виде и чаще всего представляют собой смесь, характеризующуюся определенным интервалом масс.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является заявка на изобретение №2017144051 «Способ получения комплекса антимикробных пептидов из биомассы личинок большой восковой моли (Galleria mellonella)», где в качестве исходного субстрата использовались личинки восковой моли.

III. Сущность изобретения

Целью данного изобретения является создание новой фармацевтической композиции антимикробных пептидов, полученных из личинок Musca domestica.

Заявленное изобретение использует последний метод выделения антимикробных пептидов из личинок Musca domestica.

Технический результат изобретения состоит в выделении пептидов, обладающих антимикробной активностью, из личинок Musca domestica, методом дробного высаливания с дальнейшим разделением на хроматографической колонке BioSep SEC S2000.

Метод получения фармацевтической композиции на основе антимикробных пептидов из личинок Musca domestica состоит из трех основных стадий:

1. Высаливание

2. Хроматографическое разделение

3. Создание конечной фармацевтической композиции.

Высаливание или экстракция водорастворимых пептидов из биологического образца (личинок Musca domestica).

Навеску личинок (Musca domestica) массой 3 г растирают в ступке с песком 5 г до однородной массы. Далее в процессе растирания добавляем по частям раствор состоящий из 0,5 мл азида натрия 0,25% и 20 мл фосфатносолевого буфера и перемешивают четыре часа. Далее полученные образцы центрифугируют при 4200 об/мин и отбирают водный слой, содержащий антимикробные пептиды. Для высаливания необходимо добавить к выделенному раствору 2,8 г (NH4)2So4 из расчета на 10 мл раствора (образца). Далее добиваются полного растворения соли. После чего раствор помещают в морозильную камеру при температуре 5-10°С на 24 часа. Далее образцы центрифугируют в течение 40 минут при t=5°С со скоростью 4200 об/мин. После центрифугирования водный слой используют для хроматографического разделения.

Вторым этапом получения фармацевтической композиции является хроматографическое разделение пептидов и их очистка.

Разделение проводили в следующих условиях: колонка BioSep S2000 300×2120 мм, длина волны 280 нм, объем петли 1575 мкл, элюент - 0,1 М фосфатный буферный солевой раствор, скорость потока - 1,0 мл/мин, температура колонки 25°С.

Образец исследуемого раствора с помощью шприца вводили в хроматографическую колонку. Время анализа для одной пробы занимает 60 минут. Смесь пептидов, обладающую антимикробной активностью, выделяли при времени удерживания 18-22,5 минуты. Всего для исследований было собрано шесть фракций, представленных в таблице 1 и на рисунке 1.

Время удерживания определяли по стандартам, анализируемым перед введением исследуемой пробы индивидуально, время удерживания инсулина свиного со временем удерживания 18 минут и массой 6 кДа и инсулина из поджелудочной железы быка 22,5 минут, масса 3,4 кДа. Таким образом, выделена смесь антимикробных пептидов из личинок Musca domestica с массой 3,4-6 кДа. Далее полученную смесь диализовали на протяжении 24 часов против 0,9% раствора хлорида натрия.

Третий этап

Для создании конечной фармацевтической композиции, полученный раствор разбавляли 0,9% раствором хлорида натрия в воде до концентрации пептидов 1,12 мг/мл после чего добавляли в отношении 9:1 (по объему) 10% водный раствор бензилового спирта и полученную фармацевтическую композицию пропускали сквозь фильтр 0,45 мкм, а затем расфасовывали по стерильным флаконам.

Приготовление питательной среды и физиологического раствора

Приготовление МПБ. Для приготовления 1 л МПБ взвешивают 20 г питательной среды, добавляют в 1 л дистиллированной воды и перемешивают. Раствор ставят на огонь, нагревают до полного растворения и кипения.

Приготовление суспензии микроорганизмов

Антибактериальную активность определяли согласно методике МУК 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания.

Для проведения опыта выбраны следующие культуры - Bacillus cereus АТСС 10702, Candida albicans РКПГУ-401/ИСТС-885-653, Staphylococcus aureus АТСС 6538 (209-P), Salmonella typhimurium 1626.

Выявлено, что белковая фракция №2, полученная от личинки Musca domestica, имеет противомикробную активность (табл. 2). Наблюдается, что указанная фракция активна по отношению ко всем исследованным штаммам.

Таким образом, выявлено, что белковая фракция №2, полученная из личинок Musca domestica обладает антимикробной активностью.

Группа изобретений относится к области ветеринарной медицины, а именно к фармацевтике, и может быть использовано для лечения инфекций бактериальной этиологии. Способ получения антимикробных пептидов из личинок Musca domestica включает измельчение навески личинок в ступке с песком до однородной массы с добавлением по частям раствора, состоящего из 0,25% азида натрия и фосфатного буфера, перемешивание в течение 4 часов, центрифугирование, отбор водного слоя, содержащего антимикробные пептиды. Затем осуществляют высаливание путем добавления к выделенному раствору (NH₄)₂SO₄, помещение раствора в морозильную камеру при t=5-10°С на 24 ч, центрифугирование в течение 40 минут при t=5°С со скоростью 4200 об/мин, и хроматографическое разделение пептидов с выделением фракции смеси пептидов с массой 3,4-6 кДа. Полученную смесь подвергают диализу на протяжении 24 часов против 0,9% раствора хлорида натрия, пропускают через фильтр и расфасовывают. Группа изобретений также относится к композиции антимикробных пептидов, содержащей смесь антимикробных пептидов из личинок Musca domestica, полученных указанным способом. Группа изобретений обеспечивает получение пептидов из личинок Musca domestica, обладающих антибактериальной активностью. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

1. Способ получения антимикробных пептидов из личинок Musca domestica, включающий измельчение навески личинок массой 3 г в ступке с песком 5 г до однородной массы с добавлением по частям раствора, состоящего из 0,5 мл 0,25% азида натрия и 20 мл фосфатного буфера, перемешивание в течение 4 часов, центрифугирование при 4200 об/мин, отбор водного слоя, содержащего антимикробные пептиды, высаливание путем добавления к выделенному раствору 2,8 г (NH₄)₂SO₄ из расчета на 10 мл раствора, помещение раствора в морозильную камеру при t=5-10°С на 24 ч, центрифугирование в течение 40 минут при t=5°С со скоростью 4200 об/мин, хроматографическое разделение пептидов в колонках BioSep S2000 300×2120 мм при длине волны 280 нм, объеме петли 1575 мкл, используя элюент - 0,1 М фосфатный буферный солевой раствор, при скорости потока - 1 мл/мин и температуре колонки 25°С, выделение фракции смеси пептидов с массой 3,4-6 кДа при времени удерживания 18-22,5 мин, диализ полученной смеси на протяжении 24 часов против 0,9% раствора хлорида натрия, пропускание через фильтр и расфасовку.

2. Композиция антимикробных пептидов, полученных из личинок Musca domestica, обладающая антибактериальной активностью, содержащая смесь антимикробных пептидов из личинок Musca domestica, полученных способом по п. 1, в концентрации 1,12 мг/мл, 10% водный раствор бензилового спирта и буферную систему, включающую 0,9% водный раствор хлорида натрия в качестве регулятора осмотического давления, причем раствор пептидов в 0,9% водном растворе хлорида натрия и 10% водный раствор бензилового спирта взяты в объемном соотношении 9:1.